CN107641611A - 一种具有s‑雌马酚抗性的大肠杆菌突变株及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种具有S‑雌马酚抗性的大肠杆菌突变株及应用，所述具有S‑雌马酚抗性的大肠杆菌突变株是将来源于乳酸菌(Lactococcus sp.)20‑92的L‑DDRC、L‑DZNR、L‑DHDR和L‑THDR基因克隆至大肠埃希氏菌BL21‑G2中转化得到；本发明提供一种发酵条件简单、使用方便、体系稳定、应用广泛且具有抗S‑雌马酚功能的大肠杆菌突变株，无论是在厌氧还是有氧条件下，均具有将LB培养基中的大豆素转化为S‑雌马酚的能力，且本发明工程菌DDDT‑G2是专利申请2014102431488中工程菌DDDT‑BL21产雌马酚量的1.25‑2倍。

Description

一种具有S-雌马酚抗性的大肠杆菌突变株及应用

(一)技术领域

本发明涉及一种突变工程菌的筛选与应用，特别涉及一种具有抗S-雌马酚功能的大肠杆菌突变株筛选及其在大豆素转化生产S-雌马酚中的应用。

(二)背景技术

S-雌马酚是一种植物雌激素，是豆类食物在肠道中经特定微生物转化后产生的一种代谢产物，比其相应的前体大豆异黄酮的生物活性更高。相比雌激素，S-雌马酚与雌激素-β受体结合度更强，因此S-雌马酚能预防各种具有雌激素依赖性的癌症。大量的临床研究表明豆类食物预防各种心血管疾病、妇女更年期综合征、妇科癌症和美白护肤等作用均归咎于其代谢产物S-雌马酚的生物学活性，故人体能否将大豆素代谢为S-雌马酚是决定大豆能否发挥其抵御各种疾病的关键因素。然而科学研究报道，在常吃大豆类食物的亚洲仅只有30％-50％的人能将大豆代谢成雌马酚，西方国家更低，所以雌马酚在临床预防各类疾病的作用愈加重要。

目前生产S-雌马酚的方法主要为化学合成和微生物合成，其存在的两个问题就是：(1)微生物大规模发酵合成雌马酚时存在产物(S-雌马酚)浓度过高从而抑制工程菌生长的局限性；(2)化学合成需要金属催化剂、氢气、高压高温等，对生产设备要求高、产量低、中间产物多、分离纯化难、成本较高。所以能否采用生物法大规模合成S-雌马酚成为大家关注的热点。对现有技术的文献检索发现，目前与本发明密切相关的专利有“一种S-雌马酚产生工程菌及应用”(申请号：201410243148.8)，“不动杆菌AUH-JLM455及其转化制备S-雌马酚的方法”(申请号：200810147314.9)，“雌马酚产生菌及利用”(申请号：201080007863.1)，“含有产生雌马酚的乳酸菌的组合物”(申请号：200480020952.4)，“含有维持了雌马酚产生能力的雌马酚产生微生物的发酵制品及其制备方法”(申请号：200980136848.4)，“一种奇异变形杆菌菌株及其转化大豆素元生产S-雌马酚的方法”(申请号：201210146746.4)，“一种屎肠球菌及其产生雌马酚的方法与应用”(申请号：201110086803.X)和“一株降解大豆素原产生雌马酚的双酶梭菌及其菌剂和应用”(申请号：201010513344.4)。以上这些专利均是使用从肠道中分离获得的单一或少数几种细菌混合厌氧发酵生产S-雌马酚，但研究发现现有微生物合成的方法有明显缺陷，当大规模生产雌马酚时，产物雌马酚浓度过高会抑制产雌马酚工程菌的生长，这会很大程度限制生物合成法生产雌马酚的转化率和成本。

(三)发明内容

本发明目的是针对目前微生物发酵生产过程中发酵产物S-雌马酚具有抑制工程菌生长的不足，采用海洋转座子突变文库筛选的方法，获得了一株具有S-雌马酚抗性的大肠杆菌突变株G2。发现突变株G2比本底大肠杆菌BL21在利用大豆素发酵生产S-雌马酚过程中具有生长速度更快、产量更高的优势。

本发明采用的技术方案是：

本发明提供一种具有S-雌马酚抗性的大肠杆菌突变株，所述具有S-雌马酚抗性的大肠杆菌突变株是将来源于乳酸菌(Lactococcus sp.)20-92的L-DDRC、L-DZNR、L-DHDR和L-THDR基因克隆至大肠埃希氏菌BL21-G2中转化得到；所述L-DDRC的核苷酸序列为SEQ IDNO：1所示、L-DZNR的核苷酸序列为SEQ ID NO：2所示、L-DHDR的核苷酸序列为SEQ ID NO：3所示，L-THDR的核苷酸序列为SEQ ID NO：4所示；所述大肠埃希氏菌(Escherichia coli)BL21-G2是含有海洋转座子PFAC基因的突变型大肠杆菌G2，所述PFAC的核苷酸序列为SEQID NO：5所示，所述大肠埃希氏菌(Escherichia coli)BL21-G2保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCC No.14219，保藏日期2017年6月5日，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编100101。所述具有S-雌马酚抗性的大肠杆菌突变株(记为DDDT-G2)保藏于-80℃冰箱；所述DDDT-G2是指含有基因L-DDRC、L-DZNR、L-DHDR、L-THDR和海洋转座子PFAC的突变型大肠杆菌G2，其中DDDT分别表示基因L-DDRC、L-DZNR、L-DHDR和L-THDR的缩写，字母本身没有含义。

本发明还提供一种所述具有S-雌马酚抗性的大肠杆菌突变株在制备S-雌马酚中的应用，所述的应用为：以大豆素为底物，将具有S-雌马酚抗性的大肠杆菌突变株经扩大培养获得的种子液以体积浓度5％的接种量接种至LB培养基，在好氧或厌氧条件下，37℃培养24h，向培养液中加入终浓度25μg/L的IPTG，37℃继续培养6～72h后，取培养液分离纯化，获得S-雌马酚；所述LB培养基终浓度组成：胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5.0g/L、氯化钠10g/L，溶剂为蒸馏水，pH值为7.0。

