CN108823196A - 一种高载量固定化扁桃酸消旋酶的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种高载量固定化扁桃酸消旋酶的制备方法。具体步骤如下：1)葡聚糖接枝型琼脂糖介质的制备；2)介质的活化；3)介质的溴代醇化；4)介质偶联亚氨基二乙酸；5)介质螯合二价金属离子；6)固定化扁桃酸消旋酶。本发明利用葡聚糖分子带有很多羟基的特点，制备螯合金属离子的葡聚糖接枝型琼脂糖介质来固定化扁桃酸消旋酶，提高消旋酶载量。本发明制得的固定化消旋酶对温度、pH的耐受性及操作稳定性均优于以螯合金属离子的葡聚糖未接枝型琼脂糖微球为介质得到的固定化消旋酶。

Description

一种高载量固定化扁桃酸消旋酶的制备方法
技术领域
本发明涉及生物工程领域，尤其涉及一种高载量固定化扁桃酸消旋酶的制备方法。
背景技术
来源于恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida ATCC 12633)的扁桃酸消旋酶(mandelate raeemase)能在Mg2+辅助下催化1，1-质子转移反应，使扁桃酸及其衍生物的对映异构体相互转化。将扁桃酸消旋酶与酯酶、脂肪酶等联用，构建动态动力学拆分过程，理论上可以实现底物完全转化为产物，避免原材料的浪费，提高生产效率。专利CN103820521A公开了联用重组扁桃酸消旋酶及重组酯酶BioH或者表达重组扁桃酸消旋酶及酯酶BioH的基因工程菌制备R-邻氯扁桃酸甲酯的方法。在pH 7.7，25℃，酯酶/消旋酶的摩尔比为1∶21，R-邻氯扁桃酸甲酯浓度为25mM(500μl体系)的拆分条件下，经4次循环拆分后，产物R- 邻氯扁桃酸甲酯的收率为80％，ee值大于97％(Tetrahedron Letters，2015，56(12)：1489-1491)。
自从Hegeman等1970年对扁桃酸消旋酶进行报道以来，对该酶酶学性质、结构及反应机理的研究日渐深入，但有关扁桃酸消旋酶的固定化研究尚未相关报道。与游离酶相比，固定化消旋酶可以实现酶的重复利用性和稳定性使用，降低企业生产成本，进一步推广扁桃酸消旋酶在食品、化工等领域的应用。
传统的固定化酶制剂的制备技术主要包括吸附法、交联法、包埋法和共价结合法，其中酶的纯化和固定化需要分步完成，因此酶活损失较严重，生产成本较高。近年来，固定化金属螯合层析技术被用于固定化酶的生产，主要利用目的蛋白上的六聚组氨酸标签结构与金属离子之间的特异性结合，可以使酶的纯化和固定化一步完成，实现原位纯化固定化。虽然现有技术中已公开了原位纯化固定化蛋白及其制备方法，但所用固定化介质(树脂类、琼脂糖类、纤维素膜或聚多巴胺等)均为原始材料，蛋白载量有限。
近年来，在介质表面接枝葡聚糖等聚合物来提高介质的蛋白载量在蛋白纯化领域受到了广泛应用，但到目前为止尚未出现将聚合物接枝型介质用于固定化酶制备的相关研究。
发明内容
本发明的目的是提供一种高载量固定化扁桃酸消旋酶的制备方法，以解决上述背景技术中提出的问题。
所述的高载量固定化扁桃酸消旋酶的制备方法，包括如下步骤：
1)取10mL抽干的琼脂糖介质，加入25mL二甲基亚砜、50mL环氧氯丙烷、10mL200mg/mL葡聚糖溶液及25mL去离子水，30℃下，150rpm水浴摇床中反应1h，再加入2 gNaOH，50℃下，150rpm水浴摇床中反应2h，用去离子水洗涤，得到葡聚糖接枝型琼脂糖介质。
