WO2021241953A1 - 발효나노유화제 조성물 및 그 제조방법 - Google Patents

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fermentation
culture
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nanoemulsifier
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김광년
손주현
박소영
조사랑
김주연
윤석균
정수경
강승현
박명삼
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Definitions

  • the present invention relates to a fermented nanoemulsifier composition
  • a fermented nanoemulsifier composition comprising a product obtained by fermenting oil with a skin flora and a method for preparing the same.
  • the skin consists of the epidermis, dermis and subcutaneous fat layer.
  • the epidermis is the outermost layer, acts as a protective film for the skin, and is responsible for the immune function of the skin.
  • the epidermal layer is mainly composed of keratinocytes, the lipid component between the keratinocytes, and the outermost layer is composed of proteins.
  • the human body can be a habitat for various microorganisms, and microorganisms form a symbiotic relationship with the host and affect the host.
  • Dermatophytes present in the skin are microorganisms that reproduce on the surface of the skin, and are mainly found in the outermost layer of the epidermis and the upper part of the hair follicle (upper layer).
  • aerobic microorganisms can secrete lipolytic enzymes that can use the lipids of the epidermal layer.
  • an object of the present invention is to provide a fermented nanoemulsifier composition with improved emulsifying power by utilizing a skin flora that secretes a lipolytic enzyme and a method for manufacturing the same.
  • the present invention in order to solve the above problems,
  • It provides a method for producing a fermentation nano-emulsifier composition comprising the step of preparing a fermented product by fermenting the pre-culture.
  • the medium used in the step of preparing the seed culture may include R2A (BD Difco, USA) medium.
  • the medium used in the step of preparing the pre-culture is yeast extract, glycerol, casein peptone, vegetable oil, K 2 HPO 4 KH 2 PO 4 , MgSO 4 and MgCl 2 may be included.
  • the medium used in the step of preparing the fermented product may include yeast extract, glycerol, casein peptone, vegetable oil, K 2 HPO 4 , KH 2 PO 4 , MgSO 4 and MgCl 2 .
  • the medium used in the step of preparing the seed culture is 0.1 to 5 g/L of casein hydrolyzate, 0.1 to 10 g/L of yeast extract, 0.1 to 10 g/L of glucose, 0.1 to 0.1 to soluble starch 5 g/L, K 2 HPO 4 0.1-5 g/L, sodium pyruvate 0.05-5 g/L, casein peptone 0.1-5 g/L, MgCl 2 0.01-1 g/L.
  • the step of preparing the pre-culture is yeast extract 1 to 100 g / L, glycerol 0.1 to 10 g / L, casein peptone 1 to 100 g / L, vegetable oil 10 to 500 g / L, K 2 HPO 4 1 to 10 g/L, KH 2 PO 4 1 to 10 g/L, MgSO 4 1 to 10 g/L and MgCl 2 0.1 to 50 g/L of the seed culture in a medium containing 0.01 to 3 g/L It may include the step of adding.
  • the step of preparing the fermented product is yeast extract 1 to 100 g / L, glycerol 0.1 to 10 g / L, casein peptone 1 to 100 g / L, vegetable oil 10 to 500 g / L, K 2 HPO 4 1 to 10 g/L, KH 2 PO 4 1 to 10 g/L, MgSO 4 1 to 10 g/L, and MgCl 2
  • Add 1 to 300 g/L of the pre-culture to a medium containing 0.01 to 3 g/L may include the step of
  • the step of preparing the seed culture includes the step of culturing in aerobic conditions of 15 to 35 °C, and the culture can be terminated when the absorbance of the spectrophotometer at a wavelength of 600 nm is 0.5.
  • the step of preparing the pre-culture includes culturing in aerobic conditions of 15 to 35° C., and the culture may be terminated when the absorbance of the spectrophotometer at a wavelength of 600 nm is 1.
  • preparing the fermented product may include culturing for 1 to 10 days at 15 to 35 °C.
  • a fermentation nanoemulsifier composition prepared by the method as described above.
  • the average particle diameter of the fermented nano-emulsifier may be 100 to 200 nm.
  • a cosmetic composition comprising the fermentation nanoemulsifier composition as described above.