进一步，所述大豆素的初始浓度为5-200μg/ml，优选50μg/ml。

进一步，所述的应用按如下步骤进行：(1)种子培养：将具有S-雌马酚抗性的大肠杆菌突变株接种至含有终浓度50μg/ml羧苄青霉素和终浓度50μg/ml链霉素的LB培养基中，37℃静置培养24h后，获得种子液；(2)发酵培养及转化反应：将大豆素加入LB培养基，然后以体积浓度5％的接种量接种种子液，37℃培养24h，向培养液中加入终浓度25μg/L的IPTG，37℃继续培养6～72h后，取培养液分离纯化，获得S-雌马酚；所述大豆素的初始浓度为5-200μg/ml，优选50μg/ml。

进一步，所述培养液分离纯化的方法为：取1ml的培养液，8000转每分钟离心3分钟，获得上清a；取900μl上清a至另一干净的2ml EP管中，然后向管中加入900μl乙酸乙酯，充分混匀后静置5分钟，5000转每分钟离心5分钟，获得上清b和沉淀b；取900μl上清b至另一干净的2ml EP管中；取沉淀b加入等量的乙酸乙酯重复离心1次，获得上清c；将上清b和上清c混合在一起，移到2ml离心管中，45℃真空冷冻浓缩成粉末；加入200μl无水甲醇到该EP管溶解浓缩粉末，并经0.22μm聚偏氟乙稀微孔滤膜过滤，滤液即为S-雌马酚。

本发明所述上清a、上清b、上清c均为上清液，为了便于区分不同步骤获得的上清液不同而命名，沉淀a、沉淀b均指沉淀，字母本身没有含义。

本发明所述具有S-雌马酚抗性的大肠杆菌突变株按如下方法构建：

(1)通过插入海洋转座子(PFAC)获得含有PFAC的大肠杆菌BL21(D3)；(2)将含有转座子PFAC的大肠杆菌涂布到含有庆大霉素(终浓度15μg/ml)的LB平板上，37℃培养箱中倒置培养过16小时；(3)将含有终浓度20μg/mlS-雌马酚(购自大赛璐药物手性技术(上海)有限公司)的LB培养基，混匀后以每孔200μL滴加至96孔板(购自上海康宁生物技术有限公司)，然后用灭菌牙签从平板上挑选单菌落到96孔板中，最后两孔不接种细菌做为对照。(4)37℃细菌培养箱静置培养48h，并通过酶标仪(购自Bio-Rad)每间隔21h测一次OD，筛选出6株具有生长优势突变菌株(H12、H5、G2、F8、C1、B1)，并于-80℃冰箱保存(图1)；(5)于-80℃冰箱取出6株突变菌(H12、H5、G2、F8、C1、B1)扩大培养获得种子液，以体积浓度5％的接种量接种至分别含有终浓度0μg/L、50μg/L、100μg/L、200μg/LS-雌马酚的LB培养基，37℃细菌培养箱静置培养48h，并每隔6h以分光光度计(购自上海光谱仪器有限公司)测量OD，筛选出最佳优势突变菌G2(图2)。(6)进一步验证G2突变菌的抗雌马酚能力，将突变菌G2和大肠杆菌BL21(D3)同时扩大培养获得种子液，以体积浓度5％分别接种至含有终浓度0μg/L、100μg/L、200μg/L S-雌马酚的LB培养基，37℃摇床振荡培养30h，并每间隔10h以分光光度计测量OD(图3)。所述LB培养基终浓度组成为：胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5.0g/L、氯化钠10g/L，溶剂为水，pH值为7.0。

将专利申请2014102431488中所述质粒pETDuet-1-L-DDRC-DZNR、pCDFDuet-1-L-DHDR-THDR同时转化入突变菌G2中，获得重组工程菌；将重组工程菌接种至含终浓度50μg/ml羧苄青霉素和终浓度50μg/ml链霉素的LB培养基平板上，37℃好氧培养24h，筛选同时具有羧苄青霉素和链霉素抗性的克隆，获得具有将大豆素转化为具有S-雌马酚抗性的大肠杆菌突变株DDDT-G2。

本发明所构建的生产S-雌马酚的工程菌的验证：使用HPLC方法证实本发明所构建的具有S-雌马酚抗性的大肠杆菌突变株确实具有将大豆素转化为S-雌马酚的能力。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明提供一种发酵条件简单、使用方便、体系稳定、应用广泛且具有抗S-雌马酚功能的大肠杆菌突变株，无论是在厌氧还是有氧条件下，均具有将LB培养基中的大豆素转化为S-雌马酚的能力，且本发明工程菌DDDT-G2是专利申请2014102431488中工程菌DDDT-BL21产雌马酚量的1.25-2倍(图6C、D)。所述DDDT-G2是本发明产雌马酚工程菌的名称，DDDT-BL21是专利申请2014102431488中产雌马酚工程菌名称，字母本身没有含义。

(四)附图说明

图1是96孔板筛选抗S-雌马酚突变菌生长曲线示意图。

图2是筛选最佳抗S-雌马酚突变菌G2柱状示意图。

图3是突变菌G2和大肠杆菌BL21(D3)抗S-雌马酚菌株差异生长曲线示意图。

图4是高效液相色谱法(HPLC)检测工程菌转化生产S-雌马酚的图谱；A为S-雌马酚标准品，B为产S-雌马酚基因工程菌发酵液。

图5是工程菌在不同培养条件下利用大豆素转化生成S-雌马酚的产量图。

图6是不同菌株产S-雌马酚产量差异图，其中A为37℃有氧条件下本发明产雌马酚工程菌(即具有S-雌马酚抗性的大肠杆菌突变株DDDT-G2)比专利申请2014102431488中工程菌产雌马酚产量图；B为37℃厌氧条件下本发明产雌马酚工程菌比专利申请2014102431488中产雌马酚产量图；C为37℃有氧条件下本发明产雌马酚工程菌与专利申请2014102431488中产雌马酚工程菌产量比值倍数图；D为37℃厌氧条件下本发明产雌马酚工程菌与专利申请2014102431488中产雌马酚工程菌产量比值倍数图；A、B中48h、96h是发酵时间；5μl大豆素、50μl大豆素代表加入底物体积(初始浓度为5mg/ml)；DDDT-BL21为专利申请2014102431488中S-雌马酚产生工程菌，DDDT-G2为本发明构建的产S-雌马酚基因工程菌，P-P-BL21是含有空质粒PET-Duet和PCDF-Duet的大肠杆菌BL21(D3)，P-P-G2是含有空质粒PET-Duet和PCDF-Duet的突变株G2，DZ表示大豆素，其后第一个数据代表发酵液中加入的底物大豆素的体积(初始浓度为5mg/ml)，第二个数据代表发酵时间(单位h)。