2)取步骤1)得到的葡聚糖接枝型琼脂糖介质，加入2.5g NaOH、10mL 20％(v/v)二甲基亚砜以及5mL烯丙基溴，25℃下，150rpm水浴摇床中反应24h，用去离子水洗涤，得到烯丙基溴活化的葡聚糖接枝型琼脂糖介质，即活化介质；
3)取步骤2)得到的活化介质，加入0.801g N-溴代丁二酰亚胺、12mL丙酮和10mL去离子水，于25℃下，150rpm水浴摇床中反应1h，用去离子水洗涤，得到溴代醇化的葡聚糖接枝型琼脂糖介质，即溴代醇化介质；
4)取步骤3)得到的溴代醇化介质，加入50mL含1.0mol/L亚氨基二乙酸、2.0mol/LNa2CO3和0.04mol/L NaBH4溶液，60℃下，150rpm水浴摇床中反应24h，用去离子水洗涤，得到偶联亚氨基二乙酸的葡聚糖接枝型琼脂糖介质，即亚氨基二乙酸偶联介质；
5)取步骤4)得到的亚氨基二乙酸偶联介质，加入50mL 0.1mol/L二价金属离子盐溶液，25℃下，150rpm水浴摇床中反应3h，用去离子水洗涤，得到螯合二价金属离子的葡聚糖接枝型琼脂糖介质，即金属离子螯合介质；
6)取步骤5)得到的金属离子螯合介质，加入50mL含有扁桃酸消旋酶的粗酶液，4℃下，150rpm水浴摇床中反应1h，用去离子水洗涤，得到高载量固定化扁桃酸消旋酶；
所述的葡聚糖分子量为5000至70000。
所述的二价金属离子可以是Ni2+、Cu2+、Co2+中的任意一种。
所述的扁桃酸消旋酶载量为27-31mg/mL金属离子螯合介质。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明利用葡聚糖分子带有很多羟基的特点，通过在琼脂糖介质表面接枝葡聚糖，增加可利用的羟基数量，进而提高金属离子的螯合密度和消旋酶载量。本发明制得的固定化消旋酶对温度、pH的耐受性性能好，60℃下，固定化酶的半衰期是游离酶的16-21倍，约是以螯合金属离子的葡聚糖未接枝型琼脂糖微球为介质制得的固定化消旋酶的2.5倍。此外，该固定化酶的操作稳定性好，使用固定化酶催化S-扁桃酸的外消旋反应，连续使用30个批次后，酶活仅降为初始酶活的72-81％，这有利于促进扁桃酸消旋酶在食品、化工等领域的应用。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为游离扁桃酸消旋酶及固定化消旋酶在60℃的半衰期；
图2为固定化扁桃酸消旋酶循环使用30批次后的相对活性。
具体实施方式
以下通过实施例对本发明作进一步的描述：
实施例1
取10mL抽干的琼脂糖介质，加入25mL二甲基亚砜、50mL环氧氯丙烷、10mL 200 mg/mL葡聚糖5000溶液及25mL去离子水，30℃下，150rpm水浴摇床中反应1h，再加入 2g NaOH，50℃下，150rpm水浴摇床中反应2h，用去离子水洗涤，得到葡聚糖接枝型琼脂糖介质；
加入2.5g NaOH、10mL 20％(v/v)二甲基亚砜以及5mL烯丙基溴，25℃下，150rpm水浴摇床中反应24h，用去离子水洗涤；
加入0.801g N-溴代丁二酰亚胺、12mL丙酮和10mL去离子水，25℃下，150rpm水浴摇床中反应1h，用去离子水洗涤；
加入50mL含1.0mol/L亚氨基二乙酸、2.0mol/L Na2CO3和0.04mol/L NaBH4溶液，60℃下，150rpm水浴摇床中反应24h，用去离子水洗涤；
加入50mL 0.1mol/L NiSO4溶液，25℃下，150rpm水浴摇床中反应3h，用去离子水洗涤；
加入50mL含有扁桃酸消旋酶的粗酶液，4℃下，150rpm水浴摇床中反应1h，用去离子水洗涤，得到固定化扁桃酸消旋酶，其中扁桃酸消旋酶载量为31mg/mL金属离子螯合介质。
