KR20080098600A - 고체-유체 조성물 - Google Patents

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KR20080098600A
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Abstract

정연한 유체 분자의 인벨롭에 의해 둘러싸인 나노미터 크기의 코어 물질을 포함하는 나노구조가 개시된다. 코어 물질 및 정연한 유체 분자의 인벨롭은 정상의 물리적 상태로 존재한다. 액체 및 나노구조를 포함하는 액체 조성물이 또한 개시된다.

Description

고체-유체 조성물{SOLID-FLUID COMPOSITION}
본 발명은 고체-유체 조성물, 더욱 바람직하게는 다수의 특징적인 물리적, 화학적 및 생물학적 특징이 있는 나노구조 및 이러한 나노구조를 가진 액체 조성물에 관한 것이다.
나노과학(Nanoscience)은 미세한 입자 물질의 과학이자 현대 과학에 있어서 가장 중요한 첨단 연구의 과학이다. 물질을 구성하는 입자가 나노스케일(nanoscopic)이 될 경우, 그의 융점, 및 그의 전자 및 광학 성질과 같은 물질의 모든 특성이 변하기 때문에, 이들 미세한 입자는 기초적 관점으로부터 관심의 대상이다. 새로운 특성은 기술적 및 상업적 발전을 위한 새로운 기회를 제공하며, 나노 입자의 응용예가 마이크로- 및 나노일렉트로닉(nanoelectronics), 나노 유체공학(nanofluidics), 코팅(coatings) 및 페인트(paints), 및 생명공학과 같이 다양한 영역에 제시 또는 제안되어 있다.
예를 들어, 마이크로 일렉트로 메카니컬 시스템(Micro Electro Mechanical Systems, MEMS)으로서 일반적으로 알려진, 전기적, 기계적 및/또는 광학적/전자광학적 부품을 결합하는 집적 마이크로 장치 또는 시스템을 개발하는 방향으로 현재 상당한 공업적 및 학문적 노력이 이루어지고 있다. MEMS는 집적 회로 배치 프로세 싱 기술을 사용하여 제작되며, 그의 크기 범위는 마이크로미터 내지 밀리미터일 수 있다. 이들 시스템은 마이크로 스케일에서 감지, 조절 및 작용할 수 있고, 마크로 스케일에서 영향을 발생하도록 개별 또는 배열(in array)로 작용할 수 있다.
생명공학 영역에서, 나노 입자는 생체 분자(biological molecule)의 실공간 구조 및 기능을 탐구하기 위한 나노미터 스케일의 장비에 자주 사용된다. 칼슘 알기네이트 나노스피어(nanosphere)와 같은 보조(auxiliary) 나노 입자는 또한 유전자 전달감염(gene transfection) 프로토콜을 개선시키기 위해 사용되었다.
금속 나노 입자에서, 입자 플라즈몬(particle plasmon)으로서 또한 알려진 전도 전자(conduction electron)의 공명 집단 진동(resonant collective oscillation)은 광장(optical field)에 의해 여기된다. 입자 플라즈몬의 공명 주파수는 주위 매질(surrounding medium)인 금속의 유전 함수에 의해 및 입자의 형태에 의해 주로 결정된다. 공명은 금속 입자의 표면 위에 및 그에 가깝게 한정된 로컬 필드의 향상 및 좁은 분광적 선택 흡수로 이르게 한다. 레이저 파장이 입자의 플라즈몬 공명 주파수에 맞추어 질 때, 나노 입자에 근접한 로컬 전장(local electric field)은 월등하게 향상될 수 있다.
따라서, 나노 입자는 예를 들어 생체 조직 시료에서 개별 분자의 확인을 위해 전통적인 형광표지(fluorescent labeling)와 유사한 방식으로 세포 또는 분자에 근접하여 전자기 조사선을 흡수하거나 그의 초점을 다시 맞추기 위해 사용된다.
또한, 적색단 스펙트럼의 전자기 조사선을 반사하면서 가시 범위의 전자기 조사선을 선택적으로 흡수하기 위해 갈륨 셀레나이드(gallium selenide) 나노 입자 가 사용되는 솔라 에너지 변환(solar energy conversion) 영역에서 나노 입자의 특별한 조사선 흡수 특징이 이용되기 때문에, 이로써 변환 효율을 상당히 증가시킬 수 있다.
나노과학이 작용할 수 있는 추가의 영역은 열전달과 관련이 있다. 공업적인 열전달 요건에 초점을 둔 많은 이전의 연구 및 개발에도 불구하고, 종래 유체의 열전달 특성에 있어서 기본적 제한점 때문에 냉각능의 주요 개선이 억제되었다. 고체 형태의 물질이 유체보다 월등하게 큰 열전도성을 가진 것으로 알려져 있다. 따라서, 현탁된 고체 입자를 함유하는 유체는 통상의 열전달 유체에 비해 상당히 향상된 열전도성을 나타낼 것으로 기대된다.
낮은 열전도성은 다수의 공업적 응용예에 필요한 에너지-효율 열전달 유체의 개발에 있어서 주된 제한점이다. 이러한 제한점을 극복하기 위해, 나노 유체라 불리는 새로운 분류의 열전달 유체가 개발되었다. 이들 나노 유체는 전형적으로 상당한 양의 나노 입자가 물, 오일 또는 에틸렌 글리콜과 같은 액체에 현탁된 액체 조성물이다. 생성된 나노 유체는 분산된 나노 입자를 가지지 않는 액체에 비해 매우 높은 열전도성을 가진다.
맥스웰(Maxwell)의 이론적 저작(theoretical work)이 100년 이상도 전에 발행된 이래, 입자를 함유하는 분산액의 효과적인 열전도성에 대한 많은 이론적 및 실험적 연구가 수행되었다. 그러나, 현탁액의 열전도성에 대한 이전의 모든 연구는 밀리미터- 또는 미크론-사이즈의 입자를 함유하는 현탁액으로 한정되었다. 맥스웰 모델은 구형 입자를 함유하는 현탁액의 효율적인 열전도성이 고체 입자의 체 적율(volume fraction)과 더불어 증가한다는 것을 제시한다. 또한, 현탁액의 열전도성은 입자의 체적에 대한 표면적의 비와 더불어 증가하는 것으로 알려져 있다. 체적에 대한 표면적의 비는 직경 10mm의 입자 보다 직경 10㎚의 입자가 1000배 크기 때문에, 효율적인 열전도성의 비약적 개선은 큰 입자들의 입자 형태를 변경하여 용액중 입자 크기를 감소시킨 결과로 예상된다.
전통적으로, 나노 입자는 아크 방전, 레이저 증발, 열분해 프로세스, 플라즈마의 사용, 졸 겔의 사용 등의 적용에 의해 분자 레벨 업(molecular level up)으로부터 합성된다. 널리 사용되는 나노 입자는 약 1 ㎛ 이하의 직경을 가진 물질(object)로서 폭넓게 정의되는 플러렌 탄소 나노튜브(fullerene carbon nanotube)이다. 이 단어의 좁은 의미로, 축과 실질적으로 평행한 탄소의 탄소 육각형 메쉬 시트(hexagonal mesh sheet)를 가진 물질을 탄소 나노튜브라 하며, 탄소 나노튜브를 둘러싸는 무정형 탄소를 가진 것도 또한 탄소 나노튜브의 부류내에 포함된다.
유전체 코어와 도전성 쉘 층을 가진 나노 입자인 나노쉘(nanoshell)이 또한 당업계에 공지되어 있다. 탄소 나노튜브와 마찬가지로, 나노셀도 또한 예를 들어 유전체 기질상의 금속 원자의 결합에 의한 분자 레벨업으로부터 제조된다. 나노쉘은 상기 언급한 광장 향상 현상을 이용하는 것이 바람직한 응용예에서 특히 유용하다. 그러나, 나노쉘은 근적외선 파장 응용예의 경우에만 유용하다.
추가의 처리단계가 생산 공정에 포함되지 않는 한, 분자 레벨업으로부터 생성된 나노 입자는 벌크의 특징을 나타내는 물리적 특성을 느슨하게 하는 경향이 있 음이 인식된다. 나노 입자가 이미 요구되는 잠재적인 응용예의 상기 비-포괄적 목록으로부터 이해될 수 있는 바와 같이, 나노 입자를 생산할 경우 고려해야할 매우 다양한 물리적 특성이 존재한다. 특히, 큰 마이크로 크기 입자의 물리적 특성을 보유하는 나노 입자가 가장 중요하다.
본 발명이 발견한 여러 분야중에서, 분자 생물학에 기초한 연구 및 진단의 분야에 사용한다.
과거 10 년에 걸쳐, 생물학 및 게놈 연구가 생명의 중심이 되는 분자의 이해에 있어 급격한 변화를 가져옴에 따라, 유전자의 시간적 및 공간적 발현이 모든 생명 과정에 관여한다는 것이 날로 명백해졌다. 과학은 단일의 유전적 결함이 어떻게 전통적으로 인식된 유전성 질환으로 하여금 더 복잡한 질환의 환경적 요인과 함께 복수의 유전적 결함의 상호작용의 중요성을 실현화하게 하는지에 대한 이해로부터 발전했다.
이러한 이해는 핵산 증폭 기술의 도움에 의해 가능해졌다. 특히, 중합효소 연쇄반응(PCR)은 유전성 질환의 진단, 임상 시료에서 병원균의 핵산 서열의 검출, 법의학 시료의 유전자 확인(genetic identification), 활성 종양유전자 및 다른 유전자에서 돌연변이의 분석 등을 비롯한 다양한 분야의 광범위한 응용예에서 발견된다. 또한, PCR 증폭은 DNA의 분석 및 분자 클로닝(cloning)에서 다양한 작업을 수행하는데 사용되고 있다. 이들 작업으로는 프로브로서 사용 또는 클로닝을 위한 DNA의 특정 서열의 생성, 유전자 지도작성을 위한 DNA 세그먼트의 검출, cDNA의 특정 세그먼트의 증폭에 의한 발현 서열의 검출 및 분석, 소량의 mRNA로부터 cDNA 라 이브러리의 생성, 서열화를 위한 대량의 DNA의 생성, 돌연변이의 분석 및 염색체 크롤링(chromosome crawling)이 포함된다. 다른 핵산 증폭 기술 뿐만 아니라 PCR은 분자 생물학의 많은 다른 일면에서 그 적용이 증가할 것으로 예상된다.
잘 알려진 바와 같이, DNA의 가닥은 그의 염기들(A, T, C, G로서 각각 나타내어지는 아데닌, 티민, 시토신 및 구아닌)에 의해 결정되는 4 개의 상이한 뉴클레오티드로 구성된다. 각각의 DNA 가닥은 동종의 가닥과 결합하는데, 여기서 A는 T와 짝이 되고, C는 G와 짝이 된다. 단백질의 유전암호를 지정하는 염기의 특정 서열을 유전자라 한다. DNA은 단백질 조성에 관여하는 영역(엑손) 및 단백질 조성에 직접적으로 관여하지 않는 영역(인트론)으로 세그먼트된다(segmented).
미국특허 제 4,683,195 호에 일반적으로 기술된 PCR은 공지된 서열의 두 영역 사이에 놓인 표적 DNA 단편의 시험관내 증폭을 가능케 한다. 이중가닥 표적 DNA을 먼저 용융하여 DNA 가닥을 분리한 다음, 올리고뉴클레오티드를 주형 DNA(template DNA)로 어닐링한다(annealing). 이들은 상보적이고, 따라서 목적하는 표적 단편의 5' 및 3' 경계의 목적하는 사전선택된 위치에 특이적으로 결합하는 방식으로 프라이머들을 선택한다.
올리고뉴클레오티드는 프라이머 신장법(primer extension)으로서 공지된 공정에서 DNA 중합효소를 사용하여 새로운 상보 DNA 가닥을 합성하기 위한 프라이머로서 역할을 한다. 서로에 대한 프라이머들의 배향은 충분히 길게 확장된 경우 각 프라이머로부터의 5' 내지 3' 신장 생성물이 다른 올리고뉴클레오티드에 대해 상보적인 서열을 가지는 것과 같다. 따라서, 각각의 새로 합성된 DNA 가닥은 그의 프 라이머로서 다른 올리고뉴클레오티드로 개시하는 또 다른 DNA 가닥을 합성하기 위한 주형이 된다. (i) 용융, (ii) 올리고뉴클레오티드 프라이머의 어닐링, 및 (iii) 프라이머 신장의 사이클은 상당히 많이 반복되어 프라이머들 사이에서 표적 단편을 기하급수적으로 증폭시킬 수 있다.
선행 PCR 기술에서, 반응은 DNA 중합효소 보조인자(cofactor)를 함유하는 반응 버퍼에서 수행되어야 한다. DNA 중합효소 보조인자는 활성에 대해 효소가 의존하는 비-단백질 화합물이다. 보조인자가 존재하지 않으면, 효소는 촉매적으로 비활성이다. 공지된 보조인자로는 2가의 양이온이 수용액내로 방출되는 형태의 망간 또는 마그네슘을 함유하는 화합물이 포함된다. 전형적으로, 이들 보조인자는 염화물, 황산염, 아세트산염 및 지방산염과 같은 망간 또는 마그네슘 염의 형태이다.
저농도의 보조인자를 가진 버퍼를 사용하면 비-표적 서열이 증폭되거나 미스프라이밍(mispriming)된다. 반대로, 매우 높은 농도는 프라이머 어닐링을 감소시켜 비효율적으로 DNA를 증폭시킨다. 또한, 터무스 아쿠아티쿠스(Thermus aquaticus, Taq) DNA 중합효소와 같은 열안정성 DNA 중합효소는 마그네슘-의존적이다. 따라서, 반응의 특이성 및 중합효소의 효율 모두를 극대화하기 위해서는 적절한 농도의 마그네슘 이온이 필요하다.
수년에 걸쳐, 특히 프라이머 길이 및 서열, 어닐링 온도, 증폭 길이, 버퍼 반응 보충제의 농도 등의 적절한 선택에 의해 PCR을 최적화하고자 하는 많은 시도가 이루어졌다. PCR의 효율에 관여하는 변이주의 수가 매우 많기 때문에, 공정에 참여하는 모든 성분에 대한 파라미터의 최적 셋트를 찾기가 매우 어렵다.
이후 부분에서 추가로 설명되는 바와 같이, 핵산 증폭 기술의 효율은 나노구조체를 함유하는 액체 조성물의 도움으로 크게 향상될 수 있다.
본 발명의 한 일면에 따르면, 정연한 유체 분자의 인벨롭(envelope)에 의하여 둘러싸인 나노미터 크기의 코어 물질을 포함하되, 상기 코어 물질 및 상기 정연한 유체 분자의 인벨롭이 정상(steady)의 물리적 상태로 존재하는 나노구조가 제공된다.
본 발명의 다른 일면에 따르면, 본원에 개시된 액체 및 나노구조를 포함하는 액체 조성물이 제공된다. 액체 조성물은 바람직하게는 물에 비해 향상된 초음파 속도에 의해 특징지워진다.
본 발명의 또 다른 추가의 일면에 따르면, 액체 및 나노구조를 포함하는 액체 조성물이 제공되는데, 여기서 상기 액체 조성물은 물에 비해 향상된 물질 용해능 또는 물질 분산능에 의해 특징지워지며, 상기 각각의 나노구조는 정연한 유체 분자의 인벨롭에 의하여 둘러싸인 나노미터 크기의 코어 물질을 포함하되, 상기 코어 물질 및 상기 정연한 유체 분자의 인벨롭은 정상의 물리적 상태로 존재한다.
본 발명의 또 다른 추가의 일면에 따르면, 액체 및 나노구조를 포함하는 액체 조성물이 제공되는데, 상기 각각의 나노구조는 정연한 유체 분자의 인벨롭에 의하여 둘러싸인 나노미터 크기의 코어 물질을 포함하되, 상기 나노구조는 수산화인회석(hydroxyapatite)으로부터 제조되며, 상기 코어 물질 및 상기 정연한 유체 분자의 인벨롭은 정상의 물리적 상태로 존재한다.
본 발명의 또 다른 추가의 일면에 따르면, 액체 및 나노구조를 포함하는 액체 조성물이 제공되는데, 여기서 상기 액체 조성물은 물에 비해 향상된 완충능(buffering capacity)에 의해 특징지워지며, 상기 각각의 나노구조는 정연한 유체 분자의 인벨롭에 의하여 둘러싸인 나노미터 크기의 코어 물질을 포함하되, 상기 코어 물질 및 상기 정연한 유체 분자의 인벨롭은 정상의 물리적 상태로 존재한다.
본 발명의 또 다른 추가의 일면에 따르면, 물질의 분산 또는 용해를 가능하도록 하는 조건하에서 물질을 나노구조 및 액체와 접촉시키는 단계를 포함하여 물질을 용해시키거나 분산시키는 방법이 제공되는데, 여기서 상기 나노구조는 액체의 정연한 유체 분자의 인벨롭에 의하여 둘러싸인 나노미터 크기의 코어 물질을 포함하되, 상기 코어 물질 및 상기 정연한 유체 분자의 인벨롭은 정상의 물리적 상태로 존재한다.
기술된 바람직한 구체예의 또 다른 추가의 특징에 따르면, 상기 물질은 단백질, 핵산, 소분자 및 탄수화물로 구성된 그룹 중에서 선택된다.
기술된 바람직한 구체예의 또 다른 추가의 특징에 따르면, 상기 물질은 약제학적 제제이다.
기술된 바람직한 구체예의 또 다른 추가의 특징에 따르면, 상기 약제학적 제제는 치료용 제제, 화장용 제제 또는 진단용 제제이다.
기술된 바람직한 구체예의 또 다른 추가의 특징에 따르면, 상기 조성물은 물의 완충능 보다 큰 완충능을 포함한다.
기술된 바람직한 구체예의 또 다른 추가의 특징에 따르면, 상기 조성물은 물에 비해 향상된 제제 용해능 또는 제제 분산능을 포함한다.
기술된 바람직한 구체예의 또 다른 추가의 특징에 따르면, 상기 방법은 접촉시키는 단계 이전에 제제를 용매에 용해시키거나 분산시키는 단계를 추가로 포함한다.
기술된 바람직한 구체예의 또 다른 추가의 특징에 따르면, 상기 방법은 접촉시키는 단계 이후에 제제를 용매에 용해시키거나 분산시키는 단계를 추가로 포함한다.
기술된 바람직한 구체예의 또 다른 추가의 특징에 따르면, 상기 용매는 극성 용매이다.
기술된 바람직한 구체예의 또 다른 추가의 특징에 따르면, 상기 용매는 비극성 용매이다.
기술된 바람직한 구체예의 또 다른 추가의 특징에 따르면, 상기 용매는 유기 용매이다.
기술된 바람직한 구체예의 또 다른 추가의 특징에 따르면, 상기 유기 용매는 에탄올 또는 아세톤이다.
기술된 바람직한 구체예의 또 다른 추가의 특징에 따르면, 상기 용매는 비유기(non-organic) 용매이다.
기술된 바람직한 구체예의 또 다른 추가의 특징에 따르면, 상기 방법은 용해시키거나 분산시키는 단계 이후에 용매를 증발시키는 단계를 추가로 포함한다.
기술된 바람직한 구체예의 또 다른 추가의 특징에 따르면, 상기 증발시키는 단계는 열 또는 압력에 의해 수행된다.
기술된 바람직한 구체예의 또 다른 추가의 특징에 따르면, 상기 나노구조는 액체 조성물이 먼저 표면과 접촉된 다음 예정된 세척 프로토콜에 의해 세척되는 경우, 조성물의 전기화학적 사인이 표면 상에 보존되도록 설계된다.
본 발명의 또 다른 추가의 일면에 따르면, 본원에 기술된 액체 및 나노구조를 포함하는 액체 조성물이 제공되는데, 상기 액체 조성물은 박테리아 콜로니 팽창율의 증가를 촉진시킨다.
본 발명의 또 다른 추가의 일면에 따르면, 본원에 기술된 액체 및 나노구조를 포함하는 액체 조성물이 제공되는데, 상기 액체 조성물은 파지-박테리아 또는 바이러스-세포 상호작용의 증가를 촉진시킨다.
본 발명의 추가의 일면에 따르면, 본원에 기술된 액체 및 나노구조를 포함하는 액체 조성물이 제공되는데, 상기 액체 조성물은 액체 자체의 제타 전위보다 실질적으로 큰 제타 전위에 의해 특징지워진다.
본 발명의 또 다른 추가의 일면에 따르면, 본원에 기술된 액체 및 나노구조를 포함하는 액체 조성물이 제공되는데, 각각의 상기 나노구조는 액체의 비중과 같거나 작은 비중을 가진다.
후술된 본 발명의 바람직한 구체예의 추가의 특징에 따르면, 상기 나노구조는 액체 조성물이 염료 용액과 혼합되는 경우에 염료 용액의 분광학적 특성이 실질적으로 변하도록 설계된다.
본 발명의 또 다른 추가의 일면에 따르면, 본원에 기술된 액체 및 나노구조를 포함하는 액체 조성물이 제공되는데, 상기 나노구조는 상기 액체 조성물이 염료 용액과 함께 혼합되는 경우에 염료 용액의 분광학적 특성이 실질적으로 변하도록 설계된다.
본 발명의 또 다른 추가의 일면에 따르면, 본원에 기술된 액체 및 나노구조를 포함하는 액체 조성물이 제공되는데, 상기 액체 조성물은 고체상 매트릭스에 대한 거대분자 결합을 향상시킨다.
후술된 본 발명의 바람직한 구체예의 추가의 특징에 따르면, 고체상 매트릭스는 친수성이다.
기재된 바람직한 구체예의 또 다른 추가의 특징에 따르면, 고체상 매트릭스는 소수성이다.
기술된 바람직한 구체예의 또 다른 추가의 특징에 따르면, 고체상 매트릭스는 소수성 영역과 친수성 영역을 포함한다.
기술된 바람직한 구체예의 또 다른 추가의 특징에 따르면, 거대분자는 항체이다.
기술된 바람직한 구체예의 또 다른 추가의 특징에 따르면, 항체는 폴리클로날 항체이다.
기술된 바람직한 구체예의 또 다른 추가의 특징에 따르면, 거대분자는 적어도 하나의 탄수화물 친수성 영역을 포함한다.
기술된 바람직한 구체예의 또 다른 추가의 특징에 따르면, 거대분자는 적어도 하나의 탄수화물 소수성 영역을 포함한다.
기술된 바람직한 구체예의 또 다른 추가의 특징에 따르면, 거대분자는 렉틴이다.
기술된 바람직한 구체예의 또 다른 추가의 특징에 따르면, 거대분자는 DNA 분자이다.
기술된 바람직한 구체예에서 또 다른 추가의 특징에 따르면, 거대분자는 RNA 분자이다.
본 발명의 또 다른 추가의 일면에 따르면, 본원에 기술된 액체 및 나노구조를 포함하는 조성물이 제공되는데, 상기 액체 조성물은 DNA 분자를 적어도 부분적으로 디폴딩(defolding)할 수 있다.
본 발명의 또 다른 추가의 일면에 따르면, 액체 및 나노구조를 포함하는 액체 조성물이 제공되는데, 상기 액체 조성물은 생체물질에 대한 박테리아 부착성을 변경시킬 수 있으며, 이에 의해 상기 각각의 나노구조는 정연한 유체 분자의 인벨롭에 의하여 둘러싸인 나노미터 크기의 코어 물질을 포함하고, 상기 코어 물질 및 상기 정연한 유체 분자의 인벨롭은 정상의 물리적 상태로 존재한다.
기술된 바람직한 구체예의 추가의 특징에 따르면, 본 발명의 조성물은 생체물질에 대한 그 부착성을 감소시킨다.
기술된 바람직한 구체예의 또 다른 추가의 특징에 따르면, 상기 생체물질은 플라스틱, 폴리에스테르 및 시멘트로 이루어진 그룹 중에서 선택된다
기술된 바람직한 구체예의 또 다른 추가의 특징에 따르면, 상기 생체물질은 대상에 외과적으로 이식하기에 적절하다.
기술된 바람직한 구체예의 또 다른 추가의 특징에 따르면, 상기 박테리아 부착성은 스타필로코쿠스 에피더미스(Staphylococcus epidermidis) 부착성이다.
기술된 바람직한 구체예의 또 다른 추가의 특징에 따르면, 상기 스타필로코쿠스 에피더미스 부착성은 스타필로코쿠스 에피더미스 RP 62 A 부착성, 스타필로코쿠스 에피더미스 M7 부착성 및 스타필로코쿠스 에피더미스 (API-6706112) 부착성으로 이루어진 그룹 중에서 선택된다.
본 발명의 또 다른 추가의 일면에 따르면, 본원에 기술된 액체 및 나노구조를 포함하는 액체 조성물이 제공되는데, 상기 액체 조성물은 효소 활성을 안정화시킬 수 있다.
기술된 바람직한 구체예에서 추가의 특징에 따르면, 상기 효소 활성은 비결합 효소의 효소 활성이다.
기술된 바람직한 구체예의 또 다른 추가의 특징에 따르면, 상기 효소 활성은 결합 효소의 효소 활성이다.
기술된 바람직한 구체예의 또 다른 추가의 특징에 따르면, 상기 효소 활성은 알칼리성 포스파타제 및 β-갈락토시다제로 이루어진 그룹 중에서 선택된 효소의 효소 활성이다.
본 발명의 또 다른 추가의 일면에 따르면, 본원에 기술된 액체 및 나노구조를 포함하는 액체 조성물이 제공되는데, 상기 액체 조성물은 수지에 대한 핵산의 친화성 결합을 개선할 수 있고 겔 전기영동 분리를 개선할 수 있다.
본 발명의 또 다른 추가의 일면에 따르면, 본원에 기술된 액체 및 나노구조를 포함하는 액체 조성물이 제공되는데, 상기 액체 조성물은 칼럼의 커패시티를 증가시킬 수 있다.
본 발명의 또 다른 추가의 일면에 따르면, 본원에 기술된 액체 및 나노구조를 포함하는 액체 조성물이 제공되는데, 상기 액체 조성물은 핵산 증폭 공정의 효율을 개선할 수 있다.
후술된 발명의 바람직한 구체예의 추가의 특징에 따르면, 핵산 증폭 공정은 중합효소 연쇄반응이다.
기술된 바람직한 구체예의 또 다른 추가의 특징에 따르면, 상기 중합효소 연쇄반응은 실시간 중합효소 연쇄반응이다.
기술된 바람직한 구체예의 또 다른 추가의 특징에 따르면, 상기 조성물은 상기 중합효소 연쇄반응의 DNA 중합효소의 촉매 활성을 증가시킬 수 있다.
기술된 바람직한 구체예의 또 다른 추가의 특징에 따르면, 상기 중합효소 연쇄반응은 마그네슘을 포함하지 않는다.
기술된 바람직한 구체예의 또 다른 추가의 특징에 따르면, 상기 중합효소 연쇄반응은 망간을 포함하지 않는다.
본 발명의 또 다른 추가의 일면에 따르면, 분리된 패키지 상태로 (a) 열안정성(thermostable) DNA 중합효소; 및 (b) 본원에 기술된 액체 및 나노구조를 갖는 액체 조성물을 포함하는 중합효소 연쇄반응용 키트가 제공된다.
후술된 본 발명의 바람직한 구체예의 추가의 특징에 따르면, 상기 키트는 적어도 하나의 dNTP를 추가로 포함한다.
기술된 바람직한 구체예의 또 다른 추가의 특징에 따르면, 상기 키트는 적어도 하나의 대조군 주형 DNA를 추가로 포함한다.
기술된 바람직한 구체예의 또 다른 추가의 특징에 따르면, 상기 키트는 적어도 하나의 대조군 프라이머를 추가로 포함한다.
본 발명의 또 다른 추가의 일면에 따르면, (a) 열안정성 DNA 중합효소; (b) 이중가닥 DNA 검출 분자; 및 (c) 본원에 기술된 액체 및 나노구조를 갖는 액체 조성물을 포함하는 실시간 중합효소 연쇄반응용 키트가 제공된다.
후술된 본 발명의 바람직한 구체예의 추가의 특징에 따르면, 상기 이중가닥 DNA 검출 분자는 이중가닥 DNA 삽입(intercalating) 검출 분자이다.
기술된 바람직한 구체예의 또 다른 추가의 특징에 따르면, 상기 이중가닥 DNA 삽입 검출 분자는 브롬화 에티듐, YO-PRO-1, Hoechst 33258, SYBR Gold 및 SYBR Green I로 구성된 그룹 중에서 선택된다.
기술된 바람직한 구체예의 또 다른 추가의 특징에 따르면, 상기 이중가닥 DNA 검출 분자는 프라이머-기초(primer-based) 이중가닥 DNA 검출 분자이다.
기술된 바람직한 구체예의 또 다른 추가의 특징에 따르면, 상기 프라이머-기초 이중가닥 DNA 검출 분자는 플루오레세인(fluorescein), FAM, JOE, HEX, TET, Alexa Fluor 594, ROX, TAMRA, 로다만(rhodamine) 및 BODIPY-FI로 구성된 그룹 중에서 선택된다.
본 발명의 또 다른 추가의 일면에 따르면, DNA 서열을 증폭시키는 방법이 제공되는데, 상기 방법은 (a) 본원에 기술된 액체 및 나노구조를 포함하는 액체 조성물을 제공하는 단계; 및 (b) 상기 액체 조성물의 존재하에서 DNA 서열에 대해 다수의 중합효소 연쇄반응 사이클을 수행하여 DNA 서열을 증폭시키는 단계를 포함한다.
본 발명의 또 다른 추가의 일면에 따라, 본원에 기술된 액체 및 나노구조를 포함하는 액체 조성물이 제공되는데, 상기 액체 조성물은 고체 지지체의 존재하에 적어도 하나의 거대분자를 조작(manipulation)하게 할 수 있다.
기술된 바람직한 구체예의 추가의 특징에 따르면, 상기 거대분자는 폴리뉴클레오티드이다.
기술된 바람직한 구체예의 또 다른 추가의 특징에 따르면, 상기 폴리뉴클레오티드는 DNA 및 RNA로 이루어진 그룹 중에서 선택된다.
기술된 바람직한 구체예의 또 다른 추가의 특징에 따르면, 상기 고체 지지체는 유리 비드를 포함한다.
기술된 바람직한 구체예의 또 다른 추가의 특징에 따르면, 상기 유리 비드의 직경은 약 80 내지 150 미크론이다.
기술된 바람직한 구체예의 또 다른 추가의 특징에 따르면, 상기 조작은 화학 반응에 의해 수행된다.
기술된 바람직한 구체예의 또 다른 추가의 특징에 따르면, 상기 화학 반응은 증폭 반응, 결찰 반응, 형질전환 반응, 전사 반응, 역전사 반응, 제한 소화(restriction digestion) 및 핵산전달감염 반응으로 이루어진 그룹 중에서 선택된다.
본 발명의 또 다른 일면에 따르면, 액체, 비드 및 나노구조를 포함하는 액체 조성물이 제공되는데, 상기 액체 조성물은 상기 비드의 존재하에서 적어도 하나의 거대분자를 조작하게 할 수 있으며, 상기 각각의 나노구조는 정연한 유체 분자의 인벨롭에 의하여 둘러싸인 나노미터 크기의 코어 물질을 포함하고, 상기 코어 물질 및 상기 정연한 유체 분자의 인벨롭은 정상의 물리적 상태로 존재한다.
후술된 본 발명의 바람직한 구체예의 추가의 특징에 따르면, 상기 유체 분자의 적어도 일부는 기체 상태로 존재한다.
기술된 바람직한 구체예의 또 다른 추가의 특징에 따르면, 상기 나노구조는 적어도 하나의 추가의 나노구조와 함께 클러스터를 형성할 수 있다.
기술된 바람직한 구체예의 또 다른 추가의 특징에 따르면, 상기 나노구조는 적어도 하나의 추가의 나노구조와 함께 원거리(long range) 상호작용을 유지할 수 있다.
기술된 바람직한 구체예의 또 다른 추가의 특징에 따르면, 상기 유체 분자의 적어도 일부는 상기 액체의 분자와 동일하다.
기술된 바람직한 구체예의 또 다른 추가의 특징에 따르면, 상기 나노구조의 농도는 리터 당 1020 나노구조 이하이고, 더욱 바람직하게는 리터 당 1015 나노구조 이하이다.
기술된 바람직한 구체예의 또 다른 추가의 특징에 따르면, 상기 나노구조는 그들 사이에서 원거리 상호작용을 유지할 수 있다.
기술된 바람직한 구체예의 또 다른 추가의 특징에 따르면, 상기 코어 물질은 강유전성 코어 물질, 강자성 코어 물질 및 압전성 코어 물질로 이루어진 그룹 중에서 선택된다.
기술된 바람직한 구체예의 또 다른 추가의 특징에 따르면, 상기 코어 물질은 결정성 코어 물질이다.
기술된 바람직한 구체예의 또 다른 추가의 특징에 따르면, 상기 액체는 물이다.
기술된 바람직한 구체예의 또 다른 추가의 특징에 따르면, 상기 나노구조는 상기 조성물과 고체 표면 사이의 접촉 각(contact angle)이 상기 액체와 고체 표면 사이의 접촉 각보다 작게 설계된다.
본 발명의 추가의 일면에 따르면, 고체 분말로부터 액체 조성물을 제조하는 방법이 제공되는데, 상기 방법은 (a) 고체 분말을 가열하여 가열된 고체 분말을 제공하는 단계; (b) 상기 가열된 고체 분말을 차가운 액체에 침지시키는 단계; 및 (c) 상기 단계 (b)와 실질적으로 동시에, 전자기 조사선으로 상기 차가운 액체 및 상기 가열된 고체 분말에 조사하는 단계를 포함하며, 상기 전자기 조사선은 상기 나노구조가 상기 고체 분말의 입자로부터 형성되도록 선택된 주파수인 것을 특징으로 한다.
본 발명의 추가의 일면에 따르면, 수산화인회석으로부터 액체 조성물을 제조하는 방법이 제공되는데, 상기 방법은 (a) 수산화인회석을 가열하여 가열된 수산화인회석을 제공하는 단계; (b) 상기 가열된 수산화인회석을 차가운 액체에 침지시키는 단계; 및 (c) 상기 단계 (b)와 실질적으로 동시에, 전자기 조사선으로 상기 차가운 액체 및 상기 가열된 고체 분말에 조사하는 단계를 포함하며, 상기 전자기 조사선은 상기 나노구조가 상기 수산화인회석의 입자로부터 형성되도록 선택된 주파수인 것을 특징으로 한다.
후술된 본 발명의 바람직한 구체예의 추가의 특징에 따르면, 상기 나노구조가 수산화인회석으로부터 제조된다.
후술된 본 발명의 바람직한 구체예의 추가의 특징에 따르면, 상기 수산화인회석은 마이크로 크기의 입자를 포함한다.
후술된 본 발명의 바람직한 구체예의 추가의 특징에 따르면, 상기 고체 분말은 마이크로 크기의 입자를 포함한다.
기술된 바람직한 구체예의 추가의 특징에 따르면, 상기 마이크로 크기의 입자는 결정성 입자이다.
기술된 바람직한 구체예의 또 다른 추가의 특징에 따르면, 상기 나노구조는 결정성 나노구조이다.
기술된 바람직한 구체예의 또 다른 추가의 특징에 따르면, 상기 고체 분말은 강유전성 물질 및 강자성 물질로 이루어진 그룹 중에서 선택된다.
기술된 바람직한 구체예의 또 다른 추가의 특징에 따르면, 상기 고체 분말은 BaTi03, W03 및 Ba2F9O12로 이루어진 그룹 중에서 선택된다.
기술된 바람직한 구체예의 또 다른 추가의 특징에 따르면, 상기 고체 분말은 미네랄, 세라믹 물질, 유리, 금속 및 합성 중합체로 이루어진 그룹 중에서 선택된 물질을 포함한다.
기술된 바람직한 구체예의 또 다른 추가의 특징에 따르면, 상기 전자기 조사선은 라디오 주파수 영역에 있다.
기술된 바람직한 구체예의 또 다른 추가의 특징에 따르면, 상기 전자기 조사선은 연속파 전자기 조사선이다.
기술된 바람직한 구체예의 또 다른 추가의 특징에 따르면, 상기 전자기 조사선은 변조된 전자기 조사선이다.
본 발명은 다수의 특징적인 물리적, 화학적 및 생물학적 특징이 있는 나노구조 및 이러한 나노구조를 가지는 액체 조성물을 제공하여 현재 공지된 구조의 단점을 성공적으로 해소한다.
달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 기술분야에 있는 당업자에 의해 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다. 본 명세서에 기술된 것과 유사 또는 동등한 방법 및 물질이 본 발명의 실시 또는 시험에 사용될 수 있지만, 적합한 방법 및 물질은 아래 기술된다. 불일치한 경우에, 정의를 비롯한 특허 명세서는 조절될 것이다. 또한, 물질, 방법 및 실시예는 설명을 위한 것일 뿐, 제한하고자 의도된 것이 아니다.
도면의 간단한 설명
본 발명은 첨부된 도면과 관련하여 단지 일례로서 여기에 기술된다. 도면과 관련하여 상세하게는 도시한 도면은 일례로서, 단지 본 발명의 바람직한 실시예를 예시적으로 설명하기 위한 것이며, 본 발명의 원리 및 개념적 양상을 가장 유용하고 쉽게 이해할 수 있게 설명하도록 하기 위해 나타낸다. 이 점에서, 본 발명을 근본적으로 이해하는데 필요한 설명보다 더 상세하게 본 발명을 구조적으로 설명하고자 하는 시도는 이루어지지 않았지만, 도면에 의한 설명은 본 발명의 일부 형태가 실제로 어떻게 구체화될 수 있는지를 당업자들에게 명백하게 한다.