图7是不同菌株发酵生产S-雌马酚时发酵液中细菌浓度示意图，其中A为37℃有氧条件下本发明产雌马酚工程菌比专利申请2014102431488中产雌马酚工程菌浓度图；B为37℃厌氧条件下本发明产雌马酚工程菌比专利申请2014102431488中产雌马酚工程菌浓度图；C是37℃有氧条件下本发明产雌马酚工程菌浓度与专利申请2014102431488中产雌马酚工程菌浓度比值倍数图；D是37℃厌氧条件下本发明产雌马酚工程菌浓度与专利申请2014102431488中产雌马酚工程菌浓度比值倍数图；A、B、C和D中48h、96h是发酵时间；DDDT-BL21为专利申请2014102431488中S-雌马酚产生工程菌，DDDT-G2为本发明构建的产S-雌马酚基因工程菌，P-P-BL21是含有空质粒PET-Duet和PCDF-Duet的大肠杆菌BL21(D3)，P-P-G2是含有空质粒PET-Duet和PCDF-Duet的突变株G2，DZ表示大豆素，其后第一个数据代表发酵液中加入的底物大豆素的体积ml(底物大豆素初始浓度为5mg/ml)，第二个数据代表发酵时间(单位h)。

(五)具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施例1：具有抗S-雌马酚能力大肠杆菌突变株筛选

本发明通过使用海洋转座子突变文库筛选的方法，获得了一株具有抗S-雌马酚功能的大肠杆菌突变菌株，主要包括以下步骤：

1.转座子文库构建

(1)E.coli DH5α(pRK2013)(购自北京乐博生物)，培养液制备方法为：取-80℃冰箱保存的E.coli DH5α(pRK2013)菌液，待室温微溶后用移液枪将50μl菌液接种到含有5mlLB培养基的试管中，同时加入5μl 15mg/ml的卡那霉素水溶液，37℃摇床200rpm振荡培养过夜，获得E.coli DH5α(pRK2013)培养液。

E.coli WM3064(PFAC)培养液制备方法为：从E.coli DH5α(PFAC)菌液中提取质粒PFAC，将质粒PFAC转化到大肠杆菌WM3064(浙江大学高海春教授馈赠)感受态细胞。然后将大肠杆菌WM3064感受态细胞接种在加有终浓度15μg/ml庆大霉素和终浓度5.7μg/ml2,6-二氨基庚二酸(DAP)的LB平板上，37℃培养，挑选单克隆。将单克隆接种至5ml含有终浓度15μg/ml庆大霉素和终浓度3.7μg/mlDAP的LB培养基的试管中，37℃摇床200rpm振荡培养过夜，获得E.coli WM3064(PFAC)。

大肠杆菌BL21(D3)(购自北京全式金生物技术有限公司)，培养液制备方法为：取-80℃冰箱保存的大肠杆菌BL21(D3)菌液，待室温微溶后用移液枪将50μl菌液接种到含有5ml LB培养基的试管中，37℃摇床200rpm振荡培养过夜，获得大肠杆菌BL21(D3)培养液。

LB培养基终浓度组成：胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、氯化钠10g/L，溶剂为蒸馏水，pH值自然。

(2)在无菌操作台中向1.5ml离心管中加入400μL E.coli DH5α(pRK2013)培养液、400μLE.coli WM3064(PFAC)培养液和400μL大肠杆菌BL21(D3)培养液。8000rpm离心3分钟后，弃上清，加入100μL LB培养液，混匀后将菌悬液点到含有初浓度5.7μg/mlDAP的LB平板上，无菌操作台内待液体风干后，将平板放入37℃培养箱内培养6-8小时。

(3)将LB平板上的菌刮取到含1ml LB培养基的1.5ml离心管中，混匀后，分别取10μL、100μL、200μL涂布到含Gen(庆大霉素终浓度15μg/ml)LB平板上。

(4)LB平板在37℃培养箱内培养过夜后，挑选长出的菌，即为含有PFAC的大肠杆菌BL21(D3)(E.coli BL21(D3)-PFAC)。

2.抗S-雌马酚菌突变株的筛选

(1)将含有转座子PFAC的大肠杆菌(E.coli BL21(D3)-PFAC)接种至LB培养基，在37℃扩大培养24h，获得种子液，以体积浓度5％的接种量接种至含有终浓度200μg/mlS-雌马酚的LB培养基，混匀后以每孔200μL滴加至96孔板，最后两孔加LB培养基做对照，37℃细菌培养箱培养48h，并通过酶标仪每间隔21h测一次OD，筛选出6株具有生长优势突变菌株(H12、H5、G2、F8、C1、B1)并于-80℃保存(图1)。

(2)于-80℃冰箱取出6株突变菌(H12、H5、G2、F8、C1、B1)接种至LB培养基，在37℃扩大培养24h，获得种子液，以体积浓度5％的接种量接种至分别含有终浓度0μg/L、50μg/L、100μg/L、200μg/L S-雌马酚的LB培养基，37℃细菌培养箱培养48h，并每隔6h以分光光度计测量OD，筛选出最佳优势突变菌E.coli BL21(D3)-PFAC-G2并保存于-80℃冰箱(图2)，即大肠埃希氏菌(Escherichia coli)BL21-G2(简称突变株G2)，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCC No.14219，保藏日期2017年6月5日，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编100101。所述H12、H5、G2、F8、C1、B1为具有抗S-雌马酚能力的大肠杆菌BL21(D3)突变株的名称，字母数字本身没有含义。

(2)进一步验证G2突变菌的抗雌马酚能力，将突变菌G2和大肠杆菌BL21(D3)接种至LB培养基，在37℃扩大培养24h，分别获得种子液，以体积浓度5％分别接种至含有终浓度0μg/L、100μg/L、200μg/L S-雌马酚的LB培养基，37℃细菌培养箱培养30h，并每间隔10h以分光光度计测量OD(图3)。所述LB培养基终浓度组成为：胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5.0g/L、氯化钠10g/L，溶剂为蒸馏水，pH值为7.0；结果表明突变株G2是具有抗雌马酚能力的大肠杆菌BL21(D3)。

