CN111996185A - 一种接合转移增强液及其在提高细菌接合转移效率中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种接合转移增强液及在提高细菌接合转移效率中的应用，所述应用是：在50‑60℃下，将接合转移增强液加入接合转移平板中，接种受体菌和供体菌进行接合转移。本发明的接合转移增强液可显著提高质粒和转座子的接合转移，效率高，转座子的转移效率从0.3×10‑7提高到0.5×10‑6，随机插入突变文库的质粒转移效率提高10倍左右；使用范围广，可重复性好，不仅适用于转座子的转移也适用于质粒的转移；操作性强，使用简单，在使用时只需要在接合转移的培养基中加入相应量的试剂混合液即可；能耗低，该发明使用的试剂是常规试剂，易于购买和运送，关键使用比较廉价的原材料。

Description

一种接合转移增强液及其在提高细菌接合转移效率中的应用
(一)技术领域
本发明涉及一种接合转移增强液及其在提高细菌接合转移效率中的应用。
(二)背景技术
水平基因转移是生物进化中主要和持续的动力之一。水平基因转移又称侧向基因转移，是指生物将遗传物质传递给其他细胞而非其子代的过程。然而，这种转移并非毫无限制，而是有一定的障碍。原核生物中水平基因转移主要是通过转化、接合转移和转导3种机制来实现的。转化是指原核生物从环境中摄取裸露DNA片段的过程，不需要受体和供体细胞的物理接触，因此在自然界中转化不是主要的基因转移方式。转导是由病毒介导的细胞间进行遗传转移的一种方式，是指一个细胞的DNA或RNA通过病毒载体的感染转移到另一个细胞中。转导过程中，裸露DN A不能完成转导，不同于转化或接合过程。接合转移是细菌之间通过直接或间接接触，交换DNA的过程。在自然条件下很多质粒或转座子都可通过细菌接合作用转移到新的宿主内，从而赋予宿主新的表型特征。比如在自然环境中细菌获得抗生素抗性基因，一方面是由于抗生素过度使用和滥用产生的抗生素选择压力造成细菌产生抗生素抗性突变；另一方面是细菌通过水平转移的方式获得抗生素抗性基因，后者是细菌获得耐药性的主要方式。细菌抗生素抗性基因往往编码在可移动元件(质粒和转座子等)上，通过接合转移在细菌间进行传播。接合转移对细菌耐药基因快速扩散起到了至关重要作用。
细菌接合是一个复杂的DNA转移过程，包括：转移起始位点缺刻、DNA转移的起始、双链分离、单链转移、供体受体互补链的合成及再环化等。细菌的接合转移受自身和外界因素影响：①供体菌和受体菌的生长状态、配比关系和接合时间；②细胞表面分子；③抗生素的使用；④金属离子；⑤纳米材料。虽然转化在分子生物学领域中应用很广泛，但不是所有的菌株都适用转化操作的，特别是革兰氏阳性细菌，转化的效率很低。接合转移也是微生物学和分子生物学领域研究中非常重要的技术手段，比如在研究细菌耐药基因是否通过横向水平转移方式进行传播，从而来评价其在环境中的传播，因此在实验室条件下研究其接合转移事件为耐药基因的控制和预防提供科学依据；在遗传操作中，将工程质粒(敲除用自杀质粒和克隆表达质粒等)从供体细胞导入受体细胞是关键步骤，这个过程往往会采用接合转移的方式将工程质粒导入受体细胞，这种方式对受体细胞的损伤是最小的；在分子生物学研究中，构建随机插入突变文库是常用的大规模筛选的操作技术，而接合转移是转座子导入受体细胞的关键手段等。因此，接合转移效率的高低直接关系着对耐药基因的传播研究、遗传操作技术的进行和随机插入突变文库的构建。总之，接合转移不管是实验室基础研究还是应用研究中都有着很好的发展前景和商业价值。
