KR20100049546A - 헤모필루스 인플루엔자에 비 형을 위한 배양 배지 - Google Patents

헤모필루스 인플루엔자에 비 형을 위한 배양 배지 Download PDF

Info

Publication number
KR20100049546A
KR20100049546A KR1020107001212A KR20107001212A KR20100049546A KR 20100049546 A KR20100049546 A KR 20100049546A KR 1020107001212 A KR1020107001212 A KR 1020107001212A KR 20107001212 A KR20107001212 A KR 20107001212A KR 20100049546 A KR20100049546 A KR 20100049546A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
medium
peptone
protoporphyrin
prp
protein nitrogen
Prior art date
Application number
KR1020107001212A
Other languages
English (en)
Other versions
KR101545641B1 (ko
Inventor
기슬렌 마이트레-윌모테
바슈라 로크비
데니스 스펙
Original Assignee
사노피 파스퇴르
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=39027590&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=KR20100049546(A) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by 사노피 파스퇴르 filed Critical 사노피 파스퇴르
Publication of KR20100049546A publication Critical patent/KR20100049546A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR101545641B1 publication Critical patent/KR101545641B1/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/02—Bacterial antigens
    • A61K39/102—Pasteurellales, e.g. Actinobacillus, Pasteurella; Haemophilus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/16—Antivirals for RNA viruses for influenza or rhinoviruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/02—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group
    • C12P7/04—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group acyclic
    • C12P7/18—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group acyclic polyhydric
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P9/00—Preparation of organic compounds containing a metal or atom other than H, N, C, O, S or halogen
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/90—Serum-free medium, which may still contain naturally-sourced components
    • C12N2500/92—Medium free of human- or animal-derived components
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/21—Haemophilus

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Abstract

본 발명의 주제는 헤모필루스 인플루엔자에 b 형을 위한 배양 배지로서, 상기 배지의 단백질 질소 공급원은 하나 이상의 식물 펩톤을 포함하고 헴 공급원은 프로토포르피린 IX로 이루어진다. 본 발명은 또한 헤모필루스 인플루엔자에 b 형 수막염에 대한 백신의 제조에 사용되는 폴리리보실 리비톨 포스페이트(PRP)의 제조 방법에 관한 것이다.

