CN109060915B - 一种基于柔性电极的酶生物传感器 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于柔性电极的酶生物传感器,属于生物传感器技术领域。所述的酶生物传感器,包括工作电极,所述工作电极包括柔性电极基底及固定在柔性电极基底表面的酶,所述柔性电极基底的组成材料包括聚乳酸和石墨烯。本发明提供的酶生物传感器上固载酶与待测底物发生催化反应过程中,电极体系发生电流变化,通过检测电流变化计算出待测底物浓度。本发明采用聚乳酸和石墨烯复合材料制备的电极基底为柔性材料,聚乳酸具有生物相容性好、可生物降解等优点,同时其分子上含有丰富的羧基可用于固定生物酶并保持其生物活性;聚乳酸基体中掺入了石墨烯增强材料的导电能力,实现电子传递,其优异性能大大提升传感器的灵敏度和响应速度,还可改善电极的柔韧性。
Description
技术领域
本发明涉及生物传感器技术领域,具体涉及一种基于柔性电极的酶生物传感器。
背景技术
自1962年Clark和Lyons等提出葡萄糖生物传感器的原理以来,具有快速响应、灵敏度高、选择性好等优点的生物传感器得到了研究者的广泛关注,并得到长足发展,逐渐应用于食品安全、环境、临床等领域。
随着纳米材料和纳米技术的迅猛发展,科学家们尝试将具有大的比表面积、优良导电性能等的纳米材料用于改善生物传感器的灵敏度、响应速度等性能。其中,碳纳米材料,如碳纳米管、碳纳米纤维和石墨烯等,由于具有低成本、宽电化学窗口、高电催化活性等优点,在生物传感器电极修饰中得到了大量应用。尤其是石墨烯材料,因其具有独特的电学、光学和机械性能,成为制备高性能生物传感器的新兴材料之一。
目前,生物传感器朝着低成本、可大批量制备且制备方法简单、测量容易、环境友好型等方向发展。如已报道的基于丝网印刷工艺制备的丝网印刷电极血糖生物传感器,基于喷墨打印技术在塑料、纸基等材料上面制备的免疫生物传感器、DNA生物传感器、气体分子敏感生物传感器等,都可进行大批量生产。但这些生物传感器具有固定的形状和尺寸,不能弯曲或者弯曲后影响了传感器性能,此外在体积上仍占用较大空间,因此可应用的领域存在一定局限性。因此,柔性生物传感器成为发展趋势。
高分子聚合物,由于具有优良的质量传递性能,对水、电解质、氧气的透过选择性,以及良好的生物相容性,已被广泛用于生物传感器制备,常用的高分子材料有聚苯胺、聚吡咯、聚噻吩、聚乙烯醇、聚乙烯基吡啶、β-环糊精等。此外,由于高分子聚合物具有高弹形变和黏弹性等特有力学性能,还可用于制备柔性传感器。
如专利文献CN105352428A公开了一种使用聚乳酸手性高分子构成的压电膜来对位移进行传感检测的传感器装置;专利文献CN105670253A提出了一种低逾渗阈值、低检测限聚乳酸/多壁碳纳米管敏感材料及气体传感器应用;专利文献CN102071540A提出了一种气体传感器纤维膜及其制备方法,用于纤维膜制备的高分子材料包括聚环氧乙烷、聚乙烯醇等;专利文献CN206924059U提出了一种基于叉指电极的左旋聚乳酸纳米线脉搏传感器。
但目前国内外尚无使用聚乳酸和石墨烯复合材料来制备柔性酶生物传感器的报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种加工简单、性能优异、可弯曲、体积小,可满足不同应用场合的酶生物传感器。
为实现上述目的,本发明采用如下技术方案:
一种基于柔性电极的酶生物传感器,包括工作电极,所述工作电极包括柔性电极基底及固定在柔电极基底表面的酶,所述柔性电极基底的组成材料包括聚乳酸和石墨烯。
本发明采用聚乳酸和石墨烯复合材料制备柔性电极基底,高分子量聚乳酸为基体,优良的可塑性能够制成各种形状,石墨烯均匀分散其中,由于石墨烯具有大的比表面积、导电性、高的杨氏弹性模量,有效提高柔性电极的导电性能和延展性。
