JPS6030684A - 固定化された微生物菌体もしくは酵素 - Google Patents
固定化された微生物菌体もしくは酵素Info
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- JPS6030684A JPS6030684A JP13935683A JP13935683A JPS6030684A JP S6030684 A JPS6030684 A JP S6030684A JP 13935683 A JP13935683 A JP 13935683A JP 13935683 A JP13935683 A JP 13935683A JP S6030684 A JPS6030684 A JP S6030684A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
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Description
【発明の詳細な説明】
本発明は固定化された微生物菌体もしくは酵素の製造法
に関し、その目的とするところは、基質との反射効率が
著しく高められた固定化された微生物菌体もしくは酵素
のゲルを得ることにある。
に関し、その目的とするところは、基質との反射効率が
著しく高められた固定化された微生物菌体もしくは酵素
のゲルを得ることにある。
従来、微生物、酵素等をアルギン酸塩で包括固定化する
方法は、固定化に際し活性の低下が起フ難（、又食品衛
生上安全な方法として近年食品、医薬工業への応用が試
みられている。
方法は、固定化に際し活性の低下が起フ難（、又食品衛
生上安全な方法として近年食品、医薬工業への応用が試
みられている。
そして通常、微生物菌体もしくは酵素をアルギン酸塩で
包括固定化する場合、アルギン酸塩の水溶液に該微生物
菌体もしくは酵素を懸濁したものを１通常のゲル化剤中
に注射器もしくハ゛多孔板等より滴下もしくは流下させ
ることにより１球状もしくは糸状のゲルに底型されてい
る。その際、ゲル粒子径の調整は、一般に滴下の流速を
調節することにより行なわれているが、アルギン酸塩浴
液は粘度が高（、又液滴は液体の表面張力と重力とのバ
ランスにより形成されるため１滴下に使用されるノズル
の外径より大きい粒子径のものしか成型することが出来
ない。かぐして、従来はユ爾ｌ〜６ ｃｍ程度の粒子径
のものが得られている。
包括固定化する場合、アルギン酸塩の水溶液に該微生物
菌体もしくは酵素を懸濁したものを１通常のゲル化剤中
に注射器もしくハ゛多孔板等より滴下もしくは流下させ
ることにより１球状もしくは糸状のゲルに底型されてい
る。その際、ゲル粒子径の調整は、一般に滴下の流速を
調節することにより行なわれているが、アルギン酸塩浴
液は粘度が高（、又液滴は液体の表面張力と重力とのバ
ランスにより形成されるため１滴下に使用されるノズル
の外径より大きい粒子径のものしか成型することが出来
ない。かぐして、従来はユ爾ｌ〜６ ｃｍ程度の粒子径
のものが得られている。
又ゲル包括法により固定化された微生物もしくは酵素を
用いて酵素反応を行なう場９合、該酵素反応を効率的に
行なわせるには、該固定１しゲル中へ基質を充分透過さ
せることが極めて重要である。
用いて酵素反応を行なう場９合、該酵素反応を効率的に
行なわせるには、該固定１しゲル中へ基質を充分透過さ
せることが極めて重要である。
この際、該ゲルは基質の移動に対し抵抗（拡散抵抗）を
示すため、ゲル粒子径の小さいもの程反応効率が高（、
又固定化微生物を用いる場合、従来の粒子径の大きいゲ
ル内の微生物はゲル表面の近辺で増殖し易丁（、該酵素
反応はゲルの表層近辺にしか寄与されない（福井等編「
酵素工学」第３ｇｇ〜３９才頁、東京化学同人社発行）
等の理由で、反応効率を高めるには物質移動距離を短か
ぐシ。
示すため、ゲル粒子径の小さいもの程反応効率が高（、
又固定化微生物を用いる場合、従来の粒子径の大きいゲ
ル内の微生物はゲル表面の近辺で増殖し易丁（、該酵素
反応はゲルの表層近辺にしか寄与されない（福井等編「
酵素工学」第３ｇｇ〜３９才頁、東京化学同人社発行）
等の理由で、反応効率を高めるには物質移動距離を短か
ぐシ。
ゲル粒子を微小１シシ、それに伴いゲルの表面積を増加
させることが望まれている〇 一方、マイクロカプセル法により微生物菌体もしくは酵
素を固定化した場合、微小粒子の成型は可能であるが、
このような成型操作が煩雑であることの他、モノマー、
重合触媒もしくは有機浴剤等を使用するため、活性を著
しく低下させる等の欠点がある。
させることが望まれている〇 一方、マイクロカプセル法により微生物菌体もしくは酵
素を固定化した場合、微小粒子の成型は可能であるが、
このような成型操作が煩雑であることの他、モノマー、
重合触媒もしくは有機浴剤等を使用するため、活性を著
