JPH0994090A - 酵素固定化用担体の製造方法 - Google Patents
酵素固定化用担体の製造方法Info
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- JPH0994090A JPH0994090A JP27704695A JP27704695A JPH0994090A JP H0994090 A JPH0994090 A JP H0994090A JP 27704695 A JP27704695 A JP 27704695A JP 27704695 A JP27704695 A JP 27704695A JP H0994090 A JPH0994090 A JP H0994090A
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 繰り返し使用が可能で、しかも使用後に不要
となった失活酵素を容易に脱離・再生することが出来る
酵素固定化用担体を得る。 【解決手段】 低分子量キトサンの酸性水溶液を塩基性
溶液中に滴下凝固再生せしめて得た再生粒状多孔質キト
サンを、カラギーナンの水溶液中に分散し、次いで多官
能性試薬を反応させることにより酵素固定化用担体を製
造する。
となった失活酵素を容易に脱離・再生することが出来る
酵素固定化用担体を得る。 【解決手段】 低分子量キトサンの酸性水溶液を塩基性
溶液中に滴下凝固再生せしめて得た再生粒状多孔質キト
サンを、カラギーナンの水溶液中に分散し、次いで多官
能性試薬を反応させることにより酵素固定化用担体を製
造する。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、天然高分子である
キトサンとカラギーナンを複合化した、バイオリアクタ
ーによる食品素材の製造に好適な酵素固定化用担体の製
造方法に関するものである。
キトサンとカラギーナンを複合化した、バイオリアクタ
ーによる食品素材の製造に好適な酵素固定化用担体の製
造方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】近年、固定化酵素を用いたバイオリアク
ターによる食品素材の製造が、その高い生産性と高価な
酵素の再使用可能性によるコスト意識から、食品産業を
中心に研究・実用化が計られている。酵素の固定化用担
体として、合成高分子イオン交換体、多糖類系イオン交
換体及びシリカゲル、ガラス等の無機系の担体等が使用
されている。本出願人は特公平１−１６４２０号で開示
した粒状多孔質キトサン担体以外に、これをベースとし
て特公昭６３−５４２８５号及び特開平６−２３７６９
号等で各種の官能基を導入した固定化用担体を開示し
た。しかし、上述の特公平１−１６４２０号以外の固定
化用担体は、イオン交換基として塩基性を有するもので
あったり、担体に疎水性が導入され酵素が疎水吸着され
るものであった。固定化用担体の塩基性基は等電点の低
い酸性蛋白の吸着には有効に作用するが、塩基性蛋白を
吸着固定させることは不可能で、又、強い疎水吸着は往
々にして酵素との適合性が悪く失活の原因ともなる欠点
がある。
ターによる食品素材の製造が、その高い生産性と高価な
酵素の再使用可能性によるコスト意識から、食品産業を
中心に研究・実用化が計られている。酵素の固定化用担
体として、合成高分子イオン交換体、多糖類系イオン交
換体及びシリカゲル、ガラス等の無機系の担体等が使用
されている。本出願人は特公平１−１６４２０号で開示
した粒状多孔質キトサン担体以外に、これをベースとし
て特公昭６３−５４２８５号及び特開平６−２３７６９
号等で各種の官能基を導入した固定化用担体を開示し
た。しかし、上述の特公平１−１６４２０号以外の固定
化用担体は、イオン交換基として塩基性を有するもので
あったり、担体に疎水性が導入され酵素が疎水吸着され
るものであった。固定化用担体の塩基性基は等電点の低
い酸性蛋白の吸着には有効に作用するが、塩基性蛋白を
吸着固定させることは不可能で、又、強い疎水吸着は往
々にして酵素との適合性が悪く失活の原因ともなる欠点
がある。
【０００３】又、酵素を、キトサンをベースとした固定
化用担体に強固に固定化させる目的で使用されるグルタ
ルアルデヒドは、酵素の失活を招く上に、酵素を固定化
用担体から取り除いて固定化用担体として再使用に供す
ることが不可能であり、更に食品素材生産に供する場合
は、できればグルタルアルデヒドを使用することは好ま
しくない。
化用担体に強固に固定化させる目的で使用されるグルタ
