CN112481248A - 一种聚氨酯纳米纤维膜固定化酶及其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种聚氨酯纳米纤维膜固定化酶及其制备方法与应用，由柚苷酶和聚氨酯纳米纤维载体组成，包括如下步骤：（1）用静电纺丝制备聚氨酯纳米纤维膜；（2）将聚氨酯纳米纤维膜加入到柚苷酶溶液中，晾干备用；（3）将晾干的聚氨酯纳米纤维膜加入到海藻酸钠溶液中，晾干备用；（4）重复步骤（2）和（3）即可。本发明采用层层自组装法，制备的固定化酶机械性能好，在一定PH，温度范围内能保持较高酶活性，对柚子果汁中苦味物质具有良好的脱苦效果，制备工艺简单。固定化酶可用于脱除果汁中的苦味物质，相较于游离酶可多次重复利用降低生产成本，便于与底物分离，储存稳定性好，在食品加工领域具有良好的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及食品加工领域，具体地说，涉及一种聚氨酯纳米纤维膜固定化酶。
背景技术
柚苷酶在食品行业、医药领域等具有重要的应用价值，它不仅在柚柑类水果加工以及给食品增添香味中发挥作用，还可以用于生产抗生素、生物转化类固醇和皂苷等。在使用过程中，游离柚苷酶会对周围环境更为敏感，在极端pH值、温度等因素的作用下容易失活，因此游离柚苷酶在果汁脱苦过程中存在耐受性差的问题，而使用后不可回收重复利用、与果汁难以分离等问题，造成资源浪费，增加成本。而固定化柚苷酶一方面可以使得酶保持着高效性、稳定性和活性，另一方面又可以方便使用后的回收再度利用，降低生产成本。载体的材质直接影响固定化酶催化底物的活性，构造性能优越的酶固定载体一直是固定化酶领域的研究热点。随着纳米材料的兴起，研究者们尝试用纳米级载体固定化酶，通过静电纺丝技术制备的纳米纤维膜具有孔隙率高，比表面积大，便于改性等优点而受到研究者们的青睐，能够有效的提高载酶量和酶活性，纳米纤维膜也很容易从反应体系中分离回收，提高其可重复利用率，降低生产成本。
发明内容
发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种多层可控、负载量大、稳定性高的聚氨酯纳米纤维膜固定化酶及其制备方法。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种聚氨酯纳米纤维膜固定化酶，由柚苷酶和聚氨酯纳米纤维载体组成。
上述聚氨酯纳米纤维膜固定化酶的制备方法，包括如下步骤：
(1)用静电纺丝制备聚氨酯纳米纤维膜：在18～24kV的静电压，纺丝针头距离接收滚筒18～24cm的条件下，将电纺溶液以0.3～0.5ml·h-1流速纺丝，即得聚氨酯纳米纤维膜；其中，所述的电纺溶液的质量分数为10％～14％；
其中，所述的电纺溶液是由10～14重量份的聚氨酯和86～90重量份的溶剂组成，所述溶剂由体积比为67:33的N,N-二甲基甲酰胺和丙酮组成。室温下于磁力搅拌器上搅拌24h；在pH为4的条件下，聚氨酯纳米纤维膜表面带负电荷。
(2)将聚氨酯纳米纤维膜加入到柚苷酶溶液中，置于恒温摇床振荡后取出用去离子水冲洗，晾干备用；其中，柚苷酶溶液的pH为4，浓度为1～2mg/ml，振荡时间为20～60min；在pH为4，浓度为1～2mg/ml的条件下，柚甘酶溶液带正电荷。
