MXPA00012063A - Protesis de soporte de injerto vascular biodisenadas. - Google Patents

Abstract

La invencion esta dirigida a protesis de soporte de injerto vascular biodisenadas, preparadas a partir de material de tejido limpio derivado de fuentes animales; las protesis de injerto vascular biodisenadas de la invencion se preparan usando metodos que conservan la compatibilidad de las celulas, resistencia y capacidad de biorremodelacion de la matriz de tejido procesada; las protesis de injerto biodisenadas se usan para implantacion, reparacion o en un mamifero hospedero.

Description

PRÓTESIS DE SOPORTE DE INJERTO VASCULAR BIODISEÑADAS CAMPO DE LA INVENCIÓN Esta invención está en el campo de tejido biodiseñado. La invención está dirigida a prótesis de injerto biodiseñadas preparadas a partir de material de tejido limpio derivado de fuentes animales. Las prótesis de injerto biodiseñadas de la invención se preparan utilizando métodos que conservan la compatibilidad, resistencia, y capacidad de biorremodelación de célula de la matriz de tejido. Las prótesis de injerto biodiseñadas se utilizan para implante, reparación, o para uso en un hospedero mamífero.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN El campo de bioingeniería de tejido combina los métodos de ingeniería con los principios de ciencia de vida para entender las relaciones estructurales y funcionales en tejidos normales y patológicos de mamífero. El objetivo de ingeniería de tejido es el desarrollo y aplicación final de sustitutos biológicos para restaurar, mantener, y mejorar las funciones de tejido. El colágeno es la proteína estructural principal en el cuerpo y constituye aproximadamente una tercera parte de la proteína corporal total. Comprende la mayor parte de la materia orgánica de la piel, tendones, huesos, y dientes y ocurre como inclusiones fibrosas en la mayoría de las otras estructuras corporales. Algunas de las propiedades del colágeno son su alta resistencia a la tensión; su baja antigenicidad, debido en parte a encubrimiento de determinantes antigénicos potenciales por la estructura de hélice; y su baja extensibilidad, semipermeabilidad, y solubilidad. Además, el colágeno es una sustancia natural para adhesión celular. Esas propiedades y otras hacen al colágeno un material adecuado para ingeniería de tejido y fabricación de sustitutos biológicos implantables y prótesis biorremodelables. Los métodos para obtener tejido colagenoso y estructuras de tejido a partir de tejido de mamífero explantado y los procedimientos para construir prótesis a partir de tejido, han sido investigados ampliamente para reparación quirúrgica o para reemplazo de tejido u órgano. Es un objetivo continuo de los investigadores desarrollar prótesis que se pueden utilizar de manera exitosa para reemplazar o reparar tejido de mamífero.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Los materiales colagenosos derivados biológicamente tales como submucosa intestinal han sido propuestos por muchos investigadores para utilizarse en reparación o reemplazo de tejido. Están descritos los métodos para el procesamiento mecánico y químico del yeyuno porcino proximal para generar una sola capa acelular de colágeno intestinal (ICL) que se puede utilizar para formar laminados para aplicaciones bioprostéticas. El procesamiento remueve células y desperdicios celulares mientras que mantiene la estructura de colágeno original. La lámina resultante de matriz de tejido procesada se utiliza para fabricar construcciones laminadas de capas múltiples con especificaciones deseadas. Se ha investigado la eficiencia de parches laminados para reparación de tejido blando así como el uso de ICL entubado como un soporte para injertos vasculares. Este material provee el soporte físico necesario y es capaz de integrarse en el tejido original que rodea e infiltrarse con células hospedero. La remodelación in vivo no compromete la integridad mecánica. Las propiedades intrínsecas y funcionales del implante, tal como el módulo de elasticidad, retención de sutura y UTS son parámetros importantes que se pueden manipular para requerimientos específicos variando el número de capas de ICL y las condiciones de entrelazamiento.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Esta invención está dirigida a una prótesis de tejido diseñada, la cual, cuando se implanta en un mamífero hospedero, puede servir como reparación de funcionamiento, aumento, o reemplazo de parte corporal o estructura de tejido, y padecerá biodegradación controlada que ocurre de manera concomitante con la remodelación mediante las células del hospedero. Las prótesis de esta invención, cuando se utilizan como un tejido de reemplazo, tienen de esta manera propiedades dobles: primera, funciona como una parte de sustituto corporal, y segunda, mientras aún funciona como una parte de sustituto corporal, funciona como un patrón de remodelación para el crecimiento interior de células hospedero. Con el fin de lograr esto, el material prostético de esta invención es una matriz de tejido procesada desarrollada a partir de tejido colagenoso derivado de mamífero que es capaz de unirse a sí mismo u a otra matriz de tejido procesada para formar una prótesis para injerto a un paciente. La invención se dirige hacia métodos para fabricar prótesis de tejido diseñada a partir de material de tejido limpio en donde los métodos no requieren adhesivos, suturas, o grapas para unir las capas juntas mientras se mantiene la capacidad de biorremodelación de la prótesis. Los términos "matriz de tejido procesada" y "material de tejido procesado", significan tejido celular normalmente original que ha sido procurado a partir de una fuente animal, preferiblemente un mamífero, y limpiado de manera mecánica de tejidos auxiliares y limpiado químicamente de células, desechos celulares, y se ha vuelto sustancialmente libre de componentes de matriz extracelular no colagenosos. La matriz de tejido procesada, aunque está sustancialmente libre de componentes no colagenosos, mantiene mucha de su estructura, resistencia y forma de matriz original. Las composiciones preferidas para preparar los injertos biodiseñados de la invención son tejidos animales que comprenden colágeno, incluyendo, pero no limitado a: intestino, fascia lata, pericardio, dura mater, y otros tejidos de estructuras planas o aplanadas que comprenden una matriz de tejido colagenoso. La estructura plana de esas matrices de tejido las hace capaces de ser fácilmente limpiadas, manipuladas, y ensambladas en una forma para preparar los injertos biodiseñados de la invención. Otras fuentes de tejido colagenoso adecuadas con la misma estructura de lámina plana y composición de matriz se pueden identificar por el experto en la técnica en otras fuentes animales. Una composición más preferida para preparar los injertos biodiseñados de la invención es una capa de colágeno intestinal derivada de la túnica submucosa del intestino delgado. Las fuentes adecuadas para intestino delgado son organismos de mamífero tal como humano, vaca, cerdo, oveja, perro, cabra, o caballo, aunque el intestino delgado del cerdo es la fuente preferida. La composición más preferida para preparar la prótesis de la invención es una capa de colágeno intestinal procesada derivada de la túnica submucosa del intestino delgado porcino. Para obtener la capa de colágeno intestinal procesada, el intestino delgado de un cerdo se cosecha y los tejidos mesentéricos auxiliares se seccionan del intestino. La túnica submucosa se separa preferiblemente, o se deslamina, de las otras capas del intestino delgado mediante exprimido mecánico del material intestinal crudo entre rodillos opuestos para remover las capas musculares (túnica muscularis) y la mucosa (túnica mucosa). La túnica submucosa del intestino delgado es más dura y rígida que el tejido que la rodea, y los rodillos exprimen los componentes más suaves de la submucosa. En los ejemplos que siguen, la túnica submucosa fue cosechada mecánicamente a partir de intestino delgado porcino utilizando una máquina limpiadora de intestino Bitterling y después se limpió químicamente para rendir una matriz de tejido limpia. Esta capa de colágeno intestinal químicamente y mecánicamente limpia es referida en la presente como "ICL". La ICL procesada es esencialmente colágeno telopéptido acelular, aproximadamente 93% en peso seca, con menos de 5% en peso seco de glicoproteínas, glicosaminoglicanos, proteoglicanos, lípidos, proteínas no colagenosas y ácidos nucleicos tales como ADN y ARN y está sustancialmente libre de células y deshechos celulares. La ICL procesada retiene mucho de su estructura de matriz y su resistencia. De manera importante, la capacidad de biorremodelación de la matriz de tejido se conserva en parte mediante el procedimiento de limpieza ya que está libre de residuos detergentes sueltos que afectarían de forma adversa la capacidad de biorremodelación del colágeno. Adicionalmente, las moléculas de colágeno han retenido sus regiones telopéptidas ya que el tejido no ha padecido tratamiento con enzimas durante el procedimiento de limpieza. Las capas de colágeno del dispositivo prostético pueden ser del mismo material de colágeno, tal como dos o más capas de ICL, o de materiales de colágeno diferentes, tal como una o más capas de ICL y una o más capas de fascia lata. Las matrices de tejido procesadas se pueden tratar o modificar, ya sea físicamente o químicamente, antes de la fabricación de una prótesis de injerto biodiseñada.