  • Fermented nanoemulsifier composition using skin flora can provide a skin-friendly composition by minimizing the content of synthetic raw materials.
  • it is possible to improve the emulsification power by forming a nanoemulsion having a size of nm, and it can be applied to various formulations by improving the stability of the composition, and since skin irritation can be minimized, it can be easily applied to various formulations having a skin hypoallergenic function. can be applied
  • FIG. 1 is a photograph of visually observing a fermented product according to the present invention.
  • Figure 2 is a photograph of visually observing the obtained fermented nanoemulsifier after purification.
  • 3 is a graph measuring the growth curve, turbidity and pH change of the culture medium under optimal fermentation conditions.
  • the present invention provides a nanoemulsifier composition with improved emulsification power by using a symbiotic skin flora while having a beneficial effect on the skin, among various microorganisms inhabiting the skin.
  • It provides a method for producing a fermentation nano-emulsifier composition comprising the step of preparing a fermented product by fermenting the pre-culture.
  • the skin flora used in the present invention is a microorganism of accession number KCCM 11843P (Korea Microorganism Conservation Center (Overseas), 2016.06.08.), and Epidermidibacterium keratini sp belonging to Sporichthyaceae . ) are included.
  • the medium used in the step of preparing the seed culture may be R2A (BD Difco, USA) medium.
  • the medium used in the step of preparing the pre-culture may include yeast extract, glycerol, casein peptone, vegetable oil, K 2 HPO 4 , KH 2 PO 4 , MgSO 4 and MgCl 2 .
  • the medium used in the step of preparing the fermented product is yeast extract, glycerol, casein peptone, vegetable oil, K 2 HPO 4 KH 2 PO 4 , MgSO 4 and MgCl 2 may be included.
  • the medium used in the step of preparing the seed culture is 0.1 to 5 g/L of casein acid hydrolysate, for example, 0.1 to 1 g/L, 0.1 to 10 g of yeast extract /L, for example 0.1 to 5, for example 0.1 to 1 g/L, glucose 0.1 to 10 g/L, for example 0.1 to 1 g/L, soluble starch 0.1 to 5 g/L, for example 0.1 to 1 g/L, K 2 HPO 4 0.1 to 5 g/L, for example 0.1 to 1 g/L, sodium pyruvate 0.05 to 5 g/L, for example 0.1 to 1 g/L, casein peptone 0.1 to 5 g/L, for example 0.1 to 1 g/L, MgCl 2 0.01 to 1 g/L, for example 0.01 to 0.1 g/L.
  • casein acid hydrolysate for example, 0.1 to 1 g/L, 0.1 to 10 g of yeast extract /L, for
  • the step of preparing the pre-culture is yeast extract 1 to 100 g / L, for example 1 to 50 g / L, glycerol 0.1 to 10 g / L, for example 0.5 to 5 g / L, casein peptone 1 to 100 g/L, for example 1 to 50 g/L, for example 1 to 30 g/L, for example 5 to 20 g/L, 10 to 500 g/L vegetable oil, for example 10 to 300 g/L, for example 10 to 200 g/L, K 2 HPO 4 1 to 10 g/L, for example 3 to 8 g/L, for example 5 to 8 g/L, KH 2 PO 4 1 to 10 g/L, such as 1 to 5 g/L, MgSO 4 1 to 10 g/L, such as 1 to 5 g/L, such as 1 to 3 g/L and MgCl 2 0.01 to 3 g / L, for example 0.1 to 50 g / L of the seed culture to
  • the step of preparing the fermented product is yeast extract 1 to 100 g / L, for example 1 to 50 g / L, glycerol 0.1 to 10 g / L, for example 0.5 to 5 g / L, casein peptone 1 to 100 g/L, for example 1 to 50 g/L, 1 to 30 g/L, for example 5 to 20 g/L, 10 to 500 g/L vegetable oil, for example 10 to 300 g/L, For example 10 to 200 g/L, K 2 HPO 4 1 to 10 g/L, for example 3 to 8 g/L, for example 5 to 8 g/L, KH 2 PO 4 1 to 10 g/L L, for example 1 to 5 g/L, MgSO 4 1 to 10 g/L, for example 1 to 5 g/L, for example 1 to 3 g/L and MgCl 2 0.01 to 3 g/L, For example, it may include adding 1 to 300 g/L of the pre-(s
  • the vegetable oil is sunflower seed, grape seed, canola, rice bran, olive, soybean, argan, brown rice, perilla, sesame, almond, peanut, corn, red ginseng, avocado, macadamia, coconut, rosehip, vitamin tree seed , one of edible or human-friendly oils such as shea fruit, oil palm, bergamot fruit, camellia seed, safflower seed, apricot seed, poppy seed, evening primrose seed, castor seed, green tea seed, meadowfoam seed, flax seed and hemp seed It may include the above, but is not particularly limited to the above types.
