JPS63501334A - 新規な固定化生体触媒およびその製造と使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、生細胞から成り粒子状の新規な固定化水不溶性生体触媒（生触媒：　 ｂｉｏｃａＬａｌｙｓＬ）およびその製造と使用に関する。

米国特許第３．８３８．００７号には、半固体または固体の粒子状の水不溶性酵 素組成物を製造する方法であって、ゲル化タンパク質の水溶液中に非タンパク分 解酵素（ｎｏｎ−ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃ’　ｅｎｚｙｍｅ）を懸濁させ、得ら れた混合物に水中で貧混和性ないしは不混和性の有機液体を加えて粒子状のサス ペンションを形成し、該サスペンションを処理してゲル化タンパク質のゲル化を 起こさせ、さらに、得られたゲル化タンパク質粒子を架橋剤と接触させることか ら成る方法が開示されている。ゲル化タンパク質（これは、好ましくはゼラチン である）は、酵素を所望の大きさの水不溶性粒子にするのに重要であり、さらに 、酵素を安定化する作用もある。酵素−ゲル化タンパク質水性溶液を粒子状にす るために開示されている有機液体は、とりわけ、４個またはそれ以上の炭素原子 を有する脂肪族アルコール（例えば、ブタノール）、アルコールと低級脂肪酸の エステル（例えば酢酸エチル、酢酸ブチルおよびプロピオン酸エチル）である。

この特許には、不溶性粒子を形成することのできる数種の非タンパク質分解酵素 についても言及されている。

粒子状の該組成物は、酵素反応用の基型（カラム）反応器または層型反応器に使 用することができ、特に、使用酵素が最終生成物に含有されていないことが要求 されるような反応に有用である。

生細胞、例えば、パン・菓子用イースト（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｃｒｅ ｖ　ｉｓ　１ａｅ）の細胞は、米国特許第３．８３８．００７号に開示された方 法に用いられているような有機溶媒によって迅速に殺されてしまうことは当業者 に理解されるであろう。幾つかの有機溶媒は、酵母における自己消化を開始する ものとして報告されている。例えば、酢酸エチルは、パン・菓子用イース）　（ ｂａｋｅｒ’　ｓ　ｙｅａｓＬ）を処理して、結晶シトクロムＣ［：ＮａＬｕｒ ｅＳｌ　７８　（１９５６）　、６２９−６３０］やβ−タラクトフラノシダー ゼ［Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏ、１１９　（１９７２）　、１３４６−１３５ ２）を調製するのに使用されている。

１１ｏｕｇｈおよび１ｙｏｎｓは、共有結合による酵素不溶化法が生体に対して 激しいことに注目し、そのような生体が支持体として使用されたときに生存し得 ることは殆んどないと推論している［Ｎａｔｕｒｅ。

２３５　（１９７２）　、３８９参照〕。それから、彼らは、結合剤としてチタ ン塩その他の無機塩を用い、特定の酵素を生体支持体、ずなわち、Ｓａｃｃｂａ ｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｃの幾つかの株に共有結合させる技術を開 示している。この結合技術は、［１ａｒｋｅｒ等によって開西独特願公開明細書 ２８０５６０７　（第９項、第１１−１７行）には、ｌ’ｒｃｅｓｓ　Ｕｉｏｃ ｂｃｍ、　Ｎｏ、　７　（１９７２）　、９−１２、すなわち、溶媒としてトル エンまたは塩化メチレンを用いセルローストリアセデート糸状体に微生物を捕獲 （エントラップ）することについて言及されている。該西独特願公開明細書にお いては、それらの溶媒は毒性が高く、したがって、支持マトリックス内での生長 による微生物の再生は殆んど不可能であるとしている。

最近、ＩｌａｅｇｅｒｄａｌおよびＭｏ５ｂａｃｈは、セロビオースからエタノ ールを製造するだめの小型カラム反応器における研究に基づき、パン菓子用イー ストとβ−グルコシダーゼとの共固定化体（ＣＯ−ｉｍｍｏｂｉｌｓａＬｅ）に ついて記述している［Ｆｏｏｄ　Ｐｒｏｃｅｓｓ　Ｅｎｇ、、　Ｐｒｏｃ。

Ｉｎｋ、Ｃｏｎｇｒ、、２ｎｄ　Ｉ　９７９　（ｒ’ｕｂ、１　９８０）　２　 、　１２９−３２：Ｃｈｅｍｉｃａｌ　ＡｂｓＬｒａｃｔｓ９４　（１９８１） 　１１９４５７に参照〕。ここでは、酵素はアルギン酸塩に共有結合され、しか る後、得られた調製物とともにパン菓子用イースト細胞がアルギン酸塩ゲル中で 捕獲されているが、そのような生細胞とともに有機溶媒または架橋剤のいずれも 用いられてはいない。

アルギン酸カルシウムは、リン酸イオンまたはその他のキレート化剤の存在下に ふいて不安定であるという欠点を有する。生細胞においてはリン酸塩は必須の栄 養分であり、したがって、生存細胞を含む多くの固定化系においてそのようなア ルギン酸は使用に適していない。

ヨーロッパ特願ＥＰ−へ−４１，６１０には、酵素が発酵能のある酵母生細胞と 結合されて周りを取り囲むようになった酵母／酵素不溶化法が開示されている。

この共固定化体は、酵母の細胞を脱水し、酵素の水溶液によって再水和し、さら に、酵母細胞の発酵に影響を与えない酵素沈殿剤を添加し、好ましくは、この後 に架橋剤を添加することにより製造されている。この共固定化体の製造には、有 機溶媒も分散剤を使用されていない。該共固定化体は、支持用マトリックスを欠 いているので、カラム型反応器等に用いるには不適当である。

上述した引用例は、いずれも、発酵および増殖能を保持した固定化生細胞を調製 するに当り有機溶媒、特に、トルエン、ブタノール、酢酸ブチルおよび酢酸エチ ルのような溶媒を使用することは教示していない。

本発明の目的は、生細胞を含み所望の大きさの粒子状を成す固定化水不溶性生体 触媒であって、各種の用途、例えば、カラム充填層、流動層反応器、撹拌槽型反 応器に用いることのできる生体触媒を提供することにある。

本発明の他の目的は、上記の固定化水不溶性粒子をかなり温和な条件（すなわち 、→）゛スペンションが押出される周りの有機溶媒とは対照的に、粒子内での条 件）下に調製することにより、固定化後において多量の生細胞が生存しているか 、あるいは再生することのできるようにした方法を提供することにある。

本発明の上述した目的および他の目的並びに効果は、以下の詳細な説明から明ら かになるであろう。

広範な研究と実験の後、驚くべきことに、水と貧混和性ないしは非混和性の有機 溶媒に生細胞を接触させ、ゲル化剤の水不溶液中に生細胞を懸濁させておくと、 生細胞、特に微生物の生細胞（例えば、酵素）の生存度は悪影背を受けないとい うことが見出された。

かくして、本発明は、架橋されたゲル化剤中に分散された生細胞を含む粒子状の 固定化水不溶性生体触媒を提供する。

本明細書において用いる「生細胞（Ｉｉｖｉ口ｇｃｅｌｌｓ）　Ｊという語は、 そのような細胞がその構造」二の一体性を保持しているときにのみ可能な広範囲 の代謝反応（またはタンパク質同化反応）を行なう（−とのできるような適合性 を有している細胞と理解すべきである。

そのような反応の例は、エネルギー（ＡＴＰ）の発生、細飽構戊分のり→ノイク ルおよび細胞の増殖である。

本明細書において用いる［粒子状（ｐａｒｔｉｃｕｌａｔｅ　ｆｏｒｍ）Ｊとい う語は、広い意味で解釈すべきである。粒子状とは、球形または実質的に球ｈｒ ｔの粒子の形状を含め、本明細書は一般にこのような球状ないしはほぼ球状の粒 子を指称しているが、粒子状きは、更に、例えば、繊維状の形状（例えば、押出 し繊維）、流し込みフィルｌ、（ｃａｓｔ　ｆｉｌｍ）　、容器のコーティング 、および含浸紙または含浸組織のような形状も含むこＪ二ができる。一般に、「 粒子状」とは、所望の大きさを有し本発明に従う組成物の形状を意味するものと する。

本明細書において用いる「ゲル化剤」軸ｅｌｌｉｎｇ　ａｇｅｎｔ）　Ｊという 語は、その水溶液が特別な処理（例えば、ゼラチンまたは寒天が用いられたとき には冷却）により固体状態または半固体状態に転換し得るような物質を意味する 。本発明の目的に好適なゲル化剤は、例えば、ゼラチン、ゲル化性ポリ炭水化物 （例えば、寒天）と、遊離アミノ基を含有するポリマー（例えば、キトサン）と の混合物であった適当な二価性または多価性架橋剤と架橋することができるもの 、および、ゼラチンとそのような化合物との混合物である。ゼラチン、およびゼ ラチンとキトサンとの混合物は、好ましいゲル化剤である。

本発明の目的に好適な架（ｎ剤の例は、グルタル酸ジアルデヒド（グルタリック ジアルデヒド、これは特に好ましい）およびタンニン酸である。

本発明に従う固定化水不溶性生体触媒に好適な生細胞は、例えば、微生物細胞、 および、動物や高等植物の細胞である。好適な微生物の生細胞の中で好ましいも のとしては、酵母や細菌、例え細胞である。

本発明に従えば、固定化水不溶性生体触媒は、一種またはそれ以−Ｌの酵素、特 に非タンパク分解酵素を含むこともできる。生体触媒に酵素が入れられるときに は、該酵素は生細胞およびゲル化性に対して適合性を有していなければならない ことは勿論である。

