KR101883673B1 - 요소분해효소가 고정된 실크 피브로인과 아민화된 유리탄소전극을 이용한 요소 감지장치 및 그 제조방법 - Google Patents

요소분해효소가 고정된 실크 피브로인과 아민화된 유리탄소전극을 이용한 요소 감지장치 및 그 제조방법 Download PDF

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Abstract

카바믹산 전기산화반응을 통하여 유리탄소전극을 작용기화하여 아민화된 유리탄소전극을 제조하였다. 아민화된 유리탄소전극은 요소분해효소에 의해 요소가 분해되는 과정에서 산화전류 변화를 탐지함으로써 요소를 감지하는데 이용할 수 있다. 요소분해효소를 고정한 실크 피브로인 구조체는 아민화된 GCE에 요소분해효소를 근접하게 위치시키는데 이용하였다. 제조된 생물전극 (Ur/SF/aminated GCE)은 순화 전압전류 (CV)를 이용하여 요소 감지에 사용하였다. 제조된 요소 감지 시스템은 전류와 요소농도 간에 높은 민감성과 직선의 상관관계를 보여준다. 요소분해효소로 작용기화된 실크 피브로인 막은 같은 배치에서 제조된 다른 막으로 손쉽게 교체할 수 있으며, 따라서 본 발명의 요소 감지 시스템은 휴대용 요소감지장치에 효과적으로 이용할 수 있다.

Description

요소분해효소가 고정된 실크 피브로인과 아민화된 유리탄소전극을 이용한 요소 감지장치 및 그 제조방법 {Urea sensing device using urease-immobilized silk fibroin-based aminated glassy carbon electrode}
본 발명은 요소분해효소가 고정된 실크 피브로인과 아민화된 유리탄소전극을 이용한 요소 감지장치 및 그 제조방법에 관한 것이다.
적절한 변환인자 (transducer) 상에 고정된 생물학적으로 활성인 화합물의 입체적 결합을 포함하여 생화학적 신호를 측정 가능한 전기적 신호로 변환할 수 있는 분석장치는 바이오센서로 불린다 [1]. 바이오센서 기술은 전자 분야와 생명공학의 상승적 결합에서 유래하였다 [2]. 의학적 진단부터 환경 오염물질 모니터까지에 이르는 수많은 응용분야 때문에, 바이오센싱은 최근 연구자들에게 상당한 관심을 받고 있다 [3, 4]. 이와 같은 센서에 의한 생체인식은 생물활성 매트릭스 즉, 적절한 신호 탐지기인 변환인자 (transducer)와 효소의 결합을 포함한다. 이 센서들은 정교한 민감성, 낮은 탐지한계 및 증폭된 선택성으로 인해 소형화된 탐지장치로 분류된다 [5]. 다양한 필수 분석대상 { 포도당 [6~11], 요소 [12~16] 및 아스코빅산 [17~20]을 포함}의 비정상적 수준을 정량적으로 탐지하는 것은 진보된 생물전자장치 개발에서 상당히 중요한 부분을 차지해 왔다. 인간 신체기관의 기능적 장애는 이들 분석대상물질의 비정상적인 수준과 관련이 있는 것으로 생각된다. 최근 연구에서, 인간 혈청 내 요소 농도를 정량적으로 모니터하기 위하여 요소분해효소와 결합된 유리탄소전극-기반 바이오센서가 제조되었다.
혈청 내 정상적인 요소 농도는 15 ~ 40mg/dl (또는 1.7-8.3mM) 범위이고, 혈액 내 농도는 10 ~ 50 mg/dl 범위이다. 이 범위를 벗어난 증가 또는 감소는 간부전 (hepatic failure)뿐만 아니라 쇼크, 탈수증, 위장관 출혈, 신염 증후군 및 요로 폐색 (obstruction of urinary tract)을 일으킨다 [21]. 위에서 언급한 이유로 인하여, 혈청 및 소변 내 요소 농도 측정은 수많은 신장기능부전 진단에서 중요한 임상적 위치를 차지한다 [22]. 최근, 연구자들은 혈액과 소변 시료에서, 특히 낮은 농도에서 요소 인시투 측정을 수행하기 위한 연구에 매진하고 있다.
효소 바이오센서를 제조하기 위해, 높은 작동 안정성과 전극 상에 효율적인 효소 고정화가 결정적인 이슈가 되고 있다. 특히, 효소 바이오센서의 반복 사용으로 인한 탐지 신호의 낮은 신뢰도는 가장 큰 결점 중 하나가 될 수 있다. 효소를 이용한 요소 바이오센서의 효율성과 재사용 가능성을 개선하기 위하여, 요소분해효소 고정에 알맞은 재료의 사용이 중요하다. 이 목표를 달성하기 위하여 본 발명자들은 전극 구축에 실크 피브로인을 이용하는 것을 디자인하였다. 조직 공학분야에서, 다른 기술들을 이용한 실크 피브로인-기반 다공성 구조체 제조는 그 가치를 증명해주었다. 최근까지 그러한 재료들은 탁월한 고유의 특성으로 인해 많은 생물의학분야에 응용되고 있다 [23, 24]. 바이오센서 응용에 이 재료의 사용이 널리 연구된 것은 아니지만, 그와 같은 천연 부산물은 탁월한 효소 고정화 재료로 생각된다 [25].
