JP5629841B1 - 発酵化粧料の製造方法及び乳酸菌菌株 - Google Patents

Abstract

【課題】 植物原料を乳酸発酵してなる化粧料を製造するのに、製造工程を簡素化し、且つ、発酵制御が容易に行え、植物原料を乳酸発酵してなる、防腐剤を使用せずに保存性の優れた化粧料の製造方法及び化粧料自体、並びにその製造に使用する新規菌株を提供する。【解決手段】 １種類以上の植物原料をエタノール−糖混合水溶液に浸漬し、固形物を除去して植物エキス抽出エタノール水溶液を得、該植物エキス抽出エタノール水溶液にエタノール耐性を有する乳酸菌を添加し、発酵させて、３０ｍＭ以上の乳酸を含み、エタノール濃度１３−２０容量％、ｐＨ４．５以下の発酵液を取得する。この発酵液をろ過して発酵化粧水とする。乳酸菌には、ラクトバシルス・パラカゼイ サブスピーシス パラカゼイに属する新菌株ＨＬ１９０（ＮＩＴＥ Ｐ−０１８１０）を用いることが望ましい。【選択図】なし

Description

本発明は、植物原料を乳酸発酵してなる化粧料を製造する方法、化粧料自体、並びにその製造に使用する新規乳酸菌菌株に関する。

果物や野菜からフラボノイドなどの有効成分を、エタノールを用いて抽出し、抽出物を化粧品原料とすることは知られている（特許文献１）。

一方、Ｄ−アラニンはコラーゲン産生促進効果が認められており、肌改善効果を目的として化粧料に含有させることが知られている（特許文献２）。

一般的に化粧品は、製造時に雑菌に汚染されない設備が必要とされており、また、開封後にも雑菌の汚染のリスクがあるため、従来の化粧品の多くは、防腐剤等を添加し保存性を高めているのが実情である。

ところで、５０種類にもおよぶ植物を浸透圧を利用して抽出したエキスを１年以上の長期間自然醗酵させてなる醗酵液をベースとし、これに植物原料から得た抽出エキスを加え、さらに精製水と醸造アルコールを配合して１８−２４カ月自然発酵、熟成して得た化粧水はヘーラールーノ（大高酵素株式会社の登録商標）として知られている（非特許文献１参照）。

該ヘーラールーノ（大高酵素株式会社の登録商標）は、植物抽出エキスから１年以上かけて自然発酵させて発酵液を得るための発酵期間約１年と、さらに精製水と醸造アルコールを配合して自然発酵させる期間（１８カ月−２４カ月）の合計は２年半−３年を要している。ヘーラールーノ（大高酵素株式会社の登録商標）には自然発酵により生成された乳酸が含まれｐＨが４．０以下となり、且つ製造過程で使用されるエタノールが含まれるため、保存性が高いという利点がある。

特開２００７−２２３９１８号公報 特開２０１２−５１８７３８号公報

http://www.ohtakakohso.co.jp/index.php? ヘーラールーノ

前記ヘーラールーノ（大高酵素株式会社の登録商標）は、作業工程にて自然に混入した乳酸菌等により発酵したものであるため、発酵制御が困難であり、場合によって発酵不良となり損失となることがあった。また、製造工程が複雑であり、３年間前後の長期間を要していた。

そこで本発明は、植物原料を乳酸発酵してなる化粧水を製造するのに、製造工程を簡素化し、且つ、発酵制御が容易に行える方法にて植物原料を乳酸発酵してなる、防腐剤を使用せずに保存性の優れた化粧水を含む化粧料の製造方法、及び該化粧水を含む化粧料自体、並びにその製造に使用する新規乳酸菌菌株を提供することを目的とする。

本発明の発酵化粧料の製造方法は、１種類以上の植物原料をエタノール−糖混合水溶液に浸漬し、固形物を除去して植物エキス抽出エタノール水溶液を得、該植物エキス抽出エタノール水溶液にエタノール耐性を有する乳酸菌を添加し、発酵させて、３０ｍＭ以上の乳酸を含み、エタノール濃度１３−２０容量％、ｐＨ４．５以下、好ましくは３．５以下の発酵液（植物発酵エキスエタノール水溶液）を取得することを特徴とする。

前記発酵化粧料の製造方法に使用されるエタノール−糖混合水溶液は、エタノール濃度１５−２２容量％、糖濃度１−４重量％であることが望ましい。

前記発酵化粧料の製造方法に使用されるエタノール耐性を有する乳酸菌は、エタノール濃度１０−１８容量％のエタノール存在下で乳酸発酵が可能であることが望ましい。

前記発酵化粧料の製造方法に使用されるエタノール耐性を有する乳酸菌は、０．２ｕＭ以上、好ましくは０．４ｕＭ以上のＤ−アラニン産生能を有する乳酸菌であることが望ましい。

