CN1580285A

CN1580285A - 转基因产品的表面等离子共振生物传感器检测方法

Info

Publication number: CN1580285A
Application number: CN 200410045459
Authority: CN
Inventors: 苏文金; 刘光明; 宋思杨
Original assignee: Prof China Xiamen Entry-Exit Inspection And Quarantine Bureau; Xiamen University
Current assignee: Prof China Xiamen Entry-Exit Inspection And Quarantine Bureau; Xiamen University
Priority date: 2004-05-20
Filing date: 2004-05-20
Publication date: 2005-02-16

Abstract

转基因产品的表面等离子共振生物传感器检测方法，涉及一种采用表面等离子共振生物传感器用于转基因产品的检测方法。其步骤为设计并制备末端生物素修饰的ssDNA探针；利用吸附法将探针固定在芯片表面并形成单分子层，制成检测芯片；加入样品DNA PCR产物，对杂交反应监控，洗脱后观察分析结果。引入转基因产品的检测中，其过程快捷准确、实时响应。既可对定性PCR检测的阳性结果进行验证，也可用于转基因产品的特异性检测探针的选择试验，与常规的基因检测相比，其探针固定化，可重复使用，成本低；样品无需预处理，无需额外试剂，可直接分析；响应快，检测时间缩短，可连续分析，实现了对DNA的在线和实时检测；分析操作简单，易于实现自动化测定。

Description

转基因产品的表面等离子共振生物传感器检测方法

技术领域

本发明涉及一种转基因产品的检测方法，尤其是采用表面等离子共振生物传感器用于转基因产品的检测方法。

背景技术

随着转基因农作物的迅猛发展，转基因产品的环境安全与食用安全引起了各国政府和公众的普遍关注(Anklam E，Gadani F，Heinze P，et al，Analytical methods for detection anddetermination of genetically modified organisms in agricultural crops and plant-derived food products.Eur.Food Res.Technol.，2002，214，3-26)为了保护消费者的知情权和选择权，保障人们的餐桌安全，确保农产品国际贸易的健康发展，世界各国都加大了在转基因产品的检测和安全评价方面的研究投入，我国从2002年3月20日起要求对转基因产品检测并标识(中华人民共和国国务院.《农业转基因生物安全管理条例》.2001年5月23日)。与转基因产品的迅猛发展相比，转基因产品检测方法的发展相对滞后，有关的国际标准仍未出台，目前常用的检测方法主要有以下几种(Markus L，Peter B，Klaus P，et al.IUPAC collaborative trialstudy of a method to detect genetically modified soy beans and maize in dried powder.Journal of AOAC International，1999，82：923～928)：

1.免疫学方法：以表达蛋白为目标的免疫学方法是根据抗原抗体特异性反应，针对某一特定转基因产品而设计的，其中包括免疫印迹法(western blot)、酶联免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)和试纸条法(lateral flow strip)。目前已报道一些稳定可靠的免疫学方法可检测少数几种转基因产品，如ELISA法检测RoundupReady^TM大豆的表达蛋白cp4epsps、Flavor Savr^TM番茄的表达蛋白nptII等(Stave J W，Magin K，Schimmel H，et al.AACC collaborative study of a protein method for detection ofgenetically modified corn.Cereal Foods World，2000，45：497～501)。

评价：免疫学方法具有特异性好、操作简便、费用低、对仪器和人员要求不高的特点，适用于原料和半成品分析。但是该类方法仅针对一种特异蛋白，覆盖率低；对于加工食品，受到目标蛋白的构象和含量的限制，尤其是深加工食品中目标蛋白的变性，影响抗原抗体的特异性识别，而使检测的不确定性增加；有些基因在新宿主内进行修饰，只在某些部位表达或根本不表达，也就难以用该类方法进行检测(Anklam E，Gadani F，Heinze P，et al，Analyticalmethods for detection and determination of genetically modified organisms in agricultural crops andplant-derived food products.Eur.Food Res.Technol，2002，214，3-26)。

