CN105013453A - 一种可用于提取溶菌酶的阴离子骨架聚合物及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明是关于一种阴离子骨架聚合物和其制备方法及在溶菌酶提取中的应用。利用现有的密胺海绵特有的三维骨架结构，将壳聚糖涂层包覆在骨架上，再通过二甘醇缩水甘油醚与壳聚糖涂层反应，使其交联并在表面携带悬挂的环氧基团，然后利用环氧基团与亚硫酸氢钠反应生成磺酸根阴离子，在溶菌酶提取中的离子交换环节，以阴离子骨架聚合物为整体性柱子进行提纯操作，使材料表面与溶菌酶发生静电相互作用，这样能克服溶菌酶大分子扩散能力差的缺点，提高材料的吸附能力，从而提高溶菌酶的生产效率，这种骨架材料的优点是：操作简单方便，能够重复使用，成本低，效率高。

Description

一种可用于提取溶菌酶的阴离子骨架聚合物及其制备方法
技术领域
本发明涉及生物活性物质提取技术领域，尤其是一种利用阴离子骨架聚合物快速、高效提取溶菌酶的方法及该聚合物材料的制备方法。 
背景技术
溶菌酶是一种专门作用于微生物细胞壁的水解酶，它能切断肽聚糖中N-乙酰葡萄糖胺和N-乙酰胞壁酸之间的β-1，4-糖苷键之间的联接，破坏肽聚糖支架，使细胞壁开裂，引起细菌裂解，因而是一种非常有效的抗菌剂。溶菌酶可作为水产类熟制品和肉类熟制品的防腐保鲜剂，在糕点中以及在pH6.0～7.5的饮料、果汁中加入溶菌酶也可防止微生物繁殖。溶菌酶具有破坏细菌细胞壁结构的功能，以此酶处理革兰阳性细菌得到原生质体，因此，溶菌酶是基因工程、细胞工程、发酵工程中比不可少的工具酶，生物工业的发展对溶菌酶的需求量将与日俱增。 
溶菌酶是一种碱性的球蛋白，等电点高达10.7～11.0，分子内有4个二硫键交联，化学性质非常稳定，对热也极为稳定，当pH在1.2～11.3范围内剧烈变化时，其结构几乎不变。溶菌酶广泛存在于鸟类和家禽的蛋清中，鸡蛋清中含有0.3％的溶菌酶，含量最为丰富，蛋壳膜上也有存在，含量要低一些，所以，鸡蛋白、蛋壳是提取溶菌酶的最好原料。在溶菌酶的提取中充分利用其带正电荷的特点，使用离子交换法就可以获得溶菌酶。离子交换法必须要使用一种带负电荷的多孔固体材料，传统上使用高分子阳离子交换树脂，如724树脂、D-201树脂，这些材料的缺点是孔径较小，溶菌酶作为一种大分子阳离子，其在液相中的扩散速率远低于金属离子，这些本来用于交换金属离子的树脂，若用于交换大分子离子就显得不太合适，在粘性液体中的交换速率和效率都成问题。本发明提供一种三维骨架结构的高分子材料，如图1所示，其孔径达到100μm，材料表面带有负电荷，所以非常适合于交换大分子量的溶菌酶，采用过柱子的方法明显提高离子交换的效率和速率，有利于提高溶菌酶的生产效率。 
发明内容
本发明所要解决的首要技术问题是针对现有离子交换法从鸡蛋清提取溶菌酶过程中存在离子交换树脂孔径较小的问题提供一种阴离子骨架聚合物，它具有三维网络结构 和100微米的贯通孔道，其表面带有大量的负电荷，它能快速被有粘性的蛋清所浸润，最大限度的吸附溶菌酶分子，避免因扩散速率问题影响吸附效率和速率，并能很容易将吸附物质洗脱，实现材料的多次循环使用，提高溶菌酶的生产效率。 
本发明所要解决的另一个技术问题是提供上述阴离子骨架聚合物的制备路线与方法，它切实可行，操作简便，易于大量制备。 
本发明所要解决的再一个技术问题是提供一种上述阴离子骨架聚合物在溶菌酶提取中的具体应用。 
