CN1064890A - 在微生物通气培养过程中控制碳源浓度的方法和装置 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及在微生物通气培养过程中控制碳源 浓度的方法。在补料分批通气培养、连续通气培养或 细胞再循环连续通气培养的流加培养过程中，培养罐 内的基质碳源保持低浓度。其控制方法是，监测培养 基内pH或溶解氧含量的增加，用由计算机控制的加 料控制装置，以计算出的加料速度向培养罐中，间歇 加入料液。本发明还涉及发酵生产L-赖氨酸的方 法，该方法具有优于先有技术方法的优点，能使生产 率得到改进、产物积累浓度较高、L-赖氨酸收率提 高。

Description

本发明涉及一种在微生物通气培养过程中控制碳源浓度的方法。具体地说，本发明涉及一种在通气补料分批培养、通气连续培养或细胞再循环连续培养过程中，在培养物加料期间控制培养罐中的基质碳源使其保持低水平的方法。其做法是，监测培养基中pH或溶解氧含量的增加，利用由计算机控制的加料控制装置，以计算出的加料速度向培养罐中间歇加入料液。还提供了适于实施这样一种方法的装置。
本发明进一步涉及一种发酵生产L-赖氨酸的方法。由于L-赖氨酸在饲料谷物中供应不足，所以L-赖氨酸是作为肉鸡饲料或猪饲料添加剂使用的一种重要氨基酸。
为了利用微生物发酵法生产各种物质，例如各种氨基酸或核酸，或者为了生产微生物细胞，如酵母细胞，要对微生物进行通气培养。在工业上，微生物的通气培养用补料分批培养法、连续培养法或细胞再循环培养法来进行，并采用诸如糖类等碳源作为主要的原料。
在这样一种培养方法中，必须在培养物加料过程中使培养罐内的碳源（基质）如糖类的浓度保持尽可能低的水平。这样就能达到许多目的，例如：防止粗碳源抑制基质、通过有效利用培养原料而减少粗碳源的损失、易于从最终发酵液中分离产物、以及防止分离产物后留下的废液中所含的剩余碳源污染环境。
在连续培养和细胞再循环连续培养的情况下，即使在培养物加料过程中也连续排放培养液并从中分离产物。在分离过程中必须把碳源如糖类的流量控制在可能的最低水平，以使碳源对分离过程的影响基本为零。还必须防止原料的损失。在这类培养方法中，还希望避免分析碳源浓度的手工操作，其做法是采用自动监测手段来控制碳源浓度的稳定性。
关于在培养物加料过程中把碳源如糖类的浓度维持在低水平的问题，以前曾有人描述了一些方法，这些方法包括用下列指标作为独立指标来控制碳源浓度，例如：耗氧量、二氧化碳气排放量、pH、副产物生成量、加碳源如糖类时氨的加入量（碳源的量是把加氨量乘以预定的比例系数而计算出来的）。根据这些方法，不能十分精确地测出培养过程中的微生物活性，致使在某些情况下活性发生异常变化时浓度不能得到满意的控制。由于这些原因，在培养过程中不可能把碳源浓度有效控制在低水平（例如低于3克/升）。
另外，还有另一种已知方法公开了仅以溶解氧浓度来检测培养过程中培养罐内碳源浓度的消耗，但检测可靠性差。如果通气或搅拌条件（搅拌转速、空气流量）改变，则溶解氧浓度变化很大。在这种情况下，传感器有时会错误地检测出碳源的消耗，从而使培养罐中的碳源浓度不能得到有效控制。由于这些原因，这种方法也不实用。
因此，很清楚，目前需要一种在微生物通气培养过程中自动控制碳源浓度的方法和装置。本发明提供了这样一种方法和装置以解决上述问题。
本发明的另一方面涉及一种发酵生产L-赖氨酸的方法。前人描述过的一些方法包括，用分批法或连续法培养能够产生L-赖氨酸的微生物，在培养基中积累L-赖氨酸，并收集L-赖氨酸产物。
在分批处理的情况下，将含有碳源和氮源的液体培养基置于发酵罐中进行分批培养。另一种方法是，进行培养物加料时连续地或间歇地加入只含有碳源的培养基。
在连续处理的情况下，进行培养时把培养基连续供入发酵罐中，并连续放出相同体积的培养液，以使细胞数量或产物浓度等保持恒定。
在用常规分批法进行L-赖氨酸发酵时，培养液中产物的积累量或收率虽然高，但却难以达到高生产率。另一方面，采用常规连续法时，生产率虽然高，但却难以达到高产物积累量或高收率。为了适应L-赖氨酸需求的增长并以较低廉的成本生产L-赖氨酸，必须提高L-赖氨酸发酵的生产率，改善产物积累浓度和收率。
因此，需要提供一种用能够解决先有技术技术难题的发酵法来生产L-赖氨酸的方法。本发明提供了一种以高生产率、高产物积累浓度和高收率生产L-赖氨酸的新发酵方法，从而把常规分批处理和连续处理的优点结合起来。
本发明的一个目的是提供一种在微生物通气培养过程中控制碳源浓度的方法及用于实施该方法的装置。本发明的另一个目的是提供一种发酵生产L-赖氨酸的改进方法。
本发明的一个实施方案涉及一种以补料分批培养法、连续培养法或细胞再循环连续培养法对微生物进行通气培养的方法，该方法包括，在由计算机自动控制的培养罐中间歇加入碳源料液。
本发明的另一个实施方案涉及一种以补料分批培养法、连续培养法或细胞再循环连续培养法对微生物进行通气培养的装置，该装置包括：
一个培养罐，该培养罐装有分别用于检测培养罐中培养基的PH和溶解氧浓度的传感器，以及一个为接收料液而设计的培养基通气和搅拌装置;
用于控制料液向培养罐加料速度的控制装置，该控制装置包括：用于接收分别由pH传感器和溶解氧浓度传感器输出的信号并输出转换信号的第一信号转换器;用于接收转换信号、用转换信号计算加料速度、并输出加料速度信号的计算装置;用于接收加料速度信号并输出加料速度转换信号的第二信号转换器;用于利用加料速度转换信号控制料液向培养罐加料速度的加料速度控制装置。
