DE102007057388A1

DE102007057388A1 - Vorrichtung und Verfahren zum Messen der Aktivität von Enzymen nach Inhibitorentzug

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Publication number: DE102007057388A1
Application number: DE102007057388A
Authority: DE
Inventors: Hans Jörg Dr. Meier
Original assignee: Papst Licensing GmbH and Co KG
Current assignee: Papst Licensing GmbH and Co KG
Priority date: 2007-04-14
Filing date: 2007-11-27
Publication date: 2009-05-28
Also published as: DE102007017681A1

Abstract

Zur Aktivitätsmessung von Enzymen mittels Inhibitorentzug haben sich fluorogene Substrate als vorteilhaft erwiesen, in denen 7-Amino-4-methylcumarin als Fluorogen an den C-Terminus eines Oligopeptids, vorwiegend eines Dipeptids, gebunden ist, dessen N-Terminus mit der Carboxybenzoyl-Schutzgruppe geschützt ist. Dabei ist jedoch die Eindeutigkeit und damit die Genauigkeit des Messergebnisses noch für manche Aufgaben unbefriedigend. Durch Verwendung von 7-Amino-4-trifluormethylcumarin als C-Terminus anstelle von 7-Amino-4-methyl-cumarin wird jedoch das Emissionsspektrum des abgespalteten Fluorogens nun weiter in den langwelligen Bereich verschoben, sodass die Fluoreszenz des abgespalteten Fluorogens in einem Wellenlängenbereich beobachtet werden kann, in dem andere Lumineszenzen aus der zu untersuchenden Lösung das Messergebnis nicht mehr stören, was zur Folge hat, dass man zu höheren Empfindlichkeiten bei der Messung der Aktivität solcher Enzyme vorstoßen kann, insbesondere bei gattungsgemäßen Vorrichtungen und Verfahren.

Description

Es ist eine derartige Vorrichtung und ein Verfahren aus der WO 97/00969 bekannt.
Ferner betrifft die deutsche Patentanmeldung 10 2007 017 681.5 eine ähnliche Erfindung, zu welcher ein Zusatzverhältnis beansprucht und ausdrücklich auf die gesamte Offenbarung dieser Stammanmeldung Bezug genommen wird.
Aus diesem Stand der Technik ist die Enzymaktivität solcher Enzyme bekannt, die in der Probe durch Inhibitoren vorwiegend inhibiert sind, dadurch zu messen, dass die Messprobe zuvor über eine Durchfluss- oder Durchlaufsäule gegeben wird, auf welcher der Probe die Inhibitoren entzogen werden, die das Enzym inhibieren. Danach wird das inhibitorfreie Enzym in eine Messzelle gegeben, in der nach Zugabe eines geeigneten Substrats die Aktivität des Enzyms gemessen wird, z. B. durch den Anstieg der Konzentration mindestens eines Spaltprodukts dieses Substrats über der Zeit.
Zur Aktivitätsmessung von Enzymen mittels Inhibitorentzug haben sich fluorogene Substrate als vorteilhaft erwiesen, in denen 7-Amino-4-methylcumarin als Fluorogen an den C-Terminus eines Oligopeptids, vorwiegend eines Dipeptids gebunden ist, dessen N-Terminus mit der Carboxybenzoyl-Schutzgruppe geschützt ist.
Dabei ist jedoch die Eindeutigkeit und damit die Genauigkeit des Messergebnisses noch für manche Aufgaben unbefriedigend. Durch Verwendung von 7-Amino-4-trifluormethylcumarin als C-Terminus anstelle von 7-Amino-4-methyl-cumarin wird jedoch das Emissionsspektrum des abgespalteten Fluorogens nun weiter in den langwelligen Bereich verschoben, sodass die Fluoreszenz des abgespaltenen Fluorogens in einem Wellenlängenbereich beobachtet werden kann, in dem andere Lumineszenzen aus der zu untersuchenden Lösung das Messergebnis nicht mehr stören, was zur Folge hat, dass man zu höheren Empfindlichkeiten bei der Messung der Aktivität solcher Enzyme vorstoßen kann, insbesondere bei gattungsgemäßen Vorrichtungen und Verfahren.