接合转移在微生物学和分子生物学领域，特别是遗传操作上应用特别广泛，比如研究抗性基因的横向水平转移，随机插入突变文库的构建等，但是在现有的技术上，接合转移的效率普遍不是很高，往往达不到理想的效果。尽管目前有些研究发现可以提高接合转移效率比如添加抗生素、金属离子和使用纳米材料，但是这些方法普遍只适合质粒的转移，适用范围窄；抗生素的使用成本比较高，不环保而且使用时对菌株的生长影响大；金属离子使用的是重金属离子，不环保，使用容易受培养基的成分影响，对菌株的损伤比较大，而且金属离子促进大质粒接合转移，不清楚是否也适合工程质粒(工程质粒一般比较小<10kb)和转座子介导的接合转移；纳米材料使用的是特殊材质，成本高而且不环保，操作复杂，使用后容易造成环境污染等。
(三)发明内容
本发明目的是提供一种接合转移增强液及其在提高细菌接合转移效率中的应用，成本低，使用量少，在环境中易分解；而且该增强液可明显提高接合转移效率，可提高十倍以上；适用范围广，不管是自然质粒的转移还是随机突变文库的构建都能明显提高。
本发明采用的技术方案是：
本发明提供一种接合转移增强液，所述增强液是由二甲基亚砜与甘油和甲醇以体积比(10-200):5:2混合而成，优选20:5:2。
本发明还提供一种所述接合转移增强液在提高细菌接合转移效率中的应用，所述应用是在50-60℃下，将接合转移增强液加入接合转移平板(供体菌株和受体菌株都能生长的培养基平板)中，再进行接合转移。
进一步，所述接合转移包括质粒或转座子的接合转移。
进一步，所述接合转移增强液体积加入量以接合转移平板体积计为0.01-1.0％，优选0.025％。
进一步，所述质粒接合转移包括随机插入突变文库的构建，具体优选为：以含庆大霉素抗性的E.coli WM3064/pBTK30菌体为供体菌，以铜绿假单胞菌PAO1菌体为受体菌，用LB培养基充分悬浮制成菌悬液；取菌悬液加入接合转移平板上，37℃培养箱中静置共培养6h，用LB培养基将接合转移后的混合菌体全部洗涤下来，将洗脱下来的菌液接种至LB+25μg/ml庆大霉素平板上，37℃培养箱中静置共培养，长出的菌株即为含庆大霉素抗性的铜绿假单胞菌；所述接合转移平板是在50-60℃下，向灭菌的LB培养基中加入终浓度0.2mg/ml的DAP，再加入接合转移增强液，充分混匀后倒平板；所述接合转移增强液加入量以含终浓度0.2mg/ml的DAP的LB培养基体积计为0.01-1.0％
进一步，所述供体菌按如下方法制备：将E.coli WM3064/pBTK30接种于含200μg/ml DAP+15μg/ml庆大霉素的LB培养基，37℃的摇床培养箱(180rmp)中培养至对数期(OD600≈1.0)时，6500rpm离心5min，用质量浓度0.85％NaCl水溶液洗涤两次，收集E.coliWM3064/pBTK30菌体。
进一步，所述受体菌安如下方法制备：将铜绿假单胞菌PAO1接种于LB培养基中，置于37℃的摇床培养箱(180rmp)中培养至对数期(OD600≈1.0)时，6500rpm离心5min，用质量浓度0.85％NaCl水溶液洗涤两次，收集铜绿假单胞菌PAO1菌体。
本发明所述转座子接合转移是指：转座子是一类在细菌的染色体、质粒或噬菌体之间自行移动的遗传成分，是基因组中一段特异的具有转位特性的独立的DNA序列。能在不同的宿主细胞之间通过接合转移的方式进行转移的转座子被称为接合性转座子。比如双歧杆菌DSM21854中的红霉素抗性基因erm可以通过接合性转座子转移至另一株双歧杆菌DSM20211中，即以编码红霉素抗性基因erm的双歧杆菌DSM 21854菌体为供体菌，以编码四环素抗性基因tet的双歧杆菌DSM 20211菌体为受体菌，加入M58液体培养基，混匀，制成菌悬液；分别取100μl菌悬液滴在接合转移平板上，37℃厌氧工作站中共培养24h，用M58液体培养基将平板上的菌体洗涤下来，离心，收集接合转移后的菌体，分别涂布于M58培养基+8μg/ml四环素+15μg/ml红霉素，37℃厌氧工作站中倒置培养48h，获得同时含红霉素抗性基因erm和四环素抗性基因tet的双歧杆菌DSM 20211菌体；所述接合转移平板是含0.25μl/ml接合增强液的M58培养基。