本发明的另一个实施方案涉及一种发酵生产L-赖氨酸的方法，该方法包括：在液体培养基中接种一种能够产生L-赖氨酸的微生物;培养该微生物，并在该微生物的对数生长期之后，加入另一批同时含有碳源和具有生长促进作用的养分的培养基，以维持培养基内的碳源浓度不超过5克/升;收集培养基内产生并积累的L-赖氨酸。
从附图和以下的发明详述部分中可明显看出本发明的各种其他目的和优点。
图1说明了本发明装置的一个实施方案。
图2说明了实施例1所用的装置。
图3示出比较例1所用的装置。
图4表示实施例1的流加培养条件。y轴在图4（a）、4（b）和4（c）中分别代表发酵罐中的溶解氧浓度、pH和糖浓度。x轴在图4（a）-（c）中代表递增时间。
图5示出实施例1中在一段时间内（小时，x轴）控制糖浓度（y轴）的情况。
图6示出比较例1的培养条件。y轴代表糖浓度，x轴代表时间（小时）。
本发明部分地涉及一种以补料分批培养法、连续培养法或细胞再循环连续培养法对微生物进行通气培养的方法，该方法的优点在于：加料过程中微生物对碳源如糖类的吸收速度可以控制在碳源料液的适当加料速度;碳源的消耗可以以良好的可靠性和确定性进行检测;碳源消耗的检测可以不受通气或搅拌条件的影响。该方法还具有其他优点。
本发明还提供实施上述方法的装置。
申请人为解决发明背景部分中所讨论的上述问题而进行了广泛的研究，结果发现，以补料分批培养法、连续培养法或细胞再循环连续培养法进行通气培养的过程中，如果向培养罐中间歇加入碳源如糖，则此次加料和后续各次加料时的碳源料液加料速度可以用pH的增加或溶解氧浓度的增加作为指标来确定，这种pH或溶解氧浓度的增加是由培养罐内所装的培养基中碳源的消耗引起的。随着首次加料结束与后一个加料期之间时间间隔的不同，根据培养基中pH或溶解氧的增加由一台计算机对加料速度进行监测和控制，从而解决了先有技术的难题。
因此，本发明部分地涉及一种微生物通气培养方法，其中，在微生物的补料分批通气培养、连续通气培养或细胞再循环连续通气培养过程中，首次加入碳源料液时是把料液间歇地加到培养罐中，并且以预先确定的加料速度和加料持续时间加入料液。
在某个加料期前的停料期，如果计算机检测出由于培养罐内碳源（基质）消耗而引起pH增加或溶解氧浓度增加，就开始第二次加料或后续加料，加料时，以确定的时间向培养罐中加入料液，加料速度用计算机由该停料期的时间和该停料期前的加料期中料液的加料速度来计算，计算原则是，如果所述停料期的时间长，则减小加料速度，如果所述停料期的时间短，则加大加料速度。
该方法的特征是，在微生物通气培养过程中，把培养罐中的基质浓度自动控制在恒定的低水平。
为了发酵生产各种物质或生产细胞本身，对微生物进行补料分批通气培养、连续通气培养或细胞再循环连续通气培养，同时在培养罐中连续地（这里所用的“连续地”一词是广义的，也包括“间歇地”）加入含有基质碳源（如糖类）的料液，这是人们所公知的。进行本发明的补料分批通气培养、连续通气培养或细胞再循环连续通气培养时，除了这里所述的流加培养过程中料液的加料方法外，也可以对补料分批培养、连续培养或细胞再循环连续培养的公知方法进行修改。
一般来说，如果在流加培养前的主培养中，培养基中基质碳源（如糖类）的浓度达到某一低水平，则在此时开始该流加培养过程中料液的首次加入。预定的料液加料速度预先由预备实验来确定，一般等于主培养在流加培养开始时（即首次加料开始时）的基质消耗速度。料液加入的确切持续时间是一个随意的时间，其选择范围应使微生物消耗碳源如糖类的活性变化不大（一般在10分钟至24小时范围内）。
首次加料完成后，如果培养基中的基质被消耗，则培养基的pH和溶解氧浓度都要增加。当计算机通过pH传感器和溶解氧浓度传感器检测到这种增加时，计算机就向控制料液进入培养罐流速的装置发出指令，从而开始第二次加入料液。
pH的增加和溶解氧浓度的增加并不一定同时发生。如果这两项增加之间有一个时滞，则根据较早检测到的那项增加开始第二次加料。pH传感器和溶解氧浓度传感器有时会破损，因此要经常校准。所以，这两个传感器并不是单独使用的。同时使用两个传感器能大大改善基质消耗的检测可靠性。
第二次加入料液时的加料速度是通过计算得出的速度，计算原则是，如果停料期长，则减小加料速度，如果停料期短，则加大加料速度。这就使基质加料速度与基质消耗速度达到了平衡，从而根据首次加料与第二次加料之间停料期的长短及首次加料的加料速度，把培养罐内培养基的基质浓度保持在所希望的低水平。计算过程由计算机来进行，但这一计算机程序很容易由本领域专业人员来设计。这种程序的一个例子示于下面所述的实施例1。
第二次加料的确切持续时间，按照与首次加料的确切时间类似的原则来确定。第二次加料的持续时间并不一定和首次加料相同，只要求该时间在某个范围内选择以使微生物消耗碳源（基质）如糖类的活性变化不大。每次加料持续时间的选择，应使该时间内微生物消耗基质的活性变化不大，并能使培养过程中培养罐内的基质浓度保持低水平。
第三次及以后各次加入料液的开始时刻、加料速度及加料持续时间的确定，与第二次加料类似。
因此，在某个加料期的停料期，如果计算机检测出由于培养罐内碳源（基质）消耗而引起pH增加或溶解氧浓度增加，就开始第二次加料和以后各次加料，加料持续时间和加料速度由计算机根据该停料期的持续时间和前一次加料的加料速度来计算，其计算原则是，如果停料期长，则减小加料速度，如果停料期短，则加大加料速度。