(3)将晾干的聚氨酯纳米纤维膜加入到海藻酸钠溶液中，置于恒温摇床振荡后取出用去离子水冲洗，晾干备用；其中，海藻酸钠溶液的pH为4，浓度为1～2mg/ml，振荡时间为20～60min；在pH为4，浓度为1～2mg/ml的条件下，海藻酸钠溶液带负电荷。
(4)重复步骤(2)和(3)即可制备得到聚氨酯纳米纤维膜固定化酶。
利用上述聚氨酯纳米纤维膜固定化酶对柚子果汁中苦味物质进行脱苦的方法，包括如下步骤：向聚氨酯纳米纤维膜固定化酶中加入柚皮苷反应液并控制反应液的pH为3～7、反应时间为30min～150min、反应温度为30℃～70℃，充分反应后测量柚皮苷的含量。
反应机理：聚氨酯纳米纤维膜作为载体，其孔隙率高、比表面积大、可以减少酶分子在纤维上的扩散阻力；在PH为4的条件下，聚氨酯纳米纤维膜表面带负电荷，柚苷酶带正电荷，海藻酸钠带负电荷，以聚氨酯纳米纤维膜为基底材料，将柚苷酶和海藻酸钠通过静电作用交替包覆在聚氨酯纳米纤维膜上。这种可控式的固定化方法使得载体的酶载量是可调控的，随着交替包覆层数的增加，载体的载酶量随之增加。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
1、本发明提供的聚氨酯纳米纤维膜固定化酶，以聚氨酯纳米纤维膜作为载体，能够利用纳米纤维高孔隙率、大比表面积的特性，与酶亲合力高，通过静电吸附法与酶分子结合，将酶分子层层包覆在纤维载体上，这种方法对酶活的影响小，有利于酶活的保持，同时能够有效改善固定化酶传质阻力大、酶分子易脱落等缺点，显著提高固定化酶的负载量、催化活性与稳定性。
2、采用“层层自组装法”以聚氨酯纳米纤维膜为基底材料，将柚苷酶和海藻酸钠交替包覆在聚氨酯纳米纤维膜上。该方法制备的固定化酶机械性能好，在一定pH，温度范围内能保持较高酶活性，对柚子果汁中苦味物质具有良好的脱苦效果，制备工艺简单，随着柚苷酶与海藻酸钠交替包覆的层数增加，固定化酶载酶量及酶活性也随之增大，载酶量和酶活性具有一定可控性。固定化酶可用于脱除果汁中的苦味物质，相较于游离酶可多次重复利用降低生产成本，便于与底物分离，储存稳定性好，在食品加工领域具有良好的应用前景。
附图说明
图1为制备该聚氨酯纳米纤维膜固定化酶的流程图(A)以及原理图(B)。
具体实施方式
实施例1：
聚氨酯纳米纤维膜固定化酶的制备方法，包括以下步骤：
(1)采用静电纺丝方法制备聚氨酯纳米纤维膜：电纺溶液是由10g聚氨酯，90g体积比为67:33的N,N-二甲基甲酰胺和丙酮组成，室温下于磁力搅拌器上搅拌24h，在20kV的静电压下，纺丝针头距离接收滚筒20cm的条件下，用注射泵精确控制电纺溶液以0.3ml·h-1流速纺丝，即得聚氨酯纳米纤维膜。在pH为4的条件下，聚氨酯纳米纤维膜表面带负电荷。
(2)将聚氨酯纳米纤维膜置于浓度为1mg/ml柚苷酶溶液中，放入恒温摇床振荡20min后取出用去离子水冲洗，晾干备用；在pH为4，浓度为1mg/ml的条件下，柚苷酶溶液带正电荷。
(3)将晾干的聚氨酯纳米纤维膜加入到浓度为1mg/ml海藻酸钠溶液中，置于恒温摇床振荡20min后取出用去离子水冲洗，晾干备用；在pH为4，浓度为1mg/ml的条件下，海藻酸钠溶液带负电荷。
(4)重复步骤(2)和(3)即可得到一种多层可控的聚氨酯纳米纤维膜固定化酶。
所述柚苷酶溶液为柚苷酶溶于0.2mol/L的HAc-NaAc缓冲液中。海藻酸钠溶液为海藻酸钠溶于去离子水中。