本发明方法还适用于涉及细菌之间的耐药基因或者功能基因直接转移，包括基础研究如低转移频率的耐药基因或者质粒的检出，在常规的实验室接合转移操作下经常会被忽视或者漏掉，本发明方法可以提高其检出率等。
与现有技术相比，本发明有益效果主要体现在：
本发明的接合转移增强液可显著提高质粒和转座子的接合转移，效率高，转座子的转移效率从0.3×10-7提高到0.5×10-6(实施例1)，随机插入突变文库的质粒转移效率提高10倍左右(实施例2)；使用范围广，可重复性好，不仅适用于转座子的转移(实施例1)也适用于质粒的转移(实施例2)；操作性强，使用简单，在使用时只需要在接合转移的培养基中加入相应量的试剂混合液即可(具体操作详见实施例1和例2)；能耗低，该发明使用的试剂是常规试剂(DSMO、甘油和甲醇)，易于购买和运送，关键使用比较廉价的原材料。
(四)附图说明
图1.实施例1增强液促进转座子介导的红霉素抗性基因在双歧杆菌间的接合转移在筛选平板3上的生长情况；M58为对照组，M58+0.025％VMRPHD为实验组，重复1和重复2分别代表挑取了2个单菌落进行的实验。
图2.实施例2增强液提高PAO1随机突变文库的构建效率。PIA平板用于计数受体菌株的PAO1的数量；LB+Gen15(LB培养基+15μg/ml庆大霉素)平板用于计数接合子菌株的数量。
图3.实施例1步骤5中电泳检测阳性接合子的四环素抗性基因(A)和红霉素抗性基因(B)。泳道1-泳道4为阳性接合子，5为供体菌DSM 21854，6为受体菌DSM20211。
图4.实施例1步骤6中不同VMRPHD浓度下接合转移效率比较。
(五)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
实施例1、增强液用于转座子介导的细菌间抗性基因接合转移
1、细菌菌株、试剂及培养基
供体菌株：以双歧杆菌(Bifidobacterium kashiwanohense)DSM 21854(购买于德国微生物菌种保藏中心(DSMZ))，该菌株自身编码红霉素抗性基因erm(X)。
受体菌株：双歧杆菌(Bifidobacterium longum)DSM 20211(购买于德国微生物菌种保藏中心(DSMZ))，该菌株自身编码四环素抗性基因tet(W)。
接合转移增强液(记为增强液VMRPHD)为：二甲基亚砜(DMSO)：甘油：甲醇＝20:5:2(v:v:v)
M58培养基：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，牛肉浸膏5g/L，大豆蛋白胨5g/L，葡萄糖10g/L，K2HPO4 2g/L，MgSO4 0.2g/L，MnSO4 0.05g/L，NaCl 5g/L，1ml/L吐温80，半胱氨酸0.5g/L，盐溶液40ml/L，溶剂为水，pH＝6.8；所述盐溶液组成：CaCl2 0.25g/L，MgSO40.5g/L，K2HPO4 1g/L，KH2PO4 1g/L，NaHCO3 10g/L，NaCl 2g/L，溶剂为水。
接合转移平板：M58培养基+0.25μl/ml增强液VMRPHD
筛选平板1：M58培养基+8μg/ml四环素。
筛选平板2：M58培养基+15μg/ml红霉素。
筛选平板3：M58培养基+15μg/ml红霉素+8μg/ml四环素。
2、细菌菌株培养
从双歧杆菌DSM 21854和双歧杆菌DSM 20211的平板上分别挑取单个菌落接种于新鲜的M58培养基中，37℃厌氧工作站(AW400SG/TG，英国Electrotek)中(双歧杆菌是厌氧菌，需要在厌氧的环境中生长比如厌氧袋、厌氧罐和厌氧工作站等)静置培养至对数期(OD600≈1.0)时，分别吸取1ml菌液，6500rpm离心5min，收集菌体，分别用质量浓度0.85％NaCl水溶液洗涤两次，分别获得双歧杆菌DSM 21854菌体和双歧杆菌DSM 20211菌体。
