SE452161B - Forfarande for framstellning av porosa cellulosaperlor och dess anvendning - Google Patents

Description

452161 _ Framgången med immobiliserad enzym för användning vid den praktiska utdelningen beror i hög grad på egenskaperna hos det bärare som användes för immdbiliseringen. Sålunda skall en god bärare uppfylla kraven på att vara billig och ha en sådan fysisk form att den kan användas i reaktorer, I detta avseende är for- men av en sfärisk pärla särskilt önskvärd, enär den kan användas i en packad bädd, fluidiserad bädd, expanderad bädd, omrörd be- hållare eller andra vanliga utföranden av kemiska reaktorer. En sådan-bärare skall äen ha den rätta fysiska och mekaniska styr- kan, så att den icke krossas eller deformeras när den packas i en hög pelare. Krossning eller deformering resulterar i att pelaren blir tätt packad, varigenom strömningen av vätskefor- miga reagenser genom densamma blockeras och den kemiska reak- torns verkningsgrad därmed försämras; Lämpliga bärare skall -även äga mångsidiga kemiska egenskaper, sådana som att immobi- liseringen av enzymer och andra biologiska medel på bäraren lätt kan åstadkommas genom jonbindning eller kemisk kovalent bindning, likaväl som genom ytabsorption. I detta syfte skall bäraren ha ouhög förmåga att bilda ett stort antal bindningar, så.att varje enhet av bäraren kan immobilisera stora mängder önskad énzym.

Det är sålunda särskilt önskvärt att ha en bärare med höggradig 4 porositet och likformigt fördelade inre håligheter. Sådan poro- sitet är gynnsam för god diffusion av kemiska reagenser eller re- aktionsprodukter in i och ut från de inre håligheterna i cellulo- sapärlorna. Bärarna skall vara kemiskt stabila, fysikaliskt star- ka och vara gjorda av inert material som motstår_mikrobiologiskt angrepp som kan sönderdela bäraren, detta för att åstadkomma ett 'immobiliserat enzymsystem med ett förlängt aktivt liv.

För närvarande är porösa glaspartiklar och porösa keramiska partiklar allmänt använda fö immobilisering av enzymer. Sådana partiklar uppfyller de flesta av de ovan angivna fordringarna på acceptabla partiklar, men de är relativt kostsamma. Vidare be-- gränsas antalet kemiska reaktioner som kan användas för immobi- lisering av enzymer vid glasbärare eller keramiska bärare.

I de amerikanska patenten nr 5.947-325, 3.905.954, 5.573.277, 3.505.299, 5.50l,419, 3.397°l95, 3«296-000, 5-251.824, 3-236.669, 2.843.583, 2.773,027, 2.543.928 och 2.465.343 beskrives framställ- ningen av en hel mängd cellulosamaterial i skilda former, av vilka _ 452 16l några anges som lämpliga för användning för att fixera biologiskt aktiva material, såsom enzymer eller jonbytargrupper. Dessa fram- ställningsmetoder tycks dock likaledes ha olägenheten av att vara kpstsamma, och de erhållna produkterna har vanligen en fysikalisk form som är olämplig för användning i vissa kemiska reaktorer, såsom packade bäddar och fluidiserade bäddar. Framförallt har i den tidigare tekniken icke framkommit någon metod för att fram- ställa sfäriskt formade cellulosapärlor med en likformig fördel- ning av porer över hela ytan och en stor 'likformigt fördelad inre porvolym. Cellulosapartiklarna och -pulvren enligt den ti- digare kända tekniken har vidare i allmänhet haft en sådan liten partikelstorlek, att de icke är lämpade för användning i kemiska reaktorer. Dessutom har cellulosapulvren och -partiklarna enligt tidigare känd teknik ofta haft ett hårt ytskikt som utgör ett svårt hinder för diffusion och medför ineffektiv användning ii kemiska reaktorer.

F&'eliggande uppfinning riktar sig på ett förfaringssätt att framställa högporösa cellulosapärlor med likformig porositet som är i hög grad lämpliga för immobilisering av enzymer; Dessa pär- lor kan även vara användbara vid rening och separation av enzymer, proteiner, nycleinsyror och liknande. Vidare kan pärlorna använ- das för att utskilja metalljoner ur utspädda lösningar som inne- håller desamma. ' Huvudsyftet med föreliggande uppfinning är alltså att fram- ställa billiga, högporösa, stabila partiklar med mångsidiga ke- miska egenskaper för användning som bärare vid vilka enzymer och andra biologiskt aktiva material kan immobiliseras.

Ett annat syfte med föreliggande uppfinning är att utveckla ett förfaringssätt för omvandling av cellulosaderivat till hög- porösa partiklar med god mekanisk stabilitet, som möjliggör en tillfredsställande strömning av vätska genom materialet när det behandlas i reaktorer med packad bädd.l _ _ _ Ytterligare ett ändamål med föeliggande uppfinning är att åstadkomma en porös cellulosabädd med tillräckligt stor yta för att ha en hög förmåga att immobiiisera enzymer. ' Ännu ett ändamål med föreliggande uppfinning är att åstad- komma en porös'cellulosapärla med förbättrad fysikalisk och me- .n 452 _1e1f kanisk.styrka, så att den icke krossas eller deformeras vid an- - vändning i kemiska reaktorer.

Ytterligare ett ändamål med uppfinningen är att utveckla ett_förbättrat_förfaringssätt för rening och/eller separation av enzymer, proteiner, nycleinsyror och liknande. fÄnnu ett ändamål med uppfinningen är att utveckla ett för- faringssätt för utskiljande av metalljoner ur utspädda lösningar vari sådana ingår. I Hur dessa och andra ändamål med uppfinningen förverkligas .framgår av efterföljande beskrivning.

'Föreliggande uppfinning riktar sig på ett förfaringssätt för framställning av porösa cellulosapärlor som är lämpligaför an- vändning'som bärare av enzymer och andra biologiska medel. Upp- finningen riktar sig även på ett förfaringssätt att modifiera de kemiska och fysikaliska egenskaperna hos porösa pärlor framställ- da av cellulosaderivat, liksom på olika metoder för immobilise- 'ring av enzymer och andra biologiskt aktiva ämnen på de så bil- dade porösa pärlorna. Ehuru vanliga mikrokristalliniska cellu- losapartiklar och andra partiklar framställda av cellulosa upp- fyller många av de generella fordringarna på en lämplig bärare av enzymer, har sådana partiklar olägenheten av att lätt packas sauman under tryck, och de har heller icke tillräckligt hög po- rositet för att fasthålla önskat stor mängd enzymer. Cellulosa- derivat är vanligen billiga, och när de behandlas enligt förelig- gande uppfinning ger de ett mângsidigt användbart material för kemiska reaktioner, enär de generellt är biologiskt inerta. De här beskrivna pärlorna av cellulosaderivat har alltså många önsk- värda egenskaper för användning som bärare av immobiliserade en- _Zymero Förfaringssättet enligt uppfinningen för modifiering av de fysikaliska egenskaperna hos cellulosaderivat för att bilda porösa cellulosapärlor omfattar följande åtgärder: a) upplösning av ett cellulosaderivat i ett inert, or- *ganiskt, med vatten blandbart lösningsmedel för att bilda en lösning, som har densitet som är större än hos den nedan angiv- na utfällningslösningen; b) fördelning av denna lösning i form av små droppar i'en - utfällningslösning, varigenom cellulosaderivatet utfälles i form av likformigt porösa pärlor; '452 161 e) avskfljanae av de utfailaa pariorna ur nämnda lös- ning; d) .tvättning av de avskilda porösa pärlorna med vatten; e) hydrolysering av de tvättade pärlorna för att omvand- la dem till cellulosa och för att öka de verksamma punkterna för vidhäftning av enzymer och andra biologiska ämnen; f) wav *aning av ae nyaroiyseraae* parioma för att ra porösa oellulosapärlor. I Genom att enligt uppfinningen upplösa ett cellulosaderi- vat i ett särskilt utvalt lösningsmedel och fördela detsamma i en särskilt utvald utfällningslösning blir det möjligt att fran- ställa cellulosapärlor med hög likformig porositet och överlägs- na kemiska ooh fysikaliska egenskaper. De enligt uppfinningen framställda pärlor-na är höggradigt porösa. Porerna är i allmän- het likformigt fördelade över ytan och över pärlans hela inre. _ Genom lämpligt val av lösningsmedel och utfällningslösningar kan storleken av porerna i pärlorna regleras. En särskild för- del med förfaringssättet enligt uppfinningen är att det är möj- ligt att reglera både porstorleken och porfördelningen. Såsom framgår av fig._2, 4 (A) och (B) är poröppningarna likformigt fördelade över ytan av pärlan och kan uppskattas vara cza lOOO Ä, vilket är den rätta storleken för att molekyler av enzym och reagens skall kunna röra sig i porerna. _ D Det inerta, organiska, med vatten blandbara lösningsmed- let kan vara en enda vätska eller en kombination av vätskor.

