CN101818139B - 固定化过氧化物酶的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种固定化过氧化物酶的制备方法，包括载体的预处理，用超声波将磁铁颗粒分散到壳聚糖和冰醋酸的溶液中，加入含乳化剂的石蜡油，加入戊二醛溶液，干燥后得到表面包裹壳聚糖的磁铁颗粒、成膜材料的选择，选择聚磺化苯乙烯钠盐和聚盐酸烯丙胺分别作载体的A层膜电解质材料和B层膜电解质材料、配置过氧化物酶溶液、静电交替沉积，经过A层膜的吸附和B层膜的吸附等步骤。本发明用层层自组装技术将过氧化物酶固定化到纳米磁铁颗粒的表面，不仅具有固定酶量多，且酶活力保留量较大；本发明制得的固定化过氧化物酶活性高，有很高的稳定性，可以回收循环利用，可以用于含苯酚苯胺废水的无害化处理。

Description

固定化过氧化物酶的制备方法
技术领域
本发明属于环境科学领域，涉及一种新型环境功能材料，具体地说是一种以纳米磁铁颗粒为载体的固定化过氧化物酶的制备方法。
背景技术
酶的固定化是指通过物理或化学的方法将酶分子固定到载体表面。固定化酶的制备方法有物理法和化学法两大类。主要的物理固定方法有吸附法、包埋法。吸附法操作简单，条件温和，不会引起酶的变性失活，但酶与载体结合部不太牢固而易脱落。包埋法虽然可以固定大量的酶，但酶在底物反应过程中造成较大的传质阻力。化学固定法是目前应用最多的酶固定化技术，酶与载体结合牢固，制得的固定化酶稳定性好，但制备过程中反应条件较为强烈，难以控制，最终可能导致酶被固定化后失活较为严重。
层层自组装技术是基于静电相吸而产生多层膜自组装体系的技术，通过轮流地交换吸附溶液，使两种带相反电荷的离子相互吸引结合构成多层膜结构。具体而言就是将底物上带有电荷的聚合物表面连续而又交替地沉浸在带有完全相反电荷的两种溶液中，利用静电相吸的作用，使带不同电荷的两种物质有序而紧凑地连接在一起，重复数次得到多层膜结构。该技术在材料、生物和药物/基因释放等领域得到了广泛的应用。但迄今为止，层层自组装技术在环境科学领域的应用还是空白。
发明内容
本发明针对上述问题，提供一种固定化过氧化物酶的制备方法，该方法利用层层自组装技术制备固定化过氧化氢酶，制得的固定化过氧化氢酶活性高、稳定性好。
按照本发明的技术方案：一种固定化过氧化物酶的制备方法，包括以下步骤：
a.载体的预处理：用超声波将磁铁颗粒按质量体积比为1∶10～1∶20的比例分散到含20g/L壳聚糖和1％冰醋酸的溶液中，混合均匀，充分搅拌下逐滴加入含乳化剂的石蜡油，继续搅拌，加入戊二醛溶液作为交联剂，40℃下反应1h，然后加入适量NaOH溶液，调节pH至9～10，用石油醚或乙醇洗去多余的壳聚糖和石蜡油，干燥后得到表面包裹壳聚糖的磁铁颗粒；
b.成膜材料的选择：选择聚磺化苯乙烯钠盐和聚盐酸烯丙胺分别作载体的A层膜电解质材料和B层膜电解质材料，用10mmol的醋酸缓冲液配制浓度为2％～5％的聚电解质溶液，加0.05％～0.08％NaCl溶液控制聚电解质溶液的离子强度；
c.配置过氧化物酶溶液：用pH4.5～5.5醋酸缓冲液配制酶活力为250U/mg的过氧化物酶溶液；
d.静电交替沉积：
A层膜的吸附：将载体置于A层膜聚电解质溶液和过氧化物酶溶液的混合溶液中，通过静电作用，使过氧化物酶沉积吸附在载体表面，吸附20min～60min后，用缓冲液冲洗2min～20min；
B层膜的吸附：将经过A层膜吸附后的载体置于B层膜聚电解质溶液和过氧化物酶溶液的混合溶液中，通过静电作用，使过氧化物酶沉积吸附在载体表面，吸附20min～60min后，用缓冲液冲洗2min～20min；