1. Biosensors, Trends Biochem. Sci. 9 (8) (1984) 336-340. Gronow, M. 2. Biosensors, Elsevier, New York, 1992, p. 10. F. Scheller, F. Schubert. 3. Biosensors: sense and sensibility, Chem. Soc. Rev., 2013, 42, 3184. Turner, A. P. F. 4. Biosensor technology: recent advances in threat agent detection and medicine, Chem. Soc. Rev., 2013, 42, 8733. J. Kirsch, C. Siltanen, Q. Zhou, A. Revzin and A. Simonian. 5. Recent advances in electrochemical glucose biosensors, Chem. Soc. Rev., 2013, 3, 4473. C. Chen, Q. Xie, D. Yang, H. Xiao, Y. Fu, Y. Tan and S. Yao. 6. Nonenzymatic amperometric glucose sensing of platinum, copper sulfide, and tin oxide nanoparticle-carbon nanotube hybrid nanostructures,J. Phys. Chem. C, 2009, 113, 1251-1259. Y. Myung, D. M. Jang, Y. J. Cho, H. S. Kim, J. Park, J.U. Kim, Y. Choi and C. J. Lee. 7. Nonenzymatic glucose detection using mesoporous platinum, Anal.Chem., 2003, 75, 3046-3049. S. Park, T. D. Chung and H. C. Kim. 8. Nonenzymatic amperometric response of glucose on a nanoporous gold film electrode fabricated by a rapid and simple electrochemical method, Biosens. Bioelectron.,2011, 26, 3555-3561. Y. Xia, W. Huang, J. F. Zheng, Z. J. Niu and Z. L. Li. 9. Nonenzymatic amperometric sensing of glucose by using palladium nanoparticles supported on functional carbonnanotubes, Biosens. Bioelectron., 2010, 25, 1803-1808. X. M. Chen, Z. J. Lin, D. J. Chen, T. T. Jia, Z. M. Cai, X.R. Wang, X. Chen, G. N. Chen and M. Oyamad. 10. Enzymedoped graphene nanosheets for enhanced glucose biosensing,J. Phys. Chem. C, 2010, 114, 12920-12924. S. Alwarappan, C. Liu, A. Kumar and C. Z. Li. 11. ''Plugging into enzymes'' nanowiring of redox enzymes bya gold nanoparticle, Science, 2003, 299, 1877-1881. Y. Xiao, F. Patolsky, E. Katz, J. F. Hainfeld and I. Willner. 12. Iron oxide-chitosan nanobiocomposite for urea sensor, Sensors and Actuators B 138 (2009) 572-580. Ajeet Kaushik, Pratima R. Solanki, Anees A. Ansari, G. Suman, Sharif Ahmad,Bansi D. Malhotra. 13. Nanostructured zinc oxide film for urea sensor, Materials Letters 63 (2009) 2473-2475. Azahar Ali, Anees A. Ansari, Ajeet Kaushik, Pratima R. Solanki, A. Barik, M.K. Pandey, B.D. Malhotra. 14. Andrei B. Kharitonov, Maya Zayats, Amir Lichtenstein, Eugenii Katz, Itamar Willner. 15. A novel urea biosensor based on zirconia, Thin Solid Films 519 (2010) 1187-1191. G. Sumana, Maumita Das, Saurabh Srivastava, B.D. Malhotra. 16. An amperometric urea bisosensor based on covalent immobilization of urease on N2 incorporated diamond nanowire electrode, Biosensors and Bioelectronics,56(2014)64-70. Jayakumar Shalini, Kamatchi Jothiramalingam Sankaran, Chi-Young Lee, Nyan-Hwa Tai, I-Nan Lin. 17. Voltammetry in the striatum of chronic freely moving rats: Detection of catechols and ascorbic acid, Brain Research, 1, 1981, 69-80. F Gonon, M Buda, R Cespuglio, M Jouvet. 18. 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Enzyme coated glass pH-electrode: Its fabrication and applications, Analytica Chimica Acta, 2005, 542, 157-161. Sahney, R., Puri, B.K. and Anand, S. 23. Biodegradable polymeric scaffold for musculoskeletal tissue engineering, 2001, 55, 141-150. C. Mauli Agarwal, Roert B. Ray. 24. Silk based biomaterials, 2003, 24, 401-416. Gregory H Altman, Frank Diaz, Caroline Jakuba, Tara Calabro, Rebecca L Horan, Jingsong Chen, Helen Lu, John Richmond, David L Kaplan. 