Darüber hinaus lässt sich durch den Einsatz des Bypasses aus zwei Aktivitätsmessungen, nämlich aus der Aktivitätsmessung der Probe nach der Passage durch die Säule und aus der Aktivitätsmessung der Probe nach Passage der Probe durch den Bypass neben der Gesamtaktivität des Enzym in der Probe auch die Konzentration des Inhibitors bestimmen.
Es ist Aufgabe der vorliegenden Anmeldung, eine Vorrichtung und eine Methode zu finden, die eine erhebliche Genauigkeitssteigerung und größere Zuverlässigkeit der Messungen ergibt, wodurch auch u. U. Operationen durch Punktierungen ersetzbar sind, und an die Konsistenz und Menge der Messprobe geringere Anforderungen gestellt werden müssen (können?).
Die Lösung dieser Aufgabe geschieht mit den Mitteln des Anspruchs 1 oder 2 oder 3. Weiterbildungen dienen Maßnahmen, die in den Unteransprüchen definiert sind.
Die 1 zeigt ein erstes einfaches Ausführungsbeispiel der Erfindung.
Dabei ist eine austauschbare Affinitäts-Chromatographiesäule 1 von einem Thermostaten 2 umgeben, der mindestens ein Peltierelement aufweist. Die Säule 1 besteht im wesentlichen aus einem räumlichen Zylinder, der mit poröser Substanz, einem Träger, ausgefüttert ist, an den eine Substanz gebunden ist, die den Inhibitor des Enzym-Inhibitor-Komplexes stärker bindet als es das Enzym tut, wodurch das Enzym zur Aktivitätsmessung freigesetzt wird. In die obere Öffnung 3 der Säule 1, an deren unterem Ende zweckmäßigerweise ein Sperrventil 6 angebracht ist, ragt die Spitze 8 einer austauschbaren Spritze 4, welche in einem Raum 5 die Messprobe mit dem Enzym-Inhibitor-Komplex enthält.
Das Volumen 5 wird mit ausgedrückter Spritze 4 faktisch zu Null, und der Inhalt entleert sich in die Säule 1, in der sich vorzugsweise ein fest gepackter Träger befindet.
Ein Elutionspuffer vom ca. 100–10³ fachen Volumen der Messprobe wird danach mittels einer zweiten Spritze 7 ganz oder teilweise in die Säule 1 eingebracht.
Eine erste Vorgehensweise ist folgende: Man belässt die Messprobe mit einem Teil des Elutionspuffers in der Säule 1 bei wohldefinierter Temperatur (z. B. ca. 4°C) für eine bestimmte Inkubationszeit, in der Praxis ca. 10–18 min. Insbesondere 15 min. dürften optimal sein. Danach wird durch weitere Zugabe von Elutionspuffer mit Hilfe der Spritze 7 das freie Enzym eluiert und die Elutionslösung fließt bei offenem Sperrventil 6 nach unten in Modul B gemäß 1.
Bei der ersten Methode ist das Ventil 6 zunächst offen, bis der Säulenpuffer in die Säule 1 teilweise eingelaufen ist bzw. bis die Messprobe auf der Säulenlänge verteilt ist. Solange kann auch ein Volumen, das zur Messung verworfen wird, abfließen (z. B. wie in 2 beschrieben über den Kanal 28). Nach der Inkubationszeit wird zur Elution dieses Ventil 6 geöffnet, dann jedoch wieder geschlossen, damit ein Restvolumen nicht die Messung verschlechtert. Auch dieses Restvolumen kann über den Kanal 28 entsorgt werden.
Eine zweite alternative Maßnahme besteht darin, dass die Messprobe mit Hilfe des zugegebenen Säulenpuffers von oben nach unten durch die Säule wandert mit einer Geschwindigkeit die gewährleistet, dass auf diesem Weg der Inhibitor von allen in der Messprobe enthaltenen Enzym-Inhibitorkomplexen auf die auf der Säule immobilisierte Substanz übergeht, die den Inhibitor stärker bindet als es das Enzym tut. Das ist quasi eine Wanderungsinkubation. Dadurch wird das freie Enzym eluiert und die Elutionslösung fließt nach unten in das Modul B gemäß 1.
