CN109362715A - 一种宽体沙鳅精液冷冻保存液及超低温保存方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种宽体沙鳅精液冷冻保存液及超低温保存方法，该冷冻保存液包括稀释剂和抗冻剂，稀释剂包括以下组分：NaCl20～36g/L、KCl0.3～0.42g/L、海藻糖10～30g/L、蔗糖10～36g/L、牛磺酸10～30mM和辅酶A0.01～0.25mM；抗冻剂包括二甲基亚砜、甘油和甲醇。采用该冷冻保存液对宽体沙鳅精液进行超低温保存的方法包括取精子、配置稀释剂、将稀释剂与精子混合、向混合液中分步加入抗冻剂等步骤。采用本发明中的冷冻保存液和保存方法对宽体沙鳅的精液进行保存，精子的活力较大，受精率较高，完全可以用于对宽体沙鳅的繁殖使用。

Description

一种宽体沙鳅精液冷冻保存液及超低温保存方法
技术领域
本发明涉及生物学低温冷冻保存技术领域，具体涉及一种宽体沙鳅精液冷冻保存液及超低温保存方法。
背景技术
低温生物学(Cryobiology)是研究低温对生物所产生的影响及低温在与生物有关的各个领域中应用的学科。鱼类精液的超低温冷冻保存在保护物种多样性、提高鱼类种质、选择培育优质鱼种具有广阔的前景，该技术的实施对于鱼类精子原种库建立及解决鱼类精、卵成熟不同步等问题具有重要的意义。
宽体沙鳅(Sinibotia reevesae)隶属鲤形目(Cypriniformes)鳅科(Cobitidae)宽体沙鳅亚科(Botiinae)，体表粘液发达，是长江上游特有经济鱼类。近年来由于水土流失、水利工程建设等的影响，使其原有的产卵场和索饵场受到破坏，再加上过度捕捞、水环境污染等因素，导致江河内的鱼类资源急剧下降。目前有关宽体沙鳅的研究主要集中在胚胎发育及人工繁殖方面，在对宽体沙鳅精液超低温保存方面鲜有研究。
发明内容
针对现有技术中的上述不足，本发明提供了一种宽体沙鳅精液冷冻保存液及超低温保存方法，采用本发明中的冷冻保存液和保存方法对宽体沙鳅的精液进行保存，精子的活力较大，受精率较高，完全可以用于对宽体沙鳅的繁殖使用。
为实现上述目的，本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
一种宽体沙鳅精液冷冻保存液，包括稀释剂和抗冻剂，稀释剂包括以下组分：NaCl20～36g/L、KCl0.3～0.42g/L、海藻糖10～30g/L、蔗糖10～36g/L、牛磺酸10～30mM和辅酶A0.01～0.25mM；
抗冻剂包括以下组分：二甲基亚砜、甘油和甲醇。
进一步地，稀释剂包括以下组分：NaCl30～36g/L、KCl0.36～0.4g/L、海藻糖20～26g/L、蔗糖32～36g/L、牛磺酸18～22mM和辅酶A0.12～0.17mM。
进一步地，稀释剂包括以下组分：NaCl34g/L、KCl0.38g/L、海藻糖24g/L、蔗糖32g/L、牛磺酸22mM和辅酶A0.16mM。
进一步地，二甲基亚砜、甘油和甲醇在稀释剂中的终浓度分别为8～11％、1～4％和2～4％。
采取上述冷冻保存液对宽体沙鳅精液进行超低温保存的方法，包括以下步骤：
(1)取性成熟雄鱼，吸干其生殖孔表面及周围的水分，然后由前往后压鱼腹两侧，收集精液，冰浴备用；
(2)取NaCl、KCl、海藻糖、蔗糖、牛磺酸和辅酶A混合均匀、备用；
(3)将步骤(1)收集的精液与步骤(2)制得的稀释剂以1:3～7的体积比稀释并混合均匀，备用；
(4)先向步骤(3)制得的精液中添加甲醇至终浓度为2～4％，然后在4～6℃条件下保温6～8分钟，再向精液中添加甘油至终浓度为1～4％，然后在4～6℃条件下保温6～8分钟，最后向精液中添加二甲基亚砜至终浓度为8～11％，得混合精液；