Description

헤모필루스 인플루엔자에 비 형을 위한 배양 배지{CULTURE MEDIUM FOR HAEMOPHILUS INFLUENZAE TYPE B}
본 발명의 주제는 헤모필루스 인플루엔자에 b 형을 위한 배양 배지로서, 상기 배지의 단백질 질소 공급원은 하나 이상의 식물 펩톤을 포함하고 헴 공급원은 프로토포르피린 IX로 이루어진다. 본 발명은 또한 헤모필루스 인플루엔자에 b 형 수막염에 대한 백신의 제조에 사용되는 폴리리보실 리비톨 포스페이트(PRP)의 제조 방법에 관한 것이다.
캡슐은 헤모필루스 인플루엔자에 b 형 균주의 주요 독성 인자이다. 상기는 리보실 리비톨 포스페이트의 반복 단위들의 연속물로 이루어지는 폴리사카라이드이다. 폴리리보실 리비톨 포스페이트(PRP) 또는 캡슐 폴리사카라이드 b 형이란 표현은 헤모필루스 인플루엔자에 b 형 캡슐을 나타내기 위해 호환적으로 사용된다.
헤모필루스 인플루엔자에 b 형 집단들은 종종 이종(heterogeneous)이며; 캡슐화된 세균이 캡슐화되지 않은 세균과 공존한다. 상기 캡슐화되지 않은 세균은 자발적으로 발생하는 유전적 돌연변이의 결과로서 캡슐을 발현하는 능력을 상실하였다. 문헌[Hoiseth et al., Infectious and Immunity(1985), 49:389-395]에 따르면, 상기 캡슐 발현의 상실은 각 세균 세대에서 0.1 내지 0.3%의 빈도로 발생한다. 유전자 수준에서, cap 좌는 이들 세균의 표면에서 캡슐의 발현과 관련이 있는 것으로 나타났다(Kroll, J.S., et al., J. Bacteriol. (1988) 170:859-864). 상기 캡슐화된 세균은 18 Kb 유전자의 2 개 이상의 사본을 함유하는 cap 좌를 갖는다. 상기 캡슐화되지 않은 세균은 더 이상 18 Kb 유전자를 갖지 않거나 혹은 단지 하나의 상기 유전자의 사본만을 갖는다. 상기 캡슐화된 세균을 동정하기 위해서, 항-PRP 항체 존재 하의 세균 슬라이드 상에서의 응집반응 시험이 대개 사용되거나 또는 상기 cap 좌를 특성화하는 분자 생물학 기법이 사용된다.
PRP, 또는 담체 단백질에 공유 결합된 PRP를 기본으로 하는 백신을 사용하여 헤모필루스 인플루엔자 b 형 감염을 예방한다. 이러한 백신을 제조하기 위해서는 PRP가 추출되고 이어서 정제되는 다량의 배양 배지에서 다량의 세균을 생산하는 것이 필요하다. 그럼에도 불구하고, 상기 캡슐화된 헤모필루스 인플루엔자 b 형 세균이 캡슐화되지 않은 형태로 쉽게 되돌아가는 성질은 PRP의 생산에 장애가 될 수 있다.
PRP의 산업적인 생산을 위해서, 효모 추출물, 글루코스, 헤민, β-NAD 및 무기 염이 보충된 단백질 질소의 주공급원을 대표하는 동물 펩톤을 기본으로 하는 배양 배지가 일반적으로 사용된다. 예로서, US 4,459,286에 개시된 생산 배지가 언급된다.
BSE에 관련된 위험들 때문에, 보다 양호한 생물학적 안전성을 제공하면서, 동물 기원의 제품 및 보다 특히 인간 또는 소 기원의 제품을 대체할 것이 요구된다.
카티(Carty) 등(Dev. Indust. Microbiol. 26:763-767(1985))은 PRP의 생산을 위해서 동물 펩톤을 대두 펩톤으로 대체할 수 있음을 입증하였다. 상기 배지(MP 배지)의 리터당 조성은 하기와 같다: 대두 펩톤: 10 g; 효모 추출물: 10 ㎖; NaCl: 5 g; K2HPO4: 2.5 g; Na2HPO4: 3.3 g; 덱스트로스: 5 g; 헤민 클로라이드: 10 ㎎; NAD: 10 ㎎.
타카기(Takagi) 등(J. Chem. Tech. and Biotech 81:182-188(2006))은 상기 카티 배지(MP 배지)의 조성을 최적화하고자 하였다. 이들은 상기 배양 배지 중의 PRP 농도가, 상기 헤민 및 β-NAD 농도를 증가시킬 때 70%까지 증가하여 0.25 g/ℓ에 도달할 수 있음을 입증하였다. 따라서 PRP의 생산을 증가시키기 위해서는 헤모필루스 인플루엔자에 b 형의 생육에 필요한 보조인자(헤민 및 β-NAD) 농도를 증가시키는 것이 필요한 것으로 보인다.
따라서, 특히 배양 부피가 클 때(≥100 리터) 최상의 생물학적 안전성 조건을 적용하면서 PRP를 생산하는 방법을 개선할 필요성이 여전히 존재한다.
따라서, 본 발명의 주제는, 단백질 질소 공급원이 비 동물 기원의 것이고 하나 이상의 식물 펩톤을 포함하며, 헴 공급원이 프로토포르피린 IX로 이루어짐을 특징으로 하는, 헤모필루스 인플루엔자에 b 형을 위한 신규의 배양 배지이다. 상기와 같은 배지는 PRP의 산업적인 생산에 특히 적합하다. 상기는 동물 기원의 펩톤이 식물 펩톤으로 대체되었기 때문에 보다 큰 생물학적 안전성을 제공한다. 또한 상기는, 산업적으로 활용할 수 있는 배양 상등액 중의 PRP 수준(수준 ≥ 0.2 g/ℓ)을 획득하기 위해서 헤민보다 10 내지 20 배 적은 프로토포르피린 IX를 필요로 하므로, 생산 비용에 수반되는 경우들에 부합한다.
"헤모필루스 인플루엔자에 b 혈청형의 배양을 위한 배지"란 표현은 헤모필루스 인플루엔자에 b 혈청형의 생육을 촉진하고
-단백질 질소의 공급원,
-헴 공급원,
-β-NAD 공급원,
-탄수화물 공급원,
-비타민 및 생육 인자의 공급원, 및
-무기 염
을 포함하는 배지를 의미하는 것으로 이해된다.
"단백질 질소 공급원"이란 표현은 아미노산, 펩타이드, 폴리펩타이드, 펩톤 및/또는 단백질의 양이 상기 조성물의 건조 중량의 50% 이상을 나타내는 제제를 의미하는 것으로 이해된다.
"비 동물 기원의 단백질 질소 공급원"이란 표현은 비 동물 기원을 갖는 단백질 질소 공급원을 의미하는 것으로 이해된다. 그 결과, 상기 제제는 동물 세포, 동물 조직, 또는 동물 기관 또는 신체로부터 생산되지 않는다. 상기는 일반적으로 식물, 조류, 세균, 효모 또는 진균으로부터 생산된다.
본 발명에 따른 배양 배지는 첫째로 액체 배지를 나타내지만, 또한 고체 형태일 수도 있다. 상기 고체 형태는 아가와 같은 젤화 물질(통상적으로 10 내지 30 g/ℓ의 농도 범위로 사용된다)을 액체 배지에 첨가함으로써 수득된다.
본 발명에 따른 헴의 공급원을 하기 화학식의 프로토포르피린 IX로 나타낸다:
Figure pct00001
상기 식에서,
R은 H 또는 염, 바람직하게는 알칼리 금속염, 특히 나트륨 염을 나타낸다.
본 발명의 경우에, 프로토포르피린 IX는 철과 착화되지 않는다. 지금까지, PRP의 제조에 권장되는 모든 배지들은 헴 공급원으로서 철(헴의 경우)과 착화된 프로토포르피린 IX, 또는 FeCl(헤민의 경우)과 착화된 프로토포르피린 IX, 또는 최종적으로 그리고 보다 드물게, FeOH(헤마틴의 경우)와 착화된 프로토포르피린 IX를 함유하였다. 상기 헤모필루스 인플루엔자에 b 혈청형 균주가 프로토포르피린 IX를 철과 착화된 형태로 전환되게 하는 페로킬라타제를 갖는다 하더라도(Loeb et al., J. Bacteriology(1995), 177;3613-3615), PRP를 산업적으로 활용할 수 있는 농도로 생산하기 위해 식물 펩톤을 기본으로 하는 배양 배지 중에 헴 공급원으로서 착화되지 않은 프로토포르피린 IX를 사용할 수 있음은 결코 입증되지 않았다. 일반적으로 PRP의 산업적인 생산을 보장하기 위해서는 배양 상등액 중에 0.1 내지 0.2 g/ℓ 이상의 PRP 비율이 필요한 것으로 간주된다.
놀랍게도, 헴 공급원으로서 프로토포르피린 IX 및 단백질 질소 공급원으로서 식물 펩톤을 사용함으로써, 상기 필요한 프로토포르피린 IX 농도가 상기 헴 공급원이 철과 착화된 프로토포르피린 IX인 경우 사용되는 것보다 10 내지 100 배 더 작다는 것이 관찰되었다. 실시예 1에 나타낸 바와 같이, PRP의 최대 생산(배양 상등액 중의 농도는 ∼0.4 g/ℓ이다)을 얻기 위해 100 내지 200 ㎍/ℓ의 프로토포르피린 IX 농도가 충분한 반면, 헤민 농도는 같은 PRP 생산을 위해서 10 내지 20 배 더 많이 필요하다. 더욱이, 10 ㎍/ℓ 정도로 낮은 프로토포르피린 IX의 농도에서조차 PRP의 현저한 생산이 관찰된 반면, 헤민의 경우는 대단치 않았다. 50 ㎍/ℓ의 프로토포르피린 IX에서, PRP의 생산은 100 ㎍/ℓ(이미 산업적인 규모로 사용될 수 있는 비율이다)에 도달하거나 이를 초과하는 반면, 상기 배양 배지가 동일한 농도의 헤민을 포함하는 경우에는 10 ㎍/ℓ 또는 훨씬 더 적은 정도였다(도 1 및 2 참조).
따라서, 본 발명의 주제는 프로토포르피린 IX 농도가 0.01 ㎎/ℓ 이상, 0.02 ㎎/ℓ 이상, 0.03 ㎎/ℓ 이상, 0.04 ㎎/ℓ 이상 또는 바람직하게는 0.05 ㎎/ℓ 이상인 본 발명에 따른 배양 배지이다.
일반적으로, 상기 배양 배지 중의 프로토포르피린 IX 농도는 0.1 ㎎/ℓ 내지 5 ㎎/ℓ, 바람직하게는 0.1 ㎎/ℓ 내지 2 ㎎/ℓ이다. 이러한 농도 범위에서, 상기 배양 상등액에서 PRP의 최적 생산을 제공하는 원료 물질의 최적 사용이 존재한다.
본 발명의 주제에 적합한 프로토포르피린 IX는 동물 기원의 것일 수 있으며 동물(소, 돼지 등) 조직으로부터 생산될 수 있다. 상기 제제의 순도는 일반적으로 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 보다 바람직하게는 95% 이상(중량/중량)이다. 상기 오염물질이 잔량의 아미노산, 펩타이드 및/또는 단백질을 함유할 수도 있지만, 상기 프로토포르피린 IX 제제를, 상기 임의로 존재하는 잔량의 아미노산, 펩타이드 및/또는 단백질이 일반적으로 상기 제제의 건조 중량의 5% 미만, 일반적으로 1% 미만을 나타내기 때문에, 본 발명의 목적을 위한 단백질 질소 공급원인 것으로 간주해서는 안 된다.
바람직하게는, 보다 큰 생물학적 안전성을 보장하기 위해서, 동물 기원의 어떠한 오염물질도 없는 프로토포르피린 IX를 사용한다. 상기와 같은 프로토포르피린 IX를 제조하기 위해서, 반응식 2에 개시된 단계들을 사용하는, 2007년 3월 30일자로 출원된 등록번호 제 07/02334 호의 프랑스 특허 출원에 개시된 바와 같은 제조 방법을 사용할 수 있다.
또 다른 바람직한 실시태양에서, 본 발명에 따른 배양 배지는 동물 기원의 어떠한 오염물질도 없는 프로토포르피린 IX를 포함한다.
본 발명의 주제에 따라, 상기 단백질 질소의 주공급원을 하나 이상의 식물 펩톤으로 나타낸다. 상기 펩톤은 일반적으로는 가수분해물의 형태이다. 상기를 최고의 단백질 함량을 갖는 식물 부분으로부터 일반적으로 추출된 단백질의 효소 또는 화학 처리에 의해 수득한다. 바람직하게는, 유전자 변형되지 않은 식물을 사용한다. 화학적 경로가 사용되는 경우, 상기 방법들 중 하나는 상기 단백질 추출물을 뜨거운 상태의 염산으로 가압 하에서 처리하는 것이다. 이어서 가수분해물을 수산화 나트륨으로 중화시키고 이어서 고형 부산물을 제거한다. 효소적 경로가 사용되는 경우, 전통적인 방법들 중 하나는 상기 단백질 추출물을 파파인으로 처리하는 것이다.
식물 펩톤은 주로 아미노산, 및 MW가 ≤1 KD인 작은 펩타이드의 혼합물을 함유하는 제제이다. MW가 > 1 KD인 펩타이드는 일반적으로 상기 혼합물의 40% 미만을 차지한다. 또한, 경우에 따라, 상기 작은 크기의 펩타이드를 농축시키거나 선택하기 위해서 한외여과된 가수분해물을 사용할 수도 있다. 또한 PM ≤ 1 KD, 또는 ≤ 500 달톤, 또는 심지어 ≤ 350 달톤을 갖는 가수분해물 분획을 선택하기 위해서 상기 한외여과된 가수분해물에 추가의 크로마토그래피 단계를 가할 수도 있다. 따라서 상기 펩타이드의 40% 초과, 상기 펩타이드의 50% 초과, 또는 심지어 상기 펩타이드의 60% 초과가 PM ≤ 1 KD, 또는 ≤ 500 달톤, 또는 심지어 ≤ 350 달톤을 갖는 식물 펩톤 제제가 수득된다. 본 발명의 주제에 적합한 식물 펩톤은 특히 오가노테크니(Organotechnie)에 의해 제공된 바와 같은 감자(식물 펩톤 E1 또는 식물 펩톤 ET1), 오가노테크니 또는 케리(Kerry)에 의해 제공된 바와 같은 대두, 목화(퀘스트(Quest)에 의해 제공된 Hy 목화), 벼(케리에 의해 제공된 Hy 벼), 솔라비아(Solabia)에 의해 제공된 잠두, 오가노테크니(밀 펩톤 E1) 또는 케리(HypepTM 4602, HypepTM 4601)에 의해 제공된 바와 같은 밀, 또는 완두콩, 특히 케리(HY 완두 7404)에 의해 제공된 완두콩의 효소 가수분해물 또는 옥소이드(VG100) 또는 "산 가수분해된 식물성 펩톤"이란 명칭으로 언급되는, 옥소이드(Oxoid)에 의해 제공되는 완두콩의 산 가수분해물로부터의 것이다. 바람직하게는, 본 발명의 주제에 적합한 식물 펩톤은 밀 펩톤이며, 보다 바람직하게는 상기 식물 펩톤은 완두콩 펩톤이다.
상기 식물 펩톤을 사용하기 위한 농도를 한정하기 위해서, 상기 펩톤의 단백질 질소 함량을 고려한다. 상기 함량을 켈달법(Lynch JM et al., J AOAC Int.(1999) 82(6):1389-98)을 사용하여 계산한다. 대개, 본 발명의 주제에 따른 식물 펩톤의 단백질 질소 함량은 펩톤 그램당 8% 내지 15%이다(중량/중량). 상기 범위에서, 본 발명에 따른 배양 배지 중의 식물 펩톤 농도가 0.08 내지 2.25 g/ℓ 범위의 단백질 질소 농도, 및 바람직하게는 0.4 내지 1.5 g/ℓ 범위의 농도 범위에 상응하는 경우 양호한 결과가 획득된다.
따라서, 본 발명의 주제는 총 식물 펩톤 농도가 0.08 g/ℓ 내지 2.25 g/ℓ 범위의 단백질 질소 농도와 동등한 배지이다.
β-NAD(또한 인자 V 또는 β-니코틴아미드 아데닌 다이뉴클레오타이드라 칭함)의 공급원으로서 β-NAD 자체의 정제된 제제 또는 니코틴아미드 리보사이드(NR), β-니코틴아미드 아데닌 모노뉴클레오타이드(NMN), 및 β-니코틴아미드 아데닌 다이뉴클레오타이드 포스페이트(NADP) 중에서 선택된 β-NAD의 유도체를 함유하는 정제된 제제를 사용한다. 상기 제제의 순도는 일반적으로 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 더욱 바람직하게는 95% 이상이다. 본 발명의 경우에, 동물 기원의 단백질 오염물질이 없는 β-NAD의 공급원을 사용하는 것이 바람직하다. 상기 정제된 제제를 1 μM 이상의 농도로 사용한다. 예로서, β-NAD를 2 내지 50 ㎎/배양 배지 ℓ 범위의 농도로 사용한다.
탄수화물의 공급원으로서, 헤모필루스 인플루엔자에 b 형에 의해 대사되는 임의의 당, 예를 들어 프럭토스, 리보스, 자일로스, 퓨코스, 글리세롤 또는 보다 특히 글루코스를 사용할 수 있다. 일반적으로, 상기 탄수화물 공급원은 비 동물 기원을 가지며 상기 배양 배지 중의 탄수화물 농도는 10 mM 이상이다. 글루코스를 사용하는 경우, 상기 배양 배지 중의 그의 농도는 일반적으로 2 내지 20 g/ℓ이다.