25. Bombyx Mori Silk Fibroin-Based Immobilization Method for Preparation of Urea Electrode, Electroanalysis, 1992, 4, 669-672. Yao Fang, Zbengzbong Sbao, Jiaqi Deng,' and Tongyin Yu. 26. Fabrication and characterization of three-dimensional silk fibroin scaffolds using a mixture of salt/sucrose, 2014, 22, 1268, 1274. Bo Mi Moon, Dong-Kyu Kim, Hyun Jung Park, Hyung Woo Ju, Ok Joo Lee, Jung-Ho Kim, Jung Min Lee, Joong Seob Lee, Chan Hum Park. 27. Electrochemical Introduction of Amino Group to a GlassyCarbon Surface by the Electrolysis of Carbamic Acid, Journal of The Electrochemical Society, 2007, 154, F31-F35. Shunichi Uchiyama, Hiroaki Watanabe, Haruhito Yamazaki, Aiko Kanazawa. 28. Amperometric Urea Biosensor Using Aminated Glassy CarbonElectrode Covered with Urease Immobilized Carbon Sheet,Basedon the Electrode Oxidation of Carbamic Acid, Electroanalysis 19, 2007, No. 12, 1300 - 1306. Xiuyun Wang, Hiroaki Watanabe, Naoyuki Sekioka, Hiroshi Hamana, Shunichi Uchiyamaa. 29. Biomedical polymers with separation and permeation function,1988, pp 18-61. K. Atsumi, N. Nakabayashi H.Tanzawa, T. Kondou, M. Shiba, Y. Sakurai and T. Akaike. 30. Physico-chemicapl roperties of silk fibroin membrane as a biomaterial, Biomaterials, 1990, 430-434. Norihiko M, Tsukada M, Nagura M. 31. Urease immobilized on modified polysulphone membrane: preparation and properties, Biomaterials, 1995, 129-134. Poiniak G, Krajewska B, Trochimczuk W. 32. An amperometric urea biosensor based on covalent immobilization of urease onto an electrochemically prepared copolymer polyfilm, Biomaterials, 2005, 26, 3683. V. Bisht, W. Takashima, K. Kaneto. 33. Mater. Sci. Eng. C, 2011, 31, 90. T. Ahuja, D. Kumar, N. Singh, A. M. Biradar and Rajesh. 34. Biosens. Bioelectron., 2004, 20,15. Do, Y.-C. Luo and J.-S. 35. Fabrication of Nickel Oxide Nanostructures with High Surface Area and Application for Urease-based Biosensor for Urea Detection. Hien Duy Mai, Gun Yong Sung, Hyojong Yoo. 36. ACS Nano, 2012, 6, 168. R. K. Srivastava, S. Srivastava, T. N. Narayanan, B. D. Mahlotra, R. Vajtai, P. M. Ajayan and A. Srivastava. 37. Biosens. Bioelectron., 2014, 52, 196. M. Tyagi, M. Tomar and V. Gupta.
본 발명은 상기 종래 기술의 문제점을 해결하고 좀 더 간편하게 현장에서 요소 농도를 감지할 수 있는 휴대 가능한 요소 감지장치를 제공하려는 것을 목적으로 한다.
본 발명자들은 카바믹산의 전극 산화를 이용하여 요소를 탐지하는 새로운 방법을 제시한다. 바이오센서 제조에서 중요한 양상인 요소분해효소 고정화 시약으로서 실크 피브로인을 효소 지지재료로 이용하였는데, 이는 실크 피브로인이 균일한 통공 분포를 보여 높은 기계적 특성을 나타내기 때문이다. 이와 같이 제조된, 사용이 간편하고 현장 분석이 가능한 휴대용 바이오센서 장치는 좀 더 저렴하고 대량 생산이 가능하다.
카바믹산의 전기산화반응을 통하여 본 발명자들은 아민기로 유리탄소전극을 성공적으로 작용기화하여 아민화된 유리탄소전극 (GCE)을 제조하였다. 요소분해효소에 의해 요소가 분해되는 동안 일어나는 산화반응에서의 변화를 모니터함으로써 아민화된 GCE는 요소 탐지에 효과적으로 이용되었다. 아민화된 GCE의 표면 가까이에 효소를 고정하기 위하여 요소분해효소가 작용기화된 실크 피브로인 디스크를 이용하였다. 제조된 생물전극 (Ur/SF/aminated GCE)은 CV를 이용하여 요소 탐지에 성공적으로 사용되었으며, 전류와 요소 농도 사이의 직선 상관관계와 매우 높은 민감도가 관찰되었다. 한 번 측정한 후 요소분해효소가 작용기화된 실크 피브로인 디스크를 같은 배치에서 제조한 새로운 디스크로 교체하면 휴대용 요소 감지장치에 유용한 시스템을 제조할 수 있다.