しく低下させる等の欠点がある。
本発明は、このような従来技術の欠点を解消し、固定化
された微生物菌体もしくは酵素のゲル粒子径を微小とし
、基質との反応効率の著しく高められた固定化ゲルを容
易に得ることができるようにしたものである。
された微生物菌体もしくは酵素のゲル粒子径を微小とし
、基質との反応効率の著しく高められた固定化ゲルを容
易に得ることができるようにしたものである。
即ち、本発明は、微生物菌体、酵素をタンニン液、もし
くは親水性有機溶媒、およびゲル基材としてアルギン酸
ナトリウム、アルギン酸カリウム、もしくはアルギン酸
アンモニウムと混合した液を、ゲル化剤と噴霧接触させ
微小ゲルとすることを特徴とする固定化された微生物菌
体もしくは酵素の製造法である。
くは親水性有機溶媒、およびゲル基材としてアルギン酸
ナトリウム、アルギン酸カリウム、もしくはアルギン酸
アンモニウムと混合した液を、ゲル化剤と噴霧接触させ
微小ゲルとすることを特徴とする固定化された微生物菌
体もしくは酵素の製造法である。
以下、本発明について詳述する。
先ず１本発明に用いられる微生物菌体としては、細菌、
酵母、黴、放線菌等、如何なる種別の菌体でも良い。又
酵素も如何なる種別のものでも良く。
酵母、黴、放線菌等、如何なる種別の菌体でも良い。又
酵素も如何なる種別のものでも良く。
例えばアルコール脱水素酵素、グルコースオキシダーゼ
、乳酸脱水素酵素等の酸１し還元酵素、Ｄ−グルタミル
トランスフエラーゼ、グルタミントランスアミネース、
ヘキンキナーゼ等、の転移酵素、ロイシンアミノペプチ
ダーゼ、カルボキシペプチダーゼ、ベニシリナーゼ等の
加水分解酵素、フマラーゼ、アスパルターゼ、β−チロ
シナーゼ等のりアーゼ酵素、グルコースイソメラーゼ、
マンノースイソメラーゼ等の異性化酵素、グルタチオン
シンターゼ、ＮＡＤシンターゼ等のりガーゼ酵素等が代
表例として挙げられる。
、乳酸脱水素酵素等の酸１し還元酵素、Ｄ−グルタミル
トランスフエラーゼ、グルタミントランスアミネース、
ヘキンキナーゼ等、の転移酵素、ロイシンアミノペプチ
ダーゼ、カルボキシペプチダーゼ、ベニシリナーゼ等の
加水分解酵素、フマラーゼ、アスパルターゼ、β−チロ
シナーゼ等のりアーゼ酵素、グルコースイソメラーゼ、
マンノースイソメラーゼ等の異性化酵素、グルタチオン
シンターゼ、ＮＡＤシンターゼ等のりガーゼ酵素等が代
表例として挙げられる。
上記した酵素は、タンニンもしくは多官能性架橋試薬で
不溶化させるか、又は該酵素を不溶化担体に吸着させる
。
不溶化させるか、又は該酵素を不溶化担体に吸着させる
。
先ず、タンニンで不溶１ヒさせる場合は、酵素量に対し
ｌ〜７０倍皿’（Ｗ／Ｗ）のタンニンを含有する溶液を
加え、ｐＨＡ’以下、好ましくはｌ）Ｈ，７〜２で攪拌
しつつ反応させ、得られた酵素沈澱物より例えば遠心分
離、ｆ過等の通常の分離手段を用いて不溶１６酵素をイ
ひる。
ｌ〜７０倍皿’（Ｗ／Ｗ）のタンニンを含有する溶液を
加え、ｐＨＡ’以下、好ましくはｌ）Ｈ，７〜２で攪拌
しつつ反応させ、得られた酵素沈澱物より例えば遠心分
離、ｆ過等の通常の分離手段を用いて不溶１６酵素をイ
ひる。
なお上記タンニンとしては、タンニン酸の他、ピロガロ
ールタンニン例えば没食子タンニン又は五倍子タンニン
、カテコールタンニン例えば茶、カカオ等から得られる
タンニン質分（カテコール重合体）等が用いられる。こ
れらのタンニンはタンニン作用を有する限フ精製されて
いないものでも良く、例えは市販の柿渋タンニン等も用
いられる。これらは単独でも二種以上のタンニン混合物
としても用いることが出来る。
ールタンニン例えば没食子タンニン又は五倍子タンニン
、カテコールタンニン例えば茶、カカオ等から得られる
タンニン質分（カテコール重合体）等が用いられる。こ
れらのタンニンはタンニン作用を有する限フ精製されて
いないものでも良く、例えは市販の柿渋タンニン等も用
いられる。これらは単独でも二種以上のタンニン混合物
としても用いることが出来る。
又、多官能性架橋剤で不溶化させる場合は、前記酵素を
ｌ−一〇％（Ｗ／Ｖ）の多官能性架橋剤を含有する液に
加え、！〜グｏ’６で１０分〜１６時間反応させ、得ら
れた酵素沈澱物より例えば遠心分離、ｆ過等の通常の分
離手段を用いて不溶化酵素を得る。
ｌ−一〇％（Ｗ／Ｖ）の多官能性架橋剤を含有する液に
加え、！〜グｏ’６で１０分〜１６時間反応させ、得ら
れた酵素沈澱物より例えば遠心分離、ｆ過等の通常の分
離手段を用いて不溶化酵素を得る。
なお、多官能性架橋剤としては、ポリアルデヒド類、イ
ンシアネート類等が適しており、例えばジアルデヒドデ
ンプングリオキザーノペマロンアルテヒド、コハク酸ア
ルデヒド、グルタルアルデヒド、ビメリジアルデヒド、
ヘキサメチレンイソシアネート、ｐ−トルイレンジイソ
シアネート等が挙げられ、特にグルタルアルデヒドが望
”ＥＬい。
ンシアネート類等が適しており、例えばジアルデヒドデ