如上所述，有可能在逐点监测微生物活性的同时，规定基质碳源（如糖类）料液的加料速度和其他加料条件。也有可能简便地把培养罐中的基质浓度控制在低至5克/升以下，进一步在3克/升以下。
本发明还涉及上述方法所用的装置，该装置包括：（ⅰ）一个培养罐，该培养罐装有分别用于检测培养罐中培养基的pH和溶解氧浓度的传感器，以及为经过流速控制装置接收料液而设计的通气和搅拌装置;（ⅱ）一个配有两个信号转换器的计算机，其中（a）pH传感器和溶解氧浓度传感器的连接方式是，使这两个传感器检测出的pH和溶解氧浓度检测数据经同一个信号转换器分别输入计算机;（b）流速控制装置的连接方式是，使计算机计算出的料液加料速度经过另一个信号转换器输入流速控制装置。
本发明的装置是具有以下功能的装置：检测基质碳源如糖类的消耗;根据由安装在培养罐上的pH传感器（如pH电极）和溶解氧浓度传感器（如溶解氧电极）输入计算机的信号，由计算机计算碳源料液的加料速度;将计算出的加料速度输入装在培养罐的碳源加料管上的料液流速控制装置。
正如本领域所公知的，pH传感器和溶解氧传感器经常容易破损，所以应经常校准。根据本发明，各传感器并非单独使用，而是组合使用的，从而能够大大改善碳源如糖类消耗的检测可靠性。每个传感器单独使用时，虽然可靠性降低但仍有效果。
本发明的另一个实施方案涉及用L-赖氨酸生产菌发酵生产L-赖氨酸的方法。本发明所提供的L-赖氨酸生产方法结合了常规连续发酵法和常规分批发酵法的优点，即：生产率高、产物积累浓度高、L-赖氨酸收率高。申请人发现，L-赖氨酸生产方法的上述改进可以用以下方法来实现：在液体培养基中接种能够产生L-赖氨酸的微生物;培养该微生物，并在该微生物的对数生长期后加入同时含有碳源和具有生长促进作用的养分的流加培养基，以保持培养液中的碳源浓度不超过5克/升;收集培养液中产生和积累的L-赖氨酸。
因此，本发明涉及一种发酵生产L-赖氨酸的方法，该方法包括：在液体培养基中接种能够产生L-赖氨酸的微生物;培养该微生物，并在该微生物的对数生长期之后，加入同时含有碳源和具有生长促进作用的养分的流加培养基，同时保持培养液中的碳源浓度不超过5克/升;收集培养液中产生并积累的L-赖氨酸。
在本发明的方法中，对本发明中能够产生赖氨酸的微生物没有特殊限制，只要求该微生物能够产生L-赖氨酸。这类微生物的例子包括属于短杆菌属（Brevibacterium）或棒杆菌属（Corynebacterium）的微生物，这些微生物具有使其具有L-赖氨酸生产能力的必要性质（高丝氨酸营养缺陷型、S-（2-氨乙基）-L-半胱氨酸抗性、α-氯己内酰胺抗性等）。更具体地说，这些微生物的例子包括乳酸发酵短杆菌（Brevibacterium  lactofermentum）CCTCC  M90006、M90007;黄色短杆菌（Brevibacterium  flavum）ATCC  21475;嗜乙酰乙酸棒杆菌（Corynebacterium  acetoacidophilum）CCTCC  M90008、M90009。
对液体培养基也没有特殊限制，但可以使用习知的完全液体培养基，其中含有有机和无机养分源，例如碳源、氮源和其他微量养分。
作为本发明料液中所用的碳源，可以使用常用作发酵原料（碳源）的任何糖类、有机酸类、醇类和其他物质，只要求上述赖氨酸生产菌可吸收这些碳源。
具有生长促进作用的养分是指能促进L-赖氨酸生产菌生长的氨基酸、维生素及含有这些成分的天然物质。具体的例子包括大豆蛋白水解产物、酵母提取物和玉米浆等。
正如本领域所已知的，流加培养中的流加培养基一般只含有碳源，而连续法中的液体培养基则是完全的。在本发明方法中，流加培养基既含有碳源也含有具有生长促进作用的养分。使用这种流加培养基是本发明方法的特征之一。
在本发明的方法中，培养基的加入是在微生物完成对数生长过程中或对数生长完成后进行。应避免在对数生长完成前加料，因为这样会使细菌的初始生长受到抑制。
对于在对数生长完成过程中或对数生长完成后加入培养基来说，加料过程既可连续进行也可间歇进行。另外，如果预计发酵罐中培养基的体积将超过该发酵罐容许加入的体积，则预先从发酵罐中放出一部分培养液，或者在体积达到容许体积时放出一部分培养液从而使加料过程可以继续进行。
所以，对培养基的加入来说重要的就是，加入培养基时应使培养液中碳源的浓度始终保持不超过5克/升。这也是本发明的特征之一。为使碳源浓度保持这一恒定值，可以不时从培养液中取样直接分析碳源浓度。另外，也可测定pH或溶解氧浓度，由pH或溶解氧浓度的变化监测碳源的不足，就可以控制培养基的加入。除非碳源浓度恒定保持在5克/升或更低，否则细菌的生长或生成L-赖氨酸的速度就要下降，这种情况与本发明的目的不相吻合。
本发明的特征如上所述，其他条件如发酵条件则没有特殊限制。例如，根据本发明发酵生产L-赖氨酸的温度，可以是所用的赖氨酸生产菌能够生长的任何温度，一般在25-45℃的范围，优选30-40℃。发酵过程所规定的pH一般在5.8-8.5的范围，优选6.5-7.5。对于pH的调节来说，可以采用无机或有机的酸性或碱性物质，以及脲、碳酸钙或氨气等。
作为本发明所使用的发酵罐，只要是氨基酸发酵常用的发酵罐，可以采取任何形状。例如，可以采用装有涡轮式叶轮的完全混合罐或空气带升式发酵罐。
培养过程完成后，可以用常规方法从发酵液中收集L-赖氨酸，例如用离子交换树脂法、结晶法和其他方法，或用这些方法的组合。