본 발명은 아민화된 유리탄소전극 상에 요소분해효소가 고정된 실크 피브로인이 위치하도록 하여 생성된 요소 감지장치에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 상기 요소분해효소가 고정된 실크 피브로인의 외부와 전극이 투석막과 같은 반투막으로 싸여 있음을 특징으로 한다.
또한, 본 발명은 상기 요소 감지장치가 현장 요소농도 분석이 가능한 휴대용 장치임을 특징한다.
또한, 본 발명은 상기 실크 피브로인이 상기 유리탄소전극의 표면과 같은 형상임을 특징으로 한다.
또한, 본 발명은 상기 요소분해효소가 고정된 실크 피브로인이 교체 가능함을 특징으로 한다.
또한, 본 발명은
a) 다공성 실크 피브로인 3차원 구조체를 제조하는 단계;
b) 요소분해효소를 상기 다공성 실크 피브로인 3차원 구조체에 고정화하는 단계;
c) 유리탄소전극을 아민화하는 단계; 및
d) 상기 아민화된 유리탄소전극 표면에 상기 요소분해효소가 고정된 다공성 실크 피브로인 3차원 구조체를 위치시키는 단계;를 포함하는 요소 감지장치 제조방법에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 상기 b) 단계의 고정화를 글루타르알데하이드를 이용하여 수행함을 특징으로 한다.
또한, 본 발명은 상기 d) 단계 이후 반투막으로 실크 피브로인 3차원 구조체와 전극을 감싸는 단계;를 추가하는 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명은 상기 a)의 다공성 실크 피브로인 3차원 구조체를 염 침출법으로 제조함을 특징으로 한다.
또한, 본 발명은 상기 c) 단계를 카바믹산의 라디칼 산화반응을 이용하여 진행함을 특징으로 한다.
본 발명에 따르면, 요소분해효소로 작용기화된 실크 피브로인 막은 같은 배치에서 제조된 다른 막으로 손쉽게 교체할 수 있어 우수한 민감성을 유지할 수 있으며, 따라서 본 발명의 요소 감지 시스템은 휴대용 요소감지장치에 효과적으로 이용할 수 있다.
또한, 본 발명에 따르면, 사용이 간편하고 현장 분석이 가능한 휴대용 바이오센서 장치는 좀 더 저렴하고 대량 생산이 가능하다.
도 1은 아민화된 GCE 상에 요소분해효소를 고정화하는 것을 도식화한 것이다.
도 2는 글루타르알데하이드를 이용하여 요소분해효소를 고정시킨 실크 피브로인과 투석막을 조합하여 변형한 GCE를 확대하여 카바믹산의 전기분해를 설명하는 모식도이다.
도 3은 스캔속도 50mV/s (40 cycles)로 기록된 GCE (glassy carbon electrode)에 의해 얻어진 0.5 M 암모늄 카바메이트 수용액의 순환전압전류 (CV)이다.
도 4 왼쪽은 요소 농도 (0.1 ~ 1.1 mM)에 대한 요소분해효소/GCE 생물전극의 신호반응을 나타내며, 오른쪽은 요소 농도에 대한 요소 피크 산화전류 (ca. 1.2 V)를 나타내는 표준화 곡선이다.
도 5의 왼쪽은 PBS 용액 (0.1 M, pH 7) 내에서 요소 (0.3 ~ 2.7 mM)에 대한 요소분해효소가 결합된 아민화 GCE의 신호반응을 나타내며, 오른쪽은 산화전류를 보이는 지점 (1.2 V)에서 순환전압전류법으로 얻어진 요소의 표준화 곡선이다.
도 6은 실크 피브로인 작용기화와 관련된 단계를 도시한 모식도이다. (a) 10% 글루타르알데하이드 용액 (0.1M PBS) 내에 실크 피브로인을 한 시간 동안 침지한 후 (b) 4㎎/㎖의 요소분해효소 용액 (0.1M PBS) 내에 두 시간 동안 침지하고, (c) 실크 피브로인 패치를 건조한 후 (d) 작은 디스크 형태로 만들었다.
도 7은 서로 다른 실크 피브로인 디스크를 이용하여 얻은 표준화 곡선이다.
도 8은 (a) 아민화하지 않은 GCE와 작용기화하지 않은 실크 피브로인을 이용, (b) 아민화하지 않은 GCE와 작용기화한 실크 피브로인을 이용, (c) 아민화한 GCE와 작용기화하지 않은 실크 피브로인 이용, (d) 아민화한 GCE와 요소분해효소로 작용기화한 실크 피브로인을 이용하여 0.1M 인산완충액 (pH 7.0)에서 1mM 요소의 순환전압전류를 측정한 것이다. 반응은 전압을 +0.5 ~ +1.2V (vs. Ag/AgCl)로 50mVs-1 (40 cycles) 속도로 올려주며 기록하였다. 작은 네모는 GCE의 제작 상태 (a, b, c 또는 d)에 따른 요소 농도에 대한 전류의 표준곡선을 나타낸다.