实施例2抗S-雌马酚突变菌的应用

1.具有S-雌马酚抗性的大肠杆菌突变株的构建

将质粒PETDuet-1-L-DDRC-DZNR(构建同专利申请2014102431488实施例1)和PCDFDuet-1-L-DHDR–THDR(构建同专利申请2014102431488实施例1)利用化学转化的方法同时转化入E.coli BL21(D3)-PFAC-G2中。然后在含有羧苄青霉素(50μg/ml)和链霉素(50μg/ml)的LB平板上筛选同时具有这两种抗菌素抗性的克隆，获得具有S-雌马酚抗性的大肠杆菌突变株DDDT-G2。所述LB平板终浓度组成为：胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5.0g/L、氯化钠10g/L、琼脂粉12g/L，溶剂为蒸馏水，pH值为7.0。

2.具有S-雌马酚抗性的大肠杆菌突变株的验证

本发明通过使用HPLC对工程菌生产S-雌马酚的能力进行功能验证，主要包括以下步骤：

(1)具有S-雌马酚抗性的大肠杆菌突变株的准备

从-80℃冰箱中将50μl 具有S-雌马酚抗性的大肠杆菌突变株DDDT-G2保存液接种到5ml含有羧苄青霉素(50μg/ml)和链霉素(50μg/ml)的LB培养基中，放置霉菌培养箱中，37℃静置培养24h后，获得种子液，用于接种。保存液制备方法：将2ml培养过夜的产S-雌马酚基因工程菌菌液8000转/分离心3分钟后，弃上清，然后往管中加入1ml 20％的甘油，充分将菌重悬后放入-80℃冰箱保存。

(2)发酵用培养基和发酵条件

将250μg大豆素(购自大赛璐药物手性技术(上海)有限公司)加入5ml的LB培养基(装液量为30ml)中，然后将种子液以体积浓度5％的接种量进行接种，37℃下于霉菌培养箱中静置培养24h，获得发酵液。

(3)工程菌发酵液中S-雌马酚含量的HPLC检测

向步骤(2)培养24h后的发酵液中加入5μL 25mg/ml的IPTG水溶液，37℃继续培养48h后，取1ml培养液至1.5ml EP管，8000转每分钟离心3分钟后，将900μL上清a转移至一个新的2.0ml EP管，然后加入等量的乙酸乙酯，充分混匀后静置5分钟，5000转每分钟离心5分钟后，取上清b至另一干净的2ml EP管中；取上清b后剩下的下层液体用等量的乙酸乙酯再离心1次，获得上清c，然后将上清b和上清c混合在一起，45℃冷冻离心浓缩成粉末，加入200μL无水甲醇溶解粉末，并经0.22μm聚偏氟乙稀微孔滤膜(上海兴亚净化材料厂)过滤，滤液用于HPLC检测。以S-雌马酚标准品(购自大赛璐药物手性技术(上海)有限公司)为对照。

高效液相色谱条件：

液相色谱系统：Waters2695；色谱柱：SunFireTM C18 5μm(4.6mm×205mmcolumn)。流动相：0.01％甲酸(50％)、甲醇(20％)和乙腈(30％)；洗脱程序：等度洗脱15min；流速0.8ml/min；柱温30±2℃；检测波长：S-雌马酚205nm，大豆素254nm。

从图4的HPLC检测结果可以看出，与S-雌马酚标准品相比，本发明构建的工程菌经过发酵后在其发酵液中检测到了S-雌马酚的产生。与S-雌马酚标准品相比，工程菌发酵中在约9.5分钟时也能检测到相对应的光谱吸收峰，说明该工程菌具有将大豆素转化生产为S-雌马酚的能力。

3.具有S-雌马酚抗性的大肠杆菌突变株的应用

(1)具有S-雌马酚抗性的大肠杆菌突变株的准备

种子培养：

从-80℃冰箱中将50μl具有S-雌马酚抗性的大肠杆菌突变株DDDT-G2保存液接种到5ml含有羧苄青霉素(50μg/ml)和链霉素(50μg/ml)的LB培养基中，放置在霉菌培养箱中，37℃静置培养过夜，获得种子液，用于接种。

(2)发酵用培养基和发酵条件

将大豆素作为底物加入LB培养基中，大豆素在LB培养基终浓度为50μg/ml，然后以体积浓度5％的接种量将步骤(1)获得的种子液进行接种(装液量为30ml)，37℃下于厌氧工作站中培养24h，加入5μL(占培养液体积的0.1％)25mg/ml的IPTG水溶液，37℃继续培养24、48h、72h和96h后，采用实施例2步骤3的方法进行HPLC检测。

将步骤(1)的培养条件分别改为厌氧条件下，37℃普通的恒温培养箱培养相应时间。

同样条件下，将具有S-雌马酚抗性的大肠杆菌突变株DDDT-G2改为工程菌DDDT-BL21(即专利申请2014102431488中S-雌马酚产生工程菌)、空载体PET-PCDF-BL21(含有空质粒PET-Duet和PCDF-Duet的大肠杆菌BL21(D3))和空载体PET-PCDF-G2(含有空质粒PET-Duet和PCDF-Duet的突变株G2)作为对照。

(3)工程菌发酵液中S-雌马酚含量的HPLC检测

发酵结果表明，本发明所构建的工程菌无论是在有氧还是厌氧条件下，均能将LB培养基中的大豆素转化为S-雌马酚(图5)。从图6中A、B可以看出本发明的具有S-雌马酚抗性的大肠杆菌突变株DDDT-G2是专利“一种S-雌马酚产生工程菌及应用”(申请号：201410243148.8)中雌马酚产生菌产量的1.25-2倍(图6中C、D)。

(4)工程菌发酵液中细菌浓度OD检测

OD值结果表明，当发酵产生的S-雌马酚浓度高时，无论是有氧或厌氧条件下(发酵96h)，从图7中C、D可以看出本发明构建的突变型工程菌细菌浓度均高于专利“一种S-雌马酚产生工程菌及应用”(申请号：201410243148.8)中工程菌浓度。

SEQUENCE LISTING

<110> 浙江省农业科学院

<120> 一种具有S-雌马酚抗性的大肠杆菌突变株及应用

<130>

<160> 5

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 489

<212> DNA

<213> Lactococcus sp.

<400> 1

ggatccgatg atcaaggcac agctcaaccg catcgctttg cgcgctgcag atgccgacaa 60

ggcagttgag gacctgaata agcttctggg ggtgacattc tacggcccct acgacgacga 120

gcacatgggt ctgcgcgtcg cactgcccaa gtccggcggc atcgaggtca tggcacccat 180

gcacgaccac gacgccatcg gcgcttacaa ggccctgcag accgtaggcg agggcatcag 240

cggcatcgcc atgcgcgtcg acgacttcga cgccgccaag gagcacttcg catccctggg 300

cctgacccct gtcgtcgagt tcaaccacgg caagttccgc gagatgatct tccccccgca 360

gcctgccacc cacaacctgg agatcgccgt caacgagttc cccgatgcaa atggcgctgc 420

tatccaggtt gccctcgaca tgggcgttga ttggactgac gtctgcgact gggacgcaaa 480

ggcggccgc 489

<210> 2

<211> 1945

<212> DNA

<213> Lactococcus sp.