Auch hier wird ein Verwertungsvolumen anfangs (wie in 2 mittels Kanal 28 beschrieben) entsorgt; ebenso geschieht dies nach dem Durchlauf des quasi optimalen Messvolumens.
Das Modul A in 1 stellt also eine Vorrichtung für den Inhibitorentzug dar, die sich im wesentlichen räumlich über der Messbox Modul B befindet, wobei der Durchlauf von der Säule 1 in das Modul B gemäß der 1 mittels Rohr- oder Schlauchleitung durch einen Deckel 11 hindurch in eine Fluoreszenzküvette 10 zustande kommt. (Der Deckel ist geschwärzt zur Absorption des durch die Messprobe gelangten Laserlichts). Das freie Enzym spaltet gemäß Enzymassay als proteolytisches Enzym aus dem in die Küvette 10 gegebenen Substrat ein Fragment ab, das in freier Form fluoresziert. Aus dem zeitlichen Anstieg dieser Fluoreszenzintensität lässt sich die En zymaktivität des freigesetzten Enzyms bei definierter Temperatur (welche mit Hilfe von Peltierelementen 19 eingestellt wird) bestimmen. In der unteren Messbox (Modul B) befindet sich eine Laserdiode 13 zur Anregung dieser Fluoreszenz. Die Laserdiode emittiert zweckmäßigerweise Licht der Wellenlänge, die dem Excitationsmaximum des fluoreszierenden Substratfragments entspricht. Das emittierte Fluoreszenzlicht 14 wird senkrecht zur Einstrahlrichtung mit Hilfe einer Fotodiode 17 detektiert. Kantenfilter 15 und Interferenzfilter 16 filtern nahezu alles Streulicht, das vom Anregungslicht stammt, aus und lassen nur Fluoreszenzlicht auf die Fotodiode 17 fallen.
Die Temperierung der Affinitäts-Chromatographiesäule 1 im Modul A erfolgt bei 3–20°C, vorzugsweise bei 4–5°C, da mit der Bindung des Inhibitors an das Affinitäts-Chromatographiesäulen-Material das proteolytische Enzym freigesetzt wird, das sich selbst verdauen kann, d. h. bei höheren Temperaturen greift ein proteolytisches Enzymmolekül das andere an.
Die Messung der Enzymaktivität in Modul B erfolgt temperiert bei 37°C (für humanmedizinische Zwecke), (wozu eine Zusatzeinrichtung für die Konstanthaltung der Temperatur zweckmäßigerweise wiederum mittels Peltierelementen dienlich ist: Thermostat 19).
Im einfachsten Fall ist auch die Küvette 10 als Wegwerfartikel ausgestaltet. (Sie kann vorher gefüllt sein mit Messpuffer und den Ingredientien gemäß Enzymassay). Jedoch kann auch eine Zufuhr dieser Mischung direkt in die Küvette 10 erfolgen, oder u. U. im Kanal 9 mittels zusätzlichem Ventil und Pumpe, je nach Bedarf auch noch mit einem Messpuffer geeigneter Art versetzt. Nach Abschluss der Elution wird die enzymatische Reaktion durch Zugabe von Substrat gestartet. Diese Kann z. B., wie in 2 dargestellt, aus einem Substratbehälter 18 über das Ventil 26 erfolgen, oder wie gemäß 1, über eine nicht dargestellte Spritze durch den Abschlussdeckel 11 hindurch eingebracht werden.
