JPS589689A - 固定化酵素およびその製造方法 - Google Patents
固定化酵素およびその製造方法Info
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- JPS589689A JPS589689A JP10559581A JP10559581A JPS589689A JP S589689 A JPS589689 A JP S589689A JP 10559581 A JP10559581 A JP 10559581A JP 10559581 A JP10559581 A JP 10559581A JP S589689 A JPS589689 A JP S589689A
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- enzyme
- biopolymer
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- uricase
- immobilized enzyme
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- Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は担体に結合した生体高分子と酵素とが相互作用
により結合してなる固定化酵素に関するものである・ 近年固定化酵素技術の進歩に伴ない、固定化酵素は化学
反応、分析１、医療、食品、アフイニテイクロマトグラ
フイーなと多くの分野で利用されている。現在これらに
用いられる酵素の固定化法とし【は、■水不溶性の担体
と酵素とを共有結合によって固定化する共有結合法が最
も多く使用されている・この方法は酵素が担体と共有結
合により強く結合しているため、高淡度の基質溶液ある
いは塩１１？Ｉ液などＫよって簡単に脱離することがな
いという利点をもつ反面・固定化のための・ジアゾ化、
アミド化、アルキル化等の反応条件の設定が難しく、反
応操作が複雑であり、また比較的激しい処理をするため
に酵素タン、ｅり質の高次構造の変化や活性中心の一部
破壊などがおこり、従って活性の°高い標品が得られな
いこともあり、場合によっては基質特異性などの酵素的
性質に変化をきたすとい５欠点がある・次に■イオン交
換基を有する水不溶性の担体、たとえばイオン交換基を
有する多糖類やイオン交換樹脂のような合成高分子の誘
導体１１ＣＷｆ素をイオン的に結合させることによって
固定化するイオ７結合法は、共有結合法に比べて操作が
簡単であり、その処理も緩和なため、高次構造および活
性中心のアミノ酸残基の変化が少なく、比較的活性の高
い固定化酵素が得られる。しかし担体と酵素との結合力
が共有結合などの化学結合に比べて弱い′ため、緩衝液
の種類あるいは−の影響を受けやすく、イオン強度の高
い状態で反応を行なうと酵素が担体から遊離する欠点が
ある＠また０２個もしくはそれ以上の官能基を有する試
薬を用いて酵素と酵素を架橋することによって固定化す
る架橋法は、共有結合法の場合と同じく比較的激しい条
件１で固定化反応を行なうため、得られた固定化酵素の
活性が比較的弱い場合が多い。さらに■酵素をゲルの細
かい格子内に取り込む格子型や半透膜性のポリマーの皮
膜によって酵素を被覆するマイクロカプセル型のような
包括法は、酵素タンパク質自体とは結合反応をおこして
いないので酵素自身の性質に変化をきたさない反面、膜
表面の多孔度やサイズ不均一のさいに酵素が持続的に溶
出し、また基質の分子量が大きいと利用できない欠点な
冶する。
により結合してなる固定化酵素に関するものである・ 近年固定化酵素技術の進歩に伴ない、固定化酵素は化学
反応、分析１、医療、食品、アフイニテイクロマトグラ
フイーなと多くの分野で利用されている。現在これらに
用いられる酵素の固定化法とし【は、■水不溶性の担体
と酵素とを共有結合によって固定化する共有結合法が最
も多く使用されている・この方法は酵素が担体と共有結
合により強く結合しているため、高淡度の基質溶液ある
いは塩１１？Ｉ液などＫよって簡単に脱離することがな
いという利点をもつ反面・固定化のための・ジアゾ化、
アミド化、アルキル化等の反応条件の設定が難しく、反
応操作が複雑であり、また比較的激しい処理をするため
に酵素タン、ｅり質の高次構造の変化や活性中心の一部
破壊などがおこり、従って活性の°高い標品が得られな
いこともあり、場合によっては基質特異性などの酵素的
性質に変化をきたすとい５欠点がある・次に■イオン交
換基を有する水不溶性の担体、たとえばイオン交換基を
有する多糖類やイオン交換樹脂のような合成高分子の誘
導体１１ＣＷｆ素をイオン的に結合させることによって
固定化するイオ７結合法は、共有結合法に比べて操作が
簡単であり、その処理も緩和なため、高次構造および活
性中心のアミノ酸残基の変化が少なく、比較的活性の高
い固定化酵素が得られる。しかし担体と酵素との結合力
が共有結合などの化学結合に比べて弱い′ため、緩衝液
の種類あるいは−の影響を受けやすく、イオン強度の高
い状態で反応を行なうと酵素が担体から遊離する欠点が
ある＠また０２個もしくはそれ以上の官能基を有する試
薬を用いて酵素と酵素を架橋することによって固定化す