经检测，包覆5层柚苷酶后，酶负载率为75％，负载量206mg·g-1。
酶蛋白质含量测定采用Bradford法测定，以牛血清蛋白为标准蛋白。分光光度计检测负载前后溶液以及清洗液中的蛋白含量C0、C1、C2，计算出固定在载体聚氨酯纳米纤维膜上的酶蛋白量，得到酶蛋白的负载率和负载量。
式中M是载体聚氨酯纳米纤维膜的质量(g)，V0表示原始酶溶液的体积(ml)，V1表示负载后酶溶液的体积，V2表示清洗酶膜所用溶液的体积(ml)。
对比例1：方法步骤同实施例1，但是包覆1层柚苷酶后，得到的固定化酶酶负载率和负载量分别是32％和84mg·g-1。
方法步骤同实施例1，但是包覆3层柚苷酶后，得到的固定化酶酶负载率和负载量分别是57％和135mg·g-1。
实施例2：
聚氨酯纳米纤维膜固定化酶的制备方法，包括以下步骤：
(1)采用静电纺丝方法制备聚氨酯纳米纤维膜：电纺溶液是由12g聚氨酯，88g体积比为67:33的N,N-二甲基甲酰胺和丙酮组成，室温下于磁力搅拌器上搅拌24h，在22kV的静电压下，纺丝针头距离接收滚筒22cm的条件下，用注射泵精确控制电纺溶液以0.4ml·h-1流速纺丝，即得聚氨酯纳米纤维膜。在pH为4的条件下，聚氨酯纳米纤维膜表面带负电荷。
(2)将聚氨酯纳米纤维膜置于浓度为1.5mg/ml柚苷酶溶液中浸泡40min后取出用去离子水冲洗，晾干备用；在pH为4，浓度为1.5mg/ml的条件下，柚苷酶溶液带正电荷。
(3)将晾干的聚氨酯纳米纤维膜置于浓度为1.5mg/ml海藻酸钠溶液中浸泡40min后取出用去离子水冲洗，晾干备用；在pH为4，浓度为1.5mg/ml的条件下，海藻酸钠溶液带负电荷。
(4)重复步骤(2)和(3)即可得到一种多层可控的聚氨酯纳米纤维膜固定化酶。
所述柚苷酶溶液为柚苷酶溶于0.2mol/L的HAc-NaAc缓冲液中。海藻酸钠溶液为海藻酸钠溶于去离子水中。
经检测，包覆5层柚苷酶后，酶负载率为82％，负载量229mg·g-1。
对比例2：方法步骤同本实施例2，但是包覆1层柚苷酶后，得到的固定化酶酶负载率和负载量分别是43％和105mg·g-1。
方法步骤同本实施例2，但是包覆3层柚苷酶后，得到的固定化酶酶负载率和负载量分别是66％和161mg·g-1。
实施例3：
聚氨酯纳米纤维膜固定化酶的制备方法，包括以下步骤：
(1)采用静电纺丝方法制备聚氨酯纳米纤维膜：电纺溶液是由14g聚氨酯，86g体积比为67:33的N,N-二甲基甲酰胺和丙酮组成，室温下于磁力搅拌器上搅拌24h，在24kV的静电压下，纺丝针头距离接收滚筒24cm的条件下，用注射泵精确控制电纺溶液以0.5ml·h-1流速纺丝，即得聚氨酯纳米纤维膜。在pH为4的条件下，聚氨酯纳米纤维膜表面带负电荷。
(2)将聚氨酯纳米纤维膜置于浓度为2mg/ml柚苷酶溶液中浸泡60min后取出用去离子水冲洗，晾干备用；在pH为4，浓度为2mg/ml的条件下，柚苷酶溶液带正电荷。
(3)将晾干的聚氨酯纳米纤维膜置于浓度为2mg/ml海藻酸钠溶液中浸泡60min后取出用去离子水冲洗，晾干备用；在pH为4，浓度为2mg/ml的条件下，海藻酸钠溶液带负电荷。
(4)重复步骤(2)和(3)即可得到一种多层可控的聚氨酯纳米纤维膜固定化酶。
所述柚苷酶溶液为柚苷酶溶于0.2mol/L的HAc-NaAc缓冲液中。海藻酸钠溶液为海藻酸钠溶于去离子水中。
经检测，包覆5层柚苷酶后，酶负载率为78％，负载量210mg·g-1。
