CN112442490A

CN112442490A - 一种转化酶及其在产s-雌马酚中的应用

Info

Publication number: CN112442490A
Application number: CN202011344813.4A
Authority: CN
Inventors: 胡云霏; 尹业师; 陈华海; 曹林艳; 李百元; 张飞
Original assignee: Hunan University of Science and Engineering
Current assignee: Hunan University of Science and Engineering
Priority date: 2020-11-26
Filing date: 2020-11-26
Publication date: 2021-03-05
Anticipated expiration: 2040-11-26
Also published as: CN112442490B

Abstract

本发明公开了一种转化酶及其在产S‑雌马酚中的应用，所述转化酶的氨基酸序列为SEQID NO.2所示。本发明提供的C1‑2079基因编码的转化酶可直接在有氧条件下将DHD转化为大豆苷元，通过pH反应条件的控制可实现DHD和大豆苷元的转化调控，为肠道菌产雌马酚机制和调控提供重要参考价值；同时，本发明提供的C1‑2079基因编码的转化酶在辅酶因子存在的无氧条件下，可将大豆苷元转化为DHD，以此构建的含C1‑2079转化酶基因的工程菌可在原来工程菌的基础上将S‑雌马酚产量提高9％，工艺研究前景广阔。

Description

一种转化酶及其在产S-雌马酚中的应用

(一)技术领域

本发明涉及一种大豆苷元转化功能基因C1-2079及其在产S-雌马酚中的应用。

(二)背景技术

S-雌马酚是大豆异黄酮经某些肠道细菌代谢后的终产物，其生物活性比大豆异黄酮更好。作为一种类雌激素化合物，S-雌马酚的安全性比雌激素高，多项体内外实验结果表明，S-雌马酚是雌激素在临床上更安全的替代品(Matsumoto T,Kojima M,Takayanagi K,Taguchi K,Kobayashi T.Role of S-Equol,Indoxyl Sulfate,and Trimethylamine N-Oxide on Vascular Function.Am J Hypertens.2020 Sep 10；33(9):793-803.)。目前的研究表明，S-雌马酚具有抗氧化应激和抗炎等功能，在防治心血管相关疾病和绝经妇女雌激素相关疾病等方面具有广阔的应用前景；同时又具备抑菌、调节免疫、缓解个体抑郁和焦虑以及改善记忆损伤等功能。近年来，国内相关研究发现，S-雌马酚具有抑制肿瘤细胞生长、调节肠道菌群结构、降压降血脂等功能。目前已有部分S-雌马酚相关研究成果转向了临床应用，例如美白化妆品(Ayashibara Co.,Ltd.Japan)、女性更年期保健品(Advancedmedical care.Japan)以及改善脱发洗发乳(Keramine H.Italy)等产品。可以预计，随着对S-雌马酚功能认识的不断深入，其市场应用前景也将越来越广阔。

虽然所有啮齿类动物都具有产雌马酚能力，但人类只有30-50％的个体具备转化大豆苷元生产S-雌马酚的能力，且大豆类食物摄取量高的东亚地区人群产雌马酚比例显著高于西方人群。虽然已从人、鼠、猪、鸡和牛等动物的肠道中分离到了不同类型的产S-雌马酚菌，但已知的产S-雌马酚细菌种类仍然不多，对于产S-雌马酚菌种类、大豆类饮食习惯以及人类个体产S-雌马酚能力差异的关系仍不太清楚。

由于不同个体转化大豆异黄酮生产S-雌马酚能力存在很大差异，体外补充S-雌马酚成为一种替代策略，但产S-雌马酚细菌体外培养条件苛刻、产量低，而化学合成S-雌马酚成本高且手性分离困难等原因严重制约了S-雌马酚的产业化推广，采用基因工程菌进行生产是未来S-雌马酚量产的发展方向。

日本Haretsugu H(Schroder C,Matthies A,Engst W,et al.Identificationand expression of genes involved in the conversion of daidzein and genisteinby the equol-forming bacterium Slackia isoflavoniconvertens[J].Appl EnvironMicrobiol,2013,79(11):3494-3502.)研究团队从肠道菌Lac 20-92中发现了产S-雌马酚的4种必须基因：DZNR、DDRC、DHDR和THDR，它们的功能是依次将大豆苷元转化为R-二氢大豆苷元(R-DHD)、S-二氢大豆苷元(S-DHD)、四氢大豆苷元(THD)和S-雌马酚，并发现DDRC是影响S-雌马酚生产效率的关键基因。韩国Lee P研究团队在产S-雌马酚菌DSM19450T中却发现不一样的结果：DHDR才是影响S-雌马酚生产效率的关键基因(Lee P G,Kim J,Kim E J,etal.Biosynthesis of(-)-5-hydroxy-equol and 5-hydroxy-dehydroequol from soyisoflavone,genistein using microbial whole cell bioconversion[J].ACS ChemBiol,2017,12(11):2883-2890.)。不同产S-雌马酚菌的S-雌马酚转化机制会存在差异，关键功能基因的酶活性可能决定了产S-雌马酚效率，进一步对产S-雌马酚功能基因进行挖掘、了解产S-雌马酚作用机制，是实现S-雌马酚工业化生产的基础。