ルアルデヒドは、酵素の失活を招く上に、酵素を固定化
用担体から取り除いて固定化用担体として再使用に供す
ることが不可能であり、更に食品素材生産に供する場合
は、できればグルタルアルデヒドを使用することは好ま
しくない。
【０００４】又、特開昭５７−１３２８８３号に、カラ
ギーナン水溶液に酵素活性物質と多カチオン性高分子化
合物を添加混合し、カラギーナンをゲル化させ、そのゲ
ル格子内に酵素活性物質を包括させることが開示されて
いるが、この固定化酵素活性物質は強度も弱く、酵素が
包括されているために活性が低下したときにその活性を
再活性することが出来ず再利用出来ない欠点がある。
ギーナン水溶液に酵素活性物質と多カチオン性高分子化
合物を添加混合し、カラギーナンをゲル化させ、そのゲ
ル格子内に酵素活性物質を包括させることが開示されて
いるが、この固定化酵素活性物質は強度も弱く、酵素が
包括されているために活性が低下したときにその活性を
再活性することが出来ず再利用出来ない欠点がある。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】本発明の酵素固定化用
担体は、天然高分子であるキトサンとカラギーナンを複
合したもので安全性に優れ、カラギーナンが有する硫酸
基の酸性によって塩基性酵素の吸着に優れ、更に硫酸基
が強酸性陽イオン交換基であることから、塩基性酵素を
強固に吸着するのでグルタルアルデヒド等の多官能性試
薬を使用しなくても、塩基性酵素を強固に吸着するの
で、固定化酵素の繰り返し反応が可能な上、固定化酵素
として使用後に不要になった失活酵素を容易に離脱・再
生することが出来る。
担体は、天然高分子であるキトサンとカラギーナンを複
合したもので安全性に優れ、カラギーナンが有する硫酸
基の酸性によって塩基性酵素の吸着に優れ、更に硫酸基
が強酸性陽イオン交換基であることから、塩基性酵素を
強固に吸着するのでグルタルアルデヒド等の多官能性試
薬を使用しなくても、塩基性酵素を強固に吸着するの
で、固定化酵素の繰り返し反応が可能な上、固定化酵素
として使用後に不要になった失活酵素を容易に離脱・再
生することが出来る。
【０００６】
【課題を解決するための手段】本発明は、低分子量キト
サンの酸性水溶液を塩基性水溶液中に滴下凝固再生せし
めて得た再生粒状多孔質キトサンを、カラギーナンの水
溶液中に分散し、次いで多官能性試薬を反応させる酵素
固定化用担体の製造方法である。
サンの酸性水溶液を塩基性水溶液中に滴下凝固再生せし
めて得た再生粒状多孔質キトサンを、カラギーナンの水
溶液中に分散し、次いで多官能性試薬を反応させる酵素
固定化用担体の製造方法である。
【０００７】
【発明の実施の形態】本発明で用いられる再生粒状多孔
質キトサンは、特公平１−１６４２０号で開示された方
法によって得られる。即ち、平均分子量が１０，０００
〜２３０，０００の低分子量キトサンのみを蟻酸，酢
酸，ジクロル酢酸，乳酸等の有機酸の単独又は混合、又
は塩酸，硝酸等の無機酸の酸性水溶液に溶解し、該キト
サン酸性水溶液を、水酸化ナトリウム，水酸化カリウ
ム，炭酸ナトリウム，炭酸カリウム，アンモニア，エチ
レンジアミン等のアルカリ性物質を水、又はメタノー
ル，エタノール等のアルコール類、又は水とアルコール
類の混合物に塩基性物質を加えた塩基性溶液中に、一定
量づつ滴下せしめて所望の平均粒径の粒状多孔質キトサ
ンを凝固再生析出させることにより得られる。尚、本発
明に用いられる再生粒状多孔質キトサンの平均粒径は特
に限定されるものではない。
質キトサンは、特公平１−１６４２０号で開示された方
法によって得られる。即ち、平均分子量が１０，０００
〜２３０，０００の低分子量キトサンのみを蟻酸，酢
酸，ジクロル酢酸，乳酸等の有機酸の単独又は混合、又
は塩酸，硝酸等の無機酸の酸性水溶液に溶解し、該キト
サン酸性水溶液を、水酸化ナトリウム，水酸化カリウ
ム，炭酸ナトリウム，炭酸カリウム，アンモニア，エチ
レンジアミン等のアルカリ性物質を水、又はメタノー
ル，エタノール等のアルコール類、又は水とアルコール
類の混合物に塩基性物質を加えた塩基性溶液中に、一定
量づつ滴下せしめて所望の平均粒径の粒状多孔質キトサ
ンを凝固再生析出させることにより得られる。尚、本発
明に用いられる再生粒状多孔質キトサンの平均粒径は特
に限定されるものではない。
【０００８】本発明で用いられるカラギーナンとは、ユ
ーキューマ，コンドラス，イルディヤ，ギガルティーナ
等の原藻の紅藻類より抽出される天然多糖類の１種で、