本発明の生体触媒に含むことのできる酵素の例は、アミノグリコシダーゼ、ラク ターゼ、マルタ−・ゼ、アミラーゼ、グルコースイソメラーゼ、プルラナーゼ、 インベルターゼ、リパーゼ、エステラーゼ、グルコ−スス４−シダーゼ、および デヒドロゲナーゼである。酵素の混合物を用いるこ♂もできる。

ｆ７ｉ定の冬４ｉ下においてはタンパク分解酵素を用いるこ吉もできるが、この 点は当業台には明らかであろう。例えば、ゲル化剤がゼラチンのようなタンパク 質であるときには、タンパク分解に活性な酵素はゲル化性タンパクを分解して物 理的に非常に不安定な生成物を与えるので、タンパク分解酵素の使用は回避すべ きである。

さらに、本発明に従えば、固定化水不溶性生体触媒は、任意に−・種またはそれ 以」二の酵素と組合わせた二種またはそわ以上の生ａｎ　＋＋；ｔを含むことも できる。

本発明に従う粒「状の固定化水不溶性生体触媒は、カラム型の反１１’−’　： ４：’ｉ、流動層反応器または撹怜型反応器等に用いて連続的な十〇、触媒をＪ Ｔなうのに’Ｊ：Ｉにイ１用である。この生体触媒を適用するこ、！二のできる 好適な反応は、炭水化物の転化反応（例えば、液状でん粉からのＡリボ９ツカラ イドのエタノールへの転化）、ラクトース（例えば、ホエイ中のラクトース）の 乳酸またはエタノールへの転化、および、セロビオースの酢酸、イタコン酸また はクエン酸への転化である。本発明に従う固定化水不溶性生体触媒の好適例は、 ５ａｃｅｌ＋ａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅを含み、グリセロールを 生成し副生物としてエタノールを生成するだめのものであり、あるいは、ラクタ ーゼと組合せてホエイをエタノールに転化するものであり、あるいは、Ｚｙｍｏ ｍｏｎａｓ　％（！：組合せて液状でん粉からエタノールを連続的且つ迅速に生 成するだめのものである。好ましい固定化水不溶性生体触媒は、Ｓａｃｃｈａｒ ｏｍｙｃｅｓ　ｅｅｒｅｖｉｓｉａｅを含み、任意的に１種またはそれ以上ので ん粉分解酵素、特にアミノグリフジダーゼと組合せたものである。このような組 合せは、液状でん粉（例えば、デキストリン）からエタノールを製造する発酵や 低力ｒｒ　リービールの製造に特に有用である。本発明に従う他の好適な生体触 媒は、炭化水素をケトンまたは酸に転化するため塩液を処理するためのリグニナ ーゼ形成固定化体（例えば、Ｃｏｒｉｏｌｕｓ、円＋ａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ、 　５ｐｏｒｏｔｒ　ｉｃｂｕｍおよびＳｔｅｒｐｔｏｍｙｃｅｓに属する種）、 ある種の医薬的に活性な化合物を製造するに際して特定の反応を触媒する酵素を 形成する固定化体（例えば、ステロイドや光学活性異性体を製造するのに有用な Ｃｕｒｖｕｉａｒｉａ。

Ｍｙｃｏ坤刈、ヅ↓駅−および廊隻りｏｍｏｎａｓ−に属する種）、でん粉また はグルコースから酢酸を製ｊｈするためのＡｃｅＬｏｂａｃｔｅｒに属する種の 固定化体、およびモノクロナール抗体を製造するだめの固定化ハイブリドーマ細 胞である。

本発明に従えば、」ユ述１．ｆこような固定化水不溶性生体触媒は次の各工程か ら成る方法によって製造することができる：（ａ）　ゲル化剤の水性溶液に生細 胞を懸濁させ、（ｂ）　得られた混合物に、水中で貧混和性または非混和性の有 機溶媒を加えて、生細胞とゲル化剤吉から成る水性粒子が有機溶媒中に存在する サスペンションを形成し、（Ｃ）　該サスペンションを処理して粒子中のゲル化 剤をゲル化し、（（ｊ）　工程（Ｃ）で得られた粒子を一価性または多価性架橋 剤乏処理して粒子中に存在するポリマーを架橋し、さらに、（ｅ）　所望に応じ て、工程（ｄ）で得られた粒子から水の少なく一部を除去する。

本発明に従う方法は、工業的な用途においてきわめて有用になる多くの利点があ る。例えば、本発明の方法は単純であるので、正確な制御を行なうことができる 。得られる粒子は、均一に分割されており均質であり、一般に半固体状であるか 、好ましくは、固体状である。酢酸ブチルまたはトルエン中で押出すことにより 一１本発明の固定化は無菌的に行なうことができる。最後に、本発明の方法は比 較的安価である。

ゲル化剤は、ゼラチンまたはゼラチンとキトサンとから木質的になる混合物が好 ましく、このゲル化剤は、生体触媒に加えられた酵素を安定化する作用も有する 。

生細胞、酵素およびゲル化剤から成る粒子状の混合物は、ゲル化剤の水溶液中に 生細胞および場合によっては酵素を懸濁させ、得られる混合物を水に貧混和性な いしは非混和性の有機液体に加えて粒子形状とし、さらに、得られる粒子状のサ スペンションを処理して（例えば、ゼラチンがゲル化剤であるときには冷却する ）ゲル化剤のゲル化を起こさせることにより形成することが好ましい。生細胞、 酵Ｓ（任意）、およびゲル化剤を含有する混合物を有機液体に加えるには、撹拌 を調整しながら混合したり、あるいは、生細胞、酵素およびゲル化剤から成る混 合物を有機液体中にザブマージスプレーする等の手法が行なわれる。後者の手法 は、垂直カラムを用い、このカラム内で形成粒子を有機液体（これには架橋剤が 含有されていることがある）中を下降させることによって行なうことができる。

生細胞、ゲル化剤、およびこれに酵素が含まれていることがある混合物の架橋は 、有機液体から該粒子状を分離し、二価ないしは多価架橋剤で処理することによ って行なわれる。別の方法として、例えば、ＣＩｏｓＬｒ　ｉｃｌ　ｉｕｍ細胞 の場合には、有機液体中に懸濁されている粒子状混合物を上記のごとき架橋剤で 処理してもよい。

生体触媒中に酵素を存在させることが望まれるときには、架橋工程に際してゲル 化サスペンションに該酵素を導入することができる。その後、所望に応じて、固 体化生細胞を活性化し増殖させてもよい。

好ましい態様として、架橋後に得られた粒子を乾燥することにより、該粒子が貯 蔵とバッキングに便利なようにする。使用前、通常、粒子を再度水和し、また、 必要に応じて固定化生細胞を増殖させる。

本発明の方法において出発原料として用いられる生細胞、酵素およびゲル剤から 成る混合物は、ゲル化剤の水溶液に、生細胞、および任意に酵素を懸濁させるこ とにより調製することができる。

ゲル化剤水溶液の温度は、活性混合物が液状で得られるような温度にずべきであ る。すなわち、約２５℃から約４０℃の温度が好ましく、ここで、最高温度は用 いる生細胞の熱的許容度に依存する。

溶液中のゼラチンは用いるゼラチンの種類に依存し、水に対して約０．１重量％ から約２５重量％の範囲で変わり、好ましくは、約５から１０重量％の範囲であ る。生細胞および酵素の濃度は、固定化生体触媒の使用目的およびその活性に依 存する。ゼラチンとキトサンとの混合物を用いる場合には、キトソンの濃度は、 水を基準にして約０．０５重量％から約１０重量％の範囲で変わることができ、 好ましくは、約０．１から約１重量％の範囲である。溶液のｐｌ＋は、その環境 下において細胞が最も安定になるようなｐＨにすることが好ましいが、ゼラチン が共存しているときには、ｐｉは約２から１２の範囲、好ましくは３から１０の 範囲にしてゼラチンがゲル化できるようにする。他のゲル化剤については、ρ１ １の範囲が異なることもある。

生細胞、酵素およびゲル化剤の混合物を調製するに際しては安定剤を添加しても よく、この安定剤は、ゲル化剤とともに生細胞を安定にし、さらに、酵素が存在 するときには生細胞および（または）酵素を安定にする。基本的には有機液体の 代わりに冷水を使用できるとも考えられたが、この方法は満足できる結果を生じ ないことが見出されている。本発明の方法において有用な安定剤の例は、ソルビ トール、グリセロール、使用した生細胞と酵素に対して非代謝性の基質である。

生細胞、酵素およびゲル化剤から成る水溶液ないしはサスペンションを粒子状に するのに用いる有機液体は、水中で貧混和性または非混和性の有機液体である。

好適な有機液体の例は、４個またはそれ以」二の炭素原子を有する脂肪族アルコ ール、例えば、ブタノールのようなアルカノール；アルコールと低級脂肪酸のニ スデル、例えば、酢酸エチル酢酸ブチルおよびプロピオン酸エチルのような０１ 〜Ｃ４のアルカン酸；パラフィン油、ベトロールおよび石油ニーデルのような分 枝状または直鎮状脂肪族炭素水素；ベンゼンおよびその同族体のような芳香族炭 化水素；塩化メチレンおよびトリクロロエチレンのような塩素化炭化水素；並び に、上述したような液体の二種またはそれ以」二から成る混合物である。

