JP4083119B2 - 組織学研究のための組織サンプルを調製および提供するための方法および装置 - Google Patents

Description

発明の詳細な説明

１．技術分野
本発明は、組織学的試験用の組織サンプルを包埋および提供するための方法および装置、より詳細には、顕微鏡試験用の組織サンプルを調製する方法に関する。

２．先行技術
パラフィン中に組織を包埋し、ミクロトームを用いてパラフィン包埋組織を薄層に切り、スライド上に乗せることによって顕微鏡試験用の組織サンプルを調製する手順は、当該分野で周知である。包埋に先立って、組織は、実施される特定の試験に従って選択される種々の溶液中で前処理される。典型的には、パラフィン包埋前に、組織サンプルは、固定、脱水、透明化（cleared ）、溶融パラフィンでの浸透、試験に依存して染色される。

組織サンプルを浸漬するために、サンプルは、最も一般的には、イソプロピルアルコールで脱水され、次いで、流動パラフィンに浸される。パラフィン浸漬の工程は、通常、周囲圧力、かつ包埋物質の融点よりも僅かに高い温度で行う。包埋物質がパラフィンである事象では、融点は、約50℃と58℃の間に位置する。組織サンプルの組織に含まれるイソプロピルアルコールのパラフィンでの置換は、パラフィンにイソプロピルアルコールを溶解することにより実施され、その結果、パラフィンの濃度が組織サンプルにおいて増加する。パラフィンが凝固すると、薄い切片は、パラフィンブロックに包埋された組織サンプルから切り取られ、スライド上に乗せられ、顕微鏡下で試験され得る。

Berger、米国特許第5,089,288 号は、イソプロピルアルコールで固定されている組織サンプルが処理容器中で減圧下で維持され、溶融パラフィンおよび組織サンプルが、組織サンプルからイソプロピルアルコールを除去し、かつ組織サンプルをパラフィンで浸漬するのに有効な超音波振動に同時に供されるという、組織サンプルをパラフィンで浸漬する方法を開示する。

McCormick 、米国特許第5,665,398 号は、生検の流体処理の後および組織学試験に先立って包埋組織生検を提供するためのシステムを開示する。このシステムは、組織学試験用の組織生検の調製に使用するためのカセットの組み合わせならびに処理生検を入れるための第一腔およびカセットを入れるための第二腔を有する包埋金型を含む。このシステムは、予め決められた量の溶融ワックスを包埋金型に分配する手段を含む。

McCormick の米国特許第5,080,869 号は、組織サンプルを有効に加工処理するためのカセットを記載する。このカセットは、積み重ね可能であり、複数の生検を調製するために使用され得る。このカセットは、一般的に、カセットの底壁の平面と直交および平行の両方の方向で処理流体の通過用にカセットの壁に配置された複数の開口部を含む。このカセットはまた、サンプルの同定用にカセット上にしるしを置きやすくするためカセットの前壁の傾斜伸長部分を含む。さらに、組織学試験用のパラフィン浸漬組織サンプルを調製するのに有用なシステムおよび方法の例は、Kerrodらの米国特許第5,843,700 号、およびMcCormick の同第4,569,647 号に開示される。

組織を包埋、切断するための先行技術の方法が有する問題は、細胞の凝集であり、その結果、目的の細胞は特定の視野に存在しないことがある。従って、組織を構成する細胞がスライド上に乗せられた切片上に多少均等に分布し、それにより目的の特定の細胞型が特定の切片および視野に存在する確率を改良するように切断するための組織を調製するための方法を有することが所望される。

発明の要旨
本発明の第一の目的は、スライド上に乗せるための組織サンプルを処理する方法を提供することである。本発明のさらなる目的は、切断するための組織を調製する方法であって、組織を構成する細胞が実質的に均等に組織調製物およびそれ由来の組織切片中に分布される方法を提供することである。

本発明のまださらなる目的は、切断のための組織を調製および提供するのに操作可能な装置および該装置を使用する方法を提供することである。

本発明の全体的な目的は、試験用に組織サンプルを調製する方法および装置であって、試験者の視野に分布している目的の細胞の確率が組織サンプル調製の先行技術方法と比較して高まった方法および装置を提供することである。