カッパ，イオタ，ラムダの３種のフラクションがあり、
詳しくは１、３結合したガラクトース−４−サルフェイ
トと１、４結合した３、６−アンヒドロ−Ｄ−ガラクト
ースから成るカッパカラギーナン，１、３結合したガラ
クトース−４−サルフェイトと１、４結合した３、６−
アンヒドロ−Ｄ−ガラクトース−２−サルフェイトから
成るイオタカラギーナン，１、３結合したガラクトース
−２−サルフェイトと１、４結合したＤ−ガラクトース
−２、６−サルフェイトから成るラムダカラギーナン
で、これらの単独又は混合のいずれも用いることが出来
る。
ーキューマ，コンドラス，イルディヤ，ギガルティーナ
等の原藻の紅藻類より抽出される天然多糖類の１種で、
カッパ，イオタ，ラムダの３種のフラクションがあり、
詳しくは１、３結合したガラクトース−４−サルフェイ
トと１、４結合した３、６−アンヒドロ−Ｄ−ガラクト
ースから成るカッパカラギーナン，１、３結合したガラ
クトース−４−サルフェイトと１、４結合した３、６−
アンヒドロ−Ｄ−ガラクトース−２−サルフェイトから
成るイオタカラギーナン，１、３結合したガラクトース
−２−サルフェイトと１、４結合したＤ−ガラクトース
−２、６−サルフェイトから成るラムダカラギーナン
で、これらの単独又は混合のいずれも用いることが出来
る。
【０００９】粒状多孔質キトサンを分散するカラギーナ
ン水溶液としては、濃度が０．１〜１５％のものが用い
られる。０．１％以下では効果が低く、１５％以上の濃
度にすると低分子量のカラギーナンを用いても粘度が高
くなり過ぎ取り扱い難い欠点があるので、カラギーナン
水溶液の濃度は好ましくは１〜１０％である。
ン水溶液としては、濃度が０．１〜１５％のものが用い
られる。０．１％以下では効果が低く、１５％以上の濃
度にすると低分子量のカラギーナンを用いても粘度が高
くなり過ぎ取り扱い難い欠点があるので、カラギーナン
水溶液の濃度は好ましくは１〜１０％である。
【００１０】粒状多孔質キトサンを分散させる方法とし
ては、再生粒状多孔質キトサン１重量部をカラギーナン
水溶液１〜１０重量部に入れて５〜９０℃，好ましくは
２５〜７０℃で１〜１００時間，好ましくは２〜４８時
間攪拌し分散する。この操作でカラギーナンは再生粒状
多孔質キトサンとポリイオンコンプレックスを形成し吸
着される。この様にしてカラギーナンと複合化した粒状
多孔質キトサンを得る。
ては、再生粒状多孔質キトサン１重量部をカラギーナン
水溶液１〜１０重量部に入れて５〜９０℃，好ましくは
２５〜７０℃で１〜１００時間，好ましくは２〜４８時
間攪拌し分散する。この操作でカラギーナンは再生粒状
多孔質キトサンとポリイオンコンプレックスを形成し吸
着される。この様にしてカラギーナンと複合化した粒状
多孔質キトサンを得る。
【００１１】カラギーナンの硫酸基とキトサンのアミノ
基間で形成されたポリイオンコンプレックスは比較的強
固な結合と考えられるが、酵素を固定化して酵素固定化
用担体として長時間使用する間、及び使用後の固定化酵
素を再生させる操作で粒状多孔質キトサンからカラギー
ナンが脱落するので、次いで多官能性試薬により粒状多
孔質キトサンとカラギーナンを共有結合させる処理をす
る必要がある。
基間で形成されたポリイオンコンプレックスは比較的強
固な結合と考えられるが、酵素を固定化して酵素固定化
用担体として長時間使用する間、及び使用後の固定化酵
素を再生させる操作で粒状多孔質キトサンからカラギー
ナンが脱落するので、次いで多官能性試薬により粒状多
孔質キトサンとカラギーナンを共有結合させる処理をす
る必要がある。
【００１２】この際の多官能性試薬としては、エピクロ
ロヒドリンやエチレングリコール，ポリエチレングリコ
ール又はポリプロピレングリコールのジグリシジルエー
テルが挙げられる。好ましくはエピクロロヒドリン，エ
チレングリコールジグリシジルエーテル，プロピレング
リコールジグリシジルエーテルである。
ロヒドリンやエチレングリコール，ポリエチレングリコ
ール又はポリプロピレングリコールのジグリシジルエー
テルが挙げられる。好ましくはエピクロロヒドリン，エ
チレングリコールジグリシジルエーテル，プロピレング
リコールジグリシジルエーテルである。
【００１３】この反応は濃度１〜３０％の多官能性試薬
水溶液を使用し、カラギーナンと複合化された粒状多孔
質キトサン１重量部に対し多官能性試薬水溶液１〜１０
重量部を加え、２５〜９０℃、好ましくは５０〜８０℃
で１〜４８時間，好ましくは６〜４８時間反応させる。
