CN112852620B - 一种通用型准固定化酶反应器 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种通用型准固定化酶反应器,包括一般的酶反应装置和外挂在一般的酶反应装置上的准固定化酶催化反应塔,在不改变原反应器中反应条件的情况下,极大地加速酶催化反应,且具有通用性,可以用于几乎所有酶催化反应。本发明对酶无歧视,且酶催化反应装置和准固定化酶催化反应塔可同时反应,不改变已有的所有工艺参数,极大的提高反应速度;成本低,不采用商品化固定化酶,依靠酶与吸附剂发生物理吸附作用或弱化学吸附作用,有效提高酶活性,也不造成额外的环境污染;装置简单,仅在原有装置的基础上附加组件,产生良好的经济和社会效益。
Description
技术领域
本发明涉及酶固定化技术领域,具体的来说,是一种可以外挂在一般的酶反应装置上,在不改变原反应器中反应条件的情况下,极大地加速酶催化反应,且具有通用性,可以用于几乎所有酶催化反应的通用型准固定化酶反应器。
背景技术
固定化酶技术是通过物理方法或化学方法将游离酶限制在一定区域内进行活跃的、特有的催化作用,并可回收使用的一项技术。与自由溶液酶反应相比,固定化酶反应在保持其高效专一及温和的酶催化反应特性的同时,又克服了自由溶液的不足之处,呈现贮存稳定性高、分离回收容易、可多次重复使用、操作连续可控、工艺简便等一系列优点。
固定化酶方法可以分成两大类,物理方法和化学法。其中物理法主要包括吸附法和包埋法,而化学法主要包括共价键法和交联法。吸附法固定化酶,方法简单易行、成本低而且可以再生,但是吸附法酶活力保留率较低而且不稳定;包埋法固定化酶有吸附法经济性好的优点,但是包埋法传递阻力太大限制其应用;共价键法和交联法固定化酶较复杂,而且过程中可能会导致酶失活,但是这两种方法酶活保留率较高、传质阻力小而且还十分稳定。前期实验室已经制备纳米颗粒复合杂化整体胰蛋白酶反应器和纳米颗粒复合杂化整体双酶反应器,与自由溶液相比,固定化酶反应器催化效率提高了2000倍。
专利CN210065790U公开了一种利用固定化多酚氧化酶生产茶黄素的反应器,反应液进行多次循环,这种方式虽然有效的提高了反应效率和反应完全度,但固定化酶反应柱在使用过程中存在酶脱落,失活等情况,会造成反应柱催化效率降低。专利CN109022272A公开了一种醋酸纤维整体住及其酶反应器及制备方法、应用,通过物理吸附作用在醋酸纤维整体柱上固定化酶,醋酸纤维整体柱酶反应器在酶促反应中存在酶脱附,失活等情况,无法保证催化效率。专利104152350A公开了一种将搅拌式发酵罐系统组装为填充床酶反应器的方法,将生物发酵罐和填充柱式酶反应器集合,无法保证反应完成度。
发明内容
针对现在技术存在的不足,本发明的主要目的在于提供一种可以外挂在一般的酶反应装置上,在不改变原反应器中反应条件的情况下,极大地加速酶催化反应,且具有通用性,可以用于几乎所有酶催化反应的通用型准固定化酶反应器。
为实现上述目的,本发明提供了如下技术方案:
一种通用型准固定化酶反应器,包括分别作为准固定化酶催化反应塔和酶催化反应装置的二个反应容器,分散有酶的反应液装填于酶催化反应装置,在准固定化酶催化反应塔内装填有填料;酶催化反应装置内的反应液通过管路与准固定化酶催化反应塔和酶催化反应装置之间循环。
上述酶催化反应装置中的反应液通过液泵以外循环的方式通过准固定化酶催化反应塔中的填料时,反应液中的酶一部分被动态吸附到填料的表面,形成准固定化酶床层,并与溶液中的酶一同催化酶促反应。
上述准固定化酶催化反应塔通过管路和液泵被外挂到(即置于)酶催化反应装置外部,并通过管路与酶催化反应装置形成闭合回路。
上述装置于液泵所在的管路上设置流量计,流量计用于控制反应液在系统中循环的流速。
上述准固定化酶催化反应塔由塔体、前后或上下二块筛板、填料以及塔体外壁面上设置的控温套构成;填料置于塔体内,在塔体内填料的相对二侧分别设置有前后或上下二块筛板,于二个筛板远离填料一侧的塔体上分别设有反应液进口和出口;