前記発酵化粧料の製造方法に使用されるエタノール耐性を有する乳酸菌は、ラクトバシルス属に属する乳酸菌であることが望ましい。

前記発酵化粧料の製造方法に使用されるエタノール耐性を有する乳酸菌は、ラクトバシルス・パラカゼイ サブスピーシス パラカゼイに属する乳酸菌であることが望ましい。

前記発酵化粧料の製造方法に使用されるエタノール耐性を有する乳酸菌は、ラクトバシルス・パラカゼイ サブスピーシス パラカゼイに属する新菌株ＨＬ１９０（ＮＩＴＥ
Ｐ−０１８１０）であることが望ましい。

前記発酵化粧料の製造方法における発酵は、１８−２７℃の液温にて行うことが望ましい。

前記発酵化粧料の製造方法における発酵は、熟成期間を含み少なくとも発酵開始から１００日以上継続することが望ましい。

本発明の発酵化粧料には、発酵化粧水、乳液、クリームが含まれる。

本発明の発酵化粧水は、前記何れかの製造方法により製造された発酵液（植物発酵エキスエタノール水溶液）を化粧水としたものであって、３０ｍＭ以上の乳酸を含み、エタノール濃度１３−２０容量％、ｐＨ４．５以下、好ましくはｐＨ３．５以下であることを特徴とする。

本発明の発酵化粧水は、０．２ｕＭ以上、好ましくは０．４ｕＭ以上のＤ−アラニンを含み、３０ｍＭ以上の乳酸を含み、エタノール濃度１３−２０容量％、ｐＨ４．５以下であることを特徴とする。

本発明の発酵化粧水に、液状及び／又は固形オイル、並びに乳化剤を添加混合して乳液とすることができる。

本発明の発酵化粧水に、液状及び／又は固形オイル、並びに乳化剤を添加混合してクリームとすることができる。

本発明の発酵化粧料の製造に用いられる新菌株は、ラクトバシルス・パラカゼイ サブスピーシス パラカゼイに属する新菌株ＨＬ１９０（ＮＩＴＥ Ｐ−０１８１０）である。

本発明の新菌株ＨＬ１９０（ＮＩＴＥ Ｐ−０１８１０）の特徴は、エタノール濃度１０−１８容量％の存在下で、ｐＨ４．５以下、好ましくは３．５以下で乳酸発酵が可能で、０．２ｕＭ以上、好ましくは０．４ｕＭ以上のＤ−アラニン産生能を有する。

本発明の発酵化粧料の製造方法は、１種類以上の植物原料をエタノール−糖混合水溶液に浸漬し、固形物を除去して植物エキス抽出エタノール水溶液を得、該植物エキス抽出エタノール水溶液にエタノール耐性を有する乳酸菌を添加して発酵化粧料を得る方法であるので、前記従来の非特許文献１に示される方法、即ち、５０種類にもおよぶ植物を浸透圧を利用して抽出したエキスを長期間自然醗酵させてなる醗酵液に、さらに植物原料から得た抽出エキスを加え、さらに精製水と醸造アルコールを配合し、１８−２４カ月自然発酵、熟成する方法、に比べて製造方法が簡略化されており、製造期間も短縮化でき、且つ管理された特定の乳酸菌を添加し発酵させているので発酵制御が簡単に行える。

本発明に使用される該特定の乳酸菌は、エタノール耐性に優れ、耐酸性に優れ、生存性に優れ、且つ、増殖性に優れ、乳酸生成能に優れ、加えて、Ｄ−アラニンを生成する特徴を有するので、本発明の発酵化粧料の製造に最適である。

本発明の発酵化粧料の製造方法により得られた発酵化粧水は、エタノール濃度１３−２０容量％、ｐＨ４．５以下、好ましくは３．５以下であるので、防腐剤を添加する必要がなく、保存性が高い。

本発明の発酵化粧料の製造方法により得られた発酵化粧水は、前記特徴に加え、０．２ｕＭ以上、好ましくは０．４ｕＭ以上のＤ−アラニンを含むので、特許文献２に示されるようなコラーゲン産生促進効果及び肌改善効果が期待できる。

植物エキス抽出エタノール水溶液から選抜した３種類の菌株の増殖に関して、波長６６０ｎｍの濁度計にて測定した結果を、発酵液の濁度を縦軸に、発酵日数を横軸にして示したグラフを表す図である。 植物エキス抽出エタノール水溶液から選抜した３種類の菌株を用いた発酵液のｐＨを測定した結果を、ｐＨを横軸に、発酵日数を横軸にして示したグラフを表す図である。 各菌株を、１５％エタノールを含むＭＲＳ培地で２０℃で培養し、一週間毎にｐＨを測定した結果を、ｐＨを縦軸に、発酵日数を横軸にして示したグラフを表す図である。 各菌株を、１５％エタノールを含むＭＲＳ培地で２０℃で培養し、一週間毎に生菌数を測定した結果を、生菌数を縦軸に、発酵日数を横軸にして示したグラフを表す図である。