聚乳酸分子上含有丰富的羧基可用于固定酶分子,酶(蛋白质)一端的氨基与电极基底表面的羧基缩合反应形成酰胺键,使得酶分子固定在电极基底表面。聚乳酸生物相容性好,可有效保持固载酶的生物活性。
所述的柔性电极基底为线状或薄膜形状。线状或薄膜形状的电极基底为聚乳酸和石墨烯复合材料通过挤出机或薄膜加工设备制备得到。
优选的,线状电极的直径为0.1-3mm,长度不限;薄膜电极的厚度为50-500μm。
所述的柔性电极基底中石墨烯与聚乳酸的质量比为0.5-10:100,保证有效改善聚乳酸导电性能以及杨氏弹性模量。
本发明所述的酶是一类具有生物催化活性的蛋白质,其分子结构中含有游离的氨基,作为优选,所述的酶为葡萄糖氧化酶、尿酸氧化酶、乳酸氧化酶、乙醇脱氢酶、葡萄糖脱氢酶、过氧化氢酶、辣根过氧化物酶、乙酰胆碱酶、谷氨酸氧化酶等中的任一种。
所述工作电极的制备方法,包括以下步骤:
(1)将石墨烯粉末和聚乳酸颗粒混合,加热熔化后加工成线状或薄膜状的柔性电极基底;
(2)将柔性电极基底放入含有N-羟基琥珀酰亚胺和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐的磷酸盐缓冲液中活化;
(3)将活化后的柔性电极基底浸泡到含有酶的溶液中,或者将含有酶的溶液滴加或喷印到活化后的柔性电极基底表面,经反应后酶固定在柔性电极基底表面,制得所述工作电极。
作为优选,步骤(1)中,石墨烯粉末和聚乳酸颗粒的质量比为1:20。
所述的聚乳酸颗粒为L-聚乳酸、D-聚乳酸或L-聚乳酸与D-聚乳酸的混合物。
所述的石墨烯粉末可为氧化石墨烯、还原态氧化石墨烯或元素掺杂的石墨烯,其中元素掺杂的石墨烯为氮、磷或硫等元素掺杂的石墨烯,掺杂元素包括但不限于上述几种。
作为优选,步骤(1)中,加热的温度为170-230℃。采用挤出机或薄膜加工设备将复合材料加工成线状或薄膜形状。
步骤(2)中,电极基底表面的大量羧基可以通过偶联剂N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)与1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)活化。
作为优选,步骤(2)中,N-羟基琥珀酰亚胺与1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐的摩尔比为0.1-10:1。
更为优选,缓冲液中NHS的摩尔浓度为0.08mol/L,EDC的摩尔浓度比为0.05mol/L。
作为优选,步骤(2)中,活化的时间为3-5h。
作为优选,活化前,先将柔性电极基底浸泡在N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中处理5-120min,用来溶解掉电极表面附着的熔融的聚乳酸,有利于增加聚乳酸的粗糙度和透过性。
更为优选,柔性电极基底浸泡在N,N-二甲基甲酰胺中处理10min。
DMF处理好后,用乙醇、清水依次清洗柔性电极表面,干燥后进行活化步骤。
步骤(3)中,电极基底表面的羧基活化后,与酶的氨基反应生成酰胺键,使得酶固定在电极基底表面。
作为优选,步骤(3)中,所述反应的条件为室温下放置5min-24h。更为优选,放置的时间为15h。
本发明提供的酶生物传感器采用三电极体系(包括工作电极、辅助电极和参比电极),或者两电极体系(工作电极和辅助电极)。所述辅助电极采用但不限于铂电极或碳电极,所述参比电极采用但不限于Ag/AgCl电极或者饱和甘汞电极。
本发明提供的酶生物传感器的工作原理为:电极表面固定的生物酶与待测底物发生催化反应,期间存在电子传递,导致电极体系电流发生变化,底物浓度越大,电流越大,通过检测电流的变化量可间接计算出待测底物的浓度。