Det är viktigt att man använder en riktig kombination av inert organiskt lösningsmedel och utfällningslösning för att erhålla porösa cellulosapärlor med önskad form och porositet. Det in- erta, organiska, med vatten blandbara lösningsmedlet kan vara en kombination av vätskor, som tillsammans med cellulosaderivatet ger en lösning som när den blandas med utfällningslösningen re- sulterar i en fasínversion_ varigenom oellulosaderivatet koagule- rar i form av en porös bädd. Det inerta organiska lösningsmedlet innehåller sålunda en komponent (a) som karakteriseras som en vätska som har förmåga att upplösa cellulosaderivatet, t.ex. eellulosaacetat, och som är löslig i utfällningslösningen.

En andra komponent (b) av lösningsmedelssystemet är en 452 161 vätska som är lös1ig'i komponent (a) och även i utfällningslös- ningen och som förekommer i lösningsmedelslösningen i en mängd som är tillräcklig för att densiteten av den slutliga lösnings- meàelslösningen (tillsammans med cellulosaderivatet) är till- raøkiigt mycket-högre än.aens1teten av urfailningsiösningen för att vid lösningsmedelslösningens fördelning i form av små droppar i utfällningslösningen, cellulosan skall koagulera och utfällas som porösa pärlor av önskad form och porositet. Komponenten Cb) av lösningsmedlet användes för att reglera ytaktiviteten hos lösningsmedelslösningen så att dropparna av lösningsmedelslös- ningen behåller sin form vid kontakt med utfällningslösningen.

Komponenten (b) tjänar även till att reglera porstorleken och porositeten av de utfällda pärlorna. I vissa fall kan komponent (a) och komponent (b) vara densamma. I andra fall kan det vara lämpligt att använda en eller flera vätskor vid framställning av komponent (a) och/eller komponent (b).

Med termen "utfällningslösning" avses här en flytande löning som icke utgör lösningsmedel för cellulosaderivatet och som är blandbar med det ovannämnda inerta, organiska, med vatten blandbara lösningsmedlet. Exempelvis kan utfällningslösningen vara vatten eller en vattenhaltig lösning. Utfällningslösningen är sålunda blandbar med båda lösningsmedelskomponenterna (a) och (b). Det är sålunda tydligt att när man upplöser cellulosaderi- vatet i det organiska lösningsmedlet och därefter sätter en drop- pe av den resulterande lösningsmedelslösningen till utfällnings- lösningen; så kommer cellulosaderivatet att koagulera.och utfäl- las på grund av den fasinversion som cellulosaderivatet undergår, varvid de önskade porösa cellulosapärlorna bildas.

Det är tydligt att ett flertal variationer av den ovan beskrivna metoden att framställa de önskade porösa cellulosa- pärlorna är möjliga. Förutom cellulosaaoetat kan andra cellu- 'losaderivat användas såsom utgàngsmaterial för framställning av de porösa pärlorna, t.ex. cellulosanitrat och metylcellulosa.

Termerna "cellulosaderivat“ och "hydrolyserbart cellulosaderivat" är här avsedda att omfatta material ur vilka cellulosa kan re- genereras, t.e . genom hydrolys eller hydrogenering.

De organiska lösningsmedelskomponenterna (a) och (b) 452 161 för cellulosaderivatet kan variera men bör vara kemiskt inerta relativt cellulosaderivatet och fullständigt eller i stort sett fullständigt blandbara med utfällningslösningen., Det_är viktigt att densiteten av lösningsmedelslösningen, som bildas genom att tillsätta cellulosaderivatet till det inerta lösningsmedlet, är större än densiteten av utfällningslösningen vari den fördelas, så att när dropparna av lösningsmedelslösningen fördelas i ut- fällningslösningen, kommer dropparna att sjunka, när den vatten- haltiga lösningen icke omröres. Lämpliga enkla lösningsmedel vid användning av en vattenhaltig utfällningslösning omfattar bland annat t.ex. dimetylsulfoxid och metylacetat. Kommersiellt . förekommande material kan användas som lösningsmedelskomponenter (a) och/eller (b), och dessa material kan innehålla fuktighet, vilket i vissa fall har visat sig vara fördelaktigt.

När man använder en vattenhaltig utfällningslösning kan man lämpligen som lösningsmedelskomponent (a) använda ett ämne ur den grupp som består av aceton, formamid, en blandning av aöeton och metanol eller etanol, metylacetat, en blandning av etylendiklorid och metanol, metyletylketon och dimetylsulfoxid.

Lösningsmedelskomponenten (b) kan lämpligen utväljas ur den grupp som består av dimetylsulfoxid, formamid, metylacetat, cyklohexanon, metylendiklorid, etylendiklorid, en blandning av metylendiklorid och metanol, och en blandning av etylendiklorid och metanol.

Som lösningsmedelskomponent (a) föredrages aceton, men andra lösningsmedel kan också med fördel användas, och när man använder en vattenhaltig utfällningslösning kan man välja en komponent (a) bland följande material (varvid blandningsförhållan- dena i volym räknat har nedan angivna minimà: Komnonent (a) Minimiförhållande ,(Volym) Aceton . --- Aceton + metanol 60:40 Aceton + etanol 60:40 Metylacetat --- rfretyiendikioria + metanøi 80:20 Dimetylsulfoxid --- Metyletylketon --- Formamid _ --- 452 161 Såsom angivits ovan är den primära funktionen hos kompo- nent (a) att upplösa cellulosaderivatet. Tillsättningen av komponent (b) är nödvändig för att få en lösningsmedelslösning som har den önskade densiteten, så att oellulosaderivatet utfäl- les i utfällningslösningen. Komponent (b) ger även möjlighet att reglera porstorleken och den likformiga porositeten hos pärlorna.