本发明前期从鸡肠道中分离获得一株产S-雌马酚梭菌C1(ZL201410320599.7)，从该菌的全基因组中分离鉴定了一个大豆苷元转化基因——C1-2079，该基因的重组蛋白酶在有NADPH、NADH存在的无氧条件下，具有与DZNR相似的酶活性，即可将大豆苷元转化为DHD，同时又发现C1-2079具备DZNR所没有的反向酶活性——将DHD转化为大豆苷元，而不需要任何辅酶参与，也不受溶氧的影响。通过对pH等条件的改变，可实现对大豆苷元与DHD的相互转化调控，这说明不同环境条件对C1-2079功能的作用，可显著影响细菌的S-雌马酚产率。

(三)发明内容

本发明目的是提供一种大豆苷元转化基因C1-2079及其应用，该转化基因能够催化大豆苷元转化、DHD逆转化以及参与S-雌马酚的生产，并可为肠道菌产S-雌马酚机制和调控方式研究提供重要参考。C1-2079基因为大豆苷元转化雌马酚基因工程菌研究提供新的基因资源，根据C1-2079构建的产S-雌马酚工程菌可在原来工程菌的基础上将S-雌马酚产量提高9％。

本发明采用的技术方案是：

本发明提供一种用于大豆苷元转化、二氢大豆苷元(DHD)逆转化的转化酶C1-2079，所述转化酶C1-2079编码基因核苷酸序列为SEQID NO.1所示，转化酶的氨基酸序列为SEQID NO.2所示。

本发明所述转化酶C1-2079基因来源于鸡肠道的雌马酚产生梭菌(Clostridiumsp.)CGMCC No.9123，已在专利申请(ZL201410320599.7)中公开。

本发明还涉及含转化酶C1-2079编码基因的载体，所述载体包含与适合指导在宿主细胞中表达的控制序列可操作地连接的多核苷酸，优选该表达载体为PETDute-1。

本发明还涉及由转化酶C1-2079基因转化获得的重组基因工程菌，所述重组基因工程菌是将含转化酶C1-2079基因的载体导入宿主菌构建而成，所述宿主菌优选大肠杆菌E.coli BL21(DE3)；具体构建方法为：转化酶C1-2079基因用NotI和AvrII限制性内切酶做酶切，与经同样酶切条件处理的PETDute-1质粒进行连接，构建重组质粒PETDute-1-C1-2079；将重组质粒PETDute-1-C1-2079转入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，获得重组基因工程菌。

本发明所述利用转化酶C1-2079基因制备转化酶C1-2079的方法为：将含转化酶C1-2079基因的重组基因工程菌进行诱导表达培养，培养液分离得到含有转化酶C1-2079的菌体细胞，破碎后获得的转化酶C1-2079酶液进行纯化，获得转化酶C1-2079纯酶。

本发明提供一种转化酶C1-2079在催化大豆苷元生成DHD中的应用，所述应用的方法为：以转化酶C1-2079为催化剂，以大豆苷元为底物，以NADPH、NADH为辅酶，加入亚硫酸氢钠、二硫苏糖醇(DTT)和苯甲基磺酰氟(PMSF)，以pH7.0的0.1M磷酸钾缓冲液为反应介质构成反应体系，在37℃厌氧条件下反应2-4h后，得到含有DHD的转化液；所述反应体系中，转化酶C1-2079加入终浓度为40μg/ml，大豆苷元加入终浓度为20μg/ml，NADPH和NADH加入终浓度均为500μg/ml，亚硫酸氢钠加入终浓度为0.5mg/ml，DTT加入终浓度均为0.3mg/ml，PMSF加入终浓度均为0.2mg/ml。

本发明还提供一种转化酶C1-2079在催化DHD生成大豆苷元中的应用，所述应用的方法：以转化酶C1-2079为催化剂，以DHD为底物，以pH 6.5的0.1M柠檬酸盐缓冲液为反应介质构成反应体系，在37℃条件下反应2-4h后，得到含有大豆苷元的转化液；所述反应体系中，转化酶C1-2079加入终浓度为40μg/ml，DHD加入终浓度为20μg/ml。

本发明所述转化酶C1-2079按如下方法制备：将含转化酶C1-2079基因的重组基因工程菌单菌落，在100ml含有100μg/ml氨苄抗性的LB培养基中，37℃，180rpm孵育6-8h；当细菌OD₆₀₀为0.6时，加入终浓度为0.2mM的IPTG，在16℃，120rpm条件下诱导表达16h；诱导表达所得的菌液在4℃，6000rpm条件下离心获得菌泥，将所获得的菌泥用pH7.0的PBS洗涤两次后，加入5ml的PBS悬浮菌体，在30Hz功率的超声波破碎仪中，以5s超声、7s间隔、4℃的条件超声10min；将破碎的菌液在4℃，12 000rpm离心10min，获得上清液；在上清液中加入等体积结合缓冲液(0.5M NaCl，20mM Tris-HCl，5mM咪唑，pH 7.9)，以1ml/min的流速加入到琼脂糖Ni亲和层析柱中过柱，再用15ml洗涤缓冲液(0.5M NaCl，20mM Tris-HCl，60mM咪唑，pH7.9)以2ml/min的流速洗涤，随后用2ml洗脱缓冲液(0.5M NaCl，20mM Tris-HCl，1M咪唑，pH7.9)在0.5ml/min的流速条件下洗脱目的蛋白，收集所有洗脱液作为纯化的目的蛋白，即为转化酶C1-2079。

