WO2004055179A1

WO2004055179A1 - Ｄ−アミノアシラーゼ

Info

Publication number: WO2004055179A1
Application number: PCT/JP2003/016182
Authority: WO
Inventors: Kimiyasu Isobe; Seiki Yamaguchi; Masayuki Kobayashi; Shinya Kumagai; Takami Sarashina
Original assignee: Daiichi Pure Chemicals Co., Ltd.
Priority date: 2002-12-18
Filing date: 2003-12-17
Publication date: 2004-07-01
Also published as: EP1574568A4; US20090215118A1; US20060172375A1; US20080096244A1; AU2003289400A1; JP4489598B2; US20120149071A1; JPWO2004055179A1; EP1574568A1

Abstract

基質特異性が高く、Ｎ−アセチル−Ｄ，Ｌ−アミノ酸よりＤ−アミノ酸を簡便かつ効率的さらに安価に製造することができるＤ−アミノアシラーゼの提供。　デフルビバクター（Defluvibacter）属に属する微生物が産生するＮ−アセチル−Ｄ−アミノ酸に作用し、分子量（電気泳動）約５５，０００ダルトン、等電点（変性系２次元電気泳動）５．３、Ｎ−アセチル−Ｄ−バリン、Ｎ−アセチル−Ｄ−ロイシン等に作用し、Ｎ−アセチル−Ｌ−バリン、Ｎ−アセチル−Ｌ−ロイシン等に作用しない、至適温度３７℃（pH８）、至適pH８～８．５（３７℃）、１mmol／ＬのＭｎ2+、Ｃｏ2+、Ｎｉ2+、Ｚｎ2+で活性が阻害され、５mmol／Ｌのジチオスレイトール、２−メルカプトエタノール、ｏ−フェナントリン、Ｌ−システインで活性が阻害されるＤ−アミノアシラーゼ。

Description

D—アミノアシラーゼ

技術分野

本発明は、デフルビパクター（Def luvibac t er) 属細菌より産生される新規な明

D—アミノアシラ一ゼ及び該 D—アミノアシラーゼを用いた医薬品、化成品等に利用される D—アミノ酸の製造法に関す糸る。

背景技術

近年、 D—ァミノ酸が医薬品等の原料として有効であることが明らかになり、光学的に純度の高い D—アミノ酸を安価に製造することが産業上重要な課題となつている。この方法として一般的に、化学合成したラセミ体を分割する方法が用いられ、特に副生成物や多量の廃溶媒を発生させない酵素法が現在注目されている。

従来、 D—アミノ酸の酵素法による製造方法として、 N—ァセチルー D， L一アミノ酸に D—アミノアシラーゼを作用させ、 D—ァミノ酸を特異的に得る方法が知られていて工業化されている。

D—アミノアシラーゼを産生する微生物として、シユードモナス ·エスピー (Pseudomonas sp. ) AAA 6 0 2 9株 (例えは、 Chemi cal and Pharmaceut i ca 1 Bu l l et in (米国）、 1978年、第 26巻、 p2698) 、ストレプトミセス ·オリバゼウス（St reptomyces ol ivaceus) S · 6 2株 (例えば、特開昭 5 3 - 5 9 0 9 2 号公報）、アル力リゲネス'キシロースォキシダンス ·サブスピーシーズ ·キシロースォキシダンス (Al cal igenes xyl osoxydans subsp. xyl osoxydans) A— 6株 (例えば、特開平 2— 2 3 4 6 7 7号公報)等が挙げられ、これらの微生物由来の D—アミノアシラーゼが報告されている。しかしながら、これらの D—アミノアシラーゼは N—ァセチルー D , L一アミノ酸の種類により反応特性が大きく異なり、公知の D—アミノアシラーゼを用いて広範囲の D—アミノ酸を安価に製造することは困難であった。

また、 D—アミノ酸を工業的に製造するために、遺伝子組み換え技術を用いて生産された D—アミノアシラーゼを使用する方法（例えば、特開 2 0 0 1— 1 8 5号公報及び特開 2 0 0 1 - 2 7 5 6 8 8号公報）が知られているが、本質的に反応性の低い N—ァセチルー D—アミノ酸に酵素を作用させて D—アミノ酸を製造するには多量の酵素が必要であるため、価格や生産量に制限がある。発明の開示

本発明は、従来報告されている酵素では反応性が低い N—ァセチルー D—アミノ酸に対して高い活性を有する D—アミノアシラ一ゼを産生する新規微生物を自然界より見出し、 D—アミノ酸を安価に製造する為の新規な D—アミノアシラーゼの製造法及び該新規な D—アミノアシラーゼを用いた D—ァミノ酸の製造方法を提供する。また、該新規な D—アミノアシラーゼを産生する微生物を提供することにある。

本発明者等は、上述の問題点を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、従来の酵素では反応性が低い基質に対しても良く作用する新規な D—アミノアシラーゼを産生する能力を有するデフルビパクター（Def luvibacter) 属細菌を自然界より見い出し、この知見に基づいて本発明を完成した。

すなわち、本発明は、次の酵素学的性質を有する D—アミノアシラーゼを提供するものである。

( a ) 作用： N—ァセチルー D—アミノ酸に作用し D—アミノ酸を生成する。

( b ) 分子量： S D S—ポリアクリルアミドゲル電気泳動における測定で、分子量約 5 5 , 0 0 0ダルトンを示す。

( c ) 等電点：変性系 2次元電気泳動における測定で、等電点 5 . 3を示す。 (d) 基質特異性： N—ァセチル— D—アミノ酸に作用し、特に N—ァセチルー D—パリンに良く作用し、 N—ァセチルー L一アミノ酸に作用しない。基質として、 N—ァセチルー D—バリン、 N—ァセチルー D—ロイシン、 N—ァセチル一 D—メチォニン、 N—ァセチルー D—トリプトファン、 N—ァセチルー D—フエ二ルァラニン、 N—ァセチルー D—チロシンに作用し、 N—ァセチルー L一バリン、 N—ァセチルー L一口イシン、 N—ァセチルー L一メチォニン、 N—ァセチルー L一トリプ卜ファン、 N—ァセチルー L—フエ二ルァラニン、 N—ァセチル —Lーチロシンには作用しない。

(e) 温度安定性： pH8. 5で 1日加温した場合、 4でから 30°Cまで比較的安定である。

( f ) 至適温度： pH 8で 30分反応させた場合、 37 °Cにおいて作用が至適である。

(g) pH安定性：温度 30 °Cで 1日加温した場合、 PH9付近で安定であり、 pH7 付近から PHI 0付近でも比較的安定である。

(h) 至適 pH:温度 37 °Cで反応させた場合、 pH8力ら pH8. 5付近で最も良く作用する。

(i) 金属イオンの影響： 1匪 olZLの Mn²⁺、 Co²⁺、 N i ²⁺、 Zn²⁺で活性が阻害される。

( j ) 阻害剤の影響： 5腿 ol/Lのジチオスレィトール、 2—メルカプトエタノール、 o—フエナントリン、 L—システィンで活性が阻害される。

また、本発明は、次の（a) 又は（b) のいずれかに記載のタンパク質からなる D—アミノアシラーゼ及び当該 D一アミノアシラーゼをコ一ドする遺伝子を提供するものである。

( a ) 配列番号 2に記載のァミノ酸配列からなる夕ンパク質。

(b) 配列番号 2に記載のアミノ酸配列において、 1若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入したアミノ酸配列からなり、 D—アミノアシラーゼ活性を有するタンパク質。