2.定性PCR方法：以外源DNA为目标的检测方法包括DNA杂交法(southern blot)和聚合酶链式反应法(polymerase chain reaction，PCR)。DNA杂交法准确可靠，但存在灵敏度低、操作繁琐等缺点(Anklam E，Gadani F，Heinze P，et al，Analytical methods for detectionand determination of genetically modified organisms in agricultural crops and plant-derived foodproducts.Eur.Food Res.Technol，2002，214，3-26)。PCR法是指模拟体内DNA复制方式在体外选择性扩增DNA某个特殊区域的技术，通过PCR扩增转基因产品中的外源DNA序列，然后用琼脂糖凝胶电泳分析产物，是目前最常用的转基因检测方法。

评价：对设备试剂要求不高，成本低，快速简便，可用作筛选试验。但存在电泳分析粗略、易污染、检测结果需验证、难以定量、不适合大规模分析等不足(Wenjin Su，Siyang Song，Minnan Long，and Guangming Liu，Multiplex polymerase chain reaction/membrane hybridization assayfor detection of genetically modified organisms.Journal of Biotechnology，2003，105：227-233)。

3.竞争性定量PCR方法(competitive quantitative PCR)：以待测的外源DNA与竞争DNA(以缺失或插入几十bp的外源DNA序列构建的质粒)作为相互竞争底物，在同一PCR反应体系中竞争引物和酶等，其相差几十bp的PCR产物可以通过凝胶成像分析系统进行区分和定量，以系列转基因标准品DNA制作“靶DNA浓度—靶DNA产物量/竞争DNA产物量”的标准曲线，即可依据“待测DNA产物量/竞争DNA产物量”求得样品中的转基因成分含量(Hardegger M，Brodmann P，Herrmann A.Quantitative detection of the 35S promoter andthe NOS terminator using quantitative competitive PCR.Eur Food Res Technol，1999，209：83-87)。

评价：竞争性PCR法在一个反应管中同时扩增待测样品与竞争模板，消除了实验中各种可变参数的干扰，获得了较为准确的结果，可定量分析，成本较低。但存在操作繁琐、技术复杂(需构建竞争性DNA)、要求电泳分析、易污染等不足(Ke LD，Chen Z，Yung WK.A reliability test of standard-based quantitative PCR：exogenous vs endogenousstandards.Mol.Cell Probes，2000，14：127-135)。

4.荧光定量PCR(fluorophore quantitative PCR，FQPCR)法：在PCR反应体系中加入荧光标记探针，通过光电传导系统直接探测PCR扩增过程中荧光信号的变化以获得定量结果，所以具有DNA杂交的高特异性和光谱技术的高精确性。数据的采集和分析可自动完成，简化了实验过程，减少了污染和假阳性的机会(Becker K.，D.Pan and C.B.Whitely.Real-time quantitative polymerase chain reaction to assess gene transfer.Hum.GeneTher，1999，10：2559-2566)。

评价：荧光定量PCR方法灵敏度比上述各法高，准确性和重复性好，且可定量测定(Whitcombe D，Browie J，Gillard H L，et al.A homogeneous fluorescence assay for PCRamplicons：its application to real-time，single-tube genotyping.Clin Chem，1998，44：918～923)。但目前常用的荧光定量PCR技术成本高，不便普及应用(Li Q，Luan G，Guo Q，et al.A new class of homogeneous nucleic acid probes based on specific displacementhybridization.Nucleic Acids Res.，2002，30(2)：E5-5)。

5.多基因PCR(multiplex PCR，MPCR)法：随着分子生物学的发展，转基因检测技术正由单基因PCR向多基因PCR方向发展。单基因PCR技术操作简单，但它只能检测某一特定的基因成分，若待检样品中转基因成分不明或含有多种转基因成分，就需要采用不同的PCR对可能存在的转基因成分进行多次扩增，此时PCR技术就变得繁琐费时，而且可能出现漏检引起的假阴性结果。

评价：MPCR是一种特殊的PCR技术，比单基因PCR反应更快捷、更经济，可在一个反应体系中检测多种可能的转基因成分，弥补了单基因PCR的一些不足(Minunni M，Tombelli S，Mariotti E，et al.Biosensors as new analytical tool for DNA detection.Fresenius J Anal Chem，2001，369：589-593)。目前，多基因PCR产物的检测仍然沿用传统的凝胶电泳分析方法，该方法简便易行，但缺乏特异性和灵敏性，同时容易对人和环境产生危害。