これらの中でも、入手が簡単であり且つ経済的に回収することができる点におい て、酢酸ブチルが特に好ましい。

生細胞−酵素（任意）−ゲル化剤の水性混合物に有機液体を加えるとき、および 得られるサスペンションの冷却操作（ゼラチンを用いる場合）に際して行なわれ る撹拌は、生細胞−酵素（任意）−ゲル化剤の水性混合物を所望の大きさの粒子 に分割できるようにする。得られる大きさは、撹拌の強さ、液体の比重の違い、 表面張力および液体の粘性、さらに、場合によっては、冷却速度、温度および当 初の生細胞−酵素−ゲル化剤から成る当初の混合物ないしはサスペンションの濃 度に依存する。一般に撹拌で充分であるが、他の方法、例えば、生細胞−酵素− ゲル化剤混合物を有機液体中にスプレーしてサスペンションを形成する方法を用 いることもできる。有機液体中での生細胞−酵素−ゼラチン混合物の冷却（例え ば、約１０ｔまたはそれ以下、あるいは、該混合物の凝固点よりも低い温度まで ）は、有機液体中におけるサスペンションの形成と同時に、または、その形成の 後に行なわれ、そして、冷却は迅速に行なわれたり緩漫に行なわれたりする。

架橋」二種は、二価または多価の架橋剤を用いて実施され、アミノ基含有ポリマ ーと共有結合を形成させる。好適な二価架橋剤の例は、グルタル酸ジアルデヒド およびタンニン酸である。

本発明の一態様においては、架橋工程の前に粒子の脱水が行なわれる。この脱水 は、得られる粒子の大きさを減少させ、このような縮小粒子が二価または多価架 橋剤と接触させられたときには架橋反応が向上する。

脱水工程は、粒子を例えばソルビトールまたはグリセロールを用いて浸透収縮さ せることにより実施することが好ましい。この脱水工程の後、二価または多価の 架橋剤を液体に添加したり粒子に適用する。脱水工程は、懸濁（サスペンション ）工程に用いた有機液体から粒子を分離した後に行ってもよい。

本発明の方法に用いる生細胞−酵素（任意）−ゲル化剤混合物に不溶性の充てん 材を添加してもよく、この充てん材は最終的に得られる粒子形状の物理的性質を 改良することができる。好適な不溶性充−Ｃん材の例は、微細に分割されたシリ ケートまたは酸化り〜イ素、例えば、ＫＩＥＴ、ＪＩＥＮＳＩＬ（合成酸化ケイ 素）、ＩＩＹＦＬＯＪＩｃＡＬＩＴＥ、けいぞう１−等である。

本発明の固定化生体触媒は、比較的重い材料（例えば酸化ジルコン粉末）で被覆 されて粒子に重量を５．えることにより、流動層反応：（ｇにおいて表面液速度 を高めて酸素濃度を高くするこ七もできる１゜ 最後に、本発明の方法により１τ）られた粒子状の細胞−酵素（任意）−ゲル化 剤混合物は洗浄されることが好ましい。好ましい洗浄液の例は、水または生物学 的？＋！！性物質に応じたｐＨを有する緩衝液である１、一般に、本発明の粒子 状調製物は屹燥することが好まし、い、。

本発明において用いられるセラチンのごときゲル化剤は、ポリ電解質であり、こ れが、存在する酵素の見かけの最適ｐｌ＋、ずなオ）ら、該酵素が最大の７・１ モ性を示すｐｌ＋に影背を！′ｊ、えるものと考えられる９、さらに、酵素の見 かけの最適ｐｌ＋に影腎を与える他の化合物を１＋　Ｊ”に存在さｌ！−でもよ く、例えば、硫酸プロタミンおよびポリアクリル酸によって例示されるような他 のポリ電解質を加えることもでき、これにより後の用途に応じた生細胞−酵秦− ゲル化剤粒子の最適１１１１がｉ％）られる等の効果がある。

酵ｌすの固定化に際して遭遇する実際的な問題の一つは、従来の使用法では、酵 母が固定された古島には酵母の発酵特性が不測的に変化するこ２二、ｊ；よび、 従来からの発酵条件下において見られるような好ましい発酵特性は該酵母が固定 化されると必ずしも保有されないＬいうことである。さらに、酵ｆｕの発酵特性 は、該酵れるかに応じて予測できないような変化をするということも見出されて いる。

醸造業においては連続式発酵に大きな興味があり、長期間にわたって連続式発酵 器において使用することができる固定化酵素の製造について多大の研究および開 発が行なわれている。他方、問題となるのは、長時間の反応にわたって固定化酵 母が物理的一体性を有し、さらに、長時間の反応期間にわたって所望の原料糖が ら許容できるような高濃度で恒常的にエタノールを産生ずる能力を有するかとい うこｂである。連続式発酵において遭遇する別の問題は、固定化酵母の層に４５ いて発生ずる熱に関する問題である。

醸造業におい−Ｃ興味がもたれている多くの酵母は回分式発酵で（未非常に好ま しい挙動をするが、連続式の層型発酵器において用いられる場合には熱の問題が 起こり酵母の挙動に悪影警を与える。

Ｌまたがって、連続層発酵器においては複雑で高価な冷却機構を設ける必要があ る。。

固定化および連続式発酵における使用に特に適１．２でいる酵母の種類を明らか にするために、本発明者は、観照性（ｔｈｅｒｍｏｐｌ＋　ｉ　Ｉ　ｉｃ）、あ るいは、さらに良好なものとして耐熱性（ｔｂｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｔ）　ｈ 言゛われている５抽の酵ｆ＋Ｊについてスクリーニングを行なった。酵母の観照 性は、４（）℃以」二の温度（通常は４０から４４υの間）において回分式培養 により数ｕｔ代（少なく吉も４〜５）にわたり増殖能力を維持している（！ｓき に現われる。かくして、成る酵母の観照性は、少なくとも４０℃の温度で特定の 培地において増殖させ、その増殖の程度を光学濃度によって測定する。というテ ストによって評価し７た。採用し）、二重性は次のとおりである。

テスト用酵１（↓を、１％Ｗ／Ｖのバク１〜酵母の抽出物、２％Ｗ／ＶのバクＩ −ペプトンおよび２％Ｗ／Ｖのグルコ−・ス（ｙｅａｓｔ、　ｅｘｔｒａｃｔ− ｐｅｐｔｏｎｃｉ−ｉｌｅｘＬｒｏｓｅ、以下、Ｙ　［ｉ　ｌ’旧と称する）か ら成る水性培地で増殖させた。ずなわら、３２’ｌ旧こ↓）いて￥　Ｅ　Ｐ　Ｄ 上でテスト用酵Ｂ↓４予侑増殖さぜた後、静置細胞１リットル当り１５０ｇの乾 燥酵ｔすとなるような割合で接杯した。酵Ｉ９．培養体を４２．５℃において１ ６時間にわたり増殖さ１ｉ“、光学濃度を読み取ることにより酵素細胞の増殖を 測定ｊ７た。同−条件干にお番」るパン菓子用イースト２１０３Ｎｇ　（Ｃ）３ ！；；６１３１＞について得られた光学密度の少なく、にも２．５倍の光学濃度 を与える酵母を観照性とろなし、本明細書１、＝おいてはこの光学濃度の読みを 有するものを観照性酵Ｉす２二定義する。

１述ｊ−たまうな１−１的を達成するため本発明名は、耐熱であり、さらに、エ タノール−１性の高い名神の酵１すをスクリーニングして、本発明に従う固定化 および連続式発酵用に充分な観照性を有するようへ株の同定を試みた。

本発明δによるスクリーニングデス１−によ−２．で得られたそのようｒ、ｉ酵 Ｉすの一つは、以前は旨（−（、ｌ＋ａｒｉ３ｍｙｃｅｓ　ａｎａｍｅｎｓｉｓ 　／−称されｌ−いたものである４、これは、当′ｆＪｌ　１９１３年に明らか にされたものについては、１，０市１ｅｒｉよびＫｒｃ３ｅｒ　ｖａｎ　Ｒｉｊ による「酵Ｐ３　（Ｙｅａｓｔｓ）　、、１（Ｎｏｒｌ−ｈ　ｌ１ｏｌｌａｎｄ 　ｌ’ｉ＋旧、　Ｃｏ、発行、ア人スプルダム）の第１版、および第２版、並び に、Ｋｒ叶（・ｒ　ｖａｎ　Ｒｉｊｌ、ｉｉａ集によるその後の改訂版（Ｅｌｓ ｅｖｉｃｒ発行）に記述されている。

本発明者は、ト１本の大阪にあるＩＦＯから入手ｊ７たＳ、（：ｅｒｃｖｉｓｉ ａｅ　ｖｅｒ。ａｎａｍｅｎｓｉｓ　（寄託番号ＩＦＯ０２０：３）のサノブル について調べ、驚くべきことに、この酵母の例えばグルコースの発酵能は、本発 明に従い固定化１．た場合、予期しない好ましい変化をすることを見出１．た。

我４・のスクリーニングデス１−にお「、）では、従来からのパン菓子用イース Ｉ？Ｆある２　２　Ｔ　Ｎｇ株し英国にｊｉいＣ口ｒｉＬｉｓｈ　ｉ’ｅｒｍｃ ｎｔａｔｉｏｎ　Ｐｒｏｄｕｃｔｓ　１．ｔｄ、からＰｅｒｍｉｐａｎ”ｒｅｄ ″の商品名で販売されでいる１、なお、Ｆｅｒｌｎｉｐａｎは登録商標である〕 乏種々の方法でＩＦｏ　０２０３林を比較し、た。４０℃またはそれより高い？ Ａｕ度下１よる本発明者の観照性テストにおいて、ＩＦｏ　０２０３ｉ；１正の 反応を示すのに対し、２２７Ｎｇｌ！負であるこ２二が見出された。３７℃、に 時間にお＆Ｊる生成エタノールのに４を測定する別のテストにおいては、ＩＦＯ ０２０３が２．２７％Ｖ／）／を生成し、他方、同−ｑ・件丁にｉノいで、２２ ７Ｎｇは実質的に同じである２、５４％Ｖ　／　Ｖを生成し、ていた。