ンプングリオキザーノペマロンアルテヒド、コハク酸ア
ルデヒド、グルタルアルデヒド、ビメリジアルデヒド、
ヘキサメチレンイソシアネート、ｐ−トルイレンジイソ
シアネート等が挙げられ、特にグルタルアルデヒドが望
”ＥＬい。
そして、酵素を不溶化担体に吸着させる手段としては、
通常の吸着剤１例えば活性炭、シリカゲル、酸性白土、
多孔質ガラス等、又ＤＥＡＥ−セファデックス、ＣＭ−
セファデックス、ＤＥＡＥ−セルロース、ＣＭ−セルロ
ース、アンバーライトＩＲ−な！、ダウエックス−よθ
等のイオン交換体等の不溶化担体をカラムに詰めて前記
酵素を通液するか、又は該不溶化担体を酵素と混合、攪
拌して吸着させた後、これを必要により例えば遠心分離
、ｒ過等の分離手段により不溶化担体に吸着した酵素を
得る。なおその後、必要により、該酵素を吸着した不溶
化担体に前記多官能性架橋剤を加えて反応させてもよい
。
通常の吸着剤１例えば活性炭、シリカゲル、酸性白土、
多孔質ガラス等、又ＤＥＡＥ−セファデックス、ＣＭ−
セファデックス、ＤＥＡＥ−セルロース、ＣＭ−セルロ
ース、アンバーライトＩＲ−な！、ダウエックス−よθ
等のイオン交換体等の不溶化担体をカラムに詰めて前記
酵素を通液するか、又は該不溶化担体を酵素と混合、攪
拌して吸着させた後、これを必要により例えば遠心分離
、ｒ過等の分離手段により不溶化担体に吸着した酵素を
得る。なおその後、必要により、該酵素を吸着した不溶
化担体に前記多官能性架橋剤を加えて反応させてもよい
。
次に、上記した微生物菌体、酵素をタンニンももしくは
親水性有機溶媒、およびゲル基材としてアルギン酸ナト
リウム、アルギン酸カリウム、もしくはアルギン酸アン
モニウムと常温〜オｏＣ程度で混合してゲル基材が溶解
した液を得る。
親水性有機溶媒、およびゲル基材としてアルギン酸ナト
リウム、アルギン酸カリウム、もしくはアルギン酸アン
モニウムと常温〜オｏＣ程度で混合してゲル基材が溶解
した液を得る。
これに用いる緩衝液としては、例えば酢駿緩衝液、マツ
キルヴエイン緩衝液、リン酸緩衝液、トリス緩衝液、ベ
ロナール緩衝液等が挙げられ、父親水性有機溶媒として
は、メチルアルコール、エチルアルコール、プロピルア
ルコール、アセトン等が挙げられ、これらの有機溶媒は
通常７０〜−〇係（Ｗ／Ｖ）程没で用いられる。
キルヴエイン緩衝液、リン酸緩衝液、トリス緩衝液、ベ
ロナール緩衝液等が挙げられ、父親水性有機溶媒として
は、メチルアルコール、エチルアルコール、プロピルア
ルコール、アセトン等が挙げられ、これらの有機溶媒は
通常７０〜−〇係（Ｗ／Ｖ）程没で用いられる。
なお、上記した微生物菌体、酵素を不溶化したびゲル基
材ごの混合は、これらを同時に混合してもよく、また上
記した微生物菌体、酵素を不溶化したもの、もしくは酵
素を不溶化担体に吸着したものを水、または緩衝液、も
しくは親水性有機溶媒に懸濁し、これにゲル基材または
その溶液を加え混合してもよく、さらにまたゲル基材を
水、または緩衝液、もしくは親水性有機溶媒に溶解した
液に、上記した微生物菌体、酵素を不溶化したもの、も
しくは酵素を不溶化担体に吸着したものを加え混合して
もよい。
材ごの混合は、これらを同時に混合してもよく、また上
記した微生物菌体、酵素を不溶化したもの、もしくは酵
素を不溶化担体に吸着したものを水、または緩衝液、も
しくは親水性有機溶媒に懸濁し、これにゲル基材または
その溶液を加え混合してもよく、さらにまたゲル基材を
水、または緩衝液、もしくは親水性有機溶媒に溶解した
液に、上記した微生物菌体、酵素を不溶化したもの、も
しくは酵素を不溶化担体に吸着したものを加え混合して
もよい。
そしてゲル基材としてのアルギン酸す） ＩＪウム、ア
ルギン酸カリウム、もしくはアルギン酸アンモニウムは
通常０−ｊ−−４．θ係（Ｗ／Ｖ）、好ましくは１．Ｑ
〜コ、０条（Ｗ／Ｖ）程ｊ焚用いられ、常温〜ＺＯＣ程
度で混合、溶解される。
ルギン酸カリウム、もしくはアルギン酸アンモニウムは
通常０−ｊ−−４．θ係（Ｗ／Ｖ）、好ましくは１．Ｑ
〜コ、０条（Ｗ／Ｖ）程ｊ焚用いられ、常温〜ＺＯＣ程
度で混合、溶解される。
次に上記した如（ゲル基材を混合し溶解した溶液を、噴
霧器、好ましくは加圧噴霧器を用いてゲル化剤と噴霧接
触させることにより微ホな固定化された微生′ｊＩＩＩ
Ｊ菌体もしくは酵素を得る。
霧器、好ましくは加圧噴霧器を用いてゲル化剤と噴霧接
触させることにより微ホな固定化された微生′ｊＩＩＩ
Ｊ菌体もしくは酵素を得る。
る０
そして固定化された微生物菌体もしくは酵素を得る際の
噴霧接触手段としては１通常加圧噴霧用ノズルを用いて
噴霧するのが好ましい。その際、圧力ノズルとしては例
えば単純ジェット型ノズル、衝突ジェット型ノズル、渦
巻き型ノズル、コ流体型ノズル等の加圧噴霧ノズルが用
いられる。また、回転円板噴霧器もしくに音波、静電気
、振動等を利用した噴霧器等も用いられる。そして加圧