ＨＬ１９０株（ＮＩＴＥ Ｐ−０１８１０）の添加から６５０日間の発酵液中の乳酸菌の生菌数、発酵液のｐＨについて、縦軸に生菌数及びｐＨ、横軸に日数をとったグラフを示す図である。 植物エキス抽出エタノール水溶液（発酵熟成前）についてＨＰＬＣのチャートを示す図である。 植物エキス抽出エタノール水溶液にＨＬ１９０株（ＮＩＴＥ Ｐ−０１８１０）を添加発酵熟成させた約１年後（３６０日後）の発酵液についてＨＰＬＣのチャートを示す図である。 植物エキス抽出エタノール水溶液に、ＨＬ１９０株（ＮＩＴＥ Ｐ−０１８１０）及び類縁の２種の菌株を接種、３５日間発酵させて、各菌株毎のＤ−アラニン生成量を測定した結果のグラフを示す図である。 ＭＲＳ培地に、ＨＬ１９０株（ＮＩＴＥ Ｐ−０１８１０）及び類縁の５種の菌株を接種、３５日間発酵させて、各菌株毎のＤ−アラニン生成量を測定した結果のグラフを示す図である。

以下、本発明について詳述する。

植物原料
１種類以上の植物原料としては、リンゴ、ニンジン、パイナップル、大根、キャベツ、セロリ、キュウリ、バナナ、タマネギ、ゴボウ、ホウレン草、ナシ、ミカンの皮、レモン、トマト、ピーマン、ブラックマッペモヤシ、ナス、レンコン、カボチャ、シイタケ、ショウガ、レタス、ニンニク、三つ葉、ウド、アスパラガス、熊笹、クローバー、昆布、フキノトウ、タンポポ、オオバコ、エンドウモヤシ、スギ葉、パセリ、カブ、ブドウ、イチゴ、イタドリの若芽、アサツキ、白菜、エノキタケ、サラダ菜、シュンギク、ヨモギ、セリ、ニラ、トドマツ葉、青シソ、ワカメ等が好ましく挙げられ、例えば、これらの植物原料のうち１種又は２種以上、好ましくは、多種類が用いられる。

上記植物原料の配合割合として、例えばリンゴでは植物原料総重量の０．１−５０重量％、ニンジンでは０．１−５０重量％、大根では０．０５−４０重量％、キャベツでは０．０５−４０重量％、セロリやキュウリでは０．０１−３０重量％、バナナ、タマネギ、ゴボウ、ホウレン草では０．０１−３０重量％とすることが望ましいが、特に制限されるものではない。

植物エキス抽出エタノール水溶液
これらの植物原料を１−５ｃｍ幅、好ましくは１−４ｃｍ幅、最も好ましくは１−３ｃｍ幅に切断し、エタノール１５−２２容量％、糖濃度１−４重量％のエタノール−糖混合水溶液中に浸漬する。植物エキス抽出エタノール水溶液に含まれる糖の割合は植物原料総重量の０．０５−５０重量％となるようにすると植物エキスの抽出に有利である。

３日間から３週間程度浸漬期間を経て、植物原料を圧搾することなく取り除く。エタノール−糖混合水溶液に使用される糖には、ブドウ糖果糖液糖、糖蜜、ショ糖、ブドウ糖、果糖が使用可能である。得られた植物エキス抽出エタノール水溶液のエタノール濃度は、約１０−１８容量％程度となるが、本発明のエタノール耐性を有する乳酸菌を添加し発酵を良好にするためにエタノール濃度１０−１８容量％となるように調製することが望ましい。

乳酸菌の単離
前記植物エキス抽出エタノール水溶液を安定的に発酵させることが可能な乳酸菌は以下のようにして単離することができる。前記植物エキス抽出エタノール水溶液より複数の乳酸菌菌株を単離し、さらにこれらの乳酸菌より、乳酸生成能及びエタノール耐性に優れた菌株を選抜することにより本発明に使用する乳酸菌を得る。

本発明において最も好ましい乳酸菌菌株の一例は、ラクトバシルス・パラカゼイ サブスピーシス パラカゼイに属する新菌株ＨＬ１９０であり、独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センターにおいて２０１４年２月２６日に受託され、受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−０１８１０が付与されている。

ＨＬ１９０株は、少なくとも１０−１８容量％のエタノール存在下で乳酸発酵が可能である。

ＨＬ１９０株を用いた発酵化粧料の製造方法を例をあげて詳細に説明するが本発明はこれらに限定されない。

植物発酵エキスエタノール水溶液の製造
前記の植物エキス抽出エタノール水溶液に、前記本発明に使用する乳酸菌を添加し、１８℃−２７℃の液温になるように保ち、暗所で一定期間、好ましくは６０日以上、さらに好ましくは７０日以上、最も好ましくは１００日以上放置して乳酸発酵させる。約６０日以上で得られる植物発酵エキスエタノール水溶液のｐＨは４．５以下、好ましくは４．０以下となり、約７０日以上でｐＨは約３．６以下となり、約１００日以上でｐＨは約３．２以下のほぼ一定の値となる。乳酸発酵により得られた植物発酵エキスエタノール水溶液のエタノール濃度は１３−２０容量％となる。