<400> 2

agatctgatg aagaacaagt tctatccgaa gaccttcgag cgcggctaca tcggtaacct 60

agaggtcgag aaccgagcga tccgcatgcc gatgggcacc gagctgggca acccggacgg 120

ctctcccagc tgggcctccc tcaaggcgta cgctgaggct gccgacggtg gaaccggcat 180

cgtgttcatg gacaacgccg gcgtgaccca gttccaccat gtcggactgt ccctggccag 240

cgacaactac atcggcccca tgtccgtcct cgcaaagacc atcaagcagc acggggccat 300

ccccggcctg cagatcgtcc acccgggccg cgacgcggcg ttcgtgcgcg gtgacgacct 360

gatctcctct tcccgcatcc agtgggagcc ctggtacgag aacggcggcg ctgttccccg 420

cgagctcacc atcgaggaga tccacgactt cgtcggttac ttcggcgact gcgcactccg 480

cgcgcagacc gcgggcttcg aaatcgtcga cgtccacgcg gcatgcggcg tcctgctgag 540

caacttcctc tcgccgcgca acaacacccg caatgacatg tacggcggaa gcctgcacaa 600

ccgcgcccgc ttcctgctcg aggtcatccg cgacatcaag aagaagtgcc ccaacctccc 660

gctggctatc cgactctccg gcatcgactt cgaaccggac ggcatcacca tcgaggagac 720

ctgcgaggtc gccaagatgt gcgaggcagc cggtgcggac gccatcaaca tcacctgggg 780

ttcccatgca gaggtcataa acgcggccgg cctgctctcc aagcacggcg ccaaccacgt 840

cgaggcagcg aagatgatca aggacgctgt tagcatcccc accatgctgt gcggcggcat 900

ctactccccc gagatcggcg agaagctgct cgaggacggc gtctgcgact tcatcggcat 960

cggcaagccc gcgctcgccg accccatgtg ggccaagaag gcagctgagg ggcgtcctga 1020

ggacatcagg ccctgcatcg gttgcggcgt cggctgccat gaccgcggca tgctctccgg 1080

cggcgtcgtc cagtgcgccg tcaacgcggc cctgtacaag ttcgacgaac ccgtctaccc 1140

gcaggctgag gttcccaaga aggtcatcat catcggcgca ggccccgctg gctgcgaggc 1200

tgccatcacc gcgaagaagt gcggccatga cgtcaccatc tacgagaagc gcaagatcgg 1260

tggcgttctg aaggaggcta ccgtctccga cagcaaggag gacctcggcc gcctcatcac 1320

ctactacgag acccagctca agaaggaggg catcgaggtc atctacgagg aggccactgc 1380

agacaccgtt gtagccggcg gcttcgacgt cgccatcgtc gcctgcggcg ccaccgtgcg 1440

caacctcaac atcgacggcc aggacgaccc ctccgtcgtg tacgcgatgg acttcctgga 1500

caacgactgc aagagcgatg ccgacagggt cgtcgttgtc ggcggtggca tcgtgggtgc 1560

cgagaccgcg ctgatcctcg cggaggagcg gggcaaggat gtcaccatca ccacccgctc 1620

cccggagttc ttcgtctccg gcgtcatggg catcgcctac atggttcgcc tgggtatggc 1680

gggagtcacg atcaagccct ccacccagct cgtcgccgtc aaggatggca agcccatgtt 1740

cgccggcccc cgcggcctgg agaccctgga cgtcgaccag acaatcatct cctctggctt 1800

cgtcccgacc ttcaaccagt tccgcgccca gatcgaggag aagtgcgagg acgtcagggt 1860

catcggcatc ggcgactgca aggcctcccg catggtcatg gacgctgtcc acgagggcta 1920

catcgctggc tgcaacctgg gtacc 1945

<210> 3

<211> 873

<212> DNA

<213> Lactococcus sp.

<400> 3

ggatccgatg gcacaggaag tcaaagtccc caagatgccc ggcgcacccg tgttcggcaa 60

gtggatctcc cccgaggagt ccgtcggcca gcgcctgaag ggcaagaaga tcctgctcac 120

cggcaccacc aagggcgtcg gcagggtcac ccaggagctg ctgtgcgcac acggcgcctt 180

cgtctgcggc tccggccgca cccccggcgt ggcagcctcc gtcgccgacg agctgaaggc 240

caagggctac caggccgccg gcatggacgt cgacctgtct gactacgacg ccgtgaagaa 300

gtgggttgag gagtgcgccg agctcatggg cggcatcgac gtcgtcatca acaacgcgtc 360

ccaccccggc atggccccct tcggcgagat gaccccggag atctggaact acggcatcaa 420

gaacgagctc gacctcgtct acaacgtctg caactgcgca tggccctacc tgcagaaggc 480

agacggcgcc tccatcatca tcacctcctc caccgtcgcc ctccagggca gcaactcccc 540

tcaggcctgt cacgctgcct gcaagggcgc ctgcctgtcc ctggcccgcc agctcgccgc 600

tgagggcggc cccttcggca tccgctgcaa ctccgtcacc ccgggcctgg tctggaccga 660

ggccatgtcc aacatcccca aggagatggc aagcggcctg gtcgcagccc agaccaccca 720

gcaggctgtc gacccgatgg acatcgccta cgcctacctg ttcctggcat ccgacgagtc 780

ccgccagatc accgctgcca acatccccgt cgacggcggc tgcgccggcg ctgtgaccgg 840

cggcatgcag ggcgagatcg aggtcgcggc cgc 873

<210> 4

<211> 1471

<212> DNA

<213> Lactococcus sp.