Die Teile 1, 5, 4, 10 können als (billige) Wegwerfartikel ausgestaltet sein. Der Vorteil der austauschbaren Teile liegt darin, dass keinerlei Bestandteile einer Probe eines Patienten mit einer anderen Probe eines anderen Patienten zusammenkommen können! Man muss sich vor Augen halten, dass die Körperflüssigkeit des Patienten als Messprobe auf die Säule 1 gegeben wird und vor allem nur der Enzym-Inhibitor bei der Elution auf der Säule bleibt; es ist aber nicht klar, ob auch andere Bestandteile auf der Säule noch zurückbleiben. Auf jeden Fall enthält die Messprobe in der Fluoreszenzküvette 10 nicht nur das freie Enzym, sondern auch den größten Teil der anderen Bestandteile der ursprünglichen Körperflüssigkeit. Ein weiterer Vorteil dieses Konzepts besteht darin, dass komplizierte mechanische Teile wie Ventile/Pumpen entfallen.
Die Verdünnung des Eluats mit Messpuffer kann für ein gutes Messergebnis sehr vorteilhaft, evtl. notwendig sein. Die Kombination von Laserdiode und/oder Fotodiode direkt an der Messküvette führt zu einer hohen Nachweisgrenze. Im einfachsten Fall der 1 kann man auch so verfahren: Die Elution aus der Säule 1 des Moduls A erfolgt gleich mit dem (im Überschuss beigegebenen) Substrat im Messpuffer, und zwar so, dass jedes Enzym-Molekül ein Substrat-Molekül binden kann (Substratsättigung).
In 2 ist eine gegenüber der 1 in der Funktion erweiterte und quasi halbautomatisierbare Vorrichtung dargestellt, jedoch kann auch die Säule 1 wie oben für 1 mit den zwei Methoden betrieben werden. Daher sind vor und nach der Säule 1 Mehrweg-Ventile 22, 26 vorgesehen. Teile derselben können auch mit einer Anordnung der 1 kombiniert werden.
In 2 ist ebenfalls eine Affinitäts-Chromatographiesäule 1, welche von einer temperierbaren Einheit 6 (z. B. Peltierelement) umgeben vorzugsweise auf 4°C eingestellt ist. Im Inneren der Säule ist fest gepacktes Material, an welche eine Substanz gebunden ist, die eine höhere Affinität zu den Inhibitoren aufweist als ein hier interessierender Enzyminhibitorkomplex der Messprobe, z. B. ist an das Sepharosegel als Packungsmaterial Papain als Substanz gebunden, und die Messprobe enthält z. B. den Enzym-inhibitorkomplex von Cathepsin B. Nach Einlass der Messprobe aus einem Behälter über einen Tubus 23, welcher über ein Ventil 22 (durch einen Drehpfeil gekennzeichnet) geschieht, wird aus dem Zufluss 24, wobei das Ventil 22 umgestellt wird, ein Säulenpuffer in die Säule 1 gelassen.
Der Tubus 23 kann ein Wegwerfteil sein oder/und als Zufluss aus einem Behälter dienen, der für weitere Messungen benutzt werden kann. Der Kanal 24 kann als eine weitere austauschbare 2. Spritze als Wegwerfteil aus Kunststoff mit einer bestimm ten Dosis Volumen, die im allgemeinen das Vielfache vom Volumen der Messprobe beträgt, ausgestattet sein, oder er kann einfach ein Säulenpufferreservoir sein oder zu einem solchen führen, wobei bei der entsprechenden Stellung des Ventils 22 in den Eingang der Säule 1 der Durchfluss für den Säulenpuffer freigegeben wird.
Die Pumpe 25 ist nach dem Ventil 22 angeordnet, um bei Bedarf einen beliebigen Druck (also auch O) zum optimalen Durchlauf durch die Säule zu erzeugen. Das Ventil 22 kann auch so gestellt sein, dass die Messprobe und/oder der Säulenpuffer eine Bypass-Leitung 27 zum unteren Ausgang der Durchflusssäule 1 oder zum Ventil 26 führt. Am Ausgang der Säule 1 ist dieses weitere Ventil 26 vorgesehen (wiederum mit einem Drehpfeil angedeutet), und zwar auch für folgenden Zweck: Wenn die Messprobe durch die Säule 1 läuft, wird ein erster Teil des Volumens verworfen und im Ausgang 28 entsorgt. Sodann wird das Drehventil umgestellt auf Durchflussrichtung 30 zur Messbox B hin, denn dieses weitere Volumen ist dann besser geeignet für eine genaue Messung. Der Rest der Elutionsflüssigkeit wird dann wieder zum Ausgang 28 hin abgeleitet.