酵１りの、二の２つの林間についで、初期の細胞密度を高く１７だ回分式発酵の 比軸を行なった２−、−０ろ、ｔＦｏ　０２０３は、最初の１６時間におイ’？ ：’　ｌ　５％Ｖ／Ｖ、ｔた、５し４時間後ＩＪ：　ｂ　＋、Ｎ　−Ｃ１６，５ ％のエタノールを生成するＪ、七ができ、他力、同一条件下で、２２７Ｎｇは最 初の１６時間において１３％のエタノール、また、２４時間後１、二おいて１８ ．５％の〕−タノールを生成することができた。これらのテストは、発酵性糖分 の欠如により発酵が停止しないような条イ′１下で行なわれた。。

それらの株（Ｊ一ついてさらに比較を行ない、所謂、糖のＤ値を測定した。この 値は、東独特許公報ＤＤ−２１６４８０−八においＴ導入された概念であり、２ ５秒より大きいＤ値を有するものをアルコール耐性酵母と定義ｊ〜Ｃいる。この Ｄ値は、５８℃の温度下に供された２二きに、酵母の９０％を死滅させるのに必 要な時間を秒で表オ〕シ、たものである。２５秒より小さいＤ値を有する酵１す はア刀べ］−ル感受性２二みなされる。このテストによるＬ％　ＩＰＯ０２０３ は５０秒のＤ値を有し、また、２２７Ｎｇは２６秒のＤ値を有しており、両者と も該テストではアルコール耐性とみなされる。

従来からの発酵による上述したような各種の比較テストに基づけば、本発明に従 い固定化し連続式発酵に用いたときに２つの酵母株の間に有意の相違があるだろ うき予測されるような根拠はなかった。しかしながら、実際に比較したときには 、ＩＦＯ０２０３の挙動には非常に顕著な改良が認められた。本発明に従い２２ ７Ｎｇをアミログリコシダーゼとともに共固定化し、原料デキストリンが連続的 に供給されエタノールを含む生成物流が連続的に取出されているカラムに粒状物 質を加えると、発酵が定常状態で実施されるとき、生成物流は８．５〜９．５％ Ｖ／Ｖのエタノールを含操作を行なうと、エタノールのレベルは１１〜１２％ト ナＦＪ、６ケ月間にわたって維持された。

ＩＦＯ０２０３に関する我々の研究が示しているところによれば、公表されてい る性質に反して、上述したような実験に用いたＩＰｏ　０２０３株はマルトース を発酵させないことが見出されている点において、該株の当初の単離者および１ ｏｄｄｅｒの第−版によって報告されているような発酵能に何らかの変化が生じ ている。このことは、当初の物質が寄託されてから突然変異が生じたことを示唆 しており、そこで、我々は、このマルトースを発酵させないＳ、　Ｃｅｒｅｖｉ ｓｉａｅのＩＰｏ　０２０３株を１９８６年５月７日１こｔｈｅ　［：ｅｎＬｒ ａａｌ　Ｂｕｒｅａｕ　ｖｏｏｒ　Ｓｃｌ＋ｉｍｍｅ　１ｃｕｌＬｕｒｅｓ（Ｏ ｏｓｔｅｒｓｔｒａａｔｌ、３７４２　ＳＫ　０ａａｒｎ　、オランダ国）に寄 託し、該機関カラ寄託番号ＣＢＳ　２５２．８６を受けた。

更に、我々は、ＩＦｏ　０２０３株（ＣＢＳ　２５２．８６）の人為的な変異株 についても研究を行なった。既知の変異原物質（突然変異誘発物質）を亜致死量 で酵母細胞にパルス付与することにより該株の突然変異を試みた。我々が用いた 変異原物質には亜硝酸ナトリウムおよびエチルメタンスルホネートが含まれる。

亜硝酸ナトリウムおよびエチルメタンスルホネートを用いてｌｌ’００２０３株 にパルス処理して得られた特定の株の一つは、その親株よりも曖れた性質を示す ことが見出された。本発明者らは、この変異株を２４９０−に１１３と名づけで 、この変異株２４９０−Ｋ１１３も１９８６年５月７日にＣｅｎｔｒａａｌ口ｕ ｒｅａｕ　ｖｏｏｒＳｃｈｉｍｍｅｌｃｕｌＬｕｒｅｓに寄託し寄託番号Ｃｌ３ ３２５３．８６を受けた。

簡＠ｌにするため、この寄託した変異株を変異株１３とする。変異株１３もまた 本発明の別の態様を構成するものである。

変異株１３を、親株ＩＦＯ０２０３に関する上述した各種の比較テストに供した 。耐熱性増殖テストにおいては、変異株１３はその親株ＣＢ５２５２．８６より も耐熱性が小さいが、２２７Ｎｇよりは耐性があることが見い出された。Ｋｌｅ ｔｔ−３％ｍｍｅｒｓｏｎの濃度計（６６フイルター及び３つの独立した読み取 り付き）を用いた光学濃度の平均は次のとおりであった。

林−４０℃　４１．５℃　４２．５℃ １１ン０−０２０３（Ｃ［ｌＳ　２５２．８Ｇ）　４０８　３５７　３４５変異 体１３　（ＣｎＳ２５３．８６）　３８３　３３８　３０５２２７　Ｎｇ　３２ ５　１１３　１００２１０３　Ｎｇ（Ｃ［ｌＳ　６１３１）　１７１　１４９　 ９９３７℃での従来からの発酵においては、変異株１３は３．６１％Ｖ／ＶＯ） ：ｒ−９７−ＪＬ、を生成し、これに対し、ＣＢＳ　２５２．８６ハ２．６７％ ｖ／■であり、また、２２７Ｎｇは２．５４％Ｖ／Ｖであった。

１６時間および２４時間後のアルコール生成を測定するテストによれば、変異株 １３は、１６時間では僅か１３．２５％Ｖ／Ｖまた、２４時間では１５．５％の アルコールを生成しており、アルコール生成の点では、その親株および２２７Ｎ ｇ株の両者の方が優れている。

しかしながら、変異株Ｉ３が、本発明に従いアミログリコシダーゼとともに架橋 ゼラチン内で共固定化され、粒子が連続式発酵カラムに入れられると、生成流中 のエタノールのレベルは定常状態において１１％〜■２％Ｖ／Ｖに達し、この高 レベルのアルコールが最大６時間にわたって連続的に維持され、さらに、アルコ ール生成の平衡レベルが迅速に到達される点において、該変異株は親株よりも優 れた挙動を示した。

本発明の生体触媒の主たる用途は炭水化物の転化であるが、生細胞の性質に応じ 、固定化細胞が性能を発揮するような他の微生物学的プロセスにも適用されるこ とはできる。

本発明に従えば、さらに、°ｒルコール生成用の基質を可溶性酵ｌすとアミログ リコシダーゼを含有する発酵器に通ず前に該基質を固定化酵１す／アミログリコ シダーゼを用いて好適に処理することができる。

さらに、本発明によれば、本発明の固定化酵母生体触媒を用い、部分転化したア ルコール生成用基質の転化を完了させることもできる。例えば、２０ＤＳデキス トロ一ス等量を含有する基質を可溶性酵母きアミログリコシダーゼを用い最初の 反応器で９％エタノール（Ｖ／Ｖ）まで転化させる。次に、この溶液を、本発明 に従いアルコール耐性酵母（例えば、前述したような種類に属するような酵母の 一つ）を含有する固定化酵母／アミログリコシダーゼ反応器に供給する。

生細胞が酵母細胞である生体触媒の主要な用途は、発酵性糖質の発酵、特に連続 式発酵によるエタノールの生成である。前述したように、本発明の生体触媒は連 続式発酵器において特に酵母細胞の利点を発揮させ、ここで、該生体触媒は固定 層中に存在する場合もあれば、あるいは、流動層またはく連続式）撹拌槽反応器 （ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓｌｙ　５Ｌｉｒｒｅｄ　ｔａｎｋ　ｒｅａｃｔｏｒ：　 ＣＳ　Ｔ　Ｒ）中に存在する。

本発明の好ましい実施態様においては流動層反応器中に生体触媒を存在させ、こ の場合には、該反応器内で均一な流動化が達成されるように反応混合物を導入す る。反応器空間の頂部に多機能分離区画を設けて、反応空間を出るガス−液体一 固体混合物が完全に分離され、且つ、該反応空間に生体触媒が完全に戻るように することが好ましい。多機能分離区画を備えたそのような流動層反応器は、担体 粒子に付着したバイオマスを有する廃水の精製に関するＥＰ−Ａ−００９０４５ ０に記述されている。この反応器と同種の反応器は、エタノールの分離、特に、 本発明の生体触媒を用いる分離に効果的に使用できることが見い出された。生細 胞（例えば酵母細胞）の滞在時間に対する増殖速度に関し反応器の原理は、上述 したヨーロッパ特許の場合と同様であり、最適な条件は当業者によって簡単に決 定されるが、使用する細胞に特に依存する。

発酵性糖から成る原料が反応器に連続的に供給され、エタノールから成る生１＆ 、物流が連続的に取り出される。勿論、酵母と発酵性糖原料とを適合させること が必要であり、本発明の特に好ましい態様に従えば、生体触媒として、本発明者 が寄託したアミロクリ−Ｊシダーゼと組合せたものを用い、原料としてデキスト リンを用いる。このデキス］・リンとしては、でん粉の酵素分解く例えば、アル ファアミラーゼを用いて）によって得られ、平均中音度が約７〜ｌＯのデキスト リンであり、テ′キストリンの最終分解に、Ｉ、り生体触媒そのものにおいて得 られたグル１−ス１県料を与えるようにしたものである。