Se pueden realizar modificaciones físicas tales como formación, acondicionamiento mediante estiramiento y relajación, o perforación de las matrices de tejido procesadas así como modificaciones químicas tales como unir factores de crecimiento, componentes de matriz extracelular seleccionados, material genético, y otros agentes que afectarían la biorremodelación y reparación de la parte corporal siendo tratada, reparada o reemplazada. Ya que ICL es el material de partida preferido para la producción de las prótesis de injerto biodiseñadas de la invención, los métodos descritos enseguida son los métodos preferidos para producir prótesis de injerto biodiseñadas que comprenden ICL. En la modalidad más preferida, la túnica submucosa de intestino delgado porcino se utiliza como un material de partida para las prótesis de injerto biodiseñadas de la invención. El intestino delgado de un cerdo se cosecha, sus tejidos auxiliares se remueven y después se limpia mecánicamente utilizando una máquina de limpieza de intestinos la cual mediante fuerza remueve la grasa, músculo y capas mucosales de la túnica submucosa utilizando una combinación de acción mecánica y lavado utilizando agua. La acción mecánica se puede describir como una serie de rodillos que comprimen y desprenden las capas sucesivas de la túnica submucosa cuando el intestino intacto corre entre ellos. La túnica submucosa del intestino delgado es comparativamente más dura y rígida que el tejido que la rodea, y los rodillos exprimen los componentes más suaves de la submucosa. El resultado de la limpieza a máquina fue tal que la capa submucosal del intestino fue lo único que quedó. Después de la limpieza mecánica, se utiliza un tratamiento de limpieza química para remover los componentes celulares y de matriz, preferiblemente realizado bajo condiciones asépticas a temperatura ambiente. El intestino se corta después longitudinalmente hasta el lumen y después se corta en secciones de láminas de 15 cm2. El material se pesa y se coloca en contenedores en una relación de 100:1 v/v de solución a material intestinal. En el tratamiento de limpieza química más preferido, como el método descrito en la solicitud internacional de PCT WO 98/49969, la descripción de la cual se incorpora a la presente, el tejido colagenoso se pone en contacto con un agente quelatador, tal como sal tetrasódica de etilendiamintetracético (EDTA) bajo condiciones alcalinas, preferiblemente mediante la adición de hidróxido de sodio (NaOH); seguido por contacto con un ácido en donde el ácido contiene una sal, preferiblemente ácido clorhídrico (HCl) que contiene cloruro de sodio (NaCI); seguido por contacto con una solución salina de H regulado tal como cloruro de sodio (NaCI) 1 M solución salina regulada de fosfato (PBS) /10 mM: seguido finalmente por un paso de enjuague utilizando agua. Cada paso de tratamiento se lleva a cabo preferiblemente utilizando una plataforma giratoria o de agitación. Después del enjuague, el agua se remueve de cada contenedor y a la ICL se le absorbe el exceso de agua utilizando toallitas absorbentes esterilizadas. En este punto, la ICL se puede almacenar congelada a -80°C a 4°C en regulador de pH de fosfato estéril, o secarse hasta que se utilice en la fabricación de una prótesis. Si se va almacenar en seco, las láminas de ICL se aplanan en una superficie tal como una placa plana, preferiblemente una placa o membrana, tal como una lámina de policarbonato rígida, y cualesquier marcas linfáticas del lado abluminal del matepal se remueve utilizando un escalpelo, y las láminas de ICL se permiten secar en una campana de flujo laminar a temperatura y humedad ambiente. La ICL es una estructura de lámina plana que se puede utilizar para fabricar varios tipos de construcciones que se utilizarán como una prótesis con la forma de la prótesis dependiendo finalmente del uso diseñado. Para formar las prótesis de la invención, las construcciones se deben fabricar utilizando un método que conserve la capacidad de biorremodelación del material de matriz procesada pero también sea capaz de mantener su resistencia y características estructurales en su rendimiento como un tejido de reemplazo. Las láminas de matriz de tejido procesadas se forman en capas para contactar otra lámina o se forman de manera tubular y se envuelven sobre sí mismas. El área de contacto es una región de unión en donde las capas hacen contacto. La región de unión debe ser capaz de soportar suturación y estiramiento durante la implantación y en la fase inicial de cicatrización hasta que las células del paciente formen población y de manera subsecuente biorremodelen la prótesis para formar un nuevo tejido. Cuando se utiliza como un conducto o un ducto, la región de unión debe ser capaz de soportar presiones de la materia que contiene o que está pasando, particularmente cuando se utiliza como un injerto vascular bajo las presiones sistólicas y diastólicas del flujo del sistema sanguíneo. En una modalidad preferida, el dispositivo prostético de esta invención es una construcción tubular formada a partir de una sola lámina generalmente rectangular de matriz de tejido procesada. La matriz de tejido procesada se enrolla de manera que un borde coincide y traslapa un borde opuesto. El traslape sirve como una región de unión. Como se utiliza en la presente, "región de unión" significa un área de contacto entre dos o más capas de la misma o de matriz de tejido procesado diferente tratada de tal manera que las capas están sobreimpuestas una sobre otra y se sostienen juntas de manera suficiente mediante autolaminación y enlace químico. Por ejemplo, una construcción de lámina de capas múltiples de ICL se utiliza para reparar estructuras de pared corporal tal como un parche pericardíaco o un dispositivo de reparación de hernias, se pueden utilizar construcciones tubulares para reparar órganos tubulares que sirven como conductos tal como vasculatura o estructuras de tracto digestivo o se utilizan como un tubo de crecimiento de neurona para guiar la regeneración de nervios. También se pueden implantar para formación de volumen y aumento de tejido. Un número de capas de ICL se puede incorporar en las construcciones para indicaciones de formación de volumen o resistencia. Antes de la implantación, las capas se pueden tratar adicionalmente o recubrirse con colágeno u otros componentes de matriz extracelular, ácido hialurónico, o heparina, factores de crecimiento, péptidos o células cultivadas.