この時の水溶液は、アルカリ性域とすることが好まし
い。反応終了後充分に水洗し、本発明の酵素固定化用担
体を得る。
水溶液を使用し、カラギーナンと複合化された粒状多孔
質キトサン１重量部に対し多官能性試薬水溶液１〜１０
重量部を加え、２５〜９０℃、好ましくは５０〜８０℃
で１〜４８時間，好ましくは６〜４８時間反応させる。
この時の水溶液は、アルカリ性域とすることが好まし
い。反応終了後充分に水洗し、本発明の酵素固定化用担
体を得る。
【００１４】
【実施例】以下に本発明実施例を詳述するが、本発明は
この範囲に限定されるものではない。尚、酵素の吸着
率，固定化パパイン及び固定化トリプシンの活性は、次
の測定方法により求めた。
この範囲に限定されるものではない。尚、酵素の吸着
率，固定化パパイン及び固定化トリプシンの活性は、次
の測定方法により求めた。
【００１５】〈１〉酵素の吸着率測定方法 (1) 吸着前の酵素液を、水で希釈し２８０nmにおける吸
光度を水を対照として分光光度計（ベックマン（株）
製、商品名；ＤＵ−６４０）で光路長１cmの石英セルで
測定（ａ）する。測定に際しては吸光度が０．５以下に
なる如く希釈する。 (2) 吸着後の上清の吸光度を(1) と同様に測定（ｂ）す
る。その希釈率は(1) と同様とする。 (3) 次式により酵素の吸着率を求める。 酵素の吸着率（％）＝｛（ａ−ｂ）×１００｝
光度を水を対照として分光光度計（ベックマン（株）
製、商品名；ＤＵ−６４０）で光路長１cmの石英セルで
測定（ａ）する。測定に際しては吸光度が０．５以下に
なる如く希釈する。 (2) 吸着後の上清の吸光度を(1) と同様に測定（ｂ）す
る。その希釈率は(1) と同様とする。 (3) 次式により酵素の吸着率を求める。 酵素の吸着率（％）＝｛（ａ−ｂ）×１００｝
【００１６】〈２〉固定化パパインの活性測定方法 (1) １００ｇのカゼインを、０．０５Ｍ・トリス塩酸緩
衝液（ｐＨ８．０）１，０００mlに、湯浴中で加温して
溶解させ、基質溶液とする。 (2) 固定化用担体にパパインを固定した固定化パパイン
１mlに、基質溶液５０mlを添加し、３７℃１０分間攪拌
する。 (3) 反応終了後、上清を１ml採取し、５％トリクロロ酢
酸水溶液３mlを添加する。 (4) ３，５００rpm で遠心分離を１５分行い、上清の２
８０nmにおける吸光度（ｃ）を〈１〉で用いた分光光度
計で光路長１cmの石英セルで測定する。測定に際して
は、測定値が０．５を越えない様に希釈する（希釈倍
率）。 (5) ブランクとして、固定化パパインの代わりに未酵素
固定の固定化用担体を用いて上述と同様の操作により２
８０nmにおける吸光度（ｄ）を測定する。このときの希
釈倍率は(4) と同様とする。 (6) 固定化パパインの活性は、次式により算出する。 固定化パパインの活性（Ｕ／ml・担体）＝０．４×（ｃ
−ｄ）×希釈倍率
衝液（ｐＨ８．０）１，０００mlに、湯浴中で加温して
溶解させ、基質溶液とする。 (2) 固定化用担体にパパインを固定した固定化パパイン
１mlに、基質溶液５０mlを添加し、３７℃１０分間攪拌
する。 (3) 反応終了後、上清を１ml採取し、５％トリクロロ酢
酸水溶液３mlを添加する。 (4) ３，５００rpm で遠心分離を１５分行い、上清の２
８０nmにおける吸光度（ｃ）を〈１〉で用いた分光光度
計で光路長１cmの石英セルで測定する。測定に際して
は、測定値が０．５を越えない様に希釈する（希釈倍
率）。 (5) ブランクとして、固定化パパインの代わりに未酵素
固定の固定化用担体を用いて上述と同様の操作により２
８０nmにおける吸光度（ｄ）を測定する。このときの希
釈倍率は(4) と同様とする。 (6) 固定化パパインの活性は、次式により算出する。 固定化パパインの活性（Ｕ／ml・担体）＝０．４×（ｃ
−ｄ）×希釈倍率
【００１７】〈３〉固定化トリプシンの活性測定法 (1) ５０ｇのカゼインを、０．１Ｍ・りん酸緩衝液（ｐ
Ｈ７．６）５００mlに湯浴中で加温して溶解させ基質溶
液とする。 (2) 固定化用担体にトリプシンを固定化させた固定化ト
リプシン１mlに、基質溶液５０mlを添加し、３５℃１０
分間攪拌する。 (3) 反応終了後、反応液を１ml採取し、５％トリクロロ
酢酸水溶液３mlを添加する。 (4) ３，５００rpm で遠心分離を１５分行い、上清の２
８０nmにおける吸光度（ｅ）を〈１〉で用いた分光光度
計で光路長１cmの石英セルで測定する。測定に際して
は、測定値が０．５を越えない様に希釈する（希釈倍