本发明还提供一种所述转化酶C1-2079在制备S-雌马酚中的应用，具体为：以含转化酶C1-2079基因、二氢大豆苷元外消旋酶(DDRC)编码基因、二氢大豆苷元还原酶(DHDR)编码基因、四氢大豆苷元还原酶(THDR)编码基因的工程菌发酵培养液作为催化剂，以大豆苷元为底物，在37℃条件下静置发酵6-8h，获得含S-雌马酚的反应液，分离纯化，获得S-雌马酚；所述大豆苷元加入终浓度为40μg/ml；所述催化剂中菌体OD₆₀₀为1.8。

进一步，所述催化剂按如下方法制备：将含转化酶C1-2079编码基因、DDRC编码基因、DHDR编码基因、THDR编码基因的工程菌接种至含有100μg/ml氨苄抗性和100μg/ml链霉素抗性的LB培养基中，37℃、180rpm孵育；当细菌OD₆₀₀为0.6时，加入终浓度为0.2mM的IPTG，在16℃、120rpm条件下诱导表达16h，获得发酵培养液。

进一步，所述含C1-2079编码基因、DDRC编码基因、DHDR编码基因、THDR编码基因的工程菌按如下方法构建：(1)用转化酶C1-2079基因替换载体PETDute-1-L-DZNR-DDRC(参见专利ZL201710516610.0)中DZNR基因，构建质粒PETDute-1-C1-2079-DDRC；(2)将PETDute-1-C1-2079-DDRC质粒加入到含0.1M氯化钙的大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞液中，冰浴30min，然后42℃热冲击90s，再冰浴2min，加入4倍体积的LB培养基，37℃，180rpm孵育1h；收集孵育后的菌泥涂布到含有100μg/ml氨苄抗性的LB平板中，37℃培养12-16h；(3)挑取长出来的单菌落，在含有100μg/ml氨苄抗性的LB培养基中，37℃、180rpm培养2-4h至细菌OD₆₀₀为0.1；取菌液，在5000rpm条件下离心获得菌泥，将所获得的菌泥用无菌0.1M的CaCl₂溶液洗涤三次后，加入菌液等体积预冷的0.1M无菌CaCl₂溶液悬浮菌体，然后在冰浴条件下孵育2-4h；(4)将PCDFDute-L-DHDR-THDR质粒(参见专利ZL201710516610.0)加入到步骤(3)冰浴后的菌液中，将步骤(2)中氨苄抗性改为100μg/ml氨苄和100μg/ml链霉素抗性，其他操作同步骤(2)，构建含PETDute-1-C1-2079-DDRC和PCDFDute-L-DHDR-THDR的重组大肠杆菌BL21(DE3)工程菌，即为产S-雌马酚工程菌。

进一步，所述含S-雌马酚的反应液分离纯化方法为：(1)反应液在5000rpm的条件下离心5min，然后转移上清液到新的离心管中，加入等体积的乙酸乙酯充分混匀、萃取；(2)将混合液在5000rpm离心5min，获得的上层液用离心冷冻浓缩仪浓缩，得到浓缩的冻干样品；(3)在样品中加入0.2ml甲醇溶解，利用高效液相色谱检测分离的样品。

与现有技术相比，本发明有益效果主要体现在：本发明提供的C1-2079基因编码的转化酶可直接在有氧条件下将DHD转化为大豆苷元，通过pH反应条件的控制可实现DHD和大豆苷元的转化调控，为肠道菌产雌马酚机制和调控提供重要参考价值；同时，本发明提供的C1-2079基因编码的转化酶在辅酶因子存在的无氧条件下，可将大豆苷元转化为DHD，以此构建的含C1-2079转化酶基因的工程菌可在原来工程菌的基础上将S-雌马酚产量提高9％，工艺研究前景广阔。

(四)附图说明

图1为PETDute-1-C1-2079质粒酶切电泳图，泳道1为PETDute-1-C1-2079质粒；泳道2为经NotI和AvrII酶切的PETDute-1-C1-2079质粒；M为DNA Marker。

图2为C1-2079与已知DZNR氨基酸相似性比较图。

图3为转化酶C1-2079纯化SDS-PAGE图，泳道1为纯化的转化酶C1-2079，M为蛋白Marker。

图4为转化酶C1-2079催化大豆苷元反应图。

图5为转化酶C1-2079催化DHD反应图。

图6为PETDute-1-C1-2079-DDRC、PCDFDute-L-DHDR-THDR BL21(DE3)工程菌诱导表达后的SDS-PAGE图，泳道1为C1-2079、DDRC、DHDR、THDR重组蛋白，M为蛋白Marker。

图7为PETDute-1-C1-2079-DDRC、PCDFDute-L-DHDR-THDR BL21(DE3)工程菌发酵产S-雌马酚图。

(五)具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

LB培养基组成：胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、NaCl 5g/L，溶剂为水，pH7.4。

LB平板组成：胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、NaCl 5g/L，琼脂15g/L，溶剂为水，pH7.4。