给出下列实施例是为了进一步说明本发明，但不应认为是限制性的。
实施例
实施例1-5中所用的装置示于图2，其中〔8〕小型玻璃发酵罐、〔9〕pH电极、〔10〕溶解氧电极、〔11〕个人计算机、〔12〕模拟/数字转换器、〔13〕数字/模拟转换器、〔14〕送料泵，分别对应于图1所示装置中的〔1〕培养罐（发酵罐）、〔2〕pH传感器、〔3〕溶解氧浓度传感器、〔4〕计算机、〔5〕该计算机中的信号转换器（ⅰ）、〔6〕该计算机中的信号转换器（ⅱ）、〔7〕流量控制装置。在图1-3中，〔15〕对应于用来对培养基进行通气和搅拌的通气和搅拌装置，包括马达M;〔16〕对应于规定加料速度的信号;〔17〕对应于流入〔14〕送料泵或〔7〕流量控制装置的料液。
实施例1
以细胞再循环连续培养法发酵生产L-赖氨酸
在体积为500ml的摇瓶中装入30ml含水培养基，然后于115℃加热灭菌10分钟。该培养基中含有：30克/升葡萄糖、1克/升KH2PO4、0.4克/升MgSO4·7H2O、4克/升脲、20毫克/升FeSO4·7H2O、20毫克/升MnSO4·4H2O、5毫升/升大豆蛋白酸解产物、300微克/升生物素。冷却至室温后，在培养基上接种乳酸发酵短杆菌ATCC 13869，然后于30℃下培养24小时。
在预先经过灭菌的体积为1升的小型玻璃发酵罐中，装入种子培养基和270毫升含水主培养基，主培养基中含有80克/升甘蔗废糖蜜（作为糖）、1克/升KH2PO4和10毫升/升大豆蛋白酸解产物。然后把该混合物于30℃下放置。以300毫升/分的速度通入过滤灭菌空气，并开始搅拌，同时用氨气保持pH为7.5（开始主培养）。
如图2所示，小型玻璃发酵罐与16位个人计算机相连。由插在发酵罐中的pH电极和溶解氧浓度电极检测出的pH和溶解氧浓度模拟信号，经装在该个人计算机内的模拟/数字转换器输入个人计算机。由该个人计算机规定并计算出的含水流加培养基（料液）加料速度，作为模拟信号经过装在该个人计算机内的数字/模拟转换器输入送料泵。
在开始主培养的同时，在个人计算机上设定下列条件：料液初始加料速度（第一次加料）：30毫升/小时;由pH增加检测到的糖类基质消耗数据：7.7;由溶解氧浓度增加检测到的糖类基质消耗数据：20%（溶解氧浓度的一般水平为1-10%）;料液加料时间：3小时。
为了抑制细菌生长从而产生谷氨酸，在主培养开始5小时后以0.2%（重量）的浓度加入聚氧乙烯脱水山梨糖醇单棕榈酸酯。继续进行主培养5小时后，将个人计算机置于可控条件下（自动运行状态），并以30毫升/小时的预定加料速度开始首次加入料液。加到发酵罐中的料液含有180克/升甘蔗废糖蜜（作为糖）、5毫升/升大豆蛋白酸解产物、0.2%（重量）聚氧乙烯脱水山梨糖醇单棕榈酸酯。
与此同时，使培养基以料液加料速度+20（毫升/小时）的流量通过一块平展的预先经过灭菌的微孔滤膜，使培养基分成20毫升含细胞溶液和滤液两部分。将含细胞溶液送回发酵罐。用结晶法从无细胞滤液中收集L-谷氨酸。
开始首次加入料液后，计算机就开始自动操作，并在到达预定加料液时间（3小时）的时刻，按照规定的条件立即自动停止加料液。如图4中的A部分所示，随着加料中断，发酵罐中的糖浓度下降，基本变为0克/升。此刻pH和溶解氧浓度几乎同时增加。
在pH或溶解氧浓度先到达基质消耗检测值的时刻，计算机立即计算并规定第二次加料液的加料速度。计算值被输入送料泵。以计算出的速度再次加入料液3小时。此后重复这一步骤，十分准确地将发酵罐中的糖浓度控制在0-2克/升。
第二次加料以后的各次加料中料液的加料速度，根据停料期的持续时间（τ）和该停料期前最后一次加料的速度来规定，其原则如下：
＊如果τ≤10分钟，则规定新鲜料液的加料速度为1.1ν。这里ν表示在此之前最后一个加料期的加料速度。
＊如果10分钟＜τ≤30分钟，则规定新加料速度为ν。
＊如果30分钟＜τ≤1小时，则规定新加料速度为0.9ν。
＊如果1小时＜τ≤2小时，则规定新加料速度为0.8ν。
这里，ν的系数和τ有时会随培养条件而变，如培养类型、基质种类、所及细菌的性质等。原则的数目可适当减少或增加。作为参考，预备实验已经证实，在本实施例的培养过程中并没有满足τ＞2小时的机会。另外，在本实施例中每次加料液的加料时间都规定为3小时，但是如上所述，只要在加料时间内细菌活性变化不大，就没有必要保持加料时间恒定。
连续培养80小时后，得到132克L-谷氨酸。如图5所示，自动运行开始后，糖浓度可以完全自动地稳定控制在2克/升。
比较例1（先有技术）
先有技术的特征是：用NH3来控制pH，加糖（料液）量与NH3用量成比例。
在预先经过灭菌的体积为1升的小型玻璃发酵罐中，装入按与实施例1类似的方式制得的种子培养基和270毫升与实施例1相同的主培养基。将该混合物保持在30℃，以300毫升/分的速度通入过滤灭菌空气。开始搅拌，同时用氨气保持pH为7.5（开始主培养）。
如图3所示，该小型玻璃发酵罐与一台16位个人计算机相连。
主培养开始5小时后，以0.2%的浓度加入聚氧乙烯脱水山梨糖醇单棕榈酸酯。主培养再连续进行5小时后，将个人计算机置于可控状态下。
模拟信号从与氨气管相连的质量流量计经过装在个人计算机内的模拟/数字转换器而输入个人计算机。每隔1小时计算与NH3加入量成比例量的料液的加料速度，然后计算机按程序将加料速度作为模拟信号经过装在个人计算机内的数字/模拟转换器而送入送料泵。