得られた植物発酵エキスエタノール水溶液を化粧水、乳液、クリーム等の化粧料の主原料とすることができる。

本発明の発酵方法では、エタノール濃度１５−２２容量％のエタノール糖混合水溶液で抽出した植物抽出液（エタノール濃度１０−１８容量％）を乳酸発酵させるので、得られた発酵液（植物発酵エキスエタノール水溶液）は、エタノール濃度１３−２０容量％、ｐＨ４．５以下、好ましくは３．５以下となる。そのため、発酵液に防腐剤を添加する必要がなく、保存性が高い。

植物エキス抽出エタノール水溶液の発酵において、エタノールの揮発を抑えるため、比較的低温で発酵させる場合、例えば、約２０℃前後程度の範囲での発酵条件を採用すると、エタノール及び低ｐＨが雑菌の増殖を抑制するため、特に、密閉タンク、滅菌装置等の導入は不要であり、発酵環境は、開放系でも可能である。しかしながら、必要に応じて、例えば、半密封系乃至密封系、具体的には密閉タンク、滅菌されたタンク等を用いてもかまわない。

本発明では、本来であれば必要とされるエタノール除去設備、滅菌装置、密閉タンク等の発酵設備及び防腐剤の添加等にかかる費用を削減でき、長期間安定な化粧料を提供できる。

化粧料
本発明で得られる植物発酵エキスエタノール水溶液はエタノール濃度１３−２０容量％であり、ｐＨが４．５以下であるのでそのままの状態で保存性の良好な化粧水とすることができる。また、該化粧水（植物発酵エキスエタノール水溶液）を主成分として用い、通常、化粧料に用いられる、油分（ベースオイル、液状及び／又は固形オイル等）、乳化剤、水、増粘剤、キレート剤、シリコーン類、酸化防止剤、色材、香料、保湿剤等を必要に応じて混合してクリームや乳液の形態に調製してもよい。

（乳酸菌の単離）
乳酸菌を単離するための植物エキス抽出エタノール水溶液に用いる植物原料として以下の材料を１−３ｃｍ幅に切断したものを使用した。

リンゴ ２９５ｋｇ
ニンジン ２３５ｋｇ
キュウリ ３０ｋｇ
ミカンの皮 １７６ｋｇ
レモン １２ｋｇ
これらの植物原料をエタノール−糖混合水溶液（３０００Ｌ：エタノール２０容量％、糖濃度３％）に１週間浸漬した後、固形分を圧搾することなく取り除き、植物エキス抽出エタノール水溶液を得た。

得られた植物エキス抽出エタノール水溶液を、ＢＣＰ加プレートカウント寒天培地を用い、酸生成の確認できたコロニーを分離し乳酸菌菌株とした。こうして得た乳酸菌２９株を１５容量％エタノール存在下で安定的で尚かつ最優勢菌株として発酵する株の選抜のため、１５容量％となるエタノール添加ＭＲＳ培地を調製し、２０℃で増殖できた乳酸菌３株（ＨＬ１６９、ＨＬ１９０、ＨＬ３１２）を選抜した。

この時、増殖、ｐＨを調査した。増殖に関して、波長６６０ｎｍの濁度計にて測定した結果を、発酵液の濁度を縦軸に、発酵日数を横軸にして示したグラフを図１に表す。また、ｐＨに関して、発酵液のｐＨを測定した結果を、ｐＨを横軸に、発酵日数を横軸にして示したグラフを図２に表す。

図１、図２によれば、ＨＬ１９０が増殖性に優れ、乳酸生成能に優れていることから、本発明の目的とする発酵化粧料の製造に最も優れていることがわかる。

ＨＬ１９０株の同定を行ったところ、グラム陽性、カタラーゼ陰性、オキシダーゼ陰性、生成した乳酸の型はＬ型、ブドウ糖からのガスの産生は無く、通性嫌気性で無芽胞桿菌であった。各糖類に対する資化性試験の結果は以下に示す。

炭水化物資化性（陽性：＋、陰性：−）
グリセロール −
エリスリトール −
Ｄ−アラビノース −
Ｌ−アラビノース −
リボース ＋
Ｄ−キシロース −
Ｌ−キシロース −
アドニトール −
β−メチル−Ｄ−キシロシド −
ガラクトース ＋
グルコース ＋
フルクトース ＋
マンノース ＋
ソルボース −
ラムノース −
ズルシトール −
イノシトール −
マンニトール ＋
ソルビトール −
α−メチル−D −マンノシド −
α−メチル−D −グルコシド −
N −アセチルグルコサミン ＋
アミダグリン ＋
アルブチン ＋
エスクリン ＋
サリシン ＋
セロビオース ＋
マルトース ＋
ラクトース ＋
メリビオース −
スクロース ＋
トレハロース ＋
イヌリン ＋
メレチトース −
ラフィノース −
デンプン −
グリコーゲン −
キシリトール −
ゲンチオビオース ＋
Ｄ−ツラノース ＋
Ｄ−リキソース −
Ｄ−タガロース ＋
Ｄ−フコース −
Ｌ−フコース −
Ｄ−アラビトール −
Ｌ−アラビトール −
グルコネート ＋
１０℃での生育 ＋
２３℃での生育 ＋
４５℃での生育 ＋
上記の菌学的性質から、Bergy's Manual of systematic bacteriology, vol.2(1986 ）により同定すると、ＨＬ１９０株は、ラクトバシルス・パラカセイ（Lactobacillus paracasei)の薗学的性質と一致した。

