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Die
Erfindung betrifft ein Verfahren zum Erhalten eines teilchenoptischen
Bilds einer Probe in einer teilchenoptischen Vorrichtung, in der
die in einen gefrorenen Zustand versetzte Probe einer Vakuumumgebung
ausgesetzt und ein Bild mindestens eines Abschnitts der Probe mit
Hilfe eines fokussierten Rasterelektronenstrahls erzeugt wird.
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Bekannt
ist ein solches Verfahren aus "Cryo-Scanning
Electron Microscopy Observations of Vessel Content during Transpiration
in Walnut Petioles. Facts or Artifacts?", H. Cochard et al., Plant Physiol.,
November 2000, Vol. 124, Seiten 001191-1202.
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Ein
solches Verfahren wird verwendet, um z. B. biologische Proben in
einem Rasterelektronenmikroskop (REM) beispielsweise in einem biologischen Labor
zu beobachten.
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Bei
Verwendung relativ dicker Proben (d. h. mit einer Dicke in der Größenordnung
von 0,1 mm) in solchen teilchenoptischen Vorrichtungen wie Elektronenmikroskopen
kann man mit dem Problem konfrontiert sein, daß die in der Probe zu untersuchenden
Details im Inneren des Materials der Probe liegen. Beispielsweise
kann es zu einer solchen Situation kommen, wenn ein Bakterium als
Probe verwendet wird, wobei man ein Detail weiterer Analyse mit Hilfe
einer (viel) stärkeren
Vergrößerung im
Elektronenmikroskop unterziehen möchte. Eventuell vermutet der
Benutzer der Vorrichtung, daß ein
Detail, das von möglichem
Interesse ist, an einer bestimmten Stelle im Inneren der Probe liegt,
aber dieses Detail ist im Großteil
des Materials vergraben und somit für die elektronenop tische Abbildung,
z. B. mit einem Rasterelektronenmikroskop (REM), nicht erreichbar. Man
könnte
annehmen, in einem separaten Vorgang außerhalb des Elektronenmikroskops
zu versuchen, die Probe so zu öffnen,
daß das
interessierende Detail freigelegt wird, aber da das betroffene Detail
oft kleiner als die Wellenlänge
von sichtbarem Licht ist, bleibt seine Bearbeitung direkter Beobachtung
durch den Bearbeitenden verschlossen, so daß beim Versuch zur Freilegung
das interessierende Detail leicht verfehlt oder auf unerwünschte Weise
freigelegt werden kann. Zudem ist es extrem schwierig und häufig unmöglich, die
richtige Stelle zu ermitteln, an der ein Querschnitt vorzunehmen
ist.
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Die
US-A-3761709 offenbart im Kontext der Elektronenabtastung ein Werkzeug,
um die in die Vakuumkammer gegebene Probe zu schneiden.
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Die
Erfindung zielt auf die Bereitstellung einer Lösung für das o. g. Problem mit Hilfe
eines Verfahrens nach Anspruch 1 ab.
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Die
Probe kann in einen gefrorenen Zustand versetzt werden, indem sie
zunächst
mit einer Flüssigkeit
getränkt
und anschließend
auf eine Temperatur unter dem Gefrierpunkt der Flüssigkeit
abgekühlt wird.
Durch Gefrieren der Probe erreicht man die Erzeugung einer vollständig gefüllten Matrix,
als deren Ergebnis bei der weiteren Bearbeitung alle Abschnitte
des interessierenden Details in der Probe an ihren ursprünglichen
Positionen verbleiben und sich in Form oder Struktur nicht ändern. Um
dies zu erreichen, wird die Probe mit hoher Geschwindigkeit gefroren.
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Nachdem
bestimmt wurde, in welchem Bereich der Probe das interessierende
Detail liegt, was durch Untersuchen einer freien Oberfläche der
gefrorenen Probe oder durch Verwenden eines anderen Verfahrens geschieht,
wird der betreffende Bereich einer Fräsoperation mit einem Ionenstrahl
mit dem Ziel unterzogen, das interessierende Detail freizulegen
und es da durch für
die REM-Abbildung zugänglich
zu machen. Dieser Fräsvorgang
geschieht in einer Vakuumumgebung, d. h. in einer Umgebung mit Niederdruck,
normalerweise 10-6 mbar. In der Vakuumumgebung
ist eine gekühlte
Gegenfläche
vorgesehen, um die Moleküle
zu binden, die aus der gefüllten
Matrix verdampfen. Um eine solche Bindung zu ermöglichen, ist die Temperatur
der Gegenfläche niedriger
als die der Probe, z. B. 20 °C
niedriger. Die Gegenfläche
kann die Form eines Kühlfingers
haben, der auf der gewünschten
Temperatur z. B. mit flüssigem
Stickstoff gehalten wird. Der Fräsablauf
kann durch den Benutzer manuell gesteuert oder kann computergesteuert
ablaufen.