3、接合转移平板的准备
将灭好菌的M58培养基，在室温条件下自然冷却至50℃左右，在每20ml M58培养基中加入5μl的增强液VMRPHD，充分混匀后倒平板，即为接合转移平板。以不加增强液VMRPHD的M58培养基平板为对照平板。
4、接合转移
将步骤2中分别从1ml菌液中收集的双歧杆菌DSM 21854菌体和双歧杆菌DSM20211菌体，加入200μl的M58液体培养基，混匀，制成菌悬液。分别取100μl菌悬液滴在步骤3的接合转移平板(实验组，M58+0.025％VMRPHD)和对照平板(对照，M58)上，每个实验分别挑取了两个单菌落进行实验即重复1和重复2；37℃厌氧工作站中共培养24h，分别用M58液体培养基将平板上的菌体洗涤下来，离心，收集接合转移后的菌体，一部分用于CFU计数(表1)，另一部分涂布于筛选平板1、筛选平板2和筛选平板3上，37℃厌氧工作站中倒置培养48h；通过梯度稀释平板计数，筛选平板1上生长的菌数(CFU)为受体菌数量，记为DSM 20211；筛选平板2上生长的菌数(CFU)，记为DSM 21854；能够在筛选平板3上生长的菌株记为阳性接合子(同时编码tet基因和erm基因)，最后通过公式W＝X/Y(W接合转移效率，X阳性接合子数量，Y受体菌数量)计算接合转移效率W(图1)。
表1阳性接合子、受体菌株和供体菌株的CFU计数
Figure BDA0002616167150000061
图1和表1结果发现实验组在筛选平板3上的接合子效率(0.60×10-6)明显高于对照组(0.31×10-7)。
5、接合子阳性验证
为了避免假阳性，确定接合子的正确性，我们通过PCR验证了其正确性：设计了扩增erm(X)和tet(W)特异性引物Erm-F:5'ATAACGGCAGTTGAAGTGGA3'/Erm-R:5'CATGAAGTTGTTGGGTGGC 3'和TetW-F:5'AAAAGGGACAACGAGG ACG 3'/TetW-R:5'ACAGCAAAGCGGAAACAAC 3'；PCR程序95℃5min-(95℃30s-58℃30s-72℃1min)30个循环-72℃5min；以供体菌株和受体菌株分别作为对照，受体菌株只能扩增出tet基因，供体菌株只能扩增出erm基因，阳性接合子能同时扩增出tet基因和erm基因；将步骤4中筛选平板3(M58培养基+15μg/ml红霉素+8μg/ml四环素)上长出的单菌落挑取到新的筛选平板3(M58培养基+8μg/ml四环素+15μg/ml红霉素)中，厌氧工作站37℃静置培养24h后，12000rpm离心5min收集菌体，取4份菌体(图3中泳道1-泳道4)，同时取供体菌(图3中泳道5)和受体菌(图3中泳道6)，利用天根基因组提取试剂盒提取基因组DNA，作为模板用于PCR扩增erm(图3中B)和tet(图3中A)，电泳检测结果见图3，表明挑选的接合子全部为阳性接合子(同时含有tet基因和erm基因)。
6、增强液VMRPHD浓度对接合转移效率的影响
将步骤4实验组M58+0.025％VMRPHD中VMRPHD浓度分别改为M58+0.001％VMRPHD、M58+0.025％VMRPHD、M58+0.05％VMRPHD和M58+1.0％VMRPHD，其他操作同步骤4，筛选平板3上生长的菌株见图4所示，结果当VMRPHD浓度低于0.01％时接合子效率与M58培养基相同，当浓度高于1.0％(比如2.0％时)没有接合子出现。
实施例2、增强液在PAO1中构建随机插入突变文库的作用
1、菌株、试剂及培养基