对比例3：方法步骤同本实施例3，但是包覆1层柚苷酶后，得到的固定化酶酶负载率和负载量分别是38％和103mg·g-1。
方法步骤同本实施例3，但是包覆3层柚苷酶后，得到的固定化酶酶负载率和负载量分别是60％和149mg·g-1。
利用本发明聚氨酯纳米纤维膜固定化酶(包覆5层柚苷酶后)对柚子果汁中苦味物质进行脱苦并考察在不同条件下的脱苦率及酶活性。而且对不同包覆层数下固定化酶的酶活性以及固定化酶(包覆5层柚苷酶后)的储存稳定性进行了考察。向聚氨酯纳米纤维膜固定化酶中加入柚皮苷反应液并控制反应液的pH、反应时间和反应温度，反应完成后测量反应液中柚皮苷的含量，脱苦率及相对酶活力计算如下：
式中a是反应前反应液中柚皮苷的含量(g·L-1)，b是反应后反应液中柚皮苷的含量(g·L-1)。
柚苷酶酶活力(U)的定义：在pH＝4、50℃条件下，每分钟降解1μg柚皮苷所需的酶量为一个酶活力单位。酶比活力(U·g-1)的定义：在pH＝4、50℃条件下，1g固定化柚苷酶(或1g游离柚苷酶)所表现出的酶活力。相对酶活力按下式计算：
相对酶活力/％＝酶活力/最高酶活力×100
其中，所述的柚皮苷反应液反应前的含量为0.8g·L-1，pH为3～7，反应时间为30min～150min，反应温度为30℃～70℃。
1.底物反应液pH对脱苦率及酶活性的影响
控制反应温度在50℃；反应时间为60min；分别用pH为3.0、4.0、5.0、6.0和7.0的HAc-NaAc缓冲液溶解柚皮苷，考察底物反应液pH对脱苦率及酶活性的影响，结果见表1，其中，柚皮苷浓度利用Davis法测定。
表1底物反应液pH对固定化酶脱苦率及酶活性的影响
其中，柚皮苷浓度利用Davis法测定。
由表1可知，游离柚苷酶和固定化柚苷酶的酶活力均先上升后下降，且同时在pH为4时酶活力达到最大值。然而在pH值在2-4和4-6之间时，固定化柚苷酶的酶活力均高于游离柚苷酶的酶活力，说明经固定化后的酶pH稳定性得到了提高。
2.底物反应时间对脱苦率及酶活性的影响
控制反应温度为50℃；反应液pH为4；反应时间分别控制在30min、60min、90min、120min和150min。考察底物反应时间对固定化酶脱苦率及酶活性的影响。结果见表2。
表2底物反应时间对脱苦率及酶活力的影响
由表2可知，在脱苦时间为30min时，固定化柚苷酶的酶活性反而比游离酶低，这可能是受载体影响，酶与底物接触需要经过一段传质通道，因而刚开始的时候固定化酶酶活性会低于游离酶。随着时间的增加，柚苷酶与柚皮苷越来越充分的接触，使得催化效果越好，因此固定化柚苷酶的酶活力也逐渐增加，直至催化反应时间为90min时，酶活性达到最大值。而游离酶在催化时间为60min时达到最大酶活力后，随着时间推移，酶活力逐渐下降，可能是因为游离状态的酶操作稳定性不佳，因而随时间的延长酶活性呈自然下降趋势。
3.反应温度对脱苦率及酶活性的影响
底物反应液pH为4；底物反应时间为90min；控制反应温度分别为30℃、40℃、50℃、60℃和70℃时，考察反应温度对固定化酶脱苦率及酶活性的影响。反应完成后取样分析，结果见表3。
表3反应温度对脱苦率及酶活力的影响
由表3可知，游离柚苷酶和固定化柚苷酶的酶活力均先上升后下降，且同时在温度为50℃时具有最高酶活力。然而在30-50℃和50-70℃时，固定化柚苷酶的酶活力均高于游离柚苷酶的酶活力，说明经固定化后的酶温度稳定性得到了提高。