さらに遺伝子学的に同定を行った結果、１６ｓ ｒＤＮＡの相同性解析によりラクトバシルス・パラカゼイ サブスピーシス パラカセイと１００％の相同性を示したため、ＨＬ１９０株はラクトバシルス・パラカゼイ サブスピーシス パラカセイに属すると決定した。

ＨＬ１９０株と基準株であるラクトバシルス・パラカセイ サブスピーシス バラカゼイＪＣＭ８１３０において通常のＭＲＳ培地を用いて３７℃における増殖能を比較したところ、濁度及びｐＨともに菌株間の差は確認できなかったが、エタノール添加ＭＲＳ培地を用いて２０℃で発酵能を比較したところ、酸の生成速度は基準株と比較し若干劣るものの、酸の最終生成量及び菌の生存性はＨＬ１９０株が上回っていた。耐酸性、エタノール耐性及び生存性が基準株と比較し強化されている特徴を有するＨＬ１９０株はラクトバシルス・パラカゼイ サブスピーシス パラカゼイの亜種であると考えられる。

ＨＬ１９０株と前記基準株との差異を１６ｓ ｒＤＮＡ以外の部分において遺伝子の相同性解析を行った。その結果、機能遺伝子ｒｅｃＡ、ｒｐｏＡ、ｔｕｆ ｇｅｎｅの相同性解析では基準株と１００％の相同性を示した。しかし、機能遺伝子ｄｎａＫの相同性解析では基準株と９９．６％の相同性を示し、ｄｎａＫの７６０ｂｐのうち３ｂｐの差異が認められた。

ＰＣＲ法によって増幅した機能遺伝子ｄｎａＫを制限酵素ｘｓｐＩ及びＥｃｏＴ１４Ｉ（タカラバイオ社製）を用いて分解し電気泳動したところ、泳動パターンはラクトバシルス カゼイ（ＪＣＭｌ１３４^T ：Lactobacillus casei ）、ラクトバシルス パラカゼイ サブスピーシス トレランス（ＪＣＭ１１７１^T ：Lactobacillus paracasei subsp. tolerans ）、ラクトバシルス パラカゼイ サブスピーシス パラカセイ（ＪＣＭ８１３０^T ：Lactobacillus paracasei subsp. paracasei）、ラクトバシルス ラムノサス（ＪＣＭ１１３６^T ：Lactobacillus rhamnosus ）、ラクトバシルス ペントーサス（ＪＣＭ１５５８^T ：Lactobacillus pentosus）、ラクトバシルス プランタラム サブスピーシス プランタラム（ＪＣＭ１１４９^T ：Lactobacillus Plantarum subsp. plantarum）、ラクトバシルス ファーメンタム（ＪＣＭ１１７３^T ：Lactobacillus fermentum ）、ラクトバシルス ｓｐ（ＪＣＭ９７２１：Lactobacillus sp（L. homohiochii））のいずれとも一致しなかった。

ＨＬ１９０株を独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センターに２０１４年２月２６日に寄託したところ、受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−０１８１０が付与された。

（エタノール添加培地培養試験）
比較用菌株としてラクトバシルス カゼイ（ＪＣＭｌ１３４^T ：Lactobacillus casei ）、ラクトバシルス パラカゼイ サブスピーシス トレランス（ＪＣＭ１１７１^T ：
Lactobacillus paracasei subsp. tolerans ）、ラクトバシルス パラカゼイ サブスピーシス パラカセイ（ＪＣＭ８１３０^T ：Lactobacillus paracasei subsp. paracasei
）、ラクトバシルス ラムノサス（ＪＣＭ１１３６^T ：Lactobacillus rhamnosus ）、
ラクトバシルス ペントーサス（ＪＣＭ１５５８^T ：Lactobacillus pentosus）、ラクトバシルス プランタラム サブスピーシス プランタラム（ＪＣＭ１１４９^T ：Lactobacillus Plantarum subsp. plantarum）、ラクトバシルス ファーメンタム（ＪＣＭ１１７３^T ：Lactobacillus fermentum ）、ラクトバシルス ｓｐ（ＪＣＭ９７２１：Lactobacillus sp（L. homohiochii））を用いた。