本发明提供的酶生物传感器可用于检测可被柔性电极基底表面固定的酶特异性催化的底物,如酶生物传感器上固定的是葡萄糖氧化酶,可催化的底物为葡萄糖,那么该生物传感器可应用于检测血糖;如酶生物传感器上固定的是尿酸氧化酶,可催化的底物为尿酸,那么该生物传感器可应用于检测尿酸;如酶生物传感器上固定的乙醇脱氢酶,可催化的底物为乙醇,那么该生物传感器可应用于检测乙醇。本发明的柔性电极酶生物传感器,所固定的酶包括但不限于上述几种。
本发明具备的有益效果:
(1)本发明采用聚乳酸和石墨烯复合材料制备的电极基底为柔性材料,在该柔性电极基底表面固定酶制得高性能的酶生物传感器,聚乳酸具有生物相容性好、可生物降解等优点,同时其分子上含有丰富的羧基基团可用于固定生物酶并保持其生物活性;聚乳酸基体中掺入了石墨烯增强材料的导电能力,实现电子传递,其优异性能大大提升传感器的灵敏度和响应速度,如用来检测血糖的灵敏度可高达1.21mA mM-1cm-2,响应时间小于5s,另一方面添加石墨烯还可改善电极的柔性。
(2)本发明的柔性电极酶生物传感器可大批量生产、成本低廉,可用作可抛弃型生物传感器,且可弯曲、占用空间小,大大拓宽了应用场合和应用领域,可用于医疗诊断、食品安全检测等领域,如用来检测血糖、尿酸、乳酸、残留农药、过氧化氢等。
附图说明
图1为实施例1柔性电极酶生物传感器的工作电极制备流程图。
图2为实施例1柔性电极酶生物传感器的工作电极结构组成示意图。
图3a为实施例1所制备的未使用DMF处理的酶生物传感器对不同浓度葡萄糖的循环伏安测试曲线图。
图3b为图3a虚线框中曲线的放大显示,其中a,b,c,d,e,f,g,h,i分别表示葡萄糖浓度为0、0.1、0.2、0.5、1、2、4、8、12mM。
图4为实施例1所制备的未使用DMF处理的酶生物传感器对不同浓度葡萄糖的线性响应拟合曲线。
图5为实施例2柔性电极酶生物传感器的工作电极制备流程图。
图6a为实施例2所制备的使用DMF处理的酶生物传感器对不同浓度葡萄糖的循环伏安测试曲线图。
图6b为图6a虚线框中曲线的放大显示,其中a,b,c,d,e,f,g分别表示葡萄糖浓度为0.1、1、2、4、5、10、15mM。
图7为实施例2所制备的使用DMF处理的酶生物传感器对不同浓度葡萄糖的线性响应拟合曲线。
图8为实施例3所制备的未使用DMF处理的酶生物传感器对不同浓度尿酸的线性响应拟合曲线。
图9为实施例4所制备的使用DMF处理的酶生物传感器对不同浓度乙醇的线性响应拟合曲线。
具体实施方式
下面结合附图对本发明的实施例作详细说明:在以本发明技术方案为前提进行实施,给出了详细的实施方式和具体的操作过程,但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
酶生物传感器为三电极或两电极体系,包括工作电极,工作电极由柔性电极基底和固定在柔性电极基底上的酶组成,柔性电极基底的组成材料为聚乳酸和石墨烯,形状为线状或薄膜形状。酶生物传感器用于不同目标物的特异性检测,采用循环伏安法测量。
下述实施例采用的石墨烯粉末和聚乳酸颗粒为市面上购买的材料。
实施例1
本实施例以一种基于柔性电极的葡萄糖酶生物传感器为例,其柔性电极上固定的酶为葡萄糖氧化酶。
在本实施例中,工作电极的制备方法,包括以下步骤(图1):
S1、采用双螺杆挤出机制备聚乳酸和石墨烯柔性线状电极
将石墨烯粉末和L-聚乳酸颗粒按1:20质量比混合,加入双螺杆挤出机的加料箱中,调节双螺杆挤出机温度为200℃,50min后开始挤出柔性线状电极,设置牵引速度为5cm/min。
S2、采用乙醇、纯水清洗所制备的柔性电极。