发明内容

本发明旨在提供一种可进行在线和实时监测与自动化分析，检测过程简易、快速，芯片可重复使用的转基因产品的表面等离子共振生物传感器检测方法。

本发明的步骤为：

1、设计并制备末端生物素修饰的ssDNA(单链寡核苷酸)探针；

2、利用吸附法将探针固定在芯片表面并形成单分子层(SAMs)，制成检测芯片；

3、对芯片进行洗涤处理后，加入样品DNA PCR产物，按照标准参数对杂交反应进行监控，洗脱后观察曲线并分析结果。

所说的ssDNA探针选自CaMV 35S启动子或Tnos终止子。利用吸附法将探针固定在芯片表面并形成单分子层，分别制成CaMV 35S启动子或Tnos终止子的检测芯片。对芯片可采用NaOH进行洗涤处理。所说的对杂交反应进行监控的标准参数为HBS-EP缓冲液，温度25℃，流速5μL/min。所采用的洗脱液可用50mmmol/L NaOH溶液进行。

本发明基于SPR对传感器表面变化敏感的特性，利用生物素—链霉亲和素系统的相互作用将ssDNA探针固定在几十纳米厚的金属膜表面，通过SPR特性参数的变化来检测探针与待测样品DNA相互作用时发生的细微变化，并首次引入转基因产品的检测中，其过程快捷准确、实时响应。既可对定性PCR检测的阳性结果进行验证，也可用于转基因产品的特异性检测探针的选择试验，与常规的基因检测相比，本发明具有以下优点：①探针固定化，可重复使用，成本低；②样品无需预处理，无需额外试剂，可直接分析；③响应快，检测时间大大缩短(数分钟)，可连续分析，实现了对DNA的在线和实时检测；④分析操作简单，联机操作，易于实现自动化测定。

附图说明

图1为35S-P1探针与质粒pBI121和pUC19的PCR产物杂交的SPR-SENSOR检测结果。在图1中，a为质粒S-121的杂交时间；b为质粒S-19的杂交时间。横坐标为时间/秒，纵坐标为共振强度/RU。

图2为35S-P1探针(A)及nos-P1探针(B)与已知标准样品GM(转基因)大豆粉(0％和0.3％)的PCR产物杂交的SPR-SENSOR检测结果。在图2中，a为0.3％的标准样品大豆粉的杂交时间；b为0％的标准样品大豆粉的杂交时间。横坐标为时间/秒，纵坐标为共振强度/RU。

具体实施方式

以下实施例将结合附图对本发明作进一步的说明。

实施例1

选择合适的引物与探针是成功进行DNA分析检测的关键。针对转基因产品中最常用的外源DNA如CaMV 35S启动子和Tnos终止子的序列，通过反复多次地组合调整各项参数，经软件Primer Express^TM和OLIGO 4.0搜索分析，并进行各寡核苷酸的比较，从中选出符合要求的引物和探针，详见表1、2。

表1

引物编号	目标DNA	引物序列(5’-3’)
引物编号	目标DNA	引物序列(5’-3’)	35S-1/2	CaMV 35S启动子	GCT CCT ACA AAT GCC ATC AGAT AGT GGG ATT GTG CGT CA
nos-1/2	Tnos终止子	GAA TCC TGT TGC CGG TCT TGTTA TCC TAG TTT GCG CGC TA	35S-1/2	CaMV 35S启动子	GCT CCT ACA AAT GCC ATC AGAT AGT GGG ATT GTG CGT CA

表2

探针编号	目标DNA	探针序列(5’-3’)
探针编号	目标DNA	探针序列(5’-3’)	35S-P1	CaMV 35S启动子	GAG GAG CAT CGT GGA AAA AGA AG
nos-P1	Tnos终止子	GCA TGA CGT TAT TTA TGA GAT GGG T	35S-P1	CaMV 35S启动子	GAG GAG CAT CGT GGA AAA AGA AG