Lösningsmedelskomponenten (b) ger sålunda lösningsmedels- lösningen den önskade specifika vikten, och när man använder en vattenhaltig utfällningslösning användes företrädesvis dimetyl- sulfoxid som komponent (b). Såsom nämnts kan i vissa fall kom- ponent (a) och komponent (b) vara densamma, t.ex. dimetylsulfoxid, formamid eller metylacetat, nämligen vid användning tillsammans med vattenhaltiga utfällningslösningar. Olika material som lämp- ligen kan användas som komponent (b) vid användning av en vatten- haltig utfällningslösning angives nedan.

Komponent (b) _ Minimiföhållande l (volym) Dimetylsulfoxid --- Etyienaikiorià + metanol 60:40 Metylendiklorid + metanol 60:40 Etylendiklorid . --- Metylendiklorid --- Formamid --- Cyklohexanon --- Lösningen av oellulosaderivat ooh inert lösningsmedel skall ha ett reglerat förhållande mellan cellulosaderivatet och lösningsmedlet, enär detta kommer att ha inverkan på den slutliga porositeten hos de framställda pärlorna. Ett mindre förhållande (större innehåll av lösningsmedlet) resulterar i allmänhet i pärlor med en större porositet. Ett förhållande mellan cellu- losa och lösningsmedel, innehållande komponenterna (a) och (b),' uppgående till mellan 1:20 och 1:3 (vikt/volym) har befunnits vara lämplig för framställning av cellulosapärlor med olika specifika användningar. Företrädesvis användes ett förhållande ' s mellan oellulosaderivat och lösningsmedel om l:lO till 1:6 (vikt/volym) för att åstadkomma en lätthanterlig lösning som re- sulterar i porösa oellulosapärlor med önskade egenskaper och en porvolym av minst 50 volym-%, företrädesvis 75 - 95 % och allra helst c:a 75 - 80 %. _Pär1or med högre porositet kommer i all- 452 161 mänhet att ha en större proportion likformígt fördelade inre hå- ligheter som ger ett mindre diffusionsmotstånd men kommer att vara något svagare med avseende på fysisk styrka än pärlor med lägre porositet. _ Den föredragna utfällningslösningen, vari lösningen av oellulosaderivat skall fördelas, består vanligen av vatten men kan vara en vattenhaltig_lösning som innehåller lämpliga mängder icke-joniska och joniska ytaktiva medel för att reducera ytspän- ningen_och underlätta bildandet av de porösa pärlorna. Utfäll- ningslösningen kan även lämpligen innehålla en blandning av vat- ten och metanol eller etanol (volymförhållande 50:50). Det är även möjligt att utfällningen kan ske utan närvaro av vatten så länge som cellulosaderivatet är olösligt däri och kravet på erforderlig densitet är uppfyllt. Sålunda kan kolvätelösningar användas, såsom cyklohexan, hexan, dekan, bensen och liknande, så länge som de är vätskeformiga, har en densitet som är mindre än densiteten hos det inerta organiska lösningsmedlet och är blandbara därmed. När cellulosaderivatlösningen fördelas genom utsprutning genom något lämpligt organ, t.ex. med sprutmunstycke, resulterar tryckfallet och blandbarheten av det inerta lösnings- medlet i vattenlösningen i att en dispersion bildas och att porösa pärlor av cellulosaderivatet sedan utfälles.

Vid utfällningen av cellulosapälorna måste en tillräcklig mängd av lösningsmedelskomponenten (b) vara närvarande för att lösningen med cellulosaderivatet skall få tillräckligt mycket högre densitet än utfällningslösningen. Tabell l anger ett an- tal inerta organiska lösningsmedel för utfällning av ett cellu- losaderivat i en vattenhaltig lösning. De angivna förhållandena är de minimivärden som erfordras för att få en lösningsmedels- lösning som har en densitet högre än hos vatten. Av tabellen framgår att ju högre den specifika vikten hos komponenten (b) är, desto mindre mängd erfordras av denna komponent för att upp- nå den minimala densiteten. - io 452 161.

Z Tabell l Lösningsmedel p Komponent_(b)_ Minsta volymför- Komponent (a) hållande a:b Aceton Dimetylsulfoxid 70:30 Aceton Etylendiklorid_ 80:20 Aoeton Metylendiklorid _ 80:20 Aoeton Formamid 75:25 Aceton . Cyklohexanon - 45:55 Aceton Metyiaceeat i 35:65 _ Efter utfällning av de porösa pärlorna regenereras cellu- losa ur derivatet genom hydrolys för att skapa flera aktiva punk- ter för fasthållning av enzym. Vid Iegenerering av cellulosa från dess derivat efter bildandet av pärlorna kan man avlägsna de sub- .stituerande grupperna (såsom aoetat ur oellulosaacetat) för att regenerera alla hydroxylgrupperna som normalt förekommer i cellu- losamaterialet. Ju högre graden av regenerering är, desto högre stabilitet får de resulterande pärlorna. I vissa fall där enzymer skall immobiliseras på cellulosapärlbärarna är det önskvärt att omvandla hydroxigrupperna eller de substituerande grupperna till funktionella kemiska grupper, såsom aminogrupper, vilket underlät- tar fasthållande av enzym.

På bifogade ritningar är fig. 1 ett diagram över partikel- storleksfördelningen hos de porösa pärlorna. Fig. 2 är ett elektron- mikroskopiskt fotografi av en porös cellulosapärla. Fig. 5 visar ett diagram över tryckfallet i de porösa cellulosapärlorna. Fig. 4 (A) är ett elektronmikroskopiskt fotografi av ytan av en porös oellulosapärla i 20000 gångers förstoring. Fig. 4 (B) är ett elektronmikroskopiskt fotografi av det inre av en porös cellulosa- pärla i 20000 gångers sförstoring. _Fig. l visar storleksfördelningen av de slutliga porösa pärlorna som erhålles genom fördelning (medelst sprutning) av en lösning av cellulosaderivat genom ett sprutmunstycke i enlighet med den nedan närmare beskrivna metoden. Pärlor som är antingen för stora eller för små beroende på det avsedda slutliga använd- ningsändamâlet kan eventuellt uppsamlas och upplöses på nytt.i lös- ningsmedlet, Vid användning av en kemisk reaktor av kolonntyp fö- 11 - ' 452 161 redrar man i allmänhet pärlor av likformig storlek. Den önskade partikelstorleken kan variera beroende på den avsedda användning- en av pärlorna, t.ex. typen av enzym som skall immobiliseras.

De genom den ovan beskrivna metoden framställda porösa- cellulosapärlorna har vanligen en mycket hög porositet azh en reglerad porstorlek liggande mellan 0,05 och 30 mikron. När- man använder ett förhållande av l:l0 (vikt/volym) mellan cellu- losa och lösningsmedel vid framställning av cellulosa/lösnings- medelslösningen kan de bildade slutliga pärlorna ha en porositet av c:a 90 % håligheter. Fig. 2,'4 (A) och 4 (B) visar med svep- elektronmikroskop tagna bilder av en porös cellulosapärla somw framställts enligt uppfinningen. Av dessa bilder kan man se flera viktiga särdrag hos de framställda pärlorna. För det första kan man se att pärlorna är i stort sett sfäriska till formen och att poröppningar är likformigt fördelade över pärlor- nas yta. För de flesta användningsändamål är detta önskvärt, enär man får en immobiliserad enaymkatalysator med likformïg ak- tivitet; Hålighetsfasen i cellulosapärlorna är kontinuerlig.