率）。 (5) ブランクとして、固定化トリプシンの代わりに未酵
素固定の固定化用担体を用いて上述と同様の操作により
２８０nmにおける吸光度（ｆ）を測定する。このときの
希釈は(4) と同様とする。 (6) 固定化トリプシンの活性は、次式により算出する。 固定化トリプシンの活性（Ｕ／ml・担体）＝０．４×
（ｅ−ｆ）×希釈倍率
Ｈ７．６）５００mlに湯浴中で加温して溶解させ基質溶
液とする。 (2) 固定化用担体にトリプシンを固定化させた固定化ト
リプシン１mlに、基質溶液５０mlを添加し、３５℃１０
分間攪拌する。 (3) 反応終了後、反応液を１ml採取し、５％トリクロロ
酢酸水溶液３mlを添加する。 (4) ３，５００rpm で遠心分離を１５分行い、上清の２
８０nmにおける吸光度（ｅ）を〈１〉で用いた分光光度
計で光路長１cmの石英セルで測定する。測定に際して
は、測定値が０．５を越えない様に希釈する（希釈倍
率）。 (5) ブランクとして、固定化トリプシンの代わりに未酵
素固定の固定化用担体を用いて上述と同様の操作により
２８０nmにおける吸光度（ｆ）を測定する。このときの
希釈は(4) と同様とする。 (6) 固定化トリプシンの活性は、次式により算出する。 固定化トリプシンの活性（Ｕ／ml・担体）＝０．４×
（ｅ−ｆ）×希釈倍率
【００１８】〔実施例１〕脱アセチル化度７９％、平均
分子量４６，０００のキトサン２１０ｇを３．５％酢酸
水溶液２，７９０ｇに溶解した。該キトサン酸性水溶液
を、７％水酸化ナトリウム，２０％エタノール，７３％
水よりなる凝固溶液中に落下し、キトサンを粒状多孔質
に凝固再生後、中性になるまで充分水洗し、平均粒径１
mmの再生粒状多孔質キトサン３，０００ml（湿潤）を得
た。
分子量４６，０００のキトサン２１０ｇを３．５％酢酸
水溶液２，７９０ｇに溶解した。該キトサン酸性水溶液
を、７％水酸化ナトリウム，２０％エタノール，７３％
水よりなる凝固溶液中に落下し、キトサンを粒状多孔質
に凝固再生後、中性になるまで充分水洗し、平均粒径１
mmの再生粒状多孔質キトサン３，０００ml（湿潤）を得
た。
【００１９】次に再生粒状多孔質キトサン各５０mlを、
ハーキュリーズ・ジャパン（株）製、商品名ジェノヴィ
スコ型（ＧＥＮＯＶＩＳＣＯ Ｔｙｐｅ）ＣＳＷ−２の
カッパカラギーナンを用いて、表１に示す濃度のカッパ
カラギーナン水溶液１００mlに加え、２４時間攪拌した
後、カッパカラギーナン水溶液をろ過して除き、５．６
％エピクロロヒドリン５０ml、５Ｎ−ＫＯＨ１２mlをそ
れぞれ加え７０℃で２時間攪拌し反応させた。反応終了
後、充分水洗し、酵素固定化用担体（担体Ａ〜Ｆ）を得
た。
ハーキュリーズ・ジャパン（株）製、商品名ジェノヴィ
スコ型（ＧＥＮＯＶＩＳＣＯ Ｔｙｐｅ）ＣＳＷ−２の
カッパカラギーナンを用いて、表１に示す濃度のカッパ
カラギーナン水溶液１００mlに加え、２４時間攪拌した
後、カッパカラギーナン水溶液をろ過して除き、５．６
％エピクロロヒドリン５０ml、５Ｎ−ＫＯＨ１２mlをそ
れぞれ加え７０℃で２時間攪拌し反応させた。反応終了
後、充分水洗し、酵素固定化用担体（担体Ａ〜Ｆ）を得
た。
【００２０】
【表１】
【００２１】担体Ａ〜Ｆをそれぞれ２０ml秤量し、１％
パパイン水溶液各１００mlを加え、２５℃にて３時間攪
拌した後、水洗して固定化パパインＡ* 〜Ｆ* 夫々２０
mlを得た。固定化パパインを夫々１ml取り、パパインの
吸着率及び固定化パパインの活性を測定し、表２に示し
た。
パパイン水溶液各１００mlを加え、２５℃にて３時間攪
拌した後、水洗して固定化パパインＡ* 〜Ｆ* 夫々２０
mlを得た。固定化パパインを夫々１ml取り、パパインの
吸着率及び固定化パパインの活性を測定し、表２に示し
た。
【００２２】
【表２】
【００２３】表２から明らかなように、カッパカラギー
ナン濃度が０．１〜１０％、好ましくは、１〜１０％の
とき優れた吸着率と活性を示した。さらに上述で得られ
た固定化パパインＤ* を１ml採取し、固定化パパインの
活性測定前に０．０５Ｍ−ＥＤＴＡと０．１Ｍ−システ
インを含む混合水溶液５mlに入れ、１０℃で１２時間賦
活化処理した後、充分水洗して、固定化パパインの活性
を測定した（第１回）。この操作を繰り返し行い、５回
迄固定化パパインの活性を測定し、表３に示した。
ナン濃度が０．１〜１０％、好ましくは、１〜１０％の
とき優れた吸着率と活性を示した。さらに上述で得られ
た固定化パパインＤ* を１ml採取し、固定化パパインの
活性測定前に０．０５Ｍ−ＥＤＴＡと０．１Ｍ−システ