<400> 4

gatatcgatg gcagaattcg atgttgagta tgatcttgtt gtcgttggag gaggcgcctc 60

tggaaagtct gcagcgctga tcgccgcccg tgagggcaag cgcgtcgtgg tgctcgagaa 120

gatgcccgag accggaggcc tctccatgta cgccgaaggc accgctgcct tcgagtcctc 180

tattcagaac gagctcggca ccccgcgtct ttccaagtac cacttcccga ccaagcagga 240

gggcatcgag aagttcatgg gctacagcca tcagcgcgcg aactacgacg tcgtccgcgc 300

tttcgttgag aactccgcag agaccatcga catctaccgc gacctcggcg tcgtctacaa 360

ggcctgcgac atcgccgcag aggacgaccc caacgaggtc tggaccttcc atctgcccga 420

gggcctcggc gcccattgcc aggaagtcct gctcgacgcc atccagaagc tcgacgtcga 480

catcttcacc tccacccccg ccaaggagct catcatcgag gacggcgctg tcgtcggtgt 540

cgtcgcagag tctgacggcg agcccctgcg cgtcggcggc aaggccgtta tcctggcaac 600

cggcggcatg ggctccagcc cggagcgcat cttcaagtac agctggttcg cccccgctgc 660

ctacaacatg aacaccctca ccccgctgca gaacgtcggc gacggcctcg acctcgccct 720

ctccgcgggc gcagacccca cctacatcac cacctgcccg attctcgcag caggcggccg 780

tgacatgacc atggactccc aggtcggcgg cgcgggcgtc aaccccggcg tgtggatcaa 840

caagaccggc aggcgcttcg cggccgagtc cgttgccgag aacatcggcg acatcggaac 900

ctactacggc aagcagcccg gcggcgtggt ctggtccatc ctctcccagg cggacatcga 960

ccgtctggtg gccgagggtt ccgagatcgc gatcggcgag ttcgtcgtgt accacaagcc 1020

gatggagcgc ctccctatcg agctcgaggc tcatctcgag tccggcctgg tgaagaaggc 1080

tggcagcttc gaggagctcg cagccctcat tgacgtgcct gtagacacct tcgtcgcaac 1140

tatggccgac tacaacgagg catgcgagaa gggctacgac gacgccttta tgaagaagcc 1200

ccagtacctc cgcccgatgg tcgagggtcc cttctatgcc atccctctgg ctaccggcac 1260

catgggttct gctggcggca tccgcattaa cggcaacatg caggtcgtcg acgccgacta 1320

caacgccatt cccggtctct acgcggtcgg tctggacgcc acgggtctct acggcgattc 1380

ctacaacatg gaggttcccg gcgcagcaaa cggtttcgcc cacacctccg gacgcatcgc 1440

cgcccgccac gcgatctcca ctatgggtac c 1471

<210> 5

<211> 7106

<212> DNA

<213> unknown

<220>

<223> 人工序列

<400> 5

ccatgtcagc cgttaagtgt tcctgtgtca ctcaaaattg ctttgagagg ctctaagggc 60

ttctcagtgc gttacatccc tggcttgttg tccacaaccg ttaaacctta aaagctttaa 120

aagccttata tattcttttt tttcttataa aacttaaaac cttagaggct atttaagttg 180

ctgatttata ttaattttat tgttcaaaca tgagagctta gtacgtgaaa catgagagct 240

tagtacgtta gccatgagag cttagtacgt tagccatgag ggtttagttc gttaaacatg 300

agagcttagt acgttaaaca tgagagctta gtacgtgaaa catgagagct tagtacgtac 360

tatcaacagg ttgaactgct gatcttcaga tcctctacgc cggacgcatc gtggccggat 420

ccagccgacc aggctttcca cgcccgcgtg ccgctccatg tcgttcgcgc ggttctcgga 480

aacgcgctgc cgcgtttcgt gattgtcacg ctcaagcccg tagtcccgtt cgagcgtcgc 540

gcagaggtca gcgagggcgc ggtaggcccg atacggctca tggatggtgt ttcgggtcgg 600

gtgaatcttg ttgatggcga tatggatgtg caggttgtcg gtgtcgtgat gcacggcact 660

gacgcgctga tgctcggcga agccaagccc agcgcagatg cggtcctcaa tcgcgcgcaa 720

cgtctccgcg tcgggcttct ctcccgcgcg gaagctaacc agcaggtgat aggtcttgtc 780

ggcctcggaa cgggtgttgc cgtgctgggt cgccatcacc tcggccatga cagcgggcag 840

ggtgtttgcc tcgcagttcg tgacgcgcac gtgacccagg cgctcggtct tgccttgctc 900

gtcggtgatg tacttcacca gctccgcgaa gtcgctcttc ttgatggagc gcatggggac 960

gtgcttggca atcacgcgca ccccccggcc gttttagcgg ctaaaaaagt catggctctg 1020

ccctcgggcg gaccacgccc atcatgacct tgccaagctc gtcctgcttc tcttcgatct 1080

tcgccagcag ggcgaggatc gtggcatcac cgaaccgcgc cgtgcgcggg tcgtcggtga 1140

gccagagttt cagcaggccg cccaggcggc ccaggtcgcc attgatgcgg gccagctcgc 1200

ggacgtgctc atagtccacg acgcccgtga ttttgtagcc ctggccgacg gccagcaggt 1260

aggccgacag gctcatgccg gccgccgccg ccttttcctc aatcgctctt cgttcgtctg 1320

gaaggcagta caccttgata ggtgggctgc ccttcctggt tggcttggtt tcatcagcca 1380

tccgcttgcc ctcatctgtt acgccggcgg tagccggcca gcctcgcaga gcaggattcc 1440

cgttgagcac cgccaggtgc gaataaggga cagtgaagaa ggaacacccg ctcgcgggtg 1500

ggcctacttc acctatcctg cccggctgac gccgttggat acaccaagga aagtctacac 1560

gaaccctttg gcaaaatcct gtatatcgtg cgaaaaagga tggatatacc gaaaaaatcg 1620

ctataatgac cccgaagcag ggttatgcag cggaaaagcg ctgcttccct gctgttttgt 1680

ggaatatcta ccgactggaa acaggcaaat gcaggaaatt actgaactga ggggacaggc 1740