Detta är ett önskvärt särdrag enär en diskontinuerlig, separat "bubbla" skulle resultera i ett onyttigt och icke tillgängligt dött utrymme i ett immobiliserat enzymsystem. För det tredje f&'ekommer icke något hårt "skinn" på pärlans yta. Ett hårt skinn skulle bilda ett allvarligt diffusionshinder. Slutligen är porstorlekarna fullt likformiga. Som resultat härav kommer hela den inre ytarean av de inre tomrumen i pärlorna att vara tillgänglig för enzymimmobilisering och för enzymkatalyserade reaktioner. Både den höga porositeten och andra iakttagna egen- skaper har gjort att de porösa oellulosapärlorna enligt uppfin- ningen är enastående väl lämpade för användning vid immobilise- ring av enzymer och andra biologiskt verksamma medel.

F En viktig egenskap hos enzymbäraren är det tryckfall som den förorsakar vid olika vätskeströmningshastigheter genom en enzymreaktor som innehåller bäraren. Det är sålunda exempelvis vanligt att använda DEAE-cellulosa i industrin som enzymbärare för omvandling av glykos till fruktos. För DEAE-cellulosan är tryckfallet mycket högt och följaktligen kan man endast använda grunda bäddar för att få en vätskaströmningshastighet av rimligt _ 12 g~4s2 161 värde. Tryckfallet förorsakat av de porösa cellulosapärlorna_ enligt uppfinningen i en packad pelare visas av kurvan A i fig. 3.

Den nominella linjära strömningshastigheten beräknas genom att dividera den volymetriska strömningshastigheten av den till pe- laren tillförda matningsvätskan med pelarens tvärsektionsarea.

I praktisk drift kommer den nominella linjära strömningshastig- heten i industriella kolonnreaktorer att bli mindre än 0,5 om/sek.

För en reaktorkdonn med en innerdiameter av 60 cm blir t.ex. en linjär hastighet av 0,5 m/sek. likvärdig med en volymetrisk ström- ningshastighet om 5254 liter/timme._ Vid en typisk industriell operation_för en framställning av fruktos från glukos, är socker- g koncentrationen i den tillförda lösningen c:a 0,6 kg socker/liter.

Med den ovan angivna strömningshastigheten koumer~utbytet att bli mer än 27 miljoner kg produkt per år för en kolonn med 60 om diameter. På grund av fordran på uppehållelsetid bestämd av en- zymreaktionen blir den linjära strömningshastigheten vanligtvis mindre än 0,5 cm/sek. Man ser sålunda att de porösa cellulosa- pärlorna enligt uppfinningen icke medför nâgra allvarliga tekniska problem med avseende på tryckfallet, när de användes i kemiska reaktorer av kolonntyp såsom bärare på vilka enzymer och andra biologiskt aktiva medel kan immobiliseras. När de porösa cellu- losapärlorna efter riktig derivatisering användes för andra po- I tentiella ändamål (t.ex. avlägsnande av tannin från fruktsaft, vin eller öl eller avlägsnande av metalljoner från utspädda lösningar)kan vätskeströmningshastigheten genom reaktorkolonnen bli mycket större än det ovan angivna värdet 0,5 cm/sek.

Strömningsegenskaperna och andra fysikaliska och mekaniska egenskaper hos de porösa oellulosapärlorna kan förbättras genom att bilda tvärbindningar med bi- och/eller multifuriktionella föreningar. Kurvan B i fig. 3 visar tryckfallskravet på de porösa cellulosapärlorna efter_behandling med tolylen-2,4-diiso- oyanat och enzymmobilisering._ Över en nominell linjär hastig- het av 2 cm/sek. blir de obehandlade cellulosapärlorna (kurva A) sammanpressade och avsevärt deformerade, vilket resulterar i- en drastisk ökning av tryckfallet. Kurvan.B kröker sig endast obetydligt uppåt, vilket tyder på obetydlig deformation av de behandlade pärlorna, om någon sådan alls.

Behandling av de porösa cellulosapärlorna med tvärbind- 15 452 161 ningsmedel, antingen före eller efter hydrolys av pärlorna, re- sulterar i en ökning av deras fysikaliska styrka; Avsättningen av enzym på pärlorna kommer också att öka deras fysikaliska styrka. Efter behandling med t.ex. ett diisocyanat (t.ex. _ tolylen-2,4-diisocyanat eller hexametylendiisocyanat) blir pärlorna helt fasta och starka. Tvärbindning med epiklorhydrin förbättrar också de fysikaliska egenskaperna hos de porösa cellu- losapärlorna. Kemin avseende tvärbindning av polysackarider, in- nefattande cellulosa och stärkelse, är en väl utvecklad gren av vetenskapen. Andra lämpliga tvärbindningsmedel omfattar b1.a. formaldehyd i ealtsyralösning eller glutaraldehyd. Många andra tvärbindningsmedel för kolväten är förut kända, t.ex. genom amerikanska patentet nr 3.905.954.

De porösa pärlorna enligt föreliggande uppfinning fram- stalles i allmänhet genom följande åtgärder: a) En hydrolyserbar form av cellulosa upplöses i ett inert, organiskt, med vatten blandbart lösningsmedel i ett reg- lerat förhållande mellan cellulosaderivat och lösningsmedel, som i allmänhet håller sig inom området 1:20 till 1:3 (viktzvolym), för att bilda en lösningsmedelslösning. Lösningsmedlet skall vara fullständigt eller i huvudsak fullständigt blandbart med utfällningslösningen, och densiteten av lösningsmedelslösningen skall vara tillräckligt hög för att vid kontakt med utfällnings- lösningen, ílösningsmedlet skall bli lätt blandbart med utfäll- ningslösningen och oellulosaderivatet utfällas däri. b) En lösningsmedelslösning fördelas (t.eX. genom sprut- ningl i form av små droppar i en utfällningslösning. vid kontakt med utfällningslösningen, som kan vara ett ytaktivt medel, dis- pergeras lösningsmedlet och porösa pärlor av cellulosamaterial bildas som koagulerar och sjunker till bottnen av behållaren som upptager utfällningslösningen. Cellulosaderivatlösningen kan lämpligen genom ett atomiserande munstycke sprutas under tryck in i badet av utfällningslösningen. Eventuellt kan badet omrö- ras för att befordra bildandet av pärlor. c) Efter att de utfällda pärlorna tvättats hydrolyseras desamma för att regenerera cellulosan, varigenom bildas porösa cellulosapärlor med verksamma punkter för fasthållande av enzym. :14 452 161 För att öka de pprösa pariomas stabilitet eller bíiaa lämpliga ' reaktionspunkter kan man eventuellt kemiskt modifiera pärlornai på ett antal olika sätt. Exempelvis kan pärlorna utbildas med tvärbindningar för att ge bättre stabilitet och ökad fysikalisk styrka. 'Dessutom kan man kemiskt substituera antingen positivt 'laddade_eller negativt laddade grupper för att ändra cellulosa- pärlornas ytabsorberande egenskaper. Cellulosan själv är vanligt- p vis hydrofil, och genom att ändra reaktionspukterna därpå kan 'man sålunda ändra dess hydrofila egenskaper.