图6A说明了实验结果，图中示出了从细胞生长期进入L-谷氨酸生产期的培养过程中，NH3加料速度与料液加料速度的比例，其中糖浓度的控制变得很差。因此13小时后比例系数有变化。甚至在这一变化后，这个比例系数也不稳定，致使发酵罐内糖浓度的控制不象图5那么好。所以剩余糖的浓度（发酵罐内的糖浓度）监测了5次。由于这种不稳定性，在培养过程中不可能既把剩余糖的浓度降至很低水平又避免糖浓度为0克/升。
连续培养80小时后，得到120克L-谷氨酸，但这一产量低于实施例1中132克的产量。
实施例1和比较例1的结果总结于表1。
表1
比较项目  比较例1  实施例1
（先有技术）  （发明）
培养过程中糖的可控浓度（克/升）  5-20  0-2
流加培养时间（小时）  80  80
监测剩余糖浓度的次数（次）  5  0
手工调节糖消耗速度与NH3加料
速度比例的次数（次）  5  0
流出体系的糖量（克）  28.5  0.1
谷氨酸产量（克）  120  132
实施例2
以补料分批培养法发酵生产L-苯丙氨酸
以与实施例1类似的方式，用乳酸发酵短杆菌FERM  BP-1071发酵生产L-苯丙氨酸，所不同的是将细胞再循环连续培养改为补料分批培养。
培养基、培养罐、培养时间过程的控制方法、以及控制料液加料速度的方法，也作如下修改。
（1）培养基
（a）种子培养基
蔗糖  20克/升
磷酸  1克/升
MgSO4400毫克/升
FeSO410毫克/升
MnSO410毫克/升
脲  3克/升
乙酸铵  2克/升
酪氨酸  500毫克/升
KOH  700毫克/升
蛋白水解产物（以总含氮量计）  2克/升
生物素  100微克/升
维生素B1100微克/升
硅酮消沫剂  20微克/升
pH  7.5
灭菌  120℃，20分钟
（b）主培养基
葡萄糖  150克/升
MgSO4280毫克/升
MnSO410毫克/升
磷酸  900毫克/升
生物素  500微克/升
维生素B120微克/升
蛋白水解产物（以总含氮量计）  8.7克/升
酪氨酸  1.0克/升
KOH  700毫克/升
硅酮消沫剂  2微克/升
pH  7.5
灭菌  120℃，20分钟
（c）流加培养基
除使用250克/升葡萄糖外与主培养基相同。
（2）培养罐和培养方法：
（a）种子培养：在体积为500毫升的培养瓶中装入30毫升种子培养基后，于30℃下进行振荡培养。
（b）主培养：在体积为1升的小型玻璃发酵罐中装入30毫升种子培养液和270毫升主培养基后，于30℃下进行通气培养（空气流量为150毫升/分）。用NH3调pH至7.5。
（3）培养时间：
（a）种子培养：48小时
（b）主培养：96小时
（c）开始加料时间：主培养开始35小时后。
（4）控制料液加料速度的方法：
按与实施例1类似的方式控制加料速度，所不同的是初始加料速度规定为10毫升/小时。
比较例2（先有技术）
用NH3调节pH，用pH作指标控制料液加料速度。即，当pH的增加超过规定值时，增加加料速度5%;如果有5小时未见pH增加，则降低加料速度10%。
实施例2和比较例2的结果总结于表2。
表2
比较项目  比较例2  实施例2
流加培养中糖的可控浓度（克/升）  10-30  0-3
培养时间（小时）  96  96
流出体系的糖量（克）  10.5  ＜0.2
苯丙氨酸产量（克）  13  15.5
实施例3
以补料分批培养法生产酵母细胞
按与实施例1类似的方式用啤酒酵母CBS  1523发酵生产酵母细胞，所不同的是将细胞再循环连续培养改为补料分批培养。
培养基、培养罐、培养方法和控制料液加料速度的方法，也作如下修改。
（a）种子培养基
葡萄糖  30克/升
KH2PO41克/升
硫酸铵  5克/升
MgSO40.5克/升
蛋白水解产物（以总含氮量计）  1克/升
酵母提取物  1克/升
pH  6.5
灭菌  120℃，15分钟
（b）主培养基
葡萄糖  50克/升
KH2PO41克/升
硫酸铵  10克/升
MgSO40.5克/升
玉米浆  2克/升
pH  6.5
灭菌  120℃，15分钟
（c）流加培养基
除使用500克/升葡萄糖和50克/升硫酸铵外与主培养基相同。
（2）培养罐和培养方法：
（a）种子培养：在体积为500毫升的培养瓶中装入30毫升种子培养基后，于30℃下进行振荡培养24小时。
（b）主培养：在体积为1升的小型玻璃发酵罐中装入30毫升种子培养液和270毫升主培养基后，于30℃下进行通气培养10小时（空气流量为150毫升/分）。用NH3调pH至6.5。另外，在主培养开始10小时后开始加料液（培养基）。
（3）控制料液加料速度的方法：
按与实施例1类似的方式控制加料速度，所不同的是初始加料速度规定为5毫升/小时。
比较例3（先有技术）
用乙醇副产物形成速度作指标控制料液加料速度（测定排气中的乙醇气体）。即，当乙醇形成速度的增加超过规定值时，增加加料速度;如果乙醇形成速度降至规定值以下，则增加加料速度。
实施例3和比较例3的结果总结于表3。
表3
比较项目  比较例3  实施例3
流加培养中糖的可控浓度（克/升）  5-20  0-3
培养时间（小时）  50  50
乙醇形成量（克）  5-10  0-5
酵母细胞干重（克）  39  48
实施例4
以补料分批培养法发酵生产L-苏氨酸
按与实施例1类似的方式用黄色短杆菌FERM  BP-2179（CCTCC  M89003）发酵生产L-苏氨酸，所不同的是将细胞再循环连续培养改为补料分批培养。