实施例1：转化酶C1-2079基因重组载体构建

采用OMEGA革兰氏阳性菌DNA试剂盒提取方法，提取来源于鸡肠道的雌马酚产生梭菌(Clostridium sp.)CGMCC No.9123(参见专利申请ZL201410320599.7)的基因组DNA作为模板，采用表1中引物进行PCR扩增，反应体系为：上游引物2μl，下游引物2μl，10×buffer10μl，dNTPs 2μl，pfu酶2μl，模板DNA 0.5μl，ddH₂O 82μl；扩增条件如下：94℃5min；94℃30s，53℃30s，72℃2min，重复30循环；72℃继续延伸10min。

表1 C1-2079基因的克隆引物

注：下划线为酶切位点

PCR产物用0.8％的琼脂糖凝胶电泳检测，切胶回收PCR产物，用NotI和AvrII限制性内切酶在37℃条件下对回收的PCR产物进行1h酶切，将酶切的产物做清洁处理后与经同样酶切条件处理的PET-Dute-1质粒进行连接，16℃孵育过夜；将连接产物转化大肠杆菌TOP10的感受态细胞(北京全式金生物)，转化条件为：冰浴30min，然后42℃热冲击90s，再冰浴2min，加入4倍体积的LB培养基，37℃，180rpm孵育1h；收集孵育后的菌泥涂布到含有100μg/ml氨苄抗性的LB平板中，37℃培养12-16h；挑取长出来的单菌落，在10ml含有100μg/ml氨苄抗性的LB中，37℃，180rpm培养12-16h；提取细菌中的质粒PETDute-1-C1-2079，质粒用NotI和AvrII限制性内切酶在37℃条件下进行酶切，酶切结果见图1所示，酶切后分别得到质粒和目的片段；取酶切产物进行基因测序鉴定(核苷酸序列为SEQ ID No.1所示，氨基酸序列SEQ ID No.2所示)，质粒即为构建好的转化酶C1-2079编码基因重组载体。测序得到的氨基酸序列信息，在NCBI中与已报道的DZNR氨基酸信息进行序列相似性分析，结果显示，转化酶C1-2079氨基酸序列与已知DZNR氨基酸序列相似性不高，相似度最高不到50％(图2)。

实施例2：C1-2079基因工程菌的构建

将实施例1构建的PETDute-1-C1-2079质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞(购自北京全式金生物)，转化条件为：将质粒PETDute-1-C1-2079加入到大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，冰浴30min，然后42℃热冲击90s，再冰浴2min，加入4倍体积的LB培养基，37℃、180rpm孵育1h；收集孵育后的菌泥涂布到含有100μg/ml氨苄抗性的LB平板中，37℃培养12-16h；挑取长出来的单菌落，在10ml含有100μg/ml氨苄抗性的LB培养基中，37℃、180rpm培养6-8h；当细菌OD₆₀₀为0.6时，取0.5ml菌液，加入0.5ml 30％浓度的灭菌甘油在-80℃保存，即为含转化酶C1-2079基因的重组基因工程菌。

实施例3：转化酶C1-2079的制备

挑取实施例2构建的含转化酶C1-2079基因的重组基因工程菌单菌落，在100ml含有100μg/ml氨苄抗性的LB培养基中，37℃，180rpm孵育6-8h；当细菌OD₆₀₀为0.6时，加入终浓度为0.4mM的IPTG，在16℃，120rpm条件下诱导表达16h；诱导表达所得的菌液在4℃，6000rpm条件下离心获得菌泥，将所获得的菌泥用pH7.0的PBS洗涤两次后，加入5ml的PBS悬浮菌体，在30Hz功率的超声波破碎仪中，以5s超声、7s间隔、4℃的条件超声10min；将破碎的菌液在4℃，12 000rpm离心10min，获得上清液；在上清液中加入等体积结合缓冲液(0.5MNaCl，20mM Tris-HCl，5mM咪唑，pH 7.9)，以1ml/min的流速加入到琼脂糖Ni亲和层析柱中过柱，再用15ml洗涤缓冲液(0.5M NaCl，20mM Tris-HCl，60mM咪唑，pH 7.9)以2ml/min的流速洗涤，随后用2ml洗脱缓冲液(0.5M NaCl，20mM Tris-HCl，1M咪唑，pH 7.9)在0.5ml/min的流速条件下洗脱目的蛋白，收集所有洗脱液作为纯化的目的蛋白样品进行SDS-PAGE检测，结果见图3；最后采用BCA试剂盒测定蛋白浓度，获得2ml浓度为1.2mg/ml的纯化样品，即为转化酶C1-2079，加入等量甘油冻存在-80℃。

实施例4：转化酶C1-2079酶功能测定

将实施例3方法获取的转化酶C1-2079用于大豆苷元、DHD的催化反应。

(1)酶测定体系组成及大豆苷元催化条件如下：终浓度40μg/ml的转化酶C1-2079，终浓度20μg/ml的大豆苷元，终浓度500μg/ml的NADPH和终浓度500μg/ml的NADH，终浓度0.5mg/ml的亚硫酸氢钠，终浓度0.3mg/ml的DTT，终浓度0.2mg/ml的PMSF，100mM、pH 7.0磷酸钾缓冲液为反应介质补齐至1mL，在37℃无氧条件下孵育4h。样品加入0.7ml乙酸乙酯充分混匀、萃取，5000rpm离心5min，获得的上层液用真空冷冻离心浓缩仪在0℃、抽真空条件下浓缩至干，获得浓缩的样品14.5μg；加入0.2ml甲醇溶解样品，利用高效液相色谱检测产物的生成。大豆苷元的出峰时间在7.6min左右，DHD的出峰时间在8.5min左右，检测结果显示，除了在7.6min处检测到大豆苷元出峰，在8.5min处还检测到DHD的出峰，说明转化酶C1-2079催化大豆苷元生成了DHD(图4)。