e.重复d步骤至少一次，即得固定化过氧化物酶。
所述石蜡油含Span-80乳化剂，所述石蜡油含Span-80乳化剂的体积浓度为0.5％。
所述戊二醛溶液的体积浓度为8％。
所述步骤e中，重复d步骤三次。
本发明的技术效果在于：本发明用层层自组装技术将过氧化物酶固定化到纳米磁铁颗粒的表面，不仅具有固定酶量多，且酶活力保留量较大；本发明制得的固定化过氧化物酶活性高，有很高的稳定性，可以回收循环利用，可以用于含苯酚苯胺废水的无害化处理。
本发明具有两大优势：1、可以形成多层酶结构，达到较高酶上载量；2、可在常温水溶液中进行，不形成共价键，可以保证蛋白质分子维持生物活性的天然构象，从而最大程度的保留其催化活性。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的说明。
本发明是一种固定化过氧化物酶的制备方法，包括以下步骤：
a.载体的预处理：用超声波将磁铁颗粒按质量体积比为1∶10～1∶20的比例分散到含20g/L壳聚糖和1％冰醋酸的溶液中，混合均匀，充分搅拌下逐滴加入含乳化剂的石蜡油，继续搅拌，加入戊二醛溶液作为交联剂，40℃下反应1h，然后加入适量NaOH溶液，调节pH至9～10，用石油醚或乙醇洗去多余的壳聚糖和石蜡油，干燥后得到表面包裹壳聚糖的磁铁颗粒。所述石蜡油含体积浓度为0.5％的Span-80乳化剂。所述戊二醛溶液的体积浓度为8％。磁铁颗粒的粒径为50nm，可由Sigma-Aldrich公司购得。预处理的目的是使载体表面带上电荷，以便聚电解质和酶的组装。
b.成膜材料的选择：选择聚磺化苯乙烯钠盐(PSS)和聚盐酸烯丙胺(PAH)分别作载体的A层膜电解质材料和B层膜电解质材料，用10mmol的醋酸缓冲液配制浓度为2％～5％的聚电解质溶液，加0.05％～0.08％NaCl溶液控制聚电解质溶液的离子强度；
c.配置过氧化物酶溶液：用pH4.5～5.5醋酸缓冲液配制酶活力为250U/mg的过氧化物酶溶液；
d.静电交替沉积：
A层膜的吸附：将载体置于A层膜聚电解质溶液和过氧化物酶溶液的混合溶液中，通过静电作用，使过氧化物酶沉积吸附在载体表面，吸附20min～60min后，用缓冲液冲洗2min～20min；
B层膜的吸附：将经过A层膜吸附后的载体置于B层膜聚电解质溶液和过氧化物酶溶液的混合溶液中，通过静电作用，使过氧化物酶沉积吸附在载体表面，吸附20min～60min后，用缓冲液冲洗2min～20min；
e.重复d步骤至少一次，最好是重复d步骤三次，即得固定化过氧化物酶。
本发明用层层自组装技术将过氧化物酶固定化到纳米磁铁颗粒的表面，不仅具有固定酶量多，且酶活力保留量较大；本发明制得的固定化过氧化物酶活性高，有很高的稳定性，可以回收循环利用，可以用于含苯酚苯胺废水的无害化处理。
本发明制得的固定化过氧化物酶可通过以下方法测定其酶活性：pH 6.0的过氧化氢，10mmol愈创木酚，用分光光度计在470nm处测定最大吸光值，以每分钟吸光度变化值表示酶活性的大小。
固定化酶稳定性(温度、pH、储存)：分别取游离酶和固定化酶置于70℃水浴中保温，定时取样监测其活性，从而确定酶的热稳定性。取适量游离酶和固定化酶，分别置于pH值不同的缓冲溶液中，25℃保温，每隔一段时间取样测定活性。将游离酶和固定化酶在4℃保藏1、2、3、4、5、6周后，测定酶活性。
以下是本发明的具体实施例：
实施例1
a.载体的预处理：用超声波将1.0g粒径为50nm的磁铁颗粒分散到20ml含20g/L壳聚糖和1％冰醋酸的溶液中，混合均匀，充分搅拌下逐滴加入含体积浓度为0.5％的Span-80乳化剂的石蜡油，继续搅拌30min，加入体积浓度为8％的戊二醛溶液作为交联剂，40℃下反应1h，然后加入适量NaOH溶液，调节pH至9～10，用石油醚或乙醇洗去多余的壳聚糖和石蜡油，干燥后得到表面包裹壳聚糖的磁铁颗粒。