En una modalidad preferida, una lámina de ICL se forma en una prótesis tubular. El tubo de ICL se puede fabricar en varios diámetros, longitudes y número de capas y puede incorporar otros componentes dependiendo de la indicación para su uso. La construcción tubular de ICL se puede utilizar como un injerto vascular. Para esta indicación, el injerto comprende al menos una capa con al menos un traslape de 5% para actuar como una región de unión que forma una costura apretada y la superficie laminar es preferiblemente tratada con heparina o un agente que evita trombosis. Otros medios para evitar trombosis son conocidos en la técnica de fabricación de construcciones vasculares. En otra indicación vascular, la construcción tubular de ICL se forma sobre una endoprótesis de metal (stent) para proveer una cubierta para el stent. Cuando se implanta, la ICL beneficia al receptor al proveer una cubierta protectora blanda para el stent, para evitar daño adicional a tejido hospedero durante el despliegue. Las prótesis tubulares de ICL también se pueden utilizar para reparar o reemplazar otras estructuras normalmente tubulares tales como secciones de tracto gastrointestinal, uretra, ductos, etc. También se pueden utilizar en reparación del sistema nervioso cuando se fabrican en un tubo para crecimiento de nervio empacado con componentes de matriz extracelular, factores de crecimiento o células cultivadas. En otra indicación vascular preferida, la construcción tubular de ICL se puede utilizar como un stent externo en casos en donde vasos sanguíneos dañados o enfermos o vasos de autoinjerto requieren soporte exterior. En una de dichas indicaciones, los autoinjertos de vena se transplantan dentro del cuerpo y se desea el soporte externo para la vena transplantada. Antes de que el vaso transplantado esté completamente anastomosado a la vasculatura existente, el vaso se hace pasar primero a través del lumen de un tubo de ICL. El vaso después es anastomosado y después los extremos del tubo de ICL son asegurados para mantener la posición de la construcción. Para formar una construcción tubular, se selecciona un mandril con una medición de diámetro que determinará el diámetro de la construcción formada. El mandril es preferiblemente cilindrico u oval en sección transversal y fabricado de vidrio, acero inoxidable o una composición de grado médico no reactiva. El mandril puede ser recto, curvo, en ángulo, puede tener ramificaciones o bifurcaciones, o un número de esas cualidades. El número de capas diseñadas para la construcción tubular que se formará corresponde con el número de veces que una ICL se envuelve alrededor de un mandril y sobre sí misma. El número de veces que la ICL se puede envolver depende del ancho de la lámina de ICL procesada. Para una construcción tubular de dos capas, el ancho de la lámina debe ser suficiente para envolver la lámina alrededor del mandril al menos dos veces. Es preferible que el ancho sea suficiente para envolver la lámina alrededor del mandril el número requerido de veces más un porcentaje adicional como un traslape para servir como una región de unión, para una construcción de una sola capa, preferiblemente entre 5% a 20% de la circunferencia del mandril para servir como una región de unión y para formar una costura apretada. De manera similar, la longitud del mandril dictará la longitud del tubo que se puede formar en el mismo. Para facilidad de manejo de la construcción sobre el mandril, el mandril debe ser más largo que la longitud de la construcción de manera que el mandril, y no la construcción que se forma, se pone en contacto cuando se maneja. La ICL tiene una calidad de lateralidad derivada de su estado tubular original. La ICL tiene dos superficies opuestas: una superficie mucosa que enfrenta el lumen intestinal y una superficie serosa que previamente tuvo tejidos intestinales exteriores adheridos a la misma, tal como mesenterio y vasculatura. Se ha descubierto que esas superficies tienen características que pueden afectar el rendimiento post-operativo de la prótesis pero que se pueden apalancar para rendimiento de dispositivo mejorado. En la formación de una construcción tubular para utilizarse como un injerto vascular, se prefiere que la superficie mucosa del material sea la superficie luminal del injerto tubular cuando se forma. En aplicaciones vasculares, tener la superficie mucosa en contacto con el flujo sanguíneo provee una ventaja ya que tiene algunas propiedades no trombogénicas que se prefieren para evitar la oclusión del injerto cuando ha sido implantado en un paciente. En otras construcciones tubulares, la orientación de la capa de la construcción depende del uso diseñado. Se prefiere que el mandril esté provisto con una cubierta de un material de goma o látex, elástico, de calidad de grado médico, no reactivo, en forma de un manguito. Aunque una construcción tubular de ICL se puede formar directamente sobre la superficie del mandril, el manguito facilita la remoción del tubo formado del mandril y no se adhiere a, reacciona con, o deja residuos sobre la ICL. Para remover la construcción formada, el manguito se puede jalar desde un extremo del mandril para llevar la construcción desde el mandril con el mismo. Debido a que la ICL procesada sólo se adhiere ligeramente al manguito y es más adherente a otras capas de ICL, la fabricación de tubos de ICL se facilita ya que la construcción en forma de tubo se puede remover del mandril sin estirar o tensar de otra manera o arriesgar daño a la construcción. En la modalidad más preferida, el manguito comprende KRATON® (Shell Chemical Company), un hule termoplástico compuesto de copolímeros de estireno-etileno/butileno-estireno con un bloque intermedio saturado muy estable. Para sencillez en ilustración, se forma una construcción tubular de dos capas con un diámetro de 4 mm y un traslape de 10% sobre un mandril que tiene aproximadamente 4 mm de diámetro. El mandril se provee con un manguito de KRATON® aproximadamente tan largo como la longitud del mandril y más largo que la construcción que se formará sobre él. Una lámina de ICL se corta de manera que la dimensión de ancho es de aproximadamente 28 mm y la dimensión de longitud puede variar dependiendo de la longitud deseada de la construcción. En el campo estéril de un gabinete de flujo laminar, la ICL se forma después en un tubo de colágeno de ICL mediante el siguiente procedimiento. La ICL se humedece a lo Jargo de un borde y se alinea con el mandril cubierto con manguito y, haciendo palanca con la naturaleza adhesiva de la ICL se adhiere a lo largo del mandril con cubierta de manguito y se seca en posición durante al menos 10 minutos o más. La ICL adherida se hidrata después y se envuelve alrededor del mandril y después sobre si misma una vuelta completa más 10% de la circunferencia, para un traslape de 110%, para servir como una región de unión y para proveer una costura apretada. Para obtener una construcción tubular con el lado mucosal de la ICL como el lumen de la construcción formada, el Jado mucosal de la ICL se humedece a lo largo de un borde, se adhiere sobre el mandril, y se envuelve de manera que el lado mucosal de la ICL enfrente al mandril. Para la formación de una construcción tubular de una sola capa, la ICL debe ser capaz de envolverse alrededor del mandril una vuelta completa y al menos aproximadamente un 5% de vuelta adicional como un traslape para proveer una región de unión que es igual a 5% de la circunferencia de la construcción. Para una construcción de dos capas, la ICL debe ser capaz de envolverse alrededor del mandril al menos dos veces y preferiblemente 5% a 20% adicionales de vuelta como un traslape. Aunque la envoltura de dos capas provee una jregión de unión de 100% -ent . Jas superficies de ICL, el porcentaje adicional para traslape asegura una costura apretada, impermeable. Para una construcción de tres capas, la JCL debe ser capaz de envolverse alrededor del mandril al menos tres veces y preferiblemente 5% a 20% adicionales de vuelta como un traslape. La construcción se puede preparar con cualquier número de capas dependiendo de las especificaciones para un injerto requerido por la indicación diseñada. Típicamente, una construcción tubular tendrá 10 capas o menos, preferiblemente entre 2 a 6 capas y más preferiblemente 2 ó 3 capas con grados variable de traslape. Después de envolverse, cualesquier burbujas de aire, pliegues y dobleces se aplanan por debajo del material y entre las capas. La ICL se puede enrollar ya sea manualmente o con la asistencia de un aparato que auxilia para tensionamiento uniforme y alisado de burbujas de aire o de agua o crestas que pueden ocurrir bajo el mandril o entre las capas de ICL. El aparato tendría una superficie que el mandril puede contactar a lo largo de su longitud conforme gira para envolver la ICL. Las capas de la ICL envuelta se unen después juntas deshidratándolas mientras que están en disposición de envoltura sobre el mandril con cubierta de manguito. Aunque no se desea estar limitado por la teoría, la deshidratación trae a los componentes de matriz extra celulares, tales como fibras de colágeno, en las capas juntos cuando el agua se remueve de los espacios entre las fibras en la matriz. La deshidratación se puede realizar en aire, en un vacío, o por medios químicos tal como mediante acetona o un alcohol tal como alcohol etílico o alcohol ¡sopropílico. La deshidratación se puede hacer a humedad ambiente, normalmente entre 10% Rh a 20% Rh, o menos; o aproximadamente 10% a 20% de humedad en peso. La deshidratación se puede realizar fácilmente poniendo en ángulo el mandril con las capas de ICL en flujo de aire entrante del gabinete de flujo laminar durante al menos 1 hora hasta 24 horas a temperatura ambiente, aproximadamente 20°C y a humedad ambiente. En este punto, las construcciones de ICL deshidratadas envueltas se pueden desprender del mandril a través del manguito o dejarse para procesamiento adicional. Las construcciones se pueden rehidratar en una solución acuosa, preferiblemente agua, transfiriéndolas a un contenedor a temperatura ambiente que contiene agentes de rehidratación durante al menos 10 a 15 minutos para rehidratar las capas sin separarlas o deslaminarlas. Las construcciones después son entrelazadas juntas contactándolas con un agente de entrelazamiento, preferiblemente un agente de entrelazamiento químico que conserva la capacidad de biorremodelación del material de ICL. Como se mencionó anteriormente, la deshidratación trae a los componentes de matriz extracelulares de capas de ICL adyacentes juntas para entrelazamiento de esas capas del material envuelto junto para formar enlaces químicos entre los componentes y de esta manera unir juntas las capas. De manera alternativa, las construcciones se pueden rehidratar antes de entrelazamiento contactando una solución acuosa, preferiblemente agua, transfiriéndolas a un contenedor a temperatura ambiente que contiene agente de rehidratación durante al menos 10 a 15 minutos para rehidratar las capas sin separarlas o deslaminarlas. El entrelazamiento del dispositivo prostético unido también provee resistencia y durabilidad al dispositivo para mejorar las propiedades de manejo. Son conocidos varios tipos de agentes de entrelazamiento en la técnica y se pueden utilizar tales como ribosa y otros azúcares, agentes oxidativos y métodos deshidrotérmicos (DHT). Un agente de entrelazamiento preferido es clorhidrato de 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida (EDC). En otro método preferido se añade sulfo-N-hidroxisuccinimida al agente de entrelazamiento de EDC como se describe por Staros, J.V., Biochem. 21, 3950-3955, 1982. Aparte de los agentes de entrelazamiento químicos, las capas se pueden unir juntas por otros medios tales como con gomas basadas en fibrina o adhesivos de grado médico tales como poliuretano, acetato de vinilo o poliepoxi. En el método más preferido, EDC se solubiliza en agua a una concentración preferiblemente de entre 0.1 mM a 1QQ mM,. más preferiblemente entre 1.0 mM a 10 mM, más preferiblemente a 1.0 mM. Además de agua, solución salina regulada de fosfato o regulador de pH de ácido (2-[N-morfolino]etanosulfónico) (MES) se puede utilizar para disolver el EDC. Además, otros agentes se pueden añadir a la solución tal como acetona o un alcohol se puede añadir hasta 99% v/v en agua para hacer el entrelazamiento más uniforme y eficiente. La solución de entrelazamiento de EDC se prepara inmediatamente antes de uso ya que EDC perderá su actividad con el tiempo. Para contactar el agente de entrelazamiento a la LCLr las construcciones hidratadas, unidas de ICL, se transfieren a un contenedor tal como una charola poco profunda y el agente de entrelazamiento se decanta suavemente a la charola asegurando que las capas de ICL están cubiertas y flotando libremente y que no están presentes burbujas de aire abajo o dentro de las capas de las construcciones de ICL. La charola se cubre y las capas de ICL se permiten entrelazarse durante entre 4 a 24 + 2 horas después de cuyo tiempo la solución de entrelazamiento es decantada y desechada. Las construcciones se enjuagan en la charola contactándolas con un agente de enjuague para remover agente de entrelazamiento residual. Un agente de enjuague preferido es agua u otra solución acuosa. Preferiblemente, se logra un enjuague suficiente contactando las construcciones unidas químicamente tres veces con volúmenes ¡guales de agua estéril durante cinco minutos para cada enjuague. Sí las construcciones no han sido removidas de los mandriles, se pueden remover en este punto jalando los manguitos de los mandriles. Después se permite que las construcciones se sequen y cuando se secan, el manguito se puede remover del lumen de las construcciones simplemente jalando uno de los extremos libres. En modalidades en donde las construcciones se utilizarán como un injerto vascular, las construcciones se vuelven no trombogénícas aplicando heparina al lumen del tubo formado. La heparina se puede aplicar a la prótesis, mediante una variedad de técnicas bien conocidas. Para ilustración, la heparina se puede aplicar a la prótesis de las siguientes tres formas. Primera, se aplica a la prótesis una solución de heparina de benzalconio y alcohol isopropílico (BA-Hep) llenando verticalmente el lumen o sumergiendo la prótesis en la solución y después secándola al aire. Este procedimiento trata el colágeno con un complejo de BA-Hep de unión iónica. Segunda, EDC se puede utilizar para activar la heparina y después para enlazar de manera covalente la heparina a la fibra de colágeno. Tercera, EDC se puede utilizar para activar el colágeno, después unir de manera covalente protamina al colágeno y después unir iónicamente heparina a la protamina. Muchos otros procedimientos de recubrimiento, unión y adhesión son bien conocidos en la técnica y también podrían ser utilizados. Las construcciones se esterilizan después de manera terminal utilizando medios conocidos en la técnica de esterilización de dispositivos médicos. Un método preferido de esterilización es contactando las construcciones con tratamiento de ácido peracético (PA) estéril al 0.1 % neutralizado con una cantidad suficiente de 10 N hidróxido de sodio (NaOH), de acuerdo con patente de E.U.A. No. 5,460,962, la descripción de la cual se incorpora a la presente. La descontaminación se realiza en un contenedor sobre una plataforma de agitación, tal como contenedores de 1 L Nalge, durante aproximadamente 18 ± 2 horas. Las construcciones se enjuagan después contactándolas con tres volúmenes de agua estéril durante 10 minutos cada enjuague. Las construcciones de la invención también se pueden esterilizar utilizando irradiación gama. Las construcciones se empacan en contenedores fabricados de material adecuado para irradiación gama y se sellan utilizando un sellador al vacío, los cuales a su vez se colocan en bolsas herméticas para irradiación gama entre 25.0 y 35.0 kGy. La irradiación gama de manera significante, pero no perjudicial, disminuye el módulo de Young y la temperatura de encogimiento. Las propiedades mecánicas después de la irradiación gamma aún son suficientes para uso en una escala de aplicaciones y gama es un medio preferido para esterilización ya que se utiliza ampliamente en el campo de dispositivos médicos implantables. Las prótesis tubulares se pueden utilizar, por ejemplo, para reemplazar secciones transversales de órganos tubulares tal como vasculatura, esófago, tráquea, intestino, y tubos de falopio. Esos órganos tienen una forma básica tubular con una superficie exterior y una superficie laminal interior. Las láminas planas también se pueden utilizar para soporte de órgano, por ejemplo, para soportar órganos prolapsados o hipermóviles utilizando la lámina como un cabestrillo para los órganos, tal como vejiga o uretra. Además, las láminas planas y las estructuras tubulares se pueden formar juntas para formar estructuras complejas para reemplazar o ^aumentar válvulas cardiacas o venosas. Las prótesis de injerto biodiseñadas de la invención se pueden utilizar para reparar o reemplazar estructuras corporales que han sido dañadas o están enfermas, en tejido hospedero. Aunque funcionan como una parte de sustituto corporal o soporte, las prótesis también funcionan como una estructura de matriz biorremodelable para el crecimiento interior de células hospedero. "Biorremodelación" se utiliza en la presente para significar la producción de colágeno estructural, vascularización, y repoblación celular mediante el crecimiento interior de células hospedero a una proporción casi igual a la proporción de biodegradación, reformación y reemplazo de los componentes de matriz de la prótesis implantada mediante células hospedero y enzimas. La prótesis de injerto retiene sus características estructurales mientras que se remodela mediante el hospedero en todos, o sustancialmente todos, los tejidos hospedero, y como tal, es funcional como un análogo del tejido que repara o reemplaza. La temperatura de encogimiento (°C) de la prótesis de matriz de tejido es un indicador del grado de entrelazamiento de matriz. Mientras es más alta la temperatura de encogimiento, más se entrelaza el material. La ICL no entrelazada tiene una temperatura de encogimiento de aproximadamente 68 ± 0.3°C. En la modalidad preferida, las prótesis entrelazadas de EDC deben tener una temperatura de encogimiento entre 68 ± 0.3°C a 75 ± 1°C. Las propiedades mecánicas incluyen integridad mecánica de manera que la prótesis resiste deformación durante biorremodelación, y adicionalmente es dúctil y suturable. El término "dúctil" significa buenas propiedades de manejo para facilidad de uso en la clínica. El término "suturable" significa que las propiedades mecánicas de la capa incluyen retención de sutura lo cual permite que pasen agujas y materiales de sutura a través del material de prótesis en el momento de suturar la prótesis a secciones de tejido original, un proceso conocido como anastomosis. Durante la suturación, dicha prótesis no se debe desgarrar como resultado de las fuerzas de tensión aplicadas a las mismas por la sutura y no se debe desgarrar cuando la sutura es anudada. La capacidad de suturación de la prótesis, es decir, la habilidad de la prótesis para resistir desgarramiento mientras es suturada, se relaciona con la resistencia mecánica intrínseca del material de prótesis, el grosor del injerto, la tensión aplicada a la sutura, y la velocidad a la cual el nudo se jala para cerrarse. La retención de sutura para una prótesis altamente entrelazada de 6 capas planas entrelazada en 100 mM EDC y acetona al 50% es de al menos 6.5 N. La retención de sutura para una prótesis tubular de 2 capas entrelazada en 1 mM EDC en agua es de aproximadamente 3.9 N ± 0.9 N. La resistencia de retención de sutura más baja preferida es de aproximadamente 2 N para una prótesis de 2 capas planas entrelazadas; la fuerza al jalar del cirujano cuando sutura es de aproximadamente 1.8 N. Como se utiliza en la presente, el término "no deformable" significa que las propiedades mecánicas de la prótesis imparten durabilidad de manera que la prótesis no se estira, distiende o se expande más allá de límites normales después de implantación. Como se describe enseguida, el estiramiento total de la prótesis implantada de esta invención está dentro de límites aceptables. La prótesis de esta invención adquiere una resistencia a estiramiento como una función de biorremodelación celular de post implantación mediante reemplazo de colágeno estructural por células hospedero a una velocidad más rápida que la pérdida de resistencia mecánica de los materiales implantados debido a biodegradación y remodelación. El material de tejido procesado de la presente invención es "semipermeable", aun cuando ha sido formado en capas y ha sido enlazado. La semipermeabilidad permite el crecimiento interior de células hospedero para remodelación o para deposición de agentes y componentes que afectarían la capacidad de biorremodelación, el crecimiento interior de células, la prevención o promoción de adhesión, o el flujo sanguíneo. La calidad "no porosa" de la prótesis evita el paso de fluidos diseñados para ser retenidos por la implantación de la prótesis. Por el contrario, se puede formar poros en la prótesis si se requiere una calidad porosa o perforada para una aplicación de la prótesis. La integridad mecánica de la prótesis de esta invención también está en su habilidad de ser drapeada o plegada, así como la habilidad para cortar o recortar la prótesis obteniendo un borde limpio sin deslaminación o desgaste de los bordes de la construcción. Los siguientes ejemplos se proveen para explicar mejor la práctica de la presente invención y no se deben interpretar en ninguna manera para limitar el alcance de la presente invención. Se apreciará que el diseño de dispositivo en su composición, forma y grosores se debe seleccionar dependiendo de la indicación final para la construcción. Aquellos expertos en la técnica reconocerán que se pueden hacer varias modificaciones a los métodos descritos en la presente sin apartarse del espíritu y alcance de la presente invención.