(5)将步骤(4)中制得的混合精液依次在2～6℃条件下孵育20～40分钟，-2～4℃条件下孵育5～20分钟，-30～-10℃条件下孵育10～20分钟，-50～-40℃条件下孵育10～20分钟，然后在-95～-80℃条件中保存。
进一步地，骤(1)中收集的精液活率在85％以上。
进一步地，步骤(3)中精液与稀释剂的体积比为1:3。
进一步地，步骤(4)中先向精液中添加甲醇至终浓度为2％，然后在4℃条件下保温8分钟，再向精液中添加甘油至终浓度为1％，然后在4℃条件下保温6分钟，最后向精液中添加二甲基亚砜至终浓度为10％，备用。
进一步地，步骤(4)中甲醇、甘油和二甲基亚砜在稀释剂中的终浓度分别为2％、1％和10％。
进一步地，步骤(5)中的冷存管依次在4℃条件下中孵育30分钟，0℃孵育10分钟，-20℃孵育15分钟，-43℃孵育15分钟，然后在-87℃条件中保存。
采取上述方案的有益效果为：
1、本发明的保存液中添加有合适浓度的NaCl、KCl、海藻糖、蔗糖、牛磺酸和辅酶A的混合物作为稀释剂，制得具有高渗透性的稀释液，使宽体沙鳅精子在其内部的渗透压与存在于鱼体时的渗透压基本相近，符合宽体沙鳅精子的生存要求；同时该稀释液中的海藻糖可在细胞表面能形成独特的保护膜，使细胞在高寒、高渗透压及干燥失水等恶劣环境条件下蛋白质分子不会变性失活；牛磺酸具有镇静消炎的作用，对于冻伤有防治作用，可以与海藻糖协同作用，提高精子的成活率，降低低温对宽体沙鳅精子造成的损伤；辅酶A可对精子内的脂肪和蛋白质代谢进行调整，提高精子在稀释液中的成活率。
2、本发明采用合适浓度的二甲基亚砜、甘油和甲醇联合作为抗冻剂，其中二甲基亚砜作为一种渗透性保护剂，由于其具有较强的渗透性，与宽体沙鳅精子膜上的磷脂层发生相互作用，能够降低细胞冰点，减少冰晶的形成，减轻自由基对细胞损害，改变生物膜对电解质、药物、毒物和代谢产物的通透性；甘油和甲醇均具有抗冻的作用，可以与二甲基亚砜协同作用，进一步减轻低温对精子损伤；使用时先向稀释剂中加入甲醇调至合适浓度并进行缓冲，再向稀释剂中添加甘油调至合适浓度并缓冲，最后向稀释剂中添加二甲基亚砜，不同的抗冻剂分步进行添加，给宽体沙鳅精子缓冲时间，同时不同的抗冻剂依次在精子上发挥作用，提高宽体沙鳅精子低温保存后的成活率及活力。
3、本发明采用梯度降温的方式，将装有宽体沙鳅精子的冷存管依次于4℃、-20℃和-43℃的条件下进行梯度降温并进行平衡孵育合适时间，使宽体沙鳅精子得以适应，最终在-87℃的条件下进行保存，复苏后的宽体沙鳅精子具有较高的活性。
具体实施方式
实施例1
一种宽体沙鳅精液冷冻保存液，包括稀释剂和抗冻剂，稀释剂包括以下组分：NaCl20g/L、KCl0.3g/L、海藻糖10g/L、蔗糖10g/L、牛磺酸10mM和辅酶A0.01mM；抗冻剂包括以下组分：二甲基亚砜、甘油和甲醇；二甲基亚砜、甘油和甲醇在稀释剂中的终浓度分别为8％、1％和2％。
采用上述冷冻保存液对宽体沙鳅精液进行超低温保存的方法，包括以下步骤：
(1)取性成熟雄鱼，吸干其生殖孔表面及周围的水分，然后由前往后轻压鱼腹两侧，收集精液，冰浴备用；
(2)取NaCl、KCl、海藻糖、蔗糖、牛磺酸和辅酶A混合均匀、备用；
(3)将步骤(1)收集的精液与步骤(2)制得的稀释剂以1:3的体积比稀释并混合均匀，备用；
(4)先向步骤(3)制得的精液中添加甲醇至终浓度为2％，然后在4℃条件下保温6分钟，再向精液中添加甘油至终浓度为1％，然后在4℃条件下保温6分钟，最后向精液中添加二甲基亚砜至终浓度为10％，备用；
(5)将步骤(4)制得的混合精液分装于冷存管中，备用；