本発明のいくつかの好ましい実施例を以Ｆに記述するが、本発明はこれらの１ｊ １定の実施例に限定されるものではない。

実施例１ ４０ｇの乾燥インスタント酵母す（Ｓａｃｃｈａｒｎｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｂ璽 土専９２１０３ｔＪｒ、　Ｃ１３Ｓ　Ｎｏ６１３１、乾に■固形分９６．５％） を、約４０℃の温度下においで、６０ｇのゼラチンを含有する水溶液９６０　ｍ ｅに懸ｌ蜀させた。１１１１を５．５に調整した。このゼラチン−ゼラチン水性 リスペンションを撹拌しながら４００ｒｄの■１−酎酸ブチル（Ｆめ４０を丁に 加熱）に添加し、た。得られたザスペンションを１０℃に急速冷Ｊｕｌ　１’る 。：、とにより、酵ｊサーゼラチン含有粒子を形成した。ｎ−酢酸ブチルはデカ ンテーション【、また、、２０００ｍ１！の水に溶か１．、、　ｐＨ６，５に調 整したグルタル酸ジアルデヒド３０ｇの溶液を用い、５　ｔの温度−トに１時間 、粒子（ｌｋＦ、の湿ビード）の架橋処理を１−ｊなった。ＩＩ−酢酸ブチル臭 が検知されなくなるまで水−Ｔ′″ｔ’：Ｊ子を洗浄した。得られた粒子は良好 な物理的安定性を有し、水に不溶性であった。ｈｆｉ獲（エントラップ）された 酵母細Ｂ’、ｉＩを好気条（′１下に３０００ｍｅの培地中で一晩回分式で培養 した。ジャケット中で、Ｏ，ｌ　Ｎ　０）Ｎａ０１１を用いてｐＨを４４５に保 ち、恒温ｉｔｌ’Ｉ御した水浴からの水を楯環させることにより温度を３５℃に 維持し７た、。

選択（２だ酵ｊりを次の組成から成る培地中で増殖させた（％はＷ／■）ニゲ刀 ξ′ノース２２％、Ｎ１１．ｌ　２％、に１１２Ｉ’ｆＬ　Ｏ，５％、ＮａＣ（ ２０，１％、Ｍｇ５ｏｎ　・７１ｈｆｌ　１％、Ｃａ１ＴＡ　・２１１Ｊ　０． ２％、Ｔｗｅｅｎ８０　（１ｍｌ？／ｌ）　、−ｒ−ルゴステロール（６，５ｍ ｅ／　（１）　、酵母抽出物０．１％、ビタミン’に３　＜７．５ｍｇ／　１　 ）　ｂよび消泡剤（０，５ｄ／ｊｌり。

固定化法の各工程においで粒子中に閉じ込められた、生存細胞の数（モルト抽出 寒天−にのブ【ノートカウント）は、第１表にま乏められでいる。ゼラチン埋設 酵母細胞に幻するｒ’ｌ−酢酸ブチルの劣化効果は検出できなか−７た。

実施例１に記載したの２二同様の方法であるが、酵母単独の代わりに、出発物質 として４０ｇの乾燥インスタント酵母（錬、９穂ジ鼎ツｌ−７ＣｆＥ−８翌任具 シ憇　２０３１Ｎｇ、ＣＢＳ　Ｎα６１２８、乾燥固形分９６．５％）と８ｍ（ ’、のアミワブルコシダーゼ（ΔＭ［ＧＡＳＥ　Ｌχ、２６．０００ＡＧ１単位 ／ｄ、Ｇ　１ｓＬｂｒｏｃａｄｅｓ）を用いで、架橋した酵１リーアミログルコ シダーゼーゼラチン粒子を得た。この粒子は水中で不溶性で、良好な物理的安定 性を有しでいた。

実施例３ 実施例１に記載した方法により酵Ｐトーゼ′ラチン粒子を調製した。

Ｎｎ４８７？、乾燥固ノ■多分９６，５％）を用い、１１−酢酸ブチルのデカン シコン後にｉ４た）Ｑ−］′ｌｅｔ、溶解化アＦ、　ｒｔグルコシダーゼの存在 下においでグルタル酸ジアルデヒドを用いた架橋した。

２（１０ｍ乙の水に溶か１．た３　０　ｇのグルタル酸ジアルテ゛ヒト（５０％ Ｖ　／’　Ｖ溶液）と２００　ｍｅＯＹｊ”　ｉ　［１グル丁ｊシダーゼ（ＡＭ ＩＧＡＳＥ、実施例２参照）から成る溶液および１０００ｇの湿ビードを、５’ ｔ：　（’）ＫＡ　度”Ｆ、Ｉ’　ＩＩ　６．５　ｉ”：　ｉｉ　イテｌ　１１ ３間、架（ｎ処理ｔ、た１゜液体を除去した後、架橋剤が完全に取り除かれるま でアミログルコシグーセ被覆酵素−ゼラ升ン粒子を数回洗浄した。実施例２０に 記述するような−Ｌタノール発酵を行なった。実施例２の方法に従−２−ご製造 された粒子に比軸すると２１．二のＴミログリコシダー−Ｖ　酵１リーゼラチン ｉ−＋’ｉ子は高い安定性を示した。

実施例４ 固定化微生物を連続的ＩＪＶｉｉへするため、次の改良法を実施ｊ〜だ。

七うチン含有微生物溶液を、多数の狭い管を介してｎ−＾゛ト酸ブチルを△ｆＩ するカラノ、（５″Ｃ：に維持）にポンプ給送した。前記の管は、そのＥ′端が ｔ１′１酸ブー１−ルよりも））７置的に低くな−、ており、１散生物−トラ− トン溶／ｆｆｌから成る流体”；ｉｌ、ｒｊ常的に供給ｊ７、該流体はＹｌ−酢 酸ブチルに到達！−１た２二きに小さい液滴になる。この液滴の大きさはポンプ の速度に依Ｈしていｊ、ｒ、ｏカラムの長さは５　ｃ＋＋＋であり、トｉｔη− りろ液滴がゲル化し２架橋剤と反応するのに充分子、（時間を有し。

でいｔ、−ｎ　８％）られたビート′をカラｌ、の底部から連続的に隼め、「ト ー酢酸ブチル苓除去し７水で洗浄１，７た。消費したグルタル酸ジアルデヒドを 補充しまた後、！１−酢酸ブチルはリシイクルした。カラノ・は、約４【・ｍの 内１￥交有１２．１時間当たり約８βの固定化微生物を生成した。

実施例５ 実施例４に記載した方法により、共固定化微生物−酵素粒子を連続的に調製した 。世、Ｌ、、酵素および微生物４含有するゼラチン溶液をロー酢酸ブチル低温溶 液中に押出した。

実施例６ 一連の実験を行ない、実施例１に記載１．た方法に従い酵母−ゼラチン粒子を調 製した。但し２、酢酸ブチルの代わり、次の有機溶媒を順次使用した。

石油ニーデル（高沸点留分、７０／１１０）いずれの場合においても１、Ｌれら の有機溶媒中で少なくとも１時間培養した後の生存細胞量は１００％であった。

の抹であるΔＴＣＣ９３２５を用いて不溶化粒子を得た。固定化法の各工程で； ｍ　ｉＮいて粒子中にカプセル被覆された生存細胞の量（Ｄｉ［’ｃ：ｏからの ０．１１゜１寒天上のプレートカウント、ｐｉ−ｉ’ｒ。４）を第２表によ２二 めでいる。ゼラチン埋設ＡｃｅＬｏｂ旧、ｔ　ｅ　ｒ細胞ＩＪ対するｎ−酢酸ブ チルの変質効果は検出されず、また、グルタル酸ジアルデにドによる細胞の損傷 も検出されなかった。

第２表 ４５０ｍ１の稀酢酸に４０℃において２０ｇのカニ殻キトザンを溶解させ、酢酸 ナトリウム３０ｇを用いてｐｌ＋６．０に中和した。次いで、該キト→Ｊン溶液 に、ＡｃｅｂａｃＬｅｒ　ｐａｓｔｅｕｒｉａｎｕｍの湿細胞２５０ｇを懸濁さ せ、温度を４０℃に維持した。これとは別に、５００ｍｅの水道水に２０ｇの寒 天を溶解し、温度を１００℃に上ンサスペンションに添加した。得られたサスペ ンションを、実施例４に記載したように、５℃においてｎ−酢酸ブチルに押出し た。

このようにして得られた粒子を、実施例３と同様に、水で洗浄しグルタル酸ジア ルデヒドで架橋した。但し、架橋剤の濃度は２倍に高めた。

得られる粒子は水中で不溶性であり、良好な物理的安定性を示した。

実施例９ ６０ｇのゼラチンを含有する水溶液７０ｒｎ１．に、約４０℃の温度に於いて、 ２５０ｇのバクテリアスラリー（ＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｐｌａｎＬａｒｕ ｓ、乾燥固形分３．５％）を懸濁させた。

このバクテリア−ゼラチン水性サスペンションを撹拌しなから４０００ｄのロー 酢酸ブチル（予め４０℃に加熱）に添加した。

得られるサスペンションを１０℃に急冷してバクテリア−ゼラチン含有粒子を形 成させた。ｎ−酢酸ブチルはデカンテーションした。２０００ｍ１１！の水に溶 かしｐｌ＋６．５に調整した３０ｇのグルタル酸の溶液（５０％ｖ　／　ｖ溶液 ）を用い１時間、５℃の温度で粒子（１ｋｇの湿ビード）を架橋した。ロー酢酸 ブチル臭が検出されなくなるまで粒子を水で洗浄した。得られる粒子は良好な物 理的安定性を有し、水中で不溶性であった。エントラップされたバクデリア細胞 を微好気性条件下に３０００ｍｆの培地においてバッチ方式で培養した。ジャケ ット中において、ＩＯＮのＮａ０ＩＩを用いてｐｌ＋６．０に維持し、サーモス タットで制御された水浴からの水を循環することにより３０℃に温度を維持した 。