4.不同包覆层数对酶活性的影响
控制底物反应液pH为4；底物反应时间为90min，反应温度为50℃时，考察不同包覆层数对酶活性的影响。反应完成后取样分析，结果见表4。
表4不同包覆层数对酶活性的影响
| 包覆层数 | 1 | 3 | 5 | 7 | 9 |
| 酶活力(U·g<sup>-1</sup>) | 10132.86 | 13750.45 | 15209.18 | 16189.41 | 17597.53 |
由表4可知，随着柚苷酶包覆层数的增加，固定化酶酶活性随之增加。
5.聚氨酯纳米纤维膜固定化酶的储存稳定性考察
底物反应液pH为4；底物反应时间为90min，反应温度为50℃，考察-20℃储存的聚氨酯纳米纤维膜固定化酶(包覆5层柚苷酶后)的催化活性。每5天取样分析，结果见表。
表5聚氨酯纳米纤维膜固定化酶的储存稳定性考察
| 天数 | 0 | 5 | 10 | 15 | 20 | 25 | 30 |
| 相对酶活力(％) | 100 | 93 | 89 | 84 | 80 | 78 | 72 |
表5结果表明，以聚氨酯纳米纤维膜固定化酶制备的固定化酶，储藏稳定性好，-20℃储藏30天后，仍保留72％的酶活。
综上，本发明制备的聚氨酯纳米纤维膜固定化酶机械性能好，在一定pH，温度范围内能保持较高酶活性，对柚子果汁中苦味物质具有良好的脱苦效果，制备工艺简单，随着柚苷酶与海藻酸钠交替包覆层数的增加，固定化酶的负载量及酶活性也随之增大，负载量和酶活性具有一定可控性。且便于与底物分离，储存稳定性好，在食品加工领域具有良好的应用前景。
Claims (4)
1.一种聚氨酯纳米纤维膜固定化酶，其特征在于：由柚苷酶和聚氨酯纳米纤维载体组成。
2.权利要求1所述聚氨酯纳米纤维膜固定化酶的制备方法，其特征在于包括如下步骤：
（1）用静电纺丝制备聚氨酯纳米纤维膜：在18～24kV的静电压，纺丝针头距离接收滚筒18～24cm的条件下，将电纺溶液以0.3～0.5ml·h-1流速纺丝，即得聚氨酯纳米纤维膜；其中，所述的电纺溶液的质量分数为10%～14%；
（2）将聚氨酯纳米纤维膜加入到柚苷酶溶液中，置于恒温摇床振荡后取出用去离子水冲洗，晾干备用；其中，柚苷酶溶液的pH为4，浓度为1～2mg/ml，振荡时间为20～60min；
（3）将晾干的聚氨酯纳米纤维膜加入到海藻酸钠溶液中，置于恒温摇床振荡后取出用去离子水冲洗，晾干备用；其中，海藻酸钠溶液的pH为4，浓度为1～2mg/ml，振荡时间为20～60min；
（4）重复步骤（2）和（3）即可制备得到聚氨酯纳米纤维膜固定化酶。
3.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述的电纺溶液是由10～14重量份的聚氨酯和86～90重量份的溶剂组成，所述溶剂由体积比为67:33的N,N-二甲基甲酰胺和丙酮组成。
4.利用权利要求1所述聚氨酯纳米纤维膜固定化酶对柚子果汁中苦味物质进行脱苦的方法，其特征在于包括如下步骤：向聚氨酯纳米纤维膜固定化酶中加入柚皮苷反应液并控制反应液的pH为3～7、反应时间为30min～150min、反应温度为30℃～70℃，充分反应后测量柚皮苷的含量。
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