gagagacgat gccaaagagc tacaccgacg agctggccga gtgggttgaa tcccgcgcgg 1800

ccaagaagcg ccggcgtgat gaggctgcgg ttgcgttcct ggcggtgagg gcggatgtcg 1860

aggcggcgtt agcgtccggc tatgcgctcg tcaccatttg ggagcacatg cgggaaacgg 1920

ggaaggtcaa gttctcctac gagacgttcc gctcgcacgc caggcggcac atcaaggcca 1980

agcccgccga tgtgcccgca ccgcaggcca aggctgcgga acccgcgccg gcacccaaga 2040

cgccggagcc acggcggccg aagcaggggg gcaaggctga aaagccggcc cccgctgcgg 2100

gcccgaccgg gtttaccttc aacccaacac cggacaaaaa ggatcctcta ccccggaagc 2160

ttcttgccag cccgccgatg tgcccgcacc gcaggccaag gctgcggaac ccgcgccggc 2220

acccaagacg ccggagccac ggcggccgaa gcaggggggc aaggctgaaa agccggcccc 2280

cgctgcggcc ccgaccggct tcaccttcaa cccaacaccg gacaaaaagg atcctctacg 2340

ccggacgcat cgtggccggc atcaccggcg ccacaggtgc ggttgctggc gcctatatcg 2400

ccgacatcac cgatggggaa gatcgggctc gccacttcgg gctcatgagc gcttgtttcg 2460

gcgtgggtat ggtggcaggc cccgtggccg ggggactgtt gggcgccatc tccttgctgc 2520

ctcgcgcgtt tcggtgatga cggtgaaaac ctctgacaca tgcagctccc ggagacggtc 2580

acagcttgtc tgtaagcgga tgccgggagc agacaagccc gtcagggcgc gtcagcgggt 2640

gttggcgggt gtcggggcgc agccatgacc cagtcacgta gcgatagcgg agtgtatact 2700

ggcttaacta tgcggcatca gagcagattg tactgagagt gcaccataaa tcaatctaaa 2760

gtatatatga gtaaacttgg tctgacagtt accaatgctt aatcagtgag gcacctatct 2820

cagcgatctg tctatttcgt tcatccatag ttgcctgact ccccgtcgtg tagataacta 2880

cgatacggga gggcttacca tctggcccca gtgctgcaat gataccgcga gacccacgct 2940

caccggctcc agatttatca gcaataaacc agccagccgg aagggccgag cgcagaagtg 3000

gtcctgcaac tttatccgcc tccatccagt ctattaattg ttgccgggaa gctagagtaa 3060

gtagttcgcc agttaatagt ttgcgcaacg ttgttgccat tgctgcaggc atcgtggtgt 3120

cacgctcgtc gtttggtatg gcttcattca gctccggttc ccaacgatca aggcgagtta 3180

catgatcccc catgttgtgc aaaaaagcgg ttagctcctt cggtcctccg atcgttgtca 3240

gaagtaagtt ggccgcagtg ttatcactca tggttatggc agcactgcat aattctctta 3300

ctgtcatgcc atccgtaaga tgcttttctg tgactggtga gtactcaacc aagtcattct 3360

gagaatagtg tatgcggcga ccgagttgct cttgcccggc gtcaacacgg gataataccg 3420

cgccacatag cagaacttta aaagtgctca tcattggaaa acgttcttcg gggcgaaaac 3480

tctcaaggat cttaccgctg ttgagatcca gttcgatgta acccactcgt gcacccaact 3540

gatcttcagc atcttttact ttcaccagcg tttctgggtg agcaaaaaca ggaaggcaaa 3600

atgccgcaaa aaagggaata agggcgacac ggaaatgttg aatactcata ctcttccttt 3660

ttcaatatta ttgaagcatt tatcagggtt attgtctcat gagcggatac atatttgaat 3720

gtatttagaa aaataaacaa ataggggttc cgcgcacatt tccccgaaaa gtgccacctg 3780

cagatctgca ggtcgacgga tcccaagctt cttctagagg taccgcatgc gatagcggaa 3840

gagcgcccaa tacgcaaacc gcctctcccc gcgcgttggc cgattcatta atgcagctgg 3900

cacgacaggt ttcccgactg gaaagcgggc agtgagcgca acgcaattaa tgtgagttag 3960

ctcactcatt aggcacccca ggctttacac tttatgctcc cggctcgtat gttgtgtgga 4020

attgtgagcg gataacaatt tcacacagga aacagctatg accatgatta cgccaagcgc 4080

gcaattaacc ctcactaaag ggaacaaaag ctgggtaccg ggccccccct cgagcggccg 4140

ccagtgtgat ggatgacaca tagatggcgt cgctagtatt aaatgcatat tatttttata 4200

tagtaccaac cttcaaatga ttcgtgtcaa aatttgacgt ctgtaagtca attagtttgt 4260

gagatagagc gtcttttgtg aagcaacttt tgttattgtg aaacatatgg aaaaaaagga 4320

atttcgtgtt ttgataaaat actgttttct gaagggaaaa aatacagtgg aagcaaaaac 4380

ttggcttgat aatgagtttc cggactctgc cccagggaaa tcaacaataa ttgattggta 4440

tgcaaaattc aagcgtggtg aaatgagcac ggaggacggt gaacgcagtg gacgcccgaa 4500

agaggtggtt accgacgaaa acatcaaaaa aatccacaaa atgattttga atgaccgtaa 4560

aatgaagttg atcgagatag cagaggcctt aaagatatca aaggaacgtg ttggtcatat 4620

cattcatcaa tatttggata tgcggaagct ctgtgcaaaa tgggtgccgc gcgagctcac 4680

atttgaccaa aaacaacaac gtgttgatga ttctgagcgg tgtttgcagc tgttaactcg 4740

taatacaccc gagtttttcc gtcgatatgt gacaatggat gaaacatggc tccatcacta 4800

cactcctgag tccaatcgac agtcggctga gtggacagcg accggtgaac cgtctccgaa 4860

gcgtggaaag actcaaaagt ccgctggcaa agtaatggcc tctgtttttt gggatgcgca 4920

tggaataatt tttatcgatt atcttgagaa gggaaaaacc atcaacagtg actattatat 4980