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Sobald
der Bereich, der das interessierende Detail enthält, durch das Fräsverfahren
freigelegt ist, wird das interessierende Detail für die REM-Abbildung
mit relativ geringer Geschwindigkeit weiter zugänglich gemacht. Dies geschieht,
da die Temperaturdifferenz zwischen der Probe und der Gegenfläche erhöht wird,
z. B. weil die Temperatur der Probe erhöht wird. Dadurch kommt es zu
Sublimation der gefrorenen Flüssigkeit
im freiliegenden Querschnitt der Probe. Als Ergebnis der relativ
niedrigen Sublimationsgeschwindigkeit kann der Benutzer das gewünschte Detail
mit hohem Genauigkeitsgrad freilegen und es anschließend abbilden.
Diese Abbildung erfolgt mit Hilfe eines fokussierten Rasterelektronenstrahls
(REM-Abbildung), um eine Erosionswirkung des Abbildungsstrahls auf
dem interessierenden Detail zu verhindern. Außerdem kann man durch Auswählen der
Position der Gegenfläche
die Position auf der Probe bestimmen, von der Sublimation auftreten soll.
Grund dafür
ist, daß der
Bereich, aus dem die größte Sublimation
erfolgt, der Bereich ist, der der Gegenfläche am nächsten liegt. Indem also die
Gegenfläche
nahe dem gewünschten
Bereich plaziert wird, kann Sublimation in diesem Bereich erreicht werden.
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In
einer bevorzugten Ausführungsform
der Erfindung wird der Fräsvorgang
mit einem Ionenstrahl beobachtet, indem min destens ein Teil des
freigelegten Querschnitts der Probe mit Hilfe eines fokussierten
Rasterelektronenstrahls abgebildet wird. Auf diese Weise kann der
Benutzer das Fräsverfahren
detailliert überwachen
und bei Bedarf das Fräsen stoppen,
sobald das Verfahren den gewünschten Verlaufsgrad
erreicht hat.
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In
einer weiteren bevorzugten Ausführungsform
der Erfindung wird das Sublimationsverfahren beobachtet, indem mindestens
ein Teil des freigelegten Querschnitts der Probe mit Hilfe eines
fokussierten Rasterelektronenstrahls abgebildet wird. Auf diese
Weise kann der Benutzer wie im Fall des Fräsverfahrens das Sublimationsverfahren
detailliert überwachen
und bei Bedarf das Verfahren stoppen, sobald es den gewünschten
Verlaufsgrad erreicht hat.
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In
noch einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung enthält die zu
gefrierende Probe Wasser. Wasser hat den Vorteil, daß diese Flüssigkeit
in vielen Proben, z. B. biologischen Proben, bereits natürlich vorhanden
ist. Ist Wasser nicht bereits in der Probe vorhanden, kann sie vor
dem Gefrierverfahren mit Wasser getränkt werden. Wasser, das im
Fräsverfahren
und im Sublimationsverfahren freigesetzt wird, läßt sich an der Gegenfläche mit niedrigerer
Temperatur leicht binden.
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In
einer weiteren Ausführungsform
der Erfindung ist der Ionenstrahl ein fokussierter Ionenstrahl. Durch
Fokussieren des Ionenstrahls ist es auf sehr präzise Weise möglich, den
zu fräsenden
Bereich festzulegen und ihm bei Bedarf alle möglichen Spezialformen zu geben,
wodurch das Fräsverfahren
in hohem Grad steuerbar wird.
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In
noch einer weiteren Ausführungsform
der Erfindung sind die Ionen im Ionenstrahl schwerer als Sauerstoffatome.
Als Ergebnis der relativ großen Masse
der Ionen werden Sauerstoffatome im Wasser (oder in einer anderen
Matrixflüssigkeit,
z. B. Alkohol) leicht verdrängt,
wodurch ein Fräsverfahren
mit hoher Geschwindigkeit erreicht wird.