본 발명에 따른 배양 배지는 또한 비타민 및 생육 인자의 공급원을 포함한다. 이 때문에 사카로마이세스 스페시즈의 배양물로부터 유래된 양조 효모의 자기분해 산물의 용해성 분획으로부터 수득된 효모 추출물을 사용한다. 다수의 아미노산 및 비타민류, 예를 들어 비타민 B5, B1, B2, B6, PP, H 및 B12, 미량 원소 및 올리고 뉴클레오타이드 유도체들이 그의 조성물에서 발견된다. 퀘스트, 디프코 또는 솔라비아에 의해 생산되는 상업적으로 입수할 수 있는 효모의 자기 분해 추출물들이 본 발명의 주제에 적합하다.
본 발명에 따른 배지 중의 효모 추출물의 농도는 대개 0.2 g/ℓ 내지 15 g/ℓ 범위의 농도 범위, 및 바람직하게는 0.2 g/ℓ 내지 10 g/ℓ 범위의 농도 범위, 및 훨씬 더 유리하게는 0.2 내지 5 g/ℓ 범위의 농도 범위 이내이다. 세균에 의한 RPR 생산은 효모 추출물의 농도가 0.2 내지 5 g/ℓ 범위의 농도 범위에 있을 때 보다 양호한 것으로 관찰되었다.
상기 효모 추출물은 또한 비 동물 기원의 단백질 질소의 추가적인 공급원을 나타낸다. 상기 효모 추출물 중의 단백질 질소의 함량은 실제로 일반적으로는 9 내지 11%(중량/중량)이다. 배양 도중 독성 폐기물의 축적에 원인이 될 수도 있는 질소성 과대사상태를 피하기 위해서, 식물 펩톤(들) 및 효모 추출물의 농도를 일반적으로는 상기 배지 중의 총 단백질 질소 함량이 2.5 g/ℓ를 초과하지 않도록 조절한다. 바람직하게는 상기 식물 펩톤(들) 및 효모 추출물의 농도를 본 발명에 따른 배지 중의 총 단백질 질소 함량이 0.5 내지 2.5 g/ℓ이도록 조절한다.
본 발명에 따른 배양 배지는 또한 무기 염을 포함한다. 상기 사용되는 무기 염은 일반적으로 염 용액의 형태이며, 이중 하나 이상은 세균의 접종 전에 배지의 초기 pH가 바람직하게는 6.5 내지 7.5, 가장 바람직하게는 7 내지 7.5가 되기에 충분한 완충력을 발휘한다. 일반적으로, 1가 양이온, 예를 들어 Na+ 및/또는 K+, 2가 양이온, 예를 들어 Ca++ 및/또는 Mg++, HPO4 --, H2PO4 - 및/또는 PO4 --- 형태의 포스페이트 음이온, 및 몰 농도가 10-2 mM 내지 100 mM 범위의 농도 범위 내로 변할 수 있는 염 용액 형태의 SO4 -- 및 Cl- 음이온의 혼합물을 사용한다.
선행 단락에 개시된 성분들 이외에, 본 발명에 따른 배양 배지가 그의 조성물 중에 하나 이상의 다른 무기 및/또는 유기 성분(단 이들은 PRP의 생산을 부정적으로 방해하지 않아야 한다)을 함유할 수도 있음은 물론이다. 매우 바람직하게는, 비 동물 공급원으로부터 기원하는 성분들을 도입한다. 따라서, 본 발명에 따라 상기 배지에 화학 합성에 의해 또는 미생물 발효에 의해 생산되는 아미노산, 예를 들어 트립토판 및/또는 시스틴, 일반적으로 NH4 + 이온을 제공하는 염 용액 형태의 무기 질소 및/또는 심지어 다른 물질들, 예를 들어 나트륨 락테이트를 첨가하는 것이 가능하다. 이들 첨가제를 일반적으로는 저 농도로 사용한다. 상기 배양 배지 중의 아미노산 보충물은 일반적으로 ≤ 1 mM의 농도이다. 유사하게, 상기 암모늄 염 및/또는 나트륨 락테이트는 일반적으로 ≤ 10 mM의 농도이다. 최종적으로, 본 발명에 따른 배양 배지를 이온 철 형태의 철을 공급하여 보충할 필요는 없지만(이미 상기 식물 펩톤 및 효모 추출물의 조성물 중에 충분한 양으로 존재하기 때문에), 예방책으로서 세균 생육 중에 발생할 수도 있는 임의의 철 결핍을 피하기 위해서 상기 배양 배지에 철 염의 용액을 0.5 내지 10 ㎎/ℓ의 범위일 수 있는 농도 범위로 첨가하는 것이 가능하다.
유리하게는, 본 발명에 따른 배양 배지는 인간 또는 소 기원의 임의의 폴리펩타이드, 펩타이드 및/또는 아미노산의 임의의 단백질이 없거나 심지어 동물 기원의 임의의 폴리펩타이드 및/또는 아미노산의 임의의 단백질이 없거나, 또는 훨씬 더 유리하게는 동물 기원의 어떠한 오염물질도 없다.
특정 실시태양에 따라, 본 발명의 주제는
- 0.1 mg/ℓ 내지 5 mg/ℓ의 프로토포르피린 IX,
- 2 내지 50 mg/ℓ의 β-NAD,
- 2 내지 20 g/ℓ의 글루코스,
- 2 내지 5 g/ℓ의 효모 추출물,
- 0.4　g/ℓ 내지 1.5 g/ℓ의 단백질 질소 농도와 동등한 완두콩 펩톤, 및
- 배지의 pH가 6.5 내지 7.5, 바람직하게는 7.0 내지 7.5 가 되도록, 염 용액의 형태로 Na+, NH4 +, Ca++, Mg++, HPO4 --, H2PO4 -, SO4 - - 및 Cl- 이온을 포함하는 무기 이온들의 칵테일
을 포함하는 배양 배지이다.
상기 배지 조성물을 사용함으로써, 액체 배지 중에서 배양 중에 캡슐화되지 않은 복귀 돌연변이체 세균의 발생을 막는다. 실제로, 상기 배지에, 처음에 100%의 캡슐화된 세균을 함유하는 집단(18 kb 유전자의 2 개의 사본을 함유하는 cap 좌의 전체 세균 집단의 게놈)을 접종함으로써, 여전히 100%의 캡슐화된 세균을 함유하는 세균 집단이 40 세균 세대에 상당하는 배양기간 후에 획득됨이 주목되었다. 상기 배지 조성물(특히 실시예 3.2.2.1에 언급되고 실시예 4에 사용된 것을 포함한다)은 캡슐화된 세균의 집단에 대해 안정화 역할을 발휘함으로써 상기 PRP 수율의 개선에 기여한다.
또 다른 태양에 따라, 본 발명의 주제는
(a) 헤모필루스 인플루엔자에 b 혈청형을 본 발명에 따른 액체 배양 배지에서 배양하고,
(b) (i)에서 수득된 배양 상등액을 수거하고,
(c) 상기 배양 상등액으로부터 폴리리보실 리비톨 포스페이트(PRP)를 추출하는
상기 PRP의 제조 방법이다.
본 발명의 방법에 따른 PRP를 제조하기 위해서, 단계 (i)에서 본 발명에 따른 액체 배지에서 하나 이상의 연속적인 헤모필루스 인플루엔자에 b 혈청형 배양을 수행할 수 있다. 상기 연속적인 배양은 바이오매스를 증가시킬 수 있다.
이를 위해서, 동결건조된 생성물 또는 동결 생성물로부터 수득된 세균을 일반적으로 1 리터를 초과하지 않는 배지 부피에 접종한다. 밤새 배양 후 또는 배지의 광학 밀도가 충분할 때, 첫 번째 배양물을, 상기 첫 번째 배양물과 동일하지만 그의 부피가 10 내지 20 배까지 더 클 수도 있는 두 번째 배양 배지로 옮긴다. 상기 세균 집단의 빠른 생육을 촉진하기 위해서 상기 두 번째 배지에 접종되는 세균의 양을 상기 두 번째 배양 배지의 초기 광학 밀도(OD)가 600 ㎚에서 0.2 내지 0.4가 되도록 조절한다. 상기 두 번째 배양을 대개는 발효기에서 수행하나 다른 유형의 용기(플라스크, 스피너 등)를 사용할 수도 있다. 상기 배양을 발효기에서 수행하는 경우, 상기 배양을 지속하는 동안 37 ℃ ± 1 ℃의 온도, 일정한 교반, 0.1 바의 압력, 30%의 pO2, 및 분당 배지의 부피당 0.25 기체 부피의 공기 유속이 통상적으로 사용된다. 상기 유형의 배양을 위해 다른 매개변수들을 선택하는 것은 당해 분야의 숙련가의 능력 안에 있다. 지수 세균 증식기의 끝에서, 상기 배양물을 동일한 과정을 사용하여 보다 큰 용량의 또 다른 발효기로 옮기는 등에 의해 상기 바이오매스를 추가로 증폭시킬 수 있다. 상기 획득된 배양 부피는 1000 리터 이하이거나 또는 심지어 이를 초과할 수도 있다. 상기 배양(들)을 일반적으로는 배치 방식에 따라 수행한다. 또한 다른 배양 방식, 특히 유가 배양(fed-batch) 방식을 채택할 수도 있다. 이 경우, 영양 탄수화물 보충물을 상기 지수 증식기 동안 상기 배지에 첨가하여 세균 증식을 연장하고 상기 지수 증식기의 끝에서 보다 큰 세균 밀도를 획득한다. 상기 첨가되는 탄수화물의 양을, 첨가 시 배지 중에 존재하는 락테이트 수준의 함수로서 산정한다.
최종 배양물의 상등액을 최종적으로 상기 세균의 불활성화 후에 수거한다. 상기 불활성화를 통상적으로는 최종 농도 0.35 내지 0.37%(v/v)의 포르말린 용액의 도움으로 수행한다. 상기 상등액을 원심분리 단계에 의해 상기 세균으로부터 통상적으로 분리시킨다. 이어서 생성 상등액 중에 함유된 PRP를 추출하고 당해 분야의 숙련가에게 널리 공지된 통상적인 방법에 따라 정제한다.
또 다른 실시태양에 따라, 본 발명의 주제는
(i) 헤모필루스 인플루엔자에 b 혈청형을 고체 배지 상에서 배양하고,
(ii) (i)에서 수득된 하나 이상의 콜로니를 본 발명에 따른 액체 배양 배지로 옮기고 여기에서 배양하고,
(iii) (ii)에서 수득된 배양 상등액을 수거하고,
(iv) 상기 배양 배지로부터 PRP를 추출하는
PRP의 제조 방법이다.
본 발명의 방법에 사용될 수 있는 고체 배양 배지는 헤모필루스 인플루엔자에 b 혈청형의 배양에 적합해야 한다. 상기는 또한
-단백질 질소의 공급원,
-헴 공급원,
-β-NAD 공급원,
-탄수화물 공급원,
-비타민 및 생육 인자의 공급원,
-무기 염, 및
-10 내지 30 g/ℓ 농도의 젤화 물질, 특히 아가
를 포함한다.
PRP의 산업적인 생산을 위한 방법에서, 고체 배지 중의 예비 배양 단계를 통상적으로 사용한다. 대개, 동결 건조된 생성물 또는 동결 생성물로부터 수득된 세균을 재현탁하고 이어서 말 혈액이 보충된 목탄 기재 고체 배지 상에 접종한다. 10% CO2 하에 37 ℃에서 배양기에서 16 내지 20 시간 배양 후, 세균 콜로니를 수거하고 액체 배지에서 증폭시킨다. 이 방법은 단백질 질소 공급원으로서 동물 기원의 단백질을 함유하는 고체 배지를 사용한다는 단점을 갖는다. 따라서 발명자들은 상기 단백질 질소 공급원에 동물 기원의 어떠한 단백질도 없는 고체 배지의 조성물을 동정하고자 하였다.
처음에, 발명자들은 효모 추출물이 단백질 질소 공급원, 비타민 및 생육 인자의 공급원, 헴, β-NAD, 탄수화물, 및 앞서 개시된 바와 동일한 특징들을 갖는 무기 염의 공급원으로서 동시에 작용할 수 있는 고체 배지를 사용할 수 있음을 설명하였다. 0.05 ㎎/ℓ의 프로토포르피린 IX, β-NAD의 경우 0.1 μM, 및 탄수화물의 경우 0.1 mM의 최소 농도를 권장하는 반면, 배지 중의 효모 추출물의 농도는 0.2 내지 1.5 g/ℓ의 단백질 질소 함량에 상응한다. 수득된 콜로니들은, 콜로니의 숫자로 상징되는 생육이 항상 최적인 것은 아니라 하더라도, 생육 가능하다. 상기 콜로니를 본 발명에 따른 액체 배양 배지로 직접 옮길 수 있다. 이어서 상기 과정을 상기 배양 부피를 증폭시키기 위해서 상기와 같이 수행하고, PRP를 추출 및 정제한다.
바람직하게는, 상기 고체 배양 배지는 단백질 질소의 공급원으로서 화학적 또는 효소적 가수분해물의 형태로 사용되는 식물 기원의 하나 이상의 펩톤을 포함한다. 특히, 효모 추출물 보충물로서, 밀, 목화, 벼, 대두, 완두, 감자, 완두콩 또는 이들의 혼합물로부터 수득된 하나 이상의 식물 펩톤을, 특히 0.2 g/ℓ 내지 2 g/ℓ의 범위일 수 있는 단백질 질소 농도(이때 상기 고체 배지 중의 총 단백질 질소 농도는 2.5 g/ℓ를 초과하지 않는다)로 사용할 수 있다. 사용될 수 있는 식물 펩톤의 혼합물의 예로서, 대두, 목화 및 벼 펩톤을 기본으로 하는 혼합물 또는 완두콩, 목화 및 밀 펩톤을 기본으로 하는 혼합물 또는 최종적으로 완두콩과 감자를 기본으로 하는 혼합물을 언급할 수 있다. 발명자들은 실제로, 상기 배양 배지가 단백질 질소의 공급원으로서 식물 펩톤을 또한 포함하는 경우, 세균 생육 및 상기 세균의 생육력은 끓이거나 피브린 제거한 말 혈액이 보충된 목탄 기재 고체 배지(목탄 아가)에서 관찰된 경우보다 더 양호함에 주목하였다. 상기 생육 및 생육력은 사용된 식물 펩톤이 완두콩 펩톤인 경우 최대이다.
따라서, 본 발명의 주제는 또한 고체 배지의 단백질 질소 공급원에 동물 기원의 단백질이 없고 하나 이상의 식물 펩톤을 포함하는 PRP의 제조 방법이다. 바람직하게는 상기 식물 펩톤은 완두콩 펩톤이다.
유리하게는, 본 발명에 따른 고체 배양 배지는 인간 또는 소 기원의 임의의 단백질, 임의의 폴리펩타이드, 임의의 펩타이드 및/또는 임의의 아미노산이 없거나 또는 보다 유리하게는 동물 기원의 어떠한 오염물질도 없다. 후자의 경우, 헴 공급원은 합성 프로토포르피린 IX, β-NAD 및 탄수화물 공급원(또한 비 동물 기원의 것이다), 비타민의 공급원, 및 효모 추출물 및 젤화 물질(조류로부터 유래된 생성물인 아가)에 의해 제공되는 생육 인자들로 이루어진다.
이러한 이유로 인해, 본 발명의 또 다른 주제는 고체 배양 배지 및 액체 배양 배지에 동물 기원의 어떠한 오염물질도 없는, PRP의 제조 방법이다.
또한 가장 많은 PRP를 생산하는 세균 콜로니를 선택하는 것이 가능하도록 상기 고체 배지의 조성을 최적화하고자 하였다. 상기와 같은 배지의 조성은
-상기 콜로니들의 양호한 차별화;
-상기 콜로니들의 양호한 생육력;
-상기 콜로니들의 형태를 연구할 수 있기에 충분한 상기 콜로니들의 크기 및 발육
을 획득할 수 있게 해야 한다. 상기 콜로니들을 식별할 수 있기 위해서, 16 내지 24 시간의 배양의 끝에서 충분한 크기(약 3 내지 5 ㎜)를 갖는 헤모필루스 인플루엔자에 b 형 콜로니를 수득할 수 있게 하는 배지를 가질 필요가 있다.
본 발명에 따른 PRP 제조 방법의 바람직한 실시태양들 중 하나에서, 상기 고체 배지는
-1 ㎎/ℓ 이상의 β-NAD,
-0.5 ㎎/ℓ 이상의 프로토포르피린 IX,
-상기 고체 배지 중의 단백질 질소 농도가 0.2 g/ℓ 이상이 되기에 충분한 양, 및 상기 배지 중의 식물 단백질의 양과 효모 추출물의 양 사이의 비가, 상기 배지의 단백질 질소의 농도가 0.2 g/ℓ 내지 0.8 g/ℓ인 경우 0.1 내지 9이고 상기 배지의 단백질 질소의 농도가 >0.8 g/ℓ인 경우 1 내지 9가 되도록 하는 비율의 식물 펩톤 및 효모 추출물,
-탄수화물,
-해독제, 및
-배양 배지의 pH가 6.5 내지 7.5, 바람직하게는 7.0 내지 7.5가 되도록, 염 용액의 형태로 Na+, K+, Ca++, Mg++, Fe+++, HPO4 --, H2PO4 -, SO4 -- 및 Cl- 이온을 포함하는 무기 이온들의 칵테일
을 포함한다.
상기 사용되는 탄수화물은 바람직하게는 상기 세균에 의해 대사 가능한, 비 동물 기원의 당, 예를 들어 프럭토스, 리보스, 자일로스, 퓨코스, 글리세롤, 또는 특히 글루코스이다. 0.1 g/ℓ 이상 농도의 글루코스를 사용하는 경우 양호한 결과가 획득되었다. 대개, 글루코스는 0.1 g/ℓ 내지 20 g/ℓ, 및 바람직하게는 0.1 g/ℓ 내지 10 g/ℓ의 농도로 사용된다.
상기 해독제는 문헌[Evans N.M et al., J. Med. Microbiol. Vol 7, pp 305-309, 1974]에 의해 보고된 바와 같이 아가 제제 중에 존재할 수 있는 억제성 물질을 중화시킴으로써 상기 세균의 생육을 촉진한다. 해독제로서, 바람직하게는 목탄, 전분, 트윈(등록상표), 폴리비닐 알콜, 나트륨 올리에이트 또는 나트륨 다이티오나이트가 사용된다. 0.5 내지 10 ㎎/ℓ의 농도로 사용되는 트윈 80(등록상표)(솔비탄 폴리옥시에틸렌 모노올리에이트)의 경우 양호한 결과가 관찰되는 반면, 트윈(등록상표)이 없는 고체 배지 조성물은 형태학적 관점에서 구분할 수 없는 작은 크기의 콜로니들을 생산한다. 형태학적 관점에서 구분할 수 없는 작은 크기 콜로니들은 또한 상기 β-NAD 농도가 1 ㎎/ℓ 미만인 경우, 상기 프로토포르피린 IX 농도가 0.5 ㎎/ℓ 미만인 경우, 또는 상기 글루코스 농도가 0.1 ㎎/ℓ 미만인 경우 관찰된다.