ggcgttattg gagcgtttga aggtcgaaat cgcggcaaaa cggccccaca tgaagaagaa 5040

aaaagtgttg ttccaccaag acaacgcacc gtgccacaag tcattgagaa cgatggcaaa 5100

aattcatgaa ttgggcttcg aattgcttcc ccacccgccg tattctccag atctggcccc 5160

cagcgacttt ttcttgttct cagacctcaa aaggatgctc gcagggaaaa aatttggctg 5220

caatgaagag gtgatcgccg aaactgaggc ctattttgag gcaaaaccga aggagtacta 5280

ccaaaatggt atcaaaaaat tggaaggtcg ttataatcgt tgtatcgctc ttgaagggaa 5340

ctatgttgaa taataaaaac gaattttcac aaaaaaatgt gtttttcttt gttagaccgg 5400

atcctccaat tcgccctata gtgagtcgta ttacgcgcgc tcactggccg tcgttttaca 5460

acgtcgtgac tgggaaaacc ctggcgttac ccaacttaat cgccttgcag cacatccccc 5520

tttcgccagc tggcgtaata gcgaagaggc ccgcaccgat cgcccttccc aacagttgcg 5580

cagccttttt ccaatgatga gcacttttaa agttctgcta acaggttggc tgataagtcc 5640

ccggtctgac acatagatgg cgtcgctagt attaaatgca tattattttt atatagtacc 5700

aaccttcaaa tgattcccgg gctgcaggaa ttcgatatca agcttatcga taccgtcgac 5760

ctcgaggggg ggcccggtac cgaggacgcg tcggccggga agccgatctc ggcttgaacg 5820

aattgttagg tggcggtact tgggtcgata tcaaagtgca tcacttcttc ccgtatgccc 5880

aactttgtat agagagccac tgcgggatcg tcaccgtaat ctgcttgcac gtagatcaca 5940

taagcaccaa gcgcgttggc ctcatgcttg aggagattga tgagcgcggt ggcaatgccc 6000

tgcctccggt gctcgccgga gactgcgaga tcatagatat agatctcact acgcggctgc 6060

tcaaacttgg gcagaacgta agccgcgaga gcgccaacaa ccgcttcttg gtcgaaggca 6120

gcaagcgcga tgaatgtctt actacggagc aagttcccga ggtaatcgga gtccggctga 6180

tgttgggagt aggtggctac gtctccgaac tcacgaccga aaagatcaag agcagcccgc 6240

atggatttga cttggtcagg gccgagccta catgtgcgaa tgatgcccat acttgagcca 6300

cctaactttg ttttagggcg actgccctgc tgcgtaacat cgttgctgct gcgtaacatc 6360

gttgctgctc cataacatca aacatcgacc cacggcgtaa cgcgcttgct gcttggatgc 6420

ccgaggcata gactgtacaa aaaaacagtc ataacaagcc atgaaaaccg ccactgcgcc 6480

gttaccaccg ctgcgttcgg tcaaggttct ggaccagttg cgtgagcgca tacgctactt 6540

gcattacagt ttacgaaccg aacaggctta tgtcaattcg agaattgacg cgtcaattcg 6600

aggggtatcg ctcttgaagg gaactatgtt gaataataaa aacgaatttt cacaaaaaaa 6660

tgtgtttttc tttgttagac cggggactta tcagccaacc tgttatgtgg cgcggtatta 6720

tcccgtattg acgccgggca agagcaactc ggtcgccgca tacactattc tcagaatgac 6780

ttggttgagt ggcgaatggg acgcgccctg tagcggcgca ttaagcgcgg cgggtgtggt 6840

ggttacgcgc agcgtgaccg ctacacttgc cagcgcccta gcgcccgctc ctttcgcttt 6900

cttcccttcc tttctcgcca cgttcgccgg ctttccccgt caagctctaa atcgggggct 6960

ccctttaggg ttccgattta gtgctttacg gcacctcgac cccaaaaaac ttgattaggg 7020

tgatggttca catcgagctc tcccgggaat tccacaaatt gttatccgct cacaattcca 7080

catgtggaat tccacatgtg gaattc 7106

Claims (6)

1.一种具有S-雌马酚抗性的大肠杆菌突变株，其特征在于所述大肠杆菌突变株是将来源于乳酸菌(Lactococcus sp.)20-92的L-DDRC、L-DZNR、L-DHDR和L-THDR基因克隆至大肠埃希氏菌BL21-G2转化得到；所述L-DDRC的核苷酸序列为SEQ ID NO：1所示、L-DZNR的核苷酸序列为SEQ ID NO：2所示、L-DHDR的核苷酸序列为SEQ ID NO：3所示，L-THDR的核苷酸序列为SEQ ID NO：4所示；所述大肠埃希氏菌(Escherichia coli)BL21-G2保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCC No.14219，保藏日期2017年6月5日，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编100101。

2.一种权利要求1所述具有S-雌马酚抗性的大肠杆菌突变株在制备S-雌马酚中的应用。

3.如权利要求2所述具有S-雌马酚抗性的大肠杆菌突变株在制备S-雌马酚中的应用，其特征在于所述的应用为：以大豆素为底物，将具有S-雌马酚抗性的大肠杆菌突变株经扩大培养获得的种子液以体积浓度5％的接种量接种至LB培养基，在好氧或厌氧条件下，37℃培养24h，向培养液中加入终浓度25mg/L的IPTG，37℃继续培养6～72h后，取培养液分离纯化，获得S-雌马酚；所述LB培养基终浓度组成：胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5.0g/L、氯化钠10g/L，溶剂为蒸馏水，pH值为7.0。

4.如权利要求3所述具有S-雌马酚抗性的大肠杆菌突变株在制备S-雌马酚中的应用，其特征在于所述大豆素的初始浓度为5-200μg/ml。

5.如权利要求3所述具有S-雌马酚抗性的大肠杆菌突变株在制备S-雌马酚中的应用，其特征在于所述的应用按如下步骤进行：(1)种子培养：将具有S-雌马酚抗性的大肠杆菌突变株接种至含有终浓度50μg/ml羧苄青霉素和终浓度50μg/ml链霉素的LB培养基中，37℃静置培养24h后，获得种子液；(2)发酵培养及转化反应：将大豆素加入LB培养基，然后以体积浓度5％的接种量接种种子液，37℃培养24h，向培养液中加入终浓度25mg/L的IPTG，37℃继续培养6～72h后，取培养液分离纯化，获得S-雌马酚；所述大豆素的初始浓度为5-200μg/ml。

6.如权利要求3所述具有S-雌马酚抗性的大肠杆菌突变株在制备S-雌马酚中的应用，其特征在于所述培养液分离纯化的方法为：取1ml的培养液，8000r/min离心3分钟，获得上清a；取900μl上清a至另一干净的2ml EP管中，然后向管中加入900μl乙酸乙酯，充分混匀后静置5min，5000r/min离心5分钟，获得上清b和沉淀b；取900μl上清b至另一干净的2ml EP管中；取沉淀b加入等量的乙酸乙酯重复离心1次，获得上清c；将上清b和上清c混合在一起，移到2ml离心管中，45℃真空冷冻浓缩成粉末；加入200μl无水甲醇到该EP管溶解浓缩粉末，并经0.22μm聚偏氟乙稀微孔滤膜过滤，滤液即为S-雌马酚。