培养基、培养罐、培养方法、培养的时间过程、控制料液加料速度的方法，作如下修改。
（1）培养基：
（a）种子培养基
葡萄糖  20克/升
KH2PO41.0克/升
MgSO4400毫克/升
FeSO410毫克/升
MnSO410毫克/升
脲  3.0克/升
乙酸铵  2.0克/升
蛋白水解产物（以总含氮量计）  2克/升
生物素  100微克/升
维生素B1100微克/升
硅酮消沫剂  20微克/升
pH  7.5
灭菌  120℃，20分钟
（b）主培养基
葡萄糖  50克/升
MgSO4400毫克/升
MnSO410毫克/升
磷酸  2克/升
生物素  50微克/升
维生素B15毫克/升
蛋白水解产物（以总含氮量计）  1克/升
KOH  1.5克/升
硅酮消沫剂  2微克/升
pH  7.5
灭菌  120℃，20分钟
（c）流加培养基
使用500克/升乙酸水溶液。
（2）培养罐和培养方法：
（a）种子培养：在体积为500毫升的培养瓶中装入30毫升种子培养基后，于30℃下进行振荡培养。
（b）主培养：在体积为1升的小型玻璃发酵罐中装入30毫升种子培养液和270毫升主培养基后，于30℃下进行通气培养（空气流量为150毫升/分）。用NH3调pH至7.5。
（3）培养时间：
（a）种子培养：40小时
（b）主培养：100小时
（c）开始加料的时间：主培养开始20小时后。
（4）控制料液加料速度的方法：
按与实施例1类似的方式控制加料速度，所不同的是初始加料速度规定为1.5毫升/小时。
比较例4（先有技术）
用pH作指标控制料液加料速度。即，当pH的增加超过规定值时，用一个开关式定时器以恒定的时间和0.5毫升/分的加料速度加入料液。
实施例4和比较例4的结果总结于表4。
表4
比较项目  比较例4  实施例4
流加培养中乙酸的可控浓度（克/升）  10-30  0-3
培养时间（小时）  100  100
流出体系的乙酸量（克）  5.2  ＜0.2
L-苏氨酸产量（克）  7.8  8.8
实施例5
以补料分批培养法发酵生产鸟苷
按照与实施例1类似的方式用枯草芽孢杆菌FERM  BP-3601发酵生产鸟苷，所不同的是将细胞再循环连续培养改为补料分批培养。
培养基、培养罐、培养方法、培养时间过程、以及控制料液加料速度的方法，作如下修改：
（1）培养基
（a）种子培养基
葡萄糖  30克/升
磷酸  0.4克/升
MgSO4400毫克/升
FeSO410毫克/升
MnSO410毫克/升
RNA  5克/升
氯化铵  3克/升
酵母提取物  500毫克/升
KOH  700毫克/升
蛋白水解产物（以总含氮量计）  2克/升
硅酮消沫剂  200毫克/升
pH  6.5
灭菌  120℃，20分钟
（b）主培养基
葡萄糖  200克/升
MgSO4150毫克/升
MnSO410毫克/升
磷酸  900毫克/升
氯化铵  5克/升
氯化钾  15克/升
蛋白水解产物（以总含氮量计）  1.5克/升
RNA  1.25克/升
DL-甲硫氨酸  500毫克/升
KOH  600毫克/升
硅酮消沫剂  2微克/升
pH  5
灭菌  120℃，20分钟
（c）流加培养基
使用500克/升葡萄糖水溶液。
（2）培养罐和培养方法：
（a）种子培养：在体积为500毫升的培养瓶中装入30毫升种子培养基后，于30℃下进行振荡培养。
（b）主培养：在体积为1升的小型玻璃发酵罐中装入30毫升种子培养液和270毫升主培养基后，于30℃下进行通气培养（空气流量为200毫升/分）。用NH3调pH至6.5。
（3）培养时间：
（a）种子培养：30小时
（b）主培养：150小时
（c）开始加料时间：主培养开始50小时后。
（4）控制料液加料速度的方法：
按与实施例1类似的方式控制加料速度，所不同的是初始加料速度度规定为1毫升/小时。
比较例5（先有技术）
用NH3调节pH，用pH作指标控制料液加料速度。即，当pH的增加超过规定值时，增加加料速度5%;如果有5小时未见pH增加，则降低加料速度10%。
实施例5和比较例5的结果总结于表5。
表5
比较项目  比较例5  实施例5
流加培养中糖的可控浓度（克/升）  10-30  0-3
培养时间（小时）  150  150
流出体系的糖量（克）  15.0  ＜0.2
鸟苷产量（克）  10.4  13.0
实施例6
在三个体积各为500毫升的摇瓶中，分别装入20毫升培养基，该培养基中含有30克/升葡萄糖、10克/升氯化铵、3克/升脲、1克/升KH2PO4、100毫克/升MgSO4·7H2O、10毫克/升FeSO4·7H2O、8毫克/升MnSO4·4H2O、1克/升（以含氮量计）大豆蛋白酸解产物、0.1毫克/升盐酸硫胺素、0.3毫克/升生物素。将该培养基于115℃加热灭菌10分钟后，从肉汤斜面上取一白金环已预先培养48小时的乳酸发酵短杆菌FERM BP2294（CCTCC M90006），接种在上述培养基上，然后于31.5℃下摇瓶培养24小时。上述步骤用于种子培养。
在三个体积为1升的小型发酵罐中，每罐中分别装入300毫升培养基（pH7.0），该培养基中含有80克/升糖蜜（以糖含量计）、50克/升硫酸铵、1克/升KH2PO4、1克/升MgSO4·7H2O、100毫克/升（以含氮量计）大豆蛋白酸解产物、0.1毫克/升盐酸硫胺素、0.3毫克/升生物素。将该培养基于120℃下加热灭菌15分钟。冷却至31.5℃后，在各发酵罐中加入上述进行过摇瓶培养的培养基，加入量为每个发酵罐15毫升。在下列条件下进行培养：温度为31.5℃;空气流速为0.5vvm;搅拌转速为700转/分。