  • the step of preparing the seed culture comprises the step of culturing in aerobic conditions of 15 to 35 °C, for example, 20 to 30 °C, the seed culture absorbance of the spectrophotometer at 600 nm wavelength is 0.5 It can be terminated at any point in time.
  • the step of preparing the pre-culture includes culturing in aerobic conditions of 15 to 35 ° C, for example, 20 to 30 ° C. Incubation can be terminated at this time point.
  • the step of preparing the fermented product is 15 to 35 °C, for example, 20 to 30 °C 24 hours to 240 hours, for example 72 hours to 240 hours, for example 120 hours to 240 hours It may include the step of culturing during.
  • the “fermented product” may be a culture solution itself obtained by culturing a strain, a concentrate thereof, or a lyophilisate.
  • the fermented product includes a fermentation nano-emulsifier.
  • the average particle diameter of the fermentation nano-emulsifier according to the present invention may be 100 to 200 nm, for example, 150 to 200 nm, for example, 160 to 190 nm.
  • a cosmetic composition comprising the fermentation nanoemulsifier composition as described above.
  • the cosmetic composition may include ingredients commonly used in cosmetic compositions, such as stabilizers, solubilizers, vitamins, pigments, fragrances, adjuvants, and carriers.
  • the cosmetic composition of the present invention is conventionally prepared in the art, and can be prepared in any formulation that can be applied dermatologically.
  • compositions that can have a relatively non-toxic and harmless effective action to the subject, and may include an external agent that can be applied to the skin, and the side effects resulting from the composition can affect the efficacy of the active ingredient. It may mean that the activity and physical properties of the active ingredients are not impaired while not lowering the application target and causing serious irritation.
  • the dermatologically applicable cosmetic composition of the present invention includes, for example, a solution, suspension, emulsion, emulsion, paste, gel, pack, cream, lotion, powder, soap, surfactant-containing cleansing, oil, and powder foundation. , emulsion foundation, wax foundation, spray and hair cosmetics, etc., but is not limited thereto.
  • the cosmetic composition is a skin lotion, skin softener, skin toner, astringent, lotion, gel, milk lotion, moisture lotion, nourishing lotion, massage cream, nourishing cream, moisture cream, hand cream, foundation, essence, ampoule, nutrition It can be prepared in the form of essence, pack, soap, hair shampoo, foot shampoo, cleansing foam, cleansing lotion, cleansing cream, body lotion and body cleanser.
  • the microorganism of accession number KCCM 11843P was seed cultured.
  • a seed culture was prepared by inoculating R2A (BD Difco, USA) medium and performing stationary culture under aerobic conditions at 25°C.
  • the medium composition is casein acid hydrolysate 0.5 g / L, yeast extract 0.5 g / L, glucose 0.5 g / L, soluble starch 0.5 g / L, K 2 HPO 4 0.3 g/L, sodium pyruvate 0.3 g/L, casein peptone 0.5 g/L and MgCl 2 0.05 g/L.
  • the seed culture was terminated at the point of showing an absorbance of 0.5 at a wavelength of 600 nm with a spectrophotometer.
  • the fermented product was subjected to high-speed continuous centrifugation to remove microorganisms, and the fermented product from which the cells were removed was separated into an oil phase and an aqueous phase.
  • the aqueous phase was sequentially sterilized and filtered through a 0.45 um and 0.2 um polyethersulfone (PES) membrane filter to obtain a fermentation nanoemulsifier.
  • PES polyethersulfone
  • the fermentation nanoemulsifier according to Example 19 is shown in FIG. 2 .