상기 콜로니들의 양호한 생육 및 양호한 생육력을 보장하기 위해서, 효모 추출물 및 식물 펩톤의 양은 총 단백질 질소의 농도가 0.2 g/ℓ 이상이 되도록 하는 양이다. 상기 배지 중의 식물 펩톤의 양과 효모 추출물의 양 사이의 비는, 상기 배양 배지 중의 단백질 질소의 농도가 0.8 g/ℓ를 초과하지 않는 한 0.1 내지 9의 범위로, 큰 정도로 변할 수 있다. 다른 한편으로, 보다 큰 농도에서는, 상기 비가 1 미만인 경우 상기 고체 배지 상에 상기 세균 현탁액의 불충분한 확산으로 인해 상기 콜로니들의 식별이 불량하다.
상기 고체 아가-기재 배지에 헤모필루스 인플루엔자에 b 혈청형 세균의 이종 집단(즉 캡슐화된 세균 및 캡슐화되지 않은 세균을 모두 함유한다)을 접종함으로써, 18 내지 24 시간의 배양 후에 백색 광선의 도움으로 투명성에 의해 식별이 가능한 백색 콜로니와 회색 콜로니가 관찰된다. 상기 백색 콜로니는 상기 회색 콜로니보다 더 많은 PRP를 생산한다. 더욱이, 상기 백색 콜로니는 또한 말 혈액이 보충된 목탄 아가-기재 고체 배지로부터 수득된 콜로니보다 더 많은 PRP를 생산한다(실시예 2 참조). 상기 배지 조성물은 가장 많은 PRP를 생산하는 콜로니들을 분류할 수 있게 하기 때문에 선택성 배지 조성물로서 간주된다.
본 발명에 따른 방법의 훨씬 더 바람직한 실시태양에 따라, 상기 고체 배지는
5 내지 50 mg/ℓ의 β-NAD,
0.5 내지 5 mg/ℓ의 프로토포르피린 IX,
1 내지 10 g/ℓ의 글루코스,
1 내지 10 mg/ℓ의 트윈 80,
3 내지 4 g/ℓ의 K2HPO4,
0.9 내지 3 g/ℓ의 KH2PO4,
0.5 내지 2 g/ℓ의 K2SO4,
20 내지 500 mg/ℓ의 MgCl2,
2 내지 50 mg/ℓ의 CaCl2·2H2O,
1 내지 5 mg/ℓ의 FeCl3·6H2O,
4 내지 8 g/ℓ의 NaCl,
4 내지 8 g/ℓ의 효모 추출물, 및
4 내지 8 g/ℓ의, 상기 배지의 단백질 질소 농도가 >0.8 g/ℓ인 경우 완두콩 펩톤의 양과 효모 추출물의 양 사이의 비가 ≥ 1이 되도록 하는 완두콩 펩톤
을 포함한다.
상기 배지 조성물로부터 수득한 백색 콜로니들은 회색 콜로니들보다 400 배까지 더 많은 PRP를 생산한다. 이들의 cap 좌는 제한 효소 SmaI 및 KpnI의 도움으로 게놈 DNA를 절단함으로써 연구되었다. 이어서 펄스화된 장 전기영동(pulsed field electrophoresis)을 상기 절단 생성물 상에서 수행한 다음 실시예 3에 개시된 실시 조건에 따라 특수 PvuII 탐침의 도움으로 가시화하였다. 놀랍게도, 백색 콜로니들로부터의 모든 전기영동 프로파일은 45 kb의 전기영동 밴드를 함유한다. 18 kb 전기영동 밴드는 관찰되지 않는다. 이들 콜로니의 cap 좌는 결과적으로 18 kb 유전자의 2 개 이상의 사본을 함유하며, 이는 상기 백색 콜로니로부터 유래된 세균 집단이 전적으로 캡슐화됨을 의미한다. 다른 한편으로, 상기 회색 콜로니들로부터의 전기영동 프로파일은 주로 18 kb의 전기영동 밴드를 함유한다. 상기 특히 바람직한 선택성 배지 조성물은 전적으로 완전히 캡슐화된 세균 집단을 갖는 백색 콜로니를 선택할 수 있게 한다.
실제로, 고체 배지 상에서의 예비 배양 단계를 포함하는 PRP 제조 방법에서 수율을 증가시키기 위한 추가적인 수단들 중 하나는 액체 배지에 선택성 고체 배지 조성물로부터 수득된 백색 콜로니만을 옮기는 것이다. 바람직하게는, 캡슐화된 세균으로 필수적으로 이루어진 백색 콜로니를 수득할 수 있게 하는 고체 배지 조성물을 사용한다.
따라서, 본 발명의 주제는 또한 바람직한 실시태양에서 선택성 고체 배지 조성물 상에서 수득한 백색 콜로니만을 상기 액체 배양 배지로 옮기는 PRP의 제조 방법이다.
특히 바람직한 실시태양에서, 상기 백색 콜로니를 상기 캡슐화된 세균 집단에 대해 안정화 역할을 발휘하는 액체 배양 배지로 옮긴다. 상기 모든 배양 단계들을, 단백질 질소 공급원이 비 동물 기원의 것인 배지, 또는 심지어 합성 프로토포르피린 IX를 사용하는 경우 두드러진 동물 기원의 어떠한 오염물질도 없는 배지를 사용하여 수행한다는 사실 이외에, 상기 방법은 또한 상기 헤모필루스 인플루엔자에 b 혈청형 집단이 이종이고 캡슐화된 세균 및 캡슐화되지 않은 세균을 모두 함유하는 경우 PRP의 생산을 최적화되게 할 수 있다. 고체 배지 상에서의 배양 단계는 전적으로 캡슐화된 세균 집단을 함유하는 백색 콜로니를 선택할 수 있게 한다. 상기 액체 배지에서 바이오매스를 증폭시키는 단계는 상기 나타낸 바와 같이, 캡슐화되지 않은 복귀 돌연변이체의 발생을 방지함으로써 캡슐화된 세균 집단을 안정화시킨다. 이때 최종적으로 수득되는 배양물의 리터당 PRP의 수율은 최대이다(실시예 4 참조).
상기 방법을 또한 전적으로 캡슐화된 세균 집단의 제조에 사용할 수 있다. 상기 수득되는 세균 집단은, 상기 집단의 게놈 DNA의 전기영동 프로파일이 상기 cap 좌가 18 kb 유전자의 2 개 이상의 사본을 함유함을 보이고(실시예 3의 프로토콜 참조) 본 발명에 따른 선택성 고체 배지 조성물 상에 상기 집단의 분액을 접종하여 백색 콜로니의 95% 초과, 바람직하게는 백색 콜로니의 98% 이상이 생산되는 경우, 전적으로 캡슐화된 것이다. 안정화 액체 배지(즉 캡슐화되지 않은 복귀 돌연변이체 세균의 출현을 막는다)에서 상기 세균을 증폭시킨 후에, 상기 수득되는 세균 집단을 동결 건조 또는 동결(이 경우 글리세롤과 같은 비 동물 기원의 동결제를 상기 배양 배지에 가한다)에 의해 보존한다. 따라서 전적으로 캡슐화된 세균의 동종 집단을 함유하고, 동물 기원의 어떠한 오염물질도 없는 배양 배지를 사용하여 수득되기 때문에 생물학적 안전성이 추가로 보장된 접종 배치가 제조된다. 상기 접종 배치는 차례로 PRP를 생산하는 작용을 할 수 있다.
따라서 본 발명의 주제는
-모든 단계를 동물 기원의 어떠한 오염물질도 없는 배지를 사용하여 수행하는 PRP의 제조 방법,
-(i) 헤모필루스 인플루엔자에 b 혈청형을
-5 내지 50 mg/ℓ의 β-NAD,
-0.5 내지 5 mg/ℓ의 프로토포르피린 IX,
-1 내지 10 g/ℓ의 글루코스,
-1 내지 10 mg/ℓ의 트윈 80,
-3 내지 4 g/ℓ의 K2HPO4,
-0.9 내지 3 g/ℓ의 KH2PO4,
-0.5 내지 2 g/ℓ의 K2SO4,
-20 내지 500 mg/ℓ의 MgCl2,
-2 내지 50 mg/ℓ의 CaCl2·2H2O,
-1 내지 5 mg/ℓ의 FeCl3·6H2O,
-4 내지 8 g/ℓ의 NaCl,
-4 내지 8 g/ℓ의 효모 추출물, 및
-4 내지 8 g/ℓ의, 상기 배지의 단백질 질소 농도가 >0.8 g/ℓ인 경우 완두콩 펩톤의 양과 효모 추출물의 양 사이의 비가 ≥ 1이 되도록 하는 완두콩 펩톤
을 포함하는 고체 배지 상에서 배양하고;
(ii) (i)에서 수득된 하나 이상의 백색 콜로니를
-0.1 ㎎/ℓ 내지 5 ㎎/ℓ의 프로토포르피린 IX,
-2 내지 50 ㎎/ℓ의 β-NAD,
-2 내지 20 g/ℓ의 글루코스,
-2 내지 5 g/ℓ의 효모 추출물,
-0.4 g/ℓ 내지 1.5 g/ℓ의 단백질 질소 농도와 동등한 완두콩 펩톤, 및
-배지의 pH가 6.5 내지 7.5, 바람직하게는 7.0 내지 7.5가 되도록, 염 용액의 형태로 무기 이온: Na+, NH4 +, Ca++, Mg++, HPO4 --, H2PO4 -, SO4 -- 및 Cl- 의 칵테일
을 포함하는 액체 배양 배지로 옮기고 여기에서 배양하며;
(iii) (ii)에서 수득된 세균 배양물을 동결시키거나 동결 건조시키는
전적으로 캡슐화된 헤모필루스 인플루엔자에 b 혈청형 세균 집단의 제조 방법, 및 마지막으로
-모든 단계들을 동물 기원의 어떠한 오염물질도 없는 배지를 사용하여 수행하는, 전적으로 캡슐화된 헤모필루스 인플루엔자에 b 혈청형 세균 집단의 제조 방법
이다.
본 발명의 주제는 또한 PRP의 제조를 위한, 상기 방법에 따라 수득된 캡슐화된 헤모필루스 인플루엔자에 b 혈청형 세균의 동종 집단의 용도이다.
본 발명의 주제는 본 발명에 따른 방법의 실시태양들 중 하나로부터 수득한 PRP를 포함하는 헤모필루스 인플루엔자에 b 형 수막염에 대한 백신이다.
본 발명의 주제는 마지막으로 헤모필루스 인플루엔자에 b 혈청형을 위한 고체 배양 배지이며, 상기 배지의 단백질 질소 공급원은 비 동물 기원의 것이고 상기 배지는
-1 ㎎/ℓ 이상의 β-NAD,
-0.5 ㎎/ℓ 이상의 프로토포르피린 IX,
-상기 배지 중의 단백질 질소 농도가 0.2 g/ℓ 이상이 되기에 충분한 양, 및 상기 배지 중의 식물 펩톤의 양과 효모 추출물의 양 사이의 비가, 상기 배지의 단백질 질소의 농도가 0.2 g/ℓ 내지 0.8 g/ℓ인 경우 0.1 내지 9이고 상기 배지의 단백질 질소의 농도가 >0.8 g/ℓ인 경우 1 내지 9가 되도록 하는 비율의 식물 펩톤 및 효모 추출물,
-탄수화물,
-해독제, 및
-상기 배지의 pH가 6.5 내지 7.5, 바람직하게는 7.0 내지 7.5가 되도록, 염 용액의 형태로 무기 이온: Na+, K+, Ca++, Mg++, Fe+++, HPO4 --, H2PO4 -, SO4 -- 및 Cl- 의 칵테일
을 포함한다.
바람직하게는, 상기 고체 배양 배지는
-5 내지 50 mg/ℓ의 β-NAD,
-0.5 내지 5 mg/ℓ의 프로토포르피린 IX,
-1 내지 10 g/ℓ의 글루코스,
-1 내지 10 mg/ℓ의 트윈 80,
-3 내지 4 g/ℓ의 K2HPO4,
-0.9 내지 3 g/ℓ의 KH2PO4,
-0.5 내지 2 g/ℓ의 K2SO4,
-20 내지 500 mg/ℓ의 MgCl2,
-2 내지 50 mg/ℓ의 CaCl2·2H2O,
-1 내지 5 mg/ℓ의 FeCl3·6H2O,
-4 내지 8 g/ℓ의 NaCl,
-4 내지 8 g/ℓ의 효모 추출물, 및
-4 내지 8 g/ℓ의, 상기 배지의 단백질 질소 농도가 >0.8 g/ℓ인 경우 완두콩 펩톤의 양과 효모 추출물의 양 사이의 비가 ≥ 1이 되도록 하는 완두콩 펩톤
을 포함한다.
본 발명은 하기의 실시예들에 비추어 보다 명확히 이해될 것이며 이들 실시예는 본 발명의 내용을 제한하지 않으면서 본 발명을 예시하는데 기여한다.
본 발명에 따른 배지의 조성물은 상기 세균 집단의 특징을 상기 배양 중에 감지할 정도로 변화시키지 않으므로 캡슐화된 세균 집단에 대해 안정화 역할을 발휘한다.
도 1은 헤민(◆) 또는 동물 기원(■) 또는 합성(▲) 기원의 프로토포르피린 IX의 농도(㎍/ℓ)의 함수로서, 동물 기원의 펩톤이 완두콩 펩톤으로 대체된 배양 배지 중의 PRP 생산 수준(㎎/ℓ)을 나타낸다.
도 2는 헤민(◆) 또는 동물 기원(■) 또는 합성(▲) 기원의 프로토포르피린 IX의 농도(㎍/ℓ)의 함수로서, 동물 기원의 펩톤이 밀 단백질로 대체된 배양 배지 중의 PRP 생산 수준(㎎/ℓ)을 나타낸다.
도 3은 헤모필루스 인플루엔자에 b 혈청형의 다양한 세균 집단들의 전기영동 프로파일을 나타내며, 밴드 M은 18 kb 및 45 kb의 2 개 밴드를 갖는 이종 모 집단의 전기영동 프로파일을 나타내고, 밴드 F는 선택성 고체 배지 상에서 선택 후 45 kb의 단일 밴드를 갖는 딸 집단(F)의 전기영동 프로파일을 나타내고; 밴드 B는 45 kb의 단일 밴드를 갖는 다양한 백색 세균 콜로니(B)의 프로파일을 나타내고, 밴드 G는 18 kb의 단일 밴드를 갖는 다양한 회색 세균 콜로니(G)의 다양한 프로파일을 나타낸다.
밴드 MW는 분자량 마커(kb)의 위치를 나타낸다.
실시예 1: 식물 펩톤-기재 배양 배지에서 PRP 의 생산에 대한 프로토포르피린 IX 의 영향
1) 방법
헴 공급원이 헤민이거나 또는 이나트륨 염 형태의 동물 기원의 프로토포르피린 IX(돼지 프로토포르피린) 또는 이나트륨 염 형태의 순수하게 합성 기원의 프로토포르피린 IX인 액체 식물 펩톤-기재 배양 배지에서 16 시간 세균 배양 후 수득된 PRP의 생산을 비교하였다. 상기 배양 배지 중의 헤민 및 프로토포르피린 IX 농도 범위는 시험된 헴 공급원의 함수로서 및 시험된 식물 펩톤의 함수로서 PRP 적정 곡선을 획득하기 위해 약 0.010 g/ℓ 내지 약 2 g/ℓ로 변한다. 케리에 의해 제공된 완두콩 펩톤(Hy pea 7404) 및 오가노테크니에 의해 제공된 밀 펩톤(19559)의 효소적 가수분해물을 0.87 g/단백질 질소 ℓ와 동등한 배양 배지 중의 농도로 시험하였다. PRP의 생산을 위한 현행 조건을 참고로, PRP의 생산을 또한 증가하는 농도의 헤민의 존재 하에서 0.87 g/단백질 질소 ℓ와 동등한 농도로 동물 기원의 펩톤, 예를 들어 솔라비아(Solabia)에 의해 공급되는 카제인 가수분해물(HAC)을 함유하는 배지에서 측정하였다(표 3 참조).
1.1) 배지의 제조
1.1.1. 한외여과하고 이어서 0.22 ㎛를 통한 여과에 의해 멸균한 β-NAD(Fluka) 1 g/ℓ의 모액.
1.1.2. 용해를 보조하기 위해서 25% 수성 암모니아(Cooper) 5 ㎖을 포함하는, 한외여과한 수중 0.25 g/ℓ의 헤민(Sigma) 모액. 상기 모액을 0.22 ㎛를 통한 여과에 의해 멸균한다.
1.1.3. 용해를 촉진하기 위해서 25% 수성 암모니아(Cooper) 5 ㎖을 포함하는, 한외여과한 수중 0.25 g/ℓ의 돼지 프로토포르피린 IX(Sigma) 모액. 상기 모액을 0.22 ㎛를 통한 여과에 의해 멸균한다.
1.1.4. 용해를 촉진하기 위해서 25% 수성 암모니아(Cooper) 5 ㎖을 포함하는, 한외여과한 수중 0.25 g/ℓ의 합성 프로토포르피린 IX 모액. 상기 모액을 또한 용해를 완료하기 위해서 교반하면서 수욕 중에서 80 ℃로 가열한 후에 0.22 ㎛를 통한 여과에 의해 멸균한다. 이나트륨 염 형태의 상기 프로토포르피린 IX를 반응식 2에 개시된 단계들을 사용하여, 2007년 3월 30일자로 출원된 등록번호 제 07/02334 호의 프랑스 특허 출원에 개시된 방법에 따라 합성하였다.
상기 헤민 및 프로토포르피린 IX의 모액을 멸균 여과 후 이들 각각의 활성 화합물 함량에 대해 검사하였다. 상기 프로토포르피린 IX 및 헤민 함량을 역상 고성능 액체 크로마토그래피(RP-HPLC)에 의해 측정하였다. 상기 크로마토그래피 쇄는 2상 구배의 형성을 허용하는 트윈 헤드 펌프 모듈, 프로그램 가능한 자동 주입기, 아이오드 배열 UV 검출기 및 시너지(Synergi) 4 ㎛, 폴라(Polar) RP-80A(150 x 4.6) ㎜, ref 00F-4336-E0 페노메넥스(Phenomenex)의 크로마토그래피 컬럼을 포함한다.