筛板保证反应液可以自由出入反应塔,且可以阻塞填料流出;控温套可以保证准固定化酶催化反应塔在需要的恒温条件下完成反应;酶催化反应装置包括装置本体,于装置本体的外壁面上设置有控温套;于装置本体上设有反应液进口和出口;控温套包括于塔体和装置本体外壁面上设置的电加热元件或流体加热夹套(如:水热夹套)或流体加热盘管。
上述控温套还包括附着于塔体外壁面上的保温层,电加热元件或流体加热夹套或流体加热盘管置于塔体外壁面与保温层之间;电加热元件或流体加热盘管缠绕于塔体外壁面上;电加热元件为电加热丝和/或电加热带。
上述准固定化酶催化反应塔中装填的填料不是固定化酶,而是可以吸附酶并形成动态准固定化酶床层的填料;填料为可以与酶发生物理吸附作用或者弱化学吸附作用的吸附剂;吸附剂可以为无孔或多孔颗粒或纤维,颗粒大小为粒径10微米到5毫米或纤维直径10微米到5毫米;对于多孔填料,孔径应大于100nm,以保证作为酶的催化剂可以自由进出。
上述填料对酶的吸附能力通过将填料装填到色谱柱中,以不包含反应物的溶液(优选水)为流动相,酶为样品进行测试确定;对于特定的酶,可以采用的填料色谱容量因子在5到400之间;吸附能力太小,不能形成固定化酶催化床层;吸附力太大,不利于动态固定化酶的实时更新。
上述填料为树脂或基质中的一种或二种以上;填料优选为大孔树脂,金属螯合树脂,离子交换树脂,基质优选为硅胶,氧化铝,有机聚合物中的一种或二种以上;离子交换树脂包括强酸性阳离子、弱酸性阳离子、强碱性阴离子、弱碱性阴离子中的一种或二种以上。
上述反应液中酶的浓度优选为0.1-10mg/mL。反应液能够带系统中流动循环,因填料的所在酶床层被实时更新,在不存在酶床层失活的情况,不仅可保证酶催化效率稳定,且无需改变已有的所有工艺参数。
本发明公开了一种通用型准固定化酶反应器,包括一般的酶反应装置、和外挂在一般的酶反应装置上的准固定化酶催化反应塔,在不改变原反应器中反应条件的情况下,极大地加速酶催化反应,且具有通用性,可以用于几乎所有酶催化反应。本发明的准固定相酶反应器由准固定化酶反应塔及与之配套的泵系统,流量计,控温套等构成。关键组件为内部装填有可以与酶产生较强相互作用填料的反应塔,其中的填料可以使酶被吸附到其表面上,且基本不改变酶的活性,主要包括离子交换树脂和大孔树脂、金属螯合树脂三类。将准固定化酶反应器通过管路外挂到原有的酶反应器上,通过泵将原自由溶液酶解的反应液泵入准固定化酶反应器中,反应液中的酶被吸附到填料的表面,形成固定化酶床层,并催化反应进行。反应可以在溶液中以及填料表面两部分同时进行,填料表面的酶与溶液中的酶处于一种平衡状态,并被实时更新,以保证更好地完成催化作用。准固定化酶反应器外部的控温系统可以保证装置在最优化的温度下进行催化反应。本发明对酶无歧视,且原酶反应装置和外循环准固定化酶反应装置可同时反应,不改变已有的所有工艺参数,极大的提高反应速度;成本低,不采用商品化固定化酶,依靠酶与吸附剂发生物理吸附作用或弱化学吸附作用,有效提高酶活性,也不造成额外的环境污染;装置简单,仅在原有装置的基础上附加组件,产生良好的经济和社会效益。
本发明相对于现有技术,本发明的积极效果是:
(1)对酶无歧视,且原酶反应装置和外循环准固定化酶反应装置可同时反应,不改变已有的所有工艺参数,极大的提高反应速度;
(2)成本低,不采用商品化固定化酶,依靠酶与吸附剂发生物理吸附作用或弱化学吸附作用,有效提高酶活性,也不造成额外的环境污染;
(3)装置简单,仅在原有装置的基础上附加组件,产生良好的经济和社会效益。
附图说明
图1是该发明通用型准固定化酶反应器示意图。
图中,1-准固定化酶反应塔;2-管路;3-液泵;4-流量计;5-酶催化反应装置;6-塔体;7-筛板;8-填料;9-控温套。
图2是实施例1该发明通用型准固定化酶反应器反应1h产物MALDI-TOF MS分析图。
图3是实施例1原有的酶反应装置反应12h产物MALDI-TOF MS分析图。
图4是实施例2该发明通用型准固定化酶反应器参与4-氯-3-羟基丁酸乙酯合成反应1h的气相色谱检测图。
图5是实施例2自由溶液酶反应器参与4-氯-3-羟基丁酸乙酯合成反应1h的气相色谱检测图。