备注：探针5’端标记Biotin。

选择PCR反应体系：1×PCR buffer(缓冲液)，2mmol/L MgCl2，0.2mmol/L dNTPs(脱氧核苷三磷酸)，0.2μmol/L primer，1unit of Raq酶(1单位的DNA聚合酶)，100ng DNA模板，加ddH₂O至50μL。PCR反应条件：94℃预变性3min；94℃/20s、引物退火温度/40s、72℃/59s，共运行40个循环；72℃延伸3min；于4℃条件下保存。设计并制备末端生物素修饰的ssDNA探针(CaMV 35S启动子和Tnos终止子)。利用吸附法将探针固定在芯片表面并形成单分子层，分别制成CaMV 35S启动子和Tnos终止子的SPR-SENSOR检测芯片。用10μL 50mmol/L NaOH进行洗涤处理后，加入30μL无需标记的样品DNA PCR产物，按照标准参数(HBS-EP缓冲液，温度25℃，流速5μL/min)对杂交反应进行监控，用50mmmol/LNaOH溶液进行洗脱，观察曲线并进行分析。

实施例2

设计末端生物素化的特异性探针35S-P1并固定在芯片表面，分别加入质粒pBI121(S-121)和pUC19(S-19)的CaMV 35S-PCR扩增产物，通过BIAcore X仪现场监测探针与质粒的扩增产物杂交产生的光信号变化过程。结果显示，35S-P1探针可与S-121的扩增产物进行专一性杂交并产生明显的杂交曲线，而与S-19的扩增产物无明显的杂交信号产生(参见图1)。

SPR技术提示，通过探测DNA分子之间的互补结合作用，即探测PCR产物与探针的杂交反应过程，可实现对PCR产物的特异检测；通过仪器对杂交反应过程进行在线和实时监测，可实现对PCR产物的自动化分析。整个检测过程简单快速(数分钟)，芯片可以重复使用。因此，本发明利用自行设计的寡核苷酸探针35S-P1、nos-P1制成了两种特异性的SPR芯片，分别以已知标准样品GM大豆粉(0％和0.3％)的PCR扩增产物为检测对象，首次建立了PCR检测转基因产品的SPR-SENSOR验证方法。已知标准样品的检测结果显示，无论是35S-P1探针(图2-A)还是nos-P1探针(图2-B)，均与阳性标准样品(0.3％的GM大豆粉)的扩增产物产生特异的杂交曲线，而与阴性标准样品(0％的GM大豆粉)的扩增产物无明显的杂交信号产生，表明该方法能对样品的PCR产物进行快速确认。

Claims

1、转基因产品的表面等离子共振生物传感器检测方法，其特征在于其步骤为

1)设计并制备末端生物素修饰的ssDNA探针；

2)利用吸附法将探针固定在芯片表面并形成单分子层，制成检测芯片；

3)对芯片进行洗涤处理后，加入样品DNA PCR产物，按照标准参数对杂交反应进行监控，洗脱后观察曲线并分析结果。

2、如权利要求1所述的转基因产品的表面等离子共振生物传感器检测方法，其特征在于所说的ssDNA探针选自CaMV 35S启动子或Tnos终止子。

3、如权利要求2所述的转基因产品的表面等离子共振生物传感器检测方法，其特征在于利用吸附法将CaMV 35S启动子或Tnos终止子探针固定在芯片表面并形成单分子层，制成CaMV 35S启动子或Tnos终止子的检测芯片。

4、如权利要求1所述的转基因产品的表面等离子共振生物传感器检测方法，其特征在于在步骤3)中对芯片采用NaOH进行洗涤处理。

5、如权利要求1所述的转基因产品的表面等离子共振生物传感器检测方法，其特征在于所说的对杂交反应进行监控的标准参数为HBS-EP缓冲液，温度25℃，流速5μL/min。

6、如权利要求1所述的转基因产品的表面等离子共振生物传感器检测方法，其特征在于在步骤3)中所说的洗脱采用50mmmol/L NaOH溶液作为洗脱液。