상기 여과 후 검사하려는 헤민(Sigma)의 모액을 증류수에서 1/3 희석한다. 상기 여과 후 검사하려는 돼지 프로토포르피린 IX(Sigma) 및 합성 프로토포르피린 IX의 모액을 증류수에서 1/4 희석한다. 병행하여, 암모니아처리된 수 중의 시그마(ref: 25838-5) 사의 돼지 프로토포르피린 IX로부터의 프로토포르피린 IX 0.025 g/ℓ 내지 0.125 g/ℓ 범위의 눈금화 시리즈(calibration series), 및 시그마(ref: H5533-256) 사의 헤민으로부터의 헤민 0.050 g/ℓ 내지 0.150 g/ℓ 범위의 눈금화 시리즈를 제조한다. 상기 검사하려는 샘플 및 상기 눈금화 시리즈의 다양한 용액들을 20 ㎕(헤민 용액 및 샘플의 경우) 및 5 ㎕(프로토포르피린 IX 용액 및 샘플의 경우)의 부피로 주입한다. 아세토나이트릴 및 10 mM KH2PO4 pH 2.5의 부피 혼합물의 부피로 이루어진 초기 이동 상을 1 ㎖/분의 유속으로 지정한다. 이어서 400 ㎚의 파장에서 검출되는 관심 분자들을 분리시키기 위해서 상기 이동상으로부터 불연속적인 구배를 생성시킨다. 상기 눈금화 시리즈를 확립시킨 후에 검사하려는 샘플들에 대한 피크의 표면적을 기준으로, 상기 다양한 여과된 모액들 중의 헤민 및 프로토포르피린 IX 농도를 상기로부터 추론한다(상기는 각각 헤민 용액의 경우 0.295 g/ℓ, 돼지 프로토포르피린 IX 용액의 경우 0.187 g/ℓ, 및 합성 프로토포르피린 IX 용액의 경우 0.249 g/ℓ이었다). 이러한 농도들을 0.250 g/ℓ의 표적 농도로 후속 조절하지 않았으나 상기 헤민 및 프로토포르피린 IX의 모액 중에 실제로 존재하는 상기 농도들을 상기 결과의 분석에 사용하였다.
1.1.5. 한외여과하고 이어서 0.22 ㎛를 통해 멸균한 수중 125 g/ℓ의 자기분해된 효모 추출물(Solabia) 모액.
1.1.6. 한외여과하고 이어서 0.22 ㎛를 통한 여과에 의해 멸균한 수중 465.12 g/ℓ의 글루코스 모액.
1.1.7. 농축 용액
상기는 효모 추출물 모액 40 ㎖, 글루코스 모액 43 ㎖ 및 β-NAD 모액 5 ㎖로 이루어진다.
1.1.8. 기본 배지
-기본 배지의 리터당 단백질 질소 0.95 g의 당량을 제공하기에 충분한 양의 밀 식물 펩톤(오가노테크니-Ref 19559) 또는 완두콩 식물 펩톤(케리-Ref Hypea 7404), 상기 단백질 질소의 양을 킬달법에 따라 분석한다,
-50% 수용액 중의 50% 나트륨 락테이트(VWR): 1.8 ㎖,
-이나트륨 수소 포스페이트·12H2O(Budenheim): 31.14 g,
-나트륨 이수소 포스페이트·2H2O(Merck): 2.03 g,
-L-시스틴(Jera France): 0.07 g,
-37% HCl(VWR): 0.07 ㎖,
-L-트립토판(Jera France): 0.02 g,
-암모늄 설페이트: 1 g,
-마그네슘 설페이트·7H2O: 0.4 g,
-염화 칼슘·2H2O: 0.02 g/ℓ,
-한외여과된 수: 1 리터에 충분한 양.
상기 기본 배지를 최종적으로 121 ℃에서 30 분간 오토클레이브를 사용하여 멸균한다.
1.2) 실시 프로토콜
배양을 500 ㎖ 삼각 플라스크에서 수행하였다. 각각의 삼각 플라스크에, 밀 펩톤 또는 완두콩 펩톤을 함유하는 기본 배지 100 ㎖, 농축 배지 8.8 ㎖, 및 다양한 배양 배지에서 시험되는 헤민(또는 프로토포르피린 IX)의 이론적인 농도가 10 ㎍/ℓ 내지 약 2000 ㎍/ℓ가 되도록 하는 가변적인 부피의 헤민, 돼지 프로토포르피린 IX 또는 합성 프로토포르피린 IX의 모액을 도입하였다(표 I 및 II 참조). 각각의 삼각 플라스크에 0.2%(V/V)의 접종률로 108 내지 1010 세균/㎖을 함유하는 헤모필루스 인플루엔자에 b 혈청형의 동결된 생성물의 내용물을 접종한다. 37 ℃에서 배양기 중에서 175 rpm으로 교반하면서 16 시간 배양 후에, 수득된 세균 현탁액의 OD 및 PRP 농도를, 각각의 삼각 플라스크에서 소량의 배양 상등액을 수거함으로써 측정한다.
1.3) PRP의 분석
상기 PRP 생산성을 상기 배양 상등액에 대한 중복적인 샌드위치 유형 ELISA 분석을 근거로 측정하였다.
상기 ELISA 미세플레이트를, 각 웰에 헤모필루스 인플루엔자 b 형 미생물로 초면역시킨 토끼의 면역혈청 용액 100 ㎕(상기 용액은 0.2M 카보네이트 완충제 pH 9.6으로 사전에 희석된다(희석 ∼1/2000))를 도입시켜 +4 ℃에서 밤새 민감하게 한다. 상기 ELISA 미세플레이트의 세정 및 포화 후에, 각 미세플레이트에, 희석 완충제(PBS/0.05% 트윈 20/1% 소 혈청 알부민)로 연속적으로 희석함으로써 증류수 중 1 ㎎/㎖의 정제된 PRP 용액으로부터 눈금화 시리즈를 생성시킨다. 분석하려는 배양 상등액을 또한, 상기 희석제 완충제로 연속적인 희석을 또한 수행함으로써 도입한다. 37 ℃에서 약 2 시간의 추가 배양 후에, 상기 미세플레이트의 세정 단계에 이어서, 상기 미세웰에, 파상풍 단백질과 접합된 헤모필루스 인플루엔자에 b 형 백신으로 백신화한 토끼의 혈청을 비오틴화제로 처리함으로써 획득한 비오틴화된 토끼 항체 용액 100 ㎕(희석 완충제로 사전에 희석됨)(희석 ∼1/500)를 도입한다. 37 ℃에서 1 시간 동안 배양한 다음 세정 단계 후에, 상기 각각의 미세웰에, 퍼옥시다제(Southern Biotechnology-ref 7100-05)와 커플링된 스트렙트아비딘 용액 100 ㎕(희석 완충제로 사전에 희석됨)(희석 ∼1/500)를 가한다. 37 ℃에서 1 시간 동안 배양한 다음 세정 단계 후에, 각각의 미세웰에, 가시화 용액 100 ㎕(0.05M 포스페이트-시트레이트 완충제 중의 0.4 ㎎/㎖의 오쏘-페닐렌다이아민 용액, pH = 5, 과산화 수소 0.3 ㎕가 0.03%로 보충됨)를 가한다. 20 분간 빛을 차단하여 가시화한 후에, 상기 반응을 2N H2SO4 50 ㎕/웰을 가하여 차단한다. 상기 미세플레이트를 492 및 620 ㎚(상기 플라스틱의 흡수를 고려하기 위해서)에서 판독한다. 상기 시험된 샘플들로부터 획득된 광학 밀도 값으로부터, 다양한 배양 상등액 중의 PRP 함량을, 상기 눈금화 시리즈를 사용하여 보간법에 의해 측정한다.
1.4) 결과
결과를 하기 표 1 및 2 및 도 1 및 2에 나타낸다.
Figure pct00002
Figure pct00003
Figure pct00004
도 1은 완두콩 펩톤을 함유하는 배지에 사용된 헴의 농도 및 공급원의 함수로서 획득된 PRP 생산 곡선을 나타내면서 표 I의 결과를 재현한다. 상기 PRP 생산 곡선은 헴의 공급원으로서 합성 프로토포르피린 IX가 사용되었는지 또는 동물 기원의 프로토포르피린 IX가 사용되었는지에 따라 등가이다. 다른 한편으로, PRP의 생산은 상기 배지가 프로토포르피린 IX를 함유하는 배지에 비해 헤민을 함유하는 경우 실질적으로 더 낮으며, 이는 시험된 전체 농도 범위에 있다. 최적의 PRP 생산(∼480 ㎎/㎖)을 갖기 위해서 단지 200 ㎍/ℓ의 프로토포르피린 IX를 사용해야 하는 반면 PRP의 최대 생산을 위해서는 약 2500 ㎍/ℓ의 헤민이 요구된다. 따라서 최대의 PRP 생산을 위해서는 완두콩 펩톤을 기본으로 하는 배양 배지에 헤민보다 약 12.5 배 더 적은 프로토포르피린 IX가 필요하다.
도 2는 밀 펩톤을 함유하는 배지에 사용된 헴의 농도 및 공급원의 함수로서 획득된 PRP 생산 곡선을 나타내면서 표 II의 결과를 재현한다. 상기 PRP 생산 곡선은 헴의 공급원으로서 합성 프로토포르피린 IX가 사용되었는지 또는 동물 기원의 프로토포르피린 IX가 사용되었는지에 따라 등가이다. 다른 한편으로, PRP의 생산은 상기 배지가 같은 농도의 프로토포르피린 IX를 함유하는 배지에 비해 헴을 함유하는 경우 더 낮으며, 상기 헤민 농도가 낮을수록 이는 더 명확하게 나타난다. 최적의 PRP 생산(∼400 ㎎/㎖)을 갖기 위해서 단지 약 100 ㎍/ℓ의 프로토포르피린 IX를 사용해야 하는 반면 PRP의 등가 생산을 위해서는 약 1500 ㎍/ℓ의 헤민이 요구된다. 따라서 최대의 PRP 생산을 위해서는 밀 펩톤을 기본으로 하는 배양 배지에 헤민보다 약 15 배 더 적은 프로토포르피린 IX가 필요하다.
표 I, II 및 III의 결과는 또한 동물 펩톤 및 헤민을 기본으로 하는 배지(상기는 실제로 PRP의 생산에 권장되는 배지 조성이다) 중의 헤민 농도는, 배양 상등액에서 동일한 PRP 농도를 획득하기 위해 밀 또는 완두콩 펩톤과 같은 식물 펩톤을 기본으로 하는 배지에 필요한 프로토포르피린 IX의 농도보다 2 내지 5 배 더 높을 것이 필요함을 보인다. 예를 들어, 카제인 및 헤민의 가수분해물을 기본으로 하는 배지 중의 약 400 ㎎/ℓ의 PRP 농도를 획득하기 위해서, 상기 헤민 농도는 500 ㎍/ℓ 이상이어야 하는 반면, 밀 또는 완두콩 펩톤 및 프로토포르피린 IX를 기본으로 하는 배지에서는 약 100 ㎍/ℓ의 프로토포르피린 IX 농도면 충분하다. 따라서 식물 펩톤 및 프로토포르피린 IX를 기본으로 하는 배지는 PRP의 생산을 위해 작용하는 동물 펩톤 및 헤민을 함유하는 현행 배지보다 더 유리한 것으로 보인다.
실시예 2: 콜로니들에 의한 PRP 의 생산에 대한 고체 배지 조성의 영향
약 108 미생물을 함유하는 헤모필루스 인플루엔자에 b 혈청형 세균의 동종 집단의 동결 건조된 물질을 둘베코(Dulbecco) PBS 완충제(Gibco ref 14040-083) 1 ㎖에 용해시킨다. 상기 완충제에서 10 배의 일련의 희석을 수행한다. 희석물: 10-5, 10-6 및 10-7 각각 50 ㎕를 수거하고 본 발명에 따른 다양한 선택성 고체 배지 조성물을 함유하는 페트리 디쉬, 또는 10%(v/v) 피브린 제거된 끓인 말 혈액(BioMerieux, Ref 55832)이 보충된 목탄 아가(Difco, Ref 289410)를 함유하는 표준 고체 배지를 함유하는 페트리 디쉬 상에 접종한다.
10% CO2를 함유하는 배양기에서 37 ℃에서 밤새 배양 후에, 콜리니들을 75 W 램프하에서 투명성에 의해 검사한다(상기 페트리 디쉬는 닫는다). 상기 콜로니들은 표준 배지 상에서 불투명하고 균일한 것으로 보인다. 다른 한편으로, 백색 콜로니 및 회색 콜로니를 선택성 배지 상에서 관찰한다. 4 개의 콜로니를 상기 표준 고체 배지로부터 랜덤하게 수거하고 리터당 조성이 하기와 같은 시험된 선택성 배지 중 2 개(A 및 B)로부터 4 개의 회색 콜로니 및 4 개의 백색 콜로니를 수거한다:
선택성 배지 A 선택성 배지 B
β-NAD: 10　mg 10　mg
프로토포르피린 IX: 5　mg 0.5 mg
글루코스: 1　g 1　g
트윈 80: 1　mg 1　mg
K2HPO4: 3 g 3　g
KH2PO4: 0.94　g 0.94　g
K2SO4 0.5　g 0.5　g
MgCl2 : 0,5　g 0.5　g
CaCl2·2H2O: 0.002　g 0.002　g
FeCl3·6H2O: 0.005　g 0.005　g
NaCl: 8　g 8　g
효모 추출물 (Difco-ref: 212 740): 5　g 5　g
산 가수분해물 형태의 완두콩 펩톤 (Oxoid): 5.3　g 5.3　g
박토 아가: 15　g 15　g
수거된 각각의 콜로니에 대해, PRP 함량을 펄스화된 장 전류측정 검출(HPAEC/PAD) 크로마토그래피가 커플링된 고성능 크로마토그래피에 의해 분석한다.
PRP의 정량분석을, 폴리사카라이드의 반복 단위의 성분들 중 하나이고 산 가수분해 후 정량적으로 방출되는 리비톨을 분석함으로써 수행한다.
2.1) 샘플의 제조
각각의 콜로니를 한외여과 수 500 ㎕에 용해시키고 이어서 현탁액 100 ㎕를 수거하고 한외여과 수 300 ㎕로 희석한다.
2.2) 눈금화 시리즈의 제조
한외여과 정제 수 중의 1 ㎎/ℓ의 리비톨 모액으로 출발하여, 0 내지 20 ㎍/㎖ 범위의 리비톨 눈금화 시리즈를 제조한다. 상기 눈금화 시리즈의 각 샘플의 최종 부피는 또한 400 ㎕이다.
2.3) 산 가수분해
10N 트라이플루오로아세트산 용액 100 ㎕를 각각의 샘플 제제 또는 상기 눈금화 시리즈의 각 샘플에 가한다. 가수분해를 120 ℃에서 2 시간 동안 수행한다. 이어서 모든 튜브를 질소 스트림 하에서 건조시키고 각각의 건조된 물질을 상기 분석 시에 한외여과 정제 수 400 ㎕에 용해시킨다.
2.4) HPAEC-PAD 크로마토그래피에 의한 분석
상기 가수분해물 각각 100 ㎕를 사전에 480 nM 수산화 나트륨 용액으로 평형화시킨 분석 컬럼 CARBOPAC MA1(4X250 ㎜)(DIONEX #44066) 상에 주입한다. PRP의 2 성분 모노사카라이드를 용리시키기 위해서 상기 컬럼에 48%의 1M 수산화 나트륨 및 52%의 한외여과 정제 수 용액을 함유하는 용액 스트림을 0.4 ㎖/분의 유속으로 40 분간 가한다. 상기 컬럼의 온도를 전체 분석 지속 기간 동안 30 ℃에서 유지시킨다. 상기 모노사카라이드를 전류측정 전지(DIONEX #44094)와 커플링된 ED40 멀티모드 전기화학 검출기의 도움으로 검출한다.
상기 조건 하에서, PRP의 가수분해 도중 방출된 리비톨에 상응하는 크로마토그래피 피크는 19±5% 분에서 나타난다.
상기 눈금화 곡선(상기 크로마토그래피 피크의 표면적의 함수로서 리비톨의 양)을 상기 눈금화 시리즈로부터 확립시키고 이어서 상기 각 샘플 제제 중에 함유된 리비톨의 양을 보간법에 의해 측정한다. 각각의 샘플이 함유하는 PRP의 양을 상기에 이어서, 리비톨이 PRP 중량의 41%를 차지함을 알고 있는 각 콜로니 중의 PRP 농도로부터 추론한다.
2.5) 콜로니의 바이오매스의 측정
마이크로BCA 방법(Pierce)에 따라 측정된 각 콜로니의 단백질 함량은 각 콜로니의 바이오매스를 반영한다. 이를 위해서, 상기 콜로니를 개별적으로 수거하고 이어서 멸균 한외여과 수 200 ㎕에 용해시킨다. 상기 혼합물을 30 초 동안 와류기 상에서 교반한다. 샘플(10 ㎕ 내지 40 ㎕)을, 제조사의 권장사항에 따라 마이크로BAC 키트(Pierce)의 도움으로 단백질 분석을 수행하기 위해서 수거한다. 눈금화 시리즈를 소 알부민 혈청 100 ㎍/㎖로부터 제조한다. 상기 샘플 및 눈금화 시리즈를 562 ㎚에서 분광광도계 상에서 판독한다. 상기 샘플들의 단백질 농도(㎍/콜로니로 나타냄)를 상기 눈금화 시리즈의 도움으로 계산한다.
2.6) 결과
단백질 질량(㎍으로 나타냄)의 단위당 PRP의 ㎍으로 나타낸 결과를 하기 표에 기록한다.
목탄 아가 선택성 배지 A 선택성 배지 B
콜로 니 형태 불투명성 C1 0.030*
C2 0.031
C3 0.025
C4 0.024
회색 C1 0.000 N.D
C2 0.012 0.000
C3 0.018 0.000
C4 0.000 0.000
백색 C1 0.082 0.151
C2 0.079 0.078
C3 0.079 0.176
C4 0.122 0.150
*: 단백질 질량 단위(㎍)에 대해 나타낸 콜로니에 의해 생산된 PRP의 양(㎍)을 나타낸다. N.D.: 분석 안됨
상기 콜로니에 의한 PRP의 생산이 많을수록, 단백질 질량의 단위당 분석되는 PRP의 양이 많다. 상기 결과는 백색 콜로니에 의한 PRP의 생산이 목탄 아가로부터 수거된 콜로니의 생산보다 3 내지 5 배 더 많음을 보인다. 다른 한편으로, 회색 콜로니는 일반적으로 목탄 아가로부터 수거된 콜로니보다 더 적은 양의 PRP를 생산한다.