EJEMPLOS EJEMPLO 1 : Limpieza química de intestino delgado porcino mecánicamente limpio.

El intestino delgado de un cerdo se cosechó y se desprendió mecánicamente, utilizando una máquina de limpieza de intestinos Bitterling (Nottingham, Inglaterra) el cual remueve mediante fuerza la grasa, músculo y capas mucosas de la túnica submucosa utilizando una combinación de acción mecánica y lavado utilizando agua. La acción mecánica se puede describir como una serie de rodillos que comprimen y desprenden las capas sucesivas de la túnica submucosa cuando el intestino intacto corre entre ellos. La túnica submucosa del intestino delgado es comparativamente más dura y rígida que el tejido que la rodea, y los rodillos exprimen los componentes blandos de la submucosa. El resultado de la limpieza a máquina fue tal que la capa submucosal del intestino fue lo único que permaneció. El resto del procedimiento se realizó bajo condiciones asépticas y a temperatura ambiente. Las soluciones químicas se utilizaron todas a temperatura ambiente. El intestino se cortó longitudinalmente hasta el lumen y después se cortó en secciones de 15 cm. El material se pesó y colocó en contenedores a una relación de 100:1 v/v de solución a material intestinal. A. A cada contenedor que contiene intestino se añadieron aproximadamente 1 L de solución de 100 mM de sal de tetrasodio etilendiamintetracético esterilizada por filtro de 0.22 µm (mieras) (EDTA)/10 mM de solución de hidróxido de sodio (NaOH). Los contenedores se colocaron después en una tabla de agitación durante 18 horas a 200 rpm. Después de agitación, la solución de EDTA/NaOH se removió de cada botella. B. A cada contenedor se añadió después aproximadamente 1 L de solución de 1 M ácido clorhídrico esterilizada por filtro de 0.22 µm (HCI)/1 M solución de cloruro de sodio (NaCI). Los contenedores se colocaron después sobre una mesa de agitación durante 6 a 8 horas a 200 rpm. Después de agitación, la solución de HCI/NaCI se removió de cada contenedor. C. A cada contenedor se añadió después aproximadamente 1 L de solución de 1 M cloruro de sodio esterilizada por filtro de 0.22 µm (NaCI)/10 mM solución salina regulada de fosfato (PBS). Los contenedores se colocaron después sobre una mesa de agitación durante aproximadamente 18 horas a 200 rpm. Después de agitación, la solución de NaCI/PBS se removió de cada contenedor. D. A cada contenedor se añadió después aproximadamente 1 L de solución de 10 mM PBS esterilizada por filtro de 0.22 µm. Los contenedores se colocaron después sobre una mesa de agitación durante 2 horas a 200 rpm. Después de agitación, la solución salina regulada de fosfato se removió de cada contenedor. E. Finalmente, a cada contenedor se añadió aproximadamente 1 L de agua esterilizada por filtro de 0.22 µm. Los contenedores se colocaron después sobre una mesa de agitación durante 1 hora a 200 rpm. Después de agitación, el agua se removió de cada contenedor. Las muestras de ICL procesadas se cortaron y se fijaron para análisis histológicos. La tinción de hematoxilina y eosina (H&E) y la de tricromo de Masson se realizaron sobre muestras en sección transversal y en sección longitudinal de los tejidos de control y los tratados. Las muestras de ICL procesadas aparecieron libres de células y desechos celulares mientras que las muestras de control no tratadas aparecieron normalmente y como se esperaba con gran número de células.