(6)将步骤(5)中的冷存管依次在2℃条件下中孵育20分钟，-2℃条件下孵育5分钟，-30℃条件下孵育10分钟，-50℃条件下孵育10分钟，然后在-95℃条件中保存。
实施例2
一种宽体沙鳅精液冷冻保存液，包括稀释剂和抗冻剂，稀释剂包括以下组分：NaCl36g/L、KCl0.42g/L、海藻糖30g/L、蔗糖36g/L、牛磺酸30mM和辅酶A0.25mM；抗冻剂包括以下组分：二甲基亚砜、甘油和甲醇，二甲基亚砜、甘油和甲醇在稀释剂中的终浓度分别为11％、4％和4％。
采用上述冷冻保存液对宽体沙鳅精液进行超低温保存的方法，包括以下步骤：
(1)取性成熟雄鱼，吸干其生殖孔表面及周围的水分，然后由前往后轻压鱼腹两侧，收集精液于离心管中，冰浴备用；
(2)取NaCl、KCl、海藻糖、蔗糖、牛磺酸和辅酶A混合均匀、备用；
(3)将步骤(1)收集的精液与步骤(2)制得的稀释剂以1:7的体积比稀释并混合均匀，备用；
(4)先向步骤(3)制得的精液中添加甲醇至终浓度为4％，然后在6℃条件下保温8分钟，再向精液中添加甘油至终浓度为4％，然后在6℃条件下保温8分钟，最后向精液中添加二甲基亚砜至终浓度为11％，备用；
(5)将步骤(4)制得的混合精液分装于冷存管中，备用；
(6)将步骤(5)中的冷存管依次在6℃条件下中孵育40分钟，0℃条件下孵育20分钟，-10℃条件下孵育20分钟，-40℃条件下孵育20分钟，然后在-80℃条件中保存。
实施例3
一种宽体沙鳅精液冷冻保存液，包括稀释剂和抗冻剂，稀释剂包括以下组分：NaCl34g/L、KCl0.38g/L、海藻糖24g/L、蔗糖32g/L、牛磺酸22mM和辅酶A0.16mM；抗冻剂包括以下组分：二甲基亚砜、甘油和甲醇，二甲基亚砜、甘油和甲醇在稀释剂中的终浓度分别为10％、1％和2％。
采用上述冷冻保存液对宽体沙鳅精液进行超低温保存的方法，包括以下步骤：
(1)取性成熟雄鱼，吸干其生殖孔表面及周围的水分，然后由前往后轻压鱼腹两侧，收集精液于离心管中，冰浴备用；
(2)取NaCl、KCl、海藻糖、蔗糖、牛磺酸和辅酶A混合均匀、备用；
(3)将步骤(1)收集的精液与步骤(2)制得的稀释剂以1:3的体积比稀释并混合均匀，备用；
(4)先向步骤(3)制得的精液中添加甲醇至终浓度为2％，然后在4℃条件下保温8分钟，再向精液中添加甘油至终浓度为1％，然后在4℃条件下保温6分钟，最后向精液中添加二甲基亚砜至终浓度为10％，备用；
(5)将步骤(4)制得的混合精液分装于冷存管中，备用；
(6)将步骤(5)中的冷存管依次在4℃条件下中孵育30分钟，0℃条件下孵育10分钟，-20℃条件下孵育15分钟，-43℃条件下孵育15分钟，然后在-87℃条件中保存。
实施例4
一种宽体沙鳅精液冷冻保存液，其特征在于，包括稀释剂和抗冻剂，所述稀释剂包括以下组分：NaCl30g/L、KCl0.36g/L、海藻糖20g/L、蔗糖32g/L、牛磺酸18mM和辅酶A0.12mM；抗冻剂包括以下组分：二甲基亚砜、甘油和甲醇，二甲基亚砜、甘油和甲醇在稀释剂中的终浓度分别为9％、3％和2％。
采用上述冷冻保存液对宽体沙鳅精液进行超低温保存的方法，包括以下步骤：
(1)取性成熟雄鱼，吸干其生殖孔表面及周围的水分，然后由前往后轻压鱼腹两侧，收集精液于离心管中，冰浴备用；
(2)取NaCl、KCl、海藻糖、蔗糖、牛磺酸和辅酶A混合均匀、备用；
(3)将步骤(1)收集的精液与步骤(2)制得的稀释剂以1:5的体积比稀释并混合均匀，备用；
(4)先向步骤(3)制得的精液中添加甲醇至终浓度为2％，然后在5℃条件下保温8分钟，再向精液中添加甘油至终浓度为3％，然后在6℃条件下保温6分钟，最后向精液中添加二甲基亚砜至终浓度为9％，备用；
(5)将步骤(4)制得的混合精液分装于冷存管中，备用；