噴霧する場合の噴霧圧力はｏ、５−６００ Ｋｌ ／
７ ｍ Ｑ、好ましくは／ −／ Ｊ Ｑに）／Ｃ肩・
Ｇ程度である。
噴霧接触手段としては１通常加圧噴霧用ノズルを用いて
噴霧するのが好ましい。その際、圧力ノズルとしては例
えば単純ジェット型ノズル、衝突ジェット型ノズル、渦
巻き型ノズル、コ流体型ノズル等の加圧噴霧ノズルが用
いられる。また、回転円板噴霧器もしくに音波、静電気
、振動等を利用した噴霧器等も用いられる。そして加圧
噴霧する場合の噴霧圧力はｏ、５−６００ Ｋｌ ／
７ ｍ Ｑ、好ましくは／ −／ Ｊ Ｑに）／Ｃ肩・
Ｇ程度である。
又、これらの加圧噴霧条件は、使用する菌体及び酵素の
種類、アルギン酸塩の濃度、ノズルの種類等により影響
を受けるのヱ、それにより適宜選択される。
種類、アルギン酸塩の濃度、ノズルの種類等により影響
を受けるのヱ、それにより適宜選択される。
そして固定１しされた微生物菌体もしくは酵素のゲル粒
子の大きさは、ａ常平均粒子径が、最大限ｇｏｏ〜り０
０ミクロン以下であるが、本発明においては平均粒子径
がＪ＋ｏｏミクロン以下となるように調整することが望
ましく、このような微粒子とすることにより基質との反
応効率を著しく高めることが出来る。
子の大きさは、ａ常平均粒子径が、最大限ｇｏｏ〜り０
０ミクロン以下であるが、本発明においては平均粒子径
がＪ＋ｏｏミクロン以下となるように調整することが望
ましく、このような微粒子とすることにより基質との反
応効率を著しく高めることが出来る。
そして、殊に固定１し微生物菌体を上記の如（１，５′
ＯＯミクロン程度以下の微粒子とすれば、例えば該菌体
を用いて発酵させる際、予じめ培養培地で培養すること
により該菌体を増殖させる操作も不要となり、該微生物
菌体を直接発酵に供し得る等の格段に優れた利点を有す
る。
ＯＯミクロン程度以下の微粒子とすれば、例えば該菌体
を用いて発酵させる際、予じめ培養培地で培養すること
により該菌体を増殖させる操作も不要となり、該微生物
菌体を直接発酵に供し得る等の格段に優れた利点を有す
る。
以上の如く１本発明により固定化された微生物菌体もし
くは酵素を用いれは、基質、との反応効率を著しく高め
ることが出来、又該酵素を種々の基質に繰り返し使用し
ても、該固定１しされた酵素含有ゲルからの脱離が著し
く抑制される等、本発明は産業上極めて有意義である。
くは酵素を用いれは、基質、との反応効率を著しく高め
ることが出来、又該酵素を種々の基質に繰り返し使用し
ても、該固定１しされた酵素含有ゲルからの脱離が著し
く抑制される等、本発明は産業上極めて有意義である。
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。
実施例 １
タンニン酸〔和光紬薬（株）製〕２ｉＰをλＯｍＡのｏ
、ｏｓＭトリス緩衝液（ｐＨ２，０）に溶解しｆ、−モ
のと、アスペルギルス争オリゼ−ＦＥＲＭＰ−／／り９
の皺′Ｊ＠養物より硫安分画し、ＤＥＡＥ−セルローズ
を用いて精製したロイシン・アミノペプチダーゼ標品−
００ｍ９を２０ｍ１．のＤ 、Ｄ Ｊ−Ｍ−）リス緩衝
液（ｐＨ７，０）に溶解したものとを充分混合シ、該ロ
イシン拳アミノペプチダーゼを不溶化（沈澱）させた。
、ｏｓＭトリス緩衝液（ｐＨ２，０）に溶解しｆ、−モ
のと、アスペルギルス争オリゼ−ＦＥＲＭＰ−／／り９
の皺′Ｊ＠養物より硫安分画し、ＤＥＡＥ−セルローズ
を用いて精製したロイシン・アミノペプチダーゼ標品−
００ｍ９を２０ｍ１．のＤ 、Ｄ Ｊ−Ｍ−）リス緩衝
液（ｐＨ７，０）に溶解したものとを充分混合シ、該ロ
イシン拳アミノペプチダーゼを不溶化（沈澱）させた。
該沈戯物を常法により遠心分離した後、上述のトリス緩
衝７（１（ｐＨ７、０）でコロ洗滌した。
衝７（１（ｐＨ７、０）でコロ洗滌した。
得られた不溶化酵素（乾物量として３００ｍ））ニ／％
（Ｗ／Ｖ）アルギン酸ナトリウム〔オｌ光純薬（株）製
〕水浴孜２０鮎を加えて混合し、これをエアーレス・ス
プレイヤー〔−流体型、ノズル口径：Ｑ 、 ｊ ｍｒ
ｈ１噴霧圧力ニ 、？ 、 ｏ ９／ ｃｔｉΦ０１英
国バーゲス社製〕でｈ％（Ｗ／Ｖ）塩化カルシウム溶液
中に加圧噴霧し、平均粒子径７００〜ユ！θミクロンの
微粒子状に固定化されたロイシン・アミノペプチダーゼ
を得た（実施例１の固定化酵素）０ 実施例１の固定１し酵素の活性を、従来法で固定化され
たロイシン・アミノペプチダーゼである対照−１および
対照−２の活性と比較した結果は第１表に示すとお９で
ある。なお、 対照−１：上記の不溶化酵素（ロイシン・アミノペプチ
ダーゼ） 、ｒ ｏ ｏｍｇに／％（Ｗ／Ｖ）アルギン
酸ナトリウム水溶液２０ｍ６を加えて混合し。
（Ｗ／Ｖ）アルギン酸ナトリウム〔オｌ光純薬（株）製
〕水浴孜２０鮎を加えて混合し、これをエアーレス・ス
プレイヤー〔−流体型、ノズル口径：Ｑ 、 ｊ ｍｒ