る架橋法は、共有結合法の場合と同じく比較的激しい条
件１で固定化反応を行なうため、得られた固定化酵素の
活性が比較的弱い場合が多い。さらに■酵素をゲルの細
かい格子内に取り込む格子型や半透膜性のポリマーの皮
膜によって酵素を被覆するマイクロカプセル型のような
包括法は、酵素タンパク質自体とは結合反応をおこして
いないので酵素自身の性質に変化をきたさない反面、膜
表面の多孔度やサイズ不均一のさいに酵素が持続的に溶
出し、また基質の分子量が大きいと利用できない欠点な
冶する。
本発明は担体に共有結合で結合している生体高分子、特
に硫酸プロタミンが酵素と相互作用により強く結合し、
酵素を安定化するとともに固定化するという知見に基づ
き完成したものである。
に硫酸プロタミンが酵素と相互作用により強く結合し、
酵素を安定化するとともに固定化するという知見に基づ
き完成したものである。
本発明で用いられる硫酸プロタミンは、サケ科などの魚
類の成熟した精巣より抽出され、アルギニン含量が高い
塩基性のタフバク質であるプロタミンの硫酸塩で、白色
粉末、熱湯にはよく溶けるが水には僅溶、有機溶媒には
ほとんど不溶である０まだ、熱や光には安定であり、加
熱による凝固あるいは変性をおこさない生体高分子であ
る。″ 一 本発明が適用される酵素は生体高分子と相互作用により
結合可能な酵素は全て用いられるが、生体高分子が硫酸
プロタミ７の場合は特にウリカーゼが好適であるＯまた
担体としてはガラスピーズが適している０ 本発明の固定化酵素は、担体［１法により結合した生体
高分子と酵素とを混合して室温で一定時間攪拌する、あ
るいは生体高分子を結合した担体をカラム等に充填し、
これに酵素溶液を通−液するという温和な条件で、生体
高分子と酵素との親和力により容易に固定化することか
で゛き、従来多く用いられている共有結合法による固゛
定化に比べて酵素自体の変性や失活を少なくするととも
に、酵素のもつ欠点の一つである不安定性“、たとえば
高熱、−変動あるいは化学薬品等による失活を軽減する
ことができる。しかも−反結合した酵素はかなりのイオ
ン強度にならなければ脱離せず、゛なんらかの使用条件
により脱離した場合でも、再び酵素を接触させることに
より容易に再生、再使用することができる。
類の成熟した精巣より抽出され、アルギニン含量が高い
塩基性のタフバク質であるプロタミンの硫酸塩で、白色
粉末、熱湯にはよく溶けるが水には僅溶、有機溶媒には
ほとんど不溶である０まだ、熱や光には安定であり、加
熱による凝固あるいは変性をおこさない生体高分子であ
る。″ 一 本発明が適用される酵素は生体高分子と相互作用により
結合可能な酵素は全て用いられるが、生体高分子が硫酸
プロタミ７の場合は特にウリカーゼが好適であるＯまた
担体としてはガラスピーズが適している０ 本発明の固定化酵素は、担体［１法により結合した生体
高分子と酵素とを混合して室温で一定時間攪拌する、あ
るいは生体高分子を結合した担体をカラム等に充填し、
これに酵素溶液を通−液するという温和な条件で、生体
高分子と酵素との親和力により容易に固定化することか
で゛き、従来多く用いられている共有結合法による固゛
定化に比べて酵素自体の変性や失活を少なくするととも
に、酵素のもつ欠点の一つである不安定性“、たとえば
高熱、−変動あるいは化学薬品等による失活を軽減する
ことができる。しかも−反結合した酵素はかなりのイオ
ン強度にならなければ脱離せず、゛なんらかの使用条件
により脱離した場合でも、再び酵素を接触させることに
より容易に再生、再使用することができる。
以下、実施例により説“明する。
実施例
■ウリカーゼの固定化
・ ガラスピーズ（フナコシ製、１３１ｏ ５１５
０ Ｌｏｎｇｅｈａｌｎ ａｍｉｎｏ ＣＰ Ｇ ）
０．４５１ ｉ’Ｃ”常′法−により１０％のゲルタ
ールアルデヒド１０ＴＲｔを反応させたのち、５−の′
リン酸緩衝＊ｋｍ解した硫酸プロタミン５１１Ｆを加え
て、室温で６時間攪拌する。次にこのプロタミン結合ガ
ラスピーズとウリカーゼ３Ｗｖを含む溶液１０−を混合
し、室温で１時間攪拌して反、応させたのち水洗するこ
とＫより、ウリカーセ固定化プロタミンがラスビーズ（
以下、固定化ウリカーゼという）′を得た；
゛ ・−′この固定化ウリカーゼの酵素活゛性は、ｐ
Ｈ８，５。
０ Ｌｏｎｇｅｈａｌｎ ａｍｉｎｏ ＣＰ Ｇ ）
０．４５１ ｉ’Ｃ”常′法−により１０％のゲルタ
ールアルデヒド１０ＴＲｔを反応させたのち、５−の′
リン酸緩衝＊ｋｍ解した硫酸プロタミン５１１Ｆを加え
て、室温で６時間攪拌する。次にこのプロタミン結合ガ
ラスピーズとウリカーゼ３Ｗｖを含む溶液１０−を混合
し、室温で１時間攪拌して反、応させたのち水洗するこ
とＫより、ウリカーセ固定化プロタミンがラスビーズ（
以下、固定化ウリカーゼという）′を得た；
゛ ・−′この固定化ウリカーゼの酵素活゛性は、ｐ
Ｈ８，５。
１８Ｃにおいて結゛合したウリカー′４ｔｌｌｉｊｌ当
り１４．２２μｍｏｌ／−であ′つた。 ′また、
酵素の固定化によって基質とめ親和性を示すミバエリス
定数０ｃｌＩ）は、固定化ウリカーゼおよび生のウリカ
ーゼともに１９Ｘ１０’Ｍを示し、固定化ウリカーゼの
活性中心は生のウリカーゼと同じであり、固定化による
変化はみられなかった０なお、ガラスピーズに直接結合
させたウリカーゼのｈ値は約１００倍以上の大きな値を