また本発明は、 N—ァセチルー D， L—アミノ酸又は N—ァセチルー D—アミノ酸を D—アミノ酸に効率的に変換する D—アミノアシラーゼを産生するデフルビバクタ一（Denuvibacter) 属に属する微生物を提供するものである。

また、本発明は、該微生物を培養し、その培養物から、前記の D—アミノアシラーゼを採取することを特徴とする D—アミノアシラーゼの製造方法を提供するものである。

また、本発明は、当該 D—アミノアシラーゼを N—ァセチル—D， L—アミノ酸又は N—ァセチルー D—アミノ酸に作用させることを特徴とする D—アミノ酸の製造方法を提供するものである。

本発明により、デフルビパクター（Def luvibac ter) 属に属する微生物より得られた新規な D—アミノアシラーゼは、基質特異性が高く例えば、 N—ァセチル一 D, L—バリン、 N—ァセチルー D， L一メチォニン、 N—ァセチルー D, L —トリプトファン、 N—ァセチルー D， L—ロイシン、 N—ァセチルー D， L - フエ二ルァラニン、 N—ァセチルー D, L—チロシン等より D—アミノ酸を簡便かつ効率的さらに安価に製造することができる。図面の簡単な説明

図 1は、本酵素の電気泳動法による分子量測定時の電気泳動像を示す図である。

図 2は、本酵素の温度安定性測定時の残存活性を示す図である。

図 3は、本酵素の至適温度測定時の相対活性を示す図である。

図 4は、本酵素の pH安定性測定時の残存活性を示す図である。

図 5は、本酵素の至適 pH測定時の相対活性を示す図である。

図 6は、 N—ァセチル— D， Lーバリンの分割率を示す図である。発明を実施するための最良の形態

本発明は、新規な D—アミノアシラーゼを産生する能力を有する微生物を自然界から見出し、新規な D—アミノアシラーゼの諸性質並びにその遺伝子を明らかにし、 D—アミノ酸の製造に有効であることを明らかにする事により確立された。

すなわち、本発明の新規な D—アミノアシラーゼを産生する微生物としては、上記の本発明 D—アミノアシラーゼを産生するものである限り特に限定されないが、本発明で見出した新規な D—アミノアシラーゼ産生菌の一例は、第一化学薬品株式会社，岩手工場内の土壌中より単離されたデフルビパクター

(Defluvibacter) 属に属する微生物であり、例えば、デフルビバクタ一エスピ一 A131— 3 (Defluvibacter sp. A131-3) 等が挙げられる。当該 A 131一 3株は次のような菌学的性質を有する。

(形態的所見）

1. 細胞形態：桿菌（0. 6〜0. 7X 1. 5〜2. 0 zm)

2. グラム染色：陰性

3. 胞子形成：なし

4. 運動性：あり '

5. 鞭毛：あり

6. 普通寒天培地：円形、全縁滑らか、低凸状、光沢あり、くすんだ灰色から黄淡色

(生理学的性質）

1. 力タラ一ゼ生産：陽性

2. ォキシダーゼ生産：陽性

3. 酸/ガス生産 (グルコース) ：陰性

4. 〇ZFテスト（グルコース）：陰性

5. 嫌気性生育：しない 6. 好気性成育：絶対好気性

(生物学的性状）

AP I 2 ONE同定システム（bioMerieux France) を使い、その測定方法に従い生化学的性状試験を実施した。

1. 硝酸塩還元：陰性

2. インドール生産：陰性

3. ブドウ糖酸性化：陰性

4. アルギニンジヒドラーゼ：陰性

5. ゥレアーゼ：陰性

6. エスクリン加水分解：陰性

7. ゼラチン加水分解：陰性

8. )3—ガラクトシダーゼ：陰性

9. チトクロームォキシダ一ゼ：陽性

(資化性試験）

1. ブドウ糖：陽性

2. L—ァラビノ一ス：陰性

3. D—マンノース：陽性

4. D—マンニ！ ^一ル：陰性

5. N—ァセチル一 D—ダルコサミン：陽性

6. マルトース：陰性

7. ダルコン酸カリウム：陽性

8. n—力プリン酸：陰性

9. アジピン酸：陰性

10. DL—リンゴ酸：陽性

11. クェン酸ナトリウム：陰性

12. 酢酸フヱニル：陰性 13. 2, 4—ジクロロフエノ一ル：陰性

14. フエノール：陰性

(脂肪酸組成分析）

脂肪酸組成測定には、ガスクロマトグラフィーシステム HP 6890 (Hewlett 一 Packard, CA， USA)を用い、菌種データ照合は She r 1 ock Microbial Identification System (MIDI, DE, USA) を用い、データべ一スは MIS Standard Libraries (MIDI, DE, USA) の T S B A (Version 4. 0)を用いた。

1. 要脂肪酸： 0_18:1ω 7 cの直鎖 ·モノ不飽和脂肪酸

2. ヒドロキシ脂肪酸： C_12:。30H

(ュビキノン分析）

高速液体ク口マトグラフを用いュビキノン標準試料のリテンションタイムの比較から分子種の同定を行った。

1. 主要ュビキノン系： Q_ 10

(細胞壁アミノ酸分析）

高性能薄層プレート H P T L C (Merck, NJ， USA)を用いて、細胞壁べプチドグルカンに含まれる特異的アミノ酸を対照として展開し、特異的アミノ酸の検出を行つた。

細胞壁アミノ酸： me s o—ジアミノピメリン酸

(16 S r DNA-Fu 1 1塩基配列解析）

B LAS Tを用いて DNA塩基配列データベース（GenBank)に対して相同性検索を行った。

1. デフルビバクタ一ルサチェンシス（Defluvibacter lusatiensis DSM11099) と 99. 9%の 16 S rDNA相同性

以上の生化学的および菌学的諸性質から、自然界より新たに発見した微生物はデフルビパクター（Defluvibacter) 属の細菌に分類されたが、同様の性質を持つ微生物としてはデフルビパク夕一（Deiluvibacter) 属の Defluvibacter lusatiensis DSM11099が報告されている（Def luvibacter lusatiae gen. nov. , sp. nov. , a new chlorophenoト degrading member of the — 2 subgroup of proteobacteria. Syst. Appl. Microbiol. ,1999,22,197-204.). しかし、公知のデフルビパクター（Def luvibacter) 属の細菌が D—アミノアシラーゼを産生することの記載はなく、デフルビバクタ一（Def luvibacter) 属の微生物が D— アミノアシラーゼを産生する能力を持つことは、本発明で初めて明らかにされた。なお、本発明で発見した菌株はデフルビバクタ一 'エスピー A 131— 3 (Defluvibacter sp. A131-3) と命名し、平成 14年 9月 26日、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば巿東 1丁目 1番地 1中央第 6 (郵便番号 305 - 8566) ) に FERM BP— 08563として寄託した。

そして、本発明で見出した新規な D—アミノアシラーゼを得るためには、デフルビバクタ一属の細菌、例えばデフルビパクター 'エスピ一 A 1 3 1— 3 (Defluvibacter sp. A131-3) 株を親株として人工的に変異処理及び突然変異、又は組み換え DNA操作などの公知の一般的な酵素の生産性及び性質を向上させる方法で得られた遺伝子組み換え体や、その変異株や改良株を用いることも可能である。