b.成膜材料的选择：选择聚磺化苯乙烯钠盐(PSS)和聚盐酸烯丙胺(PAH)分别作载体的A层膜电解质材料和B层膜电解质材料，用10mmol的醋酸缓冲液配制浓度为2％的聚电解质溶液，加0.05％NaCl溶液控制聚电解质溶液的离子强度；
c.配置过氧化物酶溶液：用pH4.5醋酸缓冲液配制酶活力为250U/mg的过氧化物酶溶液；
d.静电交替沉积：
A层膜的吸附：将载体置于A层膜聚电解质溶液和过氧化物酶溶液的混合溶液中，通过静电作用，使过氧化物酶沉积吸附在载体表面，吸附60min后，用缓冲液冲洗20min；
B层膜的吸附：将经过A层膜吸附后的载体置于B层膜聚电解质溶液和过氧化物酶溶液的混合溶液中，通过静电作用，使过氧化物酶沉积吸附在载体表面，吸附60min后，用缓冲液冲洗20min；
e.重复d步骤三次，即得固定化过氧化物酶。
以上得到的纳米磁铁固定化过氧化物酶的酶活为210U/mg，在温度为30～45℃内，酶活保留在80％以上，在pH4～7.2以内酶活保留在78％以上，在4℃保藏1～35d内酶活保留75％以上。
实施例2
a.载体的预处理：用超声波将1.0g粒径为50nm的磁铁颗粒分散到20ml含20g/L壳聚糖和1％冰醋酸的溶液中，混合均匀，充分搅拌下逐滴加入含体积浓度为0.5％的Span-80乳化剂的石蜡油，继续搅拌30min，加入体积浓度为8％的戊二醛溶液作为交联剂，40℃下反应1h，然后加入适量NaOH溶液，调节pH至9～10，用石油醚或乙醇洗去多余的壳聚糖和石蜡油，干燥后得到表面包裹壳聚糖的磁铁颗粒。
b.成膜材料的选择：选择聚磺化苯乙烯钠盐(PSS)和聚盐酸烯丙胺(PAH)分别作载体的A层膜电解质材料和B层膜电解质材料，用10mmol的醋酸缓冲液配制浓度为3.5％的聚电解质溶液，加0.06％NaCl溶液控制聚电解质溶液的离子强度；
c.配置过氧化物酶溶液：用pH5醋酸缓冲液配制酶活力为250U/mg的过氧化物酶溶液；
d.静电交替沉积：
A层膜的吸附：将载体置于A层膜聚电解质溶液和过氧化物酶溶液的混合溶液中，通过静电作用，使过氧化物酶沉积吸附在载体表面，吸附40min后，用缓冲液冲洗10min；
B层膜的吸附：将经过A层膜吸附后的载体置于B层膜聚电解质溶液和过氧化物酶溶液的混合溶液中，通过静电作用，使过氧化物酶沉积吸附在载体表面，吸附40min后，用缓冲液冲洗10min；
e.重复d步骤三次，即得固定化过氧化物酶。
以上得到的纳米磁铁固定化过氧化物酶的酶活为190U/mg，在温度为30～45℃内，酶活保留在60％以上，在pH4～7.2以内酶活保留在65％以上，在4℃保藏1～35d内酶活保留70％以上。
实施例3
a.载体的预处理：用超声波将1.0g粒径为50nm的磁铁颗粒分散到10ml含20g/L壳聚糖和1％冰醋酸的溶液中，混合均匀，充分搅拌下逐滴加入含体积浓度为0.5％的Span-80乳化剂的石蜡油，继续搅拌30min，加入体积浓度为8％的戊二醛溶液作为交联剂，40℃下反应1h，然后加入适量NaOH溶液，调节pH至9～10，用石油醚或乙醇洗去多余的壳聚糖和石蜡油，干燥后得到表面包裹壳聚糖的磁铁颗粒。
b.成膜材料的选择：选择聚磺化苯乙烯钠盐(PSS)和聚盐酸烯丙胺(PAH)分别作载体的A层膜电解质材料和B层膜电解质材料，用10mmol的醋酸缓冲液配制浓度为5％的聚电解质溶液，加0.08％NaCl溶液控制聚电解质溶液的离子强度；