1、本发明解决首要技术问题所采用的技术方案为：一种阴离子化的三维骨架聚合物，其结构具有如图1所示的特征，骨架之间包含约100μm的互相连通的孔道，骨架的尺寸最小处为5μm左右，骨架之间通过共同点连接，构成三维连续的网络结构。 
非常有益的是，上述的三维骨架聚合物表面带有大量的并且具有一定游离程度的磺酸根负离子基团，既有很强的亲水性，又容易和蛋清中的带正电荷的溶菌酶发生静电相互作用，由于孔径足够大，因而没有扩散方面的问题，从而提高溶菌酶提取的效率。 
2、本发明解决另一个技术问题所采用的技术方案为：一种上述高分子骨架材料的离子化方法，操作与反应路线如下所示： 
其特征步骤为：将商品的壳聚糖溶于稀醋酸水溶液中(粘度大于400mPa的配成1～2wt.％的浓度；粘度在200～400mPa范围的配成2～3wt.％的浓度)加入少量阳离子表面活性剂(十二烷基三甲基氯化铵，溶液中的含量为0.1～0.2wt.％)，将市售的密胺海绵(三 聚氰胺与甲醛交联反应制成的泡沫材料，现已商品化)浸泡在溶液中，取出后用真空吸掉多余的溶液，保证其在静置下没有溶液流出，然后再烘箱中于60℃下干燥2～3小时，再在pH＝9～10的碳酸钠溶液中浸泡20～30分钟，壳聚糖去质子化后形成不溶性的薄膜覆盖在骨架表面，材料用清水洗涤后再浸泡于10～12wt.％的二甘醇二缩水甘油醚的乙醇溶液中常温下反应1～2小时，然后用95％乙醇洗涤1～2次，再在常温下浸泡于12～15wt.％的亚硫酸氢钠的水溶液中反应1～2小时，通过环氧基团与亚硫酸根的反应使骨架材料带上磺酸根负离子基团。 
非常有益的是，上述的二甘醇二缩水甘油醚可起到两个作用：一是与壳聚糖表面的氨基反应，引出悬挂的环氧基团，使下一步反应后阴离子的游离性增强；二是与壳聚糖内部的氨基反应，使壳聚糖发生交联反应，有利于该包覆层的稳定化；另外，壳聚糖既有很强的亲水性，又有较好的机械强度，这样能保证涂层牢固附着，不会轻易脱落。 
3、本发明解决再一个技术问题所采用的技术方案为：上述阴离子骨架聚合物在溶菌酶提取中的应用方法，其特征在于将若干块材料叠加在一起，置于一个玻璃柱子中，构成整体性吸附柱子，将原料溶液浸润并流过该材料，提取物被吸附于聚合物的骨架上，在经过清水和缓冲溶液洗涤，除去其它杂质，然后通过洗脱将提取物收集，以达到分离与提纯的目的。 
非常有益的是，上述处理方法比一般的树脂填充柱子要高效快捷，材料中的每一个阴离子都有可能与溶菌酶发生作用，不存在扩散受阻的问题，经过试验发现，每一克材料能够吸附67～91毫克的溶菌酶，其吸附能力要高于现有的阳离子交换树脂。 
本发明的优点在于：1)新的吸附材料孔径大，有利于大分子扩散；2)其三维网络结构有利于液体的流通，减小流动阻力；3)悬挂的阴离子要比相对固定的阴离子基团具有更大的游离性，更容易与溶菌酶发生静电吸引作用。 
附图说明
图1为三维骨架材料的SEM图像。 
具体实施方式
以下结合实施例对本发明作进一步详细描述。 
材料制备：将商品的壳聚糖溶于稀醋酸水溶液中(粘度大于400mPa的配成1～2wt.％的浓度；粘度在200～400mPa范围的配成2～3wt.％的浓度)加入少量阳离子表面活性剂(如十二烷基三甲基氯化铵，溶液中的含量为0.1～0.2wt.％)，将圆柱状密胺海绵(直径10cm，厚度为20cm)浸泡在溶液中，取出后用真空吸掉多余的溶液，保证其在静置 下没有溶液流出，然后再烘箱中于60℃下干燥2～3小时，再在pH＝9～10的碳酸钠溶液中浸泡20～30分钟，壳聚糖去质子化后形成不溶性的薄膜覆盖在骨架表面，材料用清水洗涤后再浸泡于10～12wt.％的乙二醇二缩水甘油醚的乙醇溶液中常温下反应1～2小时，然后用95％乙醇洗涤1～2次，再在常温下浸泡于12～15wt.％的亚硫酸氢钠的水溶液中1～2小时，通过环氧基团与亚硫酸根的反应使骨架材料带上磺酸根负离子基团。 