供体菌株：大肠杆菌E.coli WM3064/pBTK30(质粒pBTK30为铜绿假单胞菌随机插入文库构建的质粒，pBTK30通过化学转化导入到菌株E.coli WM3064中，通过抗性筛选得到E.coli WM3064/pBTK30)，E.coli WM3064为营养缺陷菌株，需要提供DAP；pBTK30为庆大霉素抗性，复制子为ori R6K，具有接合转移能力。
受体菌株：铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)PAO1，生长于PIA平板，但是大肠杆菌不能生长。
增强液VMRPHD为：二甲基亚砜(DMSO)：甘油：甲醇＝20:5:2(v:v:v)
LB培养基：蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 10g/L，溶剂为水，pH值自然。
2、菌株培养
将E.coli WM3064/pBTK30接种于含200μg/ml DAP(2,6-二氨基庚二酸)+15μg/ml庆大霉素的LB培养基，37℃的摇床培养箱(180rmp)中培养至对数期(OD600≈1.0)时，吸取1ml菌液，6500rpm离心5min，用质量浓度0.85％NaCl水溶液洗涤两次，收集E.coli WM3064/pBTK30菌体。
将铜绿假单胞菌PAO1接种于LB培养基中，置于37℃的摇床培养箱(180rmp)中培养至对数期(OD600≈1.0)时，吸取1ml菌液，6500rpm离心5min，用质量浓度0.85％NaCl水溶液洗涤两次，收集铜绿假单胞菌PAO1菌体。
3、接合转移平板的准备
将灭好菌的LB培养基，在室温条件下自然冷却至50℃左右，加入终浓度0.2mg/ml的DAP，再分别按照20ml:20μl或者20ml:200μl的比例加入增强液VMRPHD，即在20ml LB+DAP培养基中加入20μl或者200μl的增强液VMRPHD，充分混匀后倒平板，即获得接合转移平板LB+DAP+0.1％VMRPHD和接合转移平板LB+DAP+1.0％VMRPHD，以不加增强液VMRPHD的LB+DAP培养基平板为对照平板。
4、接合转移
将步骤2中分别从1ml菌液收集的E.coli WM3064/pBTK30菌体和铜绿假单胞菌PAO1菌体，用300μl的LB培养基充分悬浮制成菌悬液。分别取100μl菌悬液滴在步骤3的接合转移平板LB+DAP+0.1％VMRPHD和接合转移平板LB+DAP+1.0％VMRPHD及对照平板上，37℃培养箱中静置共培养6h，用LB培养基将接合转移后的混合菌体全部洗涤下来。每个实验挑取了2个单菌落分别进行了接合转移实验，实验结果见重复1和重复2。
为了记录受体菌株的数量，将接合转移后洗脱下来的菌液在PIA(假交替单胞菌分离培养基，购买于BD公司，PAO1可以生长在该培养基但是大肠杆菌不能生长)平板上进行计数，获得受体菌数量；为了记录接合子菌株的数量，将接合转移后洗脱下来的菌液在LB+25μg/ml庆大霉素(Gen)平板(供体菌株为营养缺陷型菌株，必须在添加有DAP的培养基中才能生长，故不能生长在该培养基，而受体菌株没有庆大霉素抗性故不能生长在含有庆大霉素抗性的平板上，因此只有接合子才能生长在LB+25μg/ml庆大霉素平板)进行CFU计数，获得接合子数量。
通过10-1-10-6梯度稀释平板计数，记录接合子(生长于LB+25μg/ml庆大霉素平板)和受体(生长于PIA平板，而供体菌株不能生长PIA平板)的个数(CFU)，最后通过公式W＝X/Y(W接合转移效率，X接合子数量，Y受体菌数量)计算接合转移效率W。结果见图2。从图2中的实验结果可以得出，对照平板和实验平板上受体菌株的数量是差不多，但是接合子数量上有明显的区别，在添加0.1％和1.0％VMRPHD的实验组中接合子数量明显多于对照组(没有加VMRPHD试剂)。