ｈ１噴霧圧力ニ 、？ 、 ｏ ９／ ｃｔｉΦ０１英
国バーゲス社製〕でｈ％（Ｗ／Ｖ）塩化カルシウム溶液
中に加圧噴霧し、平均粒子径７００〜ユ！θミクロンの
微粒子状に固定化されたロイシン・アミノペプチダーゼ
を得た（実施例１の固定化酵素）０ 実施例１の固定１し酵素の活性を、従来法で固定化され
たロイシン・アミノペプチダーゼである対照−１および
対照−２の活性と比較した結果は第１表に示すとお９で
ある。なお、 対照−１：上記の不溶化酵素（ロイシン・アミノペプチ
ダーゼ） 、ｒ ｏ ｏｍｇに／％（Ｗ／Ｖ）アルギン
酸ナトリウム水溶液２０ｍ６を加えて混合し。
これを注射器（口径：コｍｍ ）を用いてｊｄ（Ｗ／Ｖ
）塩化カルシウム浴液中に誕下して得た平均粒子径ｊ
ｍｒｈの球状に固定化されたロイシン・アミノペプチダ
ーゼであり、 対照−２：上記の子爵１じ酵素（ロ、イシン拳アミノヘ
プｆターセ） 、ｙ ｏ ｏｍｇに／ｑｂ（Ｗ／Ｖ）ア
ルルシウム溶液中に滴下して得た平均粒子径λ順の球状
に固定化されたロイシン拳アミノペプチダーゼである。
）塩化カルシウム浴液中に誕下して得た平均粒子径ｊ
ｍｒｈの球状に固定化されたロイシン・アミノペプチダ
ーゼであり、 対照−２：上記の子爵１じ酵素（ロ、イシン拳アミノヘ
プｆターセ） 、ｙ ｏ ｏｍｇに／ｑｂ（Ｗ／Ｖ）ア
ルルシウム溶液中に滴下して得た平均粒子径λ順の球状
に固定化されたロイシン拳アミノペプチダーゼである。
また、相対酵素活性の測定試験は、上記の各固定化酵素
（０，２９）を用いてそれぞれロイシン−ｐ−ニトロア
ニリドを基質として中台の方法〔中台忠信、日本醤油研
究所報告、？、９９（／９７７年）〕で測定することに
より行ない、得られた活性値を、対照−１の標品（酵素
活性値：ｔｏｏ係）と比較した相対酵素活性値（係）を
示したのがｉ１表である。
（０，２９）を用いてそれぞれロイシン−ｐ−ニトロア
ニリドを基質として中台の方法〔中台忠信、日本醤油研
究所報告、？、９９（／９７７年）〕で測定することに
より行ない、得られた活性値を、対照−１の標品（酵素
活性値：ｔｏｏ係）と比較した相対酵素活性値（係）を
示したのがｉ１表である。
第１表
第１表より明らかな如（、実施例１の固定化酵素は、対
照の固定化酵素の何れに比しても著しく酵素活性値の高
いものである。
照の固定化酵素の何れに比しても著しく酵素活性値の高
いものである。
実施例 ２
豚の心臓起源の乳酸脱水素酵素（ベーリンガー社製）’
１ｏｏｒｒｂ２を０ 、０５Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ７，ｏ
）λｏ ｍｂに溶解し、ｘｔ４（Ｗ／Ｖ）グルタルアル
デヒド水溶液を、５′廐加え、攪拌しっつλＯｃで３゜
分間反応させ、得られた不溶化酵素を常法により遠心分
離した後、０，０３Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ３１，ｆ）３ｏ
ｏｍｂで洗浄後、不溶化酵素を得た０得られた不溶化酵
素３ｏｍりに０．０３−Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨオ、りｓｏ
ｍｅを加え懸濁した液に、２％（Ｗ／Ｖ）アルギン酸ナ
トリウム水ｇａｔｏ１１ｂを〃口えて混合し、これをワ
グナ−ハンディ−ペインターＷ −／ ７０ （２流体
型、ノズルロ径、０．７論１日本ワグナ−スプレーテッ
クス社製）でｊ％（Ｗ／Ｖ）塩１Ｌカルシウム溶液中に
噴鯖圧力ｉａ。
１ｏｏｒｒｂ２を０ 、０５Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ７，ｏ
）λｏ ｍｂに溶解し、ｘｔ４（Ｗ／Ｖ）グルタルアル
デヒド水溶液を、５′廐加え、攪拌しっつλＯｃで３゜
分間反応させ、得られた不溶化酵素を常法により遠心分
離した後、０，０３Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ３１，ｆ）３ｏ
ｏｍｂで洗浄後、不溶化酵素を得た０得られた不溶化酵
素３ｏｍりに０．０３−Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨオ、りｓｏ
ｍｅを加え懸濁した液に、２％（Ｗ／Ｖ）アルギン酸ナ
トリウム水ｇａｔｏ１１ｂを〃口えて混合し、これをワ
グナ−ハンディ−ペインターＷ −／ ７０ （２流体
型、ノズルロ径、０．７論１日本ワグナ−スプレーテッ
クス社製）でｊ％（Ｗ／Ｖ）塩１Ｌカルシウム溶液中に
噴鯖圧力ｉａ。
眩／ ｃ肩・Ｇで加圧噴霧し、平均粒子径１００〜２５
０ミクロンの微粒子状に固定化された。乳酸脱水素酵素
を得た（実施例２の固定化酵素）。
０ミクロンの微粒子状に固定化された。乳酸脱水素酵素
を得た（実施例２の固定化酵素）。
実施例２の固定化酵素の活性を、従来法で固定化された
乳酸脱水素酵素の活性と比較した結果は第２表に示すと