Genom förfaringssättet enligt föreliggande uppfinning kan vidare enzymer och andra biologiskt aktiva medel immobili- seras genom avsättning på de här beskrivna porösa cellulosa- pårlorna. Exempelvis kan.man omvandla porösa cellulosapärlor av det ovan beskrivna slaget till dietylaminoetyl(DEAE)-cellu- losa genom att omsätta pärlorna med N, N-dietyl-2-kloretylamin- hydroklorid på konventionellt sätt. Så erhållna pärlor innehål- ler DEAE-cellulosa och har med framgång använts för att binda glukosisomeras, erhållen ur en kultur streptomyoin. Vidare har 'l en prooedur tillämpats vid vilken cyanogenbromid använts för att immobilisera glukosisomeras.

En annan procedur för enzymimmobilisering på de porösa oellulosapärlorna innefattar användning av tolylen-2ï4-diiso- cyanat.. Diisooyanat användes för att åstadkomma tvärförbind- ningar hos cellulosa i och för förbättring av den fysikaliska styrkan av de porösa pärlorna. Emellertid har befunnits att de porösa_ce1lulosapärlorna enligt föreliggande uppfinning, när de behandlas med diisocyanat, kan immobilisera enzymer på ytan genom att an helt enkelt blandar de diisocyanatbehandlade pär- lorna med en enzymlösning. När exempelvis.glukosamylas användes, kunde diisocyanatpärlorna fasthålla mer än 1000 internationella enheter enzym per gram torra pärlor. Utan att uppfinningen på något sätt är bunden till följande teori tycks det gälla att nr- torra porösa cellulosapärlor befinner sig i torr aceton med tolylen-2,4-diisooyanat i närvaro av en katalysator (t.ex. tri- etylanin), så bildas en avsevärd mängd tvärförbindningar mellan cellulosamolekylerna att döma av pärlornas förbättrade fysika- '1 liska styrka. Efter en tillräckligt lång reaktionstid tvättades »___-_ ___-, > - - 15 rr452 161 pärlorna med torr aceton för att avlägsna återstoder av fritt diisocyanat. Cellulosapärlorna tycktes ha ett stort antal fast- hållna isocyanatgrupper. Efter blandning av de behandlade pär- lorna med en vattenhaltig enzymlösning, föreföll enzymmolekylerna vara kovalent bundna till cellulosapärlorna genom isocyanatgrup- penia-.A Det har aren visat sig att tvättning av de behandlade pärlornadmed vatten resulterar i att i isocyanatgrupperna omvand- las till aminogrupper. På detta sätt lyckades det att immobili- sera ett enzym, glukoamylas, vid aminocellulosapärlorna med glutaraldehyd, ett medel som är välkänt för sin förmåga att rea- gera med och tvärförbinda aminogrupper'(på pärlorna och en- zymet){ De porösa cellulosapärlorna som framställs enligt före- iggande uppfinning kan även få användning vid separation och rening av enzymer, proteiner, nukleinsyror och liknande. De porösa cellulosapärlorna som framställts enligt föreliggande uppfinning kan derivateras'för att bilda porösa DBAE-cel1ulosa- pärlor vilka har utmärkta strömningsegenskaper och likväl kan effektivt separera enzymer, proteiner, nukleinsyror och liknande lika effektivt som vanliga kommersiella produkter, vilka används vid teknik som är känd som kolonnkromatografi.

Man kan även derivatisera de porösa cellulosapärlorna r enligt föreliggande uppfinning (in situ) med andra grupper än DEAE. De porösa cellulosapärlorna enligt föreliggande uppfin- ning kan sålunda användas för en mångfald olika användningsända- g mål. Exempelvis kan man fästa en specifik funktionell grupp vid de porösa cellulosapärlorna, och de sedan derivatiserade pärlorna kan användas för att exempelvis avlägsna tainin ur frukt- safter genom att leda saften genom en bädd av de derivatiserade porösa cellulosapärlorna med protein.

På liknande sätt kan man avlägsna metalljoner ur utspädda. löningar vari sådana ingår. En sådan metod skulle kunna använ- das för återvinning av värdefulla metalljoner (t.ex. kopprjoner och guldjoner) ur utspädda lösningar i bergsbruket och skulle kunna vara särskilt användbar vid nutida metoder för lösnings- behandling där metaller extraheras ur malmer genom sura lös- ningar. _ 16 452 161 Uppfinningen beskrivas ännu mera detaljerat genom föl- jande exempel som icke får tolkas som någon begränsning av -uppfinningens räckvidd.

Exemnel I p I 50 g cellulosaacetat (Visc 3 från Eastman' Kodak Chemicals) upplöstes i 400 ml av lösningsmedel A (bestående av aceton och dimetylsulfoxid med volymförhållande av 6:4) för att bilda en 12 %-ig (vikt/volym) lösning. Med en sprutpistol (t.ex. en färgspruta från Sears Roebuck & Co.) sprutades cellulosalös- ningen därefter med ett lufttryok av 1,37 bar såsom fina drop- par in i en vattentank som innehöll 150 liter vatten och 4 droppar av en detergent av vanlig hushållskvalitet. Vid kontakt med vatt- nets yta koagulerar cellulosaacetatdropparna till porösa pälor och sjunker till botten. De porösa pärlorna uppsamlades sedan och tvättades. De tvättade pärlorna deacetylerades sedan med 'o:a 0,15 N natriumhydroxid övernatten vid rumstemperatur. De acetylerade pärlorna tvättades sedan och torkades genom avsug- ning, varvid erhölls en porös cellulosabädd som hade en por- volym-större än 50 volym-% och som var färdig för användning .till enzymimmobilisation. Fig. l visar storleksfördelningen av de erhållna porösa pärlorna. Undersökning med elektronmikro- skop visade att pärlorna var i stort sett sfäriska och hade samma struktur i_det inre som i ytskiktet. Porstorlekarna var helt_likformiga och porerna var likformigt fördelade över hela pärlan såsom visas i fig. 2, 4 (A) och 4 (B). Porstorleken hos pärlorna bestämdes från bilder tagna med elektronmikroskop.

För_mikrofotograferingen fordras att proven är torra, och då torkning av pärlorna i luft resulterar i en krympning av.stor- lehen, torkades pärlorna med flytande koldioxid. Porstorleken bestämdes till att vara cza 1000 Å. V Exempel II.

Med användning av en 10 %-ig (vikt/volym) oellulosaacetat- lösning i lösningsmedel a, bildades enligt samma metod som i ex- empel I porösa pärlor, vilka var lämpliga för användning vid enzymimmobilisationr 17 ' ° 452 151 Exemoel III. - En 10 %-ig (vikt/volym) lösning av cellulosaacetat (Visc 3 från Eastman Kodak Chemicals) framställdes i lösningsmedel B '(aceton och formamid i ett volymförhållande av 7:3). Cellulosa- gacetatlösningen finfördelades sedan.genom utsprutning och hydro- lyserades på det sätt som angivits i exempel I ovan. Högporösa oellulosapärlor erhölls som hade håligheter större än 50 volym-%.

Exempel IV.

Procedurerna enligt exempel II upprepades med användning av en lösning som framställts av cellulosaacetat av Visc 45-typ (från Eastman Kodak Chemicals). Porösa pärlor erhölls vilka hade utmärkta egenskaper för enzymimmobilisation. I Exempel V.. _ De i exempel II ovan angivna procedurerna utfördes med användning av en 10 %-ig lösning (vikt/volym) av cellulosa- triacetat-(från Eastman Kodak Chemicals) i lösningsmedel A. be därvid erhållna pärlorna uppvisade utmärkt porositet för enzymimmobilisation. Såsom redan nämnts kan cellulosa användas som ett stöfimaterial för immobilisation av enzymer och andra biologiskt aktiva medel. I många fall har valts cellulosa som stödmaterial enär cellulosa är billigt, kemiskt stabilt och motstândskraftigt mot mikrobiologisk nedsmutsning. Vidare har cellulosa tre hydroxylgrupper på varje anhydroglukosenhet, vilket ger god allsidighet liksom hög kapacitet för imobili- sering av önskat ämne.