实施例2
取10mL抽干的琼脂糖介质，加入25mL二甲基亚砜、50mL环氧氯丙烷、10mL 200 mg/mL葡聚糖20000溶液及25mL去离子水，30℃下，150rpm水浴摇床中反应1h，再加入2g NaOH，50℃下，150rpm水浴摇床中反应2h，用去离子水洗涤，得到葡聚糖接枝型琼脂糖介质；
加入2.5gNaOH、10mL 20％(v/v)二甲基亚砜以及5mL烯丙基溴，25℃下，150rpm 水浴摇床中反应24h，用去离子水洗涤；
加入0.801g N-溴代丁二酰亚胺、12mL丙酮和10mL去离子水，25℃下，150rpm水浴摇床中反应1h，用去离子水洗涤；
加入50mL含1.0mol/L亚氨基二乙酸、2.0mol/L Na2CO3和0.04mol/L NaBH4溶液，60℃下，150rpm水浴摇床中反应24h，用去离子水洗涤；
加入50mL 0.1mol/L CoSO4溶液，25℃下，150rpm水浴摇床中反应3h，用去离子水洗涤；
加入50mL含有扁桃酸消旋酶的粗酶液，4℃下，150rpm水浴摇床中反应1h，用去离子水洗涤，得到固定化扁桃酸消旋酶，其中扁桃酸消旋酶载量为29.7mg/mL金属离子螯合介质。
实施例3
取10mL抽干的琼脂糖介质，加入25mL二甲基亚砜、50mL环氧氯丙烷、10mL 200 mg/mL葡聚糖70000溶液及25mL去离子水，30℃下，150rpm水浴摇床中反应1h，再加入2g NaOH，50℃下，150rpm水浴摇床中反应2h，用去离子水洗涤，得到葡聚糖接枝型琼脂糖介质；
加入2.5g NaOH、10mL 20％(v/v)二甲基亚砜以及5mL烯丙基溴，25℃下，150rpm水浴摇床中反应24h，用去离子水洗涤；
加入0.801g N-溴代丁二酰亚胺、12mL丙酮和10mL去离子水，25℃下，150rpm水浴摇床中反应1h，用去离子水洗涤；
加入50mL含1.0mol/L亚氨基二乙酸、2.0mol/L Na2CO3和0.04mol/L NaBH4溶液，60℃下，150rpm水浴摇床中反应24h，用去离子水洗涤；
加入50mL 0.1mol/L CuSO4溶液，25℃下，150rpm水浴摇床中反应3h，用去离子水洗涤；加入50mL含有扁桃酸消旋酶的粗酶液，4℃下，150rpm水浴摇床中反应1h，用去离子水洗涤，得到固定化扁桃酸消旋酶，其中扁桃酸消旋酶载量为27mg/mL金属离子螯合介质。
实施例4
取10mL抽干的琼脂糖介质，加入25mL二甲基亚砜、50mL环氧氯丙烷、10mL 200 mg/mL葡聚糖40000溶液及25mL去离子水，30℃下，150rpm水浴摇床中反应1h，再加入2g NaOH，50℃下，150rpm水浴摇床中反应2h，用去离子水洗涤，得到葡聚糖接枝型琼脂糖介质；
加入2.5g NaOH、10mL 20％(v/v)二甲基亚砜以及5mL烯丙基溴，25℃下，150rpm水浴摇床中反应24h，用去离子水洗涤；
加入0.801g N-溴代丁二酰亚胺、12mL丙酮和10mL去离子水，25℃下，150rpm水浴摇床中反应1h，用去离子水洗涤；
加入50mL含1.0mol/L亚氨基二乙酸、2.0mol/L Na2CO3和0.04mol/L NaBH4溶液，60℃下，150rpm水浴摇床中反应24h，用去离子水洗涤；
加入50mL 0.1mol/L NiSO4溶液，25℃下，150rpm水浴摇床中反应3h，用去离子水洗涤；