도면에서:
도 1은 본 발명의 바람직한 구체예에 따른 나노구조의 개략도이며;
도 2a는 본 발명의 바람직한 구체예에 따라 액체 조성물을 제조하는 방법의 플로우챠트이고;
도 2b는 본 발명의 바람직한 구체예에 따라 DNA 서열을 증폭시키는 방법의 플로우챠트이며;
도 3a-e는 본 발명의 나노구조의 TEM 이미지이고;
도 4는 본 발명의 액체 조성물에 대한 염료의 효능을 나타내며;
도 5a-b는 액체 조성물에 대한 높은 원심분리의 효능을 나타내고, 도 5a는 관(tube)의 하부에 기록된 시그널을 나타내며, 도 5b는 관의 상부에 기록된 시그널을 나타내고;
도 6a-c는 본 발명의 액체 조성물에 대해 수행되는 pH 시험의 결과를 나타내고;
도 7은 본 발명의 액체 조성물의 흡수 스펙트럼을 나타내며;
도 8은 본 발명의 액체 조성물의 ζ 전위 측정 결과를 나타내고;
도 9a-b 본 발명의 액체 조성물의 존재(좌측) 및 대조군 배지의 존재(우측)하에서의 박테리오파지 반응을 나타내며;
도 10은 대조군 액체의 용균 표면적(bacteriolysis surface area)과 본 발명의 액체 조성물의 용균 표면적의 비교를 나타내고;
도 11은 본 발명의 액체 조성물의 존재(좌측) 및 대조군 배지의 존재(우측) 하에서 100회의 일상적인 시험 희석한 상태에서 파지 형별(phage typing) 농도를 나타내고;
도 12는 본 발명의 액체 조성물 및 대조군 배지의 광학 밀도를 시간의 함수로서 나타내며;
도 13a-c는 마이크로적정 플레이트에 대한 코아귤라제-음성 포도상구균의 부착성에 대한 본 발명의 액체 조성물의 효능을 조사하기 위한 실험에서 슬라임(slime)-생산 스타필로코쿠스 에피더미스(Staphylococcus epidermidis)의 광학 밀도를 나타내고;
도 14는 다른 마이크로적정 플레이트에 대한 슬라임 부착성과 관련된 15개의 반복 실험을 나타내는 막대 그래프를 나타내며;
도 15는 본 발명의 액체 조성물 및 대조군에 대한 동일한 마이크로적정 플레이트 상에서의 슬라임 부착성의 차이를 나타내고;
도 16a-c는 전기화학적 증착 실험 장치를 나타내며;
도 17a-b는 본 발명의 액체 조성물(도 17a) 및 대조군(도 17b)의 전기화학 증착을 나타내고;
도 18은 30분 동안 본 발명의 액체 조성물과 접촉한 세포에서 역삼투(RO)수 전기화학 증착을 나타내며;
도 19a-b는 본 발명의 액체 조성물(도 19a) 및 대조군 배지(도 19b)에 대한 바실러스 서브틸리스 콜로니의 성장 결과를 나타내고;
도 20a-c는 원료(raw) 분말을 함유하는 물(도 20a), 역삼투수(도 20b) 및 본 발명의 액체 조성물(도 20c)에 대한 바실러스 서브틸리스 콜로니의 성장 결과를 나타내며;
도 21a-d는 본 발명의 액체 조성물 또는 대조군 완충액을 사용하는, 배지 costar 마이크로적정 플레이트(도 21a), non-sorp 마이크로적정 플레이트(도 21b), maxisorp 마이크로적정 플레이트(도 21c) 및 polysorp 마이크로적정 플레이트(도 21d)에 대한 표지 및 비표지된 항체의 결합을 나타내며,
도 22a-d는 본 발명의 액체 조성물 또는 대조군 완충액을 사용하는, 배지 costar 마이크로적정 플레이트(도 22a), non-sorp 마이크로적정 플레이트(도 22b), maxisorp 마이크로적정 플레이트(도 22c) 및 polysorp 마이크로적정 플레이트(도 22d)에 대한 표지된 항체의 결합을 나타내고;
도 23a-d는 본 발명의 액체 조성물 및 완충액을 사용하는, 4℃에서 밤새 배양한 후의 non-sorp 마이크로적정 플레이트(도 23a), 배지 costar 마이크로적정 플레이트(도 23b), polysorp 마이크로적정 플레이트(도 23c) 및 maxisorp 마이크로적정 플레이트(도 23d)에 대한 표지된 항체의 결합을 나타내며;
도 24a-d는 본 발명의 액체 조성물 또는 대조군 완충액을 사용하는, 37℃에 서 2 시간 배양한 후의 non-sorp 마이크로적정 플레이트(도 24a), 배지 costar 마이크로적정 플레이트(도 24b), polysorp 마이크로적정 플레이트(도 24c) 및 maxisorp 마이크로적정 플레이트(도 24d)에 대한 표지된 항체의 결합을 나타내고;
도 25a-d는 본 발명의 액체 조성물 또는 대조군 완충액을 사용하는, 4℃에서 밤새 배양한 후의 배지 costar 마이크로적정 플레이트(도 25a), polysorp 마이크로적정 플레이트(도 25b), maxisorp 마이크로적정 플레이트(도 25c) 및 non-sorp 마이크로적정 플레이트(도 25d)에 대한 표지 및 비표지된 항체의 결합을 나타내며;
도 26a-d는 본 발명의 액체 조성물 또는 대조군 완충액을 사용하는, 실온에서 밤새 배양한 후의 배지 costar 마이크로적정 플레이트(도 26a), polysorp 마이크로적정 플레이트(도 26b), maxisorp 마이크로적정 플레이트(도 26c) 및 non-sorp 마이크로적정 플레이트(도 26d)에 대한 표지 및 비표지된 항체의 결합을 나타내고;
도 27a-b는 본 발명의 액체 조성물 또는 대조군 완충액에 대해 포스페이트 세척 완충액을 사용하는, 표지 및 비표지된 항체(도 27a) 및 표지된 항체만(도 27b)의 결합 결과를 나타내고;
도 27c-d는 본 발명의 액체 조성물 또는 대조군 완충액에 대해 PBS 세척 완충액을 사용하는, 표지 및 비표지된 항체(도 27c) 및 표지된 항체만(도 27d)의 결합 결과를 나타내며;
도 28a-b는 본 발명의 액체 조성물 또는 대조군 완충액을 사용하는, 4℃에서 밤새 배양한 후의 배지 costar 마이크로적정 플레이트에 대한 표지 및 비표지된 항체(도 28a) 및 표지된 항체만(도 28b)의 결합을 나타내고;
도 29a-c는 본 발명의 액체 조성물 또는 대조군 완충액을 사용하는, 아세테이트(도 29a), 카보네이트(도 29b) 및 포스페이트(도 29c) 완충액에 관한 non-sorp 마이크로적정 플레이트에의 표지된 렉틴의 결합을 나타내며;
도 30a-d는 본 발명의 액체 조성물 또는 대조군 완충액을 사용하는, 카보네이트(도 30a-b), 아세테이트(도 30c) 및 포스페이트(도 30d) 완충액에 관한 maxisorp 마이크로적정 플레이트에의 표지된 렉틴의 결합을 나타내고, 도 30b에서 도시한 그래프는 도 30a에 도시한 그래프의 직선 부분이고;
도 31a-b는 핵산에 대한 본 발명에 따른 액체 조성물의 평균 결합 향상능을 나타내며;
도 32-35b는 다른 완충액 배합물 및 다른 용출 단계에 대한 정제 전후의 PCR 산물 시료의 이미지를 나타내고;
도 36-37는 다양한 양, 농도 및 용출 단계에서 칼럼을 통과하는 PCR 산물의 이미지(도 36) 및 정량 분석(도 37)을 나타내며;
도 38a-c는 세 용출 단계에서, 도 36에 도시된 5-17번 칼럼을 통과한 PCR 산물의 이미지를 나타내고;
도 39a는 도 38a-c의 세 용출 단계 각각에 대한 로딩 부피의 함수로서, 본 발명의 액체 조성물(LC로 표시) 및 대조군 완충액(CO로 표시)의 면적을 나타내고;
도 39b는 도 38a-c의 세 용출 단계 각각에 대한 로딩 부피의 함수로서, LC/CO 비를 나타내며;
도 40a-42b는 RO 물의 존재(도 40a, 41a 및 42a) 및 본 발명의 액체 조성물 의 존재(도 40b, 41b 및 42b)하의 겔 전기영동 실험에서 DNA의 이동 속도를 비교하는 레인(lane) 이미지이고;
도 43a-45d는 러닝(running) 완충액에 대한 본 발명의 액체 조성물의 효능을 조사하는 겔 전기영동 실험에서 캡쳐된 레인 이미지이며;
도 46a-48d는 겔 완충액에 대한 본 발명의 액체 조성물의 효능을 조사하는 겔 전기영동 실험에서 캡쳐된 레인 이미지이고;
도 49는 비결합 형태의 알칼리성 포스파타제의 활성 및 안정성에 대한 본 발명의 액체 조성물의 효능을 조사하는 실험에서, 안정성 향상 파라미터의 값(Se)을 희석에 대한 함수로서 나타내며;
도 50은 결합 형태의 알칼리성 포스파타제의 활성 및 안정성에 대한 본 발명의 액체 조성물의 효능을 조사하는 실험에서, 본 발명의 액체 조성물과 RO 물에 희석된 스트렙트-아비딘에 결합된 알칼리성 포스파타제의 효소 활성을 희석에 대한 함수로서 나타내고;
도 51a-d는 β-갈락토시다제의 활성과 안정성에 대한 본 발명의 액체 조성물의 효능을 조사하는 실험에서 24 시간(도 51a), 48 시간(도 51b), 72 시간(도 51c) 및 120 시간(도 51d) 후의 β-갈락토시다제의 안정성을 나타내며;
도 52a-d는 β-갈락토시다제의 활성과 안정성에 대한 본 발명의 액체 조성물의 효능을 조사하는 실험에서 24 시간(도 52a), 48 시간(도 52b), 72 시간(도 52c) 및 120 시간(도 52d) 후의 안정성 향상 파라미터의 값(Se)을 나타내고;
도 53a는 건조 및 가열 처리 후의 알칼리성 포스파타제의 잔류 활성을 나타 내며;
도 53b는 건조 및 가열 처리 후의 알칼리성 포스파타제의 안정성 향상 파라미터의 값(Se)을 나타내고;
도 54는 PCR 반응 동안 DNA에 영향을 주는 유리 비드의 능력에 대한 본 발명의 액체 조성물의 효능을 조사하는 겔 전기영동 실험에서 캡쳐된 레인 이미지를 나타내며;
도 55a는 자동적 베이스라인 측정(automatic baseline determination)과 NeowaterTM를 사용하여 희석시킨 것으로 실시간 PCR 분석을 거친 cDNA 시료의 표준 곡선이다.
도 55b는 자동적 베이스라인 측정과 물을 사용하여 희석시킨 것으로 실시간 PCR 분석을 거친 cDNA 시료의 해리 곡선이다.
도 56a는 자동적 베이스라인 측정과 물을 사용하여 희석시킨 것으로 실시간 PCR 분석을 거친 cDNA 시료의 표준 곡선이다.
도 56b는 자동적 베이스라인 측정과 물을 사용하여 희석시킨 것으로 실시간 PCR 분석을 거친 cDNA 시료의 해리 곡선이다.
도 57a는 0.2의 매뉴얼 백그라운드 컷오프(manual background cut-off)와 NeowaterTM를 사용하여 희석시킨 것으로 실시간 PCR 분석을 거친 cDNA 시료의 표준 곡선이다.
도 57b는 0.2의 매뉴얼 백그라운드 컷오프와 물을 사용하여 희석시킨 것으로 실시간 PCR 분석을 거친 cDNA 시료의 표준 곡선이다.
도 58a는 각 세트로부터 이상값(outlier value)의 동일한 제거후의, NeowaterTM를 사용하여 희석시킨 것으로 실시간 PCR 분석을 거친 cDNA 시료의 표준 곡선이다(매뉴얼 백그라운드 컷오프=0.2).
도 58b는 각 세트로부터 이상값의 동일한 제거후의, 물을 사용하여 희석시킨 것으로 실시간 PCR 분석을 거친 cDNA 시료의 표준 곡선이다(매뉴얼 백그라운드 컷오프=0.2).
도 59a는 각 세트로부터 이상값의 개별적 제거후의, NeowaterTM를 사용하여 희석시킨 것으로 실시간 PCR 분석을 거친 cDNA 시료의 표준 곡선이다(매뉴얼 백그라운드 컷오프=0.2).
도 59b는 각 세트로부터 이상값의 개별적 제거후의, 물을 사용하여 희석시킨 것으로 실시간 PCR 분석을 거친 cDNA 시료의 표준 곡선이다(매뉴얼 백그라운드 컷오프=0.2).
도 60a는 NeowaterTM의 존재하에 반응을 수행하는 경우 백그라운드 노이즈를 입증하는 실시간 PCR을 거친 cDNA 시료의 증폭 플롯이다(델타 런(delta run) = 특정 생성물의 형광 발광치 - 베이스라인 판독치).
도 60b는 물의 존재하에 반응을 수행하는 경우 백그라운드 노이즈를 입증하는 실시간 PCR을 거친 cDNA 시료의 델타 런 대 사이클 곡선이다.
도 61a는 NeowaterTM의 존재하에 반응 부피 5 ㎕로 수행된 세 개의 실시간 PCR 반응의 증폭 플롯이다.
도 61b는 NeowaterTM의 존재하에 반응 부피 10 ㎕로 수행된 세 개의 실시간 PCR 반응의 증폭 플롯이다.
도 61c는 NeowaterTM의 존재하에 반응 부피 15 ㎕로 수행된 세 개의 실시간 PCR 반응의 증폭 플롯이다.
도 62a는 물의 존재하에 반응 부피 5 ㎕로 수행된 세 개의 실시간 PCR 반응의 증폭 플롯이다.
도 62b는 물의 존재하에 반응 부피 10 ㎕로 수행된 세 개의 실시간 PCR 반응의 증폭 플롯이다.
도 62c는 물의 존재하에 반응 부피 15 ㎕로 수행된 세 개의 실시간 PCR 반응의 증폭 플롯이다.
도 63은 본 발명에 따른 액체 조성물에서의 절대 초음파 속도의 등온 측정의 결과를 절대 시간의 함수로서 나타낸 것이다.
도 64a-d는 본 발명에 따른 액체 조성물의 존재하에서 DNA 칩에 대한 혼성화가 향상된 RNA를 나타내는 사진이다. 도 64a 및 도 64b는 10 초 노출후 DNA 칩에 대한 혼성화를 나타낸다. 도 64c 및 도 64d는 2 초 노출후 DNA 칩에 대한 혼성화를 나타낸다. 도 64a 및 도 64c는 본 발명에 따른 액체 조성물의 부재하에서의 DNA 칩에 대한 혼성화를 나타낸다. 도 64b 및 도 64d는 본 발명에 따른 액체 조성 물의 존재하에서의 DNA 칩에 대한 혼성화를 나타낸다.
도 65는 557 ㎚에서의 흡광도에 의해 측정된, 다양한 물 조성물의 수산화나트륨 적정을 나타내는 그래프이다.
도 66a-c는 pH에 의해 측정된, 나노구조를 포함하는 물과 RO 물의 수산화나트륨 적정을 나타내는 삼중으로 수행된 실험의 그래프이다.
도 67a-c는 pH에 의해 측정된, 나노구조를 포함하는 물과 RO 물의 수산화나트륨 적정을 나타내는 그래프로서, 각각의 그래프는 세 개의 삼중 실험을 요약한 것이다.
도 68a-c는 pH에 의해 측정된, 나노구조를 포함하는 물과 RO 물의 염산 적정을 나타내는 삼중으로 수행된 실험의 그래프이다.
도 69는 pH에 의해 측정된, 나노구조를 포함하는 물과 RO 물의 염산 적정을 나타내는 그래프로서, 각각의 그래프는 세 개의 삼중 실험을 요약한 것이다.
도 70a-c는 557 ㎚에서의 흡광도에 의해 측정된, 나노구조를 포함하는 물과 RO 물의 염산(도 70a) 및 수산화나트륨(도 70b-c) 적정을 나타내는 그래프이다.
도 71a-b는 RO(도 71a) 및 나노구조를 포함하는 물(도 71b)의 염산 적정 이후 큐벳의 사진이다. 각각의 큐벳은 1 ㎕ 염산의 첨가를 나타낸다.
도 72a-c는 RF 물(도 72a), RF2 물(도 72b) 및 RO 물(도 72c)의 염산 적정을 나타내는 그래프이다. 화살표는 두 번째 조사를 가리킨다.
도 73은 RO 물과 비교한 FR2 물의 염산 적정을 나타내는 그래프이다. 실험은 3 회 반복하였다. 세 실험 모두에 대한 평균치를 RO 물에 대하여 플롯팅하였 다.
도 74a-j는 분말의 분산시 다양한 시간 간격으로 3회 시도한 후 적색 분말(red powder) 및 NeowaterTM를 포함하는 용액의 사진이다. 도 74a-e는 실시예 24 C 부분으로부터의 우측 시험관 C(50% EtOH+NeowaterTM) 및 좌측 시험관 B(탈수 NeowaterTM)를 나타낸다. 도 74g-j는 밤새 적색 분말의 분쇄(crushing) 및 100 ㎕ NeowaterTM의 적정 이후의 용액을 나타낸다.
도 75a-c는 나노드롭(nanodrop)으로 측정된 3 개의 상이한 용액 2 ㎕의 흡광도 판독치이다. 도 75a는 밤새 분쇄+100 ㎕ NeowaterTM 이후 적색 분말의 용액을 나타낸다. 도 75b는 100% 탈수 NeowaterTM 첨가 이후 적색 분말의 용액을 나타내며, 도 75c는 EtOH+NeowaterTM(50%-50%) 첨가 이후 적색 분말의 용액을 나타낸다.
도 76은 1번 바이얼(CD-Dau + NeowaterTM), 4번 바이얼(CD-Dau + NeowaterTM 중 10% PEG) 및 5번 바이얼(CD-Dau + 50% 아세톤 + 50% NeowaterTM)의 분광광도계 측정 그래프이다.
도 77은 NeowaterTM 중 용해 물질(청색 선) 및 소량의 용매 아세톤을 함유하는 용해 물질(분홍색 선)의 분광광도계 측정 그래프이다.
도 78은 NeowaterTM 중 용해 물질(청색 선) 및 아세톤(분홍색 선)의 분광광 도계 측정 그래프이다. 엷은 청색 및 황색 선은 상이한 비율의 아세톤 증발을 나타내며, 보라색 선은 아세톤을 함유하지 않는 용액이다.
도 79는 200-800 nm에서의 CD-Dau의 분광광도계 측정 그래프이다. 청색 선은 RO 중 용해 물질을 나타내는 반면, 분홍색 선은 NeowaterTM 중 용해 물질을 나타낸다.
도 80은 200-800 nm에서의 t-boc의 분광광도계 측정 그래프이다. 청색 선은 RO 중 용해 물질을 나타내는 반면, 분홍색 선은 NeowaterTM 중 용해 물질을 나타낸다.
도 81a-d는 200-800 nm에서의 분광광도계 측정 그래프이다. 도 81a는 에탄올 증발 직후 에탄올의 존재하 및 부재하 AG-14B의 그래프이다. 도 81b는 에탄올 증발 24 시간 이후 에탄올의 존재하 및 부재하 AG-14B의 그래프이다. 도 81c는 에탄올 증발 직후 에탄올의 존재하 및 부재하 AG-14A의 그래프이다. 도 81d는 에탄올 증발 24 시간 이후 에탄올의 존재하 및 부재하 AG-14A의 그래프이다.
도 82는 에탄올 증발 24 시간 이후 AG-14A 및 AG-14B의 현탁액 사진이다.
도 83a-g는 NeowaterTM에 용해된 펩티드의 분광광도계 측정 그래프이다. 도 83a는 NeowaterTM에 용해된 펩티드 X의 그래프이다. 도 83b는 NeowaterTM에 용해된 X-5FU의 그래프이다. 도 83c는 NeowaterTM에 용해된 NLS-E의 그래프이다. 도 83d 는 NeowaterTM에 용해된 Palm-PFPSYK(CMFU)의 그래프이다. 도 83e는 NeowaterTM에 용해된 PFPSYKLRPG-NH2의 그래프이다. 도 83f는 NeowaterTM에 용해된 NLS-p2-LHRH의 그래프이고, 도 83g는 NeowaterTM에 용해된 F-LH-RH-palm kGFPSK의 그래프이다.
도 84a-g는 크리스탈 바이올렛 분석법(crystal violet assay)에 의해 측정된, NeowaterTM에 용해된 펩티드의 세포독성 효과를 나타내는 막대 그래프이다. 도 84a는 NeowaterTM에 용해된 펩티드 X의 세포독성 효과의 그래프이다. 도 84b는 NeowaterTM에 용해된 X-5FU의 세포독성 효과의 그래프이다. 도 84c는 NeowaterTM에 용해된 NLS-E의 세포독성 효과의 그래프이다. 도 84d는 NeowaterTM에 용해된 Palm-PFPSYK(CMFU)의 세포독성 효과의 그래프이다. 도 84e는 NeowaterTM에 용해된 PFPSYKLRPG-NH2의 세포독성 효과의 그래프이다. 도 84f는 NeowaterTM에 용해된 NLS-p2-LHRH의 세포독성 효과의 그래프이고, 도 84g는 NeowaterTM에 용해된 F-LH-RH-palm kGFPSK의 세포독성 효과의 그래프이다.
도 85는 에탄올 및 NeowaterTM에서의 레티놀 흡광도의 그래프이다.
도 86은 여과후 에탄올 및 NeowaterTM에서의 레티놀 흡광도의 그래프이다.
도 87a-b는 시험관 사진으로서, 좌측은 NeowaterTM 및 물질 "X"를 함유하고, 우측은 DMSO 및 물질 "X"를 함유한다. 도 87a는 24 시간 방치시킨 후의 시험관을 나타내고, 도 87b는 48 시간 방치시킨 후의 시험관을 나타낸다.
도 88a-c는 가열 및 진탕 공정 직후 용매 1 및 2와 함께 물질 "X"를 포함하는 시험관(도 88a), 용매 3 및 4와 함께 물질 "X"를 포함하는 시험관(도 88b) 및 용매 5 및 6과 함께 물질 "X"를 포함하는 시험관(도 88c)의 사진이다.
도 89a-c는 가열 및 진탕 공정하고 60 분후 용매 1 및 2와 함께 물질 "X"를 포함하는 시험관(도 89a), 용매 3 및 4와 함께 물질 "X"를 포함하는 시험관(도 89b) 및 용매 5 및 6과 함께 물질 "X"를 포함하는 시험관(도 89c)의 사진이다.
도 90a-c는 가열 및 진탕 공정하고 120 분후 용매 1 및 2와 함께 물질 "X"를 포함하는 시험관(도 90a), 용매 3 및 4와 함께 물질 "X"를 포함하는 시험관(도 90b) 및 용매 5 및 6과 함께 물질 "X"를 포함하는 시험관(도 90c)의 사진이다.
도 91a-c는 가열 및 진탕 공정하고 24 시간후 용매 1 및 2와 함께 물질 "X"를 포함하는 시험관(도 91a), 용매 3 및 4와 함께 물질 "X"를 포함하는 시험관(도 91b) 및 용매 5 및 6과 함께 물질 "X"를 포함하는 시험관(도 91c)의 사진이다.
도 92a-d는 NeowaterTM를 포함하는 용매 및 감소 농도의 DMSO 중에 물질 "X"를 포함하는 유리병의, 진탕 직후(도 92a), 진탕하고 30 분후(도 92b), 진탕하고 60 분후(도 92c) 및 진탕하고 120 분후(도 92d)의 사진이다.
도 93은 분광광도계에 의해 측정된, 와류하고 6 시간후의 RO/NeowaterTM 중 물질 "X"의 흡수 특징을 나타내는 그래프이다.
도 94a-b는 분광광도계에 의해 측정된, 에탄올 중 SPL2101(도 94a) 및 아세톤 중 SPL5217(도 94b)의 흡수 특징을 나타내는 그래프이다.
도 95a-b는 분광광도계에 의해 측정된, NeowaterTM 중 SPL2101(도 95a) 및 NeowaterTM 중 SPL5217(도 95b)의 흡수 특징을 나타내는 그래프이다.
도 96a-b는 분광광도계에 의해 측정된, NeowaterTM(도 96a) 및 DMSO(도 96b) 중 탁솔(taxol)의 흡수 특징을 나타내는 그래프이다.
도 97은 293T 세포에 대한 상이한 용매 중 탁솔의 세포독성 효과를 나타내는 막대 그래프이다. 대조군 RO = RO 물로 제조한 배지; 대조군 Neo = NeowaterTM로 제조한 배지; 대조군 DMSO RO = RO 물 + 10 ㎕ DMSO로 제조한 배지; 대조군 Neo RO = RO 물 + 10 ㎕ NeowaterTM로 제조한 배지; 탁솔 DMSO RO = RO 물 + DMSO 중 용해된 탁솔로 제조한 배지; 탁솔 DMSO Neo = NeowaterTM + DMSO 중 용해된 탁솔로 제조한 배지; 탁솔 NW RO = RO 물 + NeowaterTM 중 용해된 탁솔로 제조한 배지; 탁솔 NW Neo = NeowaterTM + NeowaterTM 중 용해된 탁솔로 제조한 배지.
도 98a-b는 두 개의 상이한 Taq 중합효소를 사용하여 실시예 32에 기술된 프로토콜에 따라 가열한 후의 나노구조를 포함하는 액체 조성물의 존재하 및 부재하에 수득된 PCR 산물을 나타내는 브롬화 에티듐으로 염색한 DNA 겔의 사진이다.
도 99는 두 개의 상이한 Taq 중합효소를 사용하여 실시예 33에 기술된 프로토콜에 따라 가열한 후의 나노구조를 포함하는 액체 조성물의 존재하 및 부재하에 수득된 PCR 산물을 나타내는 브롬화 에티듐으로 염색한 DNA 겔의 사진이다.
도 100은 가열 탈수 PCR 혼합물 중 NeowaterTM의 다중화 능력을 나타내는 사진다. 도 100a는 인간 인슐린 유전자에 대한 주형 및 프라이머와의 탈수 혼합물을 나타낸다. 도 100b는 PBFDV의 분절에 대한 주형 및 프라이머와의 탈수 혼합물을 나타낸다. M - 1 kb 마커(Marker), 1 - 수크로오스 150 mM Deh_RO;Rehy_RO, 2 - 수크로오스 200 mM Deh_RO;Rehy_RO, 3 - 수크로오스 150 mM Deh_RO;Rehy_NW, 4 - 수크로오스 200 mM Deh_RO;Rehy_NW, 5 - 수크로오스 150 mM Deh_NW;Rehy_RO, 6 - 수크로오스 200 mM Deh_NW;Rehy_RO, 7 - 수크로오스 150 mM Deh_NW;Rehy_RO, 8 - 수크로오스 200 mM Deh_RO;Rehy_NW.
도 101은 극미량 PCR(MVP, micro-volume PCR)에 참여하는 NeowaterTM의 능력을 나타내는 사진이다. MVP는 RO/NeowaterTM 기초 혼합물 모두에 대하여 수행하였다. 혼합물을 10 개의 관에 분취하여 PCR을 수행하였다.
도 102a-c는 syber green(SG)으로 검출한 NeowaterTM 중 베타 액틴 증폭의 증폭 플롯(도 102a), 해리 곡선(도 102b) 및 표준 곡선(도 102c)이다. 청색: 50ng 게놈 DNA; 적색: 5ng 게놈 DNA; 녹색: 0.5ng 게놈 DNA; 흑색: NTC.
도 103a-c는 syber green(SG)으로 검출한 NeowaterTM 중 PD-X 증폭의 증폭 플롯(도 103a), 해리 곡선(도 103b) 및 표준 곡선(도 103c)이다. 청색: 50ng 게놈 DNA; 적색: 5ng 게놈 DNA; 녹색: 0.5ng 게놈 DNA; 흑색: NTC.
도 104는 수산화인회석(HA)-기초 NeowaterTM(HA-18) 슬러리내 용질로서 ZnSO4로부터 Zn의 전기화학적 증착 ECD(electrochemical deposition)의 디지털 현미경사진이다. 이는 NeowaterTM의 QC이다.
도 105a-h는 HA(HA-18) 소스(source) 분말로부터 취한 증가 배율의 HRSEM 현미경사진이다.
도 106a-h는 Si 웨이퍼(wafer) 상에 존재하는 HA-기초 NeowaterTM(HA-18)로부터 취한 HRSEM 현미경사진이다.
도 107a-h는 구리 400 메쉬 카본 필름 TEM 그리드(grid) 상에 존재하는 HA-기초 NeowaterTM(HA-18)로부터 취한 TEM 현미경사진이다.
도 108은 HA-기초 NeowaterTM(AB 1-22-1) 슬러리내 용질로서 ZnSO4로부터 Zn의 전기화학적 증착 ECD의 디지털 현미경사진이다. 이는 NeowaterTM의 QC이다.
도 109a-h는 HA(AB 1-22-1) 소스 분말로부터 취한 증가 배율의 HRSEM 현미경사진이다.
도 110a-h는 Si 웨이퍼 상에 존재하는 HA-기초 NeowaterTM(AB 1-22-1)로부터 취한 HRSEM 현미경사진이다.
도 111a-h는 구리 400 메쉬 카본 필름 TEM 그리드 상에 존재하는 HA-기초 NeowaterTM(AB 1-22-1)로부터 취한 TEM 현미경사진이다.
도 112는 HA-기초 NeowaterTM(AA99-X) 슬러리내 용질로서 ZnSO4로부터 Zn의 전기화학적 증착 ECD의 디지털 현미경사진이다. 이는 NeowaterTM의 QC이다.
도 113a-h는 HA(AA99-X) 소스 분말로부터 취한 증가 배율의 HRSEM 현미경사진이다.
도 114a-h는 Si 웨이퍼 상에 존재하는 HA-기초 NeowaterTM(AA99-X)로부터 취한 HRSEM 현미경사진이다.
도 115a-h는 구리 400 메쉬 카본 필름 TEM 그리드 상에 존재하는 HA-기초 NeowaterTM(AA99-X)로부터 취한 TEM 현미경사진이다.
도 116은 HA-기초 NeowaterTM(AB 1-2-3) 슬러리내 용질로서 ZnSO4로부터 Zn의 전기화학적 증착 ECD의 디지털 현미경사진이다. 이는 NeowaterTM의 QC이다.
도 117a-h는 HA(AB 1-2-3) 소스 분말로부터 취한 증가 배율의 HRSEM 현미경사진이다.
도 118a-h는 Si 웨이퍼 상에 존재하는 HA-기초 NeowaterTM(AB 1-2-3)로부터 취한 HRSEM 현미경사진이다.
도 119a-h는 구리 400 메쉬 카본 필름 TEM 그리드 상에 존재하는 HA-기초 NeowaterTM(AB 1-2-3)로부터 취한 TEM 현미경사진이다.
도 120은 HA-기초 NeowaterTM(HAP) 슬러리내 용질로서 ZnSO4로부터 Zn의 전기화학적 증착 ECD의 디지털 현미경사진이다. 이는 NeowaterTM의 QC이다.
도 121a-h는 HA(HAP) 소스 분말로부터 취한 증가 배율의 HRSEM 현미경사진이다.
도 122a-h는 Si 웨이퍼 상에 존재하는 HA-기초 NeowaterTM(HAP)로부터 취한 HRSEM 현미경사진이다.
도 123a-h는 구리 400 메쉬 카본 필름 TEM 그리드 상에 존재하는 HA-기초 NeowaterTM(HAP)로부터 취한 TEM 현미경사진이다.
도 124은 BaTiO3-기초 NeowaterTM 슬러리내 용질로서 ZnSO4로부터 Zn의 전기화학적 증착 ECD의 디지털 현미경사진이다. 이는 NeowaterTM의 QC이다.
도 125a-j는 BaTiO3 소스 분말로부터 취한 증가 배율의 HRSEM 현미경사진이다.
도 126a-h는 Si 웨이퍼 상에 존재하는 BaTiO3-기초 NeowaterTM로부터 취한 HRSEM 현미경사진이다.
도 127a-f는 구리 400 메쉬 카본 필름 TEM 그리드 상에 존재하는 BaTiO3-기초 NeowaterTM로부터 취한 TEM 현미경사진이다.
바람직한 구체예의 설명
본 발명은 다수의 특징적인 물리적, 화학적 및 생물학적 특징을 가진 나노구조 및 이러한 나노구조를 가지는 액체 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 액체 조성물은 박테리아 콜로니 성장, 전기화학적 증착 등이 예시되나 이로만 한정되지 않는 많은 생물학적 및 화학적 응용예에 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 나노구조 및 액체 조성물의 원리는 도면 및 첨부되는 발명의 상세한 설명에 의해 더욱 이해될 수 있다.
본 발명의 적어도 하나의 구체예를 상세히 설명하기에 앞서, 본 발명은 이후의 발명의 상세한 설명에 나타내었거나 도면에 나타낸 구성요소의 상세 구조 및 배열로 그의 적용이 제한되는 것이 아님을 이해하여야 한다. 본 발명은 그 외에도 구체화할 수 있거나 다양한 방법으로 실행 또는 수행될 수 있다. 또한, 여기에 사용하는 표현 및 용어는 설명을 위한 것이지 제한하는 것으로서 간주되어서는 안되는 것으로 이해하여야 한다.
도면을 참조하면, 도 1은 정연한 유체 분자의 인벨롭(14)에 의하여 둘러싸인 나노미터 크기의 코어 물질(12)을 포함하는 나노구조(10)를 설명한다. 상기 코어 물질(12) 및 인벨롭(14)은 정상의 물리적 상태로 존재한다.
본 명세서에 사용되는 어구 "정상의 물리적 상태(steady physical state)"는 물질 또는 분자가 적어도 극소(local minimum)의 임의의 포텐셜에 의해 결합된 상황을 의미한다. 이와 같은 포텐셜의 대표적인 예로는 반데르발스 포텐셜, 유카와(Yukawa) 포텐셜, 레나르드-존스(Lenard-Jones) 포텐셜 등이 포함되나 이에 한정되지 않는다. 다른 형태의 포텐셜이 또한 예측된다.
본 명세서에 사용되는 어구 "정연한 유체 분자"는 서로 상관관계가 있는 유체 분자의 조직화된 배열을 의미한다.
본 명세서에 사용되는 용어 "약"은 ±10%를 말한다.
본 발명의 바람직한 일면에 따르면, 인벨롭(14)의 유체 분자는 액체 상태일 수도 있고 기체 상태일 수도 있다. 다음의 실시부에서 추가로 입증되는 바와 같이(실시예 3 참조), 인벨롭(14)이 기체 물질을 포함할 경우, 나노구조는 충분한 g-힘에 노출시 부유(floating)할 수 있다.
코어 물질(12)은 물질의 특정 형태 또는 분류에 한정되는 것은 아니고, 상기 나노구조가 설계되는 응용예에 따라 선택될 수 있다. 대표적인 예로는 강유전성 물질, 강자성 물질 및 압전성 물질이 포함되나 이들에 한정되지 않는다. 다음 실시부에서 입증되는 바와 같이(실시예 1 참조), 코어 물질(12)은 결정성 구조를 가질 수도 있다.
강유전성 물질은 일정 온도 범위에서 전기장의 적용에 의하여 역전되거나 방향이 바뀔 수 있는 영구 전기 극성을 유지하는 물질이다. 강자성 물질은 영구 자화를 유지하는 물질이고, 자기장 적용에 의하여 가역적이다. 본 발명의 바람직한 일면에 따르면, 코어 물질(12)이 강유전성 또는 강자성일 때, 나노구조(10)는 그의 강유전성 또는 강자성 특성을 유지한다. 따라서, 나노구조(10)는 마크로 스케일의 물리적 특성이 나노스케일 환경으로 옮겨지는 특징을 가진다.
본 발명의 바람직한 일면에 따르면, 나노구조(10)는 적어도 하나의 추가의 나노구조와 함께 클러스터를 형성할 수 있다. 더욱 상세하게는, 임의 농도의 나노구조(10)가 액체(예, 물)내에서 혼합될 때, 몇몇 나노구조들 사이의 끌어당기는 정전력은 나노구조의 클러스터를 형성하도록 그들 사이에 부착성을 유발할 수 있다. 바람직하게도, 상기 나노구조 사이의 간격이 클러스터 형성을 방해하는 경우에도, 나노구조(10)는 다른 나노구조와 원거리 상호작용(약 0.5-10 ㎛)을 유지할 수 있다. 액체에 존재하는 나노구조들 사이의 원거리 상호작용은 상기 액체에 독특한 특징을 유도하며, 이러한 성질은 비한정적인 생물학적 및 화학적 분석법과 같은 많은 응용예에 활용될 수 있다.
나노구조(10)의 독특한 특성은 예를 들어 "탑-다운(top-down)" 공정을 사용하여 나노구조(10)를 생성함으로써 달성될 수 있다. 더욱 상세하게는, 나노구조(10)는 마이크로 크기(즉, 직경 1 ㎛ 이상 또는 10 ㎛ 이하) 입자의 원료(raw) 분말로부터 생성될 수 있으며, 상기 분말은 나노미터 크기의 입자를 제공하도록 제어된 방법으로 파쇄된다. 전형적으로, 이러한 공정은 전자기 라디오 주파수(RF) 조사의 조건하에서 고온의 원료 분말이 삽입되는 차가운 액체(필수적이지는 않지만 바람직하게는 물)중에서 수행된다.
바람직한 액체로 언급된 물의 물리적 특징에 대해 검토를 한 뒤, 제조 과정 을 더욱 상세히 설명한다.
따라서, 물은 가장 주목할만한 물질 중의 하나이고, 매우 잘 연구되었다. 물은 하나의 산소 원자에 두 개의 수소 원자가 부착된 매우 간단한 분자처럼 보이지만, 복잡한 성질을 가진다. 물은 수소 결합 때문에 높은 표면 장력, 높은 점도, 및 다른 물질 주변에 스스로 정연한 육각, 오각 12면체의 물 배열을 형성하는 능력과 같은 다양한 성질을 가진다.