도 9는 암모늄 카바메이트를 이용한 라디칼 산화로 GCE 표면을 아민화하는 기작을 나타낸다.
도 10은 요소를 질소로 전환하는 생물전기화학적 기작을 나타낸다 (Journal of Environmental Sciences Supplement (2009) S96-S99).
도 11은 대시간 전류법 (Chronoamperograms)을 통해 측정된 요소분해효소/실크 프로테인/아민화 전극 (0.1M, pH 7)의 요소 농도에 대한 함수로서의 응답 속도에 관한 것이고, 삽입 그림은 산화 전류 (~60초) 대 요소 농도의 상관관계를 보여 주는 보정곡선이다.
도 12 (a)는 정상상태 전위차 측정; (b)는 산화 전류 (~60초) 대 요소 농도를 보여 주는 보정곡선이다.
아래에서는 구체적인 실시예를 들어 본 발명의 구성을 좀 더 자세히 설명한다. 그러나, 본 발명의 범위가 실시예의 기재에만 한정되는 것이 아님은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 자명하다.
시약
요소분해효소 (from Canavalia ensiformis (Jack beans), 34310 units/g solid, Sigma-Aldrich), 요소 (CON2H4 , Sigma-Aldrich), 글루타르알데하이드 (C5H8O2, GradeII, 25% 수용액, Sigma-Aldrich), 암모늄 카바메이트 (NH2COONH4, 99%, Sigma-Aldrich), 인산나트륨 2염기 2수화물 (sodium phosphate dibasic dihydrate) (HNa2O4P.2H2O, 99%, Sigma-Aldrich), 인산나트륨 1염기 1수화물 (sodium phosphate monobasic monohydrate) (H2NaO4P.H2O, 99%, Sigma-Aldrich) 및 NaCl (99%, Samchun)은 구입한 상태 그대로 사용하였다. 모든 저장 용액은 각 반응 전 바로 제조하여 사용하였다. 실험에 앞서 모든 유리용기는 왕수로 세척하였다 (농축 HCl: HNO3 부피비 = 3:1). 실크 피브로인 (직경 8mm, 두께 3mm)은 요소분해효소를 고정하는 미디어로 이용하였다. 벤조일화된 투석 튜빙 (Benzoylated dialysis tubing, Sigma-Aldrich)은 요소 또는 암모니아 같은 작은 분자들이 막을 통과하여 GCE 표면에 닿을 수 있도록 하기 위해 이용하였다.
요소분해효소 고정화 실크 피브로인
본 발명에서 요소분해효소 고정용 지지체로 사용되는 실크 피브로인은 Moon et al. [26]의 방법으로 제조되었는데, 이 방법은 실크 피브로인 폴리머 용액에 염/수크로스의 혼합물을 부은 다음 세 시간 동안 60℃로 가열하여 염 침출로 3차원 실크 구조체를 제조하는 것이다. 그런 다음, 몰드와 함께 고형화된 폴리머 혼합물은 증류수에 담가 실크 피브로인 폴리머 매트릭스에 통공이 남도록 염/수크로스 입자를 제거한 후 GCE (두께 3㎜, 직경 8㎜) 직경과 같도록 작은 크기의 디스크로 만들어 건조하였다.
작은 디스크 형상의 3차원 실크 구조체에 요소분해효소를 가하여 작용기화하였는데, 상기 실크 구조체는 효소를 붙잡아두기 좋은 안정적인 미디어이다. 원하는 목표를 충족하기 위해 다공성 실크 피브로인 디스크는 10% 글루타르알데하이드 용액 (PBS 완충액 내)에 한 시간 동안 침지하였다. 표면을 0.1M PBS로 세척하여 과량의 글루타르알데하이드를 제거한 후, 디스크를 0.1M 인산 완충액 내의 4mg/mL 요소분해효소 용액에 두 시간 동안 상온에서 침지한 다음 PBS로 씻어주어 실크 피브로인 표면에 느슨하게 결합한 요소분해효소 분자를 제거하였다. 마지막으로, 이렇게 제조된 요소분해효소 고정화 실크 피브로인 디스크는 아민화 GCE의 표면에 두었고, 투석막으로 덮었다. 전해질 전도도 (electrolytic conductivity)가 없는 무정형 구조인 실크 피브로인은 카바믹산이 전해되지 않아 요소에 대해 완전히 불활성인 것으로 보인다. 실험 프로토콜의 조합과 요소 센서의 확대도를 도 2에 나타내었다.