Claims (7)

1.一种接合转移增强液，其特征在于所述增强液是由二甲基亚砜与甘油和甲醇以体积比10-200:5:2混合而成。
2.一种权利要求1所述接合转移增强液在提高细菌接合转移效率中的应用。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于所述应用是：在50-60℃下，将接合转移增强液加入接合转移平板中，接种受体菌和供体菌进行接合转移。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述接合转移包括质粒或转座子的接合转移。
5.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述接合转移增强液体积加入量以接合转移平板体积计为0.01-1.0％。
6.如权利要求4所述的应用，其特征在于所述质粒接合转移为随机插入突变文库的构建，所述随机插入突变文库的构建方法为：以含庆大霉素抗性的E.coli WM3064/pBTK30菌体为供体菌，以铜绿假单胞菌PAO1菌体为受体菌，用LB培养基充分悬浮制成菌悬液；取菌悬液加入接合转移平板上，37℃培养箱中静置共培养6h，用LB培养基将接合转移后的混合菌体全部洗涤下来，将洗脱下来的菌液接种至LB+25μg/ml庆大霉素平板上，37℃培养箱中静置共培养，长出的菌株即为含庆大霉素抗性的铜绿假单胞菌；所述接合转移平板是在50-60℃下，向灭菌的LB培养基中加入终浓度0.2mg/ml的DAP，再加入接合转移增强液，充分混匀后倒平板；所述接合转移增强液加入量以含终浓度0.2mg/ml的DAP的LB培养基体积计为0.01-1.0％。
7.如权利要求4所述的应用，其特征在于所述转座子的接合转移是将双歧杆菌DSM21854中的红霉素抗性基因erm通过接合性转座子转移至双歧杆菌DSM 20211中，所述接合转移按如下步骤进行：以含红霉素抗性基因erm的双歧杆菌DSM 21854菌体为供体菌，以含四环素抗性基因tet的双歧杆菌DSM 20211菌体为受体菌，加入M58液体培养基，混匀，制成菌悬液；分别取菌悬液滴在接合转移平板上，37℃厌氧工作站中共培养24h，用M58液体培养基将平板上的菌体洗涤下来，离心，收集接合转移后的菌体，分别涂布于M58培养基+8μg/ml四环素+15μg/ml红霉素，37℃厌氧工作站中倒置培养48h，获得同时含红霉素抗性基因erm和四环素抗性基因tet的双歧杆菌DSM 20211菌体；所述接合转移平板是含0.025％接合增强液的M58培养基。
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Assignee: Guangzhou Qishui Biotechnology Co.,Ltd.

Assignor: HUNAN University OF SCIENCE AND ENGINEERING

Contract record no.: X2023980054826

Denomination of invention: A Joint Transfer Enhancement Liquid and Its Application in Improving the Efficiency of Bacterial Joint Transfer

Granted publication date: 20230721

License type: Common License

Record date: 20240103

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