おりである。なお、 対照−１：上記の不溶化酵素（乳酸脱水素酵素）よＯ■
に０．０３Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨｓ、ｓ）ｓ。
乳酸脱水素酵素の活性と比較した結果は第２表に示すと
おりである。なお、 対照−１：上記の不溶化酵素（乳酸脱水素酵素）よＯ■
に０．０３Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨｓ、ｓ）ｓ。
ｍ６を加えて懸濁した液に、２％（Ｗ／Ｖ）アルギン酸
ナトリウム水溶液ｊＯｍ１．を加えて混合し、これを注
射器（口径：ユ陥）を用いてＪ［（Ｗ／Ｖ）塩化カルシ
ウム溶液中に滴下して得られる平均粒子径！ ｆｆ１ｌ
＋の球状に固定化された乳酸脱水素酵素であり。
ナトリウム水溶液ｊＯｍ１．を加えて混合し、これを注
射器（口径：ユ陥）を用いてＪ［（Ｗ／Ｖ）塩化カルシ
ウム溶液中に滴下して得られる平均粒子径！ ｆｆ１ｌ
＋の球状に固定化された乳酸脱水素酵素であり。
対照−２二上記σ）不溶化酵素（乳酸脱水素酵素）３ｏ
ｍ９にｏ、ｏ！；Ｍ酢酸緩衝／（ｉ （ｐＨ３，３）
−ｔ Ｏ射器（口径： ／ ｍｒｈ ）を用いてＪ−１
（Ｗ／Ｖ ）塩化カルシウム溶液中に滴下して得られる
平均粒子径１、！論の球状に固定化された乳酸脱水素酵
素である。
ｍ９にｏ、ｏ！；Ｍ酢酸緩衝／（ｉ （ｐＨ３，３）
−ｔ Ｏ射器（口径： ／ ｍｒｈ ）を用いてＪ−１
（Ｗ／Ｖ ）塩化カルシウム溶液中に滴下して得られる
平均粒子径１、！論の球状に固定化された乳酸脱水素酵
素である。
また、相対酵素活性の測定試験は、上記の各固定１し酵
素（ｏ −２９）を用いてそれぞれピルビン酸を基質と
してストルセンバツハの方法〔ストルセンバツハ、メソ
ッドΦイン・エンチモロジーエ。
素（ｏ −２９）を用いてそれぞれピルビン酸を基質と
してストルセンバツハの方法〔ストルセンバツハ、メソ
ッドΦイン・エンチモロジーエ。
２７ｇ−２ｇｇ（／９１．ｔ）〕で測定することにより
行ない、得られた活性値を、対照−１の標品（酵素活性
値：ｉｏｏ％）と比較した相対酵素活性値（憾）を示し
たのが第２表である０第 ２ 表 第２表より明らかな如（、実施例２の固定１し酵素は、
対照の固定化酵素の何れに比しても著しく酵素活性値の
高いものである。
行ない、得られた活性値を、対照−１の標品（酵素活性
値：ｉｏｏ％）と比較した相対酵素活性値（憾）を示し
たのが第２表である０第 ２ 表 第２表より明らかな如（、実施例２の固定１し酵素は、
対照の固定化酵素の何れに比しても著しく酵素活性値の
高いものである。
実施例 ３
サイロイドユクク〔富士デグイソン化学（株）製）ｌｆ
とウレアーゼ（タイプ９１．シグマ社製〕１００ｍ９を
ｏ、ｏｓＭトリス緩衝／ｆｆ１（ｐ）Ｌ７．（７）に加
えて混合し、５Ｃで約１時間攪拌することによりウレア
ーゼを該サイロイドに吸着させ、次いでこれを常法によ
り遠心分離した後、上記トリス緩衝液（ｐＨ７−０）で
洗滌した。
とウレアーゼ（タイプ９１．シグマ社製〕１００ｍ９を
ｏ、ｏｓＭトリス緩衝／ｆｆ１（ｐ）Ｌ７．（７）に加
えて混合し、５Ｃで約１時間攪拌することによりウレア
ーゼを該サイロイドに吸着させ、次いでこれを常法によ
り遠心分離した後、上記トリス緩衝液（ｐＨ７−０）で
洗滌した。
得られたサイロイドに吸着した酵素ｓｏｍｇを。
１４（Ｗ／Ｖ）アルギン酸ナトリウム水浴液２０ｍ乙に
懸濁し、これを実施例１で用いたエアーレス・スプレイ
ヤーでｔ ４ （Ｗ／Ｖ ）塩化７ルミニウム浴液中に
噴霧用カニ、５εｙ／Ｃノｉ−Ｇで加圧噴霧して平均粒
子径１３０〜３００ミクロンの微粒子状に固定１しされ
たウレアーゼを得た（実施例３の固定化酵素）０ 実施例３の固定化酵素の活性を、従来法で固定化された
ウレアーゼである対照の活性と比較した結果は第３表に
示すとおりである０ なお、対照は、上記のサイロイドに吸着した酵ＭＣｆｙ
ｖ７−セ） ｓ ｏｍ９を／ ４ （Ｗ／Ｖ ）アルギ
ン酸ナトリウム水溶液２０鮎に懸濁し、これを注射器（
口径：ｌ爾−）を用いてｊ １ （Ｗ／Ｖ ）塩化アル
ミニウム溶液中に滴下して得られる平均粒子径ｉ、を爾
１の球状に固定化されたウレアーゼである０ また、相対酵素活性の測定試験は、上記の各固定１し酵
素（０，２７−）を用いてそれぞれ尿素を基質としてラ
イセルの方法〔ライセル・エフ・ジエー、ジ・エンチー
ムス３版、ｐ、／−２／ （／９７／））で測定するこ
とにより行ない、得られた活性値を。
懸濁し、これを実施例１で用いたエアーレス・スプレイ
ヤーでｔ ４ （Ｗ／Ｖ ）塩化７ルミニウム浴液中に
噴霧用カニ、５εｙ／Ｃノｉ−Ｇで加圧噴霧して平均粒
子径１３０〜３００ミクロンの微粒子状に固定１しされ
たウレアーゼを得た（実施例３の固定化酵素）０ 実施例３の固定化酵素の活性を、従来法で固定化された
ウレアーゼである対照の活性と比較した結果は第３表に