c.配置过氧化物酶溶液：用pH5.5醋酸缓冲液配制酶活力为250U/mg的过氧化物酶溶液；
d.静电交替沉积：
A层膜的吸附：将载体置于A层膜聚电解质溶液和过氧化物酶溶液的混合溶液中，通过静电作用，使过氧化物酶沉积吸附在载体表面，吸附20min后，用缓冲液冲洗2min；
B层膜的吸附：将经过A层膜吸附后的载体置于B层膜聚电解质溶液和过氧化物酶溶液的混合溶液中，通过静电作用，使过氧化物酶沉积吸附在载体表面，吸附20min后，用缓冲液冲洗2min；
e.重复d步骤三次，即得固定化过氧化物酶。
以上得到的纳米磁铁固定化过氧化物酶的酶活为170U/mg，在温度为30～45℃内，酶活保留在55％以上，在pH4～7.2以内酶活保留在60％以上，在4℃保藏1～35d内酶活保留58％以上。

Claims (2)

1.一种固定化过氧化物酶的制备方法，其特征是，包括以下步骤：
a.载体的预处理：用超声波将粒径为50nm的磁铁颗粒按质量体积比为1∶10～1∶20的比例分散到含20g/L壳聚糖和1％冰醋酸的溶液中，混合均匀，充分搅拌下逐滴加入含体积浓度为0.5％的Span-80乳化剂的石蜡油，继续搅拌，加入体积浓度为8％的戊二醛溶液作为交联剂，40℃下反应1h，然后加入适量NaOH溶液，调节pH至9～10，用石油醚或乙醇洗去多余的壳聚糖和石蜡油，干燥后得到表面包裹壳聚糖的磁铁颗粒；
b.成膜材料的选择：选择聚磺化苯乙烯钠盐和聚盐酸烯丙胺分别作载体的A层膜电解质材料和B层膜电解质材料，用10mmol的醋酸缓冲液配制浓度为2％-5％的聚电解质溶液，加0.05％-0.08％NaCl溶液控制聚电解质溶液的离子强度；
c.配置过氧化物酶溶液：用pH4.5-5.5醋酸缓冲液配制酶活力为250U/mg的过氧化物酶溶液；
d.静电交替沉积：
A层膜的吸附：将载体置于A层膜聚电解质溶液和过氧化物酶溶液的混合溶液中，通过静电作用，使过氧化物酶沉积吸附在载体表面，吸附20min-60min后，用缓冲液冲洗2min-20min；
B层膜的吸附：将经过A层膜吸附后的载体置于B层膜聚电解质溶液和过氧化物酶溶液的混合溶液中，通过静电作用，使过氧化物酶沉积吸附在载体表面，吸附20min-60min后，用缓冲液冲洗2min-20min；
e.重复d步骤至少一次，即得固定化过氧化物酶。
2.按照权利要求1所述的固定化过氧化物酶的制备方法，其特征是所述步骤e中，重复d步骤三次。
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CN102944597B (zh) * 2012-12-11 2014-12-10 天津工业大学 一种基于潮解型聚电解质的全固态乙醇气体传感器酶电极及其制作方法
CN103045666A (zh) * 2013-01-23 2013-04-17 江南大学 一种用磁性微球固定化米糠谷氨酸脱羧酶制备γ-氨基丁酸的方法
CN105110482B (zh) * 2015-07-27 2017-06-13 安徽大学 一种以固定化酶去除工业废水中扑热息痛的方法
CN110760497B (zh) * 2019-05-07 2023-03-21 宁波大学 一种氯过氧化物酶的共交联固定化方法

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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
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