将采用双螺杆挤出机挤出法制备的聚乳酸-石墨烯柔性线状电极分别在乙醇和纯水中超声10min后干燥。
S3、在柔性线状电极表面通过EDC/NHS活化来固定葡萄糖氧化酶。
将一定量的NHS和EDC溶解在磷酸盐缓冲液中,制备含0.08M的NHS和0.05M的EDC的混合液,将清洗过的柔性线状电极浸没在EDC/NHS混合液中,密封保存4h;
之后,将活化后的柔性线状电极浸泡到含有葡萄糖氧化酶分子的溶液中,放置18h,制得本实施例柔性电极葡萄糖酶生物传感器工作电极,如图2所示。
采用上述工作电极,以Pt片为辅助电极,以Ag/AgCl电极为参比电极,制作三电极体系。
在本实施例的柔性电极葡萄糖酶生物传感器制作完成后,通过配置标准浓度的葡萄糖溶液,对制作的传感器进行标定,具体的标定方法包括如下步骤:
F1、将Na2HPO4(0.2M)和NaH2PO4(0.2M)按一定比例混合,调节pH为6.8,加入不同质量的葡萄糖,配置成9个浓度梯度的葡萄糖溶液。
F2、检测时采用三电极电化学测量方法,通过循环伏安法测量传感器对9个浓度梯度葡萄糖溶液的响应。
F3、本实施例的循环伏安法具体参数如下:扫描电压范围为-1.0~1.0V,扫描速率为100mV/s。
经过标定后,得到的本实施例未使用DMF处理的葡萄糖酶生物传感器对不同浓度葡萄糖的循环伏安曲线和线性拟合曲线,分别如图3a、3b和图4所示,结果实现了浓度范围为100μM~12mM的葡萄糖溶液检测:其中,在葡萄糖浓度为100~500μM范围内,本实施例葡萄糖酶生物传感器的线性灵敏度为1.21mA mM-1cm-2,在葡萄糖浓度为500μM~12mM范围内,本实施例葡萄糖酶生物传感器的线性灵敏度为30.33μAmM-1cm-2。
实施例2
本实施例以一种基于柔性电极的葡萄糖酶生物传感器为例。
在本实施例中,工作电极的制备方法,包括以下步骤(图5):
A1、同实施例1的S1步骤,不同地方在于制备柔性电极基底的材料为氧化石墨烯粉末和D-聚乳酸颗粒;
A2、同实施例1的S2步骤;
A3、所制备的柔性电极先浸泡在DMF中处理10min,然后分别在乙醇和纯水中超声10min并干燥,再继续进行实施例1的步骤S3,制得本实施例工作电极;
采用上述工作电极,以Pt丝为辅助电极,以Ag/AgCl电极为参比电极,制作三电极体系。
采用与实施例1类似的方法对制作的传感器进行标定,共测量了传感器对7个浓度梯度葡萄糖溶液的响应。
经过标定后,得到的本实施例使用DMF处理的葡萄糖生物传感器对不同浓度葡萄糖的循环伏安曲线和线性拟合曲线,如图6a、6b和图7所示,实现了葡萄糖浓度范围100μM~15mM的线性检测。
实施例3
本实施例以一种基于柔性电极的尿酸酶生物传感器为例,其柔性电极上固定的酶为尿酸氧化酶,制备柔性电极基底材料为石墨烯粉末和L-聚乳酸颗粒。
本实施例在完成实施例1的S1和S2步骤后,实施S3步骤时,先用EDC/NHS活化柔性线状电极,再将其浸泡到含有尿酸氧化酶分子的溶液中,放置15h。制得本实施例的柔性电极尿酸酶生物传感器的工作电极。
采用上述工作电极,以Pt片为辅助电极,以Ag/AgCl电极为参比电极,制作三电极体系。
在本实施例的柔性电极尿酸酶生物传感器制作完成后,通过配置标准浓度的尿酸溶液,对制作的传感器进行标定,具体的标定方法包括如下步骤:
F1、将Na2HPO4(0.2M)和NaH2PO4(0.2M)按一定比例混合,调节pH为7.4,加入不同质量的尿酸,配置成9个浓度梯度的尿酸溶液。
F2、采用三电极电化学测量方法,通过循环伏安法测量传感器对9个浓度梯度尿酸溶液的响应。
F3、本实施例的循环伏安法具体参数如下:扫描电压范围为-1.0~1.0V,扫描速率为50mV/s。
经过标定后,得到的本实施例的尿酸生物传感器对不同浓度尿酸的线性拟合曲线如图8所示,实现了尿酸浓度范围10μM~1000μM的线性检测。