전기화학적 특성규명
전기화학 분석장치 모델 600C 시리즈 (CH Instruments, Inc.)를 25℃ 전후의 온도에서 세 개의 전극 셀에서 전형적인 순환전압전류법 실험에 사용하였다. CV 실험 동안 전압 창은 +0.5V 내지 +1.2V 사이로 셋팅하였다. 직경 3㎜의 유리질 탄소전극 (GCE)을 전극으로 이용하였고, 백금선과 Ag/AgCl 전극을 각각 상대 전극 및 대조 전극으로 이용하였다. GCE의 표면은 연마 패드 상에서 1㎛의 다이아몬드 분말로 연마한 다음 0.05㎛의 알루미늄 분말로 연마하여 활성화하였다. 연마 후 전극 표면은 물과 에탄올로 헹구었다.
결과 1: 암모늄 카바메이트의 전극 산화
GCE는 종래 기술 [27]과 같이 아민기에 의해 작용기화되어 아민화 GCE가 되었다. 각 메카니즘이 도 1에 도시되어 있다. 변형하지 않은 GCE를 이용하여 얻은 암모늄 카바메이트 용액의 반복적인 CV가 도 3에 나타나 있다. 도 5는 전압 스캔 수가 증가함에 따라 카바믹산의 산화 전류도 증가함을 나타낸다. 아미노기 도입에 의한 유리질 탄소전극의 전기화학적 표면 개질은 전해 전류값을 증가시키는데 필요한 것으로 생각된다 [28]. 좀 더 추론하면 카바메이트의 산화 전류는 Ag/AgCl에 대해 +0.8V 이상의 전압 범위에서 점차 증가하며, 전극 전압이 Ag/AgCl에 대해 +1.1V 이상으로 증가하면 산화 전류는 현저한 증가를 보인다. 반면, Ag/AgCl에 대해 +1.3V 이상의 전압 범위를 적용하면 산화 전류는 감소하기 시작한다. 그 이유는 그처럼 높은 전압 범위에서는 그라파이트 구조의 전기산화반응으로 인하여 전극 표면이 분해되기 때문이다.
카바믹산의 전기산화로 인한 산화전류의 증가는 산화전류 증가를 나타내지 않는 0.1M 암모늄 카보네이트 용액 (pH 9.3)의 CV 측정과 비교하면 입증된다.
결과 2: 아민화된 GCE 상에 요소분해효소의 직접 고정화 및 요소 탐지
산업적 관점에서, 작동하는 전극 상에 효소를 직접 고정화하는 것은 이 단계가 감지 시스템 디자인을 소형화할 수 있고, 특히 휴대용 소형 감지장치를 제공할 수 있기 때문에 굉장한 흥미를 불러 일으킨다. 효소 기능이 작동하는 전극을 만드는 다양한 기술들 중 가교제 (예컨대 글루타르알데하이드 등)를 이용하는 화학적 접근방법은 효소가 가교제와 공유결합을 형성함으로써 안정적으로 고정화될 수 있기 때문에 가장 확실한 해결방안인 것으로 보인다. 본 발명에서는 아민화된 GCE 상의 아민기와 요소분해효소를 이용할 수 있으므로 글루타르알데하이드를 사용하여 C=N 결합을 형성함으로써 요소분해효소를 아민화 GCE에 화학적으로 고정하였다 (도 1). 이와 같이 제조된 요소분해효소가 고정된 아민화 GCE (Urs/GCE)가 요소를 잘 감지하는지를 알아보기 위하여 CV 기술을 이용하였다. 도 2A와 같이, 요소분해효소에 의하여 요소가 분해되면서 생성되는 요소 중간산물의 산화 전류는 PBS 용액 내에서 요소 농도가 0.1 ~ 1.1 mM로 증가함에 따라 계속 증가하였다. 1.2V에서 요소 농도와 산화 전류의 양 간의 표준화 곡선은 탁월한 직선의 상관관계를 보여준다 (R2 = 0.9931, 도 4 우측):
피크 전류 (μA) = 95.69 × 요소 농도 (mM) + 70.73 (수학식 1)
결과 3: 실크 피브로인 구조체와 투석막을 이용한 바이오전극 제조
실크 피브로인을 외과적 봉합재료로서 생물의학적으로 응용하는 사례가 확대되고 있는데, 이는 실크 피브로인의 생물적합성 때문이다. 실크 피브로인의 수증기 투과성, 산소 투과성, 효소에 의핸 분해성, 투명하고 탁월한 기계적 특성과 같은 독특한 물리화학적 성질로 인하여 이 생물재료는 인공각막, 콘택트렌즈, 인공폐 및 화상 드레싱 등으로 이용되고 있다 [29, 30].
탁월한 효소 고정화 재료로서 실크 구조체의 이용은 합리적인 반응 시간, 우수한 민감성, 탁월한 재사용성 및 우수한 열안정성과 같은 특별한 장점을 발휘한다. 이와 같은 효소 고정화 시스템은 효소의 인비보 결합 모델 시스템을 제공하는데, 그리하여 고정되지 않은 효소와 비교하여 좀 더 안정적이고 경제적으로 합리적이며 재사용 가능한 대안을 제공한다 [31].