图6是实施例2固定化酶催化反应柱参与4-氯-3-羟基丁酸乙酯合成反应1h的气相色谱检测图。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述,给出的实施例仅为了阐明本发明,而不是为了限制本发明的范围。下述实施例中的实验方法,如无特殊说明,均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂、仪器等,如无特殊说明,均可从商业途径得到。以下实施例中的定量试验,均设置三次重复实验,结果取平均值。
如图1所示,一种通用型准固定化酶反应器,包括分别作为准固定化酶催化反应塔1和酶催化反应装置5的二个反应容器,分散有酶的反应液装填于酶催化反应装置5,在准固定化酶催化反应塔1内装填有填料;酶催化反应装置5内的反应液通过管路与准固定化酶催化反应塔1和酶催化反应装置5之间循环。
上述酶催化反应装置中的反应液通过液泵以外循环的方式通过准固定化酶催化反应塔1中的填料时,反应液中的酶一部分被动态吸附到填料的表面,形成准固定化酶床层,并与溶液中的酶一同催化酶促反应。
上述准固定化酶催化反应塔1通过管路2和液泵3被外挂到(即置于)酶催化反应装置5外部,并通过管路与酶催化反应装置形成闭合回路。
上述装置于液泵3所在的管路2上设置流量计4,流量计4为苏州汇通色谱分离纯化有限公司HT-7002耐腐蚀液体流量控制器,用于控制反应液在系统中循环的流速,流量计流速优选为反应液体积的0.1-10倍每分钟。
上述准固定化酶催化反应塔1由塔体6、上下二块筛板7、填料8以及塔体外壁面上设置的控温套9构成;填料8置于塔体6内,在塔体6内填料8的相对二侧分别设置有上下二块筛板7,于二个筛板远离填料8一侧的塔体6上分别设有反应液进口和出口;
筛板7(其为带有通孔的孔板,四周边缘与及塔体内壁面相贴接)保证反应液可以自由出入反应塔,且可以阻塞填料8流出;控温套9可以保证准固定化酶催化反应塔1在需要的恒温条件下完成反应;
酶催化反应装置5包括装置本体,于装置本体的外壁面上设置有控温套;于装置本体上设有反应液进口和出口;
液泵3通过管路2将装置5中的反应液泵入到准固定化酶催化反应塔中,反应液中的一部分酶在反应塔中被动态吸附在填料表面形成准固定化酶催化床层,被固定化的酶以及流路液相中的酶同时参与催化作用,直到反应液流出反应塔,并通过管路回流到酶反应装置5中;反应液通过管路于准固定化酶催化反应塔1和酶催化反应装置间形成流动的闭合回路。
于液泵3所在的管路2上设置流量计4,流量计4用于控制反应液在系统中循环的流速。
控温套9包括于塔体6和装置本体外壁面上设置水热夹套。
上述控温套9还包括附着于塔体6外壁面上的保温层(环氧树脂材料层),水热夹套置于塔体6外壁面与保温层之间。
上述准固定化酶催化反应塔中装填的填料不是固定化酶,而是可以吸附酶并形成动态准固定化酶床层的填料;填料8为可以与酶发生物理吸附作用或者弱化学吸附作用的吸附剂;吸附剂可以为无孔或多孔颗粒或纤维,颗粒大小为粒径10微米到5毫米或纤维直径10微米到5毫米;对于多孔填料,孔径应大于100nm,以保证作为酶的催化剂可以自由进出。
上述填料8对酶的吸附能力通过将填料装填到色谱柱中,以不包含反应物的溶液(优选水)为流动相,酶为样品进行测试确定;对于特定的酶,可以采用的填料色谱容量因子在5到400之间;吸附能力太小,不能形成固定化酶催化床层;吸附力太大,不利于动态固定化酶的实时更新。
上述填料8为树脂或基质中的一种或二种以上;填料8优选为大孔树脂,金属螯合树脂,离子交换树脂,基质优选为硅胶,氧化铝,有机聚合物中的一种或二种以上;离子交换树脂包括强酸性阳离子、弱酸性阳离子、强碱性阴离子、弱碱性阴离子中的一种或二种以上。
上述反应液中酶的浓度优选为0.1-10mg/mL。反应液能够带系统中流动循环,因填料8的所在酶床层被实时更新,在不存在酶床层失活的情况,不仅可保证酶催化效率稳定,且无需改变已有的所有工艺参数。
实施例1
以下结合胰蛋白酶酶解牛血清蛋白的实施例对本发明进行进一步说明,本发明的保护范围不受实施例的限制。