インを含む混合水溶液５mlに入れ、１０℃で１２時間賦
活化処理した後、充分水洗して、固定化パパインの活性
を測定した（第１回）。この操作を繰り返し行い、５回
迄固定化パパインの活性を測定し、表３に示した。
【００２４】
【表３】 この結果より、固定化パパインを賦活化処理する事によ
り、活性値が著しく高くなり、繰り返し使用にも適する
高い活性を持続することが明らかである。
り、活性値が著しく高くなり、繰り返し使用にも適する
高い活性を持続することが明らかである。
【００２５】〔実施例２〕実施例１と同様にして得られ
た再生粒状多孔質キトサン各５０mlを採取し、夫々２％
カッパカラギーナン水溶液１００mlに加え、表４に示す
処理時間で攪拌した後、カッパカラギーナン水溶液をろ
過して除き、５．６％エピクロロヒドリン５０ml、５Ｎ
−ＫＯＨ１２mlを夫々に加え７０℃で２時間攪拌し反応
させた。反応終了後、充分水洗し、酵素固定化用担体
（担体Ｇ〜Ｌ）を得た。
た再生粒状多孔質キトサン各５０mlを採取し、夫々２％
カッパカラギーナン水溶液１００mlに加え、表４に示す
処理時間で攪拌した後、カッパカラギーナン水溶液をろ
過して除き、５．６％エピクロロヒドリン５０ml、５Ｎ
−ＫＯＨ１２mlを夫々に加え７０℃で２時間攪拌し反応
させた。反応終了後、充分水洗し、酵素固定化用担体
（担体Ｇ〜Ｌ）を得た。
【００２６】
【表４】
【００２７】担体Ｇ〜Ｌを夫々２０ml秤量し、１％パパ
イン水溶液各１００mlを加え、２５℃にて３時間攪拌し
た後、水洗して固定化パパインＧ* 〜Ｌ* 夫々２０mlを
得た。固定化パパインを夫々１ml取り、パパインの吸着
率及び固定化パパインの活性を測定し、表５に示した。
イン水溶液各１００mlを加え、２５℃にて３時間攪拌し
た後、水洗して固定化パパインＧ* 〜Ｌ* 夫々２０mlを
得た。固定化パパインを夫々１ml取り、パパインの吸着
率及び固定化パパインの活性を測定し、表５に示した。
【００２８】
【表５】 表５から明らかなように、２％のカッパカラギーナン水
溶液の処理時間が１〜４８時間、好ましくは、６〜４８
時間のとき、優れた吸着率と活性を示した。
溶液の処理時間が１〜４８時間、好ましくは、６〜４８
時間のとき、優れた吸着率と活性を示した。
【００２９】〔実施例３〕実施例１と同様にして得られ
た酵素固定化用担体Ｄより５mlを採取し、１％トリプシ
ン水溶液２５mlに入れ、３時間攪拌し吸着後、充分水洗
して固定化トリプシンを５ml得た。この１mlを取り、既
述の固定化トリプシンの活性測定方法により活性を測定
した（第１回）。この固定化トリプシンを充分水洗した
後、再び同様の方法で活性測定をした（第２回）。これ
を５回迄繰り返し活性を測定しその結果を表６に示した
（Ａ）。更に５回目の活性測定終了後、この固定化トリ
プシンに０．５Ｎ−ＮａＯＨを１０ml加え、６０℃で３
時間処理した後、充分に水洗してトリプシンを除き、１
％トリプシン水溶液の５mlに入れ、３時間攪拌し再吸着
後、水洗し活性を測定した（第１回）。この固定化トリ
プシンを充分水洗した後、再び同様の方法で活性測定を
した（第２回）。これを５回迄繰り返し活性を測定しそ
の結果を表６に示した（Ｂ）。
た酵素固定化用担体Ｄより５mlを採取し、１％トリプシ
ン水溶液２５mlに入れ、３時間攪拌し吸着後、充分水洗
して固定化トリプシンを５ml得た。この１mlを取り、既
述の固定化トリプシンの活性測定方法により活性を測定
した（第１回）。この固定化トリプシンを充分水洗した
後、再び同様の方法で活性測定をした（第２回）。これ
を５回迄繰り返し活性を測定しその結果を表６に示した
（Ａ）。更に５回目の活性測定終了後、この固定化トリ
プシンに０．５Ｎ−ＮａＯＨを１０ml加え、６０℃で３
時間処理した後、充分に水洗してトリプシンを除き、１
％トリプシン水溶液の５mlに入れ、３時間攪拌し再吸着
後、水洗し活性を測定した（第１回）。この固定化トリ
プシンを充分水洗した後、再び同様の方法で活性測定を
した（第２回）。これを５回迄繰り返し活性を測定しそ
の結果を表６に示した（Ｂ）。
【００３０】
【表６】 表６から明らかなように、本法で得られた酵素固定化用
担体は、繰り返し使用、再吸着後の再繰り返し使用に於
いても、活性の持続性が高く、優れた性能を有する酵素
固定化用担体が得られた。
担体は、繰り返し使用、再吸着後の再繰り返し使用に於
いても、活性の持続性が高く、優れた性能を有する酵素
固定化用担体が得られた。
【００３１】〔実施例４〕実施例１と同様にして得られ