Für die Ermittlung des Verwertungsvolumens wird die Verdünnung der Probe nach dem Durchlauf durch die Säule 1 ermittelt. Eventuell muss man eine einfache Vorrichtung vorsehen zur Bestimmung des Volumens, das verworfen und über den Kanal 28 abgeleitet wird, daraus lässt sich dann das Volumen der eluierten Messprobe mit dem freien Enzym bestimmen als Differenz zu dem über 24 aufgetragenen Elutionspuffer.
Nach Durchfluss durch den Kanal 30 in einen (z. B. kubusförmigen oder quaderförmigen) Behälter 10 läuft die Messprobe, deren Enzym von Inhibitoren befreit ist, in diesen Behälter 10, welcher zuvor mit Messpuffer und Ingredientien gemäß Enzymassay versehen wurde. Zum Start der Enzym-Reaktion wird die optimale Dosis von Substrat zugegeben aus Vorratsbehälter 18.
Der Behälter 10 kann ebenfalls für einfachste Bedürfnisse als Wegwerfartikel ausgestaltet sein, indem der Kubus 10 z. B. aus Kunststoff besteht.
Er kann eine Fluoreszenzküvette sein, wobei im Modul B eine Laserdiode 33 vorgesehen ist, die eine Wellenlänge λ = 390 nm aufweist.
Diese Laserstrahlung aus 33 ist etwa senkrecht zur Fallrichtung, d. h. etwa 90° zur Einflussrichtung vom Kanal 29 oder 30. Senkrecht dazu (vom Betrachter aus nach rechts im Winkel von 90°) ist als Reaktion des Spaltprodukts eine Fluoreszenzstrahlung 34 dargestellt, die auf einen Kantenfilter 15, parallel dazu einen Interferenzfilter 16, und weiter parallel dazu auf eine Fotodiode 17 trifft, die an ihrem Ausgang die Intensität der Fluoreszenzstrahlung zu messen gestattet (wie in 1). Die Strahlungen 34, 35 liegen also in einer Ebene, die vorzugsweise senkrecht zur Fallrichtung ist.
Unterhalb der Fluoreszenzküvette 10 ist ein Magnetrührgerät 44 um die Achse 45 rotierend angedeutet, das die Mischung möglichst homogen machen soll. Fluoreszenz beginnt sofort, nachdem die Partikel der Messprobe auf Substratteile treffen, die Intensität ist proportional der Konzentration des Spaltprodukts und dieses wiederum ist ein proportionales Maß für die Enzymaktivität.
Die Messkurve für die emittierte Fluoreszenzintensität in 4 geht nach einer Anfangsphase in eine Gerade über, und sobald der Kurvenverlauf geradlinig ist, wird deren Anstieg festgestellt und man hat das gewünschte Ergebnis dl/dt. Die 4 ist für alle anderen Figuren repräsentativ.
Im einfachsten Fall ist das Modul A eine Wegwert-Chromatographiesäule, in welche oben eine erste Einmalspritze mit der Messprobe eingeführt wird, danach eine 2. Spritze mit dem Säulenpuffer, der Ausgang 9 kann unmittelbar über das Ventil 6 mit der Messbox 10 verbunden werden, wobei diese dann auch eine (wie beschrieben) aufbereitete, billige Wegwerfpackung ist. Das Modul B, auf jeden Fall die Messbox 10, sollte temperiert werden, wozu um die Messbox 10 herum ein weiteres Peltierelement 16 in unmittelbarer Umgebung vorgesehen ist. (Das muss für humanmedizinische Anwendung zweckmäßigerweise auf 37°C eingestellt sein). Alternativ kann also ein Substratbehälter 18 vorgesehen sein, der einen direkten Kanal zur Box 10 hin aufweist. Vorzugsweise erfolgt die Zufuhr zur Box 10 jedoch aus dem Substratbehälter indirekt über den Kanal 9 bzw. 29 bzw. 30.