실시예 3: 액체 배지 중의 PRP 의 생산에 대한 선택성 고체 배지에 대한 배양 단계의 영향
2 개의 PRP의 제조 방법을 비교하였다. 첫 번째 방법에서, 모 집단으로 불리는 헤모필루스 인플루엔자에 b 형 세균 집단의 동결된 물질(∼108 세균/㎖)의 내용물을 본 발명에 따른 액체 배양 배지에 직접 접종한다. 상기 모 집단의 특징을 사전에 분석하였다(다음 단락 참조). 두 번째 프로토콜에서, 딸 집단을 100%의 캡슐화된 세균을 함유하는 백색 콜로니로부터 딸 집단을 선택할 수 있게 하는 본 발명에 따른 선택성 고체 배지를 사용하여 상기 모 집단으로부터 유도한다. 이어서 상기 딸 집단을 상기 모 집단과 동일한 배양 배지에 접종한다. 이어서 상기 모 집단 및 딸 집단에 의한 PRP의 생산을 측정하고 세 번째 단계에서 비교하였다.
3.1) 모 집단의 특징
3.1.1: cap 좌의 분석
3.1.1.1: 시약
세균 용해 완충제
-Pett IV 완충제: 10 mM 트리스-HCl pH 7.4, 1M NaCl
-1X 용해 용액: 6 mM 트리스-HCl pH 7.4, 1M NaCl, 10 mM EDTA, 0.5% Brij 5.8, 0.2% 사르코실, 5 ㎎/㎖의 라이소자임, 1 ㎍/㎖의 Rnase
-ESP 용액: 10 mM 트리스-HCl pH 7.4, 1 mM EDTA, 1% SDS, 1 ㎎/㎖의 프로테이나제
-TE 용액: 10 mM 트리스-HCl pH 7.4, 0.1 mM EDTA
효소적 절단
-SmaI: (GIBCO-BRL Ref:15228-018)
10X 절단 완충제 4: (GIBCO BRL, 효소와 함께 공급됨) - 사용 시 뉴클레아제가 없는 멸균 정제수로 10 배 희석됨
-KpnI: (INVITROGEN Ref:155232-036)
10X 절단 완충제 4: (INVITROGEN Ref:155232-036) - 사용 시 뉴클레아제가 없는 멸균 정제수로 10 배 희석됨
펄스화된 장 전기영동 완충제
10X TBE 완충제: 890 mM 트리스-HCl pH 7.4, 890 mM 붕산, 250 mM EDTA pH 8.0 - 사용 시 한외여과 수로 20 배 희석됨
디곡시제닌으로 표지된 PvuII 탐침:
특수 표지된 PvuII 탐침을 플라스미드 pBR322-pU038(소아과-옥스포드 대학- 존 래드클리프 병원)로부터 획득한 DNA 제제로부터 수득하였다. 20 ㎍의 플라스미드 DNA를 사전에 뉴클레아제가 없는 멸균 수 중에서 10 배 희석한 10X 완충제 4(NEBIOLABS Ref. #B7002-S) 중의 40 단위의 효소 pvuII(NEBIOLABS Ref. #R0151-S)의 존재 하에 37 ℃에서 2 시간 동안 절단하였다. 이어서 상기 절단 생성물에 대해 1X TAE 완충제(여기에 0.25% 부피/부피의 브로모페놀 블루, 0.25% 부피/부피의 자일렌 시아놀 FF, 및 30% 부피/부피의 글리세롤이 첨가되었다)의 존재 하에서 1% 중량/부피로 아가로스 젤 상에서 전기영동을 수행하였다. 상기 PvuII DNA 단편에 상응하는 2.1 kb의 관심 밴드를 상기 이동의 끝에서 수거한다. 이어서 DNA를 "뉴클레오스핀" 컬럼(Macherey-Nalgel Ref:740590.250)에 통과시킴으로써 상기 아가로스 젤로부터 추출하고 이어서 그의 완전성을 260 ㎚에서의 분광광도측정 판독에 의해 검사한다. 최종적으로, 상기 PvuII 탐침을, 표지화 키트 "DIG-Chem-Link 표지화 및 검출 세트"(ROCHE Ref:1836463)를 사용하여 디곡시제닌으로 표지한다. 상기 표지된 탐침을 -20 ℃에서 보관한다.
3.1.1.2: 실시 프로토콜
상기 모 집단의 앰풀을 해동하고 10%(v/v) 피브린 제거된 끓인 말 혈액(BioMerieux, ref 55832)이 보충된 목탄 아가(Difco, ref 289410)로 이루어진 표준 고체 배지를 함유하는 페트리 디쉬 상에 접종한다. 10% CO2를 함유하는 배양기에서 37 ℃에서 18 시간 동안 배양 후, 수득되는 콜로니를 수확하고 OD 680 ㎚가 ∼1.8이 되도록 Pett IV 완충제에 현탁한다. 상기 세균 현탁액을 50 ℃에서 조절된 저 융점 아가로스와 2%(v/v)(Ref: BioRad, ref 162-0138)로 부피 대 부피로 혼합하고, 이어서 상기 혼합물을 ∼80 ㎕/플러그의 양으로 플러그 금형(BioRad Ref: 170-3713)에 분배한다. 따라서 전체 미생물을 함유하는 아가로스 금형을 수득한다. 각각의 플러그를 1 ㎖의 1X 용해 용액 중에 넣는다. 37 ℃에서 6 시간 동안 배양 후, 상기 용액을 1 ㎖의 ESP 용액으로 대체한다. 50 ℃에서 추가로 밤새 배양 후, 각각의 플러그를 30 분간 4 ㎖의 TE 용액으로 3 회 세척한다. 이어서 각각의 플러그 중에 함유된 용해된 세균의 게놈 DNA를 25 ℃에서 300 ㎕의 1X 절단 완충제 4(GIBCO BRL)(20 단위의 효소 SmaI(GIBCO-BRL Ref:15228-018)를 함유한다)의 도움으로 밤새 절단하고 이어서 4 ㎖의 TE 용액으로 세척한다. 상기 절단을 30 ℃에서 20 단위의 효소 KpnI(INVITROGEN ref:155232-036)를 함유하는 200 ㎕의 1X 완충제 4(INVITROGEN Ref:155232-036)의 도움으로 7 시간 동안 계속한 다음 TE 용액으로 세척한다. 상기 2 개의 제한 효소는 상기 세균 게놈 DNA의 cap 좌를 유리시킨다. 상기 절단된 플러그를 공인된 아가로스 젤에 0.8% v/v(BIORAD ref:162-0138)로 삽입하고 이어서, 6 볼트/㎝, 120°의 각, 직선 진행, 0.9s의 초기 개폐 시간 및 11.54 초의 최종 개폐 시간이 적용되도록 지정된 "셰프-맵퍼(Chef-mapper)" 유형(Biorad)의 장치를 사용하여, 0.5X TBE 완충제에서 13 시간 동안 수행된 펄스화된 장 전기영동을 수행한다. 상기 젤을 제조사의 권장사항에 따라 장치 "배큐진(Vacugene) XL 진공 블럿팅 시스템"(Pharmacia)의 도움으로 반건조 운반에 의해 양으로 하전된 나일론 필터(Roche Ref:1209272)로 옮긴다. 상기 나일론 필터 상으로 운반된 DNA를 312 ㎚에서 3 분간 UV로 고정시킨다. 이어서 상기 필터를 "DIG 이지 하이브(easy hyb)" 완충제(Roche ref: 1585738) 중에서 42 ℃에서 2 시간 동안 예비하이브리드화하고, 이어서 디곡시제닌/완충제 ㎖로 표지한 20 내지 50 ng의 특수 PvuII 탐침을 함유하는 "DIG 이지 하이브" 완충제 중에서 42 ℃에서 밤새 하이브리드화한다. 상기 탐침은 헤모필루스 인플루엔자에 b 혈청형 cap 좌를 특이적으로 인식한다. 이어서 상기 필터를 65 ℃에서 저 "엄격성" 완충제의 도움으로 2 회 세척한 다음 고 "엄격성" 완충제로 세척한다. 이어서 상기 필터를, 키트 "Dig-Chem-link 표지화 및 검출 세트"(Roche)를 사용하여 알칼리성 포스파타제-표지된 안티디곡시제닌 항체 용액을 가한 후에 발광 기질(ODP - star: Roche Ref:2041677)의 도움으로 가시화한다. 획득된 전기영동 프로파일을 도 3에 나타낸다. 18 kb 및 45 kb의 2 개의 밴드가 관찰되며, 이는 상기 모 집단의 cap 좌의 구조가 이종임을 가리킨다. 상기 집단의 일부는 45 kb의 전기영동 밴드에 상응하는 18 kb 유전자의 2 개의 사본을 함유하는 cap 좌를 갖는 반면, 다른 부분은 18 kb의 전기영동 밴드에 상응하는, 중복되지 않은 형태의 cap 좌를 갖는다. 결과적으로, 상기 모 집단은 캡슐화 및 비 캡슐화된 세균의 혼합물이다. 이러한 이종성은 더욱 또한, 상기 모 집단을 선택성 고체 배지 상에 접종한 후 수득된 백색 콜로니의 퍼센트를 측정하기 위한 시험을 사용하여 확인된다(실시예 2 참조).
3.2) 선택성 고체 배지 상에서의 모 집단의 배양: 선택성 고체 배지 상에서 백색 콜로니를 형성하고 캡슐화된 세균으로 필수적으로 이루어진 딸 집단으로부터 유래하는 세균 퍼센트의 측정.
3.2.1) 백색 콜로니를 형성하는 세균 퍼센트의 측정
획득된 콜로니의 선택성 고체 배지 상에서의 배양 및 형태학적 분석 단계를 실시예 2에 개시된 동일한 실시 조건에 따라 수행한다. 상기 선택성 고체 배지의 조성은 실시예 2의 선택성 배지 A의 조성에 상응한다.
가시화된 100 개의 콜로니 당 백색 콜로니의 수를 측정한다. 상기 콜로니의 60%가 백색 콜로니의 형태이며, 이는 실제로 상기 초기 모 집단이 이종이고 캡슐화 및 비 캡슐화된 세균의 혼합물을 함유함을 입증한다.
3.2.2) 딸 집단의 선택 및 특성화
3.2.2.1) 딸 집단의 선택
상기 선택성 고체 배지 A 상에서 18 내지 24 시간 배양 후 획득된 백색 콜로니를 박토 아가가 없는 선택성 고체 배지와 동일한 액체 배지의 조성물 2 ㎖을 함유하는 튜브에 접종한다. 진탕하면서, 37 ℃에서 추가로 20 시간 배양 후에, 상기 튜브의 내용물을, 리터당 조성이 하기와 같은 본 발명에 따른 액체 배지 50 ㎖을 함유하는 삼각 플라스크로 옮긴다:
β-NAD: 5 mg
프로토포르피린 IX: 1　mg
글루코스: 20　g
효모 추출물: 5　g
완두콩 펩톤 (Hypea 7404 (Quest)):7.42　g
60% 수용액 중의 나트륨 락테이트: 1.49　ml
시스틴: 0.07　g
트립토판: 0.02　g
Na2HPO4·12H2O: 31.14　g
NaH2PO4·2H2O: 2.03　g
(NH4)2SO4: 1　g
MgSO4·7H2O: 0.4　g
CaCl2·2H2O: 0.02　g
상기 삼각 플라스크를 진탕하면서 37 ℃에서 배양기에 넣는다. 600 ㎚에서 OD가 2에 근접할 때, 글리세롤을 상기 세균 현탁액 중의 그의 최종 농도가 20%(v/v)가 되도록 하는 부피로 첨가한다. 상기 세균 현탁액을 Nunc 튜브에 1 ㎖로 분배한 후에 -70 ℃에서 동결시킨다. 따라서 딸 세균 집단이, 선택성 고체 배지의 조성물 상에서 획득된 백색 콜로니로부터 생산되고 모 집단의 세균으로부터 유래된 동결된 물질의 형태로 유도되었다.
3.2.2.2) 딸 세균 집단의 특성화
상기 딸 집단의 cap 좌의 분석을 단락 3.1.1.2에 개시된 프로토콜에 따라 수행하였다. 상기 전기영동 프로파일은 45 kb의 단일 밴드를 보이며, 이는 상기 딸 집단의 cap 좌가 필수적으로 18 kb 유전자의 중복된 형태임을 가리킨다(도 3 비교). 결과적으로, 상기 딸 세균 집단은 캡슐화된 세균으로 필수적으로 이루어진다. 상기 집단의 동종성은 상기 집단이 선택성 고체 배지 상에 접종될 때 100%의 백색 콜로니를 또한 생산한다는 사실에 의해 확인되었다.
3.3) 모 집단 및 딸 집단의 세균에 의한 PRP의 생산의 비교
모 집단 또는 딸 집단으로부터 수득된 ∼1010 세균을 함유하는 앰풀의 내용물을, 단락 3.2.2.1에 나타낸 바와 같은 조성을 갖는 액체 배지 200 ㎖을 함유하는 삼각 플라스크에 직접 접종한다.
진탕(175 rpm)하면서 37 ℃ +/- 1 ℃에서 24 시간 배양 후에, 상기 배양 상등액을 수거하고, 이어서 PRP 농도를 실시예 1에 개시된 방법에 따른 ELISA에 의해 측정한다. 동일한 시험을 3 회 반복한다. 결과를 하기 표에 나타낸다. 지시된 값들은 3 회 시험의 평균값을 나타낸다.
시험 1 시험 2 시험 3
동결된 모 물질 이종 집단 145* 185 116
동결된 딸 물질 캡슐화된 세균의 동종 집단 402 447 429
*: ㎎/ℓ로 나타낸 결과
결론:
캡슐화된 세균의 동종 집단으로 이루어진 딸 집단에 의한 PRP의 생산은 ∼3의 인자까지 개선된다. 결과적으로, 100%의 캡슐화된 세균을 함유하는 백색 콜로니를 선택할 수 있게 하는 선택성 고체 배지의 단계 배양을 사용하는 방법은 획득되는 PRP 수율을 개선시킨다. 상기 방법을 또한 캡슐화 및 비 캡슐화 세균의 혼합물을 함유하는 초기 집단으로부터 전적으로 캡슐화된 세균의 집단을 구성하는데 사용할 수 있다.
실시예 4: 세균 집단 및 PRP 의 생산에 대한 안정화 배양 배지의 역할
출발 세균 집단은 18 kb 유전자의 2 개 이상의 사본을 함유하는 cap 좌를 갖고 선택성 고체 배지 상에 100%의 백색 콜로니를 생산하는 전적으로 캡슐화된 세균 집단으로 이루어진다.
4.1) 실시 프로토콜
단락 3.2.2.1의 실시 프로토콜에 따라 선택된 딸 집단으로부터 획득된 108 내지 1010 세균/㎖을 함유하는 동결된 물질의 내용물을 단락 3.2.2.1에 나타낸 조성을 갖는 액체 배지 500 ㎖을 함유하는 1 리터 발효기에 접종한다. 진탕하면서, 37 ℃에서 14 시간 동안 배양 후에, 첫 번째 배양물의 부피를, 초기 OD가 0.3과 같도록 동일한 액체 배지 500 ㎖을 함유하는 두 번째 1 리터 발효기로 옮겼다. 동일한 조건 하에서(4 부근에서 획득된 OD 값) ∼5 시간의 추가의 배양 후에, 두 번째 배양물의 부피를, 초기 OD가 0.3과 같도록 배지 500 ㎖을 함유하는 세 번째 1 리터 발효기로 옮기고, 이어서 ∼3 시간 동안 배양 후에(4 부근에서 획득된 OD 값), 상기 부피를 동일한 액체 배지 500 ㎖을 함유하는 네 번째 1 리터 발효기에 부었다. 상기 실시 프로토콜은 13 000 리터의 발효기에서 PRP의 산업적인 생산을 위해 통상적으로 수행되는 실험실 규모의 단계들에 적합하다.
세균 세대의 수를 통상적인 식 N = Log X/X0 x 1/Log2(여기에서 X는 배양의 끝에서 바이오매스를 나타내고 X0는 배양 출발시의 바이오매스를 나타낸다)를 사용하여 각 배양의 끝에서 산정한다. 실제로 1 리터 발효기에서 네 번째 배양의 끝에서 획득된 누적 세균 세대 수는 13 000 리터 발효기에서 상기 배양의 끝에서 획득된 세균 세대 수에 상응한다. 각 배양의 끝에서, cap 좌가 특성화되었으며 선택성 고체 배지 상에 백색 콜로니를 형성하는 세균의 퍼센트를 실시예 3에 개시된 방법에 따라 측정하였다. 획득된 결과를 하기 표에 함께 모았다.
초기 집단 배양물 1 배양물 2 배양물 3 배양물 4
세대 수 11.46 3.69 3.75 5.19
cap 좌 전기영동 중 가시적인 중복되지 않은 형태가 없다 전기영동 중 가시적인 중복되지 않은 형태가 없다 전기영동 중 가시적인 중복되지 않은 형태가 없다 전기영동 중 가시적인 중복되지 않은 형태가 없다 전기영동 중 가시적인 중복되지 않은 형태가 없다
백색 콜로니의 % 100 97 98 99 100
PRP (mg/ℓ) 842 904 719 782
네 번째 배양의 끝에서 누적 세대 수는 24.09 세대이다.
상기 연속적인 배양은 세균 집단의 특징을 변경시키지 않으며, 상기 집단은 상기 연속적인 배양 중에 전적으로 캡슐화된 채로 남아있는다. PRP의 생산은 또한 상기 배양 전체를 통해 매우 높은 수준으로 안정하게 남아있는다. 따라서 상기 배지의 조성물은 상기 세균 집단의 특징을 상기 배양 중에 감지할 정도로 변화시키지 않으므로 상기 캡슐화된 세균 집단에 대해 안정화 역할을 발휘한다.