本発明の新規な D—アミノアシラーゼは、当該微生物を適当な培地に接種し培養することにより得ることができる。

ここで使用される培地は、通常の微生物の培地に用いられ、当該微生物が生育し新規な D—アミノアシラ一ゼが産生されるものであれば、特に限定されないが、該培地中には、資化し得る窒素源、炭素源、無機塩類を適当量含有せしめておくことが好ましい。

窒素源、炭素源、無機塩類は特に制限されない。

例えば窒素源として、肉エキス、酵母エキス、ペプトン等が挙げられる。炭素源として、グルコース、フルクトース、ショ糖、グリセリン、酢酸等が挙げられる。無機塩類として、リン酸水素ニナトリウム、リン酸二水素カリウム、 '硫酸マグネシゥム、硝酸アンモニゥム、硫酸鉄、硫酸亜鉛等が挙げられる。

また、本発明の D—アミノアシラーゼの生成に誘導物質等は特に必要ないが、 D—アミノアシラーゼ高産生化のために、誘導化物質として、 N—ァセチルー D 一アミノ酸或いは N—ァセチル— D， L—アミノ酸等のァシル化ァミノ酸誘導体を培地中に 0 . 0 1〜0 . 5重量％ (以下単に％と記載する）程度添加することが望ましく、特に、 N _ァセチルー D—バリン、 N—ァセチルー D—ロイシン等が誘導物質として有効である。

培地の pHは、菌が生育可能な範囲であればいずれの pH範囲でも良いが、特に 7 〜9程度が好ましく、培養温度は 1 5〜4 0 °C、より好ましくは 2 5〜3 7 °Cである。培養時間は、 2 0〜4 8時間液体培地を用い振とう培養することが好ましいが、用いる培地によって時間は変動する。また、同様の培地に寒天を加えた固体培地でも菌の培養を行うことが可能である。

このような方法によつて得られた微生物菌体中に、 D—アミノアシラ一ゼが産生される。

培養物からの目的物質である D—アミノアシラ一ゼの採取及び精製は、一般の酵素の採取及び精製手段に準じて行うことができる。すなわち、培養物を遠心又はろ過などによって菌体を分離し、機械的磨砕又は超音波破砕等により菌体を破砕し、その破砕液から通常の分離手段、例えば、疎水クロマトグラフィー、ィォン交換クロマトグラフィー、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー等により採取、精製する方法が挙げられる。

このようにして得られた、本発明 D—アミノアシラーゼの酵素学的性質及びァミノ酸配列は次のとおりである。また、本発明 D—アミノアシラーゼ遺伝子の塩基配列も以下に示す。

( 1 ) 作用： N—ァセチルー D—アミノ酸に作用し D—アミノ酸を生成する。

( 2 ) 分子量：定法に則り、 S D S—ポリアクリルアミドゲル電気泳動（第一化学薬品（株）製、 PAGミニ「第一」 10Z20) を行い、タンパク質分子量マ一力一 (第一化学薬品（株）製、タンパク質分子量マーカー「第一」 · ΙΙΙ) の移動度より分子量を求めた結果、約 55, 000ダルトンを示す。

(3) 等電点： 2次元電気泳動法に則り、変性系 2次元電気泳動（第一化学薬品製、 I PGチューブゲル「第一」 4一 10及び、 PAGラージ「第一」 2D— 10/20) を行い、 2D—タンパク質等電点マーカー（第一化学薬品（株）製、 2D—タンパク質等電点マーカ一「第一」）の移動度より等電点を求めた結果、 p I値 5. 3を示す。

(4) 基質特異性：以下の N—ァセチル—D—アミノ酸及び N—ァセチルー L一ァミノ酸を基質として、 D—ァミノ酸ォキシダーゼ或いは L—ァミノ酸ォキシダ —ゼを組み合わせる方法で本発明のアシラーゼの基質特異性を確認した。以下の N—ァセチルー D—アミノ酸に作用し、 N—ァセチル _L一アミノ酸には作用しない。 N—ァセチルー D—アミノ酸として N—ァセチルー D—バリンに最も良く作用し、 N—ァセチルー D_ロイシン、 N—ァセチルー D—メチォニン、 N—ァセチルー D—トリプトファン、 N—ァセチル— D—フエ二ルァラニン、 N—ァセチル— D—チロシンにも作用する。 N—ァセチルー Lーバリン、 N—ァセチルー L一口イシン、 N—ァセチルー L一メチォニン、 N—ァセチルー L一トリプトフアン、 N—ァセチルー L一フエ二ルァラニン、 N—ァセチル—Lーチロシンには作用しない。

尚、 L一アミノ酸の測定は、下記に示す活性測定法で、 D—アミノ酸ォキシダ —ゼの代わりに L一アミノ酸のォキシダ一ゼを使用する。

(5) 温度安定性： PH8.5で 4°C、 25°C、 30°C、 40°C、 50°Cで 1日加温し、下記の活性測定法に則り残存する酵素活性を測定した結果、 4°Cから 30°Cまで比較的安定である。

(6) 至適温度： pH 8で 4° (：、 25 、 30°C、 37°C、 40°Cで下記の活性測定法に則り酵素活性を測定した結果、 37 °Cにおいて作用が至適である。 ( 7 ) pH安定性：温度 30 °Cで pH4から 12で 1日間加温後、下記の活性測定法に則り残存する酵素活性を測定した結果、 PH9付近で安定であり、 pH7付近から pHl 0付近までは比較的安定である。

( 8 ) 至適 pH：温度 37 °Cで pH 6力、ら 12で下記の活性測定法に則り酵素活性を測定した結果、 PH8力 ^ら pH8. 5付近で最も良く作用する。

(9) 金属イオンの影響：酵素液に金属イオンとして、塩ィ匕カルシウム · 2水和物、塩化鉄（III) · 6水和物、塩ィヒナトリウム、塩ィ匕コノルト（II) · 6水和物、塩化カリウム、塩化ニッケル · 6水和物、塩化マグネシウム · 6水和物、硫酸銅 (II) · 5水和物、塩化マンガン（II) · 4水和物、塩化亜鉛、モリブデン酸ナトリゥムを、 lmmol/Lになるように添加して、 N—ァセチル一 D， Lーバリンと反応させ、生成された D—バリン量を HPLCで測定した結果、 1匪 olZLの Mn²⁺、 Co²⁺、 N i²⁺、、 Zn²⁺で活性が阻害される。

(10) 阻害剤の影響：酵素液に阻害剤として、エチレンジァミン四酢酸、 2—メルカプトエタノール、 N—ェチルマレイミド、 o—フエナントリン、 L一システイン、ョ一ドアセトアミド、ジチオスレィトールを、 5画 ol/Lになるように添加して、 N—ァセチル— D, L—バリンと反応させ、生成した D—バリン量を HPLCで測定した結果、 5讓 olZLのジチオスレィトール、 2—メルカプトェタノ一ル、 o—フエナントリン、 L一システィンで活性が阻害される。

本発明 D—アミノアシラーゼ遺伝子の塩基配列及び D—アミノアシラーゼタンパク質アミノ酸配列は、以下の公知の方法により決定した。

精製された酵素の N末及び内部アミノ酸配列から考えられる DNAをすベて包含したミックスプライマーより、デフルビバクタ一 'エスピー A131— 3 (Defluvibacter sp. A131-3) より抽出精製した DNAを用い、 PCR法の反応結果から、得られた増幅産物をクローニングした結果、本発明 D—アミノアシラ —ゼ遺伝子の塩基配列は配列番号 1に記載の塩基配列と決定した。また、その塩基配列から、本発明 D—アミノアシラーゼ夕ンパク質は配列番号 2に記載のアミノ酸配列を有することが判明した。