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In
noch einer weiteren Ausführungsform
der Erfindung wird die Sublimationsgeschwindigkeit reguliert, indem
der Raumwinkel variiert wird, in dem die gekühlte Gegenfläche von
der Probe zu sehen ist. Von Vorteil ist diese Ausführungsform,
wenn z. B. flüssiger
Stickstoff zum Kühlen
der Gegenfläche dient.
Dann wird die Temperatur der Gegenfläche durch den Siedepunkt des
Stickstoffs bestimmt und läßt sich
daher nicht leicht regulieren. Durch Verschieben der Gegenfläche zur
Probe oder von ihr weg wird der Raumwinkel zusammen mit der Anzahl eingefangener
Wassermoleküle
und folglich die Sublimationsgeschwindigkeit variiert. Auf diese
Weise wird eine genaue Regulierung dieser Geschwindigkeit möglich.
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In
noch einer weiteren Ausführungsform
der Erfindung werden nach Durchführung
der Abbildung mit Hilfe eines fokussierten Rasterelektronenstrahls erneut
ein Ionenfräsverfahren
und ein Sublimationsverfahren durchgeführt, wonach erneut die Abbildung mindestens
eines Abschnitts des neu freigelegten Querschnitts der so erhaltenen
Probe mit Hilfe eines fokussierten Rasterelektronenstrahls durchgeführt wird.
Auf diese Weise ist es möglich,
eine Folge von REM-Bildern mit einer stetig (etwas) fortgeschrittenen
Erosionsfront zu erzeugen, wodurch die Zeit zwischen zwei aufeinanderfolgenden
Bildern als Ergebnis der relativ hohen Geschwindigkeit des Ionenfräsverfahrens
kurz ist und der Abstand zwischen zwei Abbildungsquerschnitten als
Ergebnis der hohen Genauigkeit des Fräsverfahrens und des Sublimationsverfahrens
extrem genau bestimmt werden kann. Dadurch kann eine dreidimensionale
Rekonstruktion mit REM-Bildern erstellt werden.
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Im
folgenden wird die Erfindung anhand der Zeichnungen beschrieben,
in denen identische Bezugszahlen entsprechende Teile bezeichnen.
Es zeigen:
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1 in
schematischer Form eine teilchenoptische Vorrichtung zur Durchführung des
erfindungsgemäßen Verfahrens;
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2A eine
Darstellung einer Probe, die erfindungsgemäß zu bearbeiten ist;
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2B einen
Querschnitt an der Linie A-A in 2A in
der erfindungsgemäß zu bearbeitenden Probe;
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3 die
Wirkung des Raumwinkels, in dem die Gegenfläche von der Probe aus zu sehen
ist.
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1 zeigt
schematisch eine teilchenoptische Vorrichtung zur Durchführung des
erfindungsgemäßen Verfahrens.
Die Vorrichtung ist durch ein sogenanntes Doppelstrahlsystem gebildet,
in dem zwei teilchenoptische Säulen 2 und 4 vorhanden sind,
wobei die Säule 2 eine
ionenoptische Säule
und die Säule 4 eine
elektronenoptische Säule
ist. Beide Säulen 2 und 4 sind
an einem Probenraum 6 angeordnet, der evakuiert werden
kann und in dem ein Objekttisch 8 vorhanden ist. Außerdem ist
der Probenraum 6 mit einer gekühlten Gegenfläche in Form eines
Kühlfingers 10 versehen.
Der Objekttisch 8 und der Kühlfinger 10 können auf
eine gewünschte
niedrige Temperatur mittels einer schematisch dargestellten Kühlanlage 12 eingestellt
werden. Die Verbindung zwischen der Kühlanlage 12 und dem
Objekttisch 8 ist durch eine Kühlleitung 14 und die
zwischen der Kühlanlage 12 und
dem Kühlfinger 10 durch
eine Kühlleitung 16 schematisch
dargestellt. Die zu bearbeitende Probe 18 liegt auf dem
Objekttisch.