Claims (23)

  1. 헤모필루스 인플루엔자에(Haemophilus influenzae) b 혈청형의 배양을 위한 배지로서, 단백질 질소의 공급원이 비 동물 기원의 것이고 하나 이상의 식물 펩톤을 포함하며 헴 공급원이 프로토포르피린 IX로 이루어진 것을 특징으로 하는 배지.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 프로토포르피린 IX 농도가 0.01 ㎎/ℓ 이상인 배지.
  3. 제 2 항에 있어서,
    상기 프로토포르피린 IX 농도가 0.1 ㎎/ℓ 내지 5 ㎎/ℓ인 배지.
  4. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 식물 펩톤이 밀 펩톤인 배지.
  5. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 식물 펩톤이 완두콩 펩톤인 배지.
  6. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 배양 배지 중의 총 식물 펩톤 농도가 0.08 g/ℓ 내지 2.25 g/ℓ의 단백질 질소 농도와 같은 배지.
  7. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서,
    동물 기원의 어떠한 오염물질도 없는 배지.
  8. 제 5 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서,
    - 0.1 mg/ℓ 내지 5 mg/ℓ의 프로토포르피린 IX,
    - 2 내지 50 mg/ℓ의 β-NAD,
    - 2 내지 20 g/ℓ의 글루코스,
    - 2 내지 5 g/ℓ의 효모 추출물,
    - 0.4　g/ℓ 내지 1.5 g/ℓ의 단백질 질소 농도와 동등한 완두콩 펩톤, 및
    - 배지의 pH가 6.5 내지 7.5, 바람직하게는 7.0 내지 7.5 가 되도록, 염 용액의 형태로 Na+, NH4 +, Ca++, Mg++, HPO4 --, H2PO4 -, SO4 - - 및 Cl- 이온을 포함하는 무기 이온들의 칵테일
    을 포함하는 액체 배양 배지.
  9. 폴리리보실 리비톨 포스페이트(PRP)의 제조 방법으로서,
    (i) 헤모필루스 인플루엔자에 b 혈청형을 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 청구된 바와 같은 액체 배양 배지에서 배양하고,
    (ii) (i)에서 수득된 배양 상등액을 수거하고,
    (iii) 상기 배양 상등액으로부터 PRP를 추출하는
    방법.
  10. 폴리리보실 리비톨 포스페이트(PRP)의 제조 방법으로서,
    (i) 헤모필루스 인플루엔자에 b 혈청형을 고체 배양 배지 상에서 배양하고,
    (ii) (i)에서 수득된 하나 이상의 콜로니를 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 청구된 바와 같은 액체 배양 배지로 옮기고 여기에서 배양하고,
    (iii) (ii)에서 수득된 배양 상등액을 수거하고,
    (iv) 상기 배양 상등액으로부터 PRP를 추출하는
    방법.
  11. 제 10 항에 있어서,
    상기 고체 배양 배지의 단백질 질소의 공급원이 비 동물 기원의 것이고 하나 이상의 식물 펩톤을 포함하는 방법.
  12. 제 11 항에 있어서,
    상기 식물 펩톤이 완두콩 펩톤인 방법.
  13. 제 11 항 또는 제 12 항에 있어서,
    상기 헴 공급원이 프로토포르피린 IX로 이루어진 방법.
  14. 제 10 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 고체 배지가
    -1 ㎎/ℓ 이상의 β-NAD,
    -0.5 ㎎/ℓ 이상의 프로토포르피린 IX,
    -상기 고체 배지 중의 단백질 질소 농도가 0.2 g/ℓ 이상이 되기에 충분한 양, 및 상기 배지 중의 식물 단백질의 양과 효모 추출물의 양 사이의 비가, 상기 배지의 단백질 질소의 농도가 0.2 g/ℓ 내지 0.8 g/ℓ인 경우 0.1 내지 9이고 상기 배지의 단백질 질소의 농도가 >0.8 g/ℓ인 경우 1 내지 9가 되도록 하는 비율의 하나 이상의 식물 펩톤 및 효모 추출물,
    -탄수화물,
    -해독제, 및
    -배양 배지의 pH가 6.5 내지 7.5, 바람직하게는 7.0 내지 7.5가 되도록, 염 용액의 형태로 Na+, K+, Ca++, Mg++, Fe+++, HPO4 --, H2PO4 -, SO4 -- 및 Cl- 이온을 포함하는 무기 이온들의 칵테일
    을 포함하는 방법.
  15. 제 14 항에 있어서,
    상기 고체 배지가
    -5 내지 50 mg/ℓ의 β-NAD,
    -0.5 내지 5 mg/ℓ의 프로토포르피린 IX,
    -1 내지 10 g/ℓ의 글루코스,
    -1 내지 10 mg/ℓ의 트윈 80,
    -3 내지 4 g/ℓ의 K2HPO4,
    -0.9 내지 3 g/ℓ의 KH2PO4,
    -0.5 내지 2 g/㎖의 K2SO4,
    -20 내지 500 mg/ℓ의 MgCl2,
    -2 내지 50 mg/ℓ의 CaCl2·2H2O,
    -1 내지 5 mg/ℓ의 FeCl3·6H2O,
    -4 내지 8 g/ℓ의 NaCl,
    -4 내지 8 g/ℓ의 효모 추출물, 및
    -4 내지 8 g/ℓ의, 상기 배지의 단백질 질소 농도가 >0.8 g/ℓ인 경우 완두콩 펩톤의 양과 효모 추출물의 양 사이의 비가 ≥ 1이 되도록 하는 완두콩 펩톤
    을 포함하는 방법.
  16. 제 14 항 또는 제 15 항에 있어서,
    오직 백색 콜로니만을 상기 액체 배양 배지로 옮기는 방법.
  17. 제 10 항 내지 제 16 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 고체 배양 배지 및 액체 배양 배지가 동물 기원의 어떠한 오염물질도 없는 방법.
  18. 전적으로 캡슐화된 헤모필루스 인플루엔자에 b 혈청형 세균의 집단을 제조하기 위한 방법으로서,
    -(i) 헤모필루스 인플루엔자에 b 혈청형을
    -5 내지 50 mg/ℓ의 β-NAD,
    -0.5 내지 5 mg/ℓ의 프로토포르피린 IX,
    -1 내지 10 g/ℓ의 글루코스,
    -1 내지 10 mg/ℓ의 트윈 80,
    -3 내지 4 g/ℓ의 K2HPO4,
    -0.9 내지 3 g/ℓ의 KH2PO4,
    -0.5 내지 2 g/ℓ의 K2SO4,
    -20 내지 500 mg/ℓ의 MgCl2,
    -2 내지 50 mg/ℓ의 CaCl2·2H2O,
    -1 내지 5 mg/ℓ의 FeCl3·6H2O,
    -4 내지 8 g/ℓ의 NaCl,
    -4 내지 8 g/ℓ의 효모 추출물, 및
    -4 내지 8 g/ℓ의, 상기 배지의 단백질 질소 농도가 >0.8 g/ℓ인 경우 완두콩 펩톤의 양과 효모 추출물의 양 사이의 비가 ≥ 1이 되도록 하는 완두콩 펩톤
    을 포함하는 고체 배지 상에서 배양하고;
    (ii) (i)에서 수득된 하나 이상의 백색 콜로니를
    -0.1 ㎎/ℓ 내지 5 ㎎/ℓ의 프로토포르피린 IX,
    -2 내지 50 ㎎/ℓ의 β-NAD,
    -2 내지 20 g/ℓ의 글루코스,
    -2 내지 5 g/ℓ의 효모 추출물,
    -0.4 g/ℓ 내지 1.5 g/ℓ의 단백질 질소 농도와 동등한 완두콩 펩톤, 및
    -배지의 pH가 6.5 내지 7.5, 바람직하게는 7.0 내지 7.5가 되도록, 염 용액의 형태로 Na+, NH4 +, Ca++, Mg++, HPO4 --, H2PO4 -, SO4 -- 및 Cl- 이온을 포함하는 무기 이온들의 칵테일
    을 포함하는 액체 배양 배지로 옮기고 여기에서 배양하며;
    (iii) (ii)에서 수득된 세균 집단을 동결시키거나 동결 건조시키는
    방법.
  19. 제 18 항에 있어서,
    상기 모든 단계를 동물 기원의 어떠한 오염물질도 없는 배지를 사용하여 수행하는 방법.
  20. PRP의 제조를 위한, 제 18 항 또는 제 19 항의 방법에 따라 수득된 집단의 용도.
  21. 제 10 항 내지 제 19 항 중 어느 한 항의 방법에 따라 수득된 PRP를 포함하는, 헤모필루스 인플루엔자에 b 형 수막염에 대한 백신.
  22. 헤모필루스 인플루엔자에 b 혈청형을 위한 고체 배양 배지로서, 상기 배지의 단백질 질소의 공급원이 비 동물 기원의 것이고 상기 배지가
    -1 ㎎/ℓ 이상의 β-NAD,
    -0.5 ㎎/ℓ 이상의 프로토포르피린 IX,
    -상기 배지 중의 단백질 질소 농도가 0.2 g/ℓ 이상이 되기에 충분한 양, 및 상기 배지 중의 식물 펩톤의 양과 효모 추출물의 양 사이의 비가, 상기 배지의 단백질 질소 농도가 0.2 g/ℓ 내지 0.8 g/ℓ인 경우 0.1 내지 9이고 상기 배지의 단백질 질소 농도가 >0.8 g/ℓ인 경우 1 내지 9가 되도록 하는 비율의 식물 펩톤 및 효모 추출물,
    -탄수화물,
    -해독제, 및
    -상기 배지의 pH가 6.5 내지 7.5, 바람직하게는 7 내지 7.5가 되도록, 염 용액의 형태로 Na+, K+, Ca++, Mg++, Fe+++, HPO4 --, H2PO4 -, SO4 -- 및 Cl- 를 포함하는 무기 이온들의 칵테일
    을 포함하는 고체 배지.
  23. 제 22 항에 있어서,
    -5 내지 50 mg/ℓ의 β-NAD,
    -0.5 내지 5 mg/ℓ의 프로토포르피린 IX,
    -1 내지 10 g/ℓ의 글루코스,
    -1 내지 10 mg/ℓ의 트윈 80,
    -3 내지 4 g/ℓ의 K2HPO4,
    -0.9 내지 3 g/ℓ의 KH2PO4,
    -0.5 내지 2 g/ℓ의 K2SO4,
    -20 내지 500 mg/ℓ의 MgCl2,
    -2 내지 50 mg/ℓ의 CaCl2·2H2O,
    -1 내지 5 mg/ℓ의 FeCl3·6H2O,
    -4 내지 8 g/ℓ의 NaCl,
    -4 내지 8 g/ℓ의 효모 추출물, 및
    -4 내지 8 g/ℓ의, 상기 배지의 단백질 질소 농도가 >0.8 g/ℓ인 경우 완두콩 펩톤의 양과 효모 추출물의 양 사이의 비가 ≥ 1이 되도록 하는 완두콩 펩톤
    을 포함하는 고체 배지.
KR1020107001212A 2007-07-10 2008-07-01 헤모필루스 인플루엔자에 비 형을 위한 배양 배지 KR101545641B1 (ko)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
FR0756371A FR2918671B1 (fr) 2007-07-10 2007-07-10 Milieu de culture d'haemophilus influenzae type b.
FR0756371 2007-07-10