示すとおりである０ なお、対照は、上記のサイロイドに吸着した酵ＭＣｆｙ
ｖ７−セ） ｓ ｏｍ９を／ ４ （Ｗ／Ｖ ）アルギ
ン酸ナトリウム水溶液２０鮎に懸濁し、これを注射器（
口径：ｌ爾−）を用いてｊ １ （Ｗ／Ｖ ）塩化アル
ミニウム溶液中に滴下して得られる平均粒子径ｉ、を爾
１の球状に固定化されたウレアーゼである０ また、相対酵素活性の測定試験は、上記の各固定１し酵
素（０，２７−）を用いてそれぞれ尿素を基質としてラ
イセルの方法〔ライセル・エフ・ジエー、ジ・エンチー
ムス３版、ｐ、／−２／ （／９７／））で測定するこ
とにより行ない、得られた活性値を。
対照の標品（酵素活性値：１ｏｏ４ｒ）と比較した相対
酵素活性値（壬）を示したのが第３表である。
酵素活性値（壬）を示したのが第３表である。
第 ３ 表
第３表より明らかな如（、実施例３の固定化酵素は対照
の固定化酵素に比し著しく酵素活性値の高いものである
。
の固定化酵素に比し著しく酵素活性値の高いものである
。
実施例 ４
グルコースλ％（Ｗ／Ｖ）、ペプトン／％（Ｗ／Ｖ）、
酵母エキス１％（Ｗ／Ｖ ） 、及び食塩１０係（Ｗ／
Ｖンを含む培養培地ＣｐＨ−＋１．（′）／Ａを３！フ
ラスコに入れ、常法により殺菌した後、該培地にサツカ
ロミセス・ルキシーＡＴＣＣｔｏ３ｔｒａの種培養液ｌ
ＯｍＬを接種し、３０ｃで２二時間振盪培養した。得ら
れた培養終了液ｌ！を遠心分離して集菌し、これを凍結
乾燥した後、！？の乾燥酵母菌１本を得た。
酵母エキス１％（Ｗ／Ｖ ） 、及び食塩１０係（Ｗ／
Ｖンを含む培養培地ＣｐＨ−＋１．（′）／Ａを３！フ
ラスコに入れ、常法により殺菌した後、該培地にサツカ
ロミセス・ルキシーＡＴＣＣｔｏ３ｔｒａの種培養液ｌ
ＯｍＬを接種し、３０ｃで２二時間振盪培養した。得ら
れた培養終了液ｌ！を遠心分離して集菌し、これを凍結
乾燥した後、！？の乾燥酵母菌１本を得た。
得られた酵母菌体オ？を／ ４ （Ｗ／Ｖ ）アルキン
酸アンモニウム水溶７ｇ（６ｏ ｏ ｍｅに懸濁し、こ
れを３！の密閉圧力容器に投入し、これにヘリウムガス
を導入後、該圧力容器内の圧力を／ ｏ Ｋｙ ／ｃｎ
１φＧＫ調整し、次いでノズルＣｄＭＫＢｏ ｇｏａｔ
ｒ型。
酸アンモニウム水溶７ｇ（６ｏ ｏ ｍｅに懸濁し、こ
れを３！の密閉圧力容器に投入し、これにヘリウムガス
を導入後、該圧力容器内の圧力を／ ｏ Ｋｙ ／ｃｎ
１φＧＫ調整し、次いでノズルＣｄＭＫＢｏ ｇｏａｔ
ｒ型。
ノズル口径： ｏ 、 ’＠ａ、いけうち（株）製〕の
コックを開け、！％（Ｗ／Ｖ）塩化カルシウム溶液中に
加圧噴霧して平均粒子径１ｏｏ−ユｔｏミクロンの微粒
子状に固定化された酵母菌体を得た（実施例４の固定化
酵母−一）０ 実施例４の固定化酵母筒のアルコール生産性を従来法で
固定化された酵母菌体である対照−１および対照−２の
アルコール生産性と比較した結果を第４表に示す０なお
。
コックを開け、！％（Ｗ／Ｖ）塩化カルシウム溶液中に
加圧噴霧して平均粒子径１ｏｏ−ユｔｏミクロンの微粒
子状に固定化された酵母菌体を得た（実施例４の固定化
酵母−一）０ 実施例４の固定化酵母筒のアルコール生産性を従来法で
固定化された酵母菌体である対照−１および対照−２の
アルコール生産性と比較した結果を第４表に示す０なお
。
対照−１：上記の酵母菌体！ノをｌ係（Ｗ／Ｖ）アルギ
ン酸アンモニウム水溶液！θθｍ乙に懸濁し、これを注
射器（口径：コ誦）を用いてｊ％（Ｗ／Ｖ）塩化カルシ
ウム溶液中に滴下して得られる平均粒子径！簡の球状に
固定化された酵母菌体であり、 対照−２：上記の酵母菌体ｊノを／％（Ｗ／Ｖ）アルギ
ン酸アンモニウム水溶（ｇｔｏｏｒｎｂに懸濁し。
ン酸アンモニウム水溶液！θθｍ乙に懸濁し、これを注
射器（口径：コ誦）を用いてｊ％（Ｗ／Ｖ）塩化カルシ
ウム溶液中に滴下して得られる平均粒子径！簡の球状に
固定化された酵母菌体であり、 対照−２：上記の酵母菌体ｊノを／％（Ｗ／Ｖ）アルギ
ン酸アンモニウム水溶（ｇｔｏｏｒｎｂに懸濁し。
これを注射器（口径：ｌｒｔｒｍ）を用いて、、ｔ％（
Ｗ／■）塩化カルシウム溶液中に滴下して得られる平均
粒子径２肋の球状に固定化された酵母菌体である０ マタ、アルコール生産性の測定は、グルコースｇ係（Ｗ
／Ｖ）、ペプトンｌ憾（Ｗ／Ｖ）、酵母ｘ＊スｏ 、
、？ ’Ｉｒ （Ｗ／Ｖ ）、及び食塩ｔ ｇ： ’ｆ
ｉ （ｗ／Ｖ）を含む培地（ｐＨｓ＋ｙ ） ｉ ｏ
ｏｍｅを、ｔｏ。
Ｗ／■）塩化カルシウム溶液中に滴下して得られる平均
粒子径２肋の球状に固定化された酵母菌体である０ マタ、アルコール生産性の測定は、グルコースｇ係（Ｗ
／Ｖ）、ペプトンｌ憾（Ｗ／Ｖ）、酵母ｘ＊スｏ 、
、？ ’Ｉｒ （Ｗ／Ｖ ）、及び食塩ｔ ｇ： ’ｆ
ｉ （ｗ／Ｖ）を含む培地（ｐＨｓ＋ｙ ） ｉ ｏ
ｏｍｅを、ｔｏ。
！フラスコに入れ、常法により殺菌、シた後、該培地に
上記の各固定化酵母（湿潤菌体）夕を加え。