本発明の D—アミノアシラーゼには、（a) 配列番号 2に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質だけでなく、（ b ) 配列番号 2に記載のァミノ酸配列において、 1もしくは数個のアミノ酸配列が置換、欠失、挿入したアミノ酸配列からなり、 D—アミノアシラーゼ活性を有するタンパク質が含まれる。ここで、上記の 1もしくは数個のアミノ酸配列が置換、欠失、挿入されたアミノ酸配列には、配列番号 2のアミノ酸配列と 80%以上、好ましくは 90%以上、さらに好ましくは 95 %以上の相同性を有するアミノ酸配列が含まれる。

本発明の D—アミノアシラーゼ遺伝子としては、前記（a) 又は（b) のタンパク質をコードする遺伝子であれば制限されないが、（ c ) 配列番号 1に記載の塩基配列からなる DNAだけでなく、（d) 配列番号 1に記載の塩基配列に相補的な塩基配列を有する DN Aとストリンジェントな条件下でハイプリダイズし、かつ D—アミノアシラーゼ活性を有する夕ンパク質をコードする D N Aが好ましい。ここで、ストリンジェン卜な条件としては、例えば 0. 1 %SDSを含む 0. 2 X S S C中 50°Cの条件、 0. 1 % SD Sを含む 1 X S S C中 60。Cの条件を挙げることができる。また、上記のストリンジェントな条件下でハイプリダイズする DNAには、配列番号 1に記載の塩基配列と 80%以上、好ましくは 90%以上、さらに好ましくは 95%以上の相同性を有する DN Aが含まれる。ァミノ酸ォキシダ一ゼを用いたアシラーゼ活性の測定方法： 10 niLの 0. 1 molZLリン酸緩衝液 pH8に 4一 AminoantipyrineO. 6 lmg (ナカライテスク

(株) 製、 Code:01907- 52) 、 N-Ethy 1-N- (2- ydroxy-3-sul f opropyl) -3- methlani 1 ine, sodium, salt, dihydrate 3. 22mg (Doj indo Laboratories製、 Code:0C13) 、 PEROXIDASE 30 uni t (SIGMA社製、 Code :P— 6782) 、 D— AMINO ACID OXIDASE 1 unit (SIGMA社製、 Code :A— 9128) 又は L一 AMINO ACID OXIDASE limit (SIGMA社製、 Code: A— 5147) 、を溶解して発色試薬とした。この発色試薬 500 Lと 10 Oinmol/Lの N—ァセチル— D， Lーバリン 100 L、測定酵素サンプル 100 L、 0. lmol/Lリン酸緩衝液 (pH8) 30 O Lを含む 1 mLの反応液を 37 °Cで 30分間加温後、分光光度計を用い 555皿の吸光度値を測定し、 D—バリンを用いて作成した検量線から酵素活性を求めた。

尚、 111は1分間に1 ^molの D—バリンの生成を触媒する酵素量とした。 HP L Cを用いたアシラーゼの測定方法： I n e r t s i l ODS— 2 (GL サイエンス (株) 製）カラムを用い、 0. 015% 1一ペンタンスルホン酸ナトリウム（pH2. 5) ：ァセトニトリル =80 ： 20緩衝液を用い、流速 0. 5mL/分、検出 230nm、カラム温度 30°Cで分析した。酵素活性は検出されたァセチル体と遊離体の面積比から、無添加を 100として分割率を求め、相対活性値で表す。

得られた新規な D—アミノアシラーゼは、 N—ァセチル—D—アミノ酸に特異的に作用し、 N—ァセチルー L一アミノ酸には作用しないので、 N—ァセチルー D—アミノ酸から D—アミノ酸を製造するために利用できるが、 N—ァセチル— D, L—アミノ酸から D—アミ'ノ酸を分割分離するためにも使用される。すなわち、 D， L一アミノ酸をァセチル化して N—ァセチルー D, L—アミノ酸とし、次に D—アミノアシラ一ゼを加えて N—ァセチル— D—アミノ酸を加水分解し D —アミノ酸を生成する事により、 D—アミノ酸と L一アミノ酸を分離することが可能である。なお、 N—ァセチル— D—アミノ酸のみを用いれば、 D—アミノ酸だけが得られる。

D—アミノアシラーゼを N—ァセチルー D， L—アミノ酸又は N—ァセチル— D—アミノ酸に作用させる場合、 D—アミノアシラ一ゼ添加量は、通常 1〜 1000 U/mL基質溶液の範囲で、好ましくは 50〜 500 U/mL基質溶液である。また、 N—ァセチルー D， L一アミノ酸又は N—ァセチル— D—アミノ酸量は 1〜40重量％ (以下％と記載する）、さらには 5〜25%水溶液とすることが好ましい。

反応温度は 10~50°C、さらには 15〜45 °Cであるのが好ましく、反応は pH6. 5〜10. 5、さらには 7. 5〜10であるのが好ましい。また、反応時間は 0. 2〜10日間、さらには 1〜 5日間であるのが好ましい。

反応液からの D—アミノ酸の分離回収は、例えば、濃縮、等電点、沈殿、ィォン交換樹脂処理、膜分離等の公知の方法で行なわれる。実施例

以下に実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に制限されるものではない。

実施例 1 デフルビパクターエスピー A131— 3株の単離

第一化学薬品株式会社岩手工場内の土壌を採取し、次法により菌体を採取した。

培地として、硝酸アンモニゥム 0. 2%、リン酸二水素カリウム 0. 2 %、リン酸水素ニナトリウム 0. 1%、硫酸マグネシウム · 7水塩 0. 05%、誘導物質 N—ァセチル— D, L—バリン 0. 2%を含む 118. 5の培地に少量の土壌を添加し 30°Cで試験管を用いて振盪培養した。次に同様の培地で寒天 2%を含む同一培地組成の平板培地上に培養液をプレートアウト（接種）し、 30°Cで培養後生育した微生物を分離した。

分離した微生物を再度上記と同一組成の培地を用いて試験管で振盪培養し、以下の 2つの方法で従来とは異なる D—アミノアシラ一ゼを産生する能力を有する微生物を選抜した。

(1)D—アミノアシラ一ゼ活性測定法： 5mLの 0. ImolZLリン酸緩衝液 pH 8に 4—AminoantipyrineO. 6 lmg (ナカライテスク（株）製、 Code:01907— 52) 、 N-Ethyl-N-(2-hydroxy-3-sulf opropyl)-3-methlani 1 ine, sodium, salt, dihydrate3. 22mg (Dojindo Laboratories製、 Code:0C13) 、 PEROXIDASE 30 unit (SIGMA社製、 Code :P— 6782) 、 D— AMINO ACID OXIDASE 1 unit (SIGMA 社製、 Code:A— 9128) 、を溶解して発色試薬とした。この発色試薬 100 L と、 100腿 ol/Lの N—ァセチルー D， L—パリン 100 Lと上記培養液を遠心分離し再懸濁を行った菌体液 100 At Lをマイクロプレー卜のセル中で混和し 37 °Cで 1時間反応後、マイクロプレートリ一ダーを用いて 555 nmの吸光度を測定した。発色が確認された菌株について D—アミノアシラーゼ活性を持つ菌株として選んだ。