Im einfachsten Fall ist Modul B eine mit Messpuffer und weiteren Ingredientien, wie z. B. ein nicht ionisches Tensid und Dithiothreitol oder Cystein, aufbereitete billige Wegwerfpackung.
Das Ventil ist dann unerlässlich, wenn man die Messprobe im Durchflussverfahren aus der Säule eluiert, denn dann wird man einen ersten Teil des Eluats verwerfen. Es ist aber auch dann unerlässlich, wenn man die Probe auf der Säule eine Zeit lang inkubiert; denn dazu muss man nach dem Auftragen der Probe auf die Säule danach einen gewissen Teil des Säulenpuffers in die Säule lassen und unten auslassen; dadurch sickert die Messprobe in die Säule ein und die Enzym-Inhibitorkomplexe der Messprobe finden so möglichst alle Kontakt mit der auf der Säule immobilisierten Substanz, die den Inhibitor besser bindet,
Während in der Anordnung gemäß 1 die Laserstrahlung 14 und das emittierte und detektierte Fluoreszenzlicht parallel oder in der Zeichnungsebene bzw. Schnittebene von Modul A verlaufen, liegen diese Strahlungen 34, 35 in 2 in einer Ebene senkrecht zur Schnittebene von Modul A, d. h. im allgemeinen senkrecht zur Fallrichtung oder Durchflussrichtung in Teil 1.
Dadurch ist unterhalb der Messküvette 10 bzw. des Moduls B ein Mischer zur Homogenisierung für den Inhalt der Küvette 10 räumlich geschickt und für einfache Handhabung vorteilhaft angeordnet, z. B. als magnetisches Rührwerk 44, 45.
In diesen Figurenbeschreibungen sind identische Ziffern für gleich wirkende oder identische Teile verwendet. Außerdem wird Modul A als ebenes Schnittbild dargestellt, während Modul B in räumlicher Darstellung gezeigt ist.
3 stellt eine weitere selbständige Variante der Erfindung dar, bei der Modul A entfällt und die Messfunktion komplett in Modul B verlagert ist. Die Messküvette ist quasi als Messtopf 100 ausgebildet, der einen (wie schon beschrieben) geschwärzten Abschluss 111 aufweist, welcher vorzugsweise Öffnungen für (insbesondere automatisierbare) Zufuhr der notwendigen Substanzen aufweist. Hierbei wird das Affinitätschromatographieadsorbens (z. B. Papain + Trägermaterial) als Gel bereits mit Messpuffer zusammen mit den übrigen Ingredientien des Enzymassays in den Messtopf gegeben, der z. B. wieder als Fluoreszenzküvette ausgestattet ist. Nach Zugabe der biologischen Messprobe wird bei der für die Inkubation optimalen Temperatur von z. B. 5°C, welche mittels Peltierelementen gehalten wird, die optimale Zeit lang inkubiert und dabei sozusagen in situ das vom Inhibitor freie Enzym in der Fluoreszenzküvette freigesetzt. Danach wir dieses Gemisch auf die für den Enzymassay notwendige Temperatur, (die für humanmedizinische Zwecke 37°C beträgt), gebracht und nach Erreichen dieser Temperatur das fluorogene Substrat zugespritzt, sodass die Fluoreszenzintensität und damit die Enzymaktivität des freien proteolytischen Enzyms gemessen werden kann (s. 4).
Das Verfahren, das gemäß 3 arbeitet, sieht also an ortsfester Stelle (im Messtopf 100 Modul B) vor, dass zuerst die Inkubation bei niedrigerer Temperatur geschieht, sodann die Temperatur hochgefahren wird (z. B. 37°C), und dann das Substrat zugegeben wird.