물의 녹는점은 유사한 분자량을 가진 다른 분자에 대해 예상되는 녹는점보다 100K 이상 더 높다. 물의 육각 얼음 상태(얼음 및 눈의 일반적인 형태)에서, 모든 물 분자는 4 개의 수소 결합에 관여하며 비교적 정적으로 유지된다. 액체 물에서, 몇몇 수소 결합은 분자가 주변으로 이동하도록 파괴되어야 한다. 이 결합들을 파괴하는데 필요한 많은 에너지는 용융 과정 동안 공급되어야 하고, 상대적으로 소량의 에너지만은 부피 변화로부터 회수된다(reclaim). 자유 에너지 변화는 녹는점에서 0이 되어야 한다. 온도가 증가함에 따르면, 액체 물에서 수소 결합의 양은 줄어들고, 그의 엔트로피는 증가한다. 용융은 오직 결합을 파괴하는데 필요한 에너지를 제공하기에 충분한 엔트로피 변화가 있을 때에만 발생할 것이다. 액체 물의 낮은 엔트로피(높은 조직화)는 끓는점을 높힌다.
대부분의 물 특성은 수소 원자 하나가 두 개의 산소 원자에 대하여 비교적 강한 힘으로 끌어당겨질 때(상호 대향시) 일어나는 상기 언급된 수소 결합에 의한 것으로, 이는 두 원자들 사이의 결합으로서 작용하는 것으로 생각될 수 있다.
물은 높은 밀도를 가지며, 이 밀도는 극대값을 가지게 되는 3.984 ℃까지 온 도 증가에 따라 증가한다. 이 현상은 물의 밀도 이상(density anomaly)으로 알려져 있다. 액체 물의 높은 밀도는 주로 수소 결합된 네트워크의 응집 특성에 기인한 것이다. 이는 자유 부피를 줄여 비교적 높은 밀도를 확보함으로써 수소 결합된 네트워크의 부분적인 개방 특성을 보상한다. 예외적인 물의 온도-밀도 거동은 12면체 퍽커링(puckering) 정도가 다른 전체 또는 부분적으로 형성된 클러스터내 환경 영역을 사용하여 설명될 수 있다.
최대 밀도(및 최소 몰 부피)는, 밀도를 증가시키는 구조적 붕괴와 밀도를 낮추는 열적 팽창을 유발하는 온도 증가의 상반 효과에 의해 초래된다. 낮은 온도에서는 고농도의 팽창 구조가 존재하는 반면, 높은 온도에서는 고농도의 붕괴 구조 및 단편이 존재하는데, 이들이 차지하는 부피는 온도와 함께 팽창한다. 온도가 증가함에 따른 팽창 구조로부터 붕괴 구조로의 변화는 각각 덜 정연한 구조 및 더 강한 수소 결합 벤딩(bending)에 기인한 엔트로피 및 엔탈피의 양의 변화를 수반한다.
일반적으로, 물의 수소결합은 광범위한 네트워크를 생성하고, 이는 다수의 육각, 오각 12면체의 물 배열을 형성할 수 있다. 수소결합된 네트워크는 대규모 정연성을 가진다. 더우기, 수소 결합의 정연화(ordering) 효과 및 비정연화(disordering) 동역학 효과 사이에는 온도 의존 경쟁이 존재한다.
공지된 바와 같이, 물 분자는 정연한 구조 및 상부 구조(superstructure)를 형성할 수 있다. 예를 들어, 단백질 및 탄수화물과 같은 다양한 생체분자의 둘레에 정연한 물의 쉘(shell)이 형성된다. 이들 생체분자의 둘레에 정연한 물 환경은 예를 들어 수용체로부터 세포 핵으로의 시그널 전달을 비롯한 세포내 기능과 관련된 생물학적 기능과 크게 연관이 있다. 또한, 이러한 물 구조는 안정하여 분자의 표면을 보호할 수 있다.
액화된 물의 정연한 구조의 대부분은 전형적으로 약 1 ㎚의 단거리 스케일에 있다. 원거리 정연성(order)이 원칙적으로 존재할 수 있지만, 물이 액상이면 원거리 정연성은 자발적으로 발생할 가능성은 극히 낮은데, 이는 액체 상태에 있는 분자들이 일정한 열 운동을 하고 있기 때문이다. 수소 결합 및 비-결합 상호작용으로 인해, 물 분자는 특정의 구조화된 클러스터링과 함께 무한한 수소결합 네트워크를 형성할 수 있다. 따라서, 물 분자의 작은 클러스터는, 다른 작은 클러스터와 추가로 클러스터되어 수 백개의 물 분자로 구성된 20면체의 물 클러스터를 형성할 수 있는 물 옥타머를 형성할 수 있다. 따라서, 물 분자는 정연한 구조를 형성할 수 있다.
물의 다른 성질로는 높은 끓는점, 높은 임계점, 압력(이상 압력)에 의한 녹는점 감소, 적어도 약 46℃까지는 온도가 증가함에 따라 감소하는 압축성 등이 포함된다.
물의 고유 특성은 나노구조(10)를 제조하기 위해 본 발명의 발명자에 의해 채용되었다. 따라서, 본 발명의 추가의 일면에 따르면, 액체 조성물을 제조하는 방법이 제공된다.
이제, 본 발명의 바람직한 구체예에 따른 방법의 플로우챠트인 도 2a에 대해 설명한다. 이 방법은 다음의 방법 단계를 포함한다: 제 1 단계로, 고체 분말(예, 미네랄, 세라믹 분말, 유리 분말, 금속 분말, 합성 중합체 등)을 충분히 높은 온도, 바람직하게는 약 700 ℃ 이상으로 가열한다. 고려되는 고체 분말의 대표적인 예로 BaTiO3, W03 및 Ba2F9O12가 포함되나 이들에 한정되지 않는다. 본 발명자들은 수산화인회석(HA)이 또한 조성물의 제조에 사용될 수 있다는 것을 예기치않게 알게 되었다. 수산화인회석은 무독성을 특징으로 하기 때문에 특히 바람직하며, 일반적으로 인간 치료요법에 대하여 FDA 승인되어 있다.
실시예 34에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 액체 조성물은 모두 시그마 알드리치(Sigma Aldrich)로부터 상업적으로 입수가능한 5 개의 상이한 수산화인회석 분말(HA-18, AB 1-22-1, AA99-X, AB 1-2-3 및 HAP)로부터 생성되었다. 많은 다른 수산화인회석 분말이 다양한 제조업자, 이를 테면 클래리온 파마슈티칼스(clarion pharmaceuticals)(예, 카탈로그 번호 1306-06-5)로부터 입수가능하다는 것이 인지될 것이다. 본 발명에 따른 HA 기초 액체 조성물 모두가 BaTiO3에 기초한 액체 조성물과 매우 유사하다는 것을 전자 현미경에 의해 나타내었다 - 도 104-127a-f. 더욱이, 표 36에 나타낸 바와 같이, HA에 기초한 액체 조성물은 모두 물에 비해 향상된 완충능을 포함하였다.
제 2 단계로, 상기 가열된 분말을 그의 밀도 이상 온도(density anomaly temperature) 이하(예, 3 ℃ 또는 2 ℃)의 차가운 액체, 바람직하게는 물에 침지한다. 제 2 단계와 실질적으로 동시에 수행되는 본 방법의 제 3 단계로, 차가운 액체 및 분말을 전자기 RF 조사선, 바람직하게는 500 MHz 이상의 조사선에 조사하는 데, 여기서 상기 조사선은 연속파 RF 조사선 또는 변조 RF 조사선일 수 있다.
액체에서 나노구조의 형성은 다음과 같이 설명될 수 있다. 차가운 액체와 RF 조사선(즉, 크게 진동하는 전자기장)의 조합은 입자 및 액체 사이의 계면에 영향을 주고, 이로 인해 액체 분자와 입자가 떨어진다. 떨어진 액체 분자는 자유 래디칼 형태이고, 이들은 입자의 (나노 크기) 파편(debris)을 둘러싼다. 낮은 온도에서, 자유 래디칼 및 파편은 정상의 물리적 상태로 된다. 나노구조에 대한 자유 래디칼의 인력은 액체 분자의 상관 길이에 비해 상대적으로 작은 크기의 나노구조로부터 이해될 수 있다. 문헌[D. Bartolo, et al., Europhys. Lett., 2000, 49(6): 729-734]에는 작은 크기의 섭동(perturbation)이 원거리 상호작용에 의해 증폭되는 순수 카시미르(pure Casimir) 효과에 기인한 것임이 개진되어 있다.
본 발명에 따른 상기 방법을 수행함으로써 본 발명의 나노구조를 성공적으로 제조하였다. 특히, 상기 방법은 이하 상세히 설명되는 바와 같이 인벨롭(14)의 형성을 가능케한다. 따라서, 본 발명의 다른 일면에 따르면, 액체 및 나노구조(10)를 가지는 액체 조성물이 제공된다. 상기 방법에 따라 액체 조성물을 제조하는 경우, 추가적인 단계 없이, 나노구조(10)의 인벨롭(14)은 바람직하게는 액체 분자와 동일한 분자로부터 형성된다. 또한, 최종 조성물에서 인벨롭(14)의 적어도 일부가 액체 분자와 다른 분자로부터 형성되도록, 나노구조는 다른 액체와 (RF 조사선의 존재 또는 부재하에) 추가로 혼합될 수 있다. 인벨롭(14)의 형성으로 인해, 나노구조의 비중은 바람직하게는 액체의 비중과 동일하거나 작다.
나도 구조의 농도는 제한되지 않는다. 바람직한 농도는 리터 당 1020 나노구조 이하, 보다 바람직하게는 리터 당 1015 나노구조 이하이다. 당업자들이라면 상기 농도인 경우에 조성물에서 나노구조들간의 평균 간격이 미크론 단위로서 다소 크다는 것을 인지할 것이다. 다음의 실시부에서 더욱 상세히 설명되고 입증되는 바와 같이, 본 발명의 액체 조성물은 많은 고유의 특징을 가진다. 이러한 특징은 예를 들어 나노구조들 간의 원거리 상호작용에 의해 향상될 수 있다. 특히, 원거리 상호작용은 상기 비교적 낮은 농도의 사용을 가능케한다.
나노구조들간의 상호작용(원거리 및 단거리 상호작용)은 박테리아 콜로니의 자기 조직화(organization)와 유사하게 액체 조성물의 자기 조직화 능력을 향상시킨다. 박테리아 콜로니가 성장하면, 자기 조직화는 박테리아 콜로니로 하여금 외부의 악조건에 대해 대항하게 하고, 성장 속도를 개선시키기 위해 환경으로부터 "집단적 습득(collectively learn)"하게 한다. 유사하게, 원거리 상호작용 및 그에 의한 액체 조성물의 원거리 정연성은, 상이한 온도, 전류, 조사선 등과 같은 비한정적인 다른 환경 조건에 맞게 조정될 수 있도록 액체 조성물로 하여금 자기-조직화를 수행하게 한다.
본 발명의 액체 조성물의 원거리 정연성은 액체 조성물을 전기화학 증착(electrochemical deposition; ECD) 실험예에 적용한 경우에 가장 잘 확인된다(다음의 실시부에서 실시예 9 참조).
ECD는 전기화학적 공정을 개시하기 위해 기질에 전위차(예를 들어, 두개의 전극을 이용)를 적용하는 공정이다. ECD 공정의 특정 성질은 그에 따라 얻은 물질 분포이다. 전기화학 공정동안, 주어진 전류에서 전극 사이의 측정된 전위는 기질 내의 여러 형태의 과-전압 및 저항 강하의 합이다. 저항 강하의 크기는 기질의 전도성 및 전극들간의 간격에 의존한다. 한 전극의 특정 국소 영역의 전류 밀도는 대항 전극까지의 거리에 대한 함수이다. 이런 효과는 일차 전류 분포(primary current distribution)라 불리며, 전극의 기하구조(geometry) 및 기질의 전도성에 의존한다.
평형(equilibrium) 전압과 비교하여 전극 사이의 전위차가 크면 기질은 비-평형 상태로 전이되며, 그 결과로 다른 형상의 구조가 형성된다. 문헌[E. Ben-Jacob, "From snowflake formation to growth of bacterial colonies," Cont. Phys., 1993, 34(5)]에 의해 비-평형 상태에 있는 계(system)가 형상을 선택할 수 있고/있거나 두 형상(조밀한 분기형태(branching) 형상 및 수지형태(dendritic) 형상) 사이의 전이를 거치는 것이 밝혀졌다.
본 발명의 바람직한 구체예에 따르면, 본 발명의 액체 조성물을 전기화학 증착 셀에 배치하면, 우세한 형상(예를 들어, 조밀한 가지형태 및/또는 수지형태)이 형성된다. 바람직하게도, 본 발명의 액체 조성물은 다른 액체(예를 들어, 물)에 의해 대체되는 경우에도, 세포 표면 상의 전기화학적 사인을 보존할 수 있다. 보다 구체적으로, 본 발명의 바람직한 구체예에 따르면, 액체 조성물은 먼저 전기화학 증착 셀의 표면과 접촉된 뒤, 예정된 세척 프로토콜에 따라 세척되며, 조성물의 전기화학적 사인은 세포 표면 상에 보존된다.
나노구조의 원거리 상호작용은 또한 본 발명의 액체 조성물을 새로운 환경 조건(예를 들어, 온도 변화)에 적용하고 조성물내 나노구조들 사이의 상호작용과 관련된 하나 이상의 물리량에 대한 새로운 환경 조건의 영향을 조사함으로 입증될 수 있다. 이러한 물리량의 하나는 초음파 속도이다. 다음에 오는 실시부에서 입증된 바와 같이, 본 발명의 액체 조성물은 물에 비해 향상된 초음파 속도에 의해 특징지워진다.
본 발명의 추가적인 특징은 액체 조성물과 고체 표면 사이의 작은 접촉 각이다. 바람직하게, 액체 조성물과 고체 표면 사이의 접촉 각은 액체(나노구조 부재)와 표면 사이의 접촉 각 보다 작다. 당업자들이라면 작은 접촉 각에 의해 액체 조성물이 보다 넓은 표면을 젖게 한다는 것을 인지할 것이다. 상술한 나노구조들 사이의 원거리 상호작용의 도움으로 인해, 본 발명의 특징이 액체 조성물중 나노구조의 고농도 뿐만 아니라 저농도로 제한되지 않는다는 것이 이해될 것이다.
본 발명의 액체 조성물의 또 다른 추가의 특징은 용해성이다. 다음에 오는 실시부에 입증된 바와 같이, 본 발명의 액체 조성물은 물에 비해 향상된 물질 용해능 또는 물질 분산능에 의해 특징지워진다(도 74-79).
본원에 사용된 용어 "용해시키다"란 수성 환경에 가용화 또는 더욱 가용화하도록 하는 본 발명의 액체 조성물의 능력을 말한다.
본원에 사용된 용어 "분산시키다"란 물질의 용해도에 따라 현탁액으로 만드는 조작을 말한다.
따라서, 본 발명의 추가의 일면에 따라, 물질의 분산 또는 용해를 가능하게 하는 조건하에서 물질을 나노구조 및 액체와 접촉시키는 단계를 포함하여, 물질을 용해시키거나 분산시키는 방법이 제공된다.
본 발명의 나노구조 및 액체는 치료용 제제, 화장용 제제 및 진단용 제제와 같은 약제학적 제제를 비롯한 임의의 물질(예를 들어, 활성제), 이를 테면 단백질, 핵산, 소분자 및 탄수화물을 용해/분산시키는데 사용될 수 있다.
치료용 제제는 예를 들어 약물, 핵산 작제물, 백신, 호르몬, 효소, 소분자(예를 들어 요오드) 또는 항체와 같은 임의의 생물학적 활성 인자일 수 있다. 치료용 제제의 예로는 항생제, 자유 래디칼 발생제, 항진균제, 항바이러스제, 비뉴클레오시드 역전사효소 억제제, 단백질분해효소 억제제, 비스테로이드성 항염증 약물, 면역억제제, 항히스타민제, 레티노이드제, 타르제(tar agent), 진양제(antipuritic agent), 호르몬, 소랄렌(psoralent) 및 항개선제(scabicide agent)가 포함되나 이들에 한정되지 않는다. 본 발명에 의해 전달가능한 핵산 작제물은 폴리펩티드(이를 테면 효소 리간드 또는 펩티드 약물), 안티센스(antisense) RNA 또는 리보자임을 암호화할 수 있다.
본 발명의 화장용 제제로는 예를 들어 항주름제(anti-wrinkling agent), 항여드름제, 비타민, 박피제(skin peel agent), 모낭 자극제 또는 모낭 억제제일 수 있다. 화장용 제제의 예로는 레티노산 및 그의 유도체, 살리실산 및 그의 유도체, 황-함유 D 및 L 아미노산 및 그의 유도체 및 염, 특히 N-아세틸 유도체, 알파-히드록시산(예를 들어, 글리콜산 및 락트산), 피틴산, 리포산 및 당업계에 공지된 많은 다른 제제가 포함되나 이들에 한정되지 않는다.
본 발명의 진단용 제제는 질환 상태를 나타내는 분자에 특이적인 항체, 화학약품 또는 염료일 수 있다.
물질은 가용화 공정을 촉진하기 위해 본 발명의 액체 조성물의 첨가 이전 또는 첨가 이후 용매에 용해될 수 있다. 본 발명에서 극성, 비극성, 유기(이를 테면 에탄올 또는 아세톤) 또는 비유기 용매를 비롯한 임의의 용매를 사용하는 것은 물질의 용해도를 더욱 증가시키기 위한 것임을 인지할 것이다.
물질이 본 발명의 액체 조성물에 계속 용해/분산되어 있도록 용매는 가용화 공정 중 언제라도 (완전히 또는 부분적으로) 제거될 수 있다. 증발(즉, 가열 또는 가압에 의해) 또는 임의의 다른 방법과 같이 용매를 제거하는 방법은 당업계에 공지되어 있다.
본 발명에 따른 액체 조성물의 추가의 특징은 완충능이다. 다음에 오는 실시부에 입증된 바와 같이, 본 발명의 액체 조성물은 물에 비해 향상된 완충능에 의해 특징지워진다(도 74-79).
본 발명에 따른 액체 조성물의 또 다른 추가의 특징은 단백질 안정성이다. 다음에 오는 실시부에 입증된 바와 같이, 본 발명의 액체 조성물은 물에 비해 향상된 단백질 안정화능에 의해 특징지워진다(도 98a-b-도 99).
본 발명을 실시하는 동안에, 액체 조성물 제조에 사용된 고체 분말이 박테리아에 대해 독성을 띠는 경우에도, 본 발명의 액체 조성물이 박테리아 콜로니 팽창률 및 파지-박테리아 또는 바이러스-세포 상호작용의 증가를 촉진시킬 수 있음이 예기치않게 실현되었다(다음에 오는 실시예 6, 7 및 10 참조). 상술한 바와 같이 코어 물질(12)을 둘러싸는 인벨롭(14)을 형성시키는 액체 조성물의 독특한 제조 방법은 박테리아 또는 파지에 대한 액체 조성물의 임의의 독성 영향을 상당히 억제한다.
본 발명의 액체 조성물의 추가적인 특징은 소위 제타(ζ) 전위에 관한 것이다. ζ 전위는, 내부에 존재하는 전기장의 영향하에 입자가 액체내로 이동할 수 있는 전기영동 및 전기분극영동이라 불리는 물리적 현상에 관한 것이다. ζ 전위는 다른 거동을 가지는 액체의 두 영역 사이의 경계로 정의된 쉐어(shear) 평면에서의 전위이다. 입자의 전기영동적 이동(장 세기에 대한 입자 속도의 비)은 ζ 전위에 비례한다.
표면과 관련된 양이므로, 입자의 총 표면적이 그들의 총 부피에 비해 크며 입자 크기가 작은 계에서 ζ 전위는 특히 중요하고, 표면 관련 현상은 그들의 거동을 결정한다.
본 발명의 바람직한 구체예에서, 액체 조성물은 액체 그 자체의 ζ 전위 보다 실질적으로 큰 ζ 전위를 특징으로 한다. 큰 ζ 전위는 액체 중의 향상된 나노구조의 이동에 대응하므로, 따라서 큰 ζ 전위는 예를 들어 전기화학 증착 공정에서 특정 형상의 형성에 기여할 수 있다.
액체 조성물의 ζ 전위를 측정하는 다수의 방법으로는 현미경 전기영동, 광 산란, 광 회절, 음향학, 전기 음향학 등이 포함되나 이들에 한정되지 않는다. 예를 들어, ζ 전위를 측정하는 방법 중 하나가 미국특허 제 6,449,563 호에 개시되어 있고, 그의 내용은 본 명세서에 참고 내용으로 포함된다.
앞의 배경 기술 부분에서 설명한 바와 같이, 본 발명은 또한 분자 생물학 연구 및 진단 분야에 관한 것이고, 특히 중합효소 연쇄반응(PCR), 리가제 연쇄반응(LCR), 가닥 치환 증폭(strand displacement amplification, SDA) 및 자기-부양 염기서열 복제(self-sustained sequence replication, SSSR)와 같으나 이에 한정되지 않는 핵산 증폭 기술에 관한 것이다.
본 발명자는 본 발명의 액체 조성물이 예를 들어 PCR 공정 중에서 DNA 중합효소의 촉매 활성을 향상시킴으로써 핵산 증폭 공정의 효율을 개선시킬 수 있다는 것을 밝혀내었다. 촉매 활성의 향상은 바람직하게는 마그네슘 또는 망간과 같으나 이에 한정되지 않는 추가적인 보조인자를 사용하지 않고 달성된다. 당업자들에 의해 인지되는 바, 마그네슘-무함유 또는 망간-무함유 PCR을 사용하는 능력이 매우 유리하다. 이는 PCR 공정의 효율이 반응에 존재하는 보조인자의 농도에 매우 민감한 것으로 알려졌기 때문이다. 목적하는 증폭 효율을 달성하기 전에, 숙련된 과학자들에게는 종종 보조인자의 농도를 먼저 계산하거나 보조인자의 농도를 다양하게 하면서 다수의 시험을 할 것이 요구된다.
따라서, 본 발명의 액체 조성물을 사용하면 사용자가 PCR 혼합물 내의 보조인자의 농도를 계산하거나 다양하게 할 필요없이 간단하고 높은 효율의 멀티-사이클 PCR 공정을 수행할 수 있다.
추가적으로, 본 발명자는 중합효소 연쇄반응이 임의의 추가 완충액 또는 액체 없이 일어날 수 있다는 것을 밝혀내었다. 임상 분석에의 PCR 적용과 연관된 주요 문제점 중 하나는 캐리오버(carryover) 오염에 대한 PCR의 감수성이다. 이는 이전 PCR에서 증폭된 분자를 가지는 시료 오염에 기인한 거짓 양성이다. 전체 공정이 임의의 추가 완충액 또는 액체를 필요로 하지 않고 수행될 수 있기 때문에, 단독 PCR 혼합물인 본 발명의 액체 조성물을 사용하면 캐리오버 오염의 가능성을 상당히 감소시키므로 오염의 위험을 피할 수 있다.
실시예 17에 기술되고 도 55-62, 도 102a-c 및 103a-c에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 액체 조성물은 감도를 향상시켜 실시간 PCR 반응의 반응 부피를 감소시키는 것으로 나타났다. 본원에 사용된 실시간 PCR 반응은 각각의 PCR 사이클 동안 이중가닥 DNA 검출 분자(예를 들어, 염료)의 존재하에 수행되는 PCR 반응을 말한다.
더욱이, 본 발명자들은 본 발명의 액체 조성물이 매우 작은 부피의 PCR 반응(예를 들어, 2 ㎕)에 사용될 수 있음을 알아내었다. 또한, 본 발명자들은 본 발명의 액체 조성물이 가열 탈수 동시다중 PCR 반응에 사용될 수 있음을 알아내었다.
따라서, 본 발명의 바람직한 구체예로 중합효소 연쇄반응용 키트가 제공된다. 본 발명의 PCR 키트에는 바람직하다면 본 발명에 따른 키트 유닛을 하나 이상 함유할 수 있는 팩으로 제공될 수 있다. 팩은 키트 사용 설명서를 포함할 수 있다. 또한, 팩에는 실험 보충물의 제조, 사용 또는 판매를 규제하는 행정기관에 의해 규정된 형태의 용기와 연관된 통지서를 첨부될 수 있으며, 이 통지서는 조성물의 형태에 대한 상기 행정기관의 승인을 반영한다.
하나의 일면에 따르면, 키트는 바람직하게는 분리된 패키지 상태로 (a) Taq 중합효소와 같으나 이에 한정되지 않는 열안정성 DNA 중합효소; 및 (b) 본 발명의 액체 조성물을 포함한다.
본 발명의 또 다른 추가의 일면에 따르면, 키트는 실시간 PCR 키트에 사용되며, 이중가닥 DNA 검출 분자와 같은 적어도 하나의 실시간 PCR 시약을 추가로 포함한다. 키트의 성분은 별도로 또는 임의의 조합으로 포장될 수 있다.
본원에 사용되는 어구 "이중가닥 DNA 검출 분자"는 정량화가능 시그널(예를 들어, 형광 시그널)을 생성하는 이중가닥 DNA 상호작용 분자를 말한다. 예를 들어, 이러한 이중가닥 DNA 검출 분자는 (1) DNA의 단편 또는 엠프리콘(amplicon)과 상호작용하고 (2) 분리된 상태의 엠프리콘의 존재하에서보다 이중쇄로 형성된 상태의 엠프리콘의 존재하에서 상이한 파장을 방출하는 형광 염료일 수 있다. 이중가닥 DNA 검출 분자는 이중가닥 DNA 삽입 검출 분자 또는 프라이머-기초 이중가닥 DNA 검출 분자일 수 있다.
이중가닥 DNA 삽입 검출 분자는 프라이머, 엠프리콘 또는 핵산 주형에 공유적으로 연결되지 않는다. 검출 분자는 이중가닥 DNA의 존재하에 그의 방출을 증가시키며, 이중쇄 DNA가 풀린 경우 그의 방출을 감소시킨다. 예로는 브롬화 에티듐, YO-PRO-1, Hoechst 33258, SYBR Gold 및 SYBR Green I가 포함되나 이들에 한정되지 않는다. 브롬화 에티듐은 이중가닥 DNA 단편의 염기쌍 사이에 삽입하는 형광 화학약품으로서, 통상적으로 겔 전기영동 이후 DNA를 검출하는데 사용된다. 254 nm 내지 366 nm 사이의 자외선에 의해 여기되는 경우, 590 nm의 형광을 방출한다. 단일가닥 DNA의 존재하에서 DNA-브롬화 에티듐 복합체는 브롬화 에티듐보다 약 50배 이상의 형광을 생성한다. SYBR Green I는 497 nm에서 여기하고 520 nm에서 방출한 다. SYBR Green I의 형광 강도는 단일가닥 DNA에 대해서보다 이중가닥 DNA와 결합시 100 배 이상 증가된다. SYBR Green I의 대체물은 몰레큘라 프로브스 인코포레이션(Molecular Probes Inc.)에 의해 소개된 SYBR Gold이다. SYBR Green I과 마찬가지로, SYBR Gold의 형광 방출은 이중쇄 DNA의 존재하에 향상되고, 이중가닥 DNA가 풀어진 경우 감소된다. 그러나, SYBR Gold의 여기 피크는 495 nm이고, 방출 피크는 537 nm이다. 보고에 따르면, SYBR Gold가 SYBR Green I 보다 더 안정한 것으로 나타났다. Hoechst 33258은 이중쇄 DNA의 AT 풍부 영역과 결합하는 이중가닥 DNA 검출 분자인 공지된 비스벤즈이미드이다. Hoechst 33258은 350 nm에서 여기하고 450 nm에서 방출한다. 450 nm에서 여기하고 350 nm에서 방출하는 YO-PRO-1는 이중가닥 DNA 특이 검출 분자인 것으로 보고되어 있다. 본 발명의 바람직한 구체예에서, 이중가닥 DNA 검출 분자는 SYBR Green I이다.
프라이머-기초 이중가닥 DNA 검출 분자는 프라이머에 공유적으로 연결되어, 엠프리콘이 이중쇄 구조를 형성하는 경우 형광 방출을 증가시키거나 감소시킨다. 증가된 형광 방출은 프라이머-기초 이중가닥 DNA 검출 분자가 프라이머의 3' 말단 가까이 부착되고 프라이머 말단 염기가 dG 또는 dC인 경우에 관찰된다. 검출 분자는 말단 dC-dG 및 dC-dG 염기쌍 부근에서 소광되고, 검출 분자가 프라이머의 말단으로부터 적어도 6 개의 뉴클레오티드만큼 떨어져 내부에 위치된 경우 엠프리콘의 이중쇄 형성의 결과로서 탈소광된다. 탈소광은 형광 방출을 실질적으로 증가시킨다. 이러한 형태의 검출 분자의 예로는 플루오레세인(488 nm에서 여기하고 530 nm에서 방출함), FAM(494 nm에서 여기하고 518 nm에서 방출함), JOE(527 nm에서 여기 하고 548 nm에서 방출함), HEX(535 nm에서 여기하고 556 nm에서 방출함), TET(521 nm에서 여기하고 536 nm에서 방출함), Alexa Fluor 594(590 nm에서 여기하고 615 nm에서 방출함), ROX(575 nm에서 여기하고 602 nm에서 방출함) 및 TAMRA(555 nm에서 여기하고 580 nm에서 방출함)가 포함되나 이들에 한정되지 않는다. 반대로, 일부 프라이머-기초 이중가닥 DNA 검출 분자는 단일가닥 DNA에 비해 이중가닥 DNA의 존재하에 그의 방출을 감소시킨다. 예로는 로다만 및 BODIPY-FI(504 nm에서 여기하고 513 nm에서 방출)가 포함되나 이들에 한정되지 않는다. 이들 검출 분자는 통상 5' 말단 dC 또는 dG에서 프라이머와 공유적으로 컨쥬게이트되며, 엠프리콘이 이중쇄인 경우 더 적은 형광을 방출한다. 이중쇄 형성시 형광의 감소는 검출 분자와 극히 근접한 부근에서 상보적 가닥 구아노신의 소광 또는 말단 dC-dG 염기쌍의 소광에 기인한다.
추가적으로, PCR 및 실시간 PCR 키트는 dATP, dCTP, dGTP, dTTP와 같으나 이에 한정되지 않는 적어도 하나의 dNTP를 포함할 수 있다. 또한, dITP 및 7-데아자(deaza)-dGTP와 같은 유사체가 고려된다.
본 발명의 바람직한 구체예에 따르면, 상기 키트는 적어도 하나의 대조군 주형 DNA 및/또는 적어도 하나의 대조군 프라이머를 추가로 포함하며, 사용자가 PCR 성능을 확인하기 위한 적어도 하나의 대조군 시험을 수행하게 할 수 있다.
본 발명의 추가적인 일면에 따르면, DNA 서열을 증폭하는 방법이 제공되고, 상기 방법은 도 2b의 플로우챠트에 예시된 다음의 방법 단계를 포함한다. 본 방법의 첫번째 단계에서, 본 발명의 액체 조성물이 제공되고, 두번째 단계에서 DNA 서 열에 대해 다수의 PCR 사이클이 상기 액체 조성물의 존재하에 수행된다.
PCR 사이클은 미국특허 제 4,683,195 호, 제 4,683,202 호, 제 4,800,159 호, 제 4,965,188 호, 제 5,512,462 호, 제 6,007,231 호, 제 6,150,094 호, 제 6,214,557 호, 제 6,231,812 호, 제 6,391,559 호, 제 6,740,510 호 및 국제 특허출원 공개 제 WO/9911823 호와 같으나 이에 한정되지 않은 문헌에 공지된 임의의 방식으로 수행될 수 있다.
바람직하게, 각 PCR 사이클에서는, DNA 서열이 먼저 처리되어 단일가닥 상보 가닥을 형성한다. 이어서, DNA 서열에 특이적인 올리고뉴클레오티드 프라이머 쌍이 액체 조성물에 첨가된다. 그후, 프라이머 쌍이 단일가닥 상보 가닥 상의 상보 서열에 어닐링된다. 적절한 조건하에서, 어닐링된 프라이머는 연장되어 각각의 단일가닥에 각각 상보적인 연장 산물을 합성하게 된다.
유리 비드와 같은 고체 지지체에 폴리뉴클레오티드를 고정시키는 것은 분자 생물학 연구 및 의약 분야에 최상의 이익을 제공할 수 있다.
본 명세서에 사용된 "폴리뉴클레오티드"는 결합하여 임의 크기의 사슬을 형성하는 DNA 또는 RNA 분자로 정의된다.
폴리뉴클레오티드는 연구 및 의학적 응용예에 증폭, 전사, 역전사, 결찰, 제한효소, 핵산전달감염 및 형질전환을 포함하나 이들에 한정되지 않는 다양한 방식으로 조작될 수 있다.
본 명세서에 사용된 "결찰"은 한 핵산 가닥의 3' 말단을 다른 5' 말단에 결합시켜 연속 가닥을 형성하는 것으로 정의된다. "전사"는 DNA로부터 메신저 RNA의 합성으로 정의된다. "역전사"는 RNA로부터 DNA의 합성으로 정의된다. "제한효소"는 DNA 분자를 제한 엔도뉴클레아제로 불리는 특정 효소를 가지는 소형 단편으로 절단하는 공정으로 정의된다. "형질전환"은 박테리아 세포가 나(naked) DNA 분자를 흡수하는 공정이다. "핵산전달감염"은 세포가 DNA 분자를 흡수하는 방법이다.
전형적으로, DNA 조작은 한 단계후 다른 단계가 이어지는 일련의 반응을 포함한다. 따라서, 전형적인 예로서 DNA는 초기에 제한 소화된 후, 증폭되어 박테리아로 형질전환된다. 각각 고유의 완충액을 필요로 하는 각각의 반응은 바람직하게는 각각 고유의 적합한 반응 조건하에서 수행된다. 전형적으로, 각각의 반응에서, DNA 또는 RNA 시료를 침전시킨 다음 그의 새로운 적합한 완충액내에서 재구성해야한다. 반복된 침전 및 재구성은 시간이 걸리며, 더욱 중요하게도 출발 물질을 손실시키기 때문에, 이런 요소가 적을 때 가장 적합할 수 있다. 폴리뉴클레오티드를 고체 지지체에 고정시키는 경우 이러한 상황은 예방된다.
따라서, 본 발명의 추가의 일면에 따르면, 액체 및 나노구조물을 포함하는 액체 조성물이 제공되고, 이 액체 조성물은 고체 지지체의 존재하에 적어도 하나의 거대분자의 조작을 가능케 하며, 이에 의해 각 나노구조는 정연한 유체 분자의 인벨롭에 의해 둘러싸인 나노미터 크기의 코어 물질을 포함하고, 상기 코어 물질 및 상기 정연한 유체 분자의 인벨롭은 정상적인 물리적 상태이다.
고체 지지체는 DNA와 RNA를 결합시키는 동시에 상술한 후속 반응에서 다른 분자를 DNA 및 RNA에 결합시켜 상호반응하게 할 수 있는 임의의 고체 지지체일 수 있다.
본 발명의 발명자는 폴리뉴클레오티드를 고정시킬 수 있는 유리 비드가 폴리뉴클레오티드를 무손상 상태로 남아 있게 하기 위해 본 발명의 액체 조성물을 필요로 함을 밝혀내었다. 즉, 실시예 16에 설명된 바와 같이, 유리 비드의 존재하에 PCR 증폭을 거치는 DNA는 PCR 산물의 가시화를 위해 본 발명의 액체 조성물의 존재를 필요로 한다.
핵산 증폭 이외에, 본 발명의 액체 조성물은 많은 화학적 및 생물학적 분석법 및 반응을 향상시키기 위하여 완충액으로 사용되거나, 기존 완충액에 첨가될 수 있다.
따라서, 일례로, 본 발명의 액체 조성물은 DNA 분자를 적어도 부분적으로 디폴딩하기 위하여 사용될 수 있다.
다른 구체예로, 본 발명의 액체 조성물은 DNA의 분리 및 정제를 촉진시키기 위해 사용될 수 있다.
또 다른 구체예로, 본 발명의 액체 조성물은 실시예 19에 입증된 바와 같이 핵산 혼성화를 향상시키기 위해 사용될 수 있다. 핵산은 DNA 및/또는 RNA 분자(즉, 핵산 서열 또는 그의 단일 염기)일 수 있다.
핵산 중 하나는 고체 지지체(예를 들어, DNA 칩)와 결합될 수 있다. DNA 칩의 예로는 포커스 어레이 칩(focus array chip), Affymetrix 칩 및 일루미나 비드 어레이 칩(illumina bead array chip)이 포함되나 이들에 한정되지 않는다.
액체 조성물이 혼성화를 향상시킨 것으로 나타났으므로, 본 발명은 발현 수준이 낮은 유전자를 검출하는데 특히 유용할 수 있다.
또 다른 구체예로, 본 발명의 액체 조성물은 알칼리성 포스파타제 또는 β-갈락토시다제가 예시되나 이들에만 한정되지 않는 결합 또는 비결합 효소인 다양한 효소의 효소 활성을 안정화시키기 위해 사용될 수 있다.
그밖의 또 다른 구체예로, 본 발명의 액체 조성물은 고상 매트릭스에의 거대분의 결합을 증가시키기 위하여 사용될 수 있다. 다음의 실시부에서 추가로 입증되는 바와 같이(실시예 1 참조), 본 발명의 액체 조성물은 친수성 및 소수성 물질 둘 다에 대한 결합을 향상시킬 수 있다. 또한, 본 발명의 액체 조성물은 소수성 영역 및 친수성 영역을 가지는 물질에 대한 결합을 향상시킬 수 있다. 하나 이상의 탄수화물 친수성 또는 탄수화물 소수성 영역, 항체, 폴리클로날 항체, 렉틴, DNA 분자, RNA 분자 등을 가진 거대분자를 포함하나 이에 한정되지 않는 많은 거대분자의 상기 물질에 대한 결합력은 향상될 수 있다.
또한, 다음의 실시부에서 추가로 입증되는 바와 같이(실시예 12-14 참조), 본 발명자는 본 발명의 액체 조성물이 칼럼의 커패시티를 향상시키고, 수지에 핵산을 결합시키고, 겔 전기영동 분리를 향상시키기 위하여 사용될 수 있음을 밝혀내었다.