(2)HPLC分析による産生菌の選抜：次に上記の発色法で N—ァセチルー D, L一パリンに対して強い活性を示すことが確認された菌株について、下記の HP LCによる分析を行った。

カラム： SUMICHIRA1 OA— 5000 (5肌 4. 6mm X 150mm) 、移動相： 2画 olZ L硫酸銅：ァセトニトリル =90 : 10、温度： 40° (：、流速： 0. 8mL/min, 検出： 23 Onmの条件で、培養後遠心分離した菌体と 100腿 olZLの N—ァセチルー D, L—パリンの反応液 30 /xLを用いて、 N—ァセチル _D, L—アミノ酸の分解と D—アミノ酸あるいは L—アミノ酸の生成を、 N—ァセチル一 D— パリン， N—ァセチルー L—パリンと D—パリン， Lーバリンが溶出される時間のピ一ク面積より分析した。その結果、発色法で選抜した菌株はいずれも N—ァセチル—D—バリンが速やかに減少し、 N—ァセチルー D—バリンの減少量に相当する D—バリンの増加が認められた。

次に、各種の N—ァセチルー D， L一アミノ酸との反応を比較して、 D—アミノ酸に特異性が高く、さらに既存の D—アミノアシラーゼとは異なり D—バリンに対する反応性が優れている酵素を産生する微生物を新規な D—アミノアシラーゼ産生菌として選抜した。

このような方法を経て得られた菌株は、前記の菌学的性質を有するものであつた。この菌株をデフルビパクターエスピー A131— 3株と命名した。実施例 2 D—アミノアシラーゼの製造

デフルビパクターエスピー A 131— 3株を、実施例 1で使用した培地に粉末酵母エキス D— 3 0. 1 % (和光純薬工業（株）製、 Code:390— 00531) 、ポリぺプロン 0. 1 % (和光純薬工業 (株) 製、 Code :394 - 00115) 、塩ィ匕ナトリウム 0. 05 %を添加した pH8の培地 20 Lで、ジャ一フアーメン夕一を用い 30° (：、 150 r/min, 27時間通気攪拌培養した。培養終了時の濁度（ABS 66 Onm) は 1. 52T、 pH7. 75であった。

培養後、冷却遠心分離機（日立ェ機（株）製）を用い、 4000 rZminで 60分間遠心分離を行い集菌した。集菌した菌体を、 20腿 ol/Lトリスー塩酸

(pH8) 緩衝液で洗浄した後、再度遠心分離機により菌体を集めて 112 gの菌体を得た。得られた菌体は、一 80°Cで凍結保存した。

凍結保存菌体を融解し、菌体量の 3倍の 2 OmmolZLトリスー塩酸（pH8) 緩衝液 340mLで懸濁後、低温室内（4°C) で攪拌しながら投入式超音波破砕機を用い、 120分間超音波破砕を行った。破枠後、高速冷却遠心機（日立ェ機

(株）製）で 8000 rZmin、 4°C、 60分間遠心分離後、上清液 365mLを得た。これを粗酵素液とした。

なお、本菌株は培養時に N—ァセチルー D, L—バリンを添加しなくとも D— アミノアシラ一ゼを産生したが、 N—ァセチル— D， L—バリンを添加することにより、その酵素産生量を 2倍以上に増加することが可能であった。

実施例 3 D—アミノアシラーゼの精製

粗酵素液を透析チューブに詰め、 0. ImolZL塩ィ匕ナトリウム含有 20匪 ol ZLトリスー塩酸 (pH8) 緩衝液中に投入し、低温室内（4°C) で攪拌を行いながら、数回緩衝液を交換し一昼夜透析を行った。透析終了後、高速冷却遠心機

(日立ェ機（株）製）で 8000 r/min、 4°C、 60分間遠心分離後上清液 342mLを得た。

この、透析終了液の 1/3量について以下の精製を行った。透析の終了した 114mLを、予め 0. lmol/L塩ィ匕ナトリウム含有 2 OmmolZLトリスー塩酸 (pH8) 緩衝液で平衡化した TO Y〇 PEARL Sup e r Q— 650 Mカラム（東ソ一（株）製）（4. 4 cm* X 37. 5 cm) に供して酵素を吸着させた。次に 0. ImolZL塩ィ匕ナトリウム含有 20讓 olZLトリスー塩酸（pH8) 緩衝液 150 OmLでカラムを洗浄し、続いて 0. 1 mo 1ZL塩ィ匕ナトリウム含有

20腿 ol/Lトリス—塩酸 (pH8) 緩衝液 570 OmLと 0. 3molZL塩ィ匕ナトリウム含有 20應 olZLトリス—塩酸 (pH8) 緩衝液 570 OmLを用いて直線濃度勾配法で酵素を溶出した。カラム流下後は 25 mLずつ分取して、各フラクションのタンパク量（280匪の吸光度）と D—アミノアシラーゼ活性 (下記の酵素活性測定法を参照）を測定し、活性画分を回収した。

各フラクションの D—アミノアシラ一ゼ酵素活性は、 10mLの 0. Imol/L リン酸緩衝液 pH8に 4— AminoantipyrineO. 61 mg (ナカライテスク（株）製、 Code:01907 - 52) 、 N-Ethyl-N- (2-hydroxy-3-sul f opropyl) -3- met lani 1 ine, sodium, sal t, dihydraie 3. 22 rag (Doj indo Laboratories製、 Code:0C13) 、 PEROXIDASES Ounit (SIGMA社製、 Code:P-6782) 、 D-AMINO ACID OXIDASE 1 unit (SIGMA社製、 Code:A-9128) 、を溶解して発色試薬とした。この発色試薬 500 と 100腿 olZLの N—ァセチルー D， Lーバリン 100 L、測定酵素サンプル 100 L、 0. lmol/Lリン酸緩衝液 (pH8)

300 を含む 1 mLの反応液を 37 °Cで 30分間加温後、分光光度計を用い 555 nmの吸光度値を測定した。

TOYOPEARL Sup e rQ_650Mクロマトグラフィーで、 D—ァミノァシラーゼ活性が認められたフラクション画分（ 968 mL)をビバフロー 50 (ザルトリウス（株）製)分画分子量 10000の限外ろ過膜を用いて濃縮し、さらに、 5 mmo 1 / Lリン酸緩衝液 (pH7.2)で透析した。

この透析した酵素液 160 mLを予め 5画 01/Lリン酸緩衝液 (pH7.2)で平衡化した B I O- GEL HT (B I 0- RAD社製）ハイドロキシアパタイトカラム（2. 2οπι X 2 Ocm) に吸着させた。

次に、 5IMO1ZLリン酸緩衝液 (pH7.2) 35 OmLでカラムを洗浄し、続いて 5IMO1ZLリン酸緩衝液（pH7.2) 75 OmLと 200腿 olZLリン酸緩衝液 (pH 7.2) 75 OmLを用いて直線濃度勾配法で酵素を溶出した。カラム流下後は 25 mLずつ分取して、各フラクションのタンパク量と D—アミノアシラーゼ活性を測定し、活性画分を回収した。

B I O-GEL HT (B I O- RAD社製）によるハイド口キシァパタイトク口マトグラフィ一で得られた活性画分 280 mLを、ビバフロー 50 (ザルトリウス（株）製）分画分子量 10000の限外ろ過膜を用いて、 20mLに濃縮した。この濃縮液を、予め 0. 3mol/L塩ィ匕ナトリウム含有 20讓 ol/Lトリスー塩酸（pH8) 緩衝液で平衡化をした S u p e r d e x 200 p. gカラム (Pharmacia Biotech社製） (2. 2 ηφ X 66 cm)に供し、同緩衝液を 1 · 5mL Z分の流速で流した。力ラム流下後は 10 inLずつ分取して、各フラクションのタンパク量と D—アミノアシラ一ゼ活性を測定した。