(6)将步骤(5)中的冷存管依次在3℃条件下中孵育25分钟，-1℃条件下孵育10分钟，-13℃条件下孵育15分钟，-50℃条件下孵育20分钟，然后在-95℃条件中保存。
实施例5
一种宽体沙鳅精液冷冻保存液，包括稀释剂和抗冻剂，稀释剂包括以下组分：NaCl36g/L、KCl0.4g/L、海藻糖26g/L、蔗糖36g/L、牛磺酸22mM和辅酶A0.17mM，抗冻剂包括以下组分：二甲基亚砜、甘油和甲醇，二甲基亚砜、甘油和甲醇在稀释剂中的终浓度分别为8％、4％和3％。
采用上述冷冻保存液对宽体沙鳅精液进行超低温保存的方法，包括以下步骤：
(1)取性成熟雄鱼，吸干其生殖孔表面及周围的水分，然后由前往后轻压鱼腹两侧，收集精液于离心管中，冰浴备用；
(2)取NaCl、KCl、海藻糖、蔗糖、牛磺酸和辅酶A混合均匀、备用；
(3)将步骤(1)收集的精液与步骤(2)制得的稀释剂以1:6的体积比稀释并混合均匀，备用；
(4)先向步骤(3)制得的精液中添加甲醇至终浓度为3％，然后在4℃条件下保温6分钟，再向精液中添加甘油至终浓度为4％，然后在4℃条件下保温6分钟，最后向精液中添加二甲基亚砜至终浓度为8％，备用；
(5)将步骤(4)制得的混合精液分装于冷存管中，备用；
(6)将步骤(5)中的冷存管依次在6℃条件下中孵育20分钟，-2℃条件下孵育5分钟，-30℃条件下孵育10分钟，-50℃条件下孵育20分钟，然后在-80℃条件中保存。
对比例1
一种宽体沙鳅精液冷冻保存液，包括稀释剂和抗冻剂，稀释剂包括以下组分：NaCl34g/L、KCl0.38g/L、蔗糖32g/L和辅酶A0.16mM；抗冻剂包括以下组分：二甲基亚砜、甘油和甲醇，二甲基亚砜、甘油和甲醇在稀释剂中的终浓度分别为10％、1％和2％。
采用上述冷冻保存液对宽体沙鳅精液进行超低温保存的方法，包括以下步骤：
(1)取性成熟雄鱼，吸干其生殖孔表面及周围的水分，然后由前往后轻压鱼腹两侧，收集精液于离心管中，冰浴备用；
(2)取NaCl、KCl、蔗糖和辅酶A混合均匀、备用；
(3)将步骤(1)收集的精液与步骤(2)制得的稀释剂以1:3的体积比稀释并混合均匀，备用；
(4)先向步骤(3)制得的精液中添加甲醇至终浓度为2％，然后在4℃条件下保温8分钟，再向精液中添加甘油至终浓度为1％，然后在4℃条件下保温6分钟，最后向精液中添加二甲基亚砜至终浓度为10％，备用；
(5)将步骤(4)制得的混合精液分装于冷存管中，备用；
(6)将步骤(5)中的冷存管依次在4℃条件下中孵育30分钟，0℃条件下孵育10分钟，-20℃条件下孵育15分钟，-43℃条件下孵育15分钟，然后在-87℃条件中保存。
对比例2
一种宽体沙鳅精液冷冻保存液，包括稀释剂和抗冻剂，稀释剂包括以下组分：NaCl34g/L、KCl0.38g/L、海藻糖24g/L、蔗糖32g/L、牛磺酸22mM和辅酶A0.16mM；抗冻剂为甘油。
采用上述冷冻保存液对宽体沙鳅精液进行超低温保存的方法，包括以下步骤：
(1)取性成熟雄鱼，吸干其生殖孔表面及周围的水分，然后由前往后轻压鱼腹两侧，收集精液于离心管中，冰浴备用；
(2)取NaCl、KCl、海藻糖、蔗糖、牛磺酸和辅酶A混合均匀、备用；
(3)将步骤(1)收集的精液与步骤(2)制得的稀释剂以1:3的体积比稀释并混合均匀，备用；
(4)向步骤(3)制得的精液中添加添加甘油至终浓度为1％，然后在4℃条件下保温6分钟，备用；
(5)将步骤(4)制得的混合精液分装于冷存管中，备用；
(6)将步骤(5)中的冷存管依次在4℃条件下中孵育30分钟，0℃条件下孵育10分钟，-20℃条件下孵育15分钟，-43℃条件下孵育15分钟，然后在-87℃条件中保存。
对比例3