본 발명의 추가의 목적, 장점 및 신규한 특징은 비한정적인 하기 실시예의 실험을 통해 당업자들에게 자명할 것이다. 또한 상기 설명되고 이하 청구 범위에서 청구하는 본 발명의 다양한 일례 및 일면은 하기 실시예를 통해 실험적으로 입증될 것이다.
상기한 설명과 함께하기 실시예를 참고하여 본 발명을 비한정적으로 설명한 다.
하기 실시예는 본 발명의 나노구조 및 액체 조성물을 사용하여 수행된 다양한 특징화 실험에 관한 것이다, 하기 실험예에 사용된 나노구조 및 액체 조성물은 상술된 본 발명의 상세한 설명에 따라 제조되었다. 보다 구체적으로, 나노구조 및 액체 조성물을 제공하기 위해 사용된 제조방법에서, 하기 프로토콜이 사용되었다:
먼저, 마이크로 크기의 BaTi03의 분말을 880 ℃의 온도로 가열하였다. 그 다음으로, 가열된 분말을 915MHz 주파수의 연속파 RF 조사선의 조건하에 2 ℃의 물에 침지시켰다. 조사선 및 급냉에 의해 마이크로 크기 입자의 분말이 나노구조로 파쇄된다. 이어서, 액체 조성물(나노구조 및 물)을 실온으로 가열하였다.
하기 실시예에서, 본 발명의 바람직한 구체예에 따라 제조된 다양한 액체 조성물은 LC1, LC2, LG3, LC4, LC5, LC6, LC7, LC8 및 LC9로 언급된다. 일부 다른 실시예에서, 본 발명의 다양한 예시적 구체예에 따라 제조된 다양한 액체 조성물은 두-쿱 테크놀로지스(Do-Coop technologies)]의 상표명인 상표명 NeowaterTM로 언급된다.
실시예 1
고체-유체 커플링 및 나노구조의 클러스터링
본 실시예에서는, 코어 물질에 대한 주변 유체 분자의 커플링을 구조 유체 시스템의 최신 기술인 극저온-온도 투과 전자 현미경(cryo-TEM)으로 조사하였다. 분석은 제 1 단계로, 본 발명의 액체 조성물(LC1)을 초고속으로 냉각하여 유리질 시료를 제공하고, 제 2 단계로, 유리질 시료를 극저온에서 TEM을 통해 조사하는 단계를 포함한다.
도 3a-e는 본 발명의 나노구조의 TEM 이미지를 나타낸다. 도 3a는 4 개의 나노구조가 차지하고 있는 길이 약 200 ㎚, 폭 약 150 ㎚인 영역의 이미지이다. 도 3a에 도시된 바와 같이, 나노구조는 유체 분자의 중간 영역을 통해 클러스터를 형성하며; 이중 한 영역은 흑색 화살표로 표시되었다. 도 3a에 백색 화살표로 표시된 나노구조 주변의 줄무늬(striation)는 그의 결정성 구조를 암시한다.
도 3b는 직경이 약 20 ㎚인 단일 나노구조의 이미지이다. 백색 화살표로 표시된 밝은 코로나는 프레스넬 효과(Fresnel effect)로 통상 알려진 광학 간섭 효과의 결과일 수 있다. 나노구조 중심으로부터 또 다른 위치에서 밝은 코로나에 비해 더 어두운 추가의 코로나(도 3b에서 흑색 화살표로 표시)가 관찰되었다. 어두은 코로나는 코어를 둘러싸는 유체 분자의 정연한 구조를 나타내며, 따라서 전체 나노구조는 정상적인 물리적 상태이다.
도 3c-e는 도 3c에 도시된 스케일-바아에 의해 예시되는 동일 배율이다. 도 3c는 도 3a보다 확대 배율로 클러스터에 대한 본 발명의 나노구조의 능력을 추가로 입증한다. 도 3d는 결정면으로 특정화되는 단일 나노구조를 나타내고, 도 3e는 하나가 결정면으로 특정화되고 다른 하나는 그의 결정성 구조에 또한 기인한 뚜렷이 정연한 어두운 영역을 가지는 2 개의 나노구조의 클러스터를 나타낸다.
실시예 2
액체 조성물에 대한 염료 효과
본 발명의 액체 조성물과 염료의 상호작용을 조사하였다. 상술된 바와 같이 제조된 액체 조성물을 에탄올에 용해시킨 Ru계 염료(N3)로 염색하였다.
본 발명의 액체 조성물(LC1)을 함유하는 제 1 큐벳(cuvette)을 염료 용액에 24 시간동안 노출시켰다. 액체 조성물을 함유하는 제 2 큐벳을 하기 프로토콜에 노출시켰다: (i) 교반, (ii) 공기 스트림으로 건조 및 (iii) 염색. 순수한 물을 함유하는 두개의 추가의 큐벳을 대조군으로 상기 시험에 적용하였다.
도 4는 4 개의 시험 결과를 나타낸다. 도 4에 도시된 바와 같이, 염료의 첨가는 색이 유지되는 순수한 물과는 반대로(도 4의 아래 곡선) 염료의 색을 탈색시킨다(도 4의 아래 곡선). 따라서, 나노구조와의 상호작용은 전자 구조의 변화에 의하거나 염료의 산화에 의해 염료 스펙트럼에 영향을 미친다.
큐벳 사진에서 탈색은 최고의 증거가 된다. 본 발명의 액체 조성물을 함유하는 도 4에 존재하는 모든 시료를 교반하였다. "건식 S-R"로 지칭된 시료는 24 시간 건조 상태로 유지시켰고; "습식 S-R"로 지칭된 시료는 에탄올에 유지시켰으며; "염료 S-R"로 지칭된 시료는 염색(에탄올에서 염색)하였고, "염료 S-건식 R"로 지칭된 시료는 건조하고 재측정하였다.
실시예 3
액체 조성물에 대한 고 g 원심분리의 효능
본 발명의 액체 조성물을 함유하는 관(tube)을 고 g 값(약 30 g)으로 원심분리하였다.
도 5a-b는 원심분리후 본 발명의 액체 조성물(LC1)에 대한 5 개의 적분광 산 란(ILS) 측정 결과를 나타낸다. 도 5a는 관의 하부에서 기록된 시그널을 나타낸다. 도시된 바와 같이, 1 ㎛ 미만의 구조로부터의 시그널은 관의 하부로부터 기록되지 않았다. 도 5b는 관의 상부에서 기록된 시그널을 나타낸다. 1 ㎛ 미만의 구조가 명백히 존재한다. 모든 측정에서, 피크 위치는 약 200-300 ㎚의 나노구조와 일치한다.
이 실험을 통해 나노구조가 숙주 액체(물)의 비중보다 낮은 비중을 가진다는 것이 입증되었다.
실시예 4
pH 시험
본 발명의 액체 조성물에 대해 2 회 pH 시험하였다. 제 1 시험에서, pH 영향을 표시하기 위해 본 발명의 액체 조성물(LC1)에 카라민 지시제를 첨가하였다.
도 6a는 적정동안 카라민 지시제의 스펙트럼 변화를 나타낸다. 이들 스펙트럼은 액체 조성물의 pH를 조사하기 위하여 사용된다. 도 6b는 액체 조성물이 pH 7.5에서 물의 스펙트럼에 가까워짐을 나타낸다. 도 6c는 공정에 사용된 최초 물과 달리 수개의 액체 조성물 시료가 pH 7.5 스펙트럼을 가짐을 나타낸다.
처음 시험의 결과는 액체 조성물이 순수한 물의 pH 값보다 높은 7.5의 pH를 가짐을 제시한다.
두번째 시험에서는, 브로모 티몰 블루(BTB)를 본 발명의 액체 조성물(LC1)에 첨가하였다. 이 지시제는 pH 자체에 영향을 미치지 않으나, 관심있는 pH 범위에서 변색시킨다.
1 번 및 4 번 시료에 대한 흡수 스펙트럼이 도 7에 도시되어 있고, 여기에서 "HW"는 액체 조성물의 스펙트럼을 나타내고; "+"는 양질(positive quality)의 결과를 나타내고; "-"는 음질(negative quality)의 결과를 나타낸다. BTB의 두 흡수 피크를 도 7에 도시하였다. 이들은 보다 산성일 때 황색을 나타내고 보다 염기성일 때 녹청색인 피크 결과를 나타낸다. 액체 조성물에 첨가시에, 액체 조성물의 색과 품질의 상관관계가 확인되었다. 액체 조성물의 녹색(염기성)이 보다 양질임을 나타낸다.
실시예 5
제타 전위 측정
본 발명의 액체 조성물에 대해 제타(ζ) 전위를 측정하였다. 도 8은 6 개의 시료에 대한 ζ 전위를 나타낸다; 초 순수물; pH 8로 이동된 초 순수물, pH 10으로 이동된 초 순수물, 양질의 액체 조성물의 시료 2 개 및 음질의 액체 조성물의 시료 1 개. ζ 전위 측정은 제타 치수 측정기(Zeta Sizer)를 사용하여 수행하였다.
도시된 바와 같이, 본 발명의 액체 조성물의 ζ 전위는 상당히 높았으며, 이는 액체에서의 나노구조의 고 이동성(high mobility)을 암시한다.
실시예 6
박테리오파지 반응
박테리오파지 형별에 대한 본 발명의 액체 조성물(LC9)의 효능을 조사하였다.
재료 및 방법
1) 공중 건강 연구소(Public Health Laboratory, Colindale, UK), 국제 표준 연구실(URL: www.phls.co.uk)로부터 입수한 스타필로코쿠스 아우레우스(staphylococcus aureus: SA)의 파지 형별에 대한 표준 국제 키트의 박테리오파지 6번 및 83A번
2) 아가 플레이트용 배지: 영양소 아가 옥소이드 2 번(Nutrient agar Oxoid No 2)(cadalog number CM 67 Oxoid Ltd.) + CaCl2. 오토클레이브 멸균후, 각 리터의 배지에 20 ㎖의 CaCl2를 첨가하였다.
3) 액체 배양물용 배지: 영양소 액체배지 2 번 옥소이드(Nutrient Broth No 2 Oxoid): 28 g/리터.
4) 파지 형별 농도: 각 박테리오파지를 1 및 100 RTD로 시험하였다(일반적인 시험 희석).
5) 파지 증식: 각 파지를 대조군 및 본 발명의 액체 조성물을 기본으로 하는 시험 배지에서 병행하여 증식시켰다.
6) 표면적 측정을 위한 컴퓨터화 "Sketch" 소프트웨어를 이용하여 용균 표면적을 측정하였다.
7) 통계학적 분석: 광학 밀도 분석에 반복 측정을 이용하는 변동 분석법(ANOVA)을 이용하고, 용해물 표면적 측정에 Microsoft WindowsTM용 SPSSTM 소프트웨어를 사용한 2 방식(ways) ANOVA법을 이용하였다.
결과
박테리오파지 반응 촉진
도 9a-b는 다음과 같이 시험 배지에서의 박테리오파지 반응을 나타낸다: 도 9a는 대조 배지(우측) 및 본 발명의 액체 조성물(좌측)에서의 박테리오파지 6 번을 나타내고; 도 9b는 대조 배지(우측) 및 본 발명의 액체 조성물(좌측)에서의 박테리오파지 83A 번을 나타낸다. 본 발명의 액체 조성물에서의 박테리오파지 반응은 박테리아의 용해가 촉진되었음을 입증한다(액체 조성물에서 1 시간 및 대조 배지에서 3 시간).
시험 플레이트상에서 우수한 용해 면적이 즉시 관찰되었고, 배양 24 시간동안 더 크게 유지되었다. RTD 농도 측정에 의해 대조군과 시험 플레이트 간의 명확한 차이가 입증되었다.
면적 측정
도 10은 대조군과 액체 조성물 사이의 용균 표면적을 비교하여 나타낸 막대 그래프이다. 파지 형별에 대해 2 방식 ANOVA법을 이용하여 통계학적 유의차를 결정하였다. 상응하는 수치를 하기 표 2 및 3에 나타내었다.
파지 대조군 조성물
6번 2.488 6.084
2.238 2.441
3.246 5.121
평균 2.657333 4.548667
STD 0.524901 1.887733
83번 2.898 7.369
2.61 4.748
4.692 8.261
평균 3.4 6.792667
STD 1.128133 1.826037
2 방식 ANOVA법 - 의존 변수: 면적
인자 SS d.f. MS F 유의차
파지 6.69 1 6.69 3.168 0.113
RO 물 20.94 1 20.94 9.917 0.014
파지-물 1.691 1 1.691 0.801 0.397
파지 반응 면적의 유의적인 증가가 액체 조성물(p=0.014)에서 관찰되었다. 파지(p=0.113) 및 배지 상호작용(p=0.397) 사이에는 유의차가 없었으며, 이는 본 발명의 액체 조성물이 두 시험 파지 모두에 대해 동일한 효능을 가짐을 나타낸다.
RTD 결정
도 11은 각 증분으로 10 배씩 증가된 희석을 나타낸다. 본 발명의 액체 조성물에서 파지의 농도 증가는 1번 웰보다 100 배 희석된 3번 웰에서 관찰되었다.
용균반응-광학 밀도 판독
도 12는 6 번 파지의 광학 밀도(OD)를 시간 함수로서의 나타낸 그래프이다. 개시점으로부터 평균 변화에 대한 상응하는 수치 및 파지 반응에 대한 OD가 각각 표 3 및 4에 제시되어 있다. 반복 측정에 대한 ANOVA가 표 5에 제시되어 있다.
6번 파지 83A번 파지
시간 대조군 조성물 대조군 조성물
15' 1.079109 1.052213 1.035938 1.038375
36' 1.142857 1.102157 1.139063 1.128668
67' 1.207373 1.205448 1.221875 1.180587
150' 1.407066 1.321226 1.366406 1.345372
275' 1.515361 1.434733 1.810938 1.3386
311' 1.483871 1.449489 1.686719 1.327314
22시간 1.616743 1.094211 2.735938 0.87246
6번 파지 83A번 파지
시간 대조군 조성물 대조군 조성물
0 0.668 0.446 0.642 0.428
0 0.634 0.435 0.638 0.458
평균 0.651 0.4405 0.64 0.443
STD 0.024042 0.007778 0.002828 0.021213
15 0.733 0.471 0.642 0.458
15 0.672 0.456 0.684 0.462
평균 0.7025 0.4635 0.687 0.46
STD 0.043134 0.010607 0.029698 0.002828
36 0.764 0.485 0.728 0.486
36 0.724 0.486 0.73 0.514
평균 0.744 0.4855 0.729 0.5
STD 0.028284 0.000707 0.001414 0.019799
67 0.799 0.537 0.777 0.523
67 0.773 0.525 0.787 0.523
평균 0.786 0.531 0.687 0.523
STD 0.018385 0.008485 0.007071 0
150 0.966 0.571 0.87 0.596
150 0.866 0.593 0.879 0.596
평균 0.916 0.582 0.8745 0.596
STD 0.070711 0.015556 0.006364 0
275 0.978 0.639 1.132 0.602
275 0.995 0.625 1.186 0.584
평균 0.9865 0.632 0.687 0.593
STD 0.012021 0.009899 0.038184 0.012728
311 0.964 0.644 1.081 0.602
311 0.968 0.633 1.078 0.574
평균 0.966 0.6385 1.0795 0.588
STD 0.002828 0.007778 0.002121 0.019799
22시간 1.003 0.463 1.691 0.388
22시간 1.102 0.501 1.811 0.385
평균 1.0525 0.482 0.687 0.3865
STD 0.070004 0.02687 0.084853 0.002121
파지 인자 SS d.f. MS F 유의차
83번 시간 17804.37 6 2967.396 164.09 0.001
시간-물 27350 6 4558.334 252.033 0.001
대조군-LC 10851.38 1 10851.38 55.805 0.017
6번 시간 6449.544 6 10.74.924 32.31 0.001
시간-물 2024.998 6 337.5 10.145 0.001
대조군-LC 904.547 1 904.547 15.385 0.059
도 12 및 표 3-5에서 입증된 바와 같이, 배지와 시간 사이에는 유의적인 상관관계가 있다. 보다 구체적으로, 6번 파지 및 83A번 파지 둘 다에서 대조군과 본 발명의 액체 조성물 사이에 유의차가 있다(p=0.001). 본 발명의 액체 조성물에서 파지 반응은 반대 방향으로 유의차를 나타낸다.
22 시간에서, 파지의 포텐시(potency) 증가에 기인할 수 있는 용해물의 첨가 "킥(kick)"이 관찰되었다.
모든 대조군 OD(배지 단독, 파지 단독, 박테리아 단독, 상이한 파지를 가지는 대조군 및 조성물에서)에서는 차이가 없었으며, 시험 반응에서는 유의차가 있었다.
결론
본 발명의 액체 조성물은 파지 반응 시간을 촉진시키고(3배); 용균 표면적을 증가시키며; RTD를 증가시킨다(100배 이상).
OD 측정에 있어서 본 발명의 액체 조성물에서의 박테리오파지 반응은 대조군과 상반된 경향을 나타내며, 경시적으로 포텐시가 증가하였다.
검토
파지-숙주 상호작용의 동역학은 액체 조성물을 함유하는 배지에서 증가하였다. 이는 반복 실험 및 "성장 곡선 동역학(kinetic)"에서 측정되었다. 동역학에 영향을 미치는 파라미터는 측정 인자(예: pH, 온도 등)에 대해 비의존적이다. 22시간 반응후 관찰된 바와 같이, 파지 농도뿐 아니라 그의 포텐시가 증가한다. 본 발명의 액체 조성물에서의 파지가 여전히 효과적인 시점에서, 대조 배지에서의 파지는 효과적이지 않았다. 또한, 액체 조성물로 예비처리된 증식 균주가 훨씬 효과적이다.
실시예 7
파지-박테리아 상호작용에 대한 액체 조성물의 효능
람다(λ) 파지에 대한 본 발명의 액체 조성물의 효능을 조사하였다. λ 파지는 분자 생물학에서 유기체의 게놈 DNA를 나타내기 위하여 사용된다. 하기 실험예는 표준 λ 파지 상호작용 적용에 의존한다. 모든 실험예에서, 시험군의 물질은 액체 조성물을 용매로 사용하여 제조하였다. 대조군의 물질은 후술하는 바와 같이 제조하였다. 대조군의 pH는 7.2 내지 7.4인 액체 조성물 용액의 pH로 조정하였다.
재료 및 방법
1) LB 배지
10 g의 박토 트립톤(Bacto Tryptone), 5 g의 효모 추출물 및 10 g의 NaCl을 1000 ㎖의 증류수에 용해시킨 다음, 오토클레이브(121 ℃, 1.5 atm에서 45 분간)로 멸균하였다.
2) LB 플레이트
15 g의 박토 아가(Bacto Agar)를 1000 ㎖의 LB 배지에 가하여 혼합하고, 상술한 바와 같이 오토클레이브로 처리하였다. 50 ℃로 냉각후, 배지를 무균 플라스틱 플레이트에 부었다. 플레이트를 사용전에 이틀간 예비배양하였다.
3) Top 아가로스 0.7%
100 ㎖의 LB 배지를 0.7 g의 화학적으로 순수한 전기영동급 아가로스(Difco 또는 다른 공급처로부터 입수)와 혼합한 후, 오토클레이브(121 ℃, 1.5 atm에서 45 분간)로 멸균하였다.
4) MgS0 4 -10 mM
1.2 g의 MgSO4를 1000 ㎖의 증류수에 용해시키고, 오토클레이브로 멸균하였다.
5) 말토스 20%(w/v)
200 g의 말토스를 1000 ㎖의 증류수에 용해시키고, 20 ㎛ 필터를 통한 여과에 의해 멸균하였다.
6) MgS0 4 -1M
120.37 g의 MgSO4를 1000 ㎖의 증류수에 용해시키고, 오토클레이브로 멸균하였다.
7) 10 mM의 MgSO 4 및 0.2%의 말토스를 함유하는 LB
100 ㎕의 1M MgSO4 및 100 ㎕의 말토스 20%를 99.8 ㎖의 LB 배지에 첨가하였다.
8) SM 완충액(파지 저장 완충액 )
5.8 g의 NaCl, 2 g의 MgSO4, 50 ㎖의 1M 트리스 HCl(pH 7.5), 5 ㎖의 2%(w/v) 젤라틴을 최종 부피가 1000 ㎖가 되도록 증류수에 용해시킨 후, 오토클레이브로 멸균하였다.
9) 박테리아 균주(숙주)
대장균(E. coli) XL1 Blue MRA(Stratagene).
10) 파지
λ GEM 11(Promega).
11) LB 플레이트에서 박테리아 배양
XL1 세포를 일반적인 박테리아 접종 절차에 따라 박테리아 루프를 이용하여 LB 플레이트에 분산시켰다. 플레이트를 37 ℃에서 16 시간동안 배양하였다.
12) LB 액체 배지에서 박테리아 배양
LB 플레이트로부터 XL1 세포의 단일 콜로니를 취해 LB 액체 배지에 접종한 후 200 rpm으로 진탕하면서 37 ℃에서 16 시간동안(밤새) 배양하였다.
13) 파지에 의한 숙주 박테리아 균주의 감염
10 mM의 MgS04 및 0.2% 말토스가 보충된 LB 배지에 XL1 세포를 접종하였다. 600 ㎚ 파장에서 0.6의 혼탁도가 얻어질 때까지(4-5 시간) 200 rpm으로 진탕하면서 37 ℃로 계속 배양하였다. 성장 배지(grown culture)를 4000 rpm으로 5 분간 원심분리하였다. 상등액을 버리고, 600 ㎚ 파장에서 0.6의 혼탁도가 얻어질 때까지 박테리아를 10 mM의 MgS04에 재현탁시켰다. 파지를 함유하는 필요한 양의 SM 완충액을 200 ㎖의 재현탁 박테리아에 첨가하였다. 37 ℃에서 15 분간 배양한 후, 하기 상이한 두 방법으로 처리하였다:
(i) 용해물을 제조하기 위하여, 적절한 부피의 LB 배지를 숙주-파지 혼합물에 첨가하고, 200 rpm으로 진탕하면서 37 ℃에서 16 시간동안(밤새) 배양하였다.
(ii) 고체 배지(플라크)상에 파지를 출현시키기 위해, 용융 Top 아가로스(50 ℃)를 숙주-파지 혼합물에 붓고 신속히 혼합한 후, 예열된 LB 플레이트상에 도포하였다. 아가로스 고형화후, 37 ℃에서 16 시간동안(밤새) 배양하였다.
14) 파지 DNA의 추출
박테리아 파편(bacterial debris)이 침강되도록 박테리아 용해물을 6000 rpm에서 5-10 분간 원심분리하였다. 상등액을 모아 파지 입자가 침강하도록 14000 rpm에서 30 분간 원심분리하였다. 상등액을 버리고, 파지 펠렛을 젤라틴-무함유 SM 완충액에 재현탁시켰다. 뉴클레아제(임의 공급처로부터의 RNase 및 DNase) 혼합물을 파지 현탁액 1 ㎕당 5-10 Weiss 단위의 최종 농도로 재현탁 파지에 첨가하였다. 37 ℃에서 30 분동안 배양한 후, 임의의 잔류 박테리아 핵산의 완전 소화가 필요할 경우, 파지의 DNA를 다음의 절차에 따라 추출하였다:
(ⅰ) 페놀:클로로포름:이소아밀 알콜(25:24:1 v/v)로 추출;
(ⅱ) 클로로포름에 의해 페놀 오염물 제거;
(ⅲ) 0.3M의 포타슘 아세테이트 및 1 부피의 이소프로판올의 최종 농도로 침전;
(ⅲ) 70% 에탄올로 세척; 및
(ⅳ) 추가의 분석을 위해 건조 및 증류수에 재현탁.
결과
플라크 형성 단위(PFU) 적정 실험
파지 원액을 SM 완충액에서 1/10으로 일련적으로 희석하여 파지 현탁액을 제조하였다: 하나는 본 발명의 액체 조성물에 기초하여 SM 완충액에서 제조하고 다른 하나는 ddH20에 기초하여 SM 완충액에서 제조하였다.
각 희석액 1 ㎕를 200 ㎕의 경쟁 박테리아 숙주와 배양하였다(13번 방법 참조). 현탁액을 37 ℃에서 15 분동안 배양하여 박테리오파지의 DNA가 숙주 박테리아에 주입되도록 하였다. 배양후, 뜨거운(45-50 ℃) top 아가로스를 첨가하고, LB 플레이트상에 분산시켰다. 각각의 희석액 및 처리액에 대한 9 개의 복제물 및 처리물을 제조하였다.
하기 표 6은 밤새 배양후 계수된 PFU 수준을 나타낸다.
파지 희석액 대조군 조성물
10-3 평균 S.D. 506 724
684 845
761 704
651 879
618 617
683 612
932 860
697 652
746 891
697.5556 753.7778
115.6083 115.4597
10-4 평균 S.D. 70 119
11 129
77 90
32 111
96 91
53 106
56 120
71 100
25 183
54.55556 116.5556
27.41857 28.20067
수치를 형질전환 제곱근으로 변경하여 데이터를 파라미터 시험을 수행하는데 필요한 값으로 표준화하였다. 하기 표 7은 요인(factorial) ANOVA법에 의한 데이터 분석 결과를 나타낸다.
인자 SS d.f. MS 유의차
처리 48.9147 1 48.9147 P=0.01
농도 2893.0255 1 2893.0255 P=0.01
상호작용 14.7506 1 14.7506 P=0.01
에러 238.8006 32 7.4938
유의 수준: P 0.05(d.f. 1; 32) = 4.14909, P 0.01(d.f. 1; 32) = 7.49924.
PFU 적정에 있어서의 농도(0.001 대 0.0001), 처리(시험군 대 대조군) 및 상호작용(처리와 농도의 임의의 조합) 간의 유의적인 효과를 검출하였다. 실험 구조의 결과로서 농도간의 유의차가 예상된다. 그러나, 본 발명의 액체 조성물에 의해 야기된 PFU 적정에 있어서의 유의적 증가는 특별히 설명될 필요가 있으며, 이후 실시예의 검토부에서 설명한다.
LB에서 대장균 균주 XLI-Blue 박테리아 성장
대조군 및 본 발명의 액체 조성물에 기초한 배지 모두에서 2 개의 LB 플레이트 각각의 1/8 섹터상에 2 ㎕의 박테리아 현탁액을 접종(총 16회 접종)하였다. 37 ℃에서 3 일동안 배양한 후, 콜로니의 형태 및 크기를 관찰하였다. 대조군과 액체 조성물 처리군 사이에 유의차가 관찰되지 않았다.
LB 박테리아 배양물(용해물)에서 파지 성장
용해물을 방법(13번)에 기술된 바와 같이 제조한 다음, 6000 rpm에서 5-10 분간 원심분리하여 박테리아 파편을 침강시키고, 혼탁도를 600 ㎚에서 측정하였다. 이어서, 방법(14번)에 상술된 바와 같이 용해물로부터 DNA를 추출하였다. 혼탁도 및 추출된 DNA 농도(대조군에서 0.726 ㎍/㎕; 액체 조성물에서 0.718 ㎍/㎕) 모두에서 대조군과 액체 조성물 처리군 사이에 유의차가 관찰되지 않았다.
검토
3 개 중 2개의 독립적 시험에서, 대조군에 비해 본 발명의 액체 조성물이 사용된 경우 낮은 파지 희석액(10-3 및 10-4)에서 PFU의 유의적인 증가가 관찰되었다.
상기 관찰로부터 예측가능한 사실은 플라크 형성이 별도의 두 공정에 의존한다는 것이다: 그의 숙주를 감염시키는 파지의 능력(감염성) 및 파지에 대한 숙주 친화성.
숙주의 친화성은 파지 재생산을 위한 박테리아 메카니즘 채택에 대한 파지의 능력에 따라 좌우된다. 본 발명의 액체 조성물과 숙주의 친화성의 상관관계는 밝혀지지 않았다. 친화성 증가는 대조군에 비해 많은 플라크의 관찰(초기 감염 부위로부터 더 먼 거리) 또는 대조군에 비해 많은 수의 파지 입자의 관찰에 의해 확립될 수 있다.
본 발명의 액체 조성물이 DNA 파지 준위(level)에 영향을 미치지 않는다는 사실은 이전의 소견을 뒷받침한다.
감염성은 본질적인 파지 입자 및/또는 파지에 의한 박테리아 세포의 감염능에 따라 달라진다. 본 발명의 액체 조성물이 사용되었을 때 PFU의 유의적 증가(대조군에 비해 약 2배 이상)는 본 발명의 액체 조성물이 감염성에 영향을 미친다는 사실을 암시한다. 비처리 박테리아보다 파지에 의해 보다 쉽게 감염되는 경쟁 박테리아를 제조하여 감염 가능성을 상승시키기 위해서는 예비-감염 처리가 필요하다(13번 방법 참조).
낮은 파지 희석액에서, PFU 형성의 제한 인자는 파지에 의한 숙주 세포의 감염능이다.
본 발명의 액체 조성물로 처리되고 성장된 박테리아는 파지에 의한 감염능을 증가시킬 것으로 예상된다. 따라서, 액체 조성물은 박테리아 수용체와 파지 입자간의 친화성을 증가시킬 것으로 예상된다.
실시예 8
마이크로적정 플레이트에 대한 코아귤라제 -음성 스타필로콕시의 부착성에 대한 액체 조성물의 효능
슬라임 폴리사카라이드의 생산은 생체막의 생성 및 유지에 중요하며, 박테리아에서 독성 인자로서 중요한 역할을 담당한다[Gotz F., "Staphylococcus and biofilms," Mol Microbiol 2002, 43(6):1367-78]. 슬라임은 표면에 대한 박테리아의 부착성 및 다층 클러스터를 형성하기 위한 그의 축적을 촉진한다. 슬라임은 또한 숙주의 면역 방어 및 항생제 치료로부터 보호한다[Kolari M. et al., "Colored moderately thermophilic bacteria in paper-machine biofilms," to apear in J Ind Microbiol Biotechnol 2003]. 박테리아에 의해 생성된 생체막은 또한 산업상 문제를 야기할 수 있다.
슬라임을 방지하고자 하는 방법의 대부분은 현재 생체막에서의 신규 항감염 활성 및 생체막을 복잡하게 하는 신규의 생체적합성 물질의 탐구와 연관되어 착안되고 있다.
실리콘상에 코아귤라제-음성 스타필로콕시의 부착성은 항균제의 서브-MIC에 의해 변형될 수 있는 것으로 입증되었다[Besnier JM et al., "Effect of subinhibitory Concentrations of antimicrobial agents on adherence to silicone and hydrophobicity of coagulase-negative staphylococci," Clin Microbiol Infect 1996, 1(4):244-248]. 이러한 효과는 슬라임-생성 및 비-슬라임 생성 균주에서 서로 다르며, 이들 항균제 저해 효능의 메카니즘과 상관관계가 없거나, 소수성의 변형은 소수성에 관여하지 않는 일부 표면 성분들이 시험관내 부착에 중요한 역할을 할 수 있었음을 제시한다.
이식-관련 감염의 치명적인 병원균인 스타필로코쿠스 에피더미스의 항생제에 대한 박테리아 내성은 항생제 접근을 손상시키는 글리코칼릭스 슬라임(glycocalyx slime)의 생성 및 숙주 방어 메카니즘에 의한 치사와 관련이 있다[Konig DP et al, "In vitro adherence and accumulation of Staphylococcus epidermidis RP 62 A and Staphylococcus epidermidis M7 on four different bone cements," Langenbecks Arch Surg 2001, 386(5):328-32]. 생체물질-관련 감염 예방을 위해 개발된 항생제를 함유하는 상이한 골 시멘트(bone cement)의 시험관내 연구가 항상 생체물질-부착 박테리아의 완전 근절을 입증하지는 못한다. 슬라임 부착의 더욱 유리한 억제 방법을 발견하고자 더욱 노력하고 있다.
또한, 표면 상호작용은 슬라임 부착성을 변형시킬 수 있다. 예를 들어, Farooq 등은 문헌[Farooq M et al., "Gelatin-sealed Polyester resists Staphylococcus epidermidis biofilm infection," J Surg Res 1999, 87(1):57-61]에서 젤라틴-주입된 폴리에스테르 이식편이 대동맥 이식편 삽입의 개 모델에서 스타필로코쿠스 에피더미스 생체막 감염을 저해함을 입증하였다. 젤라틴-주입된 폴리에스테르 이식편은 코아귤라제-음성 스타필로코쿠스 생체막 감염에 대한 생체내 내성을 입증하였다.
이 실시예에서의 실험 목적은 플라스틱에 대한 슬라임-생산 스타필로코쿠스 에피더미스(API-6706112)의 부착성에 본 발명의 액체 조성물이 미치는 영향을 조사하는 것이다.
방법
사용된 박테리아는, Bio Merieux sa Marcyl' Eoile, France(API)를 사용하여 스타필로코쿠스 에피더미스 6706112에 대해 98.4% 신뢰도로 동정되었다. 하기 표 8은 사용된 3개의 박테리아 균주를 요약한 것이다.
박테리아 균주 API 번호 신뢰도
24 6706112 98.4%
44 6706112 98.4%
56 6706112 98.4%
슬라임 부착성은 다음과 같이 분광광도계 광학 밀도(OD) 기술로 정량적으로 조사하였다. 본 발명의 액체 조성물과 보통의 물을 상응하는 배지에서 1:2.5로 희석하여 TSB에서 밤새 배양하고, 무균 마이크로적정 조직 배양 플레이트(Cellstar, Greniner labortechnik, Tissue culture Plate, 96W Flat bottom, with LID, sterile No. 655180)에 각각 총 250 ㎕의 부피로 도입하고, 37 ℃에서 배양하였다. 플레이트를 수돗물로 3회 세척하고, 크리스탈 바이올렛으로 염색한 후, 수돗물로 3회 더 세척하였다. 건조후, 염색된 부착 박테리아 필름의 OD를 MicroElisa Auto 판독기(MR5000; Dynatech Laboratories, Alexandria VA)로 550 ㎚ 파장에서 측정하였다. 박테리아 배양물의 OD를 450 ㎚ 및 630 ㎚의 이중 필터를 사용하여 각각의 염색전에 측정하였다. 각 박테리아 균주에 대한 시험은 4회 반복하여 수행하였다.
일정한 간격으로 슬라임 부착성을 평가하기 위하여 실험을 설계하였다. 동역학 평가를 위한 시간표는 18, 20, 22, 24 및 43 시간이었다. 세(3) 균주 모두를 동일한 플레이트상에서 평가하였다. 액체 조성물을 표준 배지 제조에 사용하고, 표준 오토클레이브로 멸균처리하였다.
부착값을 반복 측정에 의한 ANOVA법를 이용하여 동일한 플레이트 시험에 대해 비교하였다; 그룹 분류 인자(grouping factor)는 플레이트 및 균주였다. Microsoft WindowsTM용 SPSSTM 11.0을 사용하는 3 방식 ANOVA법이 상이한 플레이트 시험에 사용되었다.
결과
도 13a-c는 모든 슬라임-생산 스타필로코쿠스 에피더미스에서의 OD를 나타낸다(상기 표 8 참조). 부착성은 본 발명의 액체 조성물에서 유의적으로 상이하였다(p<0.001).
균주 24 및 44의 동역학은 슬라임 부착성의 증가를 나타내었으며(각각 도 13a-b), 균주 56은 부착성의 감소를 나타내었다(도 13c). 시간은 부착성 감소에 유의적인 인자로 밝혀졌으며, 마지막 시간에 가장 낮은 부착성이 관찰되었다. 유의적인 차이가 균주간에 관찰되었으며(p<0.001), 각 균주는 그의 고유의 부착 특성을 가진다. 상이한 균주 및 시간 사이에 유의적인 상호작용이 관찰되었으며(p<0.001), 균주 간의 차이는 시간 의존성이다. 회귀 분석을 통해 시간과 사용한 물의 타입에는 상호작용이 없는 것으로 관찰되었다(p=0.787). 액체 조성물과 대조군에서 부착성 차이는 모든 시간에서 유지되었으며, 18시간에서 개시되어 43시간에서 최고점에 달했다.
균주와 물 사이에 유의적인 상호작용이 관찰되었다(p<0.001). 액체 조성물 및 대조군 물 간의 차이는 균주 의존성이다. 각 균주는 그의 고유의 부착 특성을 가진다. 균주, 시간 및 물 사이에 상호작용은 관찰되지 않았다(p=0.539).
표 9는 슬라임 부착 동역학의 결과를 요약하여 나타낸 것이다(3 방식 ANOVA).
인자 SS df MS F 유의차
시간 1.356 4 0.339 8.624 0.001
균주 28.285 2 14.143 359.743 0.001
물 0.731 1 0.731 18.599 0.001
시간-균주 1.072 8 0.134 3.41 0.002
시간-물 6.75E-02 4 1.69E-02 0.429 0.787
균주-물 1.052 2 0.526 13.374 0.001
시간-균주-물 0.276 8 3.45E-02 0.877 0.539
반복 슬라임 부착 실험을 배양 24 시간후 동일한 형태의 상이한 플레이트상에서 수행하고, 각 균주를 별도의 마이크로적정 플레이트상에서 배양하였다.
도 14는 상이한 마이크로적정 플레이트상에서 15 번 반복한 슬라임 부착 실험을 나타내는 막대 그래프이다. 도시된 바와 같이, 액체 조성물 존재하의 부착성은 대조군에서의 부착성보다 높다.
액체 조성물 및 대조군 사이, 마이크로적정 플레이트 사이 및 균주중에서 유의적인 부착성 차이가 관찰되었다(p<0.001). 유의적인 상호작용이 플레이트, 균주 및 사용한 물 타입 사이에서 관찰되었다. 부착도는 균주, 플레이트 및 사용한 물에 의존한다.
표 10은 별도의 마이크로적정 플레이트에 대한 슬라임 부착성의 결과를 요약하여 나타낸 것이다(3 방식 ANOVA).