  • Examples 1 to 29 optimal fermentation conditions were evaluated by measuring the turbidity of the culture medium and the amount of microorganisms.
  • the seed culture was carried out in the manner described above, and pre-culture was performed with the composition shown in each Example, and the same composition was evaluated after fermentation at 25° C. at 200 rpm for 140 hours.
  • the method for measuring the turbidity of the culture medium is as follows.
  • the culture medium was centrifuged at 3,088 g for 15 minutes to remove microbial cells, and the culture solution from which the cells were removed was separated into an oil layer and an aqueous layer.
  • the aqueous layer was sequentially sterilized and filtered through 0.45 um and 0.2 um polyethersulfone (PES) membrane filters. It was observed that the nanoemulsion having a size of 0.2 um or less was dispersed in the culture solution from which the cells were removed by the above method.
  • the higher the content of the emulsified component the higher the density of the formed nanoemulsion, and it was determined that the turbidity could be compared.
  • the aqueous layer from which the cells were removed was diluted 10-fold with purified water, filtered through a 0.2 um membrane filter, and absorbance was measured at a wavelength of 600 nm, and the results are shown in Table 3.
  • a spectrophotometer (BIO Teck, Korea) was used as a measuring device.
  • the amount of cells in the culture was measured. After taking the culture solution for each Example and centrifuging at 13,000 g for 30 minutes, the supernatant was discarded and only microbial cells were obtained. After washing it once in 0.85% NaCl, it was suspended in 0.85% NaCl of the same volume as the culture medium, diluted 10-fold with purified water, and absorbance was measured at a wavelength of 600 nm, and the results are shown in Table 3.
  • a spectrophotometer (BIO Teck, Korea) was used as the measuring device.
  • Example 1 0.623 0.203
  • Example 2 0.415 0.499
  • Example 3 0.644 0.156
  • Example 4 0.691 0.198
  • Example 5 0.112 0.885
  • Example 6 0.421 0.123
  • Example 7 0.495 0.452
  • Example 8 0.306 0.594
  • Example 9 0.131 0.799
  • Example 10 0.173 0.303
  • Example 11 0.200 0.464
  • Example 12 0.403 0.379
  • Example 14 0.162 0.851
  • Example 15 0.241 0.569
  • Example 16 0.192 0.675
  • Example 17 0.098 0.735
  • Example 18 0.611 0.205
  • Example 19 0.802 0.248
  • Example 20 0.590 0.674
  • Example 21 0.127 0.819
  • Example 22 0.654 0.318
  • Example 23 0.206 0.502
  • Example 24 0.251 0.603
  • Example 25 0.100 0.451
  • Example 28 0.143 0.500
  • Example 29 0.080 0.901
  • Example 19 was selected as the optimal fermentation condition.
  • Comparative Examples 2 and 4 had the most foul odor in the culture broth, it was determined that the culture broth itself was difficult to apply to the cosmetic composition.
  • Example 19 the culture solution of Example 19 was judged to be easy to use as a cosmetic composition because it was close to odorless.
  • Example 19 was the optimal pre-culture medium and fermentation medium conditions, and by measuring pH, cell mass, and turbidity of the culture medium during the culture period, the time point at which secondary metabolites of microorganisms were produced and the time point of the end of fermentation An experiment was conducted to determine
  • the pH change can confirm the production and degree of metabolites in the process of fermentation of microorganisms. Specifically, the culture solution sampled by time was centrifuged at 3,088 g for 5 minutes, and the aqueous layer excluding the cells and oil layer was measured with a pH meter (Mettler toledo, FP20).
  • the turbidity of the culture medium was increased by the secondary metabolites of microorganisms, and it can be expected that this is a kind of emulsifier component.
  • the point at which the turbidity of the culture medium from which the cells were removed no longer increases after the secondary metabolism of microorganisms occurred was considered as the time point at which the emulsified component was maximally produced, and this was determined as the fermentation end time point.
  • the turbidity of the culture solution from which the cells were removed showed a tendency to be maintained without increasing. Therefore, around 180 hours was determined as the end point of fermentation.
  • the fermented nanoemulsifier according to Example 19 was diluted 10-fold with purified water, and then the sample was analyzed.