各菌株はＭＲＳ培地を用いて３７℃２４時間前培養した。次に、１５％エタノールを含むＭＲＳ培地を調製し、あらかじめ２０℃のインキュベーターに入れて放置した後、前培養液が全培地の１％となるように添加した。この培地について２０℃で培養し、一週間毎にｐＨ、生菌数について測定した。それらの結果について、図３にｐＨを縦軸に、培養日数を横軸としたグラフを表し、図４に生菌数を縦軸に、培養日数を横軸としたグラフを表す。

図３のグラフによれば、本発明に使用する菌株（ＨＬ１９０株）と、ラクトバシルス
ｓｐ（ＪＣＭ９７２１：Lactobacillus sp（L. homohiochii）の２株は、その他の比較用菌株に比べて培養日数の経過と共にもっともｐＨが低下していることが分かる。これは、これらの２種の菌株は培養日数の経過と共に乳酸を生成をしていることを示す。

また、図４によれば、比較用菌株に比べて本発明に使用するＨＬ１９０株の場合は、培養５０日を過ぎても１０⁷ 個／ｍＬ以上の菌数を保持していることが分かる。これは本発明で使用する菌株は長期の発酵において生存することから、長期にわたり雑菌の増殖を抑制しながら生存することが可能であることがわかる。

（植物エキス抽出エタノール水溶液の調製）
リンゴ２９５ｋｇ、キュウリ３０ｋｇ、レモン１２ｋｇ、ニンジン２３５ｋｇ、ミカンの皮１７６ｋｇ、を１−３ｃｍに切断し、切断した原料を網袋（２ｍｍメッシュ）に入れ、直ちにエタノール−糖混合水液溶液（３０００Ｌ：エタノール２０容量％、糖濃度３％）に浸漬した。一週間浸漬した後、原料を圧搾することなく網袋を引き上げることにより固形物を取り除き、植物エキス抽出エタノール水溶液を得た。

得られた植物エキス抽出エタノール水溶液は、ｐＨ４．７、エタノール濃度１５．２容量％、糖濃度３．９重量％となった。

（前培養液の調製）
前記「植物エキス抽出エタノール水溶液の調製」工程において、固形物を取り除く日から逆算して３日前に、あらかじめ調製した凍結保存しておいた植物エキス抽出エタノール水溶液１Ｌを用意し、ロータリーエバポレーターを用いてエタノールを除去し、エタノールの減量分だけ滅菌水を加え、除菌ろ過（０．４５ｕｍ）して前培養培地とした。これにラクトバシルス・パラカセイ サブスピーシス バラカゼイ ＨＬ１９０株（ＮＩＴＥ
Ｐ−０１８１０）を接種し２０℃３日間培養し前培養液とした。

（乳酸菌の添加、発酵、熟成）
前記「植物エキス抽出エタノール水溶液の調製」工程で得られた植物エキス抽出エタノール水溶液を熟成用タンクに移し、一方、前記「前培養液の調製」工程で得られた前培養液を該熟成用タンクに添加し、２０℃の液温になるように保ち、暗所で６５０日間放置することにより発酵、熟成した。

ＨＬ１９０株（ＮＩＴＥ Ｐ−０１８１０）の添加から６５０日間の発酵液中の乳酸菌の生菌数、発酵液のｐＨについて、生菌数を縦軸に及びｐＨ、日数を横軸にとったグラフを図５に示す。図５によれば、乳酸菌の生菌数について６０日目−１００日目頃にコロニー形成単位が１０⁸ 個／ｍＬが最大となり、その後、２２０日目頃迄急激に減少し、５００日目頃にほぼゼロとなったことが分かる。また、ｐＨについて、発酵開始時にｐＨ４．７以上あったものが乳酸の生成により５０日目頃に急激に低下し、１００日目頃に約ｐＨ３．２位迄低下しその後一定の値となったとが分かる。

（Ｄ−アラニンの生成の確認）
前記の「乳酸菌の添加、発酵、熟成」工程における約１年間発酵熟成させた発酵液を０．０６ｍＬ採種し、試料とした。該試料０．０６ｍＬに４０重量％トリクロル酢酸溶液０．０２ｍＬを添加し撹拌後５分間放置した。この液を０．４５ミクロンのフィルターで濾過後、１ＮのＮａＯＨを加えて中和しＤ−アラニン測定用試料とした。このＤ−アラニン測定用試料０．０６ｍＬに、２重量％となるように１重量％四ホウ酸ナトリウムに溶解したＮ−アセチル−Ｌ−システイン溶液０．０２ｍＬ、１．６重量％のｏ−フタルアルデヒド溶液０．０２ｍＬ及び１重量％四ホウ酸ナトリウム溶液０．０４ｍＬを添加してキラル誘導体化して高速液体クロマトグラフィーによる分析に用いた。