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20100049546A true KR20100049546A (ko) 2010-05-12
KR101545641B1 KR101545641B1 (ko) 2015-08-21

Family

ID=39027590

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020107001212A KR101545641B1 (ko) 2007-07-10 2008-07-01 헤모필루스 인플루엔자에 비 형을 위한 배양 배지

Country Status (14)

Country Link
US (1) US8673617B2 (ko)
EP (1) EP2167639B1 (ko)
JP (1) JP5611822B2 (ko)
KR (1) KR101545641B1 (ko)
CN (1) CN101688174B (ko)
AR (1) AR067131A1 (ko)
AU (1) AU2008273968B2 (ko)
BR (1) BRPI0814217A2 (ko)
CA (1) CA2693101A1 (ko)
FR (1) FR2918671B1 (ko)
IL (1) IL202495A (ko)
MX (1) MX2009013634A (ko)
WO (1) WO2009007641A2 (ko)
ZA (1) ZA200908450B (ko)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20150036311A (ko) * 2012-07-02 2015-04-07 사노피 파스퇴르 헤모필루스 인플루엔자에 비형 항원의 생산 방법

Families Citing this family (19)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2543281C2 (ru) 2009-03-11 2015-02-27 Акцо Нобель Н.В. Состав гербицида, содержащий глифосат и алкоксилированные глицериды (варианты) и способ борьбы с нежелательной растительностью
PT105484A (pt) 2011-01-14 2012-07-16 Univ Nova De Lisboa Um método de ambientómica funcional para engenharia de meio de cultura celular
CN104487086B (zh) * 2012-07-07 2019-08-30 巴拉特生物技术国际有限公司 无动物源的不含酒精的疫苗组合物及其制备方法
WO2014200658A1 (en) 2013-06-13 2014-12-18 Danisco Us Inc. Alpha-amylase from promicromonospora vindobonensis
WO2014200657A1 (en) 2013-06-13 2014-12-18 Danisco Us Inc. Alpha-amylase from streptomyces xiamenensis
WO2014200656A1 (en) 2013-06-13 2014-12-18 Danisco Us Inc. Alpha-amylase from streptomyces umbrinus
WO2014204596A1 (en) 2013-06-17 2014-12-24 Danisco Us Inc. Alpha-amylase from bacillaceae family member
WO2015050724A1 (en) 2013-10-03 2015-04-09 Danisco Us Inc. Alpha-amylases from a subset of exiguobacterium, and methods of use, thereof
DK3060659T3 (da) 2013-10-03 2019-09-09 Danisco Us Inc Alfa-amylaser fra exiguobacterium og fremgangsmåder til anvendelse deraf
EP3071691B1 (en) 2013-11-20 2019-10-23 Danisco US Inc. Variant alpha-amylases having reduced susceptibility to protease cleavage, and methods of use, thereof
KR101723167B1 (ko) * 2015-04-28 2017-04-05 주식회사 대웅 보툴리눔 독소의 제조를 위한 배지 조성물
KR101729251B1 (ko) * 2015-04-28 2017-04-21 주식회사 대웅 보툴리눔 독소의 제조를 위한 배지 조성물
KR101723168B1 (ko) * 2015-04-28 2017-04-05 주식회사 대웅 보툴리눔 독소의 제조를 위한 배지 조성물
CN105199998B (zh) * 2015-11-04 2016-06-29 长春长生生物科技有限责任公司 Hib综合培养基、b型流感嗜血杆菌结合疫苗及其制备方法
WO2017173324A2 (en) 2016-04-01 2017-10-05 Danisco Us Inc. Alpha-amylases, compositions & methods
WO2017173190A2 (en) 2016-04-01 2017-10-05 Danisco Us Inc. Alpha-amylases, compositions & methods
PL244159B1 (pl) 2018-12-17 2023-12-11 Univ Gdanski Odczynnik do ochrony bakterii podczas liofilizacji i zastosowanie odczynnika do ochrony bakteryjnych szczepów probiotycznych podczas liofilizacji
EP4065689A1 (en) * 2019-11-27 2022-10-05 Evelo Biosciences, Inc. Methods and compositions for culturing hemoglobin-dependent bacteria
CN110747148A (zh) * 2019-12-02 2020-02-04 天津瑞普生物技术股份有限公司 一种副鸡禽杆菌培养基的制备方法

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4459286A (en) * 1983-01-31 1984-07-10 Merck & Co., Inc. Coupled H. influenzae type B vaccine
NZ240659A (en) 1990-12-06 1995-07-26 Becton Dickinson Co Supplements to blood cultures to render them suitable for fastidious bacteria
WO1993004183A1 (en) 1991-08-16 1993-03-04 Merck & Co., Inc. Process for converting lipid-containing bacterial capsular polysaccharide into lipid-free polysaccharide
US5371197A (en) * 1991-09-24 1994-12-06 Merck & Co., Inc. Protein-dimeric polysaccharide conjugate vaccine
EP0833662B2 (en) * 1995-06-23 2011-01-26 SmithKline Beecham Biologicals S.A. A vaccine composition comprsing a Haemophilus influenzae B polysaccharide conjugate antigen adsorbed onto aluminium phosphate
US20040087020A1 (en) 1997-05-28 2004-05-06 Chiron S.P.A. Culture medium with yeast or soy bean extract as amino acid source and no protein complexes of animal origin
EP2267113B1 (en) 1997-05-28 2013-07-17 Novartis AG Culture medium for Neisseria meningitidis with soy bean extract as amino acid source and no protein complexes of animal origin
FR2782093B1 (fr) 1998-07-24 2002-02-08 Agronomique Inst Nat Rech Procede de preparation de cultures de bacteries lactiques
CN1709505B (zh) * 2005-07-13 2010-06-16 北京绿竹生物制药有限公司 多价细菌荚膜多糖-蛋白质结合物联合疫苗

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20150036311A (ko) * 2012-07-02 2015-04-07 사노피 파스퇴르 헤모필루스 인플루엔자에 비형 항원의 생산 방법

Also Published As

Publication number Publication date
CN101688174A (zh) 2010-03-31
CA2693101A1 (en) 2009-01-15
AU2008273968B2 (en) 2014-04-24
CN101688174B (zh) 2015-07-29
JP2010532985A (ja) 2010-10-21
AU2008273968A1 (en) 2009-01-15
FR2918671B1 (fr) 2010-10-15
WO2009007641A3 (fr) 2009-02-26
EP2167639A2 (fr) 2010-03-31
AR067131A1 (es) 2009-09-30
WO2009007641A2 (fr) 2009-01-15
JP5611822B2 (ja) 2014-10-22
US20090017074A1 (en) 2009-01-15
FR2918671A1 (fr) 2009-01-16
WO2009007641A8 (fr) 2009-11-05
ZA200908450B (en) 2011-02-23
MX2009013634A (es) 2010-01-26
EP2167639B1 (fr) 2016-08-17
KR101545641B1 (ko) 2015-08-21
BRPI0814217A2 (pt) 2014-10-21
IL202495A0 (en) 2011-08-01
IL202495A (en) 2014-01-30
US8673617B2 (en) 2014-03-18

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR101545641B1 (ko) 헤모필루스 인플루엔자에 비 형을 위한 배양 배지
Nam et al. Native-feather degradation by Fervidobacterium islandicum AW-1, a newly isolated keratinase-producing thermophilic anaerobe
Das et al. Isolation, purification & mass production of protease enzyme from Bacillus subtilis
Hoshino et al. Isolation of a Pseudomonas species from fish intestine that produces a protease active at low temperature
US6558926B1 (en) Method for production of tetanus toxin using media substantially free of animal products
Ionata et al. A novel keratinase from Clostridium sporogenes bv. pennavorans bv. nov., a thermotolerant organism isolated from solfataric muds
KR102222953B1 (ko) 난배양성 혐기성 미생물의 고수율 배양을 위한 배지 보충제 및 그를 포함하는 배지 조성물
CN104011220A (zh) 停乳链球菌id9103以及使用其的透明质酸生产方法
BG98875A (en) Strain monascus purpureus 94-25, producent of pigment and accompanying products
Sanchez-Rosario et al. Media matters, examining historical and modern Streptococcus pneumoniae growth media and the experiments they affect
CN107557314B (zh) 产蛋白酶菌株ls20-2-2及其产低温蛋白酶的方法
KR960014702B1 (ko) 산성 우레아제 및 그의 제조방법
Cortezi et al. Temperature effect on dextransucrase production by Leuconostoc mesenteroides FT 045 B isolated from Alcohol and Sugar Mill Plant
Wang et al. Purification and characterization of chitinase from a new species strain, Pseudomonas sp. TKU008
JP2886547B2 (ja) ノイラミニダーゼの製造法
North A bacterial factor induces changes in cysteine proteinase forms in the cellular slime mould Dictyostelium discoideum
Mahesh et al. Optimization for the production of extracellular alkaline phosphatase from Proteus mirabilis
Varbanets et al. Marine actinobacteria–producers of enzymes with Α-l-rhamnosidase activity
CA1086670A (en) .beta.-GALACTOSIDASE
US20060051336A1 (en) Bacteriolytic complex, method of its production, and strain for realization of the method
Padma et al. Isolation, screening, and selection of an L-glutaminase producer from soil and media optimization using a statistical approach
Dissanayaka et al. Effect of temperature, pH, carbon and nitrogen sources on extracellular protease production by four Geobacillus species isolated from Maha Oya geothermal springs in Sri Lanka
Ghaffar et al. Production and characterization of streptokinase enzyme by using Streptococcus mutans strain in liquid state fermentation through corn steep liquor (CSL) substrate
EP0771868A1 (en) Novel deaminoneuraminidase and process for producing the same
CN116004397B (zh) 一种可表达乳糖酶与蛋白酶的青霉菌株及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
AMND Amendment
E601 Decision to refuse application
AMND Amendment
J201 Request for trial against refusal decision
E902 Notification of reason for refusal
B701 Decision to grant
GRNT Written decision to grant
FPAY Annual fee payment

Payment date: 20180718

Year of fee payment: 4