D—アミノアシラ一ゼ活性が確認された画分の少量を S D S _ポリアクリルァミドゲル電気泳動 (SDS— PAGE)分析に供し、不純蛋白質が混在しないことを確認した。

SDS—ポリアクリルアミドゲル電気泳動法は、 PAGミニ「第一」 10Z 20 (第一化学薬品（株）製）を用い、第一化学薬品（株）の SDS—ポリアクリルアミドゲル電気泳動操作法に則って行った。 S D S—サンプル処理液 (第一化学薬品（株）製） 50 ^ Lと精製フラクション 50 Lを同量混合し、 5分間煮沸処理を行った。

PAGミニ「第一」 10/20ゲルに、煮沸処理を行ったサンプルを 20 L 供し、 40mAの定電流で電気泳動を行い、ぺ一ジブルー 83染色液 (第一化学薬品（株）製)で染色後、目的の D—アミノアシラーゼと推定される蛋白質のバンドを確認した。

比活性 (蛋白質量に対する酵素活性の比率)及び電気泳動で純度が高いことを確認した。この活性画分を集め、ビバフロー 50 (ザルトリウス（株）製)分画分子量 10000の限外ろ過 J5奠、さらにビバポア 10 Z 20 (ザルトリウス（株）製）分画分子量 7500の限外ろ過膜を用いて濃縮操作を行い、精製酵素として 28 niL得た。

本精製法による酵素精製収率は表 1のとおりであった。

表 1

工程名液直総タンパク量総活性量比活性活性回収率

(mL) (KU) (U/mg) (%)

破砕遠心上清 114 4605 2707 588 100

SuperQ - 650M 968 47 1334 28300 49

B 10- GEL HT 280 27 1125 41600 42

Superdex200 346 25 1003 40100 37

濃縮液 28 23 953 41400 35 実施例 4 精製酵素の酵素学的性質

実施例 3で得られたデフルビバクタ一エスピー八131—3株由来の0— アミノアシラーゼ（以下、本酵素と記載することもある）の酵素学的性質を、以下の方法で測定した。

1. 分子量の測定は、前述の SDS—ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（第一化学薬品（株）製、 PAGミニ「第一」 10Z20) で測定を行った。タンパク質分子量マーカ一（第一化学薬品（株）製、タンパク質分子量マーカ一「第一」 · III) フォスフオリラーゼ b (97， 400ダルトン）、ゥシ血清アルブミン (66, 267ダルトン）、アルドラーゼ（42, 400ダルトン）、カルボニックアンヒドラ一ゼ（30, 000ダルトン）、 1、リプシンインヒビ夕一

(20, 100ダルトン）、リゾチーム（14， 400ダルトン）の移動度より求めた分子量は約 55， 000ダルトンであった（図 1 ) 。

2. ゲルろ過による分子量の測定は、 Sup e r d e x 200 p gHR 10/ 30 (Pharmacia Biotech社製）（ 1 cm* X 30 cm)により、 0. 3mol/L塩化ナトリウム含有 20腿 ol/Lトリスー塩酸 (pH8) 緩衝液で流速 lmL/min、検出 280 で分析を行った。分子量マーカーには LMW GEL F I LTRAT I ON CAL I BRAT I ON K I T (PHARMACIA BIOTECH社製） B ov i n e S e r um A l bumi n(67， 000ダルトン）、 Ov a l ubumi n ( 4 3 , 0 0 0ダリレトン）、 C h ym o t r y p s i n o g e n A (25, 000ダルトン）、 R i bonu c l e a s eA (13， 700ダルトン）を用い、分子量と溶出時間との関係を求めた。本酵素を同じ条件で分析し算出した分子量は約 56, 000ダルトンであった。

3. タンパク質等電点は、 2次元電気泳動法に則り、変性系 2次元電気泳動（第一化学薬品（株）製、 I PGチューブゲル「第一」 4— 10及び PAGラージ

「第一」 2D— 10Z20) を用いて測定した。 2D—タンパク質等電点マーカ ― (第一化学薬品（株）製、 2D—タンパク質等電点マーカー「第一」） p I値 5. 1、 5. 2、 5. 3、 5. 4、 5. 7、 6. 0、 6. 2、 6. 4、 6. 5、 6. 7、 6. 8、 7. 0、 7. 1の移動度を基準として求めた本酵素の p I値は 5. 3であった。

4. 基質特異性は、前述した D—及び L一アミノ酸ォキシダ一ゼ発色試薬を用いた活性測定法に則り検討した。すなわち、初めに 200 し、 150 mol /L、 100 μηιοΙ/L, 50 Mmol L, 20 rnl L, 10； mol/Lの各 D 一アミノ酸及び L一アミノ酸を基質として用いて反応し、得られた 555nmの吸光度値と基質濃度の関係から酵素活性の検量線を作成した。

次に同様の発色試薬を用い基質として、 10 Ommol/Lの N—ァセチルー D， Lーバリン、 N—ァセチルー D, L—メチォニン、 N—ァセチルー D， L一トリブトファン、 N—ァセチル— D, L—ロイシン、 N—ァセチル— D， L—フエ二ルァラニン、 N—ァセチルー D， L—チロシン、 N—ァセチル— D, L一グル夕ミン酸を用いて、以下の方法で各ァセチルアミノ酸に対する反応を調べた。すなわち、 10mLの 0. lmol/Lリン酸緩衝液 pH8に 4一 Aminoantipyrine 0. 6 lmg (ナカライテスク（株）製、 Code:01907— 52) 、 N-Ethy 1-N- (2- hydroxy-3-sul f opropyl)-3-methlani 1 ine, sodium, salt, dihydrate 3. 22mg (Dojindo Laboratories製、 Code:0C13) 、 PEROXIDASES Ounit (SIGMA社製、 Code:P-6782) 、 D— AMINO ACID OXIDASE 1 unit (SIGMA社製、 Code:A - 9128) 又は L— AMINO ACID OXIDASE 1 unit (SIGMA社製、 Code:A-5147) 、を溶解して発色試薬とし、この発色試薬 500 Lと 100匪 ol/Lの各ァセチルアミノ酸基質溶液 100 L、一定濃度の本酵素液 100 /L、 0. lniol/Lリン酸緩衝液 (pH8) 300 Lを含む 1 niLの反応液を 37 で 30分間加温後、分光光度計を用い 555 nmの吸光度値を測定し、各 D—アミノ酸及び L—アミノ酸を用いて作成した検量線から酵素活性量を求めた。

尚、 111は1分間に1 mol/Lの各 D—アミノ酸及び L—アミノ酸の生成を触媒する酵素量とし、上記で求めた D—アミノ酸及び L一アミノ酸の濃度との関係式から算出した。

基質特異性は、 N—ァセチルー D—メチォニンを 1 0 0にした場合と、 N—ァセチル _D—バリンを 1 00にした場合の相対活性で表 2に示した。

表 2

基質相対活性（％対 Met) 相対活性（％対 Val)