(2)酶测定体系组成及DHD催化条件如下：终浓度40μg/ml的转化酶C1-2079，终浓度20μg/ml的DHD，100mM、pH 6.5柠檬酸盐缓冲液为反应介质补齐至1mL，在37℃恒温箱中孵育2h，加入0.7ml乙酸乙酯充分混匀、萃取，5000rpm离心5min，获得的上层液用真空冷冻离心浓缩仪在0℃、抽真空条件下浓缩至干，获得浓缩的样品15μg；加入0.2ml甲醇溶解样品，利用高效液相色谱检测产物的生成。大豆苷元的出峰时间在7.6min左右，DHD的出峰时间在8.5min左右，检测结果显示，除了在8.5min处检测到DHD的出峰，在7.6min处还检测到大豆苷元的出峰，说明转化酶C1-2079催化DHD生成了大豆苷元(图5)。(1)和(2)说明转化酶C1-2079在不同条件下可实现大豆苷元和DHD的相互转化。

大豆苷元和DHD的检测方法(HPLC)：

高效液相色谱仪器：岛津CBM-20A/CBM-20Alite系统-SPD-20A紫外检测器

检测采用的色谱柱：SunFire^TM C18(5um,4.6×205mm column)，10％乙腈和0.1％乙酸为流动相A，90％乙腈和0.1％乙酸为流动相B，流速1mL/min，检测温度30℃，检测波长254nm和275nm，进样量10μL。

实施例5：包含转化酶C1-2079基因的产S-雌马酚基因工程菌构建和应用

1、构建质粒PETDute-1-C1-2079-DDRC

按照实施例1的方式，制备经NotI和AvrII限制性内切酶处理好的C1-2079基因；以产S-雌马酚共表达载体PETDute-1-L-DZNR-DDRC为模式载体(参见专利ZL201710516610.0)，用NotI和AvrII限制性内切酶对PETDute-1-L-DZNR-DDRC进行酶切，37℃作用1h，将获得的酶切产物在0.8％浓度的琼脂糖凝胶中进行电泳，并通过切胶回收获得PETDute-1-DDRC质粒，然后通过T4连接酶对C1-2079和PETDute-1-DDRC进行连接，16℃孵育过夜；将连接产物转化大肠杆菌TOP10的感受态细胞(北京全式金生物)，转化条件为：冰浴30min，然后42℃热冲击90s，再冰浴2min，加入4倍体积的LB培养基，37℃，180rpm孵育1h；收集孵育后的菌泥涂布到含有100μg/ml氨苄抗性的LB平板中，37℃培养12-16h；挑取长出来的单菌落，在10ml含有100μg/ml氨苄抗性的LB中，37℃，180rpm培养12-16h；提取细菌中的质粒PETDute-1-C1-2079-DDRC，并进行基因测序鉴定(C1-2079核苷酸序列为SEQ ID No.1所示，氨基酸序列SEQ ID No.2所示)，质粒即为构建好的PETDute-1-C1-2079-DDRC编码基因重组载体。

2、质粒PETDute-1-C1-2079-DDRC与质粒PCDFDute-L-DHDR-THDR共表达

(1)将PETDute-1-C1-2079-DDRC质粒25ng，加入到100μl含0.1M氯化钙的大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞溶液中(～10⁶cfu/ml)，冰浴30min，然后42℃热冲击90s，再冰浴2min，加入4倍体积的LB培养基，37℃，180rpm孵育1h；收集孵育后的菌泥涂布到含有100μg/ml氨苄抗性的LB平板中，37℃培养12-16h；挑取长出来的单菌落，在10ml含有100μg/ml氨苄抗性的LB培养基中，37℃、180rpm培养6-8h，构建含PETDute-1-C1-2079-DDRC的重组大肠杆菌BL21(DE3)工程菌。

(2)挑取步骤(1)构建的含PETDute-1-C1-2079-DDRC的重组大肠杆菌BL21(DE3)工程菌单菌落，在10ml含有100μg/ml氨苄抗性的LB培养基中，37℃、180rpm培养，当细菌OD₆₀₀为0.1时，取1ml菌液，在5000rpm条件下离心2min获得菌沉，然后用1ml 0.1M的无菌氯化钙水溶液悬浮、洗涤细菌，再按相同的离心条件获得洗涤后的菌沉，并重复洗涤3次；洗涤后的菌沉用1ml冰浴冷的0.1M无菌氯化钙水溶液悬浮，在冰浴条件下静置2-4h，作为步骤(3)的感受态细胞。

(3)将PCDFDute-L-DHDR-THDR质粒(参见专利ZL201710516610.0)25ng，加入到50ul步骤(2)制备的感受态细胞中，将步骤(1)中氨苄抗性改为100μg/ml氨苄和100μg/ml链霉素抗性，其他操作同步骤(1)，构建含PETDute-1-C1-2079-DDRC和PCDFDute-L-DHDR-THDR的重组大肠杆菌BL21(DE3)工程菌，即为产S-雌马酚工程菌。