た再生粒状多孔質キトサン各５０mlを、和光純薬工業
（株）製ラムダカラギーナンを用いて表７に示す濃度の
ラムダカラギーナン水溶液１００mlに加え、２４時間攪
拌した後、ラムダカラギーナン水溶液をろ過して除き、
５．６％エピクロロヒドリン５０ml、５Ｎ−ＫＯＨ１２
mlをそれぞれ加え、７０℃で２時間攪拌し反応させた。
反応終了後、充分水洗し、酵素固定化用担体（担体Ｍ〜
Ｒ）を得た。
た再生粒状多孔質キトサン各５０mlを、和光純薬工業
（株）製ラムダカラギーナンを用いて表７に示す濃度の
ラムダカラギーナン水溶液１００mlに加え、２４時間攪
拌した後、ラムダカラギーナン水溶液をろ過して除き、
５．６％エピクロロヒドリン５０ml、５Ｎ−ＫＯＨ１２
mlをそれぞれ加え、７０℃で２時間攪拌し反応させた。
反応終了後、充分水洗し、酵素固定化用担体（担体Ｍ〜
Ｒ）を得た。
【００３２】
【表７】
【００３３】担体Ｍ〜Ｒをそれぞれ２０ml秤量し、１％
パパイン水溶液各１００mlを加え、２５℃にて３時間攪
拌した後、充分水洗し、固定化パパインＭ* 〜Ｒ* 夫々
２０mlを得た。固定化パパインを夫々１ml取り、パパイ
ンの吸着率及び固定化パパインの活性を測定し、表８に
示した。
パパイン水溶液各１００mlを加え、２５℃にて３時間攪
拌した後、充分水洗し、固定化パパインＭ* 〜Ｒ* 夫々
２０mlを得た。固定化パパインを夫々１ml取り、パパイ
ンの吸着率及び固定化パパインの活性を測定し、表８に
示した。
【００３４】
【表８】 表８から明らかなように、ラムダカラギーナン濃度が
０．１〜１０％好ましくは、１〜１０％のとき優れた吸
着率と活性を示した。
０．１〜１０％好ましくは、１〜１０％のとき優れた吸
着率と活性を示した。
【００３５】〔比較例〕実施例１と同様にして得られた
再生粒状多孔質キトサン１００mlが含む水を、ジメチル
ホルムアミドで充分に置換除去した後、ジメチルホルム
アミド１００mlに、ヘキサメチレンジイソシアナート
２．８ｇを溶解した溶解液に加え、２５℃で１時間反応
させた。反応残液を除去した後、ジメトルホルムアミド
で洗浄し、次いで充分水洗して酵素固定化用担体（担体
Ｓ）を得た。同様に、実施例１と同様にして得られた再
生粒状多孔質キトサン１００mlが含む水をジメチルホル
ムアミドで充分に置換除去した後、ジメチルホルムアミ
ド１００mlにジフェニルメタンジイソシアナート４．２
ｇを溶解した溶解液に加え２５℃で１時間反応させた。
反応残液を除去した後、ジメチルホルムアミドで洗浄
し、次いで充分水洗して酵素固定化用担体（担体Ｔ）を
得た。上記の担体Ｓ，Ｔ及び実施例１で得られた担体Ｄ
の各１０mlを１％パパイン水溶液５０mlに加え、２５℃
で２時間攪拌した。吸着後の吸着液を除き、水洗して固
定化パパインＤ* ，Ｓ* ，Ｔ* を得た。これらの固定化
パパイン各１mlの吸着率、活性を測定した結果を表９に
示した。
再生粒状多孔質キトサン１００mlが含む水を、ジメチル
ホルムアミドで充分に置換除去した後、ジメチルホルム
アミド１００mlに、ヘキサメチレンジイソシアナート
２．８ｇを溶解した溶解液に加え、２５℃で１時間反応
させた。反応残液を除去した後、ジメトルホルムアミド
で洗浄し、次いで充分水洗して酵素固定化用担体（担体
Ｓ）を得た。同様に、実施例１と同様にして得られた再
生粒状多孔質キトサン１００mlが含む水をジメチルホル
ムアミドで充分に置換除去した後、ジメチルホルムアミ
ド１００mlにジフェニルメタンジイソシアナート４．２
ｇを溶解した溶解液に加え２５℃で１時間反応させた。
反応残液を除去した後、ジメチルホルムアミドで洗浄
し、次いで充分水洗して酵素固定化用担体（担体Ｔ）を
得た。上記の担体Ｓ，Ｔ及び実施例１で得られた担体Ｄ
の各１０mlを１％パパイン水溶液５０mlに加え、２５℃
で２時間攪拌した。吸着後の吸着液を除き、水洗して固
定化パパインＤ* ，Ｓ* ，Ｔ* を得た。これらの固定化
パパイン各１mlの吸着率、活性を測定した結果を表９に
示した。
【００３６】
【表９】
【００３７】表９から明らかなように、本発明の方法で
得られた酵素固定化用担体Ｄ* を用いれば、優れた吸着
率、活性を有する固定化パパインが得られるが、本発明
以外の方法で得た酵素固定化用担体を用いた場合には、
所望する活性が得られなかった。
得られた酵素固定化用担体Ｄ* を用いれば、優れた吸着
率、活性を有する固定化パパインが得られるが、本発明
以外の方法で得た酵素固定化用担体を用いた場合には、
所望する活性が得られなかった。