一种宽体沙鳅精液冷冻保存液，包括稀释剂和抗冻剂，稀释剂包括以下组分：NaCl34g/L、KCl0.38g/L、海藻糖24g/L、蔗糖32g/L、牛磺酸22mM和辅酶A0.16mM；抗冻剂为甲醇，甲醇在稀释剂中的终浓度为2％。
采用上述冷冻保存液对宽体沙鳅精液进行超低温保存的方法，包括以下步骤：
(1)取性成熟雄鱼，吸干其生殖孔表面及周围的水分，然后由前往后轻压鱼腹两侧，收集精液于离心管中，冰浴备用；
(2)取NaCl、KCl、海藻糖、蔗糖、牛磺酸和辅酶A混合均匀、备用；
(3)将步骤(1)收集的精液与步骤(2)制得的稀释剂以1:3的体积比稀释并混合均匀，备用；
(4)先向步骤(3)制得的精液中添加甲醇至终浓度为2％，然后在2℃条件下保温8分钟，备用；
(5)将步骤(4)制得的混合精液分装于冷存管中，备用；
(6)将步骤(5)中的冷存管依次在4℃条件下中孵育10分钟，0℃条件下孵育30分钟，-20℃条件下孵育30分钟，-43℃条件下孵育5分钟，然后在-87℃条件中保存。
对比例4
一种宽体沙鳅精液冷冻保存液，包括稀释剂和抗冻剂，稀释剂包括以下组分：NaCl34g/L、KCl0.38g/L、海藻糖24g/L、蔗糖32g/L、牛磺酸22mM和辅酶A0.16mM；抗冻剂包括以下组分：二甲基亚砜、甘油和甲醇，二甲基亚砜、甘油和甲醇在稀释剂中的终浓度分别为10％、1％和2％。
采用上述冷冻保存液对宽体沙鳅精液进行超低温保存的方法，包括以下步骤：
(1)取性成熟雄鱼，吸干其生殖孔表面及周围的水分，然后由前往后轻压鱼腹两侧，收集精液于离心管中，冰浴备用；
(2)取NaCl、KCl、海藻糖、蔗糖、牛磺酸和辅酶A混合均匀、备用；
(3)将步骤(1)收集的精液与步骤(2)制得的稀释剂以1:3的体积比稀释并混合均匀，备用；
(4)先向步骤(3)制得的精液中添加甲醇至终浓度为2％，然后在4℃条件下保温8分钟，再向精液中添加甘油至终浓度为1％，然后在4℃条件下保温6分钟，最后向精液中添加二甲基亚砜至终浓度为10％，备用；
(5)将步骤(4)制得的混合精液分装于冷存管中，备用；
(6)将步骤(5)中的冷存管依次在8℃条件下中孵育10分钟，5℃条件下孵育30分钟，-7℃条件下孵育7分钟，-63℃条件下孵育8分钟，然后在-87℃条件中保存。
试验例
将实施例1-5和对比例1-4的冷冻精液分别在冻存3个月、9个月和12个月后取出一部分进行宽体沙鳅精子活力检测和受精率检测。
(1)活力检测
将取出的装有宽体沙鳅精液的冷存管迅速浸入37℃水浴锅中解冻3秒，用100uL枪头蘸取少许精液涂抹至载玻片上，并滴加30ul的蒸馏水激活精子，利用显微镜观察精子的活力和有效运动时间，具体检测结果见表1和表2。
表1精子活力统计表
通过表1可以得知，采用实施例1-5的保存液和保存方法保存后的精液精子活力均比对比例1-4中的精子活力高，尤其是采用实施例3的保存液和保存方法保存后的精液精子活力最高。
表2精子有效运动时间统计表
通过表2可以得知，采用实施例1-5的保存液和保存方法保存后的精液精子的有效运动时间均比对比例1-4中的精子有效运动时间高，尤其是采用实施例3的保存液和保存方法保存后的精液精子有效运动时间最高。
(2)受精率检测
将冻存12个月的宽体沙鳅精液解冻后加入盛放有成熟卵的容器中，用羽毛轻轻搅动，使精卵充分混匀，加水激活精子，倒掉上方的污水，将卵移入孵化器中孵化，至原肠胚期统计卵子受精率，具体结果见表3。
表3受精率检测
冻融12个月后精子受精率％
实施例1 37.59±4.21％
实施例2 38.90±4.39％
实施例3 42.50±3.57％
实施例4 37.49±3.78％
实施例5 36.98±4.23％
对比例1 27.56±2.39％
对比例2 23.42±±2.59％