固定化法の各工程において粒子中に閉じ込められ生存細胞の量（ＭＲ３ＡＧＡＲ （ＯＸＯＩＤ　ＣＭ３５９　’）上のプレートカウント）を第３表にまとめてい る。ゼラチン埋設バクテリア細胞に対するｎ−酢酸ブチルの変質効果は検出でき なかった。

（”９ＸｌＯ”バクテリア細胞７ｇ乾燥ビード）の活性培養体を第４表に記す培 地に接種（０，５％）し、窒素雰囲気下に３７℃においてｐｌ＋制御を行なうこ となく培養した。２週間後、発酵内容物をハーベストし、胞子（ｓｐａｒｅｓ） を無菌脱ミネラルＮｉｌ：Ｉ！、、０．１　ｇ／　ｎ 走化１〜だ。但し、］ぞうＪン（６％ｗ　／　ｗ　）および十ト→Ｊン（ｓｉＦ 、ｍａ。

Ｃ−３（、ｉ　４６）　０．５％ｗ　／　ｗから成る混合物を用いて該Ｌａｃｔ ｏｈａｃ　ｉ　Ｉ　ｌ　ｕｒ。

細胞４固定化した。固定化の８−］；稈において粒子内に閉じ込められた生存細 胞の早（実施例９に記載ｊまたようなプレー川・カランｌ−）を第５表にまとめ ている。

実施例１１に記載１〜だ方法を１￥り返した。但し、酵母細胞を固定化するため に、ゼラチン（６％ｗ　／　ｗ　）およびポリエチｌ／ンイミン（ｓｐ−２００ 、［＝３本触媒製）２％ｗ　／　ｗから成る混合物を用いた。固定化法の諸」ユ 程において粒子中に閉じ込められた生存細胞の数（実施例１と同様のプレートカ ウント）を第６表にまとめている。

第　６　ｙ 実施例９のｊノ法を＆り返Ｉ７た。…し、使用した混合物はゼラチン（４％ｗ／ ｗ）／＝フルギン酸アミン（２％Ｗ　／　Ｗ　）の混合物である１、このアルギ ン酸−アミン誘導体は次のように調製したニア５０ｄの蒸留水に溶かしたＭａｎ ｕｃｏｌ　Ｅ／　ＲＥ　２０　ｇの溶液（ｐＨ３，５）に、２００ｍｆｆの蒸留 水に溶かし、た１、６−ヘキサンジアミン２３ｇ（０，２モル）の溶液（濃酢酸 の添加によりｐＨをｉｏ、ｏに調節）を迅速に且つ少量ずつ添加した。得られる 反応混合物を室温下において４時間撹拌し、次いで、ｌ、０１のメタノールで希 釈し７た。沈でんを濾過ｊ７．２００ｍｐ、のメタノールで２回洗浄した。

真空下に５０℃で乾燥後、酵素および微生物に対する有用な担体になると思われ る白色の粉末が得られた。グルタル酸ジアルデヒドを用いる架橋処理（実施例１ 参照）したところ、不溶性粒子が得られ、この粒子は良好な物理的安定性を有し 、また、第６表のデータに匹敵する生存細胞カウント数を示し７た。

実施例１４ 植物細胞＜ＴａｇｅＬｅｓ　ｍ１ｎｕＬａ；　１．５％ｗ　／　Ｖ／乾燥質量） のスラリー７５ｇを、１７ｇのゼラチンを含有する水溶液（温度約４０℃、ｐＨ ５，０）　１７５　ｍ、ｅｌ；’ｌ懸濁させた。このゼラチン溶液を含有する植 物細胞を、［１−酢酸ブチル（５℃に維持）を含有するカラン、に多数の狭管を 介；−てポンプ輸送した。それらの管の下り＝；は酢酸ブチルよりも低い位ｉ６ にあり、植物細胞−ゼラチン溶液から成る流体を定常的に給送し、該流体はｎ− 酢酸ブチルに到達すると小さｌ、【液滴になる。液滴の大きさはポンプの速度に 依存していた。カラン、の長さは５ｍであり、したがって、下降液滴がゲル化す るのに充分な時間が与えられる。得られるビードをカラムの底から連続的に集め 、酢酸ブチルから分離し、水で富、浄した。ｎ−酢酸ブチルはカラムにリシイク ルした。カラムは、約４ＣＩＴ＋の直径を有し、１時間当り約８１の不溶化植物 細胞ビードを生成した。その後、各種の濃度のグルタル酸ジアルデヒドを用い、 ５℃、ｐＨ６，０において１時間、粒子の架橋を行なった。、得られた粒１を水 道水で充分に洗浄した。該粒子は水に不溶性であり、良好な物理的安定性ロー酢 酸ブチルの代わりにベトロールを用いて実施例１４の方法を繰り返した。この実 験においても、物理的安定性が良好で水に不溶性の粒−」−が得られた。

実施例１６ 一連の実験を行ない、実施例４に記載した方法により酵素−ゼラチンｔｏ、子を 調製１−だ。但し、低温酢酸ブチル内に押出す前に酵Ｉリーゼラチン→Ｊスベン ショ〕／１．−酸化ジルコンの粉末＜３２５Ｉツシユ）を加えた。添加するＺｒ ＬＯ量が多くなる稈、高密度のん１粒１−が得られるようである。代表的な実験 の結果は第１図に示され実施例４に記載の実験に従い酢酸ブチルに少量のホスフ ァチジルコリン（ｌノシチン）を添加１〜だ。この方法によると、小ビードの代 わりに、小繊維が形成された。

実施例１８ 実施例２に記載しまたような方法に従い、共固定化した°γミログリコシダーゼ と酵１すの湿粒子２０ｇを調製し、た。貯蔵安定性を増すために、酵１リーアミ ログルコシダーゼーゼラチン粒子を実験室規模の非連続式流動化装置で２０〜３ ０分間乾燥し、この際、酵母粒子の温度が４０℃を超えないよう（ご注意した。

空気による流動化を注意深く奢ｉない、また、乾燥の開始は迅速に行なった。初 期のうちは、粒子を手で撹拌ないしは振動さゼた。得られる粒子は８５〜９３％ の乾燥物質を含有し、ていた。真空下に５℃において貯蔵Ｉ７た々ころ、酵母細 胞あるいは共固定化アミログルコシダーゼのいずれも、１２ケ月間にわたり何ら の活性の低下を示さな実施例■に記載の方法によって得られた酵１す゛−ゼラチ ン含有粒子をパイメリアフタ−（Ｃ３’Ｉ”Ｒ）（作動空間：８００ｄ）に用い た１、ずなわら、３５０ｇの湿粒子を充填し、既述の増殖培地に添加されたグル コースの殺菌２０％（Ｗ／Ｖ）溶液を流量を変化さ）ｋで反応器（リアクター） に通１７だ、１温度は３２℃に保った。

該バイオリアターは、４ケ月間連続的に作動した。この期間中、流出物からザン ブルを採り、王タノ・−ル１、グルコースおよびグリセ［１−ルの測定を１１な ２．た。無菌性が維持されるような注意は払っていｊ工か−）ｊ二が、汚染はろ ノーめＩＲ４＋なかった。

得られた結Ｗによる杏、固定化酊１ｆｉ）細胞の作動安定性は高く平均エタノー ル濃度は８．０　＝　８．５体積％であった。

実施例２０ 実施例２の方法によって得られた酵母−アミログルコシダーゼ−ゼラチン粒子を 実施例１９と同様に再生し使用した。但し、グルコースの代わりに、当初のＤＥ 値が１５のマルトデキストリンの２０％（Ｗ／ｖ）溶液を用いた。

結果は、！２図に与えられており、共固定化されたアミログルコシダーゼと酵母 が高い作動安定性を有すること、また、ＤＥ−１５マルトデキス）　ＩＪン基質 が１工程の作動でエタノールに転化される可能性が示されている。平均エタノー ル濃度は８．５体積％ン含有ビードをバイオリアクター（Ｃ３ＴＲ）（作動空間 ８００ｍ７！）に用いた。ずなわら、湿ビード８０ｇ、及び、グルコース溶液５ ％（Ｗ／Ｖ）と酵Ｌす抽出物溶液２％（Ｗ／　Ｖ　）とを有する無菌培地７２０ ｍ７！を充填した。核培地はリン酸塩でＰＩ＋７．０に緩衝した。３０℃の温度 下、１６時間培養した後、サンプルを取り、そのグルコースと酢酸を分析した。

酢酸の最終濃度は０．５ｇ／（ｌであり、測定した酸生成速度は、１時間当り、 Ｉｇの細胞（乾燥質量）に対し、て酢酸２１ｍｇであった。

グルコースの代わりに基質としてエタノールを用いて同じ実験を行なった。酢酸 の最終濃度は０．８ｇ／ｊ！であり、生成速度は３１ｍｇ酢酸／ｇ細胞（乾燥質 量）７時間であった。

（作動空間：８００ｍｆｆ）に使用し、該粒子の混粒子１４０ｇを実施例９に記 載の培地３００ｍｆとともに充填した。

発酵の開始時に、４８％（Ｗ／Ｗ）のグルコース溶液３５２ｄを２２時間にわた り１６ｍｅ／時間の速度で発酵装置に添加した。

温度を３０℃に保ち、ＩＯＮのＮａ０１１を用いてｐＨ６，０に保持した。

回分式発酵の全時間は６０間であり、この期間、サンプルを採取してグルコース き乳酸を測定した。無菌性が維持されるような注意を払ってはいなかったが汚染 はみとめられなかった。結果は、乳酸の高生成能を有しており、また、終りでも ９６％という高い収率を有していることを示した。発酵終了時における乳酸濃度 は第３図に示されるように１７，８％（ｗ／ｖ）であった。