(4)S-雌马酚的合成

挑取步骤(3)产S-雌马酚工程菌单菌落，在100ml含有100μg/ml氨苄抗性和100μg/ml链霉素抗性的LB培养基中，37℃、180rpm孵育6-8h；当细菌OD₆₀₀为0.6时，加入终浓度为0.2mM的IPTG，在16℃，120rpm条件下诱导表达16h，取10ml菌液进行SDS-PAGE检测，结果见图6，C1-2079、THDR、DHDR、DDRC的蛋白大小表达分别在75kDa、60kDa、30kDa、20kDa左右，均有可溶性表达。

另取10ml诱导后的菌液(OD₆₀₀为1.8)，加入NaOH调节pH到6.5，加入终浓度40μg/ml的大豆苷元，在37℃条件下静置发酵8h；在1ml发酵液中加入0.7ml乙酸乙酯充分混匀、萃取，5000rpm离心5min，获得的上层液用离心冷冻浓缩仪在0℃、抽真空条件下浓缩至干，浓缩的样品加入0.2ml甲醇溶解，利用高效液相色谱检测S-雌马酚的生成。大豆苷元出峰时间在7.4min左右，S-雌马酚出峰时间在10.8min左右，结果显示，在10.8min左右检测到S-雌马酚的出峰(图7)，S-雌马酚的产量为35.44μg/ml，转化率为88.6％。

以产S-雌马酚模式工程菌DDDT-BL21(DE3)为参考菌株(参见专利ZL201710516610.0)，按照以上包含C1-2079的产S-雌马酚菌株大豆苷元发酵和检测方法，测定模式工程菌的S-雌马酚生成情况，产量为32μg/ml，转化率为80％。包含C1-2079的产S-雌马酚工程菌相比于以往的模式菌株，S-雌马酚转化率提高～9％。

大豆苷元和S-雌马酚的检测方法(HPLC)：

检测采用的色谱柱：SunFire^TM C18(5um,4.6×205mm column)，0.01％的三氟乙酸水溶液为流动相A，40％甲醇和60％乙腈为流动相B，流速0.8mL/min，检测温度30℃，检测波长254和205nm，进样量5μL。

序列表

<110> 湖南科技学院

<120> 一种转化酶及其在产S-雌马酚中的应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1929

<212> DNA

<213> 雌马酚产生梭菌(Clostridium sp.)

<400> 1

atgaaaaaca aatattaccc tcatctattt gaaaaaggaa aaattggaaa cgttgttatc 60

aaaaatagaa ttgtacgtaa ttctatggga acgtacttag gtaatccaga tggtacagtc 120

actgatagac aaattaaagc ttatgcacaa gctgctgatg gtggtgctgg acttattttt 180

atggataatg ctgtacctgt tcctatgaca tcttgtggtt taagagcgga caaagatgaa 240

tttattgctg gattaacttt gttggcagaa acagtcaaag aacatggagc aactcctggt 300

ctacaattgg cacatcctgg tagagatgca gcatttgtag gaagtgctga tgttattgga 360

gcatcaccaa ttacttttga accatggtat gaaatgggat ttaaaatgcc tagagcttta 420

actattgaag aaattcatga tttagtagag aaatttggag atgctgcttt aagagcaaaa 480

aaagctgggt ttgaagtcct tgaaattcat ggggctgctg gatgtattcc tacaaatttc 540

ttatcacctc atgataacaa acgtactgat atgtatggtg gatcactgca taatcgtatg 600

agattattga tagagattgt cagaaatatg aaacagaaat gtggagctga ttttcctatt 660

ggtgttaaat taagtactga agattgggaa ccagaaggaa ttcgtataga ggaaacaatt 720

gaagttgcga aagcattaga aaaagaaggt gtatctcatt taaatatgat gggtgggaca 780

catgcaactg catctcgaca attcttattg ccaaatgctt ttaatgctga acatacaaga 840

atgattaaag atgctgttca tattcctgta tttattggac acaatatttt ctctcctgaa 900

gaggcagaaa aaatgctggc tgaaggaaat ggtgattttg tggctttagg acgttctcaa 960

ttggctgacc cagcatgggc taaaaaagcg aaagagggga aagcaagaga tattaaacca 1020

tgtatcaatt gtatgatcgg ttgtattgat aaaggaatgt taggtcatac accaatccat 1080

tgtacagtga atccaacttt atacagattt gaatgcaaac ctattgttga agctgaagtt 1140

aagaaaaatg tagcaattgt aggtgctggt ccagcaggat gtgaagcagc attgacggca 1200

tctttacgag gacataaagt cactattttt gaaaagagaa gttttggtgg tgctatgata 1260

gaagcaagta aaccagacaa taaggcaaat atcaaacgtt tgattaatta ttatgaagac 1320

catattactc atgatcctaa tattacttta gttaaaaaag aagcaaatta tgatatgctt 1380

gttcaaggtg gctatgatgc tgttattatt gccataggag gtaaaacaag aattttagat 1440

gttccaggta gtgataagtc atcagttgtt tatgcaaatg actatttaaa tggttctcga 1500

gttgttgatg gaaaaaatgt cgttattatt ggtggaggta ttacaggagc tgaaacagca 1560

ctagaattag ataatgatgg aaaaaatgta accattgtag aaatggcaga tactttctta 1620

gctaattctg gttcatcttg tcaagcttat aatattgcca ttgctcaatc aaatataaaa 1680

attatgactg gtaaacgttt ggttgctgta gaagataatg gggtagtttt aattgacaga 1740

tggggtaacg aaaatactgt tgatgctgat aatgttgtta ttgcagcagg atttactcct 1800

cagtatgatc ttgcaaatca attagaagaa aatacagaaa tggaagttta taatataggg 1860

gatagcaaga aagttcgtca aatttacgat gctattcatg aaggatttat agcagccaga 1920

caaatctaa 1929

<210> 2

<211> 642

<212> PRT

<213> 雌马酚产生梭菌(Clostridium sp.)