对比例3 22.37±2.39％
对比例4 22.87±2.98％
通过表3得知，实施例1-5的精液冻存12个月后的受精率均比对比例1-4的精液受精率高，尤其是实施例3的精液受精率最高。
通过上述实验可知，按照本发明的保存液和保存方法对宽体沙鳅精子进行冻存，12个月后精子的活力最高可以达到45.70±5.53％，精子的有效运动时间最长可以的达到31.59±1.0s，精子的受精率最高可以达到42.50±3.57％，完全能够满足宽体沙鳅的繁殖需要。

Claims (10)

1.一种宽体沙鳅精液冷冻保存液，其特征在于，包括稀释剂和抗冻剂，所述稀释剂包括以下组分：NaCl20～36g/L、KCl0.3～0.42g/L、海藻糖10～30g/L、蔗糖10～36g/L、牛磺酸10～30mM和辅酶A0.01～0.25mM；
所述抗冻剂包括以下组分：二甲基亚砜、甘油和甲醇。
2.如权利要求1所述的宽体沙鳅精液冷冻保存液，其特征在于，所述稀释剂包括以下组分：NaCl30～36g/L、KCl0.36～0.4g/L、海藻糖20～26g/L、蔗糖32～36g/L、牛磺酸18～22mM和辅酶A0.12～0.17mM。
3.如权利要求1或2所述的宽体沙鳅精液冷冻保存液，其特征在于，所述稀释剂包括以下组分：NaCl34g/L、KCl0.38g/L、海藻糖24g/L、蔗糖32g/L、牛磺酸22mM和辅酶A0.16mM。
4.如权利要求3所述的宽体沙鳅精液冷冻保存液，其特征在于，所述二甲基亚砜、甘油和甲醇在稀释剂中的终浓度分别为8～11％、1～4％和2～4％。
5.采用权利要求1～4所述的冷冻保存液对宽体沙鳅精液进行超低温保存的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)取性成熟雄鱼，吸干其生殖孔表面及周围的水分，然后由前往后压鱼腹两侧，收集精液，冰浴备用；
(2)取NaCl、KCl、海藻糖、蔗糖、牛磺酸和辅酶A混合均匀、备用；
(3)将步骤(1)收集的精液与步骤(2)制得的稀释剂以1:3～7的体积比稀释并混合均匀，备用；
(4)先向步骤(3)制得的精液中添加甲醇至终浓度为2～4％，然后在4～6℃条件下保温6～8分钟，再向精液中添加甘油至终浓度为1～4％，然后在4～6℃条件下保温6～8分钟，最后向精液中添加二甲基亚砜至终浓度为8～11％，得混合精液；
(5)将步骤(4)中制得的混合精液依次在2～6℃条件下孵育20～40分钟，-2～4℃条件下孵育5～20分钟，-30～-10℃条件下孵育10～20分钟，-50～-40℃条件下孵育10～20分钟，然后在-95～-80℃条件中保存。
6.如权利要求5所述的宽体沙鳅精液超低温保存的方法，其特征在于，骤(1)中收集的精液活率在85％以上。
7.如权利要求5所述的宽体沙鳅精液超低温保存的方法，其特征在于，步骤(3)中精液与稀释剂的体积比为1:3。
8.如权利要求5所述的宽体沙鳅精液超低温保存的方法，其特征在于，步骤(4)中先向精液中添加甲醇至终浓度为2％，然后在4℃条件下保温8分钟，再向精液中添加甘油至终浓度为1％，然后在4℃条件下保温6分钟，最后向精液中添加二甲基亚砜至终浓度为10％，备用。
9.如权利要求5所述的宽体沙鳅精液超低温保存的方法，其特征在于，步骤(4)中甲醇、甘油和二甲基亚砜在稀释剂中的终浓度分别为2％、1％和10％。
10.如权利要求5所述的宽体沙鳅精液超低温保存的方法，其特征在于，步骤(5)中的冷存管依次在4℃条件下中孵育30分钟，0℃孵育10分钟，-20℃孵育15分钟，-43℃孵育15分钟，然后在-87℃条件中保存。
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