实施例4
本实施例以一种基于柔性电极的乙醇脱氢酶生物传感器为例。
在本实施例中,工作电极的制备方法包括:
S1、采用双螺杆挤出机制备聚乳酸和石墨烯柔性薄膜状电极
将氮掺杂石墨烯粉末和L-聚乳酸与D-聚乳酸混合物颗粒按1:20质量比混合,加入双螺杆挤出机的加料箱中,调节双螺杆挤出机挤出温度为180℃,挤出造粒,再通过单螺杆挤出吹膜机吹塑成膜,吹膜温度为180℃,吹膜膜泡由挤出头处通入空气使其吹胀冷却,然后薄膜通过人字板定型,牵引辊牵引,最后由收卷装置碾平收卷,得到本发明薄膜形状柔性电极基底,薄膜厚度为300μm。
S2、采用乙醇、纯水清洗所制备的柔性电极。
将上述制备的聚乳酸-石墨烯柔性薄膜形状电极裁剪为长5cm、宽3cm的条带,再取其中一个条带柔性电极先浸泡在DMF中处理10min,然后分别在乙醇和纯水中超声10min并干燥。
S3、在柔性线状电极表面通过EDC/NHS活化来固定乙醇脱氢酶。
将一定量的NHS和EDC溶解在磷酸盐缓冲液中,制备含0.08M的NHS和0.05M的EDC的混合液,将清洗过的柔性薄膜形状电极浸没在EDC/NHS混合液中,密封保存4h。然后将其浸泡到含有乙醇脱氢酶分子的溶液中,放置15h。制得本实施例的柔性电极乙醇脱氢酶生物传感器的工作电极。
采用上述工作电极,以碳电极为辅助电极,制作两电极体系。
在本实施例的柔性电极乙醇脱氢酶生物传感器制作完成后,通过配置标准浓度的乙醇溶液,对制作的传感器进行标定,具体的标定方法包括如下步骤:
F1、将Na2HPO4(0.2M)和NaH2PO4(0.2M)按一定比例混合,调节PH为7.9,加入不同质量的乙醇,配置成8个浓度梯度的乙醇溶液。
F2、将上述乙醇脱氢酶生物传感器用于不同浓度的乙醇溶液检测时,采用两电极电化学测量方法,通过循环伏安法测量传感器对8个浓度梯度乙醇溶液的响应。
F3、本实施例的循环伏安法具体参数如下:扫描电压范围为-0.6~0.6V,扫描速率为10mV/s。
经过标定后,得到的本实施例的乙醇脱氢酶生物传感器对不同浓度乙醇的线性拟合曲线如图9所示,实现了乙醇浓度范围100μM~15mM的线性检测。
以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解本领域的普通技术人员无需创造性劳动就可以根据本发明的构思做出诸多修改和变化。因此,凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案,皆应在权利要求书所确定的保护范围内。
Claims (1)
1.一种基于柔性电极的酶生物传感器,包括工作电极,其特征在于,所述工作电极包括柔性电极基底及固定在柔性电极基底表面的葡萄糖氧化酶,所述柔性电极基底的组成材料包括D-聚乳酸和石墨烯;
所述工作电极的制备方法,包括以下步骤:
S1将石墨烯粉末和D-聚乳酸颗粒按1:20质量比混合,加入双螺杆挤出机的加料箱中,调节双螺杆挤出机温度为200℃,50min后开始挤出柔性线状电极,设置牵引速度为5cm/min,制得柔性线状电极;
S2将柔性线状电极分别在乙醇和纯水中超声10min后干燥;
S3将步骤S2制备的柔性线状电极先浸泡在DMF中处理10min,然后分别在乙醇和纯水中超声10min并干燥;将NHS和EDC溶解在磷酸盐缓冲液中,制备含0.08M的NHS和0.05M的EDC的混合液,将清洗过的柔性线状电极浸没在EDC/NHS混合液中,密封保存4h;
之后,将活化后的柔性线状电极浸泡到含有葡萄糖氧化酶分子的溶液中,放置18h,制得所述工作电极。
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