<400> 2

Met Lys Asn Lys Tyr Tyr Pro His Leu Phe Glu Lys Gly Lys Ile Gly

1 5 10 15

Asn Val Val Ile Lys Asn Arg Ile Val Arg Asn Ser Met Gly Thr Tyr

20 25 30

Leu Gly Asn Pro Asp Gly Thr Val Thr Asp Arg Gln Ile Lys Ala Tyr

35 40 45

Ala Gln Ala Ala Asp Gly Gly Ala Gly Leu Ile Phe Met Asp Asn Ala

50 55 60

Val Pro Val Pro Met Thr Ser Cys Gly Leu Arg Ala Asp Lys Asp Glu

65 70 75 80

Phe Ile Ala Gly Leu Thr Leu Leu Ala Glu Thr Val Lys Glu His Gly

85 90 95

Ala Thr Pro Gly Leu Gln Leu Ala His Pro Gly Arg Asp Ala Ala Phe

100 105 110

Val Gly Ser Ala Asp Val Ile Gly Ala Ser Pro Ile Thr Phe Glu Pro

115 120 125

Trp Tyr Glu Met Gly Phe Lys Met Pro Arg Ala Leu Thr Ile Glu Glu

130 135 140

Ile His Asp Leu Val Glu Lys Phe Gly Asp Ala Ala Leu Arg Ala Lys

145 150 155 160

Lys Ala Gly Phe Glu Val Leu Glu Ile His Gly Ala Ala Gly Cys Ile

165 170 175

Pro Thr Asn Phe Leu Ser Pro His Asp Asn Lys Arg Thr Asp Met Tyr

180 185 190

Gly Gly Ser Leu His Asn Arg Met Arg Leu Leu Ile Glu Ile Val Arg

195 200 205

Asn Met Lys Gln Lys Cys Gly Ala Asp Phe Pro Ile Gly Val Lys Leu

210 215 220

Ser Thr Glu Asp Trp Glu Pro Glu Gly Ile Arg Ile Glu Glu Thr Ile

225 230 235 240

Glu Val Ala Lys Ala Leu Glu Lys Glu Gly Val Ser His Leu Asn Met

245 250 255

Met Gly Gly Thr His Ala Thr Ala Ser Arg Gln Phe Leu Leu Pro Asn

260 265 270

Ala Phe Asn Ala Glu His Thr Arg Met Ile Lys Asp Ala Val His Ile

275 280 285

Pro Val Phe Ile Gly His Asn Ile Phe Ser Pro Glu Glu Ala Glu Lys

290 295 300

Met Leu Ala Glu Gly Asn Gly Asp Phe Val Ala Leu Gly Arg Ser Gln

305 310 315 320

Leu Ala Asp Pro Ala Trp Ala Lys Lys Ala Lys Glu Gly Lys Ala Arg

325 330 335

Asp Ile Lys Pro Cys Ile Asn Cys Met Ile Gly Cys Ile Asp Lys Gly

340 345 350

Met Leu Gly His Thr Pro Ile His Cys Thr Val Asn Pro Thr Leu Tyr

355 360 365

Arg Phe Glu Cys Lys Pro Ile Val Glu Ala Glu Val Lys Lys Asn Val

370 375 380

Ala Ile Val Gly Ala Gly Pro Ala Gly Cys Glu Ala Ala Leu Thr Ala

385 390 395 400

Ser Leu Arg Gly His Lys Val Thr Ile Phe Glu Lys Arg Ser Phe Gly

405 410 415

Gly Ala Met Ile Glu Ala Ser Lys Pro Asp Asn Lys Ala Asn Ile Lys

420 425 430

Arg Leu Ile Asn Tyr Tyr Glu Asp His Ile Thr His Asp Pro Asn Ile

435 440 445

Thr Leu Val Lys Lys Glu Ala Asn Tyr Asp Met Leu Val Gln Gly Gly

450 455 460

Tyr Asp Ala Val Ile Ile Ala Ile Gly Gly Lys Thr Arg Ile Leu Asp

465 470 475 480

Val Pro Gly Ser Asp Lys Ser Ser Val Val Tyr Ala Asn Asp Tyr Leu

485 490 495