인자 SS df MS F 유의차
플레이트 0.572 2 0.286 29.798 0.001
균주 9.484 2 4.742 494.346 0.001
물 1.288 1 1.288 134.276 0.001
플레이트-균주 1.265 4 0.316 32.976 0.001
플레이트-물 2.15E-01 2 1.07E-01 11.183 0.001
균주-물 0.288 2 0.144 15.021 0.001
플레이트-균주-물 0.259 4 6.47E-02 6.744 0.001
플레이트가 플레이트 변형될 가능성을 조사하기 위하여, 다중 분석을 동일 플레이트에 대해 수행하였다(모든 균주).
도 15는 동일한 마이크로적정 플레이트상에서 본 발명의 액체 조성물 및 대조군의 슬라임 부착성 차이를 나타낸다. 하기 표 11-12는 동일한 마이크로적정 플레이트상에서 슬라임 부착성 결과를 요약하여 나타낸 것이다(반복 측정에 의한 ANOVA).
표 11-12에 도시된 바와 같이, 액체 조성물과 대조군을 사용한 슬라임 부착성 간의 유의차가 다시 한번 더 확인되었다. 그러나, 플레이트(p<0.001), 균주(p<0.001) 및 물(p<0.001) 사이에 새로운 유의적인 상호작용이 또한 관찰되었으며, 이는 액체 조성물에서의 부착성 차이가 또한 플레이트, 균주 및 이들 사이의 상호작용에 의존함을 입증하는 것이다.
균주 및 플레이트 사이에 부착성의 유의적인 차이는 플레이트가 플레이트 변형될 가능성을 제시한다. 액체 조성물을 사용한 경우 플레이트가 플레이트 변형된다는 것은 플레이트 표면상에 또는 플레이트 제조동안 액체 조성물과 상호작용할 수 있는 다른 인자들이 존재할 수 있음을 나타낸다.
인자 SS df MS F 유의차
플레이트 3.726 2 1.863 40.32 0.001
균주 8.93 2 4.465 96.623 0.001
플레이트-균주 1.019 4 0.255 5.515 0.001
대상내 인자 효과 F 유의차
조성물-대조군 17.106 0.001
조성물-대조군-플레이트 6.496 0.001
조성물-대조군-균주 50.165 0.001
조성물-대조군-플레이트-균주 0.896 0.001
검토
변형된 표면 부착을 통하여 박테리아 부착성을 변경시키기 위한 본 발명의 액체 조성물의 능력이 연구되었다. 임의의 유기적 또는 PH 변형을 배제한 대조군 배지와 비교할 때, 액체 조성물을 가진 배지는 동일한 완충액을 포함하고 동일한 오토클레이브로 멸균 처리되었다. 상기 액체 조성물에서 소수성 변형은 다소 부착성을 가지는 슬라임에 대한 환경적 선호를 이끌 수 있다. 물의 소수성 능력에 변화를 야기하는 나노구조에 의해 도입되는 표면 성질의 변화는 새로운 정도로 설명될 수 있다.
실시예 9
전기화학적 증착 시험
본 발명의 액체 조성물에 대해 준-이차원 셀에서 일련의 전기화학적 증착 시험이 수행되었다.
실험 장치
실험 장치를 도 16a-c에 나타내었다. 직경 125 mm인 준-이차원 세포(20)는 플렉시글라스 베이스(22) 및 플렉시글라스 커버(24)를 포함한다. 커버(24)가 베이스 22) 위에 위치되었을 때, 준-이차원 캐비티가 약 1 mm 높이로 형성되었다. 2 개의 동심 전극(26)은 세포(20)에 위치하며, 12.4±0.1 V의 전압원(28)에 연결되었다. 외부 전극은 직경 90 mm의 링 모양이고, 0.5 mm의 구리 와이어로 만들어졌다. 내부 전극은 두께 0.1mm, 직경 28mm의 디스크 모양이었다. 외부 전극은 전압원의 양극에 연결되었고 내부 전극은 그의 음극에 연결되었다.
먼저, 실험 장치는 본 발명의 액체 조성물, 및 역삼투(RO)수로 구성되는 대조군 용액(비교용)에 직접 전기화학적 증착을 수행하기 위하여 사용되었다.
다음으로, 실험 장치는 다음과 같이, 전기화학적 증착 사인을 남겨두는 액체 조성물의 능력을 조사하기 위하여 사용되었다. 상기 액체 조성물을 세포(20) 내에 위치시켰다. 30분 동안 베이스(22)와 접촉시킨 후, 상기 액체 조성물을 RO 물로 대체하여 전기화학적 증착 과정을 RO 물에 대해서 수행하였다.
결과
도 17a-b는 본 발명의 액체 조성물(도 17a) 및 대조군(도 17b)의 전기화학적 증착을 나타낸다. 조밀한 분기형태 형상과 수지형태 성장 사이의 전이가 액체 조성물에서 관찰되었다. 조밀한 분기형태 형상은 음극 면으로부터 수 밀리미터 지점에까지 이어졌다. 대조군의 경우, 조밀한 분기형태 형상은 음극에 매우 인접한 곳에서만 관찰되었고 형상 전이(morphology transition)는 관찰되지 않았다.
도 18은 30분 동안 본 발명의 액체 조성물에 접촉한 세포에서의 RO 물의 전기화학적 증착이다. 도 18 및 17b을 비교하면, 상기 액체 조성물이 세포 표면에 뚜렷한 사인을 남기고, 따라서 그위에 분기형태 및 수지형태의 형상을 형성하도록 한다는 것을 알 수 있다. RO 물이 깨끗한 세포에 위치되었던 도 17b에는 이러한 형성이 존재하지 않는다.
세포상에 전기화학적 증착 사인을 보존하는 액체 조성물의 능력은 상기 액체 조성물로 배양한 후 세포 표면에 의해 RO 물위에 유도되는 원거리 정연성으로서 설명될 수 있다.
실시예 10
박테리아 콜로니 성장
바실러스 서브틸리스의 콜로니 성장을 본 발명의 액체 조성물의 존재하에서 조사하였다. 대조군 그룹은 RO 물의 존재하에서 동일한 박테리아를 포함하였다.
도 19a-b는 액체 조성물(도 19a) 및 대조군(도 19b)에 대한 24시간후의 바실러스 서브틸리스 콜로니 성장의 결과를 나타낸다. 도시된 바와 같이, 본 발명의 액체 조성물은 콜로니 성장을 상당히 가속시킨다.
본 발명의 액체 조성물의 고유의 특성을 추가로 입증하기 위해, 원료 분말(이로부터, 상기 액체 조성물의 나노구조가 형성된다) 및 RO 물의 혼합물을 사용하여 앞에서 상세히 설명한 제조공정없이 부가적인 실험을 수행하였다. 본 혼합물은 소스 분말(SP) 물로서 이하에서 언급된다.
도 20a-c는 SP 물(도 20a), RO 물(도 20b) 및 액체 조성물(도 20c)에 대한 바실러스 서브틸리스 콜로니 성장의 결과를 나타낸다. 도시된 바와 같이, SP 물의 존재하에서의 콜로니 성장은 심지어 RO 물에서의 콜로니 성장보다 더 느린데, 이는 원료 물질 그 자체가 박테리아에 악영향을 미친다는 것을 나타내는 것이다. 반면, 본 발명의 액체 조성물은, 원칙적으로 상기 액체 조성물이 동일한 물질로 구성되어 있음에도 콜로니 성장을 크게 가속시켰다.
실시예 11
고체상 매트릭스에 거대분자 결합
무수한 생물학적 처리와 반응은 마이크로적정 플레이트, 막, 비드, 칩 등과 같은 고체상 매트릭스 위에서 수행된다. 고체상 매트릭스는 예를 들어, 소수성, 친수성, 전기적(예, 하전, 극성) 특성 및 친화성을 비롯한 상이한 물리적 및 화학적 특성을 가질 수 있다.
본 실시예에서 기술된 실험의 목적은 상이한 물리적 및 화학적 특성을 가진 마이크로적정 플레이트 및 막에 대한 생물학적 물질의 결합에 미치는 본 발명의 액체 조성물의 영향을 조사하는 것이다.
방법
모두 NUNCTM에 의하여 만들어진 다음의 마이크로적정 플레이트를 사용하였다: (ⅰ) 혼합된 친수성/소수성 영역을 가지며 IgG 및 다른 분자들에 대한 높은 결합능 및 친화성 특징이 있는 MaxiSorpTM(IgG의 결합능은 650 ng/㎠와 동일); (ⅱ) 소수성 표면을 가지며 지질에 대한 높은 결합능 및 친화성 특징이 있는 PolySorpTM; (ⅲ) PolySorpTM 및 MaxiSorpTM 사이의 표면 화학적 성질을 가지며 단백질에 대한 높은 결합능 및 친화성 특징이 있는 MedimSorpTM; (ⅳ) 생체분자에 대한 낮은 결합능 및 친화성 특성이 있는 비처리 마이크로적정 플레이트인 Non-SorpTM; 및 (ⅴ) 친수성 표면을 가지며 글리칸에 대한 높은 결합능 및 친화성 특성이 있는 MultiSorpTM.
다음의 CORNINGTM(Costar)의 마이크로적정 플레이트를 사용하였다: (ⅰ) 친수성 표면과 250 ng/㎠의 IgG에 대한 결합능을 가지는 배지 결합 마이크로적정 플레이트; (ⅱ) 탄수화물에 공유결합하는 탄소 결합 마이크로적정 플레이트; (ⅲ) 흡수능(adsorption capacity)이 높은 고 결합 마이크로적정 플레이트; 및 (ⅳ) 흡수능이 높은 고 결합 블랙 마이크로적정 플레이트.
상기 마이크로적정 플레이트에 대한 생체분자의 결합 효율은 네 가지 카테고리(이온 세기, 완충액 pH, 온도 및 시간)로 시험되었다.
결합 실험은 형광 표지된 생체분자 또는 표지 및 비표지된 같은 유형의 생체분자로 마이크로적정 플레이트를 코팅하고, 세척하여 비결합 분자를 제거한 다음, 상기 플레이트에 남아있는 형광 시그널을 측정함으로써 수행된다.
다음 프로토콜이 사용되었다:
1) 형광 표지된 생체분자를 결합 완충액을 사용하여 상이한 농도(전형적으로 0.4-0.02 ㎍/㎖)로 미리 희석한다. 각 세트의 희석은 두 가지 결합 완충액으로 수행하였다: (ⅰ) 본 발명의 액체 조성물; 및 (ii) 대조군 RO 물.
2) 각 농도의 100 ㎕ 시료를 마이크로적정 플레이트에 분산하고(3중), 초기 형광 준위를 측정한다.
3) 4 ℃로 밤새 또는 37 ℃로 2시간동안 플레이트를 배양한다.
4) 코팅 용액을 버린다.
5) 각 웰에 세척 용액 150 ㎕를 첨가하고 5 분간 실온에서 교반한다. 상기 세척 단계를 3회 반복한다. 전형적인 세척 용액은 1×PBS, pH 7.4; 0.05% Tween20TM; 및 0.06M NaCl을 포함한다.
6) 0.01M 수산화나트륨을 함유하는 200 ㎕ 형광 리딩(reading) 용액을 첨가하고, 실온에서 180 분간 또는 밤새 배양한다.
7) 485 ㎚의 여기 파장, 535 ㎚의 방출 파장 및 10 플래쉬의 최적 게인(optimal gain)을 갖는 형광 바닥 모드(fluorescence bottom mode)를 사용하여 형광을 읽는다.
상기 기술된 플레이트에의 당단백질(플루오로세인 이소티오시아네이트(FITS)로 표지되거나 표지되지 않은 150,000 D의 IgG) 결합 효율에 대한 본 발명의 액체 조성물의 효능을 조사하였다. IgG는 주로 친수성 분자의 혼합물로 이루어진 폴리클로날 항체이다. 상기 분자는 전체 영역에서 탄수화물 친수성 영역을 가지며, 가변 영역에서 약간 소수성이다. 이와 같은 유형의 분자는 MaxiSorpTM에 매우 높은 효율(650 ng/㎠)로 결합하는 것으로 알려져 있다.
다음 유형의 본 발명의 액체 조성물이 사용되었다: 위에 상세히 설명된 바와 같은 LC1, LC2, LC3 LC4 LC5 및 LC6.
하기 표 13은 IgG에 대하여 수행된 6 개의 분석법을 요약하여 나타낸 것이다. 표 13에서, 표지된 항체만 사용된 분석법은 Ab*으로 표시되어 있고, 표지 및 비표지된 항체의 혼합물이 사용된 분석법은 Ab*/Ab으로 표시되어 있다.
분석법 플레이트 유형 코팅 조건 세척 완충액 리딩 완충액 판독 시간
Ab*/Ab Ab* 배지 (Costar) 0.05M 카보네이트 완충액 LC1 C- lot 5(1C) O.N. 4℃ 0.1M 포스페이트 완충액+0.2M NaCl+0.05% tween LC1 C-5(1C) 0.01M 수산화나트륨 LC1 C-5(1C) 120'
Ab*/Ab Ab* 배지 (Costar) 0.05M 카보네이트 완충액 LC1 C-5(1C) O.N. 4℃ 0.1M 포스페이트 완충액+0.2M NaCl+0.05% tween LC1 C-5(1C) 1×PBS+0.06M NaCl+0.05% tween LC2 C-(2C) 0.01M 수산화나트륨 LC1 C-5(1C) 120'
Ab*/Ab Ab* 배지 (Costar) Polysorp Maxisorp Non-sorp 0.05M 카보네이트 완충액 LC1 C-5(1C) O.N. 4℃ RT O.N. 1×PBS+0.06M NaCl+0.05% tween LC2 C-(2C) 0.01M 수산화나트륨 LC1 C-5(1C) 120'
Ab*/Ab Ab* 배지 (Costar) Polysorp Maxisorp Non-sorp 0.05M 카보네이트 완충액 LC3 C-(2C) O.N. 4℃ 1×PBS+0.06M NaCl+0.05% tween LC5 C-(2C) 0.01M 수산화나트륨 LC1 C-5(1C) 120'
Ab*/Ab Ab* 블랙 (Costar) 화이트 (Costar) 투명 (Costar) 0.05M 카보네이트 완충액 C-(2C) O.N. 4℃ 1×PBS+0.06M NaCl+0.05% tween C-(2C) 0.01M NaOH C-(2C) 120'
Ab* 배지 (Costar) Polysorp Maxisorp Non-sorp 0.05M 카보네이트 완충액 LC3 C-2C O.N. 4℃/2시간 37℃ 1×PBS+0.06M NaCl+0.05% tween LC4 C-(2C) 0.01M 수산화나트륨 LC3 C-3C-5C 120'
피넛(Arachis hypogaea) 아글루티닌 (PNA)의 결합 효율에 미치는 본 발명의 액체 조성물의 효능을 MaxiSorpTM 및 Non-SorpTM 플레이트에서 조사하였다. PNA는 각각 대략 27,000 달톤의 동일한 당단백질 서브유닛 4개로 이루어진 110,000 달톤의 렉틴이다. PNA 렉틴은 친수성 영역을 통하여 당 잔기의 특정 구성을 가지는 당단백질 및 당지질과 결합한다. PNA는 또한 소수성 영역을 가진다. PNA*으로 표시된 본 분석법은 다음과 같은 세 개의 코팅 완충액의 사용을 포함한다: (ⅰ) 카보네이트 완충액, pH 9.6, (ⅱ) 아세테이트 완충액, pH 4.6 및 (ⅲ) 포스페이트 완충액, pH 7.4. 하기 표 14에 실험을 요약하여 나타내었다.
분석법 플레이트유형 코팅 조건 세척 완충액 리딩 완충액 판독 시간
PNA* Maxisorp Non-sorp 0.05M 카보네이트 완충액 LC6 C-(2C) 0.1M 아세테이트 완충액 LC6 C-(2C) 0.1M 포스페이트 완충액 LC1 C-5(1C) O.N. 4℃ 1×PBS+0.06M NaCl+0.05% tween LC4 C-(2C) 0.01M 수산화나트륨 LC3 C-3C-5C 120'
핵산의 결합 효율에 대한 본 발명의 액체 조성물의 효능이 MaxiSorpTM, PolysorpTM 및 Non-SorpTM 플레이트에서 조사되었다. 일반적으로, DNA 분자는 폴리스티렌 플레이트에 잘 결합하지 않는다. 보다 문제가 되는 것은 수천 달톤의 분자량을 가진 작은 단일가닥 DNA 분자인 올리고뉴클레오티드의 결합이다. 하기 표 15에 표지된 올리고뉴클레오티드 결합에 수행된 실험을 요약하여 나타내었다. 본 분석법은 Oligo*로 표시하였다.
분석법 플레이트유형 코팅 조건 세척 완충액 리딩 완충액 판독 시간
Oligo* Maxisorp Non-sorp 0.05M 카보네이트 완충액 LC6 C-(2C) 0.1M 아세테이트 완충액 LC6 C-(2C) 0.1M 포스페이트 완충액 LC1 C-5(1C) 2시간 37℃ 1×PBS+0.06M NaCl+0.05% tween LC4 C-(2C) 0.01M 수산화나트륨 LC3 C-3C-5C 180'
Oligo* Polysorp Maxisorp 0.05M 카보네이트 완충액 LC6 C-(2C) 0.1M 아세테이트 완충액 LC6 C-(2C) 0.1M 포스페이트 완충액 LC1 C-5(1C) O.N. 4℃ 1×PBS+0.06M NaCl+0.05% tween LC2 C-(2C) 0.01M 수산화나트륨 LC3 C-3C-5C 180'
Oligo* Polysorp Maxisorp 0.1M 아세테이트 완충액+0.2M 소듐 아세테이트 LC6 C-(2C) 0.1M 포스페이트 완충액+0.2M 소듐 아세테이트 LC1 C-5(1C) 2시간 37℃ 1×PBS+0.06M NaCl+0.05% tween LC4 C-(2C) 0.01M 수산화나트륨 LC3 C-3C-5C 180'
IgG 결과 및 검토
도 21a-22d는 배지 CostarTM(a), Non-SorpTM(b), MaxisorpTM(c) 및 PolysorpTM (d) 플레이트에 대한 Ab*/Ab 분석법(도 21a-d) 및 Ab* 분석법(도 22a-d)의 결과를 나타낸다. 본 발명의 액체 조성물을 사용하여 수득된 결과는 채워진 심볼(삼각형, 사각형 등)로 표시되고 대조군의 결과는 빈 심볼로 표시되었다. 선은 선형 회귀 피트(linear regression fit)에 대응한다. 결합 효율은 상기 선의 기울기에 의하여 평가될 수 있고, 보다 큰 기울기는 보다 더 좋은 결합 효율에 대응한다.
도 21a-22d에 도시된 바와 같이, 본 발명의 액체 조성물을 사용하여 수득된 기울기는 대조군 실험에서 수득된 기울기보다 더욱 가파르다. 따라서, 본 발명의 액체 조성물은 결합 효율을 향상시킬 수 있다. 본 발명의 액체 조성물의 결합향상능은 Sr로 표시하였고, 각 도면에서 두 기울기의 비율로서 정의되며, Sr>1은 결합 향상에 해당하고, Sr<1은 결합 억제에 해당한다. 도 21a-d에서 수득된 기울기에 대해 계산된 Sr 파라미터의 값은 각각 1.32, 2.35, 1.62 및 2.96이었고, 도 22a-d에서 수득된 기울기에 대해 계산된 Sr 파라미터의 값은 각각 1.42, 1.29, 1.10 및 1.71이었다.
도 23a-24d는 4 ℃에서 밤새 배양(도 23a-d) 및 37 ℃에서 2 시간 배양(도 24a-d)한 NonSorpTM(a), 배지 CostarTM(b), PolySorpTM(c) 및 MaxiSorpTM (d) 플레이트에 대한 Ab* 분석법의 결과를 나타낸다. 도 21a-22d와 유사하게, 본 발명의 액체 조성물 및 대조군을 사용하여 수득된 결과는 각각 채워진 심볼 및 빈 심볼로 표시되어 있다. 도 23a-24d에 도시된 바와 같이, 두 경우(NonSorpTM 플레이트에서 밤새 배양 및 PolySorpTM 플레이트에서 2시간 배양)를 제외하고는, 본 발명의 액체 조성물을 사용하여 얻어진 기울기가 대조군 실험에서 얻은 기울기보다 더욱 가파르다. 특히, 도 23a-d에 대해 얻은 Sr 파라미터의 계산값은 각각 0.94, 1.10, 1.20 및 1.27이었고 도 24a-d에 대해 얻은 Sr 파라미터의 계산값은 각각 1.16, 1.35, 0.94 및 1.11이었다.
도 25a-26d는 4 ℃로 밤새 배양(도 25a-d) 및 실온에서 밤새 배양(도 26a-d)한 배지 CostarTM(a), PolySorpTM(b), MaxiSorpTM(c) 및 Non-SorpTM (d) 플레이트에 대한 Ab*/Ab 분석법의 결과를 나타낸다. 도 25a-26d에 도시된 바와 같이, 한 경우(non-sorpTM 플레이트에서 실온으로 배양)를 제외하고는, 본 발명의 액체 조성물을 사용하여 얻어진 기울기가 대조군에서 얻어진 기울기보다 더 가파르다. 특히, 도 25a-d에 대해 얻어진 Sr 파라미터의 계산값은 각각 1.15, 1.25, 1.07 및 2.10이었고, 도 26a-d에 대해 얻어진 Sr 파라미터의 계산값은 각각 1.30, 1.48, 1.38 및 0.84이었다.
배지 CostardTM 플레이트를 이용하여 상이한 세척 프로토콜을 도 27a-d에서 비교하였다. 도 27a-b는 포스페이트 완충액을 세척 완충액로 사용한 경우의 Ab*/Ab(도 27a) 및 Ab*(도 27b) 분석법의 결과를 나타내고, 도 27c-d는 PBS를 사용한 Ab*/Ab(도 27c) 및 Ab*(도 27d) 분석법의 결과를 나타낸다. Ab*/Ab 및 Ab* 분석법(도 27a-d)에 대한 Sr 파라미터의 계산값은 각각 1.03, 0.97, 1.04 및 0.76이었다.
도 28a-b는 배지 CortarTM 플레이트가 4 ℃로 밤새 배양하기 위해 사용된 단일 실험 결과를 나타낸다(표 13에서 제 1 실험 참조). 본 실험에서 알 수 있는 바와 같이, Sr 파라미터의 계산값은 Ab*/Ab 분석법(도 28a)에 대해 0.37이었고, Ab* 분석법(도 28b)에 대하여 0.67이었다.
하기 표 17에, 상기 언급한 플레이트에 대한 결합 향상(Sr>1) 및 결합 억제(Sr<1)에 대한 도 21a-28b의 결과를 요약하여 나타내었다.
Sr 배지 Costar Polysorp Maxisorp Non-sorp
＞1 8/12 5/6 6/6 4/6
＞1.05 5/12 5/6 6/6 4/6
＞1.1 4/12 5/6 5/6 3/6
＜1 4/12 1/6 0/6 2/6
＜0.95 3/12 1/6 0/6 2/6
＜0.9 3/12 0/6 0/6 1/6
표 17 및 도 21a-28b에서 입증된 바와 같이, 본 발명의 액체 조성물은 IgG 결합을 향상시키며, MaxiSorpTM 및 PolySorpTM 플레이트에 대해 더욱 현저한 효능을 나타낸다.
렉틴 결과 및 검토
도 29a-c는 아세테이트(도 29a), 카보네이트(도 29b) 및 포스페이트(도 29c) 완충액에서 Non-SorpTM 플레이트에 대한 PNA 흡수 분석법의 결과를 나타낸다. 도 29a-c에서, 본 발명의 액체 조성물을 사용하여 얻은 결과는 개방 심볼로 표시되고 대조군의 결과는 채워진 심볼로 표시된다.
아세테이트, 카보네이트 및 포스페이트 완충액에 대한 Sr 파라미터의 계산값은 각각 0.65, 0.75 및 0.78이었다. 따라서, 세 완충액 모두에서 본 발명의 액체 조성물은 PNA의 결합을 크게 저해한다.
도 30a-d는 카보네이트(도 30a-b), 아세테이트(도 30c) 및 포스페이트(도 30d) 코팅 완충액에서 MaxiSorpTM 플레이트가 사용된 PNA 흡수 분석법의 결과를 나타낸다. 도 29a-c와 유사한 심볼이 사용되었다. 도 30a를 참조하면, 카보네이트 완충액의 경우, 어떤 효과도 관찰되지 않는 낮은 단백질 농도에서의 직선 부분 및 본 발명의 액체 조성물이 PNA의 결합을 크게 저해하는 높은 단백질 농도(약 0.72 이상)에서의 비직선 부분을 가진 2상 곡선(two-phase curve)이 수득되었다. 도 30b는 카보네이트 완충액에 대해 1.01의 Sr 파라미터의 계산값 및 그래프의 직선 부분을 나타낸다. 아세테이트 및 포스페이트 완충액에 대한 Sr 파라미터의 계산값은 각각 0.91 및 0.83이었고, 이는 본 발명의 액체 조성물이 PNA의 결합을 억제하는 것과 유사한 경향을 나타내는 것이다.
결합 향상(Sr>1) 및 결합 억제(Sr<1)에 관한 PNA* 분석법의 결과를 하기 표 18에 요약하여 나타내었다.
Sr MaxisorpTM Non-sorpTM
＞1 1/3** 0/3
＞1.05 0/3 0/3
＞1.1 0/3 0/3
＜1 2/3 0/0
＜0.95 2/3 0/3
＜0.9 1/3 3/3
**Sr은 그래프의 직선 부분에 대하여 계산되었다.
따라서, Non-SorpTM플레이트의 경우, 저해는 다른 완충액(pH)에 의하여 영향을 받지 않았다. 반면, MaxiSorpTM 플레이트의 경우, 카보네이트 완충액에서 포화 곡선일 때 현저한 효과가 관찰되었다. 이는 경쟁 분자의 수를 효율적으로 증가시키는 4 개의 서브유닛의 분해(dissociation)에 의해 설명될 수 있다.
두 개의 단백질 IgG 및 PNA은 MaxiSorpTM 플레이트에 대하여 반대로 거동한다. 이는 본 발명의 액체 조성물이 단백질의 분자 구조에 영향을 미친다는 것을 나타낸다.
올리고뉴클레오티드 결과 및 검토
올리고뉴클레오티드는 아세테이트 코팅 완충액에서 오직 MaxiSorpTM 플레이트에만 결합되었다.
아세테이트 코팅 완충액에서 MaxiSorpTM 플레이트가 사용된 분석법에 대해 평균을 낸, 4 개의 상이한 실험 조건 및 9 개의 상이한 농도의 올리고뉴클레오티드에 대해 수득한 Sr 파라미터의 값을 하기 표 19에 요약하여 나타내었다.
㎍/㎖ 조건 평균
37℃ 4℃ 37℃+Na 4℃+Na
0.4 1.32 1.20 1.75 2.17 1.61
0.36 1.33 1.44 1.30 1.17 1.31
0.32 0.98 1.31 1.17 1.30 1.19
0.28 1.38 1.47 1.27 1.34 1.36
0.24 1.16 1.16 1.13 1.26 1.18
0.20 1.26 1.23 0.94 1.09 1.13
0.16 1.08 1.16 1.22 1.20 1.16
0.12 0.89 1.18 1.34 1.57 1.24
0.08 1.21 1.03 0.93 1.29 1.11
도 31a-b는 표 9에 인용된 Sr 파라미터의 평균값을 나타내고, 여기에서 도 31a는 각 실험 조건에 대한 평균값을 나타내며, 도 31b는 전체 평균을 나타내며, 모든 실험 조건에 대하여 동일한 중량을 가진다.
도 31a-b에 도시된 바와 같이, Sr 파라미터의 평균값은 1 보다 매우 크며, 높은 농도의 올리고뉴클레오티드에 대해 더 높은 결합 효율이 제공된다. 따라서, 본 발명의 액체 조성물은 코팅 완충액에 염을 첨가하거나 첨가하지 않고도 결합 효율을 강화시킬 수 있다고 결론을 내릴 수 있다.
아세테이트 완충액이 수용액에서 DNA를 침전시키는데 사용된다는 것은 통상적인 지식이다. 이와 같은 조건하에서, DNA 분자들은 상호작용하여 플레이트의 바닥에 침전되어 고농도의 영역을 생성하는 "클럼프(clump)"를 형성하고, 이에 의하여 결합 가능성을 증가시키고, 결합할 때마다 높은 시그널을 생성한다. 분자내 상호작용은 클럼프 형성의 메커니즘과 경쟁한다. 대조군 물과는 반대로, 본 발명의 액체 조성물은 고농도에 대한 클럼프 형성의 향상을 억제할 수 있다.
본 발명의 액체 조성물로 이루어진 아세테이트 완충액을 사용하는 MaxiSorpTM 플레이트에 대한 DNA의 높은 결합 효율은, 적어도 부분적으로 DNA 분자를 디폴딩하는 본 발명에 따른 액체 조성물의 능력을 입증한다. 본 발명의 이러한 특징은, 이하 실시예 14에서 더 상세히 설명되는 바와 같이 DNA 전기영동 실험에서도 관찰되었다.
실시예 12
DNA의 분리 및 정제
핵산(DNA 및 RNA)은 생명 과학에 있어서 연구자에 의해 사용되는 가장 중요하고 기초적인 물질이다. 유전자 기능, 생체분자 생산 및 약물 개발(pharmacogenomics, 약리게놈함)은 핵산 기술을 일상적으로 적용하는 모든 영역이다. 전형적으로, PCR 기술은 DNA 또는 RNA의 특정 서열의 신장을 위해 필요하다. 우선, 추출된 DNA 또는 RNA가 정제된다. 조사할 특정 영역을 증폭한 후, 올리고뉴클레오티드 프라이머, 프라이머 다이머, 디옥시뉴클레오티드 염기(A, T, C, G) 및 염으로부터 서열을 정제한 다음 확인한다.
재료 및 방법:
PCR 산물의 정제에 대한 본 발명의 액체 조성물의 효능은 Promega kit "Wizard-PCR preps DNA 정제 시스템" (A7170)을 재구성하여 연구하였다.
Promega WizardTM 키트의 사용은 다음 단계를 포함한다:
1) DNA를 수지에 결합시키는 조건을 생성하기 위해 PCR 시료와 정제 완충액을 혼합한다.
2) DNA를 수지에 결합시키기 위해 PCR 혼합물과 수지 현탁액을 혼합하고, 상기 수지 시료를 시린지에 적용한 다음 진공시킨다.
3) 이소프로판올을 첨가하고 용액을 진공흡인하여 비결합 DNA를 제거한다.
4) 결합 DNA을 물로 용출한다.
5) 이하 보다 상세히 설명되는 바와 같이 겔 전기영동을 수행한다.
상기 키트의 재구성은 키트와 함께 공급된 최초 물(이후, 대조군), 또는 단계 1, 2 및 4의 경우 키트의 수용액을 본 발명의 액체 조성물 또는 RO 물로 대체하여 수행하였다. 단계 3에서, 키트에서와 같은 동일한 80% 이소프로판올 용액이 모든 실험에 사용되었다.
다음의 프로토콜을 겔 전기영동에 사용하였다:
(a) 겔 용액: 8% PAGE (+ 우레아)를 하기 표 20에 따른 본 발명의 액체 조성물 또는 RO 물로 제조한다.
총 부피 250 ( ㎖)
40% 아크릴아미드 50
10 x TBE 25
우레아 84.1 g
RO/액체 조성물 약 105
(b) 405 ㎕ 10% APS 및 55 ㎕ TEMED(Sigma T-7024)을 함유하는 중합 시약을 50 ㎖의 겔 용액에 첨가한다.
(c) 겔 용액을 겔 카세트(Rhenium Ltd, Novex N-C2015, 09-01505-C2)에 붓고, 플라스틱 콤(combs)을 설치한 뒤, 실온에서 30 분간 중합한다.
(d) 상기 콤을 제거하고, 테이프를 떼어낸 뒤, 두 개의 겔을 한 장치의 두 대향측상에 조립한다.
(e) 겔의 상단까지 내부 챔버를 채우고, 겔 높이의 약 5분의 1까지 RO 물 또는 본 발명의 액체 조성물 중의 러닝 완충액-TBE×1로 외부 챔버를 채운다.
(f) TBE Ficoll, 브로모페놀 블루 및 우레아(SBU)를 함유하는 시료 완충액 에 희석시켜 시료를 제조하고, DNA 시료과 1:1로 혼합한다.
(g) 8-10 ㎕의 혼합물을 각 웰에 부하한다.
(h) 전력 공급을 100V로 세팅하고, 칼라 염료(브로모페놀 블루)가 바닥으로부터 1 cm에 도달할 때까지 DNA 이동을 계속한다.
다음의 프로토콜을 겔 염색 가시화 포토그래피 및 분석에 사용하였다.
(a) 진탕하면서, 1×TBE 중에 1 U/㎕ GelStarTM을 함유하는 염료 용액에 겔을 15 분간 침지한다.
(b) 1xTBE 완충액에서 30 분간 겔을 탈염시킨다(destained).
(c) 겔을 U.V. 테이블에 두고; DNA가 가시화되도록 365 ㎚ 광을 사용한다.
(d) DC120TM 디지탈 카메라를 이용해서, 겔의 사진을 찍고, 추가 분석을 위해 디지탈 정보를 저장한다.
(100회 반응을 위해) 다음의 프로토콜에 따라, ApoE 유전자 특이 프라이머(단편 크기 265 bp)를 사용해서 인간 DNA (Promega G 3041)로부터 PCR을 제작하였다:
(a) 적절한 일련 번호로 0.2 ㎕ PCR-관(tube)을 표시한다.
(b) 2.5 ㎕의 40 ㎍/㎖ 인간 DNA (프로메가 G 3041) 또는 물을 상기 관에 가한다.
(c) 14.5 ㎕ DDW를 이용해서 17 ㎕로 조정한다.
(d) 표 21(아래 참조)에 따라 3630 ㎕의 PCR 혼합물을 제조한다.
(e) 각 관에 33 ㎕의 혼합물을 첨가한다.
(f) PCR 장치에 시료를 배치한다.
(g) 표 22(아래 참조)에 따라 PCR 프로그램을 가동시킨다.
(h) 8% PAGE 겔 상에서 각 생성물 5 ㎕를 분석한다.
(i) 반응물을 -20 ℃로 보관한다.
PCR 혼합물
DDW 836
DMSO 100% 550
fw 프라이머1* (10 μM) 550
rw 프라이머2* (10 μM) 550
10×PCR 완충액 (15 mM MgCl) 550
dNTPs (2 mM) 550
MgCl (25 mM) 0
Taq 중합효소 (5 μ/㎕) 44
총 ㎕ 3630
*프라이머 1 5'TCCAAGGAGCTGCAGGCGGCGCA (서열번호: 1) *프라이머 1 6-fam 5'mTCCAAGGAGCTGCAGGCGGCGCA (서열번호: 2) *프라이머 1 비오틴5'bTCCAAGGAGCTGCAGGCGGCGCA (서열번호: 3) *프라이머 2 5'GGCGCTCGCGGATGGCGCTGAG (서열번호: 4).
PCR 프로그램
온도 시간
1 95 ℃ 5 분
2 94 ℃ 1 분
3 68 ℃ 1 분
4 72 ℃ 30 초
5 2 단계로 이동 x 34 회
6 72 ℃ 5 분
7 4 ℃ 유지
결과:
명확히 하기 위해, 본 실시예 및 이후 실시예에서, 대조군은 "CO"로 약기하고, 역삼투수(Reverse Osmosis water)는 "RO"로 약기하며, 본 발명의 액체 조성물은 "LC"로 약기한다.
도 32는 실험예 3으로서 본 명세서에 언급된 실험예에서의 50 ㎕ PCR 산물 시료의 이미지이다. 도 32에는 11개의 레인이 존재하는데, 여기서 1번 레인은 정제전의 PCR 산물에 상응하고, 7번 레인은 래더 마커(ladder marker)이며, 2-6번, 8-11번 레인은 상기 언급된 단계 1, 2 및 4의 다음의 배합물에 상응한다: CO/CO/CO 용출액 1(2번 레인), RO/RO/RO 용출액 1(3번 레인), LC/LC/LC 용출액 1(4번 레인), CO/CO/CO 용출액 2(5번 레인), RO/RO/RO 용출액 2(6번 레인), LC/LC/LC 용출액 2(8번 레인), CO/CO/CO 용출액 3(9번 레인), RO/RO/RO 용출액 3(10번 레인), 및 LC/LC/LC 용출액 3(11번 레인).
3 개의 분석 시스템 모두 유사한 정제 특성을 보였다. 저 분자량 분자(100 bp 보다 적은 분자)의 효율적 제거가 입증된다. 원치않는 분자들로는 뉴클레오티드 염기뿐만 아니라 프라이머 및 그의 다이머가 포함된다.
도 33a-b는 실험예 4로서 본 명세서에 언급된 실험예에서 용출액 1(도 33a) 및 용출액 2(도 33b)에 대한 50 ㎕ PCR 산물 시료의 이미지이다. 도 33a-b에는 13개의 레인이 존재하는데, 여기서 6번 레인은 래더 마커이고, 1-5번, 7-13번 레인은 다음의 배합물에 상응한다: CO/CO/CO (1번 레인), RO/RO/RO (2번 레인), LC/LC/LC (3번 레인), CO/LC/LC (4번 레인), CO/RO/RO (5번 레인), CO/CO/LC (7번 레인), CO/CO/RO (8번 레인), CO/LC/CO (9번 레인), CO/RO/CO (10번 레인), LC/LC/CO (11번 레인), RO/RO/CO (12번 레인), LC/LC/LC (13번 레인), 여기에서, 13번 레인의 경우 상이한 농도의 본 발명의 액체 조성물에 사용되었다.