N-Ac-D-Val 762 100

N-Ac-D-Met 100 13

N-Ac-D-Trp 1.1 0. 2

N-Ac-D-Leu 555 73

N-Ac-D-Phe 37 4. 8

N-Ac-D-Tyr 8.4 1. 1

N-Ac-D-Glu 0 0

N-Ac-L-Val 0 0

N-Ac-L-Met 0 0

N-Ac-L-Trp 0 0

N-Ac-L-Leu 0 0

N-Ac-L-P e 0 0

N-Ac-L-Tyr 0 0

N-Ac-L-Glu 0 0

N_ァセチルー D—アミノ酸または N—ァセチルー L一アミノ酸を用いて反応を確認した結果、 N—ァセチルー D—アミノ酸のみに作用し、 N—ァセチル— L —アミノ酸にはまったく作用しなかった。 N—ァセチルー D—アミノ酸の中では N—ァセチルー D—バリンに最も良く作用し、 N—ァセチルー D—ロイシン、 N 一ァセチルー D—メチォニン、 N—ァセチルー D—トリプトファン、 N—ァセチルー D—フエ二ルァラニン、 N—ァセチルー D—チロシンにも作用した。しかし、 N—ァセチルー D—グルタミン酸には作用しなかった。 N—ァセチルー L一アミノ酸として、 N—ァセチル一 L一バリン、 N—ァセチルー L—ロイシン、 N —ァセチルー L一メチォニン、 N—ァセチルー L—トリブトファン、 N—ァセチル一 L—フエ二ルァラニン、 N—ァセチル— L _チロシン及び N -ァセチルー L 一グルタミン酸の N—ァセチルー L一アミノ酸には作用しなかった。

5. 温度安定性は、本酵素液を PH8. 5で 4°C、 25°C、 30°C、 40°C,

50°Cで 1日加温し、前述の D—アミノ酸ォキシダーゼを用いる D—アミノアシラーゼ活性測定法に則り加温処理後の残存活性を測定して確認した。本酵素の温度安定性を図 2に示す。本酵素は、 4 から 30 °Cまで残存活性が 80 %以上であり、安定であった。

6. 至適温度は、本酵素液を pH8で 4°C、 25°C、 30°C, 37°C、 40°Cで前述の D—アミノ酸ォキシダーゼを用いる D—アミノアシラーゼ活性測定法に則り活性測定を行って確認した。本酵素の至適温度を図 3に示す。本酵素は、 37°C において作用が至適であった。

7. pH安定性は、本酵素を PH4から 12で温度 30°C1日加温後、前述の D—ァミノ酸ォキシダーゼを用いる D—アミノアシラ一ゼ活性測定法に則り pH処理後の残存活性を測定して確認した。本酵素の PH安定性を図 4に示す。結果本酵素は、 pH 9付近で最も安定であり、 pH 7付近から pH 10付近でも残存活性が 50 %以上であり比較的安定であった。なお、 pH6あるいは pHl 1でも残存活性は 0%にはならなかった。

8. 至適 pHは、本酵素を温度 37°Cで pH6から 12で前述の D_アミノ酸ォキシダ一ゼを用いる D—アミノアシラーゼ活性測定法に則り酵素活性を測定して確認した。本酵素の至適 pHを図 5に示す。本酵素は、 pH8力 ^ら pH8. 5付近で最も良く作用した。

9. 金属イオンの影響は、 0. 5mol/L N—ァセチルー D—バリンと本酵素液（500 U) を含む反応液に、終濃度 limnol/Lになるように、塩化カルシゥム ' 27_K和物、塩化鉄（III) · 6水和物、塩化ナトリウム、塩ィ匕コノ^レト（II) · 67 和物、塩化カリウム、塩ィ匕ニッケル · 6水和物、塩化マグネシウム， 6水和物、硫酸銅（II) · 57Κ和物、塩化マンガン（II) · 4水和物、塩化亜鉛、モリブデン酸ナトリウムを添加して、 40°Cで 1日加温し、生成された D—バリン量を以下に記述する H P L C法により測定し、検出された N—ァセチルー D—バリンと D—バリンの面積比から各金属を添加した場合の分割率を求め、金属イオン無添加における分割率を 100として相対値を求めた。

その結果、表 3に示すように本酵素は 1醒 olZLの Mn²⁺、 C o' N i ²⁺、 Z n^Mで相対活性が 50 %未満となり活性が阻害された。

HP LC測定法は、 I n e r t s i 1 OD S— 2 (GLサイエンス（株）製）カラムを用い、 0. 01 5 % 1—ペンタンスルホン酸ナトリウム（pH2.5) ：ァセトニトリル =80 ： 20緩衝液を用い、流速 0. 5mLZ分、検出 230nm、力ラム温度 30°(で11?し( 分析した。

表 3

金属イオン 1.0mmol/L 相対活性（％)

無添加 100

塩化カルシウム 99

塩化鉄（ΠΙ) 88

塩化ナトリウム 99

塩化コバルト（II) 27

塩化力リウム 92

塩化ニッケル 20

塩化マグネシウム 90

硫酸銅（II) 90

塩化マンガン (II) 48

塩化亜鉛 31

モリブデン酸ナトリウム 105 10. 阻害剤の影響は、 0. 5molZL N—ァセチルー D—パリンと本酵素液 (500U) を含む反応液に、終濃度 5mmol/Lになるようにエチレンジァミン四酢酸、 2—メルカプトエタノール、 N—ェチルマレイミド、 0—フエナントリン、 L—システィン、ョードアセト 7ミド、ジチオスレィトールを添加して 40°Cで 1日加温し、生成された D—バリン量を前述した HPLC法により測定し、検出された N—ァセチルー D—パリンと D—パリンの面積比から各阻害剤を添加した場合の分割率を求め、阻害剤無添加における分割率を 100として相対値を求めた。

その結果、表 4に示すように本酵素は 5. 0匪 olZLのジチオスレイト一ル、 2—メルカプトェタノ一ルで相対活性が 50 %未満、 0 _フエナントリンで相対活性が 60 %未満、 L -システィンで相対活性が 80 %未満となり、活性が阻害された。

表 4

阻害剤 5匪 ol/L 相対活性 (％)

エチレンジァミン四酢酸 112

2—メルカプトエタノール 47

N—ェチルマレイミド 100

o—フエナントリン 53

L—システィン 78

ョ一ドアセ卜アミド 107

ジチオスレィ 1 ^一ル 38 実施例 5 新規 D—アミノアシラーゼのクローニング

本菌株のデフルビパクターエスピー A131— 3 (Defluvibacter sp. A131-3) より精製を行い、単離された D—アミノアシラーゼを元に、公知の方法により、その N末及び内部アミノ酸配列を分析し、 N末； KSFDLVIRNGRVVDP、内部； AQAQGLXITXEA、 TALIPAQIVERの配列を得た。このアミノ酸から考えられる DN A配列をすベて包含した N末及び内部配列ミックスプライマー ATHMGIAAYGGI MGIGTIGT (配列番号 3) 、及び0^ 1 00 1¥?616(16 0八1 (配列番号 4) の 2種類の調製を行った。なお、 Iは、イノシンを表している。