EJEMPLO 2 Estudio comparativo de otros tratamientos de limpieza para tejido colagenoso Otros métodos para desinfectar y esterilizar tejidos colagenosos que se describen en la patente de E.U.A. No. 5,560,962 a Kemp se compararon a métodos similares descritos por Cook, et al. en la solicitud Internacional PCT WO 98/22158. Los ejemplos 1 , 2 y 3 de Kemp, se hicieron además de un método de ácido peracético no regulado de pH. Intestinos delgados fueron cosechados de 4 cerdos grandes. Los intestinos se procuraron, se desprendió la capa exterior mesentérica, y los intestinos se enjuagaron con agua.

El estudio incluyó 7 condiciones: la condición A se llevó a cabo de acuerdo con la descripción del ejemplo 1 en Cook, et al. de la solicitud Internacional PCT WO 98/22158. La condición B fue una variación de A en que el material intestinal se limpió mecánicamente antes de utilizar el tratamiento químico descrito. Las condiciones C, D, y E fueron llevadas a cabo de acuerdo con los métodos de los ejemplos 1 , 2 y 3 de la patente de E.U.A. No. 5,460,962 a Kemp. En todas las condiciones, se utilizó una relación de 10 a 1 de solución a material, es decir, 100 g de material de tejido se trata con 1 L de solución. A. Material de cada uno de los 4 intestinos se colocó en botellas separadas (n=5) que contienen un litro de solución de ácido peracético al 0.2% en etanol al 5% (pH 2.56) y se agitaron sobre una plataforma de agitación. Después de 2 horas de agitación, la condición A se limpió mecánicamente sobre la máquina para limpieza de intestinos Bitterling. Para las otras 6 condiciones, B hasta G, el intestino se limpió mecánicamente utilizando la máquina para limpieza de intestinos Bitterling antes del tratamiento químico. Después de la limpieza mecánica, piezas representativas de los 4 intestinos se colocaron en botellas que contienen solución para tratamiento químico. Las botellas se agitaron durante 18 ± 2 horas sobre una plataforma. Las 6 condiciones restantes, B hasta G, fueron como sigue: B. Una solución de un litro de ácido peracético al 0.2% en etanol al 5% (pH 2.56) (n=5).

C. Una solución de un litro de ácido peracético al 0.1 % en solución salina regulada de fosfato (pH 7.2) (n=3). D. Una solución de un litro de ácido peracético al 0.1% y 1M de cloruro de sodio (NaCI) (pH 7.2) (n=3). E. Una solución de un litro de ácido peracético al 0.1 % y 1 M NaCI (pH 2.9) (n=3). F. Una solución de un litro de soluciones para "limpieza química" como se mencionó anteriormente en el ejemplo 1 (n=4). G. Una solución de un litro de ácido peracético al 0.1% en agua desionizada, regulada a pH 7.0 (n=2). Después de los tratamientos químicos y mecánicos, todas las condiciones se enjuagaron para un total de 4 veces con agua purificada estéril filtrada. El material tratado mecánicamente y químicamente se tiñó ampliamente para examinar el desecho celular con la hematoxilina de Mayer' s. La evaluación morfológica incluyó técnicas de tinción de Hematoxilina y Eosina, Trichromo de Masson, y Rojo de Alizarina. Los resultados histológicos de varios tratamientos muestran que el método de la condición A rindió un material donde fue difícil remover las capas mucosales sobre Bitterling después de tratamiento químico. El material tuvo que ser corrido a través de Bitterling aproximadamente 10-12 veces extras. El material estuvo muy inflamado primero y tuvo una cantidad significativamente grande de desecho celular sobre la superficie y en la vasculatura del material. El método de la condición B también estuvo muy hinchado y también demostró una cantidad significativamente grande de desecho celular sobre la superficie y en la vasculatura del material. Los métodos de las condiciones C y D rindieron material no hinchado que tiene desecho celular mínimo en la vasculatura. La condición E rindió un material que estuvo ligeramente hinchado y contuvo mínimo desecho celular en la vasculatura. Un equipo de aislamiento de ADN/ARN (Amersham Life Sciences) se utilizó para cuantificar el ADN/ARN residual contenido en los tejidos limpios. Los resultados se resumen en el cuadro 1.

Los análisis morfológicos se correlacionan con la cuantificación de ADN/ARN para mostrar que los regímenes de limpieza de las condiciones A y B resultan en una matriz de tejido colagenoso que permanece altamente celular y que contiene ADN residual como resultado. Los métodos de limpieza de Kemp son mucho más efectivos para la remoción de células y desechos celulares de matrices de tejido colagenoso. Finalmente, el método de limpieza química de la condición F, descrito en la solicitud Internacional PCT No. WO 98/49969 a Abraham, et al. y descrito en el ejemplo 1 , anterior, remueve todas las células y desechos celulares y su ADN/ARN a un nivel indectetable mediante esos métodos.

EJEMPLOS 3 Método para fabricar una construcción de tubo de ICL En el campo estéril de un gabinete de flujo laminar, la ICL se formó en tubos de colágeno de ICL mediante el siguiente procedimiento. Se cortaron marcas linfáticas de la superficie serosal de la ICL. La ICL se secó con toallitas absorbentes estériles para absorber el exceso de agua del material y después se extendió sobre una lámina porosa de policarbonato y se secó en el flujo de aire entrante del gabinete de flujo laminar. Una vez seca, la ICL se cortó en piezas de 28.5 mm x 10 cm para un injerto de dos capas con un traslape de aproximadamente 10%. Para soportar la ICL en la formación de los tubos, un mandril de acero inoxidable cilindrico con un diámetro de 4 mm se cubrió con KRATON®, un material de manguito elástico que facilita la remoción del mandril del tubo de colágeno formado y no se adhiere o reacciona con la ICL. El borde largo de la ICL se humedeció después con agua estéril y se adhirió al mandril y se permitió secar durante 15 minutos para formar una "bandera". Una vez adherida, la ICL se enrolló alrededor del mandril y sobre sí una vuelta completa. Después de que el enrollado estuvo completo, se alisaron burbujas de aire, pliegues y crestas de abajo del material y entre las capas. Los mandriles y construcciones enrolladas se permitieron secar en el flujo de aire entrante del gabinete de flujo laminar durante una hora en el gabinete a temperatura ambiente, aproximadamente a 20°C.

La solución de entrelazamiento químico de 1 mM EDC entrelazada o solución de entrelazamiento de 10 mM EDC/acetona al 25% v/v en agua, en volúmenes de 50 ml por tubo, se prepararon inmediatamente antes de entrelazamiento; EDC perderá su actividad con el tiempo. Los tubos de ICL hidratados se transfirieron después a cualquiera de dos recipientes cilindricos que contienen agente de entrelazamiento. El recipiente se cubrió y se permitió reposar durante 18 + 2 horas en una campana para humo, después de cuyo tiempo la solución de entrelazamiento se decantó y se desechó. Los tubos de ICL se enjuagaron después 3 veces con agua esterilizada durante 5 minutos por enjuague. Los tubos de ICL entrelazada se removieron después del mandril jalando el manguito de Kraton del mandril desde un extremo. Una vez removido, el tubo de ICL que contiene el Kraton se permitió secar durante una hora en la campana. Una vez que se secó, el manguito se removió del lumen del tubo de ICL simplemente jalando desde un extremo. Los tubos de ICL se esterilizaron en ácido peracético al 0.1% a aproximadamente pH 7.0 durante la noche de acuerdo con los métodos descritos en la patente de E.U.A. No. 5,460,962, de propiedad común, la descripción de la cual se incorpora a la presente en su totalidad. Los tubos de ICL se enjuagaron después de solución de esterilización tres veces con agua esterilizada durante 5 minutos por enjuague. Los tubos de colágeno de ICL esterilizados con ácido peracético se secaron después en la campana de flujo laminar y después se empacaron en tubos cónicos de 15 ml estériles hasta la implantación.

EJEMPLO 4 Prueba mecánica de prótesis de tubo de ICL Se midieron varias propiedades mecánicas de una construcción tubular de ICL de dos capas formada a partir de una sola lámina de ICL envuelta alrededor de un mandril con traslape de 20%, entrelazada en 1 mM EDC en agua. La retención de sutura, estallamiento, porosidad (fuga/permeabilidad integral de agua) y prueba de cumplimiento se realizaron de acuerdo con la "Guidance for the Preparation of Research and Marketing Applications for Vascular Graft Prostheses", FDA Draft Document, de agosto de 1993. La retención de sutura, estallamiento y análisis de cumplimiento se realizaron utilizando un sistema de prueba servohidráulica MTS con software TestStar-SX. Los resultados se resumen en el cuadro 2. Brevemente, la prueba de retención de sutura consistió de una sutura siendo jalada 2.0 mm desde el borde de un injerto a una velocidad constante. Se midió la fuerza máxima cuando la sutura se desgarró a través del injerto. La medición promedio obtenida fue por arriba de los límites requeridos indicando que la construcción puede soportar las presiones físicas de suturación en la clínica.