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Die
Säule 2 erzeugt
einen Ionenstrahl 20, der sich auf einer optischen Achse 22 bewegt;
dieser Ionenstrahl 20 wird auf die Probe 18 mit
Teilchenstrahllinsen (nicht gezeigt) fokussiert. Mit Hilfe von (nicht gezeigten)
Ablenkspulen kann der fokussierte Ionenstrahl 20 ein gewünschtes
Abtastmuster an einem Abschnitt der Probe 18 abarbeiten,
die mit diesem Ionenstrahl zu bearbeiten ist. Die Säule 4 erzeugt
einen Elektronenstrahl 24, der sich auf einer optischen
Achse 26 bewegt; dieser Elektronenstrahl 24 wird
auf die Probe 18 mit Teilchenstrahllinsen (nicht gezeigt)
fokussiert. Zudem ist die Säule 4 auf
bekannte Weise mit (nicht gezeigten) Ablenk spulen so versehen, daß ein REM-Bild
des Bereichs der Probe 18 auf bekannte Weise erhalten werden
kann, die zu bearbeiten und/oder abzubilden ist.
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Die
Probe 18 wird in gefrorenem Zustand in den Probenraum 6 gegeben
und dort auf einer gewünschten
niedrigen Temperatur mit Hilfe der Kühlanlage 12 gehalten,
die den Objekttisch 8 kühlt.
Möglich
ist auch, die Probe auf dem Objekttisch 8 in einem nicht
gefrorenen Zustand zu plazieren und die Probe anschließend in
situ zu gefrieren. Um zu gewährleisten,
daß die
Struktur der Probe nicht durch den Gefrierablauf beeinträchtigt wird,
muß man
eine ausreichend hohe Gefriergeschwindigkeit gewährleisten, z. B. 105 K/s. Angenommen wird, daß die Probe
vor dem Gefrieren so mit Wasser getränkt wurde, daß nach dem
Gefrieren die Probe aus einem Probenmaterial besteht, das in eine
Matrix aus Eis eingebettet ist. Die Temperatur, bei der die Probe
bearbeitet wird, hängt
von der Anwendung ab; beispielsweise ist die Temperatur die von
flüssigem
Stickstoff, die etwa –196 °C beträgt. Der
Kühlfinger 10 wird
gegenüber
der Probe 18 plaziert, wobei der Finger auch auf einer
gewünschten
niedrigen Temperatur mit Hilfe der Kühlanlage 12 gehalten
wird. Die Temperatur des Kühlfingers 10 kann
von der Temperatur der Probe 18 abweichen, was später näher erläutert wird.
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Im
folgenden wird das Fräsverfahren
der Probe 18 anhand von 2A und 2B näher beleuchtet. 2A ist
eine Draufsicht auf den Objekttisch 8 mit der Probe 18.
Die erfindungsgemäße Bearbeitung
der Probe beginnt mit der Auswahl eines Bereichs 28 der
Probe, wobei der Benutzer vermutet, daß in diesem Bereich ein interessierendes
Detail liegt. Anschließend
wird dieser Bereich einem Fräsverfahren
mit dem Ionenstrahl 20 mit dem Ziel unterzogen, einen Querschnitt
freizulegen, in dem das interessierende Detail liegt. Die Ionen
im Ionenstrahl 20 sind z. B. Galliumionen, Argonionen oder
andere Ionen mit einer Atommasse, die die von Sauerstoff (weit) übersteigt.
Diese Auswahl bewirkt, daß das Fräsverfahren
mit relativ hoher Geschwindigkeit erfolgt, da die Sauerstoffatome
der Matrix durch die viel schwereren Ionen leicht verdrängt werden.
Beim Fräsen
liegt die Temperatur der Probe normalerweise in der Größenordnung
von –130 °C, und die
Temperatur des Kühlfingers
liegt normalerweise in der Größenordnung
von –150 °C. Der Abstand
von der Spitze des Kühlfingers
zur Probe beträgt
normalerweise 5 mm. Als Ergebnis des Vorhandenseins des Kühlfingers
wird das im Fräsverfahren
freigesetzte Wasser am Kühlfinger
gebunden, was verhindert, daß durch die
Ionen verdrängte
Wassermoleküle
wieder zur Probe zurückkehren
und das Fräsverfahren
dort stören
oder verlangsamen. Ein typischer Wert für die Energie der Ionen im
Fräsverfahren
liegt in der Größenordnung
von 30 bis 50 keV zum Schnellfräsen; für die feinere
Bearbeitung, die bei Annäherung
an das interessierende Detail zur Anwendung kommt, beträgt ein typischer
Wert 5 keV. Ein Typischer Wert für
den Strom im Ionenstrahl liegt in der Größenordnung von 1 bis 50 nA.
Im Fräsverfahren
liegt der Druck in der Vakuumumgebung normalerweise in der Größenordnung
von 10-6 mbar. Während der Fräsoperation
wird das Verfahren mittels REM-Abbildung mit Hilfe des Elektronenstrahls 24 überwacht.