Gemäß 1/2 verbleibt die Messprobe im oberen Modul A, der bei der niedrigeren Temperatur konstant gehalten wird; und wird dann in den unteren Modul B, der die höhere Temperatur (ebenfalls konstant) hat, zur Messung (unter Hinzufügung der Ingredientien) gegeben.
Eine weitere, hier nicht dargestellte Variante sieht vor, dass im Modul A (in die Säule 1) die Messprobe und anschließend der Säulenpuffer zusammen mit dem Substrat gegeben wird. Dabei würde vermutlich die Selbstverdauung des durch den Inhibitorentzug frei werdenden Enzyms wesentlich vermieden. Wie in 1 z. B. würde der Modul A bei der Temperatur von z. B. 3–10°C thermostatisiert werden.
Bei dieser niedrigen Temperatur würde die an sich unerwünschte Reaktion zwischen Enzym und Substrat noch vernachlässigbar sein, so dass das Substrat schon in Modul A dazugegeben werden könnte. Die Messung könnte wie bei 1 oder 2 oder 3 wieder in der Messküvette (10 z. B.) des Moduls B erfolgen. Modul B hat dabei die konstante höhere Temperatur. Im Unterschied zum Verfahren gemäß 1 oder 2 ist jedoch das Substrat schon in der eluierten Flüssigkeit, die aus Modul A austritt und in Modul B geleitet wird. Dabei kann das Prozedere wie in 2 bezüglich Zuleitung in Modul B angewendet werden.
ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Patentliteratur

- WO 97/00969 [0001]
- DE 102007017681 [0002]

Claims

Verfahren zur Bestimmung der Aktivität von Enzymen in einer Messprobe, die wenigstens ein Enzym und wenigstens einen zu dem Enzym korrespondierenden Enzyminhibitor enthält, indem nach Entzug des Inhibitors das befreite Enzym in seiner Aktivität dadurch gemessen wird, dass der Messprobe mit gegebenenfalls zugemischtem Puffer ein fluorogenes Substrat zugegeben wird, wobei als fluorogenes Substrat ein Oligopeptid, insbesondere ein Dipeptid vorgesehen ist, dessen N-Terminus mit einer Schutzgruppe geschützt ist und wobei insbesondere an dessen C-Terminus das fluorogene 7-Amino-4-trifluormethylcumarin gebunden ist.
Vorrichtung zur Bestimmung der Aktivität von Enzymen in einer Messprobe, die wenigstens ein Enzym und wenigstens einen zu dem Enzym korrespondierenden Enzyminhibitor enthält, insbesondere für ein Verfahren nach Anspruch 1, bei dem man als fluorogenes Substrat ein Oligopeptid, insbesondere ein Dipeptid verwendet, dessen N-Terminus mit einer Schutzgruppe geschützt ist und an dessen C-Terminus das fluorogene 7-Amino-4-trifluormethylcumarin gebunden ist. eine Chromatographiesäule (1), die ein Trägermaterial und eine an das Trägermaterial gebundene Substanz enthält, welche in der Lage ist, den wenigstens einen Enzyminhibitor zu binden, wobei die vorzugsweise temperierbare Chromatographiesäule (1) in einem ersten Modul A zentral räumlich über einem zweiten Modul B angeordnet ist, wobei ein Messprobenspeicher und ein Säulenpufferreservoir vorgesehen sind, wobei Modul B ein Versuchsgefäß als Messküvette (10) ausgebildet enthält, wobei eine die Messküvette umgebende Messvorrichtung mit einer Strahlungsquelle und einer Messeinheit zum Erfassen des Anstiegs der Konzentration zumindest eines Spaltprodukts eines Substrats pro Zeiteinheit vorgesehen ist, wobei das Versuchsgefäß die Messprobe und gegebenenfalls damit gemischtem Puffer und/oder Substrat aufnimmt und temperierbar ist, einen Substratbehälter und/oder einen Messpufferbehälter für das Zudosieren von Substrat und/oder Messpuffer zu eluierter flüssiger Messprobe aus der Chromatographiesäule (1) in die Messküvette (10), wobei die Messküvette (10), vorzugsweise kubischer Form, mindestens zwei, insbesondere zueinander senkrechte, optisch offene Wandflächenseiten aufweist, auf deren Senkrechten die Strahlungsquelle (13, 33) und die Messeinheit (15, 16, 17) zur Intensitätsmessung der Strahlung (z. B. emittierte Strahlung 14, 34) angeordnet sind, wobei vorzugsweise eine Fläche des Kubus' strahlungsundurchlässig ist,