溶菌酶的提取按以下操作步骤进行： 
a.预处理，取鸡蛋壳晾干，粉碎成末； 
b.提取，将蛋壳粉移入搪瓷缸中，然后加入等量的去离子水，在搅拌下用10％HCl溶液调pH为5.0～5.2范围，在40℃下保温搅拌2～3小时，趁热过滤，滤渣再提取2次，合并滤液； 
c.吸附，将以上滤液通过由阴离子化骨架聚合物制成的整体柱(10cm×100cm，由5块圆柱状样品叠加而成)，流速控制在100～150mL/min，然后用去离子水洗涤柱子，再用柱子体积2倍量的pH为6.5、0.15mol/L磷酸盐缓冲液洗涤； 
d.洗脱，用10wt.％的(NH4)2SO4溶液洗脱柱子，收集溶菌酶洗脱液； 
e.盐析，将洗脱液倾入搪瓷缸中，然后加入固体(NH4)2SO4至近饱和时，溶菌酶沉淀洗出； 
f.透析，收取沉淀置于透析膜中透析纯化，收集透析液； 
g.干燥，将透析液在冷冻干燥机中干燥，即得溶菌酶，收率0.16～0.18％，比活力大于1.7×104U/mg。 
材料吸附能力评估：阴离子骨架材料的干态密度一般为0.04～0.05g/mL，整体柱的体积为7.85L，其质量为314～393g，平均值为353g，整体柱经过充分吸附后，经过洗脱、提纯后每次获得的溶菌酶量为24～32g，因此每克材料能吸附溶菌酶的量在67～91mg范围，而一般的离子交换树脂的吸附能力为10～15mg/g，所以，本发明提供的材料在吸附能力上有明显优势，这主要归功于其大孔径和高孔隙率(低密度)的特点。 

Claims (5)

1.一种阴离子骨架聚合物，其特征在于骨架之间通过共同点连接，构成三维网络结构，骨架的尺寸最小处为5μm左右，骨架之间包含约100μm的互相连通的孔道。
2.根据权利要求1所述的阴离子骨架聚合物，其特征在于所述的聚合物表面含有悬挂的磺酸根阴离子。
3.根据权利要求1或2所述的三维骨架聚合物，其特征在于所述的三维骨架聚合物能以整体性柱子的方式通过离子交换原理吸附带正电荷的溶菌酶大分子，使其吸附能力与扩散速率明显提高。
4.一种权利要求1所述的阴离子三维骨架聚合物的制备方法，其特征在于步骤依次为：
(1)将密胺海绵浸泡在壳聚糖溶液中，取出后用真空吸掉多余的溶液，保证其在静置下没有溶液流出，然后再烘箱中于60℃下干燥2～3小时，再在pH＝9～10的碳酸钠溶液中浸泡20～30分钟，壳聚糖去质子化后形成不溶性的薄膜覆盖在骨架表面；
(2)上述材料用清水洗涤后再浸泡于10～12wt.％的二甘醇二缩水甘油醚的乙醇溶液中常温下反应1～2小时，然后用95％乙醇洗涤1～2次，再在常温下浸泡于12～15wt.％的亚硫酸氢钠的水溶液中反应1～2小时，通过环氧基团与亚硫酸根的反应使骨架材料带上磺酸根负离子基团。
5.根据权利要求4所述的聚阳离子的合成方法，其特征在于壳聚糖溶液的浓度与其本身的粘度有关：粘度大于400mPa的配成1～2wt.％的浓度，粘度在200～400mPa范围的配成2～3wt.％的浓度。
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