  • a particle size analyzer HORIBA Scientific, Japan
  • the results are shown in FIG. 4, and the average particle diameter was measured to be about 181.7 nm.
  • the nanoemulsion formed in the fermentation nanoemulsifier obtained by separating and purifying the culture solution according to Example 19 was observed with a transmission electron microscope (JEM-F200, JEOL).
  • the sample was pretreated by dropping a drop on a Cu grid coated with carbon, drying it at room temperature for 6 hours, and observed under a microscope.
  • the micrograph is shown in FIG. 5 . It can be seen that a round-shaped nanoemulsion (micelle) is formed.
  • Example 19 was analyzed by TLC (Thin Layer Chromatography) for quantitative comparison and the generation of emulsified components according to culture conditions.
  • 1N HCl was added to the obtained fermentation broth to adjust the pH to 2-3.
  • An organic solvent mixed with chloroform and methanol in a ratio of 2: 1 (v/v) was added to the fermentation broth in a ratio of 2: 1 (v/v) and stirred at 25 ° C. for 2 hours, By allowing to stand overnight, the emulsified component was transferred to the lower layer solution (chloroform) for purification.
  • the obtained chloroform was concentrated under reduced pressure, volatilized, and the remaining emulsified component was dissolved in chloroform.
  • the purified product (emulsifying component) was dripped onto a silica gel TLC plate (TLC Silica gel 60, Merck; 5 cm x 6.5 cm), and chloroform, methanol, acetic acid (6.5:2: 0.2 v/v) was developed to the endpoint.
  • 10% sulfuric acid mixed with ethanol was sprayed on a naturally dried plate, dried, and heated at 100° C. for 5 minutes to visualize the spots. As a result, polar lipid spots could be observed, as shown in FIG. 6 .
  • Example 19 As the fermentation of Example 19 proceeded, it was attempted to confirm the time when the actual emulsified layer was formed. For each fermentation period, 10 ml of the culture medium was taken and observed after centrifugation at 3,088 g for 5 minutes.
  • an emulsified layer is formed at a time very similar to the time when secondary metabolism begins to occur. Through this, it can be seen that an emulsion component is formed as a secondary metabolite.
  • a primary skin irritation evaluation was performed to evaluate whether or not skin irritation occurred.
  • the evaluation agency was commissioned by Corederm Co., Ltd. Thirty-two subjects were selected and applied on the back for 24 hours, and then at 30 minutes, 24 hours, and 48 hours after the patch was removed, the dermatologist judged the presence or absence of primary skin irritation, respectively.
  • the skin reaction determination was based on the International Contact Dermatitis Association (ICDRG) standards and the American Cosmetics Association (PC) standards, and the results are shown in Table 5.
  • IDRG International Contact Dermatitis Association
  • PCPC American Cosmetics Association
  • an essence formulation containing a fermentation nanoemulsifier obtained by separation and purification of Example 19 was prepared. Specifically, raw materials 2 to 7 were sequentially added to raw material No. 1 in the table below, and dissolved by stirring. Afterwards, ingredients No. 8 to No. 9 were sequentially added to the reaction vessels No. 1 to No. 7, and uniformly dissolved and mixed to complete the essence formulation.
  • a skin formulation containing the fermented nanoemulsifier obtained by separation and purification of Example 19 was prepared according to the composition of the following table. Specifically, ingredients 2 to 7 were sequentially added to raw material 1 in the table below, and uniformly dissolved and mixed to complete the skin formulation.
  • Example 30 In order to evaluate the stability according to the storage temperature conditions, the stability according to the conditions of the essence according to Example 30 and the skin formulation composition according to Example 31 was confirmed. Each composition was stored for 3 months at room temperature and 25°C under normal conditions, and stored for 1 month under severe conditions at low temperature (-5°C), high temperature (50°C), and circulation (-5 to 40°C/12 hr) conditions. Thus, pH and separation properties were observed. Changes in the formulation were observed after 3 months under normal conditions, and changes in formulations were observed after 1 month under severe conditions. The results are shown in Tables 8 and 9.