新規であると考えられる本発明の特徴は、添付の特許請求の範囲に詳細に示される。しかし、構成および操作方法の両方に関する本発明自身、ならびにそのさらなる目的および利点は、添付の図面と共に以下の説明を参考として理解されることが最もよいであろう。

発明の詳細な説明
貯蔵および切断のためにサンプリングした組織を調製する方法は、図１に図式で示される。組織サンプル１０は、組織を好適な流動性培地、すなわち一連の流動性培地１１に浸して組織を脱水および／または透明化することにより固体または半固体支持体（例えば、アガロースまたはパラフィン）に包埋するために調製される。次いで、脱水された組織は、ある体積の溶融パラフィン１２に移動され、細胞株を含み得る組織は、細胞分散手段１３（例えば、超音波器または機械的攪拌器）により該体積の溶融物中で断片化され、分配される。

あるいは、パラフィン／細胞スラリーは、冷たいチューブ部分に入る前に暖かい静止混合器チューブ部分を通って押し出される。得られた循環（endless ）プラグ(plug)は均一である。静止混合器は、流れている物質が種々の内部障害物を通過する間に強制的に混合させる市販のチューブまたはパイプである。チューブはしばしば、チューブの中に異なる角度で配置された一連の流れ分割機を有する。チューブは、高温で流れるパラフィン／細胞溶融物のラージスケール均質化を可能にする連続超音波器の一部であり得る。

組織を構成する細胞が該体積の溶融物１４中に分配された後、軸ボア(axial bore)を有するピペット１５は該体積の溶融物をボアに抜き取るために使用される。分配組織を含む該体積の溶融物は、軸ボアの中でその融点以下に冷却される。従って、固まった際、軸ボア内で形成された円柱状プラグは、貯蔵および／または切断のためにピペットから全体的にまたは部分的に押し出され得る。ピペットはまた、組織を貯蔵するために使用され得る。押し出された物質はまた、組織の他の試験（例えば、電子顕微鏡検査または蛍光分光法）に必要な場合、さらに処理され得る。

ピペットは、ミクロトーム２１のレシーバー部２０に配置され、プラグ１４の薄いディスク２２が図２に示されるようにボアから押し出され得る。ミクロトームブレード２３は、プラグから押し出されたディスクを切り離すために前進する。次いで、ディスク２２は、染色および試験のために支持体（例えば、顕微鏡スライド２４）に移動される。従って、軸ボアの直径、プラグおよびディスクの直径は、「ピン様」（約0.1mm の直径を有する）または「ウエハ様」（約1.5cm 以上の直径）であり得る。ピペットは、任意の、好ましくは硬い管状部材であり得る。好ましい材料は、ガラスおよび硬いまたはやや硬いエラストマー（例えば、ポリエチレン、ポリプロピレンまたはポリスチレン）である。チューブの軸ボアへ溶融物を抜き取る手段としては、減圧吸引、遠心分離および毛管現象が挙げられる。減圧吸引の好ましい手段は、管状部材の軸ボア内に滑動可能に配置されたプランジャー２５である。伝統的なパラフィンが本方法に使用され得るが、好ましい包埋培地はアガロースなどの親水性ゲルである。

上記の顕微鏡試験のために細胞を含む組織の一部を調製する方法の変動において、管状部材は、包埋培地の溶融温度で硬いままであり、かつ例えば、ナイフブレードにより切断することにより自身から容易に切り離し可能なポリマー物質を含む。ポリマー管状部材の軸ボア内の包埋組織の円柱状プラグは、乗せる前にボアから押し出される必要はない。代替方法によると、組織の一部はある体積の流動性包埋培地(fluid embedding medium)に置かれ、次いで、組織を構成する細胞はその一部を構成する細胞が該体積の溶融流動性包埋培地中で実質的に均一に分布するまで粉砕される。該体積の流動性包埋培地の一部は、ポリマー管状部材の軸ボアに抜き取られ、軸ボア内で凝固して円柱状プラグを形成することが可能である。円柱状プラグが形成された後、管状部材の一部（円柱状プラグの一部を含む）は、次いで、横方向に切断され、またはさもなければ管状部材の残りから切り離されて、切り離された部分を形成する。次いで、ポリマー管状部材の一部を含む環により周囲に境界があり、環内に含まれる包埋細胞の薄いディスクを含む切り離された部分は、硬い支持体基材上に乗せられる。