次に、デフルビパクターエスピー A 1 3 1 — 3培養菌体より、公知の方法を用いゲノム DN Aの抽出を行った。

精製酵素から得られたミックスプライマーと、培養菌体より得られたゲノム DNAを用い Hot Star Taq(QIAGEN製)で P C R反応を行った。 PCRには、供給業者から提供される緩衛液中に以下のものを含む反応液（1 0 1)を使用した： dNTP 2 0 0 M、各プライマー 5 Opmol、デフルビバクタ一エスピー A 1 3 1一 3のゲノム DNA 1 0 0ng、および DNAポリメラ一ゼ 1ュニット。反応は、 9 5°Cでの変性 1 5分間の後 1 ) 9 5 °Cでの変性段階 3 0秒間； 2) 40 °Cでのァニーリング段階 3 0秒間； 3 ) 7 2°Cでの合成段階 9 0秒間を、 30サイクル行った。ァガロース電気泳動で確認したところ約 1. 3kbの DNA 増幅があった。得られた P CR産物を; p CR 2. 1 topo (インビトロジェン社製）を用いてクロ一ニングを行い、部分塩基配列 (部分遺伝子)の決定を行った。得られた部分遺伝子を元に、プライマー ATACCGCTACATCGGCMTCGCAT (配列番号 5) 、及び TGCCACTGGTTGAAGCCATCGCCA (配列番号 6 ) の 2種類を設計合成し Inverse P CR法を用いて Hot Star Taq(QIAGEN製）で P C R反応を行った。 Inverse PCR法に用いる铸型は、デフルビパクターエスピー A1 3 1— 3 から抽出した 5 gのゲノムを制限酵素 Sal I (NEB)を用い 3 7 °Cにて一晩消化 · 精製したものを、 T4 Ligase(NEB)で環状化したものを用いた。反応は、 9 5°C での変性 1 5分間の後 1) 94 °Cでの変性段階 30秒間； 2) 6 0。(：でのァニ一リング段階 30秒間； 3) 7 2 °Cでの合成段階 4分間を、 30サイクル行った。得られた PCR産物を pCR 2. 1 topoを用いてクロ一ニングを行い、全塩基配列 (全遺伝子)の決定を行つた。

この塩基配列の結果から、 N末の外側及び C末のプライマー ATGGCCAAAAGCTTCG ATCTC (配列番号 7) 、及び TCATCGCGGCGTGCTCCGGATG (配列番号 8 ) の作製を行い、 Hot Star 丁 9 68 製）及び1(00 plus (TOYUBO製）のポリメラーゼを用いて PCR反応を行った。 Hot Star Taqの反応は、 95°Cでの変性 15分間の後 1) 94 °Cでの変性段階 30秒間； 2) 58 °Cでのァニ一リング段階 30秒間； 3 ) 72 °Cでの合成段階 2分間を、 30サイクル行い、 KOD plusの反応は、 95 での変性 2分間の後 1) 94 °Cでの変性段階 30秒間； 2) 58 °Cでのァニーリング段階 30秒間； 3) 68°Cでの合成段階 2分間を 30サイクル行った。得られた PCR産物を pCR2. 1 topoを用いてクロ一ニングを行い、クローンの塩基配列を比較し、本発明 D—アミノアシラーゼ遺伝子の塩基配列 (配列番号 1 )並びに本発明 D—アミノアシラーゼのァミノ酸配列 (配列番号 2 )を確定した。

実施例 6 D—パリンの製造

15 %N—ァセチルー D， L—パリン水溶液を基質として用い、デフルビパクターエスピー A 131— 3株由来の D—アミノアシラ一ゼが基質水溶液 1 niL 当たり 200Uの酵素量を添加し、 40°Cで 3日間反応を行い、生成された N— ァセチルー D， L—パリンから D—バリンの分割生成率を、実施例 1 (2)記載の HPLC測定法で測定した。結果を図 6に示す。

本酵素を基質水溶液に 20 OU/mL含有する系で、反応 1日目で N—ァセチル一 D, L—バリン中の N—ァセチルー D—パリンの 90%以上が D—バリンに変換されており、その分割率は 90%以上であった。

また、 N—ァセチル— Lーバリンは全く分解されず、本酵素が D—アミノ酸の製造に関して実用性を有することが確認された。

Claims

請求の範囲

1. 次の酵素学的性質を有する D—アミノアシラーゼ。

(a) 作用： N—ァセチル— D—アミノ酸に作用し D—アミノ酸を生成する。

(b) 分子量： SDS—ポリアクリルアミドゲル電気泳動における測定で、分子量約 55， 000ダルトンを示す。

( c ) 等電点：変性系 2次元電気泳動における測定で、等電点 5. 3を示す。

(d) 基質特異性： N—ァセチルー D—アミノ酸に作用し、特に N—ァセチルー D—パリンに良く作用し、 N—ァセチルー L一アミノ酸に作用しない。基質として、 N—ァセチル— D—バリン、 N—ァセチル— D—口イシン、 N—ァセチルー D—メチォニン、 N—ァセチル—D—トリブトファン、 N—ァセチル—D—フエ二ルァラニン、 N—ァセチル— D—チロシンに作用し、 N—ァセチルー L—バリン、 N—ァセチルー L—ロイシン、 N—ァセチルー L—メチォニン、 N—ァセチル— L—トリブトファン、 N—ァセチルー L—フエ二ルァラニン、 N—ァセチル - L—チロシンには作用しない。

(e) 温度安定性： pH8. 5で 1日加温した場合、 4°Cから 30°Cまで比較的安定である。

(g) PH安定性：温度 30°Cで 1日加温した場合、 pH9付近で安定であり、 pH7 付近から PHI 0付近でも比較的安定である。

(h) 至適 pH：温度 37°Cで反応させた場合、 pH8から pH8.5付近で最も良く作用する。

( i ) 金属イオンの影響：

の^[11"、 Co²⁺、 N i ²⁺、、 Zn²⁺で活性が阻害される。

(j) 阻害剤の影響： 5mmolZLのジチオスレィトール、 2—メルカプトエタノール、 o—フエナントリン、 L一システィンで活性が阻害される。

2. 次の（a) 又は（b) のいずれかに記載のタンパク質からなる D—ァミノアシラーゼ。

( a ) 配列番号 2に記載のァミノ酸配列からなるタンパク質。

3. 次の（a) 又は（b) のいずれかに記載のタンパク質からなる D—ァミノアシラーゼをコ一ドする遺伝子。

4. 次の（c) 又は（d) の DNAからなるものである請求項 3記載の遺伝子。

(c) 配列番号 1に記載の塩基配列からなる DNA。

( d ) 配列番号 1に記載の塩基配列に相補的な塩基配列を有する D N Aとストリンジェントな条件下でハイブリダィズし、かつ D—アミノアシラ一ゼ活性を有するタンパク質をコードする DNA。

5. N—ァセチル— D， L—アミノ酸又は N—ァセチルー D—アミノ酸から D 一アミノ酸を生成する D—アミノアシラーゼを産生するデフルビバク夕一

(Defluvibacter) 属に属する微生物。

6. デフルビバク夕一 'エスピー（Defluvibacter sp.) A 131 _ 3と命名され、 FERM BP_ 08563として寄託された請求項 5記載の微生物。

7. 請求項 1又は 2記載の D—アミノアシラーゼを産生するものである請求項 5又は 6記載の微生物。

8 . 請求項 5〜 7のいずれか 1項記載の微生物を培養し、その培養物から D— アミノアシラーゼを採取することを特徴とする請求項 1又は 2記載の D—ァミノアシラーゼの製造方法。

9 . 請求項 1又は 2記載の D—アミノアシラーゼを N—ァセチルー D, L—ァミノ酸又は N—ァセチルー D—アミノ酸に作用させることを特徴とする D—アミノ酸の製造方法。