在三个发酵罐其中之一，在培养基中的糖用尽时停止培养（常规分批培养），用酸性铜茚三酮比色法定量测定培养基中积累的L-赖氨酸的浓度。在另两个发酵罐中，在培养基中的糖浓度变为5克/升或更低时开始加入流加培养基。在其中一个发酵罐中，流加培养基只含有葡萄糖（40克/升）（常规流加培养）;在本发明的发酵罐中，流加培养基含有葡萄糖（40克/升）、大豆蛋白水解产物（100毫克/升，以含氮量计）、盐酸硫胺素（0.1毫克/升）和生物素（0.3毫克/升）。在这些发酵罐中进行培养的同时，控制流加培养基加料速度以使培养液中的糖浓度保持在5克/升或更低。在每个培养物中加入100毫升流加培养基后，在培养液中的糖用尽时完成培养。定量测定培养液中积累的L-赖氨酸的浓度。
这三个发酵罐中的培养结果示于表6。
表6
发酵方法  L-赖氨酸生产率  L-赖氨酸收率
（克/升·小时）  （%）
分批培养（先有技术）  1.9  26
流加培养（先有技术）  2.1  27
本发明  2.6  30
从表6可见，L-赖氨酸的生产率和收率都很好。
实施例7
在二个体积各为500毫升的摇瓶中，分别装入20毫升培养基，该培养基中含有30克/升葡萄糖、10克/升氯化铵、3克/升脲、1克/升KH2PO4、100毫克/升MgSO4·7H2O、10毫克/升FeSO4·7H2O、8毫克/升MnSO4·4H2O、100毫克/升（以含氮量计）大豆蛋白酸解产物、0.1毫克/升盐酸硫胺素、0.3毫克/升生物素。将该培养基于115℃加热灭菌10分钟后，从肉汤斜面上取一白金环已预先培养48小时的乳酸发酵短杆菌FERM BP2297（CCTCC M90007），接种在上述培养基上，然后于31.5℃下摇瓶培养24小时。上述步骤用于种子培养。
在二个体积为1升的小型发酵罐中，每罐中分别装入300毫升培养基（pH7.0），该培养基中含有80克/升糖蜜（以糖含量计）、50克/升硫酸铵、1克/升KH2PO4、1克/升MgSO4·7H2O、100毫克/升（以含氮量计）大豆蛋白酸解产物、0.1毫克/升盐酸硫胺素、0.3毫克/升生物素。将该培养基于120℃下加热灭菌15分钟。冷却至31.5℃后，在各发酵罐中加入上述进行过摇瓶培养的培养基，加入量为每个发酵罐15毫升。在下列条件下进行培养：温度为31.5℃;空气流速为0.5vvm;搅拌转速为700转/分。
在培养液中的糖浓度变为5克/升或更低时开始加入流加培养基。该流加培养基中含有葡萄糖（40克/升）、大豆蛋白水解产物（100毫克/升，以含氮量计）、盐酸硫胺素（0.1毫克/升）和生物素（0.3毫克/升）。在其中一个发酵罐中，在连续培养的同时控制流加培养基的加料速度，以使培养液中的糖浓度恒定保持在5克/升或更低（本发明）。在另一个发酵罐中，连续培养时的加料速度要使糖浓度处在5-15克/升的范围内（对照）。在每个培养物中加入100毫升流加培养基后，在培养液中的糖用尽时完成培养。定量测定培养液中积累的L-赖氨酸的浓度。
这二个发酵罐中的培养结果示于表7。
表7
糖浓度的控制（克/升）  L-赖氨酸生产率  L-赖氨酸收率
（克/升·小时）  （%）
低于5（本发明）  3.5  41
5-15（对照）  2.9  38
实施例8
在三个体积各为500毫升的摇瓶中，分别装入20毫升培养基，该培养基中含有30克/升葡萄糖、10克/升氯化铵、3克/升脲、1克/升KH2PO4、100毫克/升MgSO4·7H2O、10毫克/升FeSO4·7H2O、8毫克/升MnSO4·4H2O、1克/升（以含氮量计）大豆蛋白酸解产物、0.1毫克/升盐酸硫胺素、0.3毫克/升生物素。将该培养基于115℃加热灭菌10分钟后，从肉汤斜面上取一白金环已预先培养48小时的嗜乙酰乙酸棒杆菌FERM  BP2295（CCTCC  M90008），接种在上述培养基上，然后于31.5℃下摇瓶培养24小时。上述步骤用于种子培养。
在三个体积为1升的小型发酵罐中，每罐中分别装入300毫升培养基（pH7.0），该培养基中含有80克/升糖蜜（以糖含量计）、50克/升硫酸铵、1克/升KH2PO4、1克/升MgSO4·7H2O、100毫克/升（以含氮量计）大豆蛋白酸解产物、0.1毫克/升盐酸硫胺素、0.3毫克/升生物素。将该培养基于120℃下加热灭菌15分钟。冷却至31.5℃后，在各发酵罐中加入上述进行过摇瓶培养的培养基（种子培养基），加入量为每个发酵罐15毫升。在下列条件下进行培养：温度为31.5℃;空气流速为0.5vvm;搅拌转速为700转/分。
在培养液中的糖浓度变为5克/升或更低时，开始加入流加培养基。本发明的流加培养基含有葡萄糖（40克/升）、大豆蛋白水解产物（100毫克/升，以含氮量计）、盐酸硫胺素（0.1毫克/升）、生物素（0.3毫克/升）。在进行培养的同时控制流加培养基的加料速度，以使培养基中的糖浓度恒定保持在5克/升或更低。在培养物中加入100毫升流加培养基后，在培养液中的糖用尽时从发酵罐中放出100毫升培养基。
在继续进行培养的同时进一步加入流加培养基。在这种情况下仍然规定培养液中的糖浓度，使其保持在5克/升或更低。加入100毫升流加培养基后，在培养液中的糖用尽时停止培养。把发酵罐中的培养基和前面放出的培养基合并，定量测定其中积累的L-赖氨酸的浓度。