도 34a-b는 실험예 5로서 본 명세서에 언급된 실험예에서 용출액 1(도 34a) 및 용출액 2(도 34b)에 대한 50 ㎕ PCR 산물 시료의 이미지이다. 도 34a-b에서, 4번 레인은 래더 마커이고, 1-3번, 5-13번 레인은 다음의 배합물에 상응한다: CO/CO/CO (1번 레인), RO/RO/RO (2번 레인), LC/LC/LC (3번 레인), CO/LC/LC (5번 레인), CO/RO/RO (6번 레인), CO/CO/LC (7번 레인), CO/CO/RO (8번 레인), CO/LC/CO (9번 레인), CO/RO/CO (10번 레인), LC/LC/CO (11번 레인), RO/RO/CO (12번 레인), 및 LC/CO/COC (13번 레인). 도 34a에서 14번 레인은 배합물 RO/CO/CO에 상응한다.
도 35a-b는 실험예 6으로서 본 명세서에 언급된 실험예에서 용출액 1(도 35a) 및 용출액 2(도 35b)에 대한 50 ㎕ PCR 산물 시료의 이미지이다. 도 35a-b에서, 1-13번 레인은 도 34a와 같은 배합물에 상응하고, 15번 레인은 정제전 PCR 산물에 상응한다.
실시예 13
칼럼 커패시티( column capacity )
본 실시예에서, 칼럼 커패시티에 대한 본 발명에 따른 액체 조성물의 효능을 조사하였다. 실시예 12의 프로토콜에 따라 각각 제조된 PCR 반응물을 100개 제조하고 배합하여 5 ㎖의 원액을 만들었다. 실험예 7로서 본 명세서에 언급된 실험예는 2 단계를 포함하였는데, 여기서 예비 단계(이후 단계 A)는 결합 및 용출에 대한 칼럼에 적용된 부피의 효능을 조사하기 위한 것이었고, 제 1 단계(이후 단계 B)는 칼럼 커패시티에 대한 본 발명에 따른 액체 조성물의 효능을 조사하기 위한 것이었다.
단계 A : 4개의 칼럼(1-4번 칼럼)에는 50, 150, 300 또는 600 ㎕ 원액 PCR 산물 용액을 적용하였고, 13개의 칼럼(5-17번 칼럼)에는 300 ㎕의 원액 PCR 용액을 적용하였다. 모든 칼럼을 50 ㎕의 물로 용출하였다. 용출된 용액을 7-10번 레인에 다음의 순서로 부하하였다: 7번 레인(최초 PCR, 농축계수×1), 8번 레인(최초×3), 9번 레인(×6) 및 10번 레인(×12). 5-17번 칼럼(×6)으로부터의 모든 용출액의 "혼합물"을 11번 레인에 부하하였다. 1-5번 레인에는 최초 농도(×1)로 예비-희석시킨 5-17번 칼럼의 "혼합물"과 1-4번 칼럼으로부터의 용출액을 부하하였다. 6번 레인은 래더 마커였다.
다음의 프로토콜을 단계 A에 사용하였다:
1) 각각의 시료에 대한 시린지(syringe) 및 WizardTM 미니칼럼을 표시하고 진공 매니폴드(Vacuum Manifold)에 삽입한다.
2) 100 ㎕의 직접 PCR 정제 완충액 용액 각각을 마이크로튜브(micro-tube)내로 분배한다.
3) 잠시동안 교반한다.
4) 1 ㎖의 각각의 수지 용액을 첨가하고 1분동안 3회 잠시 교반한다.
5) 수지/DNA 혼합물을 시린지에 가하고 진공시킨다.
6) 각각의 시린지에 80% 이소프로판올 용액 2 ㎖를 첨가하여 세척하고 진공시킨다.
7) 30초간 진공을 유지하여 수지를 건조시킨다.
8) 미니칼럼을 1.5 ㎖의 미소원심관으로 옮긴다.
9) 2분동안 10000g으로 원심분리한다.
10) 미니칼럼을 1.5 ㎖의 깨끗한 관으로 옮긴다.
11) 50 ㎕의 적절한 물(뉴클레아제 무함유 또는 본 발명의 액체 조성물)을 첨가한다.
12) 20초간 10000g으로 원심분리한다.
13) 50 ㎕의 저장 마이크로튜브로 옮겨 -20℃에서 저장한다.
14) 두 번째 용출 사이클을 위해 단계 9-11을 반복한다.
가시화 단계:
15) 6 ㎕의 로딩 완충액(loading buffer)과 6 ㎕의 각각의 시료를 혼합한다.
16) 각각의 혼합물 100 ㎕를 아크릴아미드 우레아 겔(AAU)에 부하하고, 겔을 70V 10mAmp로 가동시킨다.
17) 겔을 Gel Star 용액(50 ㎖ TBE 중 10000 u 용액 5 ㎕)으로 염색하고, 실온에서 15분간 흔든다.
18) TBE 완충액 중에서 30분동안 실온에서 흔들어 겔을 탈염한다.
19) 겔의 사진을 촬영한다.
단계 B : 단계 A의 "혼합 " 용출액을 "농축 PCR 용액"으로서 사용하여 12번 칼럼에 적용하였다. 1-5번 칼럼에는 키트 시약(kit reagent)을 사용하여 8.3 ㎕, 25 ㎕, 50 ㎕, 75 ㎕ 및 100 ㎕을 각각 적용하였다. 칼럼을 50 ㎕ 키트 물로 용출시키고, 각각의 용출액 5 ㎕를 겔위의 상응하는 레인에 적용하였다. 7-11번 칼럼을 결합 및 용출 완충액으로서 본 발명의 액체 조성물을 가진 1-5번 칼럼으로서 처리하였다. 시료를 상응하는 겔 레인에 적용하였다. 13번 칼럼은 단계 A의 5-17번 칼럼의 "혼합물"을 가진 대조군의 역할을 하였다.
다음의 프로토콜을 단계 B에 사용하였다:
1) 각각의 시료에 대해 사용될 시린지(syringe) 및 WizardTM 미니칼럼을 표시하고 진공 매니폴드(Vacuum Manifold)에 삽입한다.
2) 100 ㎕의 직접 PCR 정제 완충액 용액 각각을 마이크로튜브(micro-tube)내로 분배한다.
3) 잠시동안 교반한다.
4) 1 ㎖의 각각의 수지 용액을 첨가하고 1분동안 3회 잠시 교반한다.
5) 수지/DNA 혼합물을 시린지에 가하고 진공시킨다.
6) 각각의 시린지에 80% 이소프로판올 용액 2 ㎖를 첨가하여 세척하고 진공시킨다.
7) 30초간 진공을 적용하여 수지를 건조시킨다.
8) 미니칼럼을 1.5 ㎖의 미소원심관으로 옮긴다.
9) 2분동안 10000g으로 원심분리한다.
10) 미니칼럼을 1.5 ㎖의 깨끗한 관으로 옮긴다.
11) 50 ㎕의 뉴클레아제 무함유 또는 본 발명의 액체 조성물을 첨가한다.
12) 20초간 10000g으로 원심분리한다.
13) 50 ㎕의 저장 마이크로튜브로 옮겨 -20℃에서 저장한다.
14) 두 번째 용출 사이클을 위해 단계 9-11을 반복한다.
가시화 단계는 단계 A와 동일하였다.
결과:
도 36-37은 단계 A의 1-11번 레인에 대한 이미지(도 36) 및 SionImage 소프트웨어를 이용한 정량 분석(도 37)을 나타낸다. 도 36a에 도시된 바와 같이, 8-11번 레인은 과부하된다. 3번 및 4번 칼럼이 과부하되었기 때문에 3번 및 4번 레인은 더 적은 양의 DNA를 함유하며, 그 결과 용출된 시료의 희석후 더 적은 양의 DNA가 회수된다. 도 37에 도시한 바와 같이, DNA 로딩 부피(loading volume)가 더 클 경우, DNA가 더 많이 손실된다.
도 38a-c는 용출액 1(도 38a), 용출액 2(도 38b) 및 용출액 3(도 38c)에 대한 단계 B의 1-12번 레인의 이미지를 나타낸다. 제 1 용출액 도면은 칼럼이 유사하게 과부화된 것을 나타낸다. 결합능의 차이는 제 2 용출액에서 뚜렷하게 나타난다. 밴드 강도는 레인의 수와 상응하게 증가한다.
상응하는 1-5번 및 7-11번 레인의 강도를 비교하면, 본 발명의 액체 조성물은 키트 시약보다 더 많은 DNA와 결합할 수 있음을 나타낸다.
도 39a-b는 SionImageTM 소프트웨어를 이용한 정량분석을 나타내며, 여기서 도 39a는 3개의 용출액 각각에 대한 로딩 부피의 함수로서 대조군(도 39a-b에서 CO로 표시함) 및 본 발명의 액체 조성물(도 39a-b에서 LC로 표시함)의 면적을 나타내고, 도 39b는 LC/CO의 비를 나타낸다. 도 39a-b에 도시된 바와 같이, 용출액 3의 경우 본 발명의 액체 조성물에 대한 면적이 더 크다.
실시예 14
겔 전기영동에 의한 DNA 의 분리
겔 전기영동은 크기 및 형태에 기초한 DNA 분자의 결정 및 분리를 위해 통상적으로 사용되는 방법이다. DNA 시료가 겔의 상부에 적용되어, DNA 분자를 둘러싸는 러닝 완충액(running buffer)의 역할을 한다. 전류가 인가되면 겔은 양으로 하전되어 음으로 하전된 DNA 단편으로 하여금 겔을 하향이동하게 한다. 이동 속도는 더 작으면서 코일(coiled) 또는 폴드(folded) 분자인 경우에 더 빠르고, 크면서 비폴드(unfolded) 분자인 경우에 더 느리다. 이동이 완료되면, DNA는 형광 표지에 의해 표식될 수 있고, UV 조명하에 가시화된다. DNA는 또한 막으로 이동되어 고감도의 효소 착색에 의해 가시화될 수 있다. DNA는 겔상의 위치 및 밴드의 세기에 따라 평가된다.
다음에 전기영동에 의해 DNA 이동에 대한 본 발명의 액체 조성물의 효능을 조사한 실험예를 설명한다.
재료 및 방법:
두 가지 형태의 DNA를 사용하였다 : (i) PCR 산물, 280개의 염기쌍; 및 (ii) 크기가 80, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 및 1030 bp인 11개의 DNA 단편으로 구성된 래더 DNA. 실시예 12의 프로토콜에 따라 겔을 제조하였다.
세 개의 실험을 수행하였다. 실험예 1에서는, 2-10번 레인에 PCR 배치(batch) 번호 181103을, 1번 레인에 래더 DNA를 부하하였고; 실험예 2에서는, 2-11번 레인에 PCR 배치 번호 31203을, 1번 레인에 래더 DNA를 부하하였으며; 실험예 3에서는, 1-5번 및 7-11번 레인에 PCR 배치 번호 31203을, 6번 레인에 래더 DNA를 부하하였다.
결과:
도 40a-42b는 실험예 1, 2 및 3 각각에 대한 RO 물의 존재하에서의 이동 속도(도 40a, 41a 및 42a) 및 본 발명의 액체 조성물의 존재하에서의 이동속도(도 40b, 41b 및 42b)를 비교하는 DNA 이미지이다. 도 40a-42b의 이미지에서, 러닝 완충액 및 겔 완충액 모두는 같은 형태의 액체로 구성되었다, 즉, 도 40a, 41a 및 42a에서 러닝 완충액 및 겔 완충액은 모두 RO 물로 구성되었고, 도40b, 41b 및 42b에서 러닝 완충액 및 겔 완충액은 모두 본 발명의 액체 조성물로 구성되었다.
도 40a-42b에 도시된 바와 같이, 두 형태의 DNA(PCR 산물 및 래더 DNA) 모두 본 발명의 액체 조성물에 비해 RO 물에서 상당히 빠르게 이동하였다.
겔 함량에 대한 본 발명의 액체 조성물의 효능 및 러닝 완충액에 대한 그의 효능을 분리할 목적으로, 러닝 완충액 및 겔 완충액의 가능한 모든 배합물에 대해 상기 실험을 반복하였다.
따라서, 도 43a-45d는 러닝 완충액에 대한 본 발명의 액체 조성물의 효능을 조사하는 실험예 1(도 43a-d), 실험예 2(도 44a-d) 및 실험예 3(도 45a-d)의 이미지이다. 각각의 도면의 쌍(즉, a-b 및 c-d 쌍)에서, 겔 완충액은 동일한 액체로 구성되고, 러닝 완충액은 상이하다. 실시예 12에 도입한 약어를 사용하여, 다음의 겔/러닝 완충액의 배합물을 도 43a-45d에 도시하였다: 도 43a-b는 각각 RO/RO 및 RO/LC의 이미지이고; 도 43c-d는 각각 LC/LC 및 LC/RO의 이미지이며; 도 44a-b는 각각 RO/RO 및 RO/LC의 이미지이고; 도 44c-d는 각각 LC/RO 및 LC/LC의 이미지이며; 도 45a-b는 각각 RO/LC 및 RO/RO의 이미지이고; 도 45c-d는 각각 LC/LC 및 LC/RO의 이미지이다.
도 46a-48d는 겔 완충액에 대한 본 발명의 액체 조성물의 효능을 조사하는 실험예 1(도 46a-d), 실험예 2(도 47a-d) 및 실험예 3(도 48a-d)의 이미지이다. 각각의 도면의 쌍(즉, a-b 및 c-d 쌍)에서, 러닝 완충액은 동일한 액체로 구성되고, 겔 완충액은 상이하다. 특히, 도 46a-b는 각각 RO/RO 및 LC/RO의 이미지이고; 도 46c-d는 각각 LC/LC 및 RO/LC의 이미지이며; 도 47a-b는 각각 RO/RO 및 LC/RO의 이미지이고; 도 47c-d는 각각 RO/LC 및 LC/LC의 이미지이며; 도 48a-b는 각각 RO/RO 및 LC/RO의 이미지이고; 도 48c-d는 각각 RO/LC 및 LC/LC의 이미지이다.
도 43a-48d에 도시된 바와 같이, 본 발명의 액체 조성물은 RO 물에 비해 DNA 이동을 지연시킨다. 전기장의 유의적인 변화는 관찰되지 않았음을 주목하기 바란다. 이와 같은 효과는 겔 완충액이 본 발명의 액체 조성물로 구성되고 러닝 완충액이 RO 물로 구성되는 경우에 더욱 현저하다.
따라서, 본 발명의 액체 조성물의 영향하에서는 DNA의 폴드가 감소하는(비폴드) 방식으로 DNA 구조가 변한다는 것이 상기 실험을 통해 입증된다. 본 발명의 액체 조성물에서 DNA의 비폴드는, RO 물보다 본 발명의 액체 조성물과 DNA 분자 사이에 더욱 강한 수소 결합 상호작용이 존재하는 것을 나타내는 것일 수 있다.
실시예 15
효소 활성 및 안정성
효소 활성 및 안정성 모두의 증가는 효소를 이용하는 어느 공정에서나 비용을 줄이고 효능을 향상시키는데 있어 중요하다. 장기 저장중, 장시간 사용중 및 또한 과잉-희석된 경우, 효소는 전형적으로 안정성을 떨어뜨릴 수 있는 스트레스에 노출되어 결국에는 활성을 잃게 된다.
본 실시예에서는, 효소의 활성 및 안정성에 대한 본 발명의 액체 조성물의 효능이 입증된다. 본 연구는 생명공학 산업에서 통상적으로 사용되는 두 가지 효소에 관한 것이다: 알칼리성 포스파타제(AP) 및 β-갈락토시다제. 두 가지 형태의 AP가 사용되었다: 비결합 형태 및 AP가 스트렙트-아비딘에 결합된 결합 형태(ST-AP).
다음에 묽은 효소에 대한 본 발명의 액체 조성물의 효능을 조사하는 실험예를 설명한다. 희석은 중성 pH(7.4)에서 첨가제없이 본 발명의 액체 조성물 또는 RO 물에서 수행하였다.
비결합 형태의 알칼리성 포스파타제
재료 및 방법:
알칼리성 포스파타제(Jackson INC)를 RO 물 또는 본 발명의 액체 조성물에서 연속적으로 희석하였다. 희석 시료 1:1,000 및 1:10,000을 관에서 실온으로 배양하였다.
상이한 시간 간격으로, 90 ㎕의 pNPP 용액(AP 특이 발색 기질)과 10 ㎕의 효소를 혼합함으로써 효소 활성을 결정하였다. 마이크로적정 플레이트(각각의 시험 포인트에 대해 적어도 4회 반복)에서 분석하였다. 405 ㎚ 파장에서 ELISA 리더(reader)에 의해 색의 강도를 결정하였다.
RO 물과 상이한 농도를 가진 3 개의 본 발명에 따른 액체 조성물(이하에 더욱 상세히 설명되는 LC3, LC7 및 LC8) 모두의 각각의 희석물에 대해 시간 t=0에서 효소 활성을 결정하였다. 안정도는 22 시간후(t=22) 및 48 시간후(t=48)의 활성을 t=0에서의 활성으로 나눈 것으로 결정하였다.
결과 및 검토:
이하의 표 23-25에 t=0(표 23), t=22(표 24) 및 t=48(표 25)에 대해 1-6으로 번호를 붙인 6 개의 실험의 평균 활성값을 요약한다. 1-5번 실험은 모두 실온에서 수행하였다.
액체 희석율 평균 활성
1 2 3 4 5 6
RO 1:1000 3.27 2.91 2.72 1.74 2.46 2.89
1:10000 0.49 0.35 0.37 0.29 0.45 0.42
0 0.07 0.08 0.08 0.10 0.08 0.08
LC7 1:1000 3.55 3.51 3.39 3.39 0.08 3.43
1:10000 0.62 0.56 0.55 0.63 0.08 0.58
0 0.08 0.08 0.08 0.08 0.08 0.08
LC8 1:1000 3.44 3.34 3.45 3.54 3.37 3.55
1:10000 0.58 0.45 0.56 0.58 0.48 0.59
0 0.08 0.08 0.08 0.09 0.08 0.08
LC3 1:1000 3.47 3.39 3.44 3.60 2.87 3.48
1:10000 0.63 0.68 0.80 0.67 0.41 0.55
0 0.08 0.08 0.08 0.08 0.09 0.08
액체 희석율 평균 활성
1 2 3 4 5 6
RO 1:1000 1.78 0.77 2.01 0.36 1.46 1.70
1:10000 0.28 0.14 0.17 0.17 0.19 0.22
0 0.04 0.07 0.07 0.06 0.04 0.08
LC7 1:1000 3.42 2.47 3.10 2.64 2.57
1:10000 0.45 0.32 0.40 0.40 0.47
0 0.04 0.08 0.09 0.06 0.08
LC8 1:1000 3.27 2.23 3.42 3.39 3.02 3.30
1:10000 0.45 0.27 0.08 0.47 0.47 0.47
0 0.04 0.04 0.05 0.04 0.04 0.08
LC3 1:1000 3.50 3.31 3.36 3.15 3.08 3.31
1:10000 0.56 0.55 0.61 0.58 0.46 0.48
0 0.08 0.04 0.08 0.08 0.05 0.08
액체 희석율 평균 활성
1 2 3 4 5 6
RO 1:1000 1.34 0.49 0.86 0.22 0.60 1.34
1:10000 0.22 0.12 0.11 0.13 0.13 0.22
0 0.08 0.08 0.08 0.08 0.08 0.08
LC7 1:1000 3.03 2.43 2.05 2.16 3.03
1:10000 0.37 0.31 0.23 0.29 0.37
0 0.08 0.08 0.08 0.08 0.08
LC8 1:1000 2.48 2.32 2.07 2.67 1.78 2.48
1:10000 0.37 0.25 0.27 0.41 0.26 0.37
0 0.05 0.07 0.07 0.08 0.08 0.05
LC3 1:1000 3.27 3.57 2.22 2.58 1.83 3.27
1:10000 0.46 0.45 0.42 0.45 0.31 0.46
0 0.08 0.08 0.07 0.08 0.08 0.08
표 23-25에 나타낸 바와 같이, LC7, LC8 및 LC3의 존재하에서의 활성은 RO 물의 존재하에서의 활성보다 확실히 높다. 안정성에 대한 본 발명에 따른 액체 조성물의 효능을 정량하기 위해, 본 발명의 액체 조성물의 존재하에서의 안정도를 RO 물에서의 안정도로 나눈 것으로서 안정성 향상 파라미터(stability enhancement parameter, Se)를 정의하였다.
도 49는 희석율의 함수로서 22 시간(삼각형 모두) 및 48 시간(정사각형 모두)에 대한 Se 값을 나타낸다. LC7, LC8 및 LC3에 대한 Se 값은 각각 청색, 적색 및 녹색으로 도 49에 도시하였다. 도 49에 도시된 바와 같이, 측정된 안정화 효능은 1:10,000의 효소 희석액에 대해 약 2 내지 3.6 범위이고, 1:1,000의 희석액에 대해 약 1.5 내지 3의 범위이다. 정도의 차이는 다소 있지만 동일한 현상이 저온에서 관찰되었다.
알칼리성 포스파타제의 결합 형태
전형적으로 다른 분자에 효소를 결합시키면 그의 안정성이 증가한다. 효소는 전형적으로 고농도로 저장되며, 사용하기 전에만 원하는 희석액으로 희석된다. 다음의 실험예는 효소가 장기간 동안 고농도로 저장되는 경우 본 발명에 따른 액체 조성물의 안정화 효능을 조사하기 위한 것이다.
재료 및 방법:
스트렙트-아비딘 알칼리성 포스파타제(Sigma)를 RO 물 및 상기 언급한 본 발명의 액체 조성물 LC7, LC8 및 LC3로 1:10 및 1:10,000으로 희석하였다. 희석된 시료를 관에서 5일동안 실온으로 배양하였다.
모든 시료는 그의 최종 효소 농도가 1:10,000이 되도록 희석하여, 위에 상세히 설명한 바와 같이 활성도를 결정하였다. 효소의 활성도는 t=0 및 5 일후에 결정하였다.
결과 및 검토:
도 50은 RO 물과 본 발명의 액체 조성물의 1:10의 희석액(청색) 및 1:10,000의 희석액(적색)을 5일간 저장한 후의 복합 효소의 활성도를 나타내는 챠트이다. RO 물의 경우, 효소 활성도는 두 희석액 모두에서 약 0.150 OD이다. 반면, 본 발명의 액체 조성물의 존재하에서 활성도는 1:10,000 희석액에서 보다 1:10 희석액에서 약 3.5배 높다. 그러나, 두 희석액 모두 RO 물에서보다 본 발명의 액체 조성물에서 효소의 활성이 상당히 크다.
β- 갈락토시다제
재료 및 방법:
효소 형태, 농도 및 배양 시간을 제외하고, 상기 설명한 알칼리성 포스파타제 실험에 사용된 동일한 프로토콜에 따라 β-갈락토시다제를 가지고 실험하였다. β-갈락토시다제(Sigma)를 RO 물과 본 발명의 액체 조성물로 연속적으로 희석하였다. 시료를 1:330 및 1:1000으로 희석하고 실온에서 배양하였다.
100 ㎕의 ONPG 용액(β-갈락토시다제 특이 발색 기질)과 10 ㎕의 효소를 37 ℃에서 15 분동안 혼합하고 50 ㎕의 정지액(1M Na2HCO3)을 첨가한 후, 0, 24 시간, 48 시간, 72 시간 및 120 시간의 시간 간격으로 효소 활성을 결정하였다. 마이크로적정 플레이트(각각의 시험 포인트에 대해 적어도 8회 반복)에서 분석하였다. 405 ㎚ 파장에서 ELISA 리더에 의해 색의 강도를 결정하였다.
RO 물과 상기 언급한 본 발명에 따른 액체 조성물 LC7, LC8 및 LC3의 각각의 희석액에 대해 시간 t=0에서 효소 활성을 결정하였다. 동일한 조건하에서 실험을 5회 수행하였다. 효소의 안정도 및 안정성 향상 파라미터(Se)를 위에 상세히 설명한 바와 같이 산출하였다.
결과 및 검토:
도 51a-d는 t=24 시간(도 51a), t=48 시간(도 51b), t=72 시간(도 51c) 및 t=120 시간(도 51d)에서의 안정도(t=O의 활성도로 나눈 t≠0의 활성도)를 나타낸다. 액체 RO, LC7, LC8, LC3 및 LC4는 도 51a-d에 각각 청색, 적색, 녹색 및 보라색으로 도시되어 있고, 안정도의 평균값은 원으로 도시되어 있다. 도 51a-51d에 도시된 바와 같이, LC7, LC8 및 LC3의 존재하의 활성은 RO 물의 존재하의 활성보다 확실히 높다.
도 52a-d는 도 51a-d와 동일하게 색 표시된 t=24 시간(도 52a), t=48 시간(도 52b), t=72 시간(도 52c) 및 t=120 시간(도 52d)에서의 안정성 향상 파라미터(Se)를 나타낸다. 도 52a-d에 도시된 바와 같이, 측정된 안정화 효능의 범위는 1:1000의 효소 희석액의 경우 약 1.3 내지 2.21이고, 1:330의 희석액의 경우 약 0.83 내지 1.3이다.
따라서, β-갈락토시다제에 대한 본 발명의 액체 조성물의 안정화 효능은 AP에 대해 관찰된 안정화 효능과 비슷하다. 안정화의 정도는 약간 낮다. 이는 시간이 경과함에 따라 활성 손실이 약화되는 분석법에서 고단백질 농도의 비교적 낮은 특이 활성(464 u/ ㎎)으로 설명될 수 있다.
건조 알칼리성 포스파타제의 활성 및 안정성
많은 효소들은 저장하기 전에 건조된다. 건조 공정 및 후속하는 건조 상태로 장시간동안의 저장은 효소 활성에 영향을 미치는 것으로 알려져 있다. 다음 실험은 건조 알칼리성 포스파타제의 활성 및 안정성에 대한 본 발명의 액체 조성물의 효능을 조사하기 위한 것이다.
재료 및 방법:
알칼리성 포스파타제(Jackson INC)를 위에 상세히 설명한 바와 같이 상기 언급한 본 발명의 액체 조성물 LC7, LC8 및 LC3 및 RO 물로 1:5000으로 희석하였다.
5 ㎕의 분취(aliquot) 용액을 9 개의 마이크로적정 플레이트에 채웠다. 플레이트 하나를 위에 상세히 설명한 바와 같이 t=0에서 효소 활성에 대해 시험하였고, 나머지 8 개의 플레이트는 37 ℃에서 밤새 건조시켰다. 건조 공정은 데시케이트 주위(dessicated environment)에서 16 시간동안 수행하였다.
2 개의 플레이트를 먼저 실온으로 냉각한 다음 실온에서 100 ㎕의 pNPP 용액을 첨가하여 효소 활성에 대해 시험하였다. 색의 강도는 405 ㎚ 파장에서 ELISA 리더(reader)에 의해 결정하였고, 안정도는 위에 상세히 설명한 바와 같이 산출하였다. 6 개의 플레이트를 30분동안 60℃로 옮기고 그후 효소 활성을 결정하였다.
결과:
도 53a는 건조후(2회 반복) 및 60℃로 열처리하고(6회 반복) 30 분후의 효소 활성을 나타낸다. 평균값을 "+" 기호로 도 53a에 나타내었다. 처리군 모두 효소를 크게 손상시켰고, 이들의 효능은 상가적이었다.
도 53b는 안정성 향상 파라미터(Se)를 나타낸다. 효소가 비교적 적은 데이타베이스 및 극한의 조건에 노출되었음에도 불구하고, 본 발명의 액체 조성물은 효소의 활성을 명백히 안정화시킨다. 예를 들어, LC7의 경우, 안정성 향상 파라미터의 평균값이 1.16에서 1.22로 증가하였다.
실시예 16
DNA 의 고정
본 실시예에서, 본 발명의 액체 조성물의 존재 또는 부재하에 유리 비드와 DNA 고정의 효능을 조사하였다. 유리 비드와 같은 고체 지지체(solid support)에의 폴리뉴클레오티드의 고정은 분자생물학 연구 및 의약의 분에서 가장 이로울 수 있다. 전형적으로, DNA 조작은 PCR, 결찰(ligation), 제한(restriction) 및 형질전환(transformation)을 비롯한 일련의 반응을 포함한다. 각각 특정 완충액을 필요로 하는 각각의 반응은 바람직하게는 각각의 적합한 반응 조건하에서 수행된다. 전형적으로, 각각의 반응에서, DNA 또는 RNA 시료를 침전시킨 다음 그의 새로운 적합한 완충액 내에서 재구성해야한다. 반복된 침전 및 재구성은 시간이 걸리며, 더욱 중요하게도 출발 물질을 손실시키기 때문에, 이런 요소가 적을 때 가장 적합할 수 있다. 예로서, 본 발명자는 PCR 반응동안 유리 비드의 존재하에서 본 발명의 액체 조성물이 DNA에 어떤 영향을 미치는지를 조사하기 위해 선택하였다.
재료 및 방법:
수득되는 단편 크기가 750 bp가 되도록 T7 포워드 프라이머(TAATACGACTCACTATAGGG)(서열번호: 5) 및 M13 리버스 프라이머(GGAAACAGCTAT GACCATGA)(서열번호: 6)를 사용하여 750 개 염기쌍의 유전자로 클로닝된 pBS 플라스미드로부터 PCR을 제작하였다. 프라이머를 200 μM(200 pmol/㎕) 농도의 PCR-급 물에서 구축하였다. 이어, 이들을 배합된 혼합물로 제조하기 위해 각각 10 μM의 작용 농도(working concentration)가 되도록 NeowaterTM로 1:20으로 순차적으로 희석시켰다. 예를 들어, 1 ㎕의 각 프라이머(200 μM 원액으로부터)를 18 ㎕의 NeowaterTM와 배합 및 희석하고, 혼합 및 침강(spun down)시켰다. 농축 DNA를 2 pg/㎕의 작용 농도가 되도록 NeowaterTM로 1:500으로 희석하였다. Biometra T-Gradient PCR 장치에서 PCR을 수행하였다. 사용된 효소는 완충액 Y 중의 SAWADY Taq DNA 중합효소(PeqLab 01-1020)였다.
PCR 혼합물을 다음과 같이 제조하였다:
최종 농도 X1 농도 시약
X1 1㎕ X10 완충액 Y
0.2 mM 0.2 ㎕ 각각 10 mM dNTPs
0.4 유닛 0.08 ㎕ 5 u/㎕ Tag
3.22 ㎕ NeowaterTM
팁 엔드(tip end)로 비즈를 잡고 개방관(open tube) 상부의 첨단(tip)위에서 천천히 가볍게 두드린다 - 유리 비드가 관으로 들어갈 것임. 중요점 - 혼합물중 분말의 양은 거의 볼 수 없어야 함. 너무 많은 양의 글래스 분말은 PCR 반응을 억제할 것임. 유리 비드 - 어떤 처리도 하지 않음.
시료를 혼합하되 교반하지 않았다. 이들을 94 ℃에서 정확히 1 분동안 PCR 장치에 놓아 둔 다음 꺼냈다. 그후, 4.5 ㎕의 PCR 혼합물을 깨끗한 관내로 분취하고, 0.5 ㎕의 프라이머 혼합물과 5 ㎕의 희석 DNA를 순서대로 첨가하였다. 혼합하되 교반 또는 원심분리하지 않은 후, 시료를 PCR 장치에 놓아 두었고, 다음의 PCR 프로그램을 사용하였다:
시간 온도 단계
10 초 94 ℃ 단계 1
10 초 50 ℃ 단계 2
10 초 74 ℃ 단계 3
상술한 바와 같이 분석하기 위해, PCR 반응의 산물을 8% PAGE 겔위에 부하하였다.
겔위에 부하된 PCR 산물은 다음과 같았다:
1번 레인 : NeowaterTM로 희석된 DNA, H2O로 희석된 프라이머(혼합물), NeowaterTM(10 ㎕가 되는 부피)(유리 비드 함유)
2번 레인 : NeowaterTM로 희석된 DNA, NeowaterTM로 희석된 프라이머(혼합물), NeowaterTM(10 ㎕가 되는 부피)(유리 비드 함유)
3번 레인 : H2O중의 전체(양성 대조군)(유리 비드 함유)
4번 레인 : 음성 대조군. DNA 무함유, H2O와 NeowaterTM(10 ㎕가 되도록)중의 프라이머(유리 비드 함유)
5번 레인 : NeowaterTM로 희석된 DNA, H2O로 희석된 프라이머(혼합물), NeowaterTM(10 ㎕가 되는 부피)(유리 비드 무함유)
6번 레인 : NeowaterTM로 희석된 DNA, NeowaterTM로 희석된 프라이머(혼합물), NeowaterTM(10 ㎕가 되는 부피)(유리 비드 무함유)
7번 레인 : H2O중의 전체(양성 대조군)(유리 비드 무함유)
8번 레인 : 음성 대조군. DNA 무함유, H2O와 NeowaterTM(10 ㎕가 되도록)중의 프라이머(유리 비드 무함유)
결과 및 결론
도 54는 DNA 이미지이다. 도면에 나타낸 바와 같이, PCR은 유리 비드의 존재하에 수행되며, 반응이 개시하기 위해서는 네오워터(neowater)가 필요하다. 네오워터가 반응에 포함되지 않는 경우, PCR 산물은 관찰되지 않는다(3번 레인 참조).
최종적으로, 본 발명의 액체 조성물은 유리 비드의 존재하에 PCR 반응동안 필요하다.
실시예 17
실시간 PCR
DNA와 cDNA 핵산 서열의 검출 및 정량화는 법의학, 의학, 의약품 개발 및 분자 생물학 연구를 비롯한 폭넓은 범위의 적용예에 있어서 중요하다. 실시간 PCR은 아가로스 겔에서 브롬화 에티듐의 시각화에 의존하는 종래 PCR의 종점 검출(endpoint detection)과는 대조적으로, 각각의 PCR 사이클동안(즉, 실시간으로) 엠프리콘 생성의 지표로서 PCR 반응중 방출되는 형광을 모니터링한다.
감도가 높기 때문에, 실시간 PCR은 매우 소량의 DNA 또는 cDNA을 검출하고 정량화하는데 특히 적합하다. 감도 및 재현성을 개선하고 실시간 PCR에 필요한 반응 부피를 감소시키는 것은 귀중한 시료를 보존하는데 도움이 된다.
본 실시예에서는 본 발명에 따른 액체 조성물의 존재하 및 부재하에 실시간 PCR 반응의 감도 및 반응 부피를 조사하였다.
A. 감도 시험
재료 및 방법:
어플라이드 바이오시스템(Applied Biosystem) 7300 PCR 시스템에서 SYBR Green 방법을 사용하여 실시간 PCR 반응을 수행하였다. 96 웰 플레이트[뉴욕 소재 코닝(Corning)]에서 반응을 수행하였다. 프라이머 서열은 다음과 같았다:
포워드 프라이머(forward primer): CACCAGACTGACTCCTCATT 서열번호:7
리버스 프라이머(reverse primer): CCTGTTGCTGCACATATTCC 서열번호:8
각각 12개의 시료로 된 두 세트를 아래 표 28에 기술된 바와 같이 준비하였고, 한 세트에는 핵산분해효소를 함유하지 않는 물을, 다른 세트에는 NeowaterTM를 사용하였다. 각 세트에 대하여, 13X 혼합물을 제조하였다:
성분 ㎕/웰 13개 반응당 풀(pool)(㎕)
포워드 프라이머(물 또는 NeowaterTM에 희석시킴) 0.5 6.5
리버스 프라이머(물 또는 NeowaterTM에 희석시킴) 0.5 6.5
ABI SYBR green 혼합물 10 130
물 또는 NeowaterTM 6 78
1:5에서 출발하여 1:2560으로 종료하는 일련의 희석액이 되도록 cDNA 시료를 물 또는 NeowaterTM에 희석하였다(총 10 개의 희석액). 1:5 희석액은 원래의 cDNA 3 ㎕ + H2O 또는 NeowaterTM 12 ㎕를 사용하여 제조하였다. 이후의 희석액들은 시료 7.5 ㎕ 및 H2O 또는 NeowaterTM 7.5 ㎕를 취하여 제조하였다.
17 ㎕의 혼합물을 3 ㎕의 cDNA 시료에 첨가하였다. 각 세트에서 첫 번째 반응은 희석시키지 않은 cDNA 시료였다.
형광이 선택한 수준을 초과하는데 필요한 PCR 사이클의 수(역치 사이클(threshold cycle, Ct)) 대 물 및 NeowaterTM 희석 시료 모두에 대한 그의 상응하는 Log cDNA 농도의 표준 곡선을 플롯팅하였다. 이 표준 곡선은 반응 효율인 직선성 공정의 지표이다.
물 및 NeowaterTM 희석 시료 모두에 대한 각각의 표준 곡선의 반응에 대하여 해리 곡선을 플롯팅하였다.
자동적 베이스라인 측정을 사용하여 표준 곡선 및 해리 곡선 모두를 플롯팅하였다. 표준 곡선에 대해서만 매뉴얼 백그라운드 컷오프(manual background cut-off) 0.2로 플롯팅하고, 각 세트로부터 동일하거나 동일하지 않은 이상값을 제거하였다.
결과
자동적 베이스라인 측정에 의한 원 데이터를 아래 표 29에 나타내었다:
웰 cDNA 희석액 Ct
NeoWater
A1 A 1:1 26.24
B1 A 1:5 27.26
C1 A 1:10 28.52
D1 A 1:20 29.56
E1 A 1:40 30.27
F1 A 1:80 31.36
G1 A 1:160 32.17
H1 A 1:320 33.53
A2 A 1:640 33.81
B2 A 1:1280 34.04
C2 A 1:2560 36
D2 NTC 측정하지 않음
물
A3 B 1:1 23.02
B3 B 1:5 24.39
C3 B 1:10 25.44
D3 B 1:20 26.36
E3 B 1:40 29.16
F3 B 1:80 28.46
G3 B 1:160 28.68
H3 B 1:320 29.49
A4 B 1:640 32.66
B4 B 1:1280 37
C4 B 1:2560 측정하지 않음
D4 NTC 측정하지 않음
자동적 베이스라인 측정에 의한 표준 곡선 및 해리 곡선을 NeowaterTM에 대해서는 도 55a-b에 물에 대해서는 도 56a-b에 나타내었다. NeowaterTM의 경우, 해리 곡선의 기울기 값은 -2.969이었고 회귀값은 0.987이었다. 물의 경우, 해리 곡선의 기울기 값은 -4.048이었고 회귀값은 0.875이었다.