将牛血清蛋白(BSA)溶解于含8mol/L尿素的50mmol/L NH4HCO3(pH 8.0)溶液中,加100mmol/L二硫苏糖醇(DTT),56℃反应1h,冷却至室温。加入200mmol/L碘乙酰胺(IAA),37℃下避光反应30min,得预处理好的牛血清蛋白溶液。
在酶催化反应装置5(自由溶液酶反应器,即非固定化酶反应装置)中加入预处理好的牛血清蛋白溶液以及胰蛋白酶溶液(浓度为10mg/mL),它们的比例为50/1(w/w),设定控温套9(水热夹套)温度为37℃,同时,打开液泵3,调节流量计4流速为10mL/min,使反应液通过管路2进入准固定化酶催化反应塔1,塔体6规格为15×310mm,上筛板和下)筛板7的带有的通孔孔径为500目,填料8为离子交换树脂(漂莱特A400强碱性阴离子交换树脂),粒径为600μm,孔径50nm,容量因子为1.3。循环1h,反应结束后加入甲酸中止反应并将反应液置于-20℃保存待分析。结果如图2所示;
同时对比采用原有的酶反应装置进行预处理好的牛血清蛋白溶液的胰蛋白酶酶解独立反应12h,酶解条件同上(预处理好的牛血清蛋白溶液以及胰蛋白酶溶液(浓度为10mg/mL),它们的比例为50/1(w/w),温度为37℃。结果如图3所示;
酶解产物同时用SDS-PAGE测定,结果显示两种酶解方式下产物都没有出现BSA条带,说明两种酶解方式BSA都已完全酶解。用MALDI-TOF MS进行分析,本发明装置酶解序列覆盖度(即质谱鉴定出来的能够跟数据库中的序列对应的一部分氨基酸数占总的氨基酸序列的比值)达到60%(39条肽段),原有的酶反应装置酶解序列覆盖度为50%(29条肽段)。
实施例2
以下结合4-氯-3-羟基丁酸乙酯的制备为实施例对本发明进行进一步说明,本发明的保护范围不受实施例的限制。
将4-氯乙酰乙酸乙酯、水、异丙醇、异丙醇脱氢酶、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP)按质量比30:150:70:10:1配制反应液,反应液体积约250mL,控制温度为30℃,用饱和碳酸氢钠溶液调节pH至6.0,将反应液加入酶催化反应装置5。打开液泵3,控制流量计4流速为50mL/min,反应液通过管路2进入准固定化酶催化反应塔1,塔体6规格为15×310mm,上筛板和下筛板的通孔孔径为500目,填料8为大孔树脂(漂莱特PAD400),粒径800μm,孔径,容量因子为1.6,如此循环至反应1h。经气相色谱检测,双向循环固定化酶反应器反应1h达到反应终点,4-氯乙酰乙酸乙酯转化率为100.00%,
分别对比相同条件下自由溶液酶反应器(原有的酶反应装置,即非固定化酶反应装置)和固定化酶催化反应塔(即不含酶反应液在内含通过物理吸附方法固定异丙醇脱氢酶的大孔树脂PAD400,大孔树脂PAD400置于上下筛板(500目)之间,于外壁面上设有水热夹套的反应柱内部循环反应)反应1h的反应情况(反应条件同上,温度为30℃,pH为6.0),其中自由溶液酶反应器4-氯-3-羟基丁酸乙酯转化率为20%,固定化酶催化反应柱4-氯-3-羟基丁酸乙酯转化率为45%。
本发明对酶无歧视,且原酶反应装置和外循环准固定化酶反应装置可同时反应,不改变已有的所有工艺参数,极大的提高反应速度;成本低,不采用商品化固定化酶,依靠酶与吸附剂发生物理吸附作用或弱化学吸附作用,有效提高酶活性,也不造成额外的环境污染;装置简单,仅在原有装置的基础上附加组件,产生良好的经济和社会效益。
上所述仅是本发明的优选实施方式,应当指出,对于本技术领域的普通技术人员,在不脱离本发明构思的前提下,还可以做出若干改进和润饰,这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围内。
Claims (10)
1.一种通用型准固定化酶反应器,其特征在于:
包括分别作为准固定化酶催化反应塔(1)和酶催化反应装置(5)的二个反应容器,分散有酶的反应液装填于酶催化反应装置(5),在准固定化酶催化反应塔(1)内装填有填料;