结果表明，赖氨酸的生产率为2.9克/升·小时，赖氨酸的收率为28%。
实施例9
在二个体积各为500毫升的摇瓶中，分别装入20毫升培养基，该培养基中含有30克/升葡萄糖、10克/升氯化铵、3克/升脲、1克/升KH2PO4、100毫克/升MgSO4·7H2O、10毫克/升FeSO4·7H2O、8毫克/升MnSO4·4H2O、1克/升（以含氮量计）大豆蛋白酸解产物、0.1毫克/升盐酸硫胺素、0.3毫克/升生物素。将该培养基于115℃加热灭菌10分钟后，从肉汤斜面上取一白金环已预先培养48小时的嗜乙酰乙酸棒杆菌FERM BP2296（CCTCC M90009），接种在上述培养基上，然后于31.5℃下摇瓶培养24小时。上述步骤用于种子培养。
在二个体积为1升的小型发酵罐中，每罐中分别装入300毫升培养基（pH7.0），该培养基中含有80克/升糖蜜（以糖含量计）、50克/升硫酸铵、1克/升KH2PO4、1克/升MgSO4·7H2O、100毫克/升（以含氮量计）大豆蛋白酸解产物、0.1毫克/升盐酸硫胺素、0.3毫克/升生物素。将该培养基于120℃下加热灭菌15分钟。冷却至31.5℃后，在各发酵罐中加入上述进行过摇瓶培养的培养基，加入量为每个发酵罐15毫升。在下列条件下进行培养：温度为31.5℃;空气流速为0.5vvm;搅拌转速为700转/分。
在其中一个发酵罐中，在培养液中的糖浓度变为5克/升或更低时，开始加入流加培养基。该流加培养基含有葡萄糖（40克/升）、大豆蛋白水解产物（100毫克/升，以含氮量计）、盐酸硫胺素（0.1毫克/升）、生物素（0.3毫克/升）（本发明）。在继续进行培养的同时控制流加培养基的加料速度，以使培养液中的糖浓度恒定保持在5克/升或更低。加入100毫升流加培养基后，在培养液中的糖用尽时从发酵罐中放出100毫升培养液。
在继续进行培养的同时进一步加入流加培养基。在这种情况下仍然规定培养基中的糖浓度，使其保持在5克/升或更低。加入100毫升流加培养基后，在培养液中的糖用尽时停止培养。把发酵罐中的培养液和前面放出的培养液合并，定量测定其中积累的L-赖氨酸的浓度。
结果表明，赖氨酸的生产率为3.6克/升·小时，赖氨酸的收率为38%。
另一个发酵罐在培养开始25小时后开始加入供连续培养用的流加培养基。作为流加培养基使用的培养基是将初始培养基稀释4倍而得到的。以每小时0.05的稀释倍数通入约1升流加培养基以进行连续培养。达到恒态后，定量测定培养基中L-赖氨酸的浓度。
结果表明，赖氨酸的生产率为3.4克/升·小时，赖氨酸的收率为28%。
如实施例6-9所表明的，本发明能够以常规连续法的高生产率发酵生产L-赖氨酸，同时保持了常规分批法发酵所达到的高产物积累浓度和高收率。因此，利用本发明可以使工业化生产L-赖氨酸的生产率大大改善，而成本降低。
以上提到的所有出版物均在此列为参考。
以上为清楚和便于理解起见而略为详细地描述了本发明，但本领域专业人员通过阅读本公开会认识到，可以对其形式和细节做出各种改变而不偏离本发明的实质范围。

Claims (7)

1、一种以补料分批培养法、连续培养法或细胞再循环连续培养法对微生物进行通气培养的方法，该方法包括以下步骤：
(i)以确定的时间和预先确定的加料速度向培养罐中间歇加入基质料液，从而完成所述料液的首次加入；
(ii)在某个加料期前的停料期，如果传感器检测出由于培养罐内基质消耗而引起pH增加或溶解氧浓度增加，就开始第二次加料或后续的加料，加料时，以确定的时间向培养罐中加入料液，加料速度用计算机由该停料期的时间和该停料期前的加料期中料液的加料速度来计算，计算原则是，如果所述停料期的时间长，则减小加料速度，如果所述停料期的时间短，则加大加料速度；
(iii)通过自动控制使所述培养罐内所述基质的浓度保持在恒定的低水平。
2、权利要求1的方法，其中所述基质为碳源。
3、权利要求2的方法，其中所述碳源为糖。
4、一种在补料分批通气培养、连续通气培养或细胞再循环连续通气培养过程中控制基质碳源浓度的装置，该装置包括：
（ⅰ）一个培养罐，该培养罐装有分别用于检测培养罐中培养基的pH和溶解氧浓度的传感器，以及一个为接收料液而设计的培养基通气和搅拌装置;
（ⅱ）用于控制料液向培养罐加料速度的控制装置，该控制装置包括：用于接收分别由pH传感器和溶解氧浓度传感器输出的信号并输出转换信号的第一信号转换器;用于接收转换信号、用转换信号计算加料速度、并输出加料速度信号的计算装置;用于接收加料速度信号并输出加料速度转换信号的第二信号转换器;用于利用加料速度转换信号控制料液向培养罐加料速度的加料速度控制装置。
5、权利要求4的装置，其中所述第一信号转换器包括一个模拟/数字转换器，所述第二信号转换器包括一个数字/模拟转换器。
6、权利要求4的装置，其中所述加料速度控制装置包括一个加料速度控制器和一个送料泵。
7、一种发酵生产L-赖氨酸的方法，该方法包括如下步骤：
（ⅰ）在液体培养基中接收一种能够产生L-赖氨酸的微生物;
（ⅱ）培养所述微生物，并在所述微生物的对数生长期之后，加入另一批同时含有碳源和具有生长促进作用的养分的培养基，其中所述碳源在培养基内的浓度保持不超过5克/升;
（ⅲ）收集培养基中产生并积累的L-赖氨酸。
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