실크 피브로인에 고정된 요소분해효소를 아민화 GCE에 결합시킨 Urs/SF/아민화 GCE를 제조하기 위하여, 먼저 작은 디스크 형태의 실크 피브로인을 10% 글루타르알데하이드 용액 (in PBS)으로 한 시간 동안 작용기화하였다. 0.1M PBS 표면을 씻어내어 과량의 글루타르알데하이드를 제거하였다. 디스크는 0.1M 인산 완충액 내의 4㎎/㎖ 요소분해효소 용액에 상온에서 두 시간 동안 침지한 후 PBS로 씻어내어 느슨하게 결합한 요소분해효소 분자들을 표면에서 제거하였다. 마지막으로, 이와 같이 제조된 요소분해효소 고정화 실크 피브로인 디스크를 아민화된 GCE의 표면에 위치하도록 하고 투석막으로 씌웠다. 투석막은 요소 및 암모니아와 같은 작은 분자들은 투과시키지만 요소분해효소 분자와 같이 큰 분자들은 투과시키지 않는 것으로 알려져 있다.
결과 4: Ur / SF / 아민화 GCE 의 전기화학적 반응
도 5에서, 요소 농도 함수로서 Ur/SF/아민화 GCE의 반응을 측정하기 위해 순환전류전압 (CV)을 나타내었다. 도 5 (a)와 같이, 요소분해효소에 의하여 요소가 분해되면서 생성되는 요소 중간산물의 산화 전류는 PBS 용액 내에서 요소 농도가 0.3 ~ 2,7 mM로 증가함에 따라 상대적으로 높은 민감도 (112.3 μA mM- 1 cm-2) 를 보이며 계속 증가하였다. 1.2V에서 요소 농도와 산화 전류의 양 간의 표준화 곡선은 탁월한 직선의 상관관계를 보여준다 (R2 = 0.99405, 도 5 우측).
전극 표면에서 일어나는 제안된 반응 기작은 도 10에 나타내었다. 생화학적 반응이 일어나는 동안, 실크 피브로인 (SF)에 고정된 요소분해효소 (Urs)는 전기활성 중간체인 카바믹산을 형성하며 요소를 암모니아 (NH3)와 이산화탄소 (CO2)로 분해하는 반응을 촉매하는데, 반면 최종 산물은 전기불활성 물질인 것으로 생각된다. 따라서, 효소반응 동안 관찰되는 산화전류 반응은 오로지 중간체 산물의 전기촉매작용에 의한 것이다. 전기분해 동안 요소의 최종 전극반응산물 중 하나는 질소인 것으로 확인되었다. 나아가, 카바믹산은 3 전자 산화로 질소와 이산화탄소를 형성하는 것으로 추측할 수 있다.
요소 감지 측정결과의 신뢰도를 나타내기 위하여, 도 7은 동일한 배치에서 제조한 다른 실크 피브로인 디스크를 이용하여 얻은 표준화 그래프 (calibration plot)를 비교한 것이다. 매번 실크 피브로인 디스크를 새것으로 교체하여 얻은 결과는 거의 일관성을 나타내었다.
요소분해효소가 고정된 실크 피브로인이 결합된 아민화된 GCE 상의 전기활성종 (I*)의 표면 농도는 요소농도의 함수로 작성한 산화 피크 전류의 기울기로부터 계산할 수 있고, 피크 전류 (I)는 다음의 회귀방정식으로 계산할 수 있다.
피크 전류 (μA) = 112.3 × 요소 농도 (mM) + 14.33 (수학식 2)
Figure 112016102371780-pat00001
상기 식에서 R은 일반기체상수 (8.314 J mol-1 K-1)를 나타내며, T는 온도 (300K), n은 이동한 전자의 수, F는 패러데이 상수 (96485 C mol-1), S는 GCE의 기하학적 표면적 (0.07 ㎠), v는 스캔 속도를 나타낸다. 1mM 요소 농도에 대한 피크 전류값을 계산하고 세 개의 전자가 이동했다고 가정한 결과, 얻어진 전기활성종 (I*)의 표면 농도는 4.55 × 10-6 mol m-2이다.
도 8에서, 1mM 요소용액에 대한 CV는 GCE의 변형 패턴, 즉 (a) 아민화되지 않은 GCE와 작용기화되지 않은 실크 피브로인, (b) 아민화되지 않은 GCE와 작용기화 된 실크 피브로인, (c) 아민화된 GCE와 작용기화되지 않은 실크 피브로인, (d) 아민화된 GCE와 작용기화된 실크 피브로인에 따라 달라지는 것으로 나타났다. 반응은 0.1M 인산 완충액 내에서 전압을 0.5 ~ 1.2V (vs. Ag/AgCl)로, 속도 50mVs-1 (40 cycles)로 올리면서 기록하였다. 요소 가수분해에 대한 40번째 CV 전류는 적용한 전압 (vs. Ag/AgCl)에 대하여 그래프로 나타내었다.