Asn Gly Ser Arg Val Val Asp Gly Lys Asn Val Val Ile Ile Gly Gly

500 505 510

Gly Ile Thr Gly Ala Glu Thr Ala Leu Glu Leu Asp Asn Asp Gly Lys

515 520 525

Asn Val Thr Ile Val Glu Met Ala Asp Thr Phe Leu Ala Asn Ser Gly

530 535 540

Ser Ser Cys Gln Ala Tyr Asn Ile Ala Ile Ala Gln Ser Asn Ile Lys

545 550 555 560

Ile Met Thr Gly Lys Arg Leu Val Ala Val Glu Asp Asn Gly Val Val

565 570 575

Leu Ile Asp Arg Trp Gly Asn Glu Asn Thr Val Asp Ala Asp Asn Val

580 585 590

Val Ile Ala Ala Gly Phe Thr Pro Gln Tyr Asp Leu Ala Asn Gln Leu

595 600 605

Glu Glu Asn Thr Glu Met Glu Val Tyr Asn Ile Gly Asp Ser Lys Lys

610 615 620

Val Arg Gln Ile Tyr Asp Ala Ile His Glu Gly Phe Ile Ala Ala Arg

625 630 635 640

Gln Ile

Claims

1.一种转化酶C1-2079，其特征在于所述转化酶的氨基酸序列为SEQID NO.2所示。

2.一种权利要求1所述转化酶C1-2079编码基因，其特征在于所述编码基因核苷酸序列为SEQID NO.1所示。

3.一种由权利要求1所述转化酶C1-2079的编码基因构建的重组基因工程菌。

4.一种权利要求1所述转化酶C1-2079在催化大豆苷元生成二氢大豆苷元中的应用，其特征在于所述应用为：以转化酶C1-2079为催化剂，以大豆苷元为底物，以NADPH、NADH为辅酶，加入亚硫酸氢钠、二硫苏糖醇和苯甲基磺酰氟，以pH7.0的0.1M磷酸钾缓冲液为反应介质构成反应体系，在37℃厌氧条件下反应2-4h后，得到含有二氢大豆苷元的转化液；所述反应体系中，转化酶C1-2079加入终浓度为40μg/ml，大豆苷元加入终浓度为20μg/ml，NADPH和NADH加入终浓度均为500μg/ml，亚硫酸氢钠加入终浓度为0.5mg/ml，二硫苏糖醇加入终浓度均为0.3mg/ml，苯甲基磺酰氟加入终浓度均为0.2mg/ml。

5.一种权利要求1所述转化酶C1-2079在催化二氢大豆苷元生成大豆苷元中的应用，其特征在于所述应用的方法为：以转化酶C1-2079为催化剂，以二氢大豆苷元为底物，以pH6.5的0.1M柠檬酸盐缓冲液为反应介质构成反应体系，在37℃条件下反应2-4h后，得到含有大豆苷元的转化液；所述反应体系中，转化酶C1-2079加入终浓度为40μg/ml，二氢大豆苷元加入终浓度为20μg/ml。

6.一种权利要求1所述转化酶C1-2079在制备S-雌马酚中的应用。

7.如权利要求6所述的应用，其特征在于所述应用为：以含转化酶C1-2079基因、二氢大豆苷元外消旋酶DDRC编码基因、二氢大豆苷元还原酶DHDR编码基因、四氢大豆苷元还原酶THDR编码基因的工程菌发酵培养液作为催化剂，以大豆苷元为底物，在37℃条件下静置发酵6-8h，获得含S-雌马酚的反应液，分离纯化，获得S-雌马酚。

8.如权利要求7所述的应用，其特征在于所述大豆苷元加入终浓度为40μg/ml；所述催化剂中菌体OD₆₀₀为1.8。

9.如权利要求7所述的应用，其特征在于所述催化剂按如下方法制备：将转化酶C1-2079编码基因、二氢大豆苷元外消旋酶DDRC编码基因、二氢大豆苷元还原酶DHDR编码基因、四氢大豆苷元还原酶THDR编码基因的工程菌接种至含有100μg/ml氨苄抗性和100μg/ml链霉素抗性的LB培养基中，37℃、180rpm孵育；当细菌OD₆₀₀为0.6时，加入终浓度为0.2mM的IPTG，在16℃、120rpm条件下诱导表达16h，获得发酵培养液。

10.如权利要求7所述的应用，其特征在于所述工程菌按如下方法构建：(1)转化酶C1-2079、载体PETDute-1-L-DZNR-DDRC分别经NotI和AvrII限制性内切酶酶切后连接，构建质粒PETDute-1-C1-2079-DDRC；(2)将PETDute-1-C1-2079-DDRC质粒加入到含0.1M氯化钙的大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞液中，冰浴30min，然后42℃热冲击90s，再冰浴2min，加入4倍体积的LB培养基，37℃，180rpm孵育1h；收集孵育后的菌泥涂布到含有100μg/ml氨苄抗性的LB平板中，37℃培养12-16h；(3)挑取长出来的单菌落，在含有100μg/ml氨苄抗性的LB培养基中，37℃、180rpm培养2-4h至细菌OD₆₀₀为0.1；取菌液，在5000rpm条件下离心获得菌泥，将所获得的菌泥用无菌0.1M的CaCl₂溶液洗涤三次，加入预冷的0.1M无菌CaCl₂溶液悬浮菌体，然后在冰浴条件下孵育2-4h；(4)将PCDFDute-L-DHDR-THDR质粒加入到步骤(3)冰浴后的菌液中，将步骤(2)中氨苄抗性改为100μg/ml氨苄和100μg/ml链霉素抗性，其他操作同步骤(2)，构建含PETDute-1-C1-2079-DDRC和PCDFDute-L-DHDR-THDR的重组大肠杆菌BL21(DE3)工程菌。