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In 2A bezeichnet
die Linie A-A einen Querschnitt des Hohlraums, der durch den Fräsablauf
gebildet wird. 2B zeigt diesen Querschnitt. In 2B ist
die Oberseite der Probe mit der Bezugszahl 30 bezeichnet.
Der fokussierte Ionenstrahl wird abtastend über die Oberfläche des
Bereichs geführt,
der zum Fräsen
ausgewählt
wurde, wodurch ein Abschnitt des Volumens des Hohlraums fortwährend abgetragen
wird. Eine Seitenwand 32 des Hohlraums bildet den Querschnitt
der Probe, der freizulegen ist und der das interessierende Detail
enthält. Der
Hohlraum hat eine solche Form, daß es möglich ist, ein REM-Bild der
freigelegten Oberfläche 32 zu erzeugen.
Dazu wird ausreichend Material abgetragen, damit der Elektronen strahl
(der in dieser Darstellung durch die optische Achse 26 symbolisch
gezeigt ist) die abzubildende Oberfläche in einem Winkel bestrahlen
kann, der die Abbildung ermöglicht;
allerdings wird vermieden, mehr Material wegzufräsen als zur Erzeugung des REM-Bilds
notwendig ist. Aus diesem Grund zeigt die Wand 33 des Hohlraums
den dargestellten abgeschrägten
Verlauf.
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Schlußfolgert
man auf der Grundlage der im Fräsverfahren
erzeugten REM-Bilder, daß das
Fräsverfahren
in gewünschtem
Grad fortgeschritten ist, wird das Fräsverfahren gestoppt, und die
Sublimationsphase kann beginnen. Die Sublimationsphase wird durch
Erhöhen
der Temperaturdifferenz zwischen dem Kühlfinger und der Probe eingeleitet;
im hier verwendeten Zahlenbeispiel wird die Temperatur der Probe
von –130 °C auf –95 °C erhöht, während die
Temperatur des Kühlfingers
gleich bleibt. Die Sublimation bewirkt, daß der Materialabtrag von der Oberfläche viel
langsamer verläuft,
wodurch ein extrem kontrollierter Verlauf der Freilegung des interessierenden
Details erreicht wird. Auf diese Weise werden ferner alle möglichen
sehr feinen Details freigelegt, weil nur die Eismatrix verdampft
und die umliegenden Abschnitte der Probe erhalten bleiben, da diese
nicht mehr dem Ionenbeschuß während der Sublimationsphase
ausgesetzt sind. Die Sublimationsphase kann auch mit Hilfe von REM-Bildern
begleitet werden, bis das interessierende Detail so freigelegt ist,
daß das
abschließend
gewünschte REM-Bild
erzeugt werden kann. Bei Bedarf ist es möglich, das Verfahren zu wiederholen,
d. h. mit Ionenfräsen
wird so viel Material von der Wand 32 abgetragen, daß sich eine
neue Wand 34 erhebt, wonach noch eine weitere Sublimationsphase
eingeleitet wird, ein abschließend
gewünschtes
REM-Bild erzeugt wird und eine weitere Wiederholung möglich ist.
Indem auf diese Weise eine große
Anzahl von REM-Bildern aufeinanderfolgender Querschnitte erzeugt
wird, kann man eine dreidimensionale Darstellung des Inneren der
Probe erhalten. Dadurch vollzieht sich das gesamte Verfahren in
ein und derselben teilchenoptischen Vorrichtung, so daß keine
Zugabe in das Vakuum und Entfernung aus ihm zwischen den REM-Bildern
notwendig ist, wodurch sich eine beträchtliche Zeitersparnis realisieren
läßt.
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3 veranschaulicht
den Einfluß der
Position des Kühlfingers 10 im
Hinblick auf den interessierenden Bereich 28 in der Probe 18.
Da der Kühlfinger (der
in dieser Darstellung durch seine Spitze 10 schematisch
gezeigt ist) in der direkten Umgebung des Bereichs 28 liegt,
tritt die Sublimation vorwiegend aus diesem Bereich auf. Dies kommt
dadurch zustande, daß die
Kühlfläche im Blick
von diesem Bereich einen relativ großen Raumwinkel einschließt, der
deutlich größer als
der eingeschlossene Raumwinkel 38 ist, betrachtet man die
Kühlfläche von
einem entfernten Bereich der Probe.