実施例２３ Ｎ２ガス雰囲気にあるＣ３ＴＲ（培養体積０．５１り及び第４表に示す培地を用 いて、実施例１０に記載した固定化Ｃ１ｏｓｔｒｉｄｉｕｍ細胞を含む有機溶媒 の発酵を行なった。ビード（２ｇ／ｌ胞子を含有する０、２５β）の「殺菌」お よび発芽の活性化は、水性エタノール（５０％（Ｗ／Ｗ）を用い、Ｋｒｏｕｗｅ ｌの方法（口１ｏｔｅｃｈｎｏ　ｌ。

ＬｅＬＬｓ、３　（１９８１）１５８−１５９）に従って行なった。エタノール は、培地添加の前に、殺菌生理食塩で洗浄することにより除去した。その後、発 芽と生育相のみが続いた。最初の１６０時間に１１られた発酵結果を第４図に示 している。グルコースはブタノール、ブチレート、アセテート及びラクテートに 転化している。微少量のアセトンが見られることもあった（但し、示していない ）。ブタノールの最大生成能は０．７６ｇ／１時間であり、このとき、グルコー ス転化速度は５ｇ／β時間であった。

培養の諸段階においてビードを電子顕微鏡で走査すると、ゼラチンマ）　ＩＪフ ックス中胞子及び幾分かの残存細胞が均一に分散されており、ビードの完全なコ ロニー化は７日間で達成されることが示されている。

実施例２４ Ｍｕｒａｓｂｉｇｅ及びＳｋｏｏｇ培地（２％ｗ／ｖサッカロース含有）を用い て、実施例１４および１５に記載の固定化植物細胞の酸素潤度の大きさであった 。

用いた方法は、酵母の連続培養に基づくものであり、発酵装置に添加する新しい 培地の速度を制御するために増殖依存性ｐＨ変化を採用している（“ｐｈａｕｘ ｏｓＬａＬ″）。この方法は、Ｇ、　Ａ、　Ｍａｒｇｉｎ及びＬ　Ｉ’、　ｌｌ ｅｍｐｆ　ｌ　ｉｎｇによる’Ａｒｃｈ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、　１０７　（１ ９７６）　４１−４７”に記述されている。Ｇａ　Ｉ　ｌｅｎｋａｍｐ型のｌｌ の発酵装置に、後述する組成を有する基礎最少培地を充填した。すべての操作は 無菌条件下に行なわれ、上述の著者による複合培地を含有する発酵装置に、Ｓ、 Ｃｅｒｃｖｉｓｉａｅ　Ｉ　Ｆ　０　０２０３　（ＣＢＳ　２５２．８６）の予 備増殖培養体を接種した。当初、ｐｌ＋を４．５に維持した。このため、発酵装 置にＮａ０Ｉｌ用の入口を設け、必要に応じてＮａ口１１を注入してｐ＋＋４． ５に保った。さらに、発酵装置に、’ｐｈａｕｘｏｓｔａＬ’　によって制御さ れる新鮮培地用の入口も設けて、グルコース濃度が制限されないようにした。初 期の温度設定は３２℃であった。発酵装置が定常状態操作に達したときには、温 度を４０℃に上げた。該発酵装置は、４ケ月間連続運転した。

後述するようなプロトコールに従い、アルコール濃度が限定的になると変異原物 質を用いて酵母にパルスを与え、さらに、後の場合においても、アルコール濃度 が限定的になったときに酵母に再び変異原物質によるパルス処理を施した。当初 、エチルメタンスルホネート（ＥＭＳ）を注入し、注入直後、発酵装置における ＥＭＳの濃度が後述するようなバーセン）ｗ／ｖとなるようにした。ＥＭＳを３ 回注入した後は、引き続く注入は亜硝酸ナトリウムの水溶液で行ない、注入直後 において、発酵装置内の亜硝酸ナトリウムの濃度が後述したようなミリモル（ｍ Ｍ）／ｌになるようにした。

基礎培地のダ３度は次のとおりであった。

ｇ／ｌ Ｎｌ１．Ｃ７！２．５ に１１２間、　０．２５ Ｍｇ５Ｏ−、７１１２００，１ ＮａＣＡ’　０．０５ Ｓｐｏｒｅ　ＩＥｌｅｍｅｎＬｓ　０．１　（ｉｐ、）Ｖｉｔａｍｉｎｓ　ｏ、 ５　（ｍｌ？）Ｅｒｇｏｓｔｅｒｏｌ　１．７２　（ｍｇ＞Ｔｗａｃｎ　８０　 ０．２５ Ｇｌｕｃｏｓｅ　１００　ｇ 変異原物質のパルス化処理プロトコールは次のとおりである。

接種後（時間）　変異原物質パルス １６０　０、　Ｏ１，８ＭＳ ４６０　０、１　ＥＭＳ ６５０　１、ＯＥＭｓ ｌ　２　０　０　０、　１　ｍＭ　ＮａＮ口。

１４３０　０、５ｍＭ　ＮａＮＯ２ １６０　（１１，０ｍＭ　ＮａＮ１１゜１８２　（１２，ＯｍＭ　ＮａＮ［１２ １９Ｇ　（，１３，ＯｍＭ　ＮａＮＯ２規則的／、（間隔で１ノンプルを取り出 １２、全体で２４９０時間終了後、取り１１冒〜だサンプルを稀釈１２、（逼％ エタノールを５有するモルト狼、天りにまいた３、増茄の良好な１６のコロニー を前述し、たようｆＪ、　ｆ：ｉ時間／　３７　’Ｃ了Ｊｌ／　１１−ル生成テ ストで更に分析した。３７を二に↓ダける６時間培養後、１１χ離されたいろい ろな変異株は２．５３”＝−３，（ｉ　１％シフ／νの間の濃膣のメタノール濃 度４・与えることがμ出さｔまた。３．６１％の数値を与えたー′Ｊ［］ニーを 変異体２４９０Ｋ　ｌ　１３　、’二ｌ＋、し、前述１〜たようにＣＢ　Ｓ　２ ５３．８６として寄記した。

主培養体の発酵を続、け、全体で４８６０時間の培養後、別のサンプルを取り出 した。

単離された各種のヅンブルをテストし、前述した手法に従い６時間、：（７℃に おいてアルコール生成能を調べた。得られた変異株は２．６９〜３．５６％ｖ　 ／　ｖのエタノールを生成することができるこ乏が見出された。３．５６％のエ タノールを生成するサンプルを変異体４８６０に１とし、また、３．３１％のエ タノールを生成する変異体は変異体４８ＧＯＫＩ６と命名した。

実施例２６ 第６図に示すようなタイプの流動層型反応器において発酵を行なった。

この発酵装置は、内径（ｉｃｍで高さ１５００ｃｍのカラムの形状を成ず流動層 部（１）から本質的に成り、その頂部に内径１４印の沈降区画（２）とその沈降 区画（セトラ・−）の内側にあるガス分離セクションに３）とが設りられている 。流動層部（１）は原料パイプ（１２）よりト方から供給を・妥けるようになっ てｉ９す、沈降区画（２）には出１コ（１４）と再循環（リザイクル）０（１５ ）とが設けられている流動層部（１）は水ジャケット（４）により恒温制御され るようになっている。水ジャうット（４）はライン（６）を介１−で供給を受け 、温度側０１１装置（７）および冷却水貯蔵装置（１１）ｉ；二よって制御され る１、流動層部（１）内のｐｌ＋は、１）１１制１３１１１装置（１０）により 制御されるようになっており１、二の装置（１０）は、注入パイプ（５）を辿る アルカリの供給量を制御する。原料は原Ｉｔ貯蔵器（１６）から入口（１２）を 介して流動層部（ＩＮ、盲人られるが、この入口（１２）には温度指示装置（８ ）お、ＶびｐＨ指示装置（９）が設けられている。ライン（１５）を介し７て沈 降区画（２）を出る再循環用基質は、ポンプ（１３）を辿ってリシイクルされ入 口（１２）を介し２て戻される。

次の組成の基質を調製した。

Δ２マルトデキストリン（ＩＩＩＥ　８−１０）　１６０　ｇ／　ｊ７Ｎ１１． Ｃｎ　２．５　ｇ／　１ Ｋｌｌ、ｌ’１．．１．　０．２５　ｇ　／　ｉ！］：３．基礎塩 Ｃａ［Ｊ、、２＋１．０　２．Ｏｇ／Ｉ！藺ｇｓＯｎ、７＋１２０　１０．Ｏｇ ／Ｉ！ＮａＣｆｆ　１．０　ｇＩｎ Ｃ１胞子エレメント クエン酸　０．２５０ｇ／ｊ！ Ｆｅ５Ｏ＝　（ＮＩＰ４）　−３Ｏ４，６１１２００，４５０ｇ　／　（！Ｚｎ ５Ｕ４．７１１２０　０．０８４８　／　Ｉ！［ｕＳＯｎ、　５１１２０　０゜ ０１３ｇ＃Ｍｎ５ＩＪ、、　４１１□Ｕ　０００１０ｇ／ｊｌ！１１．１川、　 ０．０１０ｇ／１ ＮａＪｏＯ，、２１１，００，０１０ｇ　／　ｅにｌ　０．００５ｇ／ｆｆ １）、ビタミン イノシ］・−ル　０．２００　ｇ／Ｉ：！ニコチン酸　０．０１０　ｇ／１ Ｃａ−Ｄ、−バントデン酸　０．０１０　ｇ／ｌビタミン旧　０．０１０　ｇ／ ｌ ［Ｉ−アミノ安息香酸　０．００６　ｇ／１２ビタミン＋１６　（１，００１ｇ ／Ｒ ロービオチン　０．０４．１０−’　ｇ／ｌエルゴスデ１１−ル　０．００１　 ｇ／（１’ｌ’ｗｅｅｎ−２００，２５０ｄ／　１２消泡剤　０．２５　ｄ／　 ｅ マル用・デキスｌ−リン溶液、是礎塩Ｊｔ′−地、ビタミン溶液および胞子エレ メント溶液を２０分間１２０　ｔにおいて、別々に殺菌した。