Den stora olägenheten med användning av cellulosa som stödmaterial är att cellulosa har fibrös form och saknar den erforderliga mekaniska styrkan. Reaktdrer packade med cellu- losa har dåliga strömningsegenskaper, utvecklar besvärande högt tryckfall och uppvisar ofta kanalisering. För att lösa detta problem frænställes enligt uppfinningen cellulosa i pärlform som ger bättre mekanisk styrka och förbättrade strömningsegen- skaper jämfört med tidigare material. _Enär strukturen hos cel- lulosapärlorna skiljer sig från strukturen hos vanlig cellulosa, kan emellertid upptagandet av enzymer och stabiliteten hos de immobilíserade enzymerna skilja sig från vad som gäller för vanlig cellulosa. De kemiska reaktioner som ingår i framställ- ningen av immobiliserade enzymer påverkar icke endast upptag- .påverkar även den mekaniska styrkan hos cellulosapärlorna. _ ' 18 452 161. ningen och stabiliteten hos enzymet på cellulosapärlorna, ntan Så- dana kemiska procedurer för immobilisering av enzymer, som ökar den mekaniska styrkan hos oellulosapärlorna, förbättrar även strömningsegenskaperna i en reaktor, såsom framgår av exemplen.

Exempel VI ' 1 g porösa oellulosapärlor framställda enligt exempel I dispergerades i 15 ml vatten som med natriumhydroxid givits ett pH-värde av 11,5 och hölls vid en konstant temperatur av 2000. 1 g cyanogenbromid tillsattes till denna dispersion. pH-värdet ¿hölls vid 11,5 med 1 N Na0H. Efter 15 minuter tvättades pärlerna med fosfatbuffer, (0,1 M) vid pH=7,0 och 0°C. 15 ml glukoamylas- lösning (30 mg/ml) tillsattes sedan till pärlorna. Blandningen fick stå över natten. De så framställda pärlorna innehöll 1850 enheter enzymaktivitet per gram torrvikt av cellulosapärlorna vid 60°C med användning av 5 % maltos som subtrat. En enhet .enzymaktivitet definieras som den storhet som alstrar en mikro- mol av produkten per minut.

Exempel VII _ Porösa cellulosapärlor (0,2 g) erhållna på samma sätt som i exempel I dispergerades i 5 ml aceton. 0,2 ml trietylamin tillsattes till dispersionen liksom 0,2 ml tolylen-2,4-diisocyanat.

Efter 30 minuter tvättades pärlorna med aceton och sedan tillsat- tes en acetatbuffer vid pH = 4,75. 5 ml glukoamylaslösning (25 mg/ml) tillsattes. Enzymen immobiliserades därigenom på pärlorna med en aktivitet av 2000 enheter/g oellulosapärlor.

Exempel V11; ' 0 200 mg glukosisomeras i maleinsyrabufferlösning immobi-7 liserades på 2 g cellulosapärlor genom sanma förfaringssätt som beskrivits i exempel VII. Cellulosapärlorna innehöll 90 enheter enzymaktivitet per gram cellulosapärlor vid 6000 med användning ' av 9 % fruktos som substrat. ÉšÉERÉl_ÉÄ 300 mg invertas i 5 ml acetatbuffer immobiliserades på 0,5 g porösa èellulosapärlor med användning av samma metod beskrivits i exempel VII. Cellulosapärlorna innehöll 5000 en- heter aktivitet per gram använd cellulosa. i 19 452 161 ' Exempel_§ 50 mg laktas i fosfatbuffer (pH = 7,0) immobiliserades på 0,5 g cellulosapärlor med användning av samma förfaringssätt som beskrivits i exempel VI. De resulterande cellulosapärlorna innehöll ungefär 80 enheter enzymaktivitet per gram cellulosa- pärlor vid'50°C med användning av l % laktos som substrat.

Exempel XI 500 mg glukosisomeras upplöstes i l50 ml maleinsyra- buffer (0,0l M, pH = 5,5). Enzymlösningen pumpades genom 5 g porösa tvärförbundna_cellulosapärlor som framställts enligt exempel XVI. De så erhållna DEAE-cellulosapärlorna innehöll lOO enheter enzymaktivitet per gram pärlor.

Exempel XII 0,25 g porösa cellulosapärlor framställda enligt exempel I dränktes i 5 % glutaraldehyd och 0,1 M Mg0l2. Efter torkning med användning av vakumavsugning i en Buchner~tratt upphettades proven till 8000 under 30 minuter. 5 ml glukoamylas (25 mg/ml) tillsattes till pärlorna. Efter att ha stått över natten inne- höll de så framställda pärlorna c:a 200 enheter enzymaktivitet per gram torra oellulosapärlor. ' Eiempel XIII 1 g porösa cellulosapärlor cyanetylerades med 10 ml akrylo- nitril (C = CC 2 N) vid 5000. De så behandlade cellulosapärlorna behandlades sedan med hydroxylamin vid ett pH-värde liggande mel- _ lan 6,5 och 6,7 vid en temperatur av 500 - l00°Q under 4 timmar.

Ngen resulterande produkten av modifierade porösa pärlor innehöll 0 å Nonëgrupper och är lamplig för absorberande av tunga joner såsom ferri-, ferro- och kuprijoner.

Exempel XIV En suspension av 2,5 g porösa cellulosapärlor behandlades med 2,5 ml hexametylendiisocyanat och trietylamin, efterföljt av Produkten behandlades sedan med 50 ml av Den erhållna produkten hade hydrolys i vatten. 0,5 M 0-metylisourea vid pH = 5. följande funktionella grupp: NH;$ -porösa H cellulosa- N - C - NH I Äpärlor som är användbar som anjonisk jonbytare. r J i 5 ml 0,2 N natriumhydroxid och 5 ml epiklorohydrin. 20 452 161 ' iExempel XV _ 5 g porösa cellulosapärlor erhållna enligt exempel I tillsattes till 100 ml 56 %-ig formaldehyd'oeh 200 ml 37 7~ig 'saltsyra._ Efter att ha stått under 1,5 timmar vid rumstempe- ratur filtrerades pärlorna och tvättades därefter med vatten och 0,2 %-ig natriumkarbonatlösning. Pärlorna torkades sedan vid 75 - 8000. De resulterande tvärbundna porösa cellulosa- pärlorna uppvisade hög fysikalisk styrka.

Exempel X¶l _ _ 5 g porösa cellulosapärlor behandlades med formaldehyd för bildande av tvärförbindningar i enlighet med förfarandet i exempel XV. Pärlorna behandlades sedan med 5 gram 2-kloro- trietylamin. Efter upphettning av blandningen under en tid av 35 minuter vid en temperatur av 80 - 85°C tvättades pär- lorna i följd med natriumklorid, natriumhydroxid, saltsyra, vatten och etanol. De med tvärförbíndningar utbildade porö- sa DEAE-cellulosapärlorna_som så erhållits uppvisade utmärkt porositet med en hålvolym större än 50 %.