베이스라인 컷오프 0.2에 의한 원 데이터를 아래 표 30에 나타내었다:
웰 cDNA 희석액 Ct
NeoWater
A1 A 1:1 24.24
B1 A 1:5 25.2
C1 A 1:10 26.46
D1 A 1:20 27.59
E1 A 1:40 28.35
F1 A 1:80 29.35
G1 A 1:160 30.17
H1 A 1:320 31.52
A2 A 1:640 31.72
B2 A 1:1280 32.03
C2 A 1:2560 33.99
D2 NTC 측정하지 않음
물
A3 B 1:1 24.14
B3 B 1:5 25.51
C3 B 1:10 26.52
D3 B 1:20 27.5
E3 B 1:40 30.3
F3 B 1:80 29.61
G3 B 1:160 29.81
H3 B 1:320 30.76
A4 B 1:640 33.86
B4 B 1:1280 38.2
C4 B 1:2560 측정하지 않음
D4 NTC 측정하지 않음
베이스라인 컷오프 0.2에 의한 표준 곡선을 NeowaterTM에 대해서는 도 57a에 물에 대해서는 도 57b에 나타내었다. NeowaterTM의 경우, 해리 곡선의 기울기 값은 -2.965이었고 회귀값은 0.986이었다. 물의 경우, 해리 곡선의 기울기 값은 -4.094이었고 회귀값은 0.885이었다.
각각의 세트로부터 동일한 이상값을 제거한 후의 원 데이터 및 매뉴얼 백그라운드 컷오프 0.2를 아래 표 31에 나타내었다:
웰 cDNA 희석액 Ct
NeoWater
B1 A 1:5 25.2
C1 A 1:10 26.46
D1 A 1:20 27.59
E1 A 1:40 28.35
F1 A 1:80 29.35
G1 A 1:160 30.17
H1 A 1:320 31.52
D2 NTC 측정하지 않음
물
B3 B 1:5 25.51
C3 B 1:10 26.52
D3 B 1:20 27.5
E3 B 1:40 30.3
F3 B 1:80 29.61
G3 B 1:160 29.81
H3 B 1:320 30.76
D4 NTC 측정하지 않음
각각의 세트로부터 동일한 이상값을 제거한 후의 표준 곡선 및 매뉴얼 백그라운드 컷오프 0.2를 NeowaterTM에 대해서는 도 58a에 물에 대해서는 도 58b에 나타내었다. NeowaterTM의 경우, 해리 곡선의 기울기 값은 -3.338이었고 회귀값은 0.994이었다. 물의 경우, 해리 곡선의 기울기 값은 -2.918이었고 회귀값은 0.853이었다.
각각의 세트로부터 분리된(separate) 이상값을 제거한 후의 원 데이터 및 매뉴얼 백그라운드 컷오프 0.2를 아래 표 32에 나타내었다:
웰 cDNA 희석액 Ct
NeoWater
B1 A 1:5 25.2
C1 A 1:10 26.46
D1 A 1:20 27.59
E1 A 1:40 28.35
F1 A 1:80 29.35
G1 A 1:160 30.17
H1 A 1:320 31.52
D2 NTC 측정하지 않음
물
B3 B 1:5 25.51
C3 B 1:10 26.52
D3 B 1:20 27.5
F3 B 1:80 29.61
D4 NTC 측정하지 않음
각각의 세트로부터 분리된 이상값을 제거한 후의 표준 곡선 및 매뉴얼 백그라운드 컷오프 0.2를 NeowaterTM에 대해서는 도 59a에 물에 대해서는 도 59b에 나타내었다. NeowaterTM의 경우, 해리 곡선의 기울기 값은 -3.338이었고 회귀값은 0.994이었다. 물의 경우, 해리 곡선의 기울기 값은 -3.399이었고 회귀값은 0.999이었다.
결론
NeowaterTM 표준 곡선의 높은 기울기 값(-2.969)이 일부 백그라운 노이즈의 존재를 반영할 수도 있지만, 도 55a 및 도 56a에서 표준 곡선의 기울기 값은 NeowaterTM의 존재하에서 증폭 효능이 더 높다는 것을 반영하는 것이다. 두 해리 곡선의 조사를 통해 임의의 비특이적 산물의 부재가 입증된다. 이것은 NeowaterTM의 존재하에서 백그라운드(BG) 판독의 상승이 존재한다는 것을 나타낸다(물의 존재하에서는 0.09인 것과는 대조적으로 0.7임). 이러한 높은 BG 컷오프의 결과는 NeowaterTM 표준 곡선이 물의 표준 곡선(Ct값이 -23.02에서 시작함) 보다 더 높은 Ct값 26.24에서 시작한다는 것이다. 이러한 높은 BG의 현상은 아마도 NeowaterTM의 존재하에서 감도가 상승한다는 하나의 일면을 반영한다. 이러한 상승된 감도의 다른 일면은 높은 cDNA 희석액에서 NeowaterTM 표준 곡선이 직선이라는 것이며, 이는 희박한 표적 엠프리콘을 확실히 검출하는 능력을 반영한다.
NeowaterTM에 대한 높은 회귀값은 NeowaterTM가 존재하면 더 넓은 동적 범위의 농도에 대하여 양을 더욱 정확하게 평가할 수 있음을 나타낸다.
같은 BG 컷오프 값에서 두 세트의 반응을 비교하기 위해, 백그라운드 노이즈를 조사하였고, 두 세트에 대하여 0.2의 BG 값을 수동으로 선택하였다. 이 값은 두 세트(도 60a 및 60b)에 대한 백그라운드 판독치 보다 크며 직선 범위에 있다는 것을 알 수 있었다.
도 57a 및 도 57b는 동일한 BG 컷오프 0.2에서 플롯팅된 표준 곡선을 나타낸다. NeowaterTM 표준 곡선은 더 작은 R2 값을 가지지만, 높은 cDNA 농도에서는 물의 표준 곡선과 동일한 Ct값을 갖는다(1:1 cDNA 희석액에서 Ct-24.24). 증폭의 효능 및 동적 범위는 NeowaterTM의 존재하에서 더 높다.
보다 최적의 곡선에 도달하기 위해, cDNA 농도 1:5, 1:640, 1:1280, 1:2560에 상응하는 이상값을 제거하고 도 58a 및 58b에 나타낸 바와 같이 표준 곡선을 다시 그렸다.
각각의 세트에 대해 가능한 최적의 곡선에 도달하기 위해, 각각의 세트로부터 개별적으로 이상값을 제거하였다. 표준 곡선을 도 59a 및 59b에 도시한 바와 같이 다시 그렸으며, 이는 동적 범위가 높을수록(점이 많을수록) NeowaterTM의 존재하에서는 정확성이 높아지고(이상값이 적어지고) 감도가 높아짐을 입증한다. NeowaterTM 세트에 대한 최적의 표준 곡선(기울기 값 -3.3)은 물 세트에 대한 표준 곡선 보다 더 많은 측정점을 포함하며, 그중 두 개는 더 높은 주형 희석액을 나타낸다.
B. 부피 시험
물 대신 NeowaterTM를 사용하여 실시간 PCR 반응을 수행하여 감도는 유지하면서 반응 부피를 더욱 감소시킬 수 있는 지에 대한 가능성을 조사하였다.
재료 및 방법
모든 재료는 감도를 측정하기 위해 위에서 사용했던 것들과 동일하였다. cDNA 시료를 1:80으로 희석하였는데, 이는 도 59a 및 59b에 도시된 바와 같이 두 세트 모두(NeowaterTM 및 물)에서 정확한 결과에 도달했던 최고 희석액이었기 때문이다.
시험된 반응 부피는 5 ㎕, lO ㎕ 및 15 ㎕이었다. 세 가지의 부피 세트는 각각 다음과 같은 8 개의 반응을 포함하였다: NeowaterTM를 함유하는 3 개의 반응, NeowaterTM를 함유하지 않는 3 개의 반응 및 하나의 음성 대조군(마이너스 주형). 반응 부피의 감소 이외에, SYBR green 용액과 용매(물 또는 NeowaterTM) 사이의 비율이 변하였다(아래 표 33에 기술된 바와 같음). 비율의 변화로 인해 결과를 감도 시험의 결과와 비교할 수 없었다.
성분 표준 20㎕ 반응의 조성 부피 시험을 위한 20㎕ 반응의 조성 5㎕ 부피 시험 풀 30㎕ 10㎕ 부피 시험 풀 60㎕ 15㎕ 부피 시험 풀 80㎕
포워드 프라이머(물 또는 NeowaterTM에 희석시킴) 0.5 0.5 0.75 1.5 2
리버스 프라이머(물 또는 NeowaterTM에 희석시킴) 0.5 0.5 0.75 1.5 2
ABI SYBR green 혼합물 10 5 7.5 15 20
물 또는 NeowaterTM 6 11 16.5 33 44
cDNA 시료 (물 또는 NeowaterTM에 희석시킴) 3 3 4.5 9 12
나타낸 바와 같이 각각의 부피 시험의 풀을 물 또는 NeowaterTM로 제조한 다음, 반응 웰에 목적하는 부피로 분취해냈다. 모든 결과를 백그라운도 컷오프 값 0.2로 판독하였다.
결과
세 가지 반응 3 세트(즉, 5 ㎕, 10 ㎕ 및 15 ㎕)의 증폭 곡선을 NeowaterTM에 대해서는 도 61a-c에 도시한 바와 같이 플롯팅하고, 물에 대해서는 도 62a-c에 도시한 바와 같이 플롯팅하였다.
도 61a-c 및 62a-c에 상응하는 원 데이터를 아래 표 34에 나타내었다:
반응 부피(㎕) NeowaterTM 3 세트의 Ct값 물 3 세트의 Ct값
5 30.83 측정하지 않음
5 32.52 34.62
5 32.37 33.53
5 NTC - 측정하지 않음 NTC - 측정하지 않음
10 31.48 32.82
10 32.94 측정하지 않음
10 35.27 34.12
10 NTC - 측정하지 않음 NTC - 측정하지 않음
15 31.03 측정하지 않음
15 31.01 32.43
15 32.49 35.9
15 NTC - 측정하지 않음 NTC - 측정하지 않음
결론
결과의 조사에 의해 일반적으로 NeowaterTM의 존재하에 수행된 반응의 재현성이 더 우수한 것으로 나타났다. 물 세트의 경우 모든 세트에서 판독치 사이의 변동이 매우 높고 측정되지 않은 판독정보가 더 많은 반면, 각각의 3 세트에서의 유사성은 NeowaterTM 세트의 경우에 더욱 높다. 이는 이들 반응이 감소된 부피에서 정확히 수행될 수 있음을 나타내는 것일 수 있다.
실시예 18
초음파 시험
본 발명의 액체 조성물을 초음파 공진기에서 일련의 초음파 시험을 실시하였다.
방법
ResoScan® 리서치 시스템(독일 하이델베르그 소재)을 사용하여 본 발명의 액체 조성물(본 실시예에서는 NeowaterTM라 함) 및 재증류수에서의 초음파 속도를 측정하였다.
표준화( calibration )
ResoScan® 리서치 시스템의 세포 모두를 0.005% Tween 20을 보충한 표준수(탈염수, Roth. Art.3175.2 Charge:03569036)로 채우고 20℃에서 등온 측정동안 측정하였다. 두 세포들 사이의 초음파 속도의 차이를 이하에 더욱 상세히 설명되는 바와 같이 등온 측정에서 제로 값으로서 사용하였다.
등온 측정
ResoScan® 리서치 시스템의 세포 1을 기준으로서 사용하였으며, 증류수(Roth Art.34781 lot#48362077)로 채웠다. 세포 2는 본 발명의 조성물로 채웠다. 절대 초음파 속도를 20℃에서 측정하였다. 실험값을 비교하기 위해, 초음파 속도를 20.000℃로 보정하였다.
결과
도 63은 본 발명의 조성물(U2) 및 증류수(U1)에 대하여 20.051℃에서 측정한 절대 초음파 속도(U)를 관찰 시간의 함수로서 나타낸 것이다. 두 시료는 모두 관측 시간대(35 분)에서 안정한 등온 속도를 나타내었다.
아래 표 35는 측정한 초음파 속도 U1, U2 및 20℃에 대한 그의 보정값을 요약하여 나타낸 것이다. 보정값은 증류수에 대하여 1℃ 당 3 m/s의 온도-속도 상관관계를 사용하여 산출하였다.
시료 온도 U
증류수 20.051℃ 1482.4851
NeowaterTM 1482.6419
증류수 20℃ 1482.6381
NeowaterTM 1482.7949
도 63 및 표 35에 나타낸 바와 같이, 증류수 및 본 발명의 액체 조성물 사이의 차이를 등온 측정에 의해 관찰하였다. 차이 △U=U2-U1은 온도 20.051℃에서 15.68 cm/s이었고, 온도 20℃에서 13.61 cm/s이었다. △U의 값은 ResoScan® 리서치 시스템의 어떤 노이즈 시그널보다도 매우 높았다. 결과는 두 번째 ResoScan® 리서치 시스템에서 한때 재생되었다.
실시예 19
칩에의 RNA 의 혼성화
본 발명에 따른 액체 조성물의 존재하 및 부재하에 DNA 칩에 대한 RNA 시료들 사이의 혼성화 세기를 조사하였다.
재료 및 방법
GEArray Q Series Human Signal Transduction PathwayFinder Gene Array: HS-008을 사용하였다.
Rneasy 키트(QIAGEN)를 사용하여 인간 림프구로부터 RNA를 추출하였다. GEArray AmpoLabeling-LPR 키트(Catalog Number L-03)를 사용하여 제조업자의 프로토콜에 따라 RNA를 표지하였다.
제조업자의 프로토콜에 따라 어레이에 RAN 시료를 혼성화시켰다. 기본적으로 막을 탈이온수에서 5 분동안 예비-습윤화시킨 다음, 예비가온한 GEAhyb 혼성화 용액(GEArray)에서 2 시간동안 60℃에서 인큐베이션하였다. 혼성화 용액에 상기 표지된 RNA를 첨가하고 60℃에서 밤새 방치하여 막과 혼성화하게 하였다. 세정후, 막을 자가방사선촬영(autoradiography)용 X선 필름에 2초 또는 10초의 노출 시간동안 노출시켰다.
결과
도 64a-d에 도시된 바와 같이, 동일한 노출 기간 이후 시그널 강도에 의해 입증된 바, DNA 칩에의 RNA 혼성화는 본 발명의 액체 조성물의 존재하에 증가된다.
실시예 20
나노구조를 포함하는 조성물의 완충능
완충능에 대한 나노구조를 포함하는 조성물의 효과를 조사하였다.
재료 및 방법
페놀 레드 용액(20 ㎎/25 ㎖)을 제조하였다. 290 ㎕를 13 ㎖의 RO 물 또는 여러 배치(batch)의 나노구조를 포함하는 물[NeowaterTM, 이스라엘 소재 두-쿱 테크놀로지스(Do-Coop technologies)]에 첨가하였다. 각각의 물의 출발 pH는 상이하였지만 페놀 레드 용액이 첨가된 후 황색 또는 엷은 오렌지색이었으므로 이들 모두 산성이었음을 알 수 있었다. 2.5 ㎖의 각각의 물 + 페놀 레드 용액을 큐벳에 첨가하였다. 수산화나트륨의 부피를 증가시켜 각각의 큐벳에 첨가하고, 분광광도계에서 흡수 스펙트럼을 판독하였다. 산성 용액의 피크는 430 nm이었고, 알칼리 용액의 피크는 557 nm이었다. 파장 범위는 200-800 nm이나, 0.02M 수산화나트륨의 첨가와 관련하여 그래프는 단지 557 nm의 파장만이 조회되었다.
결과
수산화나트륨 적정후 각각의 물 용액에 대한 557 nm에서의 흡광도를 표 36에 요약하였다.
NW1 HAP NW2 AB 1-2-3 NW3 HA 18 NW4 Alexander NW5 HA-99-X NW6 RO 첨가된 0.02M 수산화나트륨 (㎕)
0.026 0.033 0.028 0.093 0.011 0.118 0.0110.022 0
0.132 0.17 0.14 0.284 0.095 0.318 0.022 4
0.192 0.308 0.185 0.375 0.158 0.571 0.091 6
0.367 0.391 0.34 0.627 0.408 0.811 0.375 8
0.621 0.661 0.635 1.036 0.945 1.373 0.851 10
1.074 1.321 1.076 1.433 1.584 1.659 1.491 12
도 65 및 표 36에 나타낸 바와 같이, RO 물은 수산화나트륨을 첨가한 경우 더 큰 pH 변화를 보이고 있다. 그것은 경미한 완충 효과를 가지는데, 흡광도가 0.09 A에 도달했을 때 완충 효과는 "깨져" 수산화나트륨이 더 많이 첨가될수록 pH가 더 크게 변한다. HA-99 물은 RO와 유사하다. NW (#150905-106) (NeowaterTM), AB 물 Alexander (AB 1-22-1 HA Alexander)는 약간의 완충 효과를 가지고 있다. HAP 및 HA-18은 NeowaterTM 보다 더 큰 완충 효과를 보이고 있다.
요약하면, 본 실험으로부터, HA-99-X를 제외한 시험된 나노구조를 포함하는 모든 새로운 물 형태(HAP, AB 1-2-3, HA-18, Alexander)는 NeowaterTM와 유사한 특징을 보인다.
실시예 21
나노구조를 포함하는 액체 조성물의 완충능
완충능에 대한 나노구조를 포함하는 액체 조성물의 효과를 조사하였다.
재료 및 방법
50 ㎖의 RO 물 또는 나노구조를 포함하는 물[NeowaterTM, 이스라엘 소재 두-쿱 테크놀로지스(Do-Coop technologies)]에 수산화나트륨 및 염산을 첨가하고 pH를 측정하였다. 실험은 삼중으로 수행되었다. 모두, 3 개의 실험을 수행하였다.
수산화나트륨 적정: - 1 ㎕ 내지 15 ㎕의 1M 수산화나트륨을 첨가하였다.
염산 적정: - 1 ㎕ 내지 15 ㎕의 1M 염산을 첨가하였다.
결과
수산화나트륨 적정에 대한 결과를 도 66a-c 및 67a-c에 도시하였다. 염산 적정에 대한 결과를 도 68a-c 및 도 69에 도시하였다.
동일한 pH 수준에 도달하기 위해서 RO 물에 요구된 것보다 더 많은 양의 수산화나트륨이 필요하기 때문에, 나노구조를 포함하는 물은 완충능이 있다. 이러한 특징은 7.6-10.5의 pH 범위에서 더욱 크다. 또한, 나노구조를 포함하는 물은 동일한 pH 수준에 도달하기 위해서 RO 물에 요구된 것보다 더 많은 양의 염산이 필요하다. 이러한 효과는 알칼리 범위보다 산성 pH 범위에서 더 높다. 예를 들어, 10 ㎕의 수산화나트륨 1M(총합으로)을 첨가한 경우, RO의 pH는 7.56에서 10.3으로 증가하였다. 나노구조를 포함하는 물의 pH는 7.62에서 9.33으로 증가하였다. 1O ㎕의 염산 0.5M(총합으로)을 첨가한 경우, RO의 pH는 7.52에서 4.31로 감소한 반면, 나노구조를 포함하는 물의 pH는 7.71에서 6.65로 감소하였다. 이러한 특징은 7.7-3의 pH 범위에서 더 크다.
실시예 22
나노구조를 포함하는 액체 조성물의 완충능
완충능에 대한 나노구조를 포함하는 액체 조성물의 효과를 조사하였다.
재료 및 방법
페놀 레드 용액(20 ㎎/25 ㎖)을 제조하였다. 1 ㎖를 45 ㎖의 RO 물 또는 나노구조를 포함하는 물[NeowaterTM, 이스라엘 소재 두-쿱 테크놀로지스(Do-Coop technologies)]에 첨가하였다. pH를 측정하고 필요에 따라 적정하였다. 3 ㎖의 각각의 물 + 페놀 레드 용액을 큐벳에 첨가하였다. 수산화나트륨 또는 염산의 부피를 증가시켜 각각의 큐벳에 첨가하고, 분광광도계에서 흡수 스펙트럼를 판독하였다. 산성 용액의 피크는 430 nm이었고, 알칼리 용액의 피크는 557 nm이었다. 파장 범위는 200-800 nm이나, 0.02M 수산화나트륨의 첨가와 관련하여 그래프는 단지 557 nm의 파장만이 조회되었다.
염산 적정:
RO: 45 ㎖ pH 5.8
1 ㎖ 페놀 레드 및 5 ㎕ 수산화나트륨 1M을 첨가하였다. 새로운 pH = 7.85
NeowaterTM (# 150905-106): 45 ㎖ pH 6.3
1 ㎖ 페놀 레드 및 4 ㎕ 수산화나트륨 1M을 첨가하였다. 새로운 pH = 7.19
수산화나트륨 적정:
I. RO: 45 ㎖ pH 5.78
1 ㎖ 페놀 레드, 6 ㎕ 염산 0.25M 및 4 ㎕ 수산화나트륨 0.5M을 첨가하였다. 새로운 pH = 4.43
NeowaterTM (# 150604-109): 45 ㎖ pH 8.8
1 ㎖ 페놀 레드 및 45 ㎕ 염산 0.25M을 첨가하였다. 새로운 pH = 4.43
II. RO: 45 ㎖ pH 5.78
1 ㎖ 페놀 레드 및 5 ㎕ 수산화나트륨 0.5M을 첨가하였다. 새로운 pH = 6.46
NeowaterTM (# 120104-107): 45 ㎖ pH 8.68
1 ㎖ 페놀 레드 및 5 ㎕ 염산 0.5M을 첨가하였다. 새로운 pH = 6.91
결과
도 70a-c 및 도 71a-b에 도시된 바와 같이, 나노구조를 포함하는 물의 완충능이 RO 물의 완충능 보다 더 높았다.
실시예 23
rf 물의 완충능
완충능에 대한 RF 물의 효과를 조사하였다.
재료 및 방법
2-3(few) ㎕ 방울의 수산화나트륨 1M을 첨가하여 150 ㎖ RO 물의 pH를 올렸다(pH= 5.8). 이 물 50 ㎖을 3 개의 병에 분취하였다. 3 개의 병을 다음과 같이 처리하였다:
1번 병: 처리하지 않음(RO 물)
2번 병: RO 물을 3OW로 30 분동안 조사하였다. 이 병을 적정 개시전에 벤치(bench)에 10 분동안 방치하였다(RF 물).
3번 병: pH가 5에 도달했을 때 RF 물을 두 번째 조사하였다. 조사후, 적정을 계속하기 전에 병을 10 분동안 벤치에 방치하였다.
적정은 50 ㎖ 물에 1 ㎕ 0.5M 염산을 첨가함으로써 수행하였다. pH 값이 4.2 이하에 도달했을 때 적정을 종료하였다.
실험은 삼중으로 수행되었다.
결과
도 72a-c 및 도 73으로부터 알 수 있는 바와 같이, RF 물 및 RF2 물은 나노구조를 포함하는 담체 조성물의 것과 유사한 완충 특성을 포함한다.
실시예 24
나노구조를 포함하는 액체 조성물의 용해능
모두 물에 용해되지 않는 것으로 알려진 두 물질을 나노구조를 포함하는 액체 조성물이 농도 1 ㎎/㎖로 용해시킬 수 있는 지를 확인하기 위해 다음의 실험을 수행하였다.
A. 에탄올/[ Neowater TM , 이스라엘 소재 두-쿱 테크놀로지스( Do - Coop technologies)] 기초 용액에서의 용해
재료 및 방법
다양한 조성으로 분말을 용해하여 5 개의 시험을 실시하였다. 조성은 다음과 같다:
A. 10 ㎎ 분말 (적색/백색) + 990 ㎕ NeowaterTM
B. 10 ㎎ 분말 (적색/백색) + 990 ㎕ NeowaterTM (90 분간 탈수).
C. 10 ㎎ 분말 (적색/백색) + 495 ㎕ NeowaterTM + 495 ㎕ EtOH (50%-50%).
D. 10 ㎎ 분말 (적색/백색) + 900 ㎕ NeowaterTM + 90 ㎕ EtOH (90%-10%).
E. 10 ㎎ 분말 (적색/백색) + 820 ㎕ NeowaterTM + 170 ㎕ EtOH (80%-20%).
시험관을 와류시키고(vortexed) 60℃로 1 시간동안 가열하였다.
결과
1. 5 개의 시험관 모두 백색 분말은 용해되지 않았다.
2. 적색 분말은 용해되었지만 잠시 후 침전되었다. 색이 엷은 황색으로 변했기 때문에 시험관 C가 분말을 더 잘 용해시킨 것처럼 보였다.
B. 분쇄한 후 에탄올/[ Neowater TM , 이스라엘 소재 두-쿱 테크놀로지스( Do -Coop technologies )] 기초 용액에서의 용해
재료 및 방법
분쇄한 후, 적색 분말을 다음과 같은 4 개의 조성물로 용해시켰다:
A. 1/2 ㎎ 적색 분말 + 49.5 ㎕ RO.
B. 1/2 ㎎ 적색 분말 + 49.5 ㎕ NeowaterTM.
C. 1/2 ㎎ 적색 분말 + 9.9 ㎕ EtOH → 39.65 ㎕ NeowaterTM (20%-80%).
D. 1/2 ㎎ 적색 분말 + 24.75 ㎕ EtOH → 24.75 ㎕ NeowaterTM (50%-50%).
총 반응 부피: 50 ㎕.
시험관을 와류시키고 60℃로 1 시간동안 가열하였다.
결과
분쇄후에 적색 분말을 용해시키기 위해서는 20%의 에탄올만 NeowaterTM와 함께 필요하였다.
C. 강력한 분쇄한 후 에탄올/[ Neowater TM , 이스라엘 소재 두-쿱 테크놀로지스( Do - Coop technologies )] 용액에서의 용해
재료 및 방법
하나는 분말 단독(바이얼 1)에 대해, 다른 하나는 100 ㎕ NeowaterTM에 분산시킨 분말에 대해 실시하는 두 가지의 분쇄 프로토콜을 수행하였다.
두 개의 조성물을 교반기 위에 있는 두 개의 바이얼에 넣고 물질을 밤새 분쇄하였다:
15 시간후, 100 ㎕의 NeowaterTM를 2-3(few) 분당 10 ㎕의 적정에 의해 1 ㎎의 적색 분말(1번 바이얼)에 첨가하였다.
0-24 시간동안 시험관을 사진촬영하여 변화를 모니터링하였다(도 74f-j).
비교로서, 두 개의 시험관을 관찰하였는데 시험관 중 하나는 990 ㎕ NeowaterTM(90 분간 탈수)에 분산시킨 적색 분말을 포함하였고(1% 용액), 다른 하나는 50% 에탄올/50% NeowaterTM를 포함하는 용액 중에 분산시킨 적색 분말을 포함하였다(1% 용액). 시험관을 60℃에서 1 시간동안 가열하였다. 시험관을 도 14a-e에 도시하였다. 24 시간후, 각각의 용액으로부터 2 ㎕를 취하여 나노드롭(nanodrop)에서 흡광도를 측정하였다(도 75a-c)
결과
도 14a-j는 강력한 분쇄후에는 물질이 24 시간동안 안정하게 유지되고 침전되지 않았기 때문에 적색 물질을 용해시킬 수 있음을 설명한다. 그러나, 도 14a-e는 시간이 지남에 따라 물질의 색이 변하는 것을 보여준다(안정하지 않음).
1번 바이얼은 거의 흡수하지 않았다(도 75a); 용액 B의 흡광 피크는 220-270 nm에 존재하였고(도 75b) 왼쪽으로 쉬프트(shift)되었으며(220 nm); 용액 C의 흡광 피크는 250-330 nm에 존재하였다(도 75c).
결론
적색 물질의 분쇄에 의해 물질이 NeowaterTM에 분산하게 되었다. 분산액은 24 시간에 걸쳐 유지되었다. 유리 바이얼내 물질의 유지는 100% 탈수 NeowaterTM 및 EtOH-NeowaterTM(50%-50%) 모두에서 72 시간후에도 안정한 용액을 유지하였다.
실시예 25
나노구조를 포함하는 액체 조성물의 다이드제인 ( daidzein ), 다우노루비신( daunorubicine ) 및 t- boc 유도체 용해능
모두 물에 용해되지 않는 것으로 알려진 세 가지 물질[다이드제인-다우노마이신 접합체(Daidzein-daunomycin conjugate, CD-Dau); 다우노루비신(세루비딘 염산염, Cerubidine hydrochloride); 다이드제인의 t-boc 유도체(tboc-Daid)]을 나노구조를 포함하는 액체 조성물이 용해시킬 수 있는 지를 확인하기 위해 다음의 실험을 수행하였다.
재료 및 방법
A. CD - Dau 의 용해 - 제 1 부:
필요 농도: 3 ㎎/㎖ Neowater.
특성: 물질은 DMSO, 아세톤, 아세토니트릴에 용해한다.
특성: 물질은 EtOH에 용해한다.
다음과 같은 5 개의 상이한 유리 바이얼을 준비하였다:
1. 5 ㎎ CD-Dau + 1.2 ㎖ NeowaterTM.
2. 1.8 ㎎ CD-Dau + 600 ㎕ 아세톤.
3. 1.8 ㎎ CD-Dau + 150 ㎕ 아세톤 + 450 ㎕ NeowaterTM (25% 아세톤).
4. 1.8 ㎎ CD-Dau + 600 ㎕ 10% *PEG (폴리에틸렌 글리콜).
5. 1.8 ㎎ CD-Dau + 600 ㎕ 아세톤 + 600 ㎕ NeowaterTM.
1번, 4번 및 5번 바이얼에 대해, 시료를 와류시키고 분광광도계 측정을 수행하였다.
아세톤을 증발시키기 위해 바이얼을 개방해 두었다(2번, 3번 및 5번 바이얼).
결과
1번 바이얼 (100% Neowater ): 2-3(few) 시간후 CD-Dau가 침전되었다.
2번 바이얼 (100% 아세톤): CD-Dau가 아세톤에 현탁되었지만, 아세톤이 물질을 용해시켰기 때문에 48 시간후 물질이 부분적으로 침전되었다.
3번 바이얼 (25% 아세톤): CD-Dau가 그다지 용해되지 않았고 물질이 용액에 부유하였다(용액이 흐리게 보였다).
4번 바이얼 (10% PEG + Neowater ): CD-Dau가 1번 바이얼내 CD-Dau 보다는 더 잘 용해되었지만, 100% 아세톤과의 혼합물만큼은 잘 용해되지 않았다.
5번 바이얼 : CD-Dau를 먼저 아세톤에 현탁시키고, 완전히 용해시킨 후에 아세톤을 교환하기 위해 NeowaterTM를 첨가하였다. NeowaterTM가 존재하였음에도 불구하고 먼저 아세톤이 물질을 용해하였다. 그러나, 아세톤이 증발함에 따라 물질은 바이얼의 바닥에 부분적으로 침전되었다(그러나, 물질은 현탁된 채로 유지되었다).
분광광도계 측정(도 76)은 아세톤의 존재하 및 부재하 모두에서 물질의 거동을 나타낸다. 물 또는 10% PEG로 현탁된 물과 비교하였더니 아세톤의 경우에는 2 개의 피크가 존재하였는데, 두 경우는 모두 하나의 피크만을 보여주었다.
B. CD - Dau 의 용해 - 제 2 부:
2번, 4번 및 5번 용액으로부터 아세톤이 증발되자마자, 물질이 약간 침전되어 추가량의 아세톤을 바이얼에 첨가하였다. 이러한 프로토콜은 아세톤 및 NeowaterTM의 존재하에서 물질의 용해를 가능하게 하고, 그와 동시에 용액으로부터 아세톤의 후속적인 증발을 가능하게 한다(이러한 공정을 2회 수행하였다). 두 번째 사이클 후, 액체상을 바이얼로부터 제거하고, 추가량의 아세톤을 침전 물질에 첨가하였다. 침전 물질이 용해되면 앞서 제거한 액체상과 합하였다. 합한 용액을 다시 증발시켰다. 물질이 전혀 용해되지 않았기 때문에 1번 바이얼로부터 용액을 제거하고, 대신 1.2 ㎖의 아세톤을 침전에 첨가하여 물질을 용해시켰다. 그 뒤, 1.2 ㎖의 10% PEG + NeowaterTM도 첨가하고, 얼마후 용액으로부터 아세톤을 증발시켰다. 이러한 공정이 완료했을 때, 바이얼들을 하나의 바이얼로 합하였다(총 부피 3 ㎖). 이와 같은 최종 부피의 상부에 3 ㎖의 아세톤을 첨가하여 물질을 용해시켜 투명한 액화 용액을 수득한 다음, 50℃에서 다시 증발시켰다. 일단 이러한 상태에 도달하면 용액이 분리된다는 사실에 기인하여 용액은 평형에 도달하지 않았다. 평형을 피함으로써, 물질의 수화 상태가 유지되어 액체로서 유지된다. 용매를 증발시킨 후, 물질을 깨끗한 바이얼로 옮기고 진공 조건하에 밀폐하였다.
C. CD - Dau 의 용해 - 제 3 부:
아세톤-용해 물질 2 ㎖ 및 이전 실험에서 남은 나머지 물질 1 ㎖을 첨가하여 추가의 3 ㎖ 물질(총 부피 6 ㎖)을 생성하였다.
1.9 ㎖의 NeowaterTM를 아세톤이 함유된 바이얼에 첨가하였다.
1OO ㎕ 아세톤 + lOO㎕ NeowaterTM를 남아있는 물질에 첨가하였다.
50℃로 조정된 핫 플레이트상에서 증발시켰다.
용액이 안정해질 때까지 이러한 공정을 3회 반복하였다(아세톤의 첨가 및 그것의 증발).
두 바이얼을 함께 합하였다.
이들 두 용액을 합한 후에 물질이 약간 침전되었다. 아세톤을 첨가하고 용매의 증발을 반복하였다.
바이얼을 합하기 전에(3 ㎖ + 2 ㎖), 제 2 부에 상술된 바와 같은 실험에서 제조된 첫 번째 용액을 용액이 평형에 도달하고 평형을 유지하도록 9℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 이와 같이 실시함으로써 미리 용해된 물질은 침전되지 않았다. 다음날 아침, 용액의 흡수도를 확립하여 상이한 그래프를 수득하였다(도 77). 두 바이얼을 합한 후에 물질이 약간 침전되었기 때문에 흡수도 측정을 다시 수행하였다. 부분적인 침전의 결과로서, 아세톤(5 ㎖)을 첨가하여 용액을 1:1로 희석시킨 다음 핫 플레이트상에서 50℃로 용액을 증발시켰다. 증발 공정을 수행하는 동안 용액의 분광광도계 판독정보는 아세톤의 존재에 기인하여 변화하였다(도 78). 이들 실험은 소량의 아세톤이 존재하는 경우 흡수도 판독정보에 영향을 미칠 수 있다는 것을 암시한다.
B. 다우노루비신(세루비딘 염산염)의 용해
필요 농도: 2 ㎎/㎖
재료 및 방법
하나의 바이얼에는 2 ㎎ 다우노루비신 + 1 ㎖ NeowaterTM를 제조하고, 다른 바이얼에는 2 ㎎의 다우노루비신 + 1 ㎖ RO를 제조하였다.
결과
분광광도계 측정에 의해 설명된 바와 같이(도 79), 물질은 NeowaterTM 및 RO 모두에 쉽게 용해되었다.
결론
다우노루비신은 어려움없이 NeowaterTM 및 RO에 용해한다.
C. t- boc 의 용해
필요 농도: 4 ㎎/㎖
재료 및 방법
1.14 ㎖의 EtOH를 18.5 ㎎의 t-boc(유성 물질)를 함유하는 하나의 유리 바이얼에 첨가하였다. 그후, 이것을 두 개의 바이얼로 분배하고, 용액이 25% EtOH를 포함하도록 1.74 ㎖의 NeowaterTM 또는 RO 물을 상기 바이얼들에 첨가하였다. 분광광도계 측정후, 용액으로부터 용매를 증발시키고, 각 바이얼의 최종 부피가 2.31 ㎖가 되도록 두 바이얼 모두에 NeowaterTM를 첨가하였다. 두 바이얼내 용액을 하나의 깨끗한 바이얼에 합한 다음 수송을 위해 진공 조건하에서 포장하였다.
결과
분광광도계 측정치를 도 80에 도시하였다. 물질을 에탄올에 용해시켰다. NeowaterTM를 첨가한 다음 열(50℃)에 의해 용매를 증발시킴으로써, 물질을 NeowaterTM에 용해시킬 수 있었다.
결론
물질을 용해시키기 위한 최적의 방법은 먼저 물질을 용매(아세톤, 아세트산 또는 에탄올)를 사용하여 용해시킨 다음 친수성 유체(NeowaterTM)를 첨가하고 용액을 가열하여 용매를 증발시킴으로써 용매를 제거하는 것이었다.
실시예 26
나노구조를 포함하는 액체 조성물의 AG -14a 및 AG -14b 용해능
모두 물에 용해되지 않는 것으로 알려진 두 가지 약초 물질(herbal material) AG-14A 및 AG-14B를 나노구조를 포함하는 액체 조성물이 농도 25 ㎎/㎖로 용해시킬 수 있는 지를 확인하기 위해 다음의 실험을 수행하였다.
제 1 부
재료 및 방법
4 개의 시험관 각각에서 분말의 최종 농도가 2.5 ㎎/㎖가 되도록, 2.5 ㎎의 각각의 물질(AG-14A 및 AG-14B)을 NeowaterTM 단독 또는 75% NeowaterTM와 25% 에탄올을 포함하는 용액에 용해시켰다. 시험관을 와류시키고 에탄올을 증발시키기 위해 50℃로 가열하였다.
결과
에탄올의 존재하 및 부재하에 NeowaterTM 중에서 두 가지 약초 물질의 분광광도계 측정치를 도 81a-d에 도시하였다.
결론
RO 중의 현탁액은 AG-14B를 용해시키지 않았다. NeowaterTM중 AG-14B의 현탁액은 응집되지 않았던 반면, RO 물에서는 응집되었다.