Vorrichtung zur Bestimmung der Aktivität von Enzymen in einer Messprobe, die wenigstens ein Enzym und wenigstens einen zu dem Enzym korrespondierenden Enzyminhibitor enthält, insbesondere für ein Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Vorrichtung enthält: einen Messtopf (100) mit vorzugsweise hohlzylindrischem Innenraum, in welchem sich ein Trägermaterial befindet, das eine Substanz hält, welche in der Lage ist, den wenigstens einen Enzyminhibitor zu binden, wobei der Messtopf (100) zur Aufnahme von Messprobe und ggf. damit gemischtem Puffer und/oder Substrat vorgesehen ist, wobei der als Versuchsgefäß ausgebildete Messtopf zweistufig temperierbar ist, ferner wenigstens einen Substratbehälter und/oder wenigstens einen Messpufferbehälter für das Zudosieren von Substrat und/oder Messpuffer mit Zugängen zum Messtopf (100) oder diese Zugänge inklusive deren Behälter als Ausgänge unabhängiger Spritzen ausgestaltet sind, wobei der Messtopf (100) innerhalb einer Strahlungs-Messanordnung angeordnet ist, wobei der Messtopf (100) von vorzugsweise kubischer Form zwei optisch offene Wandflächenseiten (113, 114) aufweist, wobei senkrecht zu diesen Wandflächen eine Strahlenquelle (13, 33) und dazu eine Messeinheit (15, 16, 17) zur Messung der Lichtabsorption oder der Lumineszenz (z. B. der emittierten Strahlung 14, 34) angeordnet sind.
Vorrichtung nach Anspruch 2, wobei der Messprobenspeicher als eine erste Spritze (4) und das Säulenpufferreservoir als eine zweite wesentlich größere Spritze (7) ausgebildet ist, wobei der Substratbehälter als eine weitere Spritze ausgebildet vorgesehen ist.
Verfahren zur Bestimmung der Aktivität von Enzymen in einer Messprobe, die wenigstens ein Enzym und wenigstens einen zu dem Enzym korrespondierenden Enzyminhibitor enthält, insbesondere nach Anspruch 1, wobei man durch den Einsatz eines Bypasses aus zwei Aktivitätsmessungen der Messprobe, nämlich aus der Aktivitätsmessung nach der Passage durch den Bypass und aus der Aktivitätsmessung nach der Passage durch die Säule, neben der Gesamtaktivität des Enzyms in der Messprobe auch die Konzentration des Inhibitors bestimmen kann.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 2 bis 5, wobei im Bodenbereich der Messküvette (10) oder des Messtopfes (100) zentral ein Magnetrührwerk vorgesehen ist und die Strahlen (14, 34) in waagerechter Ebene verlaufen.
Vorrichtung nach Anspruch 2, wobei der Messprobenspeicher und das Säulenpufferreservoir mit Zuflusskanälen (23, 24) vor der Säule (1) insbesondere über eine erste Ventilanordnung (22) vorgesehen sind, so dass deren Volumina in die Säule (1) eingebracht werden können, und wobei insbesondere über eine zweite Ventilanordnung (26) nach dem Modul A die Elutionslösung in den Modul B gelangen kann (Kanal 29, 30), wobei an der zweiten Ventilanordnung vorzugsweise zusätzliche Kanäle (27, 28, 18) vorgesehen sind.
Vorrichtung nach Anspruch 2 oder 4, wobei der Messpufferbehälter als weitere Spritze ausgebildet ist.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 2, 3, 7, wobei von der ersten Ventilanordnung (22) vor der Säule (1) eine Bypassleitung (27) zur zweiten Ventilanordnung (26) führt.