殺菌後、この４つの溶Ｍを互いに：：’＋’ｆｉ加して−に述したような組Ｘ］ とした。

流動層反応器（第に図）に、ぞの作動′ト間（１）の５０％（ト０．５）Ｊ・な るようにビード（平均直径：１．旧１１ｍ）を充ｔＨシた。１．二のビードは、 実施例２において詳述したように、架橋ゼラチン担持体中に固定化された賦活酵 Ｌす細胞１．−γｉｖグリコシダーゼ２二から成る。

この実施例の実験は、次の酵１ｉＪ株を用いズー行なオ）れた、。

１、ｓａｃｃｂｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｐｒｅｖｉｓｉａｅ　（／＜ン１５７−用イ ースト、２２７　Ｎ、、’１２．５ａｃ　〔、ｌ＋ｒｏ＋−１ｙｃｅｓ　ｃｅｒ ｅｖｉｑｉａｅ　Ｃｔ（Ｓ　２　５　２．　８　６３．５ａｃｃｈｒｔ＋ｍｙｃ ｃｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ　ＣＢ　Ｂ２５３．８６マルトデー１−ストリン（ Ｍ叶聞ｅｅｌ、ＣＩ’Ｃ）溶液を００から連続的に発酵装置に供給（７、このと き、その供給は、すべてのオリゴサツカライドが糖化ｊ−エタノールに転化する ような特定の速度で行な一つだ。温度を３２℃に保持し、４、ＯＮのＮ　ａ　［ Ｉ　ＩＩを添加するこ乏によりｐ１１４．１５に保った。

基質は上述の条件下で連続的発酵に供１．た。ビードの流動化を促進するために 、再循環パイプ０２１にあるポンプ０争により反応混合物の線速度を０．１５ｃ ｍ／秒に調製１．た。１′Ｊ［出混合物中のエタノール濃度、マルトデキストリ ン、マルｉ−スおよびグルツースなどの糖類の濃度、ならびに、グリ七ＫＮ　− Ｊｉ／濃度は、高圧液体り「１マドグラフ（炭水化物カラｌ、付、タイプＨＰ　 Ｘ　Ｏ７Ｃ［］１ｏｃａｄ）を用いて毎日測定した。。

第７図は、使用（−７た；３種の異なる酵Ｊす株１、関（〕Ｃ１反応器内の基質 の６釈速度と最終的なエタノール濃度の関係を示している。

定常状態は、いずれも１週間維持された。驚くべきＱ、：に、酵母株ＣＢ５２５ ２．８６およびＣＢ５２５３．８６のみが、１０．５体積％より人きい最１ｔエ タノール濃Ｊ９］および２％より小さいグリセロール濃度を達成するこきができ たが１、＝７れに対して、パン菜子用イース１−の場合、最終的な１タノ−ル濃 度は９％より小さく、また、グリｌ−「コール濃度は３％ｖ　／　ｖより人−＼ か−、ｊ二、、さらにＣｌｌ５２５３、８　（ｉの場合アルコール生成（７）平 （ｊｉレベルにすく到達した。

の培地で培養した。＋−−−ド中の酵１’１Ａｉｌｌ　ｌ自をプレートカウント により適時測定１．５た。第８図は、培’Ｉｔ＝時間に対し、乾燥ビード全体Ｉ ｇ当りの生存細胞の平均濃度を示１．ている。

乾燥ビードのｇ当り少なくとも４Ｘ１０”細胞から成る最終濃度を得ることがで きた。実施例２６の流動層反応器にこのような活性化ビードを充填することによ り、単位反応器体積当りに高い濃度の酵母細胞が得られた。第９図は、反応器ｍ ”当りの酵母細胞の数と、と−ドによる反応器の装填度とを示している。酵母細 胞の濃度は、非固定化反応系（例えば、細胞リサイクル反応器）において得られ る濃度の少なくとも１０倍であった。

ＣＢ５２５３．８６を含む高活性ビード（実施例２７参照）を、実施例２６に記 載の流動層反応器３台から成る発酵システｌ、（但し、互いに直列に接続）に使 用した。各反応器は、作動空間の４０％ｗ／ｖを占めるようにビードが充填され た。

第一段階、第二段階および第三段階における体積は、それぞれ、次のとおりであ る：　Ｖ＋　＝５００ｍ１２；　Ｖａ　＝４８０ｍｌおよび■３＝８００ｍｅ０ 各反応器における原料の滞在時間は、Ｔ、＝２．６３時間、１’、＝２．５３時 間およびＴ、＝であった。最終エタノール濃度およびアミログルコシダーゼの残 存活性に関する結果を第２図に示している。この図に示すように、エタノール生 成用の安定した反応系が得られ、第三段階における平均エタノール濃度はｌ０９ ４体積％であった。

第７表は、これらの３つの段階における平均比反応速度、エタノール濃度、収率 および生成速度を示すものである。

第７表 ζり 一 グルコース４星：　（９／Ｉ） 、ｇｌＬ！ ＋、５ ζク 国際調査報告 ｌＩＩｌｓｍａａａ＊ａｌム＊５ｕｃｅ當、＊−ｍｓ、？ｃτ／ＮＬ８６１００ ０３９−２−

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．架橋したゲル化剤中に分散された生細胞から成る粒子状の固定化水不溶性生 体触媒。 ２．生細胞が、酵母、細菌および植物の細胞から成る群、または、それらの混合 物から選はれる請求の範囲第１項に従う生体触媒。 ３．生細胞およびゲル化剤と適合する１種またはそれ以上の酵素とともに該生細 胞が分散されている請求の範囲第１項または第２項に従う生体触媒。 ４．酵素が、アミログルコシダーゼ、ラクターゼ、マルターゼ、アミラーゼ、グ ルコースイソメラーゼ、プルラナーゼ、インベルターゼ、リパーゼ、エステラー ゼ、グルコースオキシダーゼまたはデヒドロゲナービである請求の範囲第３項に 従う生体触媒。 ５．ゲル化剤が、ゼラチン、または、ゲル化性ポリ炭水化物と架橋条件下に架橋 され得る遊離アミノ基を含有するポリマーとの混合物である前記請求の範囲のい ずれかに従う生体触媒。 ６．Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの生存細胞が架橋ゼラチンに分散され、さらに、 任意的にアミログリコシダーゼが分散されていることがある請求の範囲第５項に 従う生体触媒。 ７．生細胞が、酵母抽出物／ペプトン／グルコース中において４０℃を超える温 度下に持続増殖することのできるＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの親熱性株である前 記請求の範囲のいずれかに従う生体触媒。 ８．耐熱性株がＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅＣＢＳ２５２．８６である請求の範囲 第７項に従う生体触媒。 ９．生細胞が、２５秒より小さいＤ値（５８℃において生細胞の９０％を死滅さ せるのに要する時間）を有するＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのエタノール感受止株 である請求の範囲第１項〜第６項のいすれかに従う生体触媒。 １０．エタノール感受性株がＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅＣＢＳ２５３．８６であ る請求の範囲第９項に従う生体触媒。 １１．Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅＣＢＳ２５３．８６。 １２．生細胞から成り粒子状の固定化水不溶性生体触媒を製造する方法であって 、 （ａ）ゲル化剤の水溶液中に生細胞を懸濁させ、（ｂ）このようにして得られた 混合物を、水中で貧混和性または非混和性の有機液体に加えて、生細胞とゲル化 剤とから成る水性粒子が該有機液体中に存するサスペンションを形成し、（ｃ） 該サスペンションを処理して、粒子中でゲル化剤をゲル化させ、 （ｄ）工程（ｃ）で得られた粒子を二価または多価架橋剤で処理して、粒子中で ゲル化剤を架橋させ、さらに、（ｅ）所望に応じて、工程（ｄ）で得られた粒子 から水の少なくとも一部分を除去する工程を含む前記方法。 １３．生細胞およびゲル化剤に適合性を有する酵素を、工程（ａ）のサスペンシ ョンに導入し、および／または、該酵素を架橋工程（ｄ）に際してゲル化サスペ ンションに導入する請求の範囲第１２項に従う方去。 １４．請求の範囲第２項〜第１０項のいずれかに記載した生体触媒を調製する請 求の範囲第１２項または第１３項に従う方法。 １５．工程（ｃ）で得られた粒子を脱水、好ましくは浸透収縮により脱水する請 求の範囲第１２項〜第１４項のいずれかに従う方法。 １６．工程（ｄ）で得られた粒子を再水和し、さらに、所望に応じて、固定化細 胞を増殖させる請求の範囲第１２項〜第１５項のいずれかに従う方法。 １７．請求の範囲第１項〜第１０項のいずれかに記載の触媒の炭水化物転化にお ける使用。 １８．発酵性糖類の発酵によりエタノールを生成する方法であって、生細胞が酵 母細胞であり請求の範囲第１項〜第１０項のいずれかに従う生体触媒の存在下に 発酵性糖類を発酵条件に供することから成る方法。 １９．連続式発酵装置内のカラムに生体触媒を保持し、該発酵装置に糖類脈料を 連続的に供給し、さらに、発酵装置からエタノールを連続的に除去する請求の範 囲第１８項に従う方法。 ２０．原料がデキストリンであり、生細胞がＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅＣＢＳ２ ５２．８６、またはＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅＣＢＳ２５３．８６であり、さら に、生体触媒がアミログルコシダーゼを追有する請求の範囲第１９項に従う方法 。 ２１．ＥＰ−Ａ−００９０４５０に実質的に記載され、頂部に多機能分離区画を 備える流動層反応器を使用する請求の範囲第１８項〜第２０項に従う方法。