【００３８】
【発明の効果】低分子量キトサンの酸性水溶液を塩基性
溶液中に滴下凝固再生せしめて得た再生粒状多孔質キト
サンを、カラギーナンの水溶液中に分散し、次いで多官
能性試薬と反応させ、カラギーナンを再生粒状多孔質キ
トサンに共有結合させる方法で得られた本発明の酵素固
定化用担体は、天然高分子であるキトサンとカラギーナ
ンを複合化したことにより、天然物を母体とすることか
ら安全性に極めて優れ、また、カラギーナンの硫酸基に
由来するカチオン性により塩基性酵素の吸着率も高く、
固定化酵素の活性にも優れ、繰り返し使用しても、優れ
た性能を発揮する効果がある。
溶液中に滴下凝固再生せしめて得た再生粒状多孔質キト
サンを、カラギーナンの水溶液中に分散し、次いで多官
能性試薬と反応させ、カラギーナンを再生粒状多孔質キ
トサンに共有結合させる方法で得られた本発明の酵素固
定化用担体は、天然高分子であるキトサンとカラギーナ
ンを複合化したことにより、天然物を母体とすることか
ら安全性に極めて優れ、また、カラギーナンの硫酸基に
由来するカチオン性により塩基性酵素の吸着率も高く、
固定化酵素の活性にも優れ、繰り返し使用しても、優れ
た性能を発揮する効果がある。
Claims (1)
- 【請求項１】 低分子量キトサンの酸性水溶液を塩基性
溶液中に滴下凝固再生せしめて得た再生粒状多孔質キト
サンを、カラギーナンの水溶液に分散し、次いで多官能
性試薬を反応させることを特徴とする酵素固定化用担体
の製造方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP27704695A JP2824902B2 (ja) | 1995-09-29 | 1995-09-29 | 酵素固定化用担体の製造方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP27704695A JP2824902B2 (ja) | 1995-09-29 | 1995-09-29 | 酵素固定化用担体の製造方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0994090A true JPH0994090A (ja) | 1997-04-08 |
| JP2824902B2 JP2824902B2 (ja) | 1998-11-18 |
Family
ID=17578037
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP27704695A Expired - Fee Related JP2824902B2 (ja) | 1995-09-29 | 1995-09-29 | 酵素固定化用担体の製造方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2824902B2 (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN107647112A (zh) * | 2017-09-18 | 2018-02-02 | 江苏瑞牧生物科技有限公司 | 一种饲用酶制剂载体及其制备方法 |
| CN114940776A (zh) * | 2022-06-28 | 2022-08-26 | 中山大学 | 一种多孔壳聚糖微球及其固定碱性蛋白酶的方法 |
-
1995
- 1995-09-29 JP JP27704695A patent/JP2824902B2/ja not_active Expired - Fee Related
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN107647112A (zh) * | 2017-09-18 | 2018-02-02 | 江苏瑞牧生物科技有限公司 | 一种饲用酶制剂载体及其制备方法 |
| CN114940776A (zh) * | 2022-06-28 | 2022-08-26 | 中山大学 | 一种多孔壳聚糖微球及其固定碱性蛋白酶的方法 |
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| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP2824902B2 (ja) | 1998-11-18 |
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