  • the skin flora can form a fermented nanoemulsifier by using oil, and the fermented nanoemulsifier according to the present invention forms a nanoemulsion with a nanometer (nm) size to form a chemical interface
  • the emulsification power can be improved without using an active agent, the stability of the composition can be improved, so that it can be applied in various formulations, and skin irritation can be minimized.

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Abstract

본 발명은 피부 상재균으로 오일을 발효하여 수득한 산물을 포함하는 발효나노유화제 조성물의 제조방법에 따르면 합성 원료의 함량을 최소화함으로써 피부에 친화적인 조성물을 제공할 수 있다. 또한, nm 크기의 나노에멀젼을 형성함으로써 유화력을 향상시킬 수 있고, 조성물의 안정성을 향상시켜 다양한 제형으로 응용할 수 있으며, 피부 자극 최소화할 수 있으므로, 피부 저자극의 기능을 필요로 하는 다양한 제형의 제품에 용이하게 적용할 수 있다.

Description

발효나노유화제 조성물 및 그 제조방법
본 발명은 피부 상재균으로 오일을 발효하여 수득한 산물을 포함하는 발효나노유화제 조성물 및 그 제조방법에 관한 것이다.
본 출원은 2020.05.26자로 출원된 한국특허출원 제2020-0063024호에 기초한 우선권의 이익을 주장하며, 해당 특허 출원의 문헌에 개시된 모든 내용은 본 명세서의 일부로서 포함된다.
피부는 표피, 진피, 피하지방층으로 이루어져 있다. 이중 표피는 가장 바깥층에 존재하고, 피부의 보호막 역할을 하며, 피부의 면역 기능을 담당하고 있다. 표피층은 주로 각질형성세포로 이루어져 있으며, 각질세포 사이는 지질성분으로 이루어져 있고, 가장 바깥층은 단백질로 구성되어 있다.
사람의 몸은 다양한 미생물들의 서식처가 될 수 있고, 미생물은 숙주와 공생관계를 이루며 숙주에 영향을 미친다. 이중 피부에 존재하는 피부상재균은 피부의 표면에 생식하는 미생물로써, 표피의 가장 외곽층과 모낭의 윗부분(상위층)에서 주로 발견된다. 피부상재균으로는 약 1000여종의 미생물이 존재한다. 피부에 존재하는 미생물 중 호기성 미생물은 표피층의 지질을 이용할 수 있는 지방분해효소를 분비할 수 있다.
하지만, 피부 상재균 및 이를 이용한 피부 조성물에 대한 연구는 미비한 실정이다.
따라서, 지방분해효소를 분비하는 피부 상재균을 활용하여 유화력이 향상된 발효나노유화제 조성물 및 그 제조방법을 제공하고자 한다.
본 발명의 목적은 피부 상재균을 이용한 오일의 발효 산물로부터 발효나노유화제 조성물 및 그 제조방법을 제공하는 것이다.
상기 과제를 해결하기 위하여 본 발명은,
피부상재균으로 기탁번호 KCCM 11843P(한국미생물보존센터(국외), 2016.06.08)의 미생물을 종균배양하여 종균배양물을 제조하는 단계;
상기 종균배양물을 전배양하여 전배양물을 제조하는 단계; 및
상기 전배양물을 발효하여 발효물을 제조하는 단계를 포함하는, 발효나노유화제 조성물의 제조방법을 제공한다.
일구현예에 따르면, 상기 종균배양물을 제조하는 단계에서 사용하는 배지는 R2A(BD Difco, USA) 배지를 포함할 수 있다.
또한, 상기 전배양물을 제조하는 단계에서 사용하는 배지는 이스트 추출물, 글리세롤, 카제인 펩톤, 식물성오일, K2HPO4 KH2PO4, MgSO4 및 MgCl2를 포함할 수 있다.
또한, 상기 발효물을 제조하는 단계에서 사용하는 배지는 이스트 추출물, 글리세롤, 카제인 펩톤, 식물성오일, K2HPO4, KH2PO4, MgSO4 및 MgCl2를 포함할 수 있다.