En la prueba de estallamiento, se aplica presión al injerto en incrementos de 0.14 kg/cm2 durante intervalos de un minuto hasta que el injerto estalla. Para referencia, la presión sistólica es de aproximadamente 120 mm Hg (16.0 kPa) en una persona de tensión normal, de esta manera, la resistencia al estallamiento obtenida por la prueba demostró que la construcción podría mantener presiones de hasta 7.75 veces la presión sistólica, indicando de esta manera que la construcción se puede injertar para indicaciones vasculares y soportar los rigores de circulación sanguínea. Para prueba de cumplimiento, el injerto se puso a 80 y 120 mm Hg en sucesión. El diámetro del injerto se midió después en cada presión utilizando software de análisis de imagen y el cumplimiento calculado como (Di -DßoyíDßo x 40 mmHg) x 100%. El cumplimiento de una artería carótida de conejo es de aproximadamente 0.07%/mmHg, la artería humana es de aproximadamente 0.06%/mmHg y la vena humana es de aproximadamente 0.02%/mmHg, indicando que la construcción exhibe el cumplimiento requerido para servir como un injerto vascular. Para medir la porosidad, PBS bajo presión hidrostática de 120 mmHg se aplica al injerto. El volumen de PBS que penetra a través del injerto durante un período de 72 horas se normalizó al tiempo y área de superficie del injerto para calcular la porosidad. La temperatura de encogimiento se utiliza para supervisar el grado de entrelazamiento en un material colagenoso. Mientras más se entrelaza un injerto, se requiere más energía, por lo tanto una temperatura de encogimiento más alta. Un calorímetro de evaluación diferencial se utilizó para medir el flujo de calor a y desde una muestra bajo condiciones térmicamente controladas. La temperatura de encogimiento se definió como la temperatura de surgimiento del punto máximo de desnaturalización en la gráfica de temperatura-energía. La retención de sutura está bien por arriba de los 2 N sugeridos para suturar una prótesis en un paciente; una fuerza al jalar de un cirujano cuando sutura es de 1.8 N. La resistencia de estallamiento sobre siete veces la presión sistólica. El cumplimiento está en la escala de arterias y venas humanas. La porosidad en el tubo de ICL es baja comparada con un injerto tejido; el tubo de ICL no requiere pre-coagulación. La temperatura de encogimiento, una medición de la temperatura de desnaturalización de colágeno, está cercana a la de ICL no entrelazado indicando una cantidad baja de entrelazamiento. La prueba mecánica se realizó sobre la prótesis de manguito de ICL para determinar la resistencia del manguito de JCL. Un resumen de los resultados de las varias pruebas de características mecánicas y físicas de construcciones de ICL de dos capas se presenta en el cuadro 2.

CUADRO 2 Resumen de propiedades mecánicas EJEMPLO 5 Implantación de tubos de colágeno como stents externos 29 Conejos machos blancos de Nueva Zelandia se sometieron a injerto de derivación por interposición de la artería carótida derecha común utilizando la vena yugular ipsilateral en reversa. En el grupo experimental (n=15), una vez que se realizó la anastomosis proximal la vena se hizo pasar a través de un tubo de colágeno que tiene dimensiones de 4 mm en diámetro y 35 a 40 mm en longitud y la anastomosis distal fue entonces completada. Las fugas se repararon y el tubo de colágeno se hizo a la medida para cubrir completamente el injerto de vena, incluyendo ambas anastomosis. Los animales de control (n=14) fueron tratados idénticamente pero sin soporte de tubo. Una muerte intraoperativa resultó de una fuga no reconocida en el segmento intermedio de un injerto de vena en el grupo experimental. De otra manera, no hubo complicaciones significantes tales como infección o sangrado en ningún grupo. Todos los animales sobrevivieron hasta los puntos finales y todos los injertos de vena fueron patentes en la cosecha. Postoperativamente, la velocidad de flujo y la presión intraluminal en los injertos de vena se medió en el día 3 o 28 (n=5 por grupo). Los injertos de vena se cosecharon el día 3 para evaluación de fosforilación de tirosina mediante análisis de Western blot (n=4 por grupo), y en el día 28 para medición morfométrica (n=5 por grupo), microscopía de evaluación y de transmisión de electrones (n=5 por grupo) y estudios de tensión isométrica (n=5 por grupo).

El día de la cosecha, los animales fueron anestesiados y sacrificados de manera subsecuente con una sobredosis intravenosa de barbitúricos. Los injertos de vena implantados en la circulación arterial desarrollaron de manera predecible engrosamiento de pared, con hiperplasia de célula de músculo liso y deposición de matriz extracelular en la íntima y media, un procedimiento de adaptación que ha sido referido como "arterialización". En 50% de injertos de vena implantados, sin embargo, este procedimiento se vuelve patológico normalmente debido a lesiones hiperplásticas íntimas que causan ya sea estenosis focal o promueven aterosclerosis acelerada. Este estudio muestra que el soporte de tubo externo de injertos de vena modula de manera efectiva la señalización de tirosina cinasa y la respuesta hiperplástica en injertos de vena experimentales, con tensión de corte incrementada y tensión de pared reducida.

EJEMPLO 6 Evaluación hemodinámica La velocidad de flujo sanguíneo se midió aplicando sondas de flujo (de 3 ó 4 mm de diámetro), conectadas a medidor de flujo (Transonic Systems Inc., Ithaca, NY), sobre la superficie externa de vasos; el flujo se midió con el tubo de colágeno in situ en injertos de vena soportados por tubo. La presión sanguínea intraluminal se midió utilizando una aguja de calibre 27, conectada a un transductor de presión y monitor (Propaq 106, Protocol Systems Inc., Beaverton, Oregon). Las velocidades de flujo y presiones intraluminales se determinaron en la arteria carótida (proximal y distal al injerto de vena) y en el injerto de vena en un estudio piloto; no hubo diferencias significantes en las velocidades de flujo o niveles de presión en injertos de vena comparados a los segmentos proximal o distal de arterias carótidas. De aquí que, los valores reportados para velocidad de flujo (Q; an ml min"1) se tomaron de los segmentos medios de injertos de vena y valores para presión sanguínea intraluminal (P; en mmHg) de los segmentos proximales de las arterias carótidas.

Las tensiones de corte se calcularon como t = 4rjQ/pr¡3, en dyne/cm2 (t, tensiones de corte; rj, viscosidad sanguínea; Q, velocidad de flujo r¡, radio interno). La tensión de pared se calculó como T = P r¡ en 103 dyne/cm1 (T, tensión de pared; P, presión sanguínea arterial media; r¡ radio interno). La viscosidad sanguínea (0.03 en poises) se asumió que es constante. El radio interno (?)se determinó mediante morfometría, se demostró previamente que el diámetro histológico sobreestimó el diámetro in situ por 10%. Para propósitos analíticos, los radios internos y tensiones de pared se reconocieron como aproximaciones y el flujo de sangre se asumió que es laminar. Para normalizar la tensión de pared por grosor de pared, las presiones tensoras de la pared también se calcularon (presiones tensoras de pared = presión x radio interno/grosor de pared). Los grosores de pared se definieron como la suma de los grosores de la íntima, la media, y el tubo de colágeno, respectivamente.

Las velocidades de flujo y presiones no se alteraron de manera significante en injertos de vena con soporte de tubo en comparación a los controles (cuadro 3). Aplicando las ecuaciones formuladas anteriormente, la tensión de pared calculada disminuyó por 1.7 veces y la tensión de corte se incrementó por 4.8 veces en injertos de vena soportados por tubo comparados a controles (cuadro 3). La disminución en tensión de pared se esperó debido a que la presión no fue diferente sino que el radio interno se redujo por 1.7 veces en injertos de vena soportados por tubo comparado a controles (1.63 ± 0.06 mm vs. 2.69 ± 0.09 mm, respectivamente; p<0.0001). De manera similar, el incremento en tensiones de corte se anticipó debido a que el flujo no cambió significativamente y la tensión de corte es inversamente proporcional a la tercera energía del radio interno.

Las fuerzas hemodinámicas se conoce que juegan un papel importante en la regulación de células que componen la pared de vaso sanguíneo. En particular, los efectos de tensión de corte sobre células endoteliales han sido estudiados extensivamente in vitro. Varios genes endoteliales inducibles de tensión de corte han sido identificados in vitro, incluyendo PDG-A, PDGF-B, factor de crecimiento de fibroblasto básico (FGF) y sintasa de óxido nítrico, todos los cuales han estado implicados en remodelación de herida. La transformación de estímulos biomecánicos (hemodimámicos) en respuestas biológicas normalmente inicia con la activación de cinasas de proteína e interacciones de proteína a proteína que conduce a transcripción de gen (o inhibición del mismo). Takahashi y Berk, J Clin Invest. 34: 212-219 (1996), han demostrado que la tensión de corte puede activar la cinasa regulada por señal extracelular (ERK1/2) a través de una trayectoria dependiente de tirosina cinasa en células endoteliales de vena umblical humana cultivada. Los factores hemodinámicos in vivo son complejos, sin embargo, la importancia relativa de cada uno de estos factores ha sido identificada en modelos animales.