上記の各固定化酵母（湿潤菌体）夕を加え。
夫々の培地で、ｌ０Ｃ１３日間静置培養した培養液のア
ルコール濃度を測定することにより行なった。
ルコール濃度を測定することにより行なった。
その結果を第４表に示す。
第４表
第４表より明らかな如く、実施例４の固定化酵母を用い
れば、対照の固定化酵母の何れを用いた場合よりもアル
コール生成量は著しく向上することが認められた。
れば、対照の固定化酵母の何れを用いた場合よりもアル
コール生成量は著しく向上することが認められた。
出願人 キッコーマン株式会社
Claims (5)
- （１）微生物菌体、酵素をタンニンもしくは多官水性有
機溶媒、およびゲル基材としてアルギン酸ナトリウム、
アルギン酸カリウム、もしくはアルギン酸アンモニウム
と混合した液を、ゲル化剤と噴霧接触させ微小ゲルとす
ることを特徴とする固定化された微生物菌体もしくは酵
素、の製造法。 - （２）ゲル化剤が塩化カルシウム、酢酸カルシウム、硫
酸アルミニウム、及び塩化アルミニウムより選ばれた少
な（とも１種である特許請求の範囲第７項記載の固定化
された微生物菌体もしくは酵素の製造法。 - （３） ０．４’−６００Ｋｌ ／ Ｃｒ／Ｌ・Ｇの噴
霧圧力で。 加圧噴霧することを特徴とする特許請求の範囲第１項記
載の固定１しされた微生物菌体もしくは酵素の製造法。 - （４）固定化された微生物菌体もしくは酵素のゲル平均
粒子径がｓｏｏミクロン以下である特許請求の範囲第１
項記載の固定化された微生物菌体もしくは酵素の製造法
。 - （５）多官能性架橋試薬がグルタルアルデヒドである特
許請求の範囲第１項記載の固定１しされた微生物菌体も
しくは酵素の製造法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP13935683A JPS6030684A (ja) | 1983-08-01 | 1983-08-01 | 固定化された微生物菌体もしくは酵素 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP13935683A JPS6030684A (ja) | 1983-08-01 | 1983-08-01 | 固定化された微生物菌体もしくは酵素 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6030684A true JPS6030684A (ja) | 1985-02-16 |
| JPS6349996B2 JPS6349996B2 (ja) | 1988-10-06 |
Family
ID=15243419
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP13935683A Granted JPS6030684A (ja) | 1983-08-01 | 1983-08-01 | 固定化された微生物菌体もしくは酵素 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS6030684A (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2007208433A (ja) * | 2006-01-31 | 2007-08-16 | Oki Electric Ind Co Ltd | カラーキラー回路 |
| JP5074632B1 (ja) * | 2012-02-23 | 2012-11-14 | 健 佐々木 | 放射性セシウムで汚染された環境媒体を浄化する方法 |
| JP2019195792A (ja) * | 2018-05-11 | 2019-11-14 | 三原 義広 | 粒子、浄化処理方法 |
-
1983
- 1983-08-01 JP JP13935683A patent/JPS6030684A/ja active Granted
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2007208433A (ja) * | 2006-01-31 | 2007-08-16 | Oki Electric Ind Co Ltd | カラーキラー回路 |
| JP5074632B1 (ja) * | 2012-02-23 | 2012-11-14 | 健 佐々木 | 放射性セシウムで汚染された環境媒体を浄化する方法 |
| JP2019195792A (ja) * | 2018-05-11 | 2019-11-14 | 三原 義広 | 粒子、浄化処理方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS6349996B2 (ja) | 1988-10-06 |
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