酶催化反应装置(5)内的反应液通过管路于准固定化酶催化反应塔(1)和酶催化反应装置(5)之间循环;准固定化酶催化反应塔中装填的填料不是固定化酶,而是可以吸附酶并形成动态准固定化酶床层的填料。
2.根据权利要求1所述的反应器,其特征在于:酶催化反应装置中的反应液通过液泵(3)以外循环的方式通过准固定化酶催化反应塔(1)中的填料时,反应液中的酶一部分被动态吸附到填料的表面,形成准固定化酶床层,并与溶液中的酶一同催化酶促反应。
3.根据权利要求1所述的反应器,其特征在于:准固定化酶催化反应塔(1)通过管路(2)和液泵(3)被外挂到酶催化反应装置(5)外部;液泵(3)通过管路(2)将酶催化反应装置(5)中的反应液泵入到准固定化酶催化反应塔中,反应液中的一部分酶在反应塔中被动态吸附在填料表面形成准固定化酶催化床层,被固定化的酶以及流路液相中的酶同时参与催化作用,直到反应液流出反应塔,并通过管路回流到酶催化反应装置(5)中;反应液通过管路于准固定化酶催化反应塔(1)和酶催化反应装置间形成流动的闭合回路。
4.根据权利要求3所述的反应器,其特征在于:于液泵(3)所在的管路(2)上设置流量计(4),其为液体流量控制器,流量计(4)用于控制反应液在系统中循环的流速。
5.根据权利要求1、3或4所述的反应器,其特征在于:准固定化酶催化反应塔(1)由塔体(6)、前后或上下二块筛板(7)、填料(8)以及塔体外壁面上设置的控温套(9)构成;
填料(8)置于塔体(6)内,在塔体(6)内填料(8)的相对二侧分别设置有前后或上下二块筛板(7),于二个筛板远离填料(8)一侧的塔体(6)上分别设有反应液进口和出口;
筛板(7)保证反应液可以自由出入反应塔,且可以阻塞填料(8)流出;控温套(9)可以保证准固定化酶催化反应塔(1)在需要的恒温条件下完成反应;
酶催化反应装置(5)包括装置本体,于装置本体的外壁面上设置有控温套;于装置本体上设有反应液进口和出口;
控温套(9)包括于塔体(6)和装置本体外壁面上设置的电加热元件或流体加热夹套或流体加热盘管。
6.根据权利要求5所述的反应器,其特征在于:准固定化酶催化反应塔(1)的反应液进口通过管路A与酶催化反应装置(5)的反应液出口相连;准固定化酶催化反应塔(1)的反应液出口通过管路B与酶催化反应装置(5)的反应液进口相连;于管路A或管路B上设有液泵(3);
所述控温套(9)还包括附着于塔体(6)外壁面上的保温层,电加热元件或流体加热夹套或流体加热盘管置于塔体(6)外壁面与保温层之间;
电加热元件或流体加热盘管缠绕于塔体(6)外壁面上;电加热元件为电加热丝和/或电加热带。
7.根据权利要求1所述的反应器,其特征在于:填料(8)为可以与酶发生物理吸附作用或者弱化学吸附作用的吸附剂;吸附剂可以为无孔或多孔颗粒或纤维,颗粒大小为粒径10微米到5毫米或纤维直径10微米到5毫米;对于多孔填料,孔径应大于100nm,以保证作为酶的催化剂可以自由进出。
8.根据权利要求1或7所述的反应器,其特征在于:填料(8)对酶的吸附能力通过将填料装填到色谱柱中,以不包含反应物的溶液为流动相,酶为样品进行测试确定;对于特定的酶,可以采用的填料色谱容量因子在5到400之间;吸附能力太小,不能形成固定化酶催化床层;吸附力太大,不利于动态固定化酶的实时更新。
9.根据权利要求8所述的反应器,其特征在于:
填料(8)为树脂或基质中的一种或二种以上;
填料(8)为大孔树脂,金属螯合树脂和/或离子交换树脂,基质为硅胶,氧化铝和/或有机聚合物中的一种或二种以上;
离子交换树脂包括强酸性阳离子、弱酸性阳离子、强碱性阴离子和/或弱碱性阴离子中的一种或二种以上。
10.根据权利要求1所述的反应器,其特征在于,
反应液中酶的浓度为0.1-10mg/mL;
反应液能够在系统中流动循环,因填料(8)的所在酶床层被实时更新,在不存在酶床层失活的情况,不仅可保证酶催化效率稳定,且无需改变已有的所有工艺参数。
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