複数かつ異なる組織または細胞を含む調製物を作製することが利点である。

本発明の別の局面において、１つの端が移動可能ストッパー（３３）に接続された多数のボアホール（３２）を有する加熱または冷却金属ブロック（３１）は、同じまたは異なる組織または細胞を含む好適な液体（３４）でそれぞれ充填され得る。超音波または他の機械的動き（３５）を全ブロックに適用することにより、細胞は各ボアホールにおいて均等に分散される。

金属ブロックは冷却可能であり、各ホールで液体を凝固可能である。金属ブロックに取り付けられた容器（４２）に向けてプラグを上方へまたは下方へ部分的に圧力をかけまたは押す（４１）ことにより、プラグは容器内で自由に並行する（４３）。

容器（４１）は、好ましくはより低い融点を有するパラフィンで充填され、冷却することで凝固し、プラグを覆う（４４）ことが可能である。

得られたパラフィンまたはゲルは、切断される（cut ）（４５）かまたは切断され（sectioned ）各プラグ由来のスライドを含むパラフィンまたはゲルの薄い口（４６）を得る。薄い薄片は、スライド（４７）に乗せられ、顕微鏡での組織の検査用に必要なようにさらに処理される。

本発明の方法によると、切片のサイズは制御され得、組織を構成する細胞はプラグ内で実質的に均質に分布し、従って、切片がそこから取り出される。本発明の特定の態様が示され記載されたが、種々の他の変更および修正が本発明の趣旨および範囲から逸脱せずになされ得ることは当業者に明らかである。例えば、チューブの軸ボアに移動された後にそのまま凝固され得る任意の流動性包埋培地、流体への触媒の添加、またはUV照射は、本方法に使用され得る。従って、本発明の範囲内であるかかる変更および修正の全てを添付の特許請求の範囲で保護することが意図される。

図１は、本発明の組織サンプル調製のために使用される工程の順序を示した概略図である。 図２は、切断に好適な円柱状組織生検を形成するのに操作可能なピペットの好ましい態様の縦切断図である。 図３は、多数のボアホールを使用する好ましい態様の工程の順序を示した概略図である。 図４は、多数のボアホールを使用する好ましい態様の工程の順序を示した概略図である。

Claims (4)

1. （ａ）組織の一部をある体積の流動性包埋培地に置く工程、次いで
   （ｂ）該一部を構成する細胞が該体積の流動性包埋培地中で実質的に均一に分布されるまで該一部を粉砕する工程、次いで
   （ｃ）該体積の流動性包埋培地の一部を管状部材の軸ボアに導入する工程、次いで
   （ｄ）該軸ボア中の該流動性包埋培地を凝固させて円柱状のプラグを形成する工程；次いで
   （ｅ）該円柱状のプラグの一部を該軸ボアから押出し、該円柱状プラグの一部を切り離して、切り離し部分を形成する工程、次いで
   （ｆ）該円柱状プラグの切り離し部分を硬い支持体基材に乗せる工程
   を含む、顕微鏡試験用の細胞を含む組織の一部を調製するための方法。
2. 前記組織が細胞株である請求項１記載の方法。
3. 同じおよび／または異なる前記流動性包埋培地を少なくとも２つのボアホールへ導入し、少なくとも２つの形成されたプラグを押出し、該少なくとも２つのプラグを含む新しいプラグを形成する、請求項１または２記載の方法。
4. （ａ）組織の一部をある体積の流動性包埋培地に置く工程、次いで
   （ｂ）該一部を構成する細胞が該体積の流動性包埋培地中で実質的に均一に分布されるまで該一部を粉砕する工程、次いで
   （ｃ）該体積の流動性包埋培地の一部を管状部材の軸ボアに導入する工程、次いで
   （ｄ）該軸ボア中の該流動性包埋培地を凝固させて円柱状のプラグを形成する工程；次いで
   （ｅ）該円柱状のプラグの一部を含む該管状部材の一部を該管状部材から切り離し、切り離し部分を形成する工程、次いで
   （ｆ）該管状部材および円柱状プラグの切り離し部分を硬い支持体基材に乗せる工程
   を含む、顕微鏡試験用の細胞を含む組織の一部を調製するための方法。

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