高速液体クロマトグラフィーは、以下の条件で行った。カラム：ＯＤＳ −８０Ｔｓ東ソー；カラムサイズ：４．６ｍｍ×１５ｃｍ、カラム温度：３５℃、流速：１．０ｍＬ／ｍｉｎ、検出：蛍光検出器（Ｅｘ３５０ｎｍ、Ｅｍ４５０ｎｍ）
溶出は以下のグラジエント条件で行った。
Ａ液；５０ｍＭ 酢酸ナトリウム緩衝液 ｐＨ５．５３
Ｂ液；５０ｍＭ 酢酸ナトリウム緩衝液 ｐＨ５．５３／メタノール＝２０／８０
時間（分） Ａ％ Ｂ％
０分 ９３％ ７％
５分 ９３％ ７％
３５分 ７８％ ２２％
６５分 ５０％ ５０％
７５分 ０％ １００％
植物エキス抽出エタノール水溶液（発酵熟成前）と、該植物エキス抽出エタノール水溶液に前記の「乳酸菌の添加、発酵、熟成」工程における約１年間（３６０日間）発酵熟成させた発酵液（発酵熟成後）についてＤ−アラニンの生成をＨＰＬＣでそれぞれ確認した。ＨＰＬＣのチャートを図６（発酵熟成前）と図７（発酵熟成後）に示す。

図６及び図７によれば、発酵熟成前には存在しないが、発酵熟成後の植物発酵エキスエタノール水溶液中にＤ−アラニンが生成されることがわかる。

（植物エキス抽出エタノール水溶液での対照菌株とのＤ−アラニン生成の比較）
前記「Ｄ−アラニンの生成の確認」において、植物発酵エキスエタノール水溶液中にＤ−アラニンの存在が認められたので、本発明に使用する乳酸菌と対照菌株とのＤ−アラニンの生成の比較を次のようにして行った。

対照菌株として、本発明で使用するラクトバシルス・パラカセイ サブスピーシス バラカゼイ ＨＬ１９０株（ＮＩＴＥ Ｐ−０１８１０）と類縁の、ラクトバシルス ｓｐ（ＪＣＭ９７２１：Lactobacillus sp（L. homohiochii））、及びラクトバシルス パラカゼイ サブスピーシス パラカセイ（ＪＣＭ８１３０^T ：Lactobacillus paracasei subsp. paracasei）を用いた。ＪＣＭ９７２１は前記乳酸生成試験（図３）において乳酸の生成が良好で、増殖試験（図４）において増殖がやや良好であった菌株である。ＪＣＭ８１３０^T は前記乳酸生成試験（図３）において乳酸の生成がやや良好で、増殖試験（図４）において増殖がやや良好であった菌株である。

植物エキス抽出エタノール水溶液３０ｍＬにこれらの３種の菌株を各々接種し、２０℃で３５日間培養した。培養後、１Ｎ ＮａＯＨで中和し、前記アラニン生成の確認試験と同様にＨＰＬＣを行いＤ−アラニン生成量を測定した。Ｄ−アラニン生成量の結果を図８に示す。

図８によれば、本発明に使用する乳酸菌であるラクトバシルス・パラカセイ サブスピーシス バラカゼイ ＨＬ１９０株（ＮＩＴＥ Ｐ−０１８１０）は、ＪＣＭ９７２１やＪＣＭ８１３０^T にくらべ、Ｄ−アラニン生成量が際立って多いことがわかる。

（ＭＲＳ培地でのＤ−アラニン生成の比較）
植物発酵エキスエタノール水溶液を使用せずに培地を替えて、ＭＲＳ培地にて、本発明に使用する乳酸菌と対照菌株とのＤ−アラニンの生成の比較試験を次のように行った。

対照菌株として、本発明で使用するラクトバシルス・パラカセイ サブスピーシス バラカゼイ ＨＬ１９０株（ＮＩＴＥ Ｐ−０１８１０）と類縁の、ラクトバシルス カゼイ（ＪＣＭｌ１３４^T ：Lactobacillus casei ）、ラクトバシルス パラカゼイ サブスピーシス トレランス（ＪＣＭ１１７１^T ： Lactobacillus paracasei subsp. tolerans ）、ラクトバシルス パラカゼイ サブスピーシス パラカセイ（ＪＣＭ８１３０^T ：Lactobacillus paracasei subsp. paracasei）、ラクトバシルス ラムノサス（ＪＣＭ１１３６^T ：Lactobacillus rhamnosus ）、 ラクトバシルス ｓｐ（ＪＣＭ９７２１：Lactobacillus sp（L. homohiochii））を用いた。

各菌株はＭＲＳ培地を用いて３７℃２４時間前培養した。次に前培養した各菌株をＭＲＳ培地５ｍＬに接種し、３７時間で２４時間培養した。培養上清を除菌ろ過した後、１Ｎ ＮａＯＨで中和しＤ−アラニン測定用試料とした。前記アラニン生成の確認試験と同様にＨＰＬＣを行いＤ−アラニン生成量を測定した。Ｄ−アラニン生成量の結果をグラフとして図９に示す。図９のグラフによれば、試験に用いた菌株の中で本発明で使用するラクトバシルス・パラカセイ サブスピーシス バラカゼイ ＨＬ１９０株（ＮＩＴＥ Ｐ−０１８１０）は、他の菌株と比べてＤ−アラニン生成量が際立って多いことがわかる。