示す。
り１４．２２μｍｏｌ／−であ′つた。 ′また、
酵素の固定化によって基質とめ親和性を示すミバエリス
定数０ｃｌＩ）は、固定化ウリカーゼおよび生のウリカ
ーゼともに１９Ｘ１０’Ｍを示し、固定化ウリカーゼの
活性中心は生のウリカーゼと同じであり、固定化による
変化はみられなかった０なお、ガラスピーズに直接結合
させたウリカーゼのｈ値は約１００倍以上の大きな値を
示す。
■固定化ウリカーゼの安定性
固定化ウリカーゼと生のウリカーゼをそれぞれ試験管に
採り、所定温度に調節した恒温槽に５分間静置したのち
冷却し、尿酸液を加えて２９３ ｎｍの吸収の変化を初
速変法により測定した０結果は第１図に示す。−は７．
５に一定とし、２５Ｃにおける１分間の吸光度の変化を
１００襲としたときの各温度における活性し）を縦軸に
表わす。生のウリカーゼＣ仏−）は温度の上昇とともに
急速に活性は減少するが、固定化ウリカーゼ（−０−）
は熱に対して安定であり、７０Ｕでも１００％の活性を
示した＠ 次に１温度を２５ＣＩＩＣ一定し、−の影響について検
討した結果、ウリカーゼ活性は元来−依存性があるが、
第２図に示すように固定化ウリカーゼ（−０−）は−依
存領域が広くなり、中性付近で用いれば活性は１００％
維持することができる。
採り、所定温度に調節した恒温槽に５分間静置したのち
冷却し、尿酸液を加えて２９３ ｎｍの吸収の変化を初
速変法により測定した０結果は第１図に示す。−は７．
５に一定とし、２５Ｃにおける１分間の吸光度の変化を
１００襲としたときの各温度における活性し）を縦軸に
表わす。生のウリカーゼＣ仏−）は温度の上昇とともに
急速に活性は減少するが、固定化ウリカーゼ（−０−）
は熱に対して安定であり、７０Ｕでも１００％の活性を
示した＠ 次に１温度を２５ＣＩＩＣ一定し、−の影響について検
討した結果、ウリカーゼ活性は元来−依存性があるが、
第２図に示すように固定化ウリカーゼ（−０−）は−依
存領域が広くなり、中性付近で用いれば活性は１００％
維持することができる。
！１８１図は固定化ウリカーゼおよび生のウリカーゼの
温度と活性の関係を、第２図は−と活性の関係を表わす
グラフである。
温度と活性の関係を、第２図は−と活性の関係を表わす
グラフである。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、担体に結合した生体高分子と酵素とが相互作用によ
り結合してなることを特徴とする固定化酵素。 ２、・酵素がウリカーゼである特許請求の範囲第１項記
載の固定化酵素・ ３、生体高分子が硫酸プ■りｉｙである特許請求の範囲
第１項記載の国定化酵素。 ４、担体がガラスぜ−ズである特許請求の範囲第１項記
載の固定化酵素・ ５、生体に結合した生体高分子Ｋｌ！ｌ素を接触させて
生体高分子と酵素とを結合させることを特徴とする固定
化酵素の製造方法。 ６、酵素がウリカーゼである特許請求の範１！ｌＪｇｓ
項記載の固定化酵素の製造方法・ ７、 生体高分子が硫酸プロタ建ンである特許請求の範
８第６項記載の固定化酵素の製造方法。 ８、 担体がガラスピーズである特許請求の範囲第５項
記載の固定化酵素の製造方法０
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP10559581A JPS589689A (ja) | 1981-07-08 | 1981-07-08 | 固定化酵素およびその製造方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP10559581A JPS589689A (ja) | 1981-07-08 | 1981-07-08 | 固定化酵素およびその製造方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS589689A true JPS589689A (ja) | 1983-01-20 |
Family
ID=14411846
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP10559581A Pending JPS589689A (ja) | 1981-07-08 | 1981-07-08 | 固定化酵素およびその製造方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS589689A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN111203280A (zh) * | 2020-01-15 | 2020-05-29 | 扬州大学 | 一种具有类尿酸酶活性的铂纳米团簇及其制备方法 |
-
1981
- 1981-07-08 JP JP10559581A patent/JPS589689A/ja active Pending
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN111203280A (zh) * | 2020-01-15 | 2020-05-29 | 扬州大学 | 一种具有类尿酸酶活性的铂纳米团簇及其制备方法 |
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