加入50mL含有扁桃酸消旋酶的粗酶液，4℃下，150rpm水浴摇床中反应1h，用去离子水洗涤，得到固定化扁桃酸消旋酶，其中扁桃酸消旋酶载量为28.4mg/mL金属离子螯合介质。
实施例5
取10mL抽干的琼脂糖介质，加入25mL二甲基亚砜、50mL环氧氯丙烷、10mL 200 mg/mL葡聚糖10000溶液及25mL去离子水，30℃下，150rpm水浴摇床中反应1h，再加入2g NaOH，50℃下，150rpm水浴摇床中反应2h，用去离子水洗涤，得到葡聚糖接枝型琼脂糖介质；
加入2.5g NaOH、10mL 20％(v/v)二甲基亚砜以及5mL烯丙基溴，25℃下，150rpm水浴摇床中反应24h，用去离子水洗涤；
加入0.801g N-溴代丁二酰亚胺、12mL丙酮和10mL去离子水，25℃下，150rpm水浴摇床中反应1h，用去离子水洗涤；
加入50mL含1.0mol/L亚氨基二乙酸、2.0mol/L Na2CO3和0.04mol/L NaBH4溶液，60℃下，150rpm水浴摇床中反应24h，用去离子水洗涤；
加入50mL 0.1mol/L CuSO4溶液，25℃下，150rpm水浴摇床中反应3h，用去离子水洗涤；
加入50mL含有扁桃酸消旋酶的粗酶液，4℃下，150rpm水浴摇床中反应1h，用去离子水洗涤，得到固定化扁桃酸消旋酶，其中扁桃酸消旋酶载量为29.1mg/mL金属离子螯合介质。
对比例1
取10mL抽干的琼脂糖介质，加入2.5g NaOH、10mL 20％(v/v)二甲基亚砜以及5 mL烯丙基溴，25℃下，150rpm水浴摇床中反应24h，用去离子水洗涤；
加入0.801g N-溴代丁二酰亚胺、12mL丙酮和10mL去离子水，25℃下，150rpm水浴摇床中反应1h，用去离子水洗涤；
加入50mL含1.0mol/L亚氨基二乙酸、2.0mol/L Na2CO3和0.04mol/L NaBH4溶液，60℃下，150rpm水浴摇床中反应24h，用去离子水洗涤；
加入50mL 0.1mol/L CuSO4溶液，25℃下，150rpm水浴摇床中反应3h，用去离子水洗涤；
加入50mL含有扁桃酸消旋酶的粗酶液，4℃下，150rpm水浴摇床中反应1h，用去离子水洗涤，得到固定化扁桃酸消旋酶，其中扁桃酸消旋酶载量为11mg/mL金属离子螯合介质。
对比例2
取10mL抽干的琼脂糖介质，加入2.5g NaOH、10mL 20％(v/v)二甲基亚砜以及5 mL烯丙基溴，25℃下，150rpm水浴摇床中反应24h，用去离子水洗涤；
加入0.801g N-溴代丁二酰亚胺、12mL丙酮和10mL去离子水，25℃下，150rpm水浴摇床中反应1h，用去离子水洗涤；
加入50mL含1.0mol/L亚氨基二乙酸、2.0mol/L Na2CO3和0.04mol/L NaBH4溶液，60℃下，150rpm水浴摇床中反应24h，用去离子水洗涤；
加入50mL 0.1mol/L NiSO4溶液，25℃下，150rpm水浴摇床中反应3h，用去离子水洗涤；
加入50mL含有扁桃酸消旋酶的粗酶液，4℃下，150rpm水浴摇床中反应1h，用去离子水洗涤，得到固定化扁桃酸消旋酶，其中扁桃酸消旋酶载量为13mg/mL金属离子螯合介质。
对比例3
取10mL抽干的琼脂糖介质，加入2.5g NaOH、10mL 20％(v/v)二甲基亚砜以及5 mL烯丙基溴，25℃下，150rpm水浴摇床中反应24h，用去离子水洗涤；
加入0.801g N-溴代丁二酰亚胺、12mL丙酮和10mL去离子水，25℃下，150rpm水浴摇床中反应1h，用去离子水洗涤；