아민화되지 않은 GCE와 작용기화되지 않은 실크 피브로인으로 만들어진 전극에서 산화 피크가 없는 것 (도 8의 a)은 아민화되지 않은 GCE 표면에서 산화가 일어나지 않았기 때문이다. 이와 반대로, 아민화되지 않은 GCE와 작용기화된 실크 피브로인으로 제조된 전극에서 CV는 카바믹산 산화에 해당하는 약 +1.2V에서 약한 산화 피크를 보인다. 따라서, 아민화된 GCE를 사용하면 요소분해효소로 작용기화된 실크 피브로인의 제조와 상관없이 동일한 용액 내에서 요소 가수분해의 산화반응이 아민화되지 않은 GCE에서보다 훨씬 커진다고 추론할 수 있다. 이는 아민화를 통하여 GCE 표면에서 새로운 산화 활성부위가 생성되기 때문이라고 할 수 있다.
도 8의 c와 d를 비교하면, 아민화된 GCE는 실크 피브로인이 작용기화되지 아ㅎ았지만 매우 높은 산화반응을 나타낸다. 그러나, 용액에 요소를 가하여도 산화전류에 영향을 주지 않는데, 이는 요소분해효소가 없기 때문에 요소 가수분해가 일어나지 않아 전류값이 증가하지 않는다고 추측할 수 있다.
요소의 분해는 CV 측정중 완전히 비활성화되므로 안정적이고 신뢰할 수 있는 전류 응답을 얻기 위해 15-20분의 긴 소요시간이 필요하다. 안정적 상태에서 전극의 대응시간을 조사하기 위해 일정한 확률로 1.2V의 전위차 측정 (amperometry)을 수행하였다. 정기적인 시간 간격을 두고 요소를 추가함으로써, 산화 전류의 증가가 관찰되었다. 대시간 전류법 (Chronoamperograms, 이중 전위 단계 대시간 전류법 측정; double-potential step amperometry) 실험결과 자극을 통해 전극 전반에 걸쳐 빠르게 확산되어 짧은 반응시간 동안 안정적인 신호가 관찰되었다. 요소 추가 약 1분 후 거의 안정적인 신호가 얻어졌다. 각 요소 농도에 대한 보정곡선은 0.5~3.5 mM 범위 (도 11)의 산화전류와 요소 농도 사이에 훌륭한 선형 관계를 보여준다. CV와 비교할 때, 전위차 측정시 관찰된 선형 감지 범위는 더 넓고, 반응 시간은 상당히 짧아진다. 요소분해효소/실크피브로인/아민화 GCE의 신속한 검출기 반응을 평가하기 위하여 단일 전위단계 대시간 전류법 측정 (Single-potential step amperometry)도 수행하였다 (도 12 (a)). 연속적으로 일정량의 요소를 가하면, 분석대상을 가한지 약 1분 후에 산화 전류가 지속적으로 증가하였다. 0.3~8.4 mM 요소 (도 12 (b))의 농도 범위에서 104.3 μA mM-1cm-2의 충분히 높은 감도 값을 얻을 수 있었다.
Figure 112016102371780-pat00002

Claims (10)

  1. 아민화된 유리탄소전극의 표면 또는 아민화된 유리탄소전극에 근접하여 요소분해효소가 고정된 실크 피브로인 지지체가 위치하며,
    상기 요소분해효소가 고정된 실크 피브로인 지지체는 교체 가능하며,
    요소분해효소가 고정된 실크 피브로인 지지체와 유리탄소전극은 반투막으로 싸여 있고,
    전기화학 분석장치에 연결하여 시료 내의 요소를 탐지하는 휴대용 요소 감지장치.
  2. 청구항 1에 있어서,
    상기 실크 피브로인은 상기 유리탄소전극의 표면과 같은 형상임을 특징으로 하는 휴대용 요소 감지장치.
  3. a) 염 침출법으로 다공성 실크 피브로인 3차원 구조체를 제조하는 단계;
    b) 요소분해효소를 상기 다공성 실크 피브로인 3차원 구조체에 고정화하는 단계;
    c) 유리탄소전극에 카바믹산을 가하여 라디칼 산화반응을 이용하여 유리탄소전극을 아민화하는 단계;
    d) 상기 아민화된 유리탄소전극 표면에 상기 요소분해효소가 고정된 다공성 실크 피브로인 3차원 구조체를 위치시키는 단계; 및
    e) 상기 d) 단계 이후 반투막으로 실크 피브로인 3차원 구조체와 전극을 감싸는 단계;를 포함하는, 요소분해효소가 고정된 다공성 실크 피브로인 3차원 구조체를 교체할 수 있고 휴대 가능한 요소 감지장치 제조방법.
  4. 청구항 3에 있어서,
    상기 b) 단계의 고정화는 글루타르알데하이드를 이용하여 수행함을 특징으로 하는 휴대 가능한 요소 감지장치 제조방법.
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