Exempel XVII En dispersion bildades av 0,5 g porösa cellulosapärlor Disper- sionen upphettades sedan under flera minuter till en tempera- tur av 80°0. Därefter tvättades pärlorna och de så behandla- de; med tvärföbindningar utbildade porösa pärlorna uppvisade större styrka än de porösa cellulosapärlorna före utbildandet av tvärförbindningarna. Våta cellulosapärlor som erhållits en- ligt metoden i exempel I tvättades i aceton. De tvättade pär-- _lorna suspenderades sedan i torr aceton innehållande 0,6 ml trietylamin för varje gram cellulosa. Tolylen-2,4-diisooyanat i en mängd av l,6 ml per gram cellulosapärlor tillsattes till suspensionen vid 000. Efter en period av 50 minuter tvättades pärlorna med torr aceton och filtrerades sedan. de porösa cellulosapärlorna innehöll isocyanatreaktiva grupper som sedan kunde hydrolyseras till en aminogrupp genom tillsätt- ning av vatten.

Exempel XVIII 0,2 g cellulosapärlor framställda enligt exempel 1 sus- penderades i 10 ml destillerat vatten, pH-värdet inställdes på 11,5 genom tillsättninfl av l ¶ Na0H vid 2000. 0,2 g CNBr -De resulteran-' 21 ccc452 151 tillsattes till cellulosapärlsuspensionen i små portioner och H» pH-värdet hölls konstant medelst en autotitratometer med 1 § NaOH.

Efter 20 minuter tvättades pärlorna med iskallt destillerat vat- ten och en lämplig bufferlösning. Enzymer upplösta i en lämplig bufferlösning tillsattes till de tvättade cellulosapärlorna.

Vid denna metod använd cellulosa (BOLKA FLOC") merseriserades med 18 %-ig NaOH under 4 timmar och tvättades sedan med destille- rat vatten.

Exempel XIX I 2 g genom avsugning torkade cellulosapärlor enligt exem- pel I tvättades med aceton för att avlägsna fuktighet och sus- penderades i 10 ml aceton. 0,1 ml trietylamin eller dibutyl- tenndiacetat tillsattes som katalysator. 0,1 ml tolylen-2,4- diisocyanat eller hexametylendiisocyanat tillsattes till Cellu- losapärlsuspensionen. Efter reaktion under 45 minuter vid rums- temperatur tvättades cellulosapärlorna med aceton för att av- lägsna överskott av diisooyanat, och därefter användes vatten för att tvätta cellulosapärlorna och avlägsna aceton. Enzymer upplösta i en lämplig bufferlösning tillsattes till'cellulosa- pärlorna. Cellulosapärlorna förvarades vid 4°C över natten.

Exempel XX Akryldiisocyanat infördes i cellulosapärlorna på sama säzt som i exempel XIX. Innan enzymlösningen tillsattes hade cellulosapärlorna suspenderats i destillerat vatten. 0,1 ml trietylamin tillsattes för att katalysera reaktionen mellan isocyanat och vatten för att bilda arylamincellulosapärlor.

Arylaminderivatet diazoterades sedan med NaN02 i H01. Enzymer suspenderade i en lämplig bufferlösning infördes sedan i cellu- losapärlorna. I Exempel XXI Diisocyanat fäst på cellulosan enligt exempel XIX reage- rar med vatten för att bilda en aminogrupp med eller utan en tertiär amin som katalysator. Glytaraldehyd användes för att koppla enzymen med cellulosapärlorna genom att tvärförbinda aminogrupper på enzymerna eller på cellulosapärlorna.

Exempel XXII 2 g genom avsugning torkade pärlor framställda enligt exempel I suspenderades i 10 ml 3%-ig glutaraldehyd som var 0,1 M i Mg C12. Suspensionen upphettades vid lOO°C under _. 22 452 161 30 minuter. Cellulosapärlorna tvättades sedan med destillerat vatten. Enzymer upplösta i en lämplig bufferlösning tillsattes till oellulosapärlorna. Reaktionen fick fortsätta över natten via 4°c, _ l ' Exempel XXIII_ _ s 1 g cellulosapärlor framställda enligt metoden i exempel I behandlades med_10 ml 10%-ig 3-aminopropyltrietoxisilan i to- luen under 4 timmar i en refluxapparat. Gellulosapärlorna - filtrerades sedan och tvättades med aceton.~ 2,5%-ig glutar- alaehyaiösning 1 0,1 M fosfavbuffer (pH e 7;o) tillsattes vill cellulosapärlorna vid rumstemperatur med omröring då och då under l timme.' Gellulosapärlorna tvättades sedan omsorgsfullt med vatten och en lämplig buffer1ösning.“ Enzymer upplösta i lämplig bufferlöning tillsattes till ce1lu1osapärlorna.~ Reak- fionen fick fortsatta över natten via 4°c.

Exempel XXIV Porösa cellulosapärlor framställda enligt metoden i eexempel I utbildades med tvärförbindningar medelst 36%-igf formaldehyd och 37%-ig H01 med ett volymförhållande av 5:1.

De tvärförbundna cellulosapärlorna (5 g torrvikt) suspende- rades i 50 ml kall 1,5 § Na0H-lösning. 6 g 2-klorotrietyl- aminhydroklorid tillsattes till cellulosapärlorna. Blandningen upphevtaaes sedan via eo - s5°c under 35 minuter. Biananingen kyldes i ett isbad och filtrerades. Cellulosapärlorna tvättades med 500 ml ZE NaCl och tvättades sedan med 200 ml 1 E NaOH och 200 ml 1 E NaOH alternerande tre gånger. Efter tvättning med ytterligare 200 ml 1 § Na0H tvättades cellulosapärlorna med l destillerat vatten till dess att pH-värdet hos tvättvattnet_ blev neutralt. Reaktionen med 2-klorotrietylaminhydroklorid upprepades på nytt för att få en högre grad av substitution.

Enzymer upplösta i en lämplig buffer tillsattes till cellulosa- - pärlorna och lämnades över natten vid 4°C.

Exempel XXV I Hexametylendiisocyanat fästes på cellulosapärlorna på sätt som beskrivas i exemplen XIV, coh sedan hydrolyserades isocyanatgrupperna för att bilda en aminogrupp, såsom beskri- vits i exemplen XX.. O-metylisourea tillsattes till cellulosa- pärlorna för att inkorporera guanidinofunktionen i de derivati- serade pärlorna. 23 452 161 ' Exemp1en_XVIII - XXIII avser immobilisering av enzymerllf genom kovalent bindning, medan exemplen XXIV och XXV använder jonadsorption. Glykoamvlas, glykosisomeras och invertas in- fördes i olika pärlor i exemplen XVIII - XXV och mängden en- zymtillsats uppmättes. _De genom kovalent bindning immobiliserade enzymerna tvättades med 2 M Naöl-lösning för att avlägsna_de absorberade enzymerna. Vissa egenskaper hos de immobiliserade enzymerna _anges i tabell 2. Det visar sig att sanna kemiska förfarande som används för reguljär cellulosa även kan användas för goellulosapärlor. Det förhållandet att cellulosapärlorna har högre förmåga att bära enzymer än reguljär cellulosa kan an- tyda enstörre ytarea hos de porösa cellulosapärlorna.

Exempel XXVI .