加入50mL含1.0mol/L亚氨基二乙酸、2.0mol/L Na2CO3和0.04mol/L NaBH4溶液，60℃下，150rpm水浴摇床中反应24h，用去离子水洗涤；
加入50mL 0.1mol/L CoSO4溶液，25℃下，150rpm水浴摇床中反应3h，用去离子水洗涤；
加入50mL含有扁桃酸消旋酶的粗酶液，4℃下，150rpm水浴摇床中反应1h，用去离子水洗涤，得到固定化扁桃酸消旋酶，其中扁桃酸消旋酶载量为12.4mg/mL金属离子螯合介质。
本发明葡聚糖接枝方法安全，操作简便，采用螯合金属离子的葡聚糖接枝型琼脂糖介质制备得到的固定化扁桃酸消旋酶，扁桃酸消旋酶载量可达到27-31mg/mL金属离子螯合介质，60℃下固定化酶的半衰期是50-70min(附图1)，连续使用30个批次后，酶活降为初始酶活的72-81％(附图2)。相同条件下，以螯合金属离子的葡聚糖未接枝型琼脂糖微球为介质制备的固定化消旋酶，消旋酶载量为11-13mg/mL金属离子螯合介质，60℃下固定化酶的半衰期是20-30min(附图1)，连续使用30个批次后，酶活降为初始酶活的60％左右 (附图2)。

Claims (4)

1.一种高载量固定化扁桃酸消旋酶的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)取10mL抽干的琼脂糖介质，加入25mL二甲基亚砜、50mL环氧氯丙烷、10mL 200mg/mL葡聚糖溶液及25mL去离子水，30℃下，150rpm水浴摇床中反应1h，再加入2g NaOH，50℃下，150rpm水浴摇床中反应2h，用去离子水洗涤，得到葡聚糖接枝型琼脂糖介质；
2)取步骤1)得到的葡聚糖接枝型琼脂糖介质，加入2.5g NaOH、10mL 20％(v/v)二甲基亚砜以及5mL烯丙基溴，25℃下，150rpm水浴摇床中反应24h，用去离子水洗涤得到烯丙基溴活化的葡聚糖接枝型琼脂糖介质，即活化介质；
3)取步骤2)得到的活化介质，加入0.801g N-溴代丁二酰亚胺、12mL丙酮和10mL去离子水，于25℃下，150rpm水浴摇床中反应1h，用去离子水洗涤，得到溴代醇化的葡聚糖接枝型琼脂糖介质，即溴代醇化介质；
4)取步骤3)得到的溴代醇化介质，加入50mL含1.0mol/L亚氨基二乙酸、2.0mol/LNa2CO3和0.04mol/L NaBH4溶液，60℃下，150rpm水浴摇床中反应24h，用去离子水洗涤，得到偶联亚氨基二乙酸的葡聚糖接枝型琼脂糖介质，即亚氨基二乙酸偶联介质；
5)取步骤4)得到的亚氨基二乙酸偶联介质，加入50mL 0.1mol/L二价金属离子盐溶液，25℃下，150rpm水浴摇床中反应3h，用去离子水洗涤，得到螯合二价金属离子的葡聚糖接枝型琼脂糖介质，即金属离子螯合介质；
6)取步骤5)得到的金属离子螯合介质，加入50mL含有扁桃酸消旋酶的粗酶液，4℃下，150rpm水浴摇床中反应1h，用去离子水洗涤，得到高载量固定化扁桃酸消旋酶。
2.根据权利要求1中所述的一种高载量固定化扁桃酸消旋酶的制备方法，其特征在于，所述步骤1)中的葡聚糖分子量为5000至70000。
3.根据权利要求1中所述的一种高载量固定化扁桃酸消旋酶的制备方法，其特征在于，所述步骤5)中的二价金属离子为Ni2+、Cu2+、Co2+中的任意一种。
4.根据权利要求1中所述的一种高载量固定化扁桃酸消旋酶的制备方法，其特征在于，所述扁桃酸消旋酶载量为27-31mg/mL金属离子螯合介质。
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