CUADRO 3 Parámetros hemodinámicos EJEMPLO 7 Extracción de proteína v análisis Western blot Injertos de vena extirpados se limpiaron de tejidos adventiciales, se lavaron en solución salina regulada de fosfato (PBS), enfriada por hielo, se cortaron en anillos de 1 cm, se congelaron en nitrógeno líquido y se almacenaron a -80°C. Las proteínas se extrajeron de las muestras congeladas mediante trituración de los tejidos a un polvo fino en un mortero y nitrógeno líquido seguido por sonificación en regulador de pH de lisis enfriado por hielo (1:4 p/v; 50 mM Tris-HCl, pH 7.4, 1 % NP-40, deoxicolato de sodio al 0.25%, 150 mM NaCI, 1 mM EGTA, 1 mM PMSF, 1 mM ortovanadato de sodio, 1mM fluoruro de sodio, 1 µg-ml"1 aprotinina, 1 µg-ml'1 leupeptina, y 1 µg ml"1 pepstatina). Los desechos insolubles se formaron en pellas en una microcentrifuga a 14,000 g a 4°C. El sobrenadante se recolectó como lisado de célula y se almacenó a -80°C hasta que se utilizó. La concentración de proteína se determinó utilizando el análisis de Bradford (Biorad Laboratories, Richmond, CA) con albúmina de suero bovino (BSA) como el estándar. Cantidades iguales de extractos de proteína (15 . pg) se mezclaron en un regulador de pH de carga de gel (glicerol al 20%, 10OmM Tris-HCl, -pH 7.4, 100 mM NaCI, 100mM ditiotreitol) (1 :4; v/v) y se pusieron a ebullición durante 9 minutos. Las muestras se cargaron después en un minigel de SDS al 8%-poliacrílamida, se separaron mediante electroforesis y se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa. La unión no específica se bloqueó incubando la membrana en TTBS (10 mM Tris-HCl, pH 8.0, TVVEEN al 0.05%-20 y 150 mM NaCI) que contiene BSA al 1% durante la noche a 4°C. Un anticuefo monoclonal de anti-fosfolirosina de ratón (PY20, 1 _µg/ml; Chemicon Internacional Inc., Temecula, CA) fue aplicado después a la tinción durante 1 hora a temperatura ambiente. La unión de anticuerpo se detectó incubando la tinción con un IgG anti-ratón de cabra conjugado con peroxidasa de rábano picante (dilusión de 1:5000; Santa Oruz_Biotechnology, Santa Cruz, CA). La tinción se lavó varias veces entre. pasos de bloqueo con TTBS. El inmunoblot se visualizó utilizando un equipo de quimioluminiscencia mejorado (Amersham, Arlington Heights, IL) y se autoradiografió. Las autoradiografías fueron escaneadas, analizadas (Adobe Photoshop 3.0, Adobe Systems Inc., Mountain View, CA) y la densidad integrada de bandas visualizadas se midió (N.I.H Image 1.61 ). Se obtuvieron los materiales químicos de Sigma Chemical Co. (St Louis, MO) a menos que se establezca de otra manera. Los análisis Western blot demostraron una reducción de 15 veces (p<0.001 ) en residuos de tirosina fosforilada en los extractos de pared de injertos de vena soportados por tubo del día 3, cuando se comparó con los controles. Los residuos de tirosina fosforilada fueron detectados en aproximadamente proteínas de 113 kDa en injertos de venas soportados por tubo. En injertos de vena de control, sin embargo, además de la cantidad más grande de residuos de tirosina fosforilados en aproximadamente proteínas de 113 kDa, los residuos de tirosina fosforilados también estuvieron presentes en proteínas con pesos moleculares justo por arriba de 82 kDa y de 200 kDa. La actividad de proteína de tirosina cinasa se reduce de manera notable en injertos de vena con tensión de pared reducida y tensiones de corte incrementadas, ambas de las cuales son las consecuencias del soporte del tubo. La identidad de las proteínas de tirosina fosforiladas (de aproximadamente 82, 113 y 200 kDa) permanece para ser definida de manera adicional. Sin embargo, se postula que la actividad de tirosina cinasa disminuida en injertos de venas soportados por tubo puede estar asociada, en parte, con expresión reducida o activación de los receptores por factores de crecimiento, tales como PDGF, FGF y factor de crecimiento epidérmico; los receptores para esos factores de crecimiento tienen tirosina cinasas de proteína intrínsecas, las cuales están en la escala de 110 a 170 kDa en peso molecular. Más aun, Kraiss et al. (Circ Res 1996;79:45-53) a mostrado que la reducción abrupta en flujo sanguíneo y tensión de corte está asociada con PDGF-A ARNm incrementado y expresión de proteína en injertos prostéticos de mandril. En paralelo, Mehta et al. (Nature Medicine 1998;4:235-239) ha demostrado recientemente una disminución significante en proteína PDGF-B con formación de stent externa de injertos de vena en el modelo de cerdo. Aunque la tensión de pared y la tensión de corte no fueron evaluadas en el estudio de Mehta et al, supra, su modelo de stent externo produjo similarmente efectos hemodinámicos similares a nuestro modelo de soporte de tubo, es decir, tensión de pared reducida y tensión de corte incrementada.

EJEMPLO 8 Evaluación morfológica Los injertos de vena se limpiaron de sangre con una infusión inicial de solución de sal balanceada de Hanks (Gibco Laboratories, Life Technologies Inc., Grand Island, NY). Como se describió anteriormente, los injertos de vena fueron después perfusionados de manera fija in situ con glutaraldehído al 2% formado en regulador de pH de 0.1 M cacodilato (pH 7.2) complementado con 0.1M sacarosa para dar una osmolaridad de aproximadamente 300mOsm, a una presión de 80 mmHg. Después de inmersión en el fijador durante 48 horas, secciones transversales (3 por injerto) del segmento intermedio de los injertos de vena fueron procesadas para evaluación morfométrica. Brevemente, la evaluación morfométrica se realizó sobre secciones que fueron teñidas con tinción de tricromo de Masson modificado y elastina de Verhoeff. La íntima y la media fueron delineadas mediante identificación de la demarcación entre la orientación cruzada (criss-cross) de las células de músculo liso hiperplástico íntimo y células de músculo liso circular de la media. El límite exterior de la media se definió mediante la interfaz entre las células de músculo liso circulares de la media y el tejido conectivo de la adventitia. Las dimensiones del lumen, íntima y media fueron mediadas mediante videomorfometría (Innovision 150, American Innovision Inc., San Diego, CA). El radio interno y los grosores de la íntima y media de injertos de vena fueron derivados a partir de las áreas luminales, intimal y medial medidas. La relación intimal (relación intimal = área intimal/[áreas ¡ntima+medial]) e índice luminal (índice luminal = diámetro luminal/[grosores intimal+medial]) también fueron calculados. Después de procesamiento de muestra adicional como se describe anteriormente, la microscopía de evaluación de electrón (microscopio de barrido de electrones Philips 500 (N.V. Philips, Eindhoven, Holanda) y microscopía de transmisión de electrones (microscopio de transmisión de electrones Philips 300, N.V. Philips, Eindhoven, Holanda) fueron realizados sobre secciones intermedias representativas.

Los injertos de vena de soporte externo con el tubo de colágeno redujeron el diámetro luminal de los injertos de vena del día 28 por 63% comparado a los injertos de vena de control (cuadro 4) los grosores de la íntima disminuyeron por 45% (46±2 µm vs 84+5 µm, p<0.0001 ) y la media por 20% (63±8 µm vs 79±4 µm, p<0.05) en los injertos de vena soportados por tubo comparados a controles, respectivamente. Las áreas intimal y medial también se redujeron, 66% y 49% respectivamente (cuadro 4). Debido a la reducción más grande en dimensión íntimal en relación a la reducción en la media, la relación intimal disminuyó por 10% (cuadro 4). Sin embargo, el índice luminal, una evaluación de grosor de pared en sección transversal en relación al diámetro luminal, se mantuvo constante con o sin soporte de tubo (cuadro 4). La microscopía de barrido de electrones mostró un revestimiento endotelial confluente con limites de células distintas en los injertos de vena soportados por tubo y los injertos de vena de control. Las células endoteliales no fueron alteradas y aplanadas en injertos de vena soportados por tubo en comparación a células endoteliales más cúbicas y voluminosas en el injerto de vena de control. En la transmisión de microscopía de electrones, los injertos de vena con soporte de tubo tuvieron menos edema subendotelial y menos deshechos que los controles; adicionalmente, la orientación de las células de músculo liso intimal estuvieron ordenadas y circulares, y su forma fue alargada y organizada en varias capas en injertos de vena soportados por tubo. En contraste, las células de músculo liso intimal estuvieron desorganizadas y menos alargadas en los injertos de vena de control. Una multitud de factores hemodinámicos son conocidos por influir el grosor de pared en injertos de vena. Schwartz, et al (J Vasc Surg 1992;15:176-186) han mostrado que el engrosamiento "miointimal" (con referencia a íntima y media) se correlaciona de manera más fuerte con tensión de pared en injertos de vena de conejo. Por otro lado, Dobrin (Hypertension 1995;26:38-43) ha demostrado que el engrosamiento intimal se correlaciona mejor con la velocidad de flujo baja (una determinante de tensión de corte) y que el engrosamiento medial fue un mejor correlacionado de deformación en la dirección circunferencial (una determinante de tensión de pared). El concepto prevaleciente es que la remodelación de pared depende de la tensión de corte y la tensión de pared. En este estudio, se ha descubierto una reducción más grande en engrosamiento intimal que en engrosamiento medial lo cual se puede correlacionar con el incremento más grande en tensión de corte y disminución más pequeña en tensión de pared, respectivamente, lo cual soportaría los resultados de Dobrin. Aunque el engrosamiento de pared se debe a la hiperplasia de células de músculo liso y la elaboración de una matriz extracelular, se sabe más acerca del primero que del último. Zwolak, et al. (J Vasc Surg 1987;5:126-136) a descrito las cinéticas celulares en los injertos de vena de conejo. La proliferación de células de músculo liso ha mostrado que se incrementa en injertos sometidos a flujo bajo y tensión de corte. Adicionalmente, Mehta et al, supra, ha reportado que la formación de stent de injertos de vena reduce la proliferación de células de músculo liso intimal y medial como se evalúa mediante inmunotinción para el antígeno nuclear de célula proliferante (PCNA).