AG-14A 및 AG-14B는 Neowater/RO에 용해되지 않았다.
제 2 부
재료 및 방법
5 ㎎의 AG-14A 및 AG-14B를 62.5 ㎕ EtOH + 187.5 ㎕ NeowaterTM에서 희석하였다. 추가의 62.5 ㎕ NeowaterTM를 첨가하였다. 시험관을 와류시키고 에탄올을 증발시키기 위해 50℃로 가열하였다.
결과
EtOH에 현탁시키고 NeowaterTM를 첨가한 다음 증발시켜 AG-14A 및 AG-14B를 용해시켰다.
도 82에 도시된 바와 같이, AG-14A 및 AG-14B는 48 시간동안 현탁액 중에 안정하게 유지되었다.
실시예 27
나노구조를 포함하는 담체의 펩티드 용해능
모두 물에 용해되지 않는 것으로 알려지 7 개의 세포독성 펩티드를 나노구조를 포함하는 담체 조성물이 용해시킬 수 있는 지를 확인하기 위해 다음의 실험을 수행하였다. 또한, 나노구조를 포함하는 담체 조성물이 펩티드의 세포독성 활성에 영향을 미치는 지를 확인하기 위해 Skov-3 세포에 대한 펩티드의 효과를 측정하였다.
재료 및 방법
가용화 : 7 개의 펩티드(펩티드 X, X-5FU, NLS-E, PaIm-PFPSYK (CMFU), PFPSYKLRPG-NH2, NLS-p2-LHRH 및 F-LH-RH-palm kGFPSK)를 모두 0.5 mM로 NeowaterTM에 용해시켰다. 분광광도계 측정을 실시하였다.
시험관내 실험: Skov-3 세포를 맥코이(McCoy) 5A 배지에서 성장시키고, 96 웰 플레이트에서 1500 세포/웰의 농도로 희석시켰다. 24 시간후, 최종 농도가 각각 10-6M, 10-7M 및 10-8M이 되도록 2 ㎕(0.5 mM, 0.05 mM 및 0.005 mM)의 펩티드 용액을 1 ㎖의 맥코이 5A 배지에서 희석시켰다. 각각의 처리를 9 회 반복하였다. 각각의 플레이트는 세 농도로 2 개의 펩티드, 및 6 개의 웰 대조군을 함유하였다. 90 ㎕의 맥코이 5A 배지 + 펩티드를 상기 세포들에 첨가하였다. 1 시간후, 10 ㎕의 FBS를 첨가하였다(경쟁을 방지하기 위해). 24 시간후 및 48 시간후에 크리스탈 바이올렛에 기초한 생육성 분석법으로 세포를 정량하였다. 이러한 분석법에서 염료는 DNA를 염색한다. 가용화시, 플레이트 판독기에서 단층이 흡수한 염료의 양을 정량하였다.
결과
NeowaterTM에 희석시킨 7 개의 펩티드에 대한 분광광도계 측정치를 도 83a-g에 도시하였다. 도 84a-g에 도시된 바와 같이, 용해된 펩티드는 모두 세포독성 활성을 포함하였다.
실시예 28
나노구조를 포함하는 액체 조성물의 레티놀 용해능
나노구조를 포함하는 액체 조성물이 레티놀을 용해시킬 수 있는 지를 확인하기 위해 다음의 실험을 수행하였다.
재료 및 방법
레티놀(비타민 A)을 시그마(Sigma)(Fluka, 99% HPLC)로부터 구입하였다. 레티놀을 다음의 조건하에서 NeowaterTM에 용해시켰다.
EtOH 및 NeowaterTM 중 1% 레티놀(1 ㎖ 중 0.01 g)
EtOH 및 NeowaterTM 중 0.5% 레티놀(1 ㎖ 중 0.005 g)
EtOH 및 NeowaterTM 중 0.5% 레티놀(25 ㎖ 중 0.125 g)
EtOH 및 NeowaterTM 중 0.25% 레티놀(25 ㎖ 중 0.0625 g). 최종 EtOH 농도: 1.5%
EtOH 에서의 레티놀의 흡광 스펙트럼: 표준화 그래프(calibration graph)를 작성하기 위해 상이한 레티놀 농도를 가진 레티놀 용액을 무수 EtOH에서 제조하고; 분광광도계에서 흡광 스펙트럼을 검출하였다.
미지 농도의 EtOH를 함유하는 NeowaterTM 중 0.25% 및 0.5% 레티놀로 이루어진 2 개의 용액을 분광광도계에서 검출하였다. 일부 오일 방울이 물에 용해되지 않았기 때문에 레티놀의 실제 농도도 역시 미지였다.
여과: 최종 EtOH 농도 1.5%로 NeowaterTM 중 0.25 % 레티놀의 용액 2개를 제조하였다. 이 용액을 0.44 및 0.2 ㎕ 필터에서 여과하였다.
결과
레티놀은 산성 NeowaterTM에서 보다 알칼리성 NeowaterTM에서 쉽게 용해하였다. 용액의 색은 황색이었으며 시간이 경과함에 따라 흐려졌다. 흡광도 실험에서, 0.5% 레티놀은 0.125% 레티놀과 유사한 패턴을 보였고, 0.25% 레티놀은 0.03125% 레티놀과 유사한 패턴을 보였다 - 도 85 참조. 레티놀은 열에 불안정하기 때문에; (레티놀의 융점은 63℃임), 가열멸균처리될(autoclave) 수 없다. 레티놀이 (EtOH에) 완전히 용해된 경우에 여과가 가능하였다. 도 86에 도시된 바와 같이, 여과된 이후에는 용액 중에 0.03125% 미만의 레티놀이 존재하였다. 두 필터 모두 유사한 결과가 수득되었다.
실시예 29
나노구조를 포함하는 액체 조성물의 물질 X 용해능
나노구조를 포함하는 액체 조성물이 물질 X를 최종 농도 40 ㎎/㎖로 용해시킬 수 있는 지를 확인하기 위해 다음의 실험을 수행하였다.
제 1 부 - 물 및 DMSO 중의 용해도
재료 및 방법
첫 번째 시험관에서는, 25 ㎕의 NeowaterTM가 1 ㎎의 물질 "X"에 첨가되었다. 두 번째 시험관에서는, 25 ㎕의 DMSO가 1 ㎎의 물질 "X"에 첨가되었다. 두 시험관 모두 와류시키고 60℃로 가열한 다음 진탕기에서 1 시간동안 진탕하였다.
결과
물질은 NeowaterTM에 전혀 용해되지 않았다(시험관 1). 물질은 DMSO에 용해되어 황갈색이 수득되었다. 용액은 24-48 시간동안 유지되었고 그의 안정성을 경시적으로 분석하였다(도 87a-b).
결론
NeowaterTM가 물질 "X"를 용해시키지 못해 물질이 침전된 반면, DMSO는 물질 "X"를 거의 완전히 용해시켰다.
제 2 부 - 시간 경과에 따른 상이한 용매내 물질 안정성/동역학의 조사 및 DMSO의 감소
재료 및 방법
각각 총 반응 부피 25 ㎕를 함유하는 6 개의 상이한 시험관을 분석하였다:
1. 1 ㎎ "X" + 25 ㎕ NeowaterTM (100%).
2. 1 ㎎ "X" + 12.5 ㎕ DMSO ――――→ 12.5 ㎕ NeowaterTM (50%).
3. 1 ㎎ "X" + 12.5 ㎕ DMSO + 12.5 ㎕ NeowaterTM (50%).
4. 1 ㎎ "X" + 6.25 ㎕ DMSO + 18.75 ㎕ NeowaterTM (25%).
5. 1 ㎎ "X" + 25 ㎕ NeowaterTM+ 수크로오스* (10%).
6. 1 ㎎ + 12.5 ㎕ DMSO + 12.5 ㎕ 탈수 NeowaterTM ** (50%).
* O.1 g 수크로오스 + 1 ㎖ (NeowaterTM) = 10% NeowaterTM + 수크로오스
** 탈수 NeowaterTM는 NeowaterTM를 60℃에서 90 분동안 탈수하여 제조하였다.
시험관 모두를 와류시키고 60℃로 가열한 다음 1 시간동안 진탕하였다.
결과
0 시간에서 6 개의 용매 및 물질 X를 포함하는 시험관을 도 88a-c에 도시하였다. 가용화하고 60 분후에 6 개의 용매 및 물질 X를 포함하는 시험관을 도 89a-c에 도시하였다. 가용화하고 120 분후에 6 개의 용매 및 물질 X를 포함하는 시험관을 도 90a-c에 도시하였다. 가용화하고 24 시간후에 6 개의 용매 및 물질 X를 포함하는 시험관을 도 91a-c에 도시하였다.
결론
모든 시험관에서 물질이 24 시간후에 침전되었기 때문에, 물질 "X"는 시간이 경과하는 내내 안정하게 유지되지 않았다.
동일한 비율의 용매를 함유하였더라도, 2번 시험관과 6번 시험관의 용매는 차이가 있다. 이는 6번 시험관이 탈수되지 않은 NeowaterTM 보다 더욱 친수성인 탈수된 NeowaterTM를 함유하고 있기 때문이다.
제 3 부 - 추가의 시간 경과에 따른 상이한 용매내 물질 안정성/동역학의 조사 및 DMSO 의 감소
재료 및 방법
1 ㎎ 물질 "X" + 50 ㎕ DMSO를 유리 시험관에 배치하였다. 50 ㎕ NeowaterTM를 시험관내로 적정한 다음(2-3(few) 초당 5 ㎕씩), 500 ㎕의 NeowaterTM 용액(9% DMSO + 91% NeowaterTM)을 첨가하였다.
두 번째 유리 시험관에는, 1 ㎎의 물질 "X" + 50 ㎕의 DMSO를 첨가하였다. 50 ㎕의 RO를 시험관내로 적정한 다음(2-3(few) 초당 5 ㎕씩), 500 ㎕의 RO 용액(9% DMSO + 91% RO)을 첨가하였다.
결과
도 92a-d에 도시된 바와 같이, 물질 "X"는 NeowaterTM를 포함하는 용액에 분산된 채로 유지되었지만, RO 물을 포함하는 용액에서는 시험관 바닥에 침전되었다. 도 33은 와류시키고 6 시간후 RO/NeowaterTM 및 아세톤에 분산된 물질의 흡수 특징을 도시한 것이다.
결론
물질 "X"는 NeowaterTM와 비교하여 RO에서 다르게 용해하였고 RO에 비해 NeowaterTM에서 더욱 안정하다는 것이 명백하다. 분광광도계 측정치(도 93)로부터, 그래프 아래의 면적이 RO에서보다 넓기 때문에 물질 "X"는 5 시간후에도 NeowaterTM에 더 잘 용해되었음이 명백하다. NeowaterTM가 물질 "X"를 수화시킨다는 것이 명백하다. DMSO의 양은 20-80% 까지 감소될 수 있고, 물질 "X"를 수화시키고 이것을 NeowaterTM 중에 분산시킨 NeowaterTM에 기초한 용액이 제조될 수 있다.
실시예 30
나노구조를 포함하는 액체 조성물의 SPL 2101 및 SPL 5217 용해능
나노구조를 포함하는 액체 조성물이 물질 SPL 2101 및 SPL 5217를 최종 농도 30 ㎎/㎖로 용해시킬 수 있는 지를 확인 하기 위해 다음의 실험을 수행하였다.
재료 및 방법
SPL 2101을 그의 최적 용매(에탄올)에 용해시켰고(도 94a), SPL 5217을 그의 최적 용매(아세톤)에 용해시켰다(도 94b). 두 화합물을 유리 바이얼에 넣고 어둡고 차가운 환경에 유지하였다. 데시케이터에서 용매의 증발을 수행한 다음, 미량이라도 용매들이 존재하지 않을 때까지 오랜 시간에 걸쳐 NeowaterTM를 상기 용액에 첨가하였다.
결과
도 95a-b에 분광광도계 데이터에 의해 도시된 바와 같이 SPL 2101 및 SPL 5217은 NeowaterTM에 용해하였다.
실시예 31
나노구조를 포함하는 액체 조성물의 탁솔 용해능
나노구조를 포함하는 담체 조성물이 물질 탁솔(파클리탁셀, Paclitaxel)을 최종 농도 0.5 mM으로 용해시킬 수 있는 지를 확인하기 위해 다음의 실험을 수행하였다.
재료 및 방법
가용화 : 17% EtOH를 함유하는 NeowaterTM 또는 DMSO 중에서 0.5 mM의 탁솔 용액을 제조하였다(4 ㎖ 중 0.0017 g). 분광광도계를 사용하여 흡광도를 검출하였다.
세포 생육성 분석: 150,000 개의 293T 세포를 3 ㎖의 DMEM 배지를 함유하는 6 웰 플레이트에 시딩하였다(seed). 각각의 처리군을 RO 또는 NeowaterTM에 기초한 DMEM 배지에서 성장시켰다. 최종 농도가 1.666 μM이 되도록 탁솔(NeowaterTM 또는 DMSO에 용해시킴)을 첨가하였다(3 ㎖의 배지 중 0.5 mM 탁솔 10 ㎕). 탁솔로 처리하고 24 시간후에 세포를 수확하고 사멸된 세포를 검출하기 위해 트립판 블루 용액을 사용하여 계수하였다.
결과
도 96a-b에 도시된 바와 같이 탁솔은 DMSO 및 NeowaterTM 둘 다에 용해되었다. 다양한 탁솔 용액에 대한 293T 세포의 생육성을 도 97에 도시하였다.
결론
NeowaterTM 중의 용액으로 된 후 탁솔은 세포독성 효과를 포함하였다.
실시예 32
나노구조를 포함하는 액체 조성물의 안정화 효과
나노구조를 포함하는 액체 조성물이 단백질의 안정성에 영향을 미치는 지를 확인하기 위해 다음의 실험을 수행하였다.
재료 및 방법
두 가지의 상업용 Taq 중합효소(Peq-lab 및 Bio-lab)를 PCR 반응에 제공하여 ddH2O(RO) 및 나노구조를 포함하는 담체[NeowaterTM, 이스라엘 소재 두-쿱 테크놀로지스(Do-Coop technologies)]에서의 그의 활성을 측정하였다. 효소를 다른 시간동안(1 시간에서 2.5 시간까지) 95℃로 가열하였다. 다음과 같은 2 가지 형태의 반응을 수행하였다:
물 단독 - 효소와 물만 비등시켰다.
내부성분 모두 - 반응 성분 모두를 비등시켰다: 효소, 물, 완충액, dNTP, 게놈 DNA 및 프라이머.
비등시킨 후, 필요한 임의의 추가의 반응 성분을 PCR 관에 첨가하고 통상의 PCR 프로그램을 30 사이클로 셋팅하였다.
결과
도 98a-b에 도시된 바와 같이, 나노구조를 포함하는 담체 조성물은 모든 성분이 열 응력에 가해진 조건하 및 효소만 열 응력에 가해진 조건하 모두에서 열로부터 효소를 보호하였다. 반대로, RO 물은 모든 성분이 열 응력에 가해진 조건하에서만 열로부터 효소를 보호하였다.
실시예 33
나노구조를 포함하는 담체의 안정화 효과에 대한 추가의 설명
나노구조를 포함하는 담체 조성물이 두 가지의 상업용 Taq 중합효소(Peq-lab 및 Bio-lab)의 안정화에 영향을 미치는 지를 확인하기 위해 다음의 실험을 수행하였다.
재료 및 방법
PCR 반응은 다음과 같이 구성하였다:
Peq - lab 시료
나노구조를 포함하는 담체 조성물[NeowaterTM, 이스라엘 소재 두-쿱 테크놀로지스(Do-Coop technologies)] 또는 증류수[역삼투(Reverse Osmosis) = RO) 20.4 ㎕
0.1 ㎕ Taq 중합효소(Peq-lab, Taq DNA 중합효소, 5 U/㎕).
세 개의 시료를 구성하여 95℃의 일정한 온도에서 PCR 장치에 배치하였다. 인큐베이션 시간은 60, 75 및 90 분이었다.
Taq 효소를 비등시킨 후, 다음의 성분을 첨가하였다:
2.5 ㎕ 1OX 반응 완충액 Y (Peq-lab)
0.5 ㎕ dNTP 1O mM (Bio-lab)
1 ㎕ 프라이머 GAPDH 혼합물 10 pmol/㎕
0.5 ㎕ 게놈 DNA 35 ㎍/㎕
Bio - lab 시료
나노구조를 포함하는 담체[NeowaterTM, 이스라엘 소재 두-쿱 테크놀로지스(Do-Coop technologies)] 또는 증류수[역삼투(Reverse Osmosis) = RO) 18.9 ㎕.
0.1 ㎕ Taq 중합효소(Bio-lab, Taq 중합효소, 5 U/㎕)
5 개의 시료를 구성하고 95℃의 일정한 온도에서 PCR 장치에 배치하였다. 인큐베이션 시간은 60, 75, 90, 120 및 150 분이었다.
Taq 효소를 비등시킨 후, 다음의 성분을 첨가하였다:
2.5 ㎕ TAQ 1OX 완충액 Mg-무함유 (Bio-lab)
1.5 ㎕ MgCl2 25 mM (Bio-lab)
0.5 ㎕ dNTP 1O mM (Bio-lab)
1 ㎕ 프라이머 GAPDH 혼합물 (10 pmol/㎕)
0.5 ㎕ 게놈 DNA (35 ㎍/㎕)
각각의 처리군(Neowater 또는 RO)에 대하여, 양성 및 음성 대조군을 제조하였다. 양성 대조군은 효소를 비등시키지 않은 것이었다. 음성 대조군은 효소를 비등시키지 않고 반응에 DNA를 함유시키지 않은 것이었다. 비등 taq 분석뿐만 아니라 대조군 반응에 대하여 PCR 혼합물을 제조하였다.
시료를 PCR 장치에 배치하고 다음과 같이 가동시켰다:
PCR 프로그램:
1. 94℃ 2 분 변성
2. 94℃ 30 초 변성
3. 60℃ 30 초 어닐링(annealing)
4. 72℃ 30 초 연장(elongation)
단계 2-4를 30회 반복
5. 72℃ 10 분 연장
결과
도 99에 도시된 바와 같이, 나노구조를 포함하는 액체 조성물은 효소 둘 다를 열 응력으로부터 최대 1.5 시간동안 보호하였다.
실시예 34
액체 조성물 및 나노구조 중의 가열 탈수 동시다중 PCR 혼합물
액체 조성물 및 나노구조가 다중 PCR 시스템에 사용될 수 있는 지를 확인하기 위해 다음의 실험을 수행하였다.
재료 및 방법
다음의 성분도 포함하는 표준 PCR 혼합물을 제조하였다(KCl 완충액, dNTP, Taq, BPB):
첨가제(최종 농도): 수크로오스(15O mM, 20O mM)
Taq 효소: Bio-lab
인간 인슐린 유전자에 대한 프라이머(내부 대조군)
인간 게놈 DNA(내부 대조군)
물이 증발할 때까지(RO/NW 기초) 시료를 오븐에서 가열-탈수시켰다.
(A) DDW(RO/NW) 단독 및 (B) PBFDV DNA 분절의 EGD-프라이머 혼합물, RO 및 NW 기초 (동시다중)를 사용하여 재탈수하였다.
결과
도 100에서 알 수 있는 바와 같이, 반응의 충실도를 유지하면서 전체 PCR 혼합물을 가열 탈수하고 이것을 NeowaterTM 또는 RO 물을 사용하여 재탈수시키는 것이 가능하다. 더욱이, 가열 탈수 PCR 혼합물의 동시다중능은 NeowaterTM 재탈수 혼합물을 사용하여 관찰될 수 있다. 주요 표적 유전자(PBFDV 분절)는 인간 게놈 인슐린 유전자 및 그의 증폭 프라이머 세트를 증폭시키지 않으면서 성공적으로 증폭될 수 있음을 알 수 있다. 따라서, 이러한 방법은 하나의 시료 기초위에서 PCR 반응이 정확하게 수행되었음을 보증하는 특성인 다목적 PCR 반응에 대한 내부 표준으로 사용될 수 있다(위음성 결과를 제거함).
실시예 35
Neowater TM 에서 극미량 PCR
액체 조성물 및 나노구조가 작은 부피의 PCR 반응에서 사용될 수 있는 지를 확인하기 위해 다음의 실험을 수행하였다.
재료 및 방법
최종 부피 2 ul에서 MVP를 수행하였다. 표적 DNA는 플라스미드였고; PDX 유전자를 포함하였다. 혼합물을 제조하고, 2 ul의 완전 혼합물(DNA, 프라이머 및 NeowaterTM 모두를 함유함)을 시험관에 분취하고 PCR을 수행하였다.
결과
도 101로부터 알 수 있는 바와 같이, 모든 반응을 정확하게 수행하여 극미량반응(microreaction) 부피의 PCR에 참여하는 NeowaterTM의 능력을 입증하였다.
실시예 36
Neowater TM 를 이용한 QPCR
액체 조성물 및 나노구조가 QPCR 반응(정량적 PCR)에 사용될 수 있는 지를 확인하기 위해 다음의 실험을 수행하였다.
재료 및 방법
몇몇 DNA 표적(플라스미드 및 게놈) 및 유전자 표적(베타 액틴, PDX, PCT 등)에 대하여 Syber Green을 사용하여 QPCR을 수행하였다.
결과
도 102a-c에서 알 수 있는 바와 같이, NeowaterTM를 이용한 베타 액틴의 QPCR은 숙달되어 있어 프라이머-다이머 형성 없이도 기하급수적인 방식의 증폭을 이용한다(효능 103%, 급격한 기울기). 도 103a-c에서 볼 수 있는 바와 같이, NeowaterTM를 이용한 PDX 플라스미드의 QPCR은 숙달되어 있어 프라이머-다이머 형성없이도 기하급수적인 방식의 증폭을 이용한다(효능 101%, 급격한 기울기).
실시예 37
수산화인회석을 이용한 Neowater TM 의 생성
1-5 표지된 5 개의 상이한 수산화인회석(HA) 분말을 사용하여 다음과 같이 NeowaterTM을 생성하였다.
비정상점(anomaly point) 이하(즉 4℃ 이하)로 유지된 RO 물에 15 와트의 전력으로 915 MHz에서 Rf 시그널을 조사하였다. RF 조사하고 10 분후, 약 900℃로 가열한 서브미크론 크기의 수산화인회석 분말을 로(furnace)에서 물로 떨어뜨렸다. RF 조사를 추가의 5 분동안 계속한 다음, 물을 실온에 2 일동안 두었다. 대부분의 소스 분말(더 큰 입자/응집체를 함유함)이 바닥에 가라앉아 물의 투명한 부분을 분리하였다.
소스 분말은 4 KV에서 작동시킨 고분해능 주사형 전자현미경(high resolution scanning electron microscope)(HRSEM, Ziess, Leo 982)에 의해 특징화되었다. 카본 접착 테이프 위에 분말을 도포하여 시료를 제조하였다.
생성된 Neowater도 특징화하였다. 먼저, Neowater QC 시험을 수행하였고, 5 개의 용액 모두 양성(positive)임을 알 수 있었다. 그 다음으로, HA-기초 NeowaterTM 및 소스 분말을 200 KV에서 작동하고 Gatan CCD가 구비된 투과형 전자 현미경(transmission electron microscope)(TEM, Tecnai T20, FEI) 및 HRSEM (Leo 982) 둘 다에 의해 특징화하였다. Si 웨이퍼 위에 3 방울의 HA-기초 Neowater를 떨어뜨려 HRSEM용 시료를 준비하였고(우수한 콘트라스트를 가지도록), 구리 400 메쉬 카본 필름 TEM 그리드 위에 한 방울을 떨어뜨려 TEM용 시료를 준비하였다. 기질의 임의의 가능한 분해를 방지하기 위해 모든 시료를 진공 데시케이터에서 건조시켰다.
결과
5 개의 슬러리 모두가 직경 범위 10-100 nm의 분리된 둥근 입자를 함유하는 것으로 밝혀졌다. 도 104-127a-f에 도시된 바와 같이, HA-기초 NeowaterTM가 BaTiO3-기초 NeowaterTM와 매우 유사하다는 것이 전자 현미경법에 의해 드러났다. 도 104는 1-10 범위의 수를 사용하여 NeowaterTM의 품질을 조사하는 QC 시험의 디지털 현미경 사진을 나타낸다. +10인 경우 이는 높은 품질의 NeowaterTM를 의미한다. 도 105a-h는 소스 분말로부터 취한 HRSEM 현미경사진을 나타낸다. 소스 분말이 구형의 큰 응집체를 함유한 반면, 각각의 구형은 약 50 nm 정도의 직경을 가진 더 작은 입자들로부터 형성된다는 것을 알 수 있다. 도 106a-h는 HA-기초 NeowaterTM로부터 촬영한 HRSEM 현미경사진을 나타낸다. NeowaterTM 제조 공정후 남는 것은 대부분 직경 10-100 nm의 분리된 미세한 입자를 함유하고 있음을 알 수 있다. 도 107은 HA-기초 NeowaterTM의 TEM 현미경사진을 나타낸다. 고분해능의 TEM을 사용하면 입자의 형태 및 크기를 보다 쉽게 볼 수 있다.
명확하게 하기 위해 별도의 구체예의 문맥에 기술된 본 발명의 특정의 특성은 또한 하나의 구체예에 함께 제공될 수 있음이 인지될 것이다. 반대로, 요약하여 하나의 구체예의 문맥에 기술된 본 발명의 다양한 특성은 또한 별도로 또는 임의의 적합한 서브컴비네이션으로 제공될 수 있다.
본 발명은 그의 특정 구체예와 함께 기술되었지만 다양한 대안, 수정 및 변형도 본 분야의 기술자에게 자명할 것이라는 것은 명백하다. 따라서, 첨부되는 청구범위의 정신 및 광범위한 범위내에 포함되는 모든 대안, 수정 및 변형도 포함시키고자 한다. 본 명세서에서 언급된 모든 공개 문헌, 특허 및 특허 출원은 이들 각각의 공개 문헌, 특허 및 특허 출원이 구체적이고 개별적으로 이들 본원에서 전체적으로 참고문헌으로서 인용된 것처럼 본 명세서에서 전체적으로 참고문헌으로서 포함된다. 추가로, 본 명세서에서 참고문헌의 인용 또는 확인은 상기 문헌이 본 발명의 선행 기술로서 이용가능하다는 것을 허가하는 것으로 이해되어서는 안 된다.
SEQUENCE LISTING <110> DO-COOP TECHNOLOGIES LTD. <120> SOLID-FLUID COMPOSITION <130> 33244 <160> 8 <170> PatentIn version 3.2 <210> 1 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Single strand DNA oligonucleotide <400> 1 tccaaggagc tgcaggcggc gca 23 <210> 2 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Single strand DNA oligonucleotide <400> 2 tccaaggagc tgcaggcggc gca 23 <210> 3 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Single strand DNA oligonucleotide <400> 3 tccaaggagc tgcaggcggc gca 23 <210> 4 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Single strand DNA oligonucleotide <400> 4 ggcgctcgcg gatggcgctg ag 22 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Single strand DNA oligonucleotide <400> 5 taatacgact cactataggg 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Single strand DNA oligonucleotide <400> 6 ggaaacagct atgaccatga 20 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Single strand DNA oligonucleotide <400> 7 caccagactg actcctcatt 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Single strand DNA oligonucleotide <400> 8 cctgttgctg cacatattcc 20

Claims (60)

  1. 액체, 및 각각 정연한(ordered) 유체 분자의 인벨롭(envelope)에 의하여 둘러싸인 나노미터 크기의 코어 물질을 포함하되 상기 코어 물질 및 상기 정연한 유체 분자의 인벨롭이 정상(steady)의 물리적 상태로 존재하는 나노구조를 포함하며, 물에 비해 향상된 초음파 속도를 특징으로 하는 액체 조성물.
  2. 액체, 및 각각 정연한 유체 분자의 인벨롭에 의하여 둘러싸인 나노미터 크기의 코어 물질을 포함하되 상기 코어 물질 및 상기 정연한 유체 분자의 인벨롭이 정상의 물리적 상태로 존재하며 수산화인회석으로부터 제조되는 나노구조를 포함하는 액체 조성물.
  3. 액체, 및 각각 정연한 유체 분자의 인벨롭에 의하여 둘러싸인 나노미터 크기의 코어 물질을 포함하되 상기 코어 물질 및 상기 정연한 유체 분자의 인벨롭이 정상의 물리적 상태로 존재하는 나노구조를 포함하며, 물에 비해 향상된 물질 용해능 또는 물질 분산능을 특징으로 하는 액체 조성물.
  4. 액체, 및 각각 정연한 유체 분자의 인벨롭에 의하여 둘러싸인 나노미터 크기의 코어 물질을 포함하되 상기 코어 물질 및 상기 정연한 유체 분자의 인벨롭이 정상의 물리적 상태로 존재하는 나노구조를 포함하며, 물에 비해 향상된 완충능을 특 징으로 하는 액체 조성물.
  5. 물질을 상기 물질의 분산 또는 용해를 가능하도록 하는 조건하에서, 액체, 및 상기 액체의 정연한 유체 분자의 인벨롭에 의하여 둘러싸인 나노미터 크기의 코어 물질을 포함하되 상기 코어 물질 및 상기 정연한 유체 분자의 인벨롭은 정상의 물리적 상태로 존재하는 나노구조와 접촉시키는 단계를 포함하여, 물질을 용해시키거나 분산시키는 방법.
  6. 제 5 항에 있어서, 상기 물질이 단백질, 핵산, 소분자 및 탄수화물로 구성된 그룹 중에서 선택되는 방법.
  7. 제 3 항 또는 제 5 항에 있어서, 상기 물질이 약제학적 제제인 액체 조성물 또는 방법.
  8. 제 7 항에 있어서, 상기 약제학적 제제가 치료용 제제, 화장용 제제 또는 진단용 제제인 액체 조성물 또는 방법.
  9. 제 1 항, 제 3 항, 제 4 항 또는 제 5 항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 유체 분자의 적어도 일부가 상기 액체의 분자와 동일한 조성물 또는 방법.
  10. 제 1 항, 제 3 항, 제 4 항 또는 제 5 항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 유체 분자의 적어도 일부가 기체 상태로 존재하는 조성물 또는 방법.
  11. 제 1 항, 제 3 항, 제 4 항 또는 제 5 항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 나노구조의 농도가 리터당 1020 나노구조 이하인 조성물 또는 방법.
  12. 제 1 항, 제 3 항, 제 4 항 또는 제 5 항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 나노구조가 상기 나노구조의 클러스터(cluster)를 형성할 수 있는 조성물 또는 방법.
  13. 제 1 항, 제 3 항, 제 4 항 또는 제 5 항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 나노구조가 그들 사이에 원거리 상호작용(long range interaction)을 유지할 수 있는 조성물 또는 방법.
  14. 제 1 항, 제 3 항, 제 4 항 또는 제 5 항 중 어느 하나의 항에 있어서, 각각의 상기 나노구조가 상기 액체의 비중과 같거나 작은 비중을 갖는 조성물 또는 방법.
  15. 제 1 항, 제 3 항 또는 제 5 항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 조성물이 물의 완충능 보다 큰 완충능을 포함하는 조성물 또는 방법.
  16. 제 1 항, 제 4 항 또는 제 5 항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 조성물이 물에 비해 향상된 제제 용해능 또는 제제 분산능을 포함하는 조성물 또는 방법.
  17. 제 5 항에 있어서, 상기 접촉시키는 단계 이전에 상기 제제를 용매에 용해시키거나 분산시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  18. 제 5 항에 있어서, 상기 접촉시키는 단계 이후에 상기 제제를 용매에 용해시키거나 분산시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  19. 제 17 항 또는 제 18 항에 있어서, 상기 용매가 극성 용매인 방법.
  20. 제 17 항 또는 제 18 항에 있어서, 상기 용매가 비극성 용매인 방법.
  21. 제 17 항 또는 제 18 항에 있어서, 상기 용매가 유기 용매인 방법.
  22. 제 21 항에 있어서, 상기 유기 용매가 에탄올 또는 아세톤인 방법.
  23. 제 17 항 또는 제 18 항에 있어서, 상기 용매가 비유기 용매인 방법.
  24. 제 17 항에 있어서, 상기 용해시키거나 분산시키는 단계 이후에 상기 용매를 증발시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  25. 제 24 항에 있어서, 상기 증발시키는 단계가 열 또는 압력에 의해 수행되는 방법.
  26. 액체, 및 각각 정연한 유체 분자의 인벨롭에 의하여 둘러싸인 나노미터 크기의 코어 물질을 포함하되 상기 코어 물질 및 상기 정연한 유체 분자의 인벨롭이 정상의 물리적 상태로 존재하는 나노구조를 포함하며, 실시간 중합효소 연쇄 반응의 효율을 향상시킬 수 있는 액체 조성물.
  27. 제 26 항에 있어서, 상기 실시간 중합효소 연쇄 반응의 DNA 중합효소의 촉매 활성을 향상시킬 수 있는 조성물.
  28. 제 26 항에 있어서, 상기 실시간 중합효소 연쇄 반응이 마그네슘을 함유하지 않는 조성물.
  29. 제 26 항에 있어서, 상기 유체 분자의 적어도 일부가 상기 액체의 분자와 동일한 조성물.
  30. 제 26 항에 있어서, 상기 유체 분자의 적어도 일부가 기체 상태로 존재하는 조성물.
  31. 제 26 항에 있어서, 상기 나노구조의 농도가 리터당 1020 나노구조 이하인 조성물.
  32. 제 26 항에 있어서, 상기 나노구조가 상기 나노구조의 클러스터를 형성할 수 있는 조성물.
  33. 제 26 항에 있어서, 상기 나노구조가 그들 사이에서 원거리 상호작용을 유지할 수 있는 조성물.
  34. 제 26 항에 있어서, 상기 나노구조가 물의 완충능 보다 큰 완충능을 포함하는 조성물.
  35. 제 26 항에 있어서, 상기 나노구조가 물에 비해 향상된 제제 용해능 또는 제제 분산능을 포함하는 조성물.
  36. (a) 열안정성 DNA 중합효소; (b) 이중가닥 DNA 검출 분자; 및 (c) 액체, 및 각각 정연한 유체 분자의 인벨롭에 의하여 둘러싸인 나노미터 크기의 코어 물질을 포함하되 상기 코어 물질 및 상기 정연한 유체 분자의 인벨롭이 정상의 물리적 상태로 존재하는 나노구조를 갖는 액체 조성물을 포함하는 실시간 중합효소 연쇄반응용 키트.
  37. 제 36 항에 있어서, 적어도 하나의 dNTP를 추가로 포함하는 키트.
  38. 제 36 항에 있어서, 적어도 하나의 대조군 주형(control template) DNA를 추가로 포함하는 키트.
  39. 제 36 항에 있어서, 적어도 하나의 대조군 프라이머(control primer)를 추가로 포함하는 키트.
  40. 제 36 항에 있어서, 상기 이중가닥 DNA 검출 분자가 이중가닥 DNA 삽입(intercalating) 검출 분자인 키트.
  41. 제 40 항에 있어서, 상기 이중가닥 DNA 삽입 검출 분자가 브롬화 에티듐, YO-PRO-1, Hoechst 33258, SYBR Gold 및 SYBR Green I로 구성된 그룹 중에서 선택되는 키트.
  42. 제 40 항에 있어서, 상기 이중가닥 DNA 검출 분자가 프라이머-기초(primer-based) 이중가닥 DNA 검출 분자인 키트.
  43. 제 42 항에 있어서, 상기 프라이머-기초 이중가닥 DNA 검출 분자가 플루오레세인(fluorescein), FAM, JOE, HEX, TET, Alexa Fluor 594, ROX, TAMRA, 로다만(rhodamine) 및 BODIPY-FI로 구성된 그룹 중에서 선택되는 키트.
  44. 제 36 항에 있어서, 상기 유체 분자의 적어도 일부가 상기 액체의 분자와 동일한 키트.
  45. 제 36 항에 있어서, 상기 유체 분자의 적어도 일부가 기체 상태로 존재하는 키트.
  46. 제 36 항에 있어서, 상기 나노구조의 농도가 리터당 1020 나노구조 이하인 키트.
  47. 제 36 항에 있어서, 상기 나노구조가 상기 나노구조의 클러스터를 형성할 수 있는 키트.
  48. 제 36 항에 있어서, 상기 나노구조가 그들 사이에서 원거리 상호작용을 유지할 수 있는 키트.
  49. 제 36 항에 있어서, 상기 나노구조가 물의 완충능 보다 큰 완충능을 포함하는 키트.
  50. 제 36 항에 있어서, 상기 나노구조가 물에 비해 향상된 제제 용해능 또는 제제 분산능을 포함하는 키트.
  51. 제 1 항, 제 3 항, 제 4 항, 제 5 항, 제 26 항 또는 제 36 항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 나노구조가 수산화인회석으로부터 제조되는 조성물, 방법 또는 키트.
  52. (a) 액체에 액체보다 최소 500도 더 따뜻한 수산화인회석을 침지하는 단계; 및 (b) 상기 수산화인회석의 입자로부터 나노구조가 형성되도록 선택된 주파수를 특징으로 하는 전자기 조사선을 상기 액체 및 상기 수산화인회석에 조사하는 단계를 포함하여, 액체 조성물을 생성하는 방법.
  53. 제 52 항에 있어서, 상기 수산화인회석이 마이크로 크기의 입자를 포함하는 방법.
  54. 제 52 항에 있어서, 상기 마이크로 크기의 입자가 결정성 입자인 방법.
  55. 제 52 항에 있어서, 상기 나노구조가 결정성 나노구조인 방법.
  56. 제 52 항에 있어서, 상기 액체가 물인 방법.
  57. 제 52 항에 있어서, 상기 전자기 조사선이 라디오 주파수 영역에 있는 방법.
  58. 제 57 항에 있어서, 상기 전자기 조사선이 연속파 전자기 조사선인 방법.
  59. 제 57 항에 있어서, 상기 전자기 조사선이 변조된 전자기 조사선인 방법.
  60. 제 57 항에 있어서, 상기 침지 단계 및 상기 조사 단계가 동시에 수행되는 방법.
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