なお、前記「対照菌株とのＤ−アラニン生成量の比較」と「ＭＲＳ培地でのＤ−アラニン生成の比較」の試験においてグラフの単位が異なるのは、Ｄ−アラニン合成の材料となるＬ−アラニンの両者の原料中に含まれる量が異なるからと思われる。

（化粧水の製造）
前記「乳酸菌の添加、発酵、熟成工程」で得られた、２０℃、暗所で６５０日間発酵熟成させた発酵物をろ過滅菌（０．４ｕｍ）して得た発酵液を化粧水とした。

（乳液の製造）
前記「化粧水の製造方法」で得られた化粧水８０ｍＬにホホバオイル１０ｍＬ、ポリソルベート２０（モノラウリン酸ポリオキシエチレンソルビタン）１５ｍＬを加え、混合して１０５ｍＬの乳液を得た。

（化粧クリームの製造）
シアバター２０ｇ、ホホバオイル３０ｍＬ、パーム油乳化ワックス６ｇ、みつろう４ｇを容器に入れ混合しながら加熱して溶かす。一方、前記「化粧水の製造方法」で得られた化粧水６０ｍＬを別の容器に入れ加熱したものを、先のシアバターを溶かした容器内に注ぎ混合してクリーム状とすることにより化粧クリームを得た。

本発明の化粧料の製造方法により製造される化粧水は、エタノール濃度１３−２０容量％、ｐＨ４．５以下であるので、防腐剤を使用せずに保存性の優れた化粧料を提供できる。

Claims (15)

1. １種類以上の植物原料をエタノール−糖混合水溶液に浸漬し、固形物を除去して植物エキス抽出エタノール水溶液を得、
   該植物エキス抽出エタノール水溶液にエタノール耐性を有する乳酸菌を添加し、発酵させて、３０ｍＭ以上の乳酸を含み、エタノール濃度１３−２０容量％、ｐＨ４．５以下の発酵液を取得することを特徴とする発酵化粧料の製造方法。
2. 前記エタノール−糖混合水溶液は、エタノール濃度１５−２２容量％、糖濃度１−４重量％である請求項１に記載の発酵化粧料の製造方法。
3. 前記エタノール耐性を有する乳酸菌は、エタノール濃度１０−１８容量％のエタノール存在下で乳酸発酵が可能である請求項１又は２に記載の発酵化粧料の製造方法。
4. 前記エタノール耐性を有する乳酸菌は、０．２ｕＭ以上のＤ−アラニン産生能を有する乳酸菌である請求項１乃至３の何れか１項に記載の発酵化粧料の製造方法。
5. 前記エタノール耐性を有する乳酸菌は、ラクトバシルス属に属する乳酸菌である請求項１乃至４の何れか１項に記載の発酵化粧料の製造方法。
6. 前記エタノール耐性を有する乳酸菌は、ラクトバシルス・パラカゼイ サブスピーシス パラカゼイに属する乳酸菌である請求項１乃至５の何れか１項に記載の発酵化粧料の製造方法。
7. 前記エタノール耐性を有する乳酸菌は、ラクトバシルス・パラカゼイ サブスピーシス パラカゼイに属する新菌株ＨＬ１９０（ＮＩＴＥ Ｐ−０１８１０）である請求項１乃至６の何れか１項に記載の発酵化粧料の製造方法。
8. 前記発酵は、１８−２７℃の液温にて行う請求項１乃至７の何れか１項に記載の発酵化粧料の製造方法。
9. 前記発酵は、熟成期間を含み少なくとも発酵開始から１００日以上継続する請求項１乃至８の何れか１項に記載の発酵化粧料の製造方法。
10. 請求項１乃至９の何れか１項に記載の製造方法により製造された発酵液を化粧水としたものであって、３０ｍＭ以上の乳酸を含み、エタノール濃度１３−２０容量％、ｐＨ４．５以下であることを特徴とする発酵化粧水。
11. 請求項１０に記載の発酵化粧水であって、０．２ｕＭ以上のＤ−アラニンを含むことを特徴とする発酵化粧水。
12. 請求項１０又は１１に記載の発酵化粧水に、液状オイル及び／又は固形オイル、並びに乳化剤を添加し混合して製造した乳液。
13. 請求項１０又は１１に記載の発酵化粧水に、液状オイル及び／又は固形オイル、並びに乳化剤を添加し混合して製造したクリーム。
14. ラクトバシルス・パラカゼイ サブスピーシス パラカゼイに属する新菌株ＨＬ１９０（ＮＩＴＥ Ｐ−０１８１０）。
15. エタノール濃度１０−１８容量％の植物エキス抽出エタノール水溶液中で乳酸発酵が可能で、０．２ｕＭ以上のＤ−アラニン産生能を有する請求項１４に記載の新菌株ＨＬ１９０（ＮＩＴＥ Ｐ−０１８１０）。
    

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