CUADRO 4 Análisis dimensional de injertos de vena del día 28 Soporte de tubo Control Valor-p Área luminal (mm2) 8.6±0.6 23.2±1.6 <0.001 Área intimal (mm2) 0.48±0.02 1.42±0.08 <0.001 Área medial (mm2) 0.70±0.11 1.36±0.07 <0.001 Relación intimal 0.46±0.06 0.51±0.01 <0.01 índice luminal 34.1 ±3.6 34.9±2.2 0.33 Relación intimal=área ¡ntimal/(áreas intimal+medial); índice luminal = diámetro luminal/(grosores intimal+medial). Los valores son los promedios ±s.e.m. (n=5 por grupo) Las diferencias estadísticas entre los injertos de vena soportados por tubo y los injertos de vena de control se compararon utilizando la prueba de suma de Clasificación por Jerarquías de Mann-Whitney.

EJEMPLO 9 Estudios de tensión isométrica Los injertos de vena se seccionaron en cuatro anillos de 5mm. En el grupo soportado por tubo, el tubo de colágeno fue seccionado cuidadosamente y removido para permitir la concentración y relajación de vaso no impedida. Cada anillo se montó inmediatamente entre dos ganchos de acero inoxidable en baños de órgano de 5 ml que contienen solución de Krebs oxigenada (122 mM NaCI, 4.7 mM KCl, 1.2 mM MgCI2, 2.5 mM CaCI2, 15.4 mM NaHCO3, 1.2 mM KH2PO4 y 5.5 mM glucosa, mantenida a 37°C y oxigenada con 95% O2 y 5% CO2), como se describe anteriormente con algunas modificaciones. En breve, después de la equilibración, la tensión de descanso se ajustó en incrementos de 0.5 a 1.25 gms y la respuesta máxima a una solución de Krebs oxigenada modificada que contiene 60 mM KCl, 66.7 mM NaCI, 1.2 mM MgCI2, 2.5 mM CaCI2, 15.4 mM NaHCO3, 1.2 mM KH2PO4 y 5.5 mM glucosa se midió para establecer una relación de longitud-tensión. Las curvas de respuesta de dosis acumulativas a los agonistas contráctiles de bradykinina (10"9 a 10"5 M), norepinefrina (10"9 a 10"4 M), y serotonina (10"9 a 10"4 M) fueron realizadas. Las respuestas de relajación a acetilcolina (10"8 a 10"4 M), y agonistas dependientes de endotelio, y nitroprusida (10"8 a 10"4 M) y agonistas independientes de endotelio, se evaluaron sobre anillos pre-contraídos con norepinefrina, a la concentración que produjo 80% de contracción máxima. Todos los anillos se permitieron re-equilibrarse durante un mínimo de 30 minutos entre cada corrida experimental y la misma secuencia de prueba de agonistas se mantuvo para todos los experimentos, (todos los químicos se obtuvieron de Sigma Chemical Co. (St Louis, MO)). Los injertos de vena soportados por tubo demostraron respuestas similares a KCl comparados con los controles (fuerza 300±46 mg vs 280±47 mg). Las sensibilidades de injerto de vena soportados por tubo en respuesta a norefinefrina y serotonina no fueron significativamente diferentes de las de los controles (cuadro 5). Los injertos de vena soportados por tubo fueron más sensibles, sin embargo, a bradiquinina que los controles (cuadro 5). Las fuerzas de contracción máximas generadas en respuesta a todos los tres agonistas (norepinefrina, serotonina y bradiquinina) expresadas como relaciones de contracción estandarizadas, no se alteraron de manera significante con soporte de tubo extemo de injertos de vena. Como se reporto anteriormente, los injertos de vena de control no se relajaron en respuesta a acetilcolina. En contraste, 10 de 20 anillos de los injertos de vena soportados por tubo demostraron relajación dependiente de dosis en respuesta a acetilcolina con una relajación máxima de 64% de tensión pre-contraída, aunque con una sensibilidad menor (cuadro 5). De los cinco injertos de vena soportados por tubo estudiados, solamente uno no tuvo respuesta a acetilcolina en todos los anillos. En repuesta a nitroprosida, la sensibilidad (cuadro 5) y la relajación máxima fueron similares en injertos de vena con o sin soporte de tubo. Esos resultados muestran una completa conservación de función de célula de músculo liso y recuperación de relajación dependiente de endotelio con soporte de tubo de injertos de vena. A pesar de la reducción significante en grosor de pared, los injertos de vena soportados por tubo generaron fuerzas contráctiles similares en respuesta a KCl y todos los tres agonistas de contracción probados (norepinefrina, serotonina y bradiquinina).

La fuerza máxima generada por un anillo de vaso puede estar correlacionada con la masa de célula de músculo liso, con la condición de que todos los otros factores (tales como la integridad y número de receptores para el agonista o canales de potasio) son constantes. Seguiría que la masa de célula de músculo liso no cambió de manera significante con soporte de tubo, sugiriendo que la reducción en grosor intimal puede ser en parte debido a la producción disminuida de matriz extracelular.

La concentración para la respuesta media máxima (EC50) se calculó mediante análisis logístico y la sensibilidad se define como -log?o(EC5o). En cada injerto de vena, la sensibilidad se determinó para cada anillo de vaso (4 anillos por injerto de vena) y la media se tomó como el valor para ese injerto de vena. Los valores mostrados son los medios ± s.e. . (n=5 por grupo). Las diferencias estadísticas entre los injertos de vena soportados por tubo y los injertos de vena de control se compararon utilizando la prueba de la "t" de Students. La recuperación de relajación dependiente de endotelio a acetilcolina en 50% de anillos de vaso con soporte de tubo indicaría que la función endotelial fue modulada. La tensión de corte incrementada se ha mostrado que estimula la producción incrementada de óxido nítrico in vitro, lo cual explicaría en parte la relajación a acetilcolina en injertos de vena soportados por tubo. La suplementación sistémica con L-arginina, el precursor de óxido nítrico, también ha mostrado que conserva la relajación dependiente de endotelio de injertos de vena a acetilcolina. La función endotelial mejorada también ha sido reportada por Onohara, et al (J Surg Res 1993:55:344-350) con producción incrementada de prostaciclina (PGI) en injertos de vena expuestos a alta tensión de corte. De manera alternativa, la función endotelial conservada en injertos de vena se puede atribuir a la lesión menor de estiramiento de pared con soporte de tubo. Después de todo, las células endoteliales son conocidas por tener un papel regulador en proliferación de célula de músculo liso y migración además de su papel en mecano transducción y respuestas vasomotoras. Por lo tanto se postula que la función endotelial mejorada con soporte, de tubo puede reducir la liberación de señales mitogénicas y quimioatrayentes tales como PDGF. Aunque la invención mencionada anteriormente ha sido descrita en algún detalle a manera de ilustración y ejemplo para propósitos de claridad y entendimiento, será obvio para alguien de habilidad en la técnica que ciertos cambios y modificaciones se pueden practicar dentro del alcance de las reivindicaciones que se anexan.

Claims (5)

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES

1.- Una prótesis biorremodelable caracterizada porque comprende un tubo de colágeno que comprende al menos una capa de colágeno de submucosa entrelazado estéril.

2.- Una prótesis de soporte de vena externa biorremodelable caracterizado porque comprende un tubo de colágeno que comprende al menos una capa de colágeno de submucosa entrelazado estéril.

3.- Un método para producir un tubo de colágeno que comprende al menos una capa de colágeno de submucosa de intestino delgado caracterizado porque comprende: (a) enrollar el colágeno de submucosa alrededor de un mandril y sobre sí mismo una vuelta completa para formar un tubo de colágeno de submucosa de dos capas; (b) secar el tubo sobre el mandril; (c) contactar el tubo con un agente de entrelazamiento para entrelazar el colágeno; (d) remover el agente de entrelazamiento enjuagando el tubo; (e) secar el tubo entrelazado sobre el mandril; y (f) remover el tubo del mandril.

4.- El método de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado además porque comprende adicionalmente el paso de (g) contactar el tubo de colágeno con un ácido peracético para esterilizar el tubo de colágeno.

5.- Un método para utilizar un tubo de colágeno para evitar lesión de estiramiento en un injerto de vena autólogo que tiene dos extremos implantados en la circulación arterial caracterizado porque comprende: (a) remover un segmento de vasculatura; (b) anastomizar un primer extremo del injerto de vena; (c) hacer pasar el injerto de vena a través de un tubo de colágeno; (d) anastomizar un segundo extremo del injerto de vena; y (e) cubrir el injerto de vena y ambas anastomosis con dicho tubo de colágeno.