- Protein och enzymer kan separeras och renas enligt följande förfarande. 2 g glykosisomeras (Streo. albgg erhållet _ från Miles Laboratory) suspenderades i 20 ml 0,01 ß fosfatbuffer (pH = 7,01 och suspensionen centrifugerades, och det som flöt upp tillsattes till en pelare av porösa DEAE-cellulosapärlor framställda enligt exempel XVI. Bäddvolymen var 30 ml och pe- larens diameter 1,5 cm. Pelaren tvättades med 0,01 M fosfat- buffer (pH = 7,0). Éelaren eluderades med NaCl-gradientlösning i 0,01 E fosfatbuffer. Glukosisomeras började eludera ut ur pelaren och in i NaCl-fraktionerna vid koncentrationer liggan- de mellan 0,25 och 0,45 M. 452 161 i 24 Qëyell 2 _Enzvmbeläggninz nå Dorösa cellulosapärlør Énzymer' Sätt för Enzymbeläggníng på cel- Försöksvillkor immobíli- lulosan, internatí0nel~ . sering, la enheter/g (beräknat exempel ur den initiala reak- tionshastígheten) Reguljär Porösa cel- cellulosa lulosapärlor xv11I 020 1000 10% malros, 60°c ' XIX 550* " 3 G1uk°amy1as XX 275 10% maltos, 40°0 (Å~ Oryzae) Xx: - 550 5% maltøs, 60°0 - XXII _so 190 10% ma1t°s, 60°c 0 _ XXIII 200 " ; Glukoêmylas XXIV 5000 9000 7 I " i (A._N1ger) XXV 1000 ¶ “ E . 010103150- XIX 90 0,5M fruktos, 60°0 É i meras f (Strap. XXIV I 300 " * 'albus) - HV ; 160 " f Inverçës XIX ~ 1140 0,125M sukros, 45°0 _ âgâïâšša xxïv ~ 2000 0 H xxv _ 1040 " I 25 452 161 Exemnel XXVII« Porösa cellulosapärlor enligt ekempel XIII tillsattes till en 0,005 M natriumacetatlösning (pH =_5,2) som innehåller 1600 miljondelar kuprijoner. Efter 1 timme hade cellulosapärlorna upptagit 6,3 % kuprijoner räknat på pärlornas vikt.

Det har vidare befunnits att när de porösa cellulosapär- lorna enligt föreliggande uppfinning torkats och/eller upphet- tats, t.ex. till l00°C före användning, uppvisar de resulte- rande pärlorna förhöjd fysikalisk styrka.

Uppfinningen i dess bredaste aspekter är icke begränsad till de specifika detaljer som beskrivits ovan, utan modifika- tioner av dessa detaljer ligger inom uppfinningens ram och om- fattas av de efterföljande patentkraven. Dessutom kan upp- finningen omfatta, bestå av eller' väsentligen bestå av här ovan angivna material och åtgärder.

Claims (14)

452 161 10 15 20 25 ~ medel , 2!- EÅIEEIEBA!

1., Förfaringssätt för framställning av porösa cellulosapärlor lämpliga för användning som bärare av enzymer och andra biologiska k än n e te c k n a t a v följande åtgärder: a) ett hydrolyserbart cellulosaderivat upplöses i ett inert orga- niskt, med vatten blandbart lösningsmedel för att bilda en lösning som har en densitet större än hos en utfällningslösning, varvid förhållandet mellan cellulosaderivatet och lösningsmedlet ligger i menan 1:20 och 1:30 räknat vikt/voiym; b) nämnda lösning fördelas i form av små droppar i en utfäll- ningslösning, varigenom cellulosaderivatet utfälles 'i form av lik- formigt porösa pärlor; c) de utfällda pärlorna avskiljes från lösningen; d) de avskilda porösa pärlorna tvättas med vatten; e) de tvättade pärlorna hydrolyseras för att omvandla pärlorna till cellulosa och öka de aktiva ställena för fästande avenzymer och andra biologiska medel; f) de hydrolyserade pärlorna tvättas för att erhålla porösa cel- lulosapärl or som har en likformigt fördelad hålvolym större än 50 volym-i; ; och g) de porösa cellulosapärlorna utbildas med tvärförbindningar medelst minst ett tvärförbindningsmedel för att erhålla tvärför- .bundna porösa cellulosapärlor, varvid pärlorna ntbildas med tvär- förbindningar antingen innan de hydrolyseras eller efter det att de hydrolyserats.

2. Förfaringssätt enligt patentkrav 1, k ä n n e t e c k - n a t därav, att fördel ningen åstadkommes genom utsprutning. 10 15 20 25 452 ' 161 21-

'3. fiirfaringssätt enHgt patentkrav 1, k ä n n e t e c k - n a t därav, att utfä11nings1ösningen utväïjes ur den grupp som består av vatten, bïandningar av vatten och etanoï e11er metanoï, ahexan, cykïohexan, oktan och bensen.

4. J Förfaringssätt enïigt patentkrav 3, k ä n n e t e c k - n a t därav, att utfäïïníngsïösningen är vatten.

A5. Förfaringssätt enïigt patentkrav 1, k ä n n e t e c k - n att därav, att ce11u1osaderivatet är ce11u1osaacetat och att hydroïysen utföres i en kaustik ïösning.

6. Förfaringssätt enïigt patentkrav 1, k ä n n e t e c k - n a t därav, att ïösningsmedïet är en bïandning av: al ett ämne ur den grupp som består av aceton, 1 en bïandning av aceton och metanoï e11er etanoï, mety1acetat, mety1end1k1orid och metanoï, metyïetyïketon, formamid och dimetyïsuïfoxid; och b) ett ämne ur den grupp som består av dimetyïsuïfoxíd, formamid, metyïacetat, cykïohexanon, metyïendikïorid, ety1end1k1or1d, en bïandning av metyïendikïorid och metanoï, och en bïandning av ety'| endi k'| ori d och Inetanoï .

7. _ Förfaringssätt en1igt patentkrav 6, k ä n n e t e c k - n a t därav, att 1ösningsmed1et är dimety1su1foxid, formamid e11er metyïacetat.

8. Förfaringssätt enïigt patentkrav 1, k ä n n e t e c k - n a t därav, att håïvoïymen hos pärïorna ïigger me11an c:a 75 och 95 %.

9. , Förfaringssätt en1igt patentkrav 1, k ä n n e t e c k - _ n a t därav, att tvärförbindningsmedïet är diisocyanat.

10. Förfaringssätt enïigt patentkrav 9, k ä n n e t e c k n a t därav, att diisocyanatet är to1y1en = 2,4-diisocyanat eïïer hexa- metylendiisocyanat. 10 452 161 1?

11. 'Fürfaringssätt enïigt patentkrav 1, k ä n n e t e c k - -In a t därav, att tvärförbindningsmediet är epikïorohydrin i en natriumhydroxidïösning.

12. eFörfaringssätt enïigt patentkrav 1, k ä n n e t e c k - n a t därav, att tvärförbindningsmed1et är forma1dehyd i en sa1t- syraiösning.

13. Förfaringssätt enïigt patentkrav 1, k ä n n e t e c k - n a t därav, att tvärförbindningsmediet är gïutaraïdehyd.

14. E Användning av porösa tvärförbundna ceïïuiosapärïor fram- stäilda enïigt patentkraven 1-13 för immobiiisering av enzymer och andra bioïogiskt aktiva medeï och för separering och rening av enzymer, proteiner och nukïeinsyror.