구체적인 구현예에 따르면, 상기 종균배양물을 제조하는 단계에서 사용하는 배지는 카제인 가수분해물 0.1 내지 5 g/L, 이스트 추출물 0.1 내지 10 g/L, 글루코스 0.1 내지 10 g/L, 가용성 전분 0.1 내지 5 g/L, K2HPO4 0.1 내지 5 g/L, 피루브산나트륨 0.05 내지 5 g/L, 카제인 펩톤 0.1 내지 5 g/L, MgCl2 0.01 내지 1 g/L를 포함할 수 있다.
또한, 상기 전배양물을 제조하는 단계는 이스트 추출물 1 내지 100 g/L, 글리세롤 0.1 내지 10 g/L, 카제인 펩톤 1 내지 100 g/L, 식물성오일 10 내지 500 g/L, K2HPO4 1 내지 10 g/L, KH2PO4 1 내지 10 g/L, MgSO4 1 내지 10 g/L 및 MgCl2 0.01 내지 3 g/L를 포함하는 배지에 상기 종균배양물 0.1 내지 50g/L을 첨가하는 단계를 포함할 수 있다.
또한, 상기 발효물을 제조하는 단계는 이스트 추출물 1 내지 100 g/L, 글리세롤 0.1 내지 10 g/L, 카제인 펩톤 1 내지 100 g/L, 식물성오일 10 내지 500 g/L, K2HPO4 1 내지 10 g/L, KH2PO4 1 내지 10 g/L, MgSO4 1 내지 10 g/L 및 MgCl2 0.01 내지 3 g/L를 포함하는 배지에 상기 전배양물 1 내지 300g/L를 첨가하는 단계를 포함할 수 있다.
일구현예에 따르면, 상기 종균배양물을 제조하는 단계는 15 내지 35℃의 호기 조건에서 배양하는 단계를 포함하고, 600nm 파장에서 분광광도계의 흡광도가 0.5인 시점에 배양 종료할 수 있다.
일구현예에 따르면, 상기 전배양물을 제조하는 단계는 15 내지 35℃의 호기 조건에서 배양하는 단계를 포함하고, 600nm 파장에서 분광광도계의 흡광도가 1인 시점에 배양 종료할 수 있다.
일구현예에 따르면, 상기 발효물을 제조하는 단계는 15 내지 35℃에서 일 1 내지 10일 동안 배양하는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 구현예에 따르면, 상기한 바와 같은 방법으로 제조된 발효나노유화제 조성물을 제공한다.
일구현예에 따르면, 상기 발효나노유화제의 평균입경은 100 내지 200nm일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예에 따르면, 상기한 바와 같은 발효나노유화제 조성물을 포함하는 화장료 조성물을 제공한다.
기타 본 발명에 따른 구현예들의 구체적인 사항은 이하의 상세한 설명에 포함되어 있다.
본 발명에 따른 피부 상재균을 이용한 발효나노유화제 조성물은 합성 원료의 함량을 최소화함으로써 피부에 친화적인 조성물을 제공할 수 있다. 또한, nm 크기의 나노에멀젼을 형성함으로써 유화력을 향상시킬 수 있고, 조성물의 안정성을 향상시켜 다양한 제형으로 응용할 수 있으며, 피부 자극을 최소화할 수 있으므로, 피부 저자극의 기능을 가지는 다양한 제형에 용이하게 적용할 수 있다.
도 1은 본 발명에 따른 발효물을 육안으로 관찰한 사진이다.
도 2는 정제 후, 수득한 발효나노유화제를 육안으로 관찰한 사진이다.
도 3은 최적 발효조건에서 생장곡선, 배양액의 혼탁도 및 pH 변화를 측정한 그래프이다.
도 4는 입도 분석 결과를 나타내는 그래프이다.
도 5는 발효나노유화제의 나노에멀젼을 투과전자현미경으로 관찰한 사진이다.
도 6은 TLC 분석 결과를 나타내는 크로마토그램이다.
도 7은 발효시간별 유화층 형성을 육안으로 관찰한 사진이다.
본 발명은 다양한 변환을 가할 수 있고 여러 가지 실시예를 가질 수 있는 바, 특정 실시예를 예시하고 상세하게 설명하고자 한다. 그러나, 이는 본 발명을 특정한 실시 형태에 대하여 한정하려는 것이 아니며, 본 발명의 사상 및 기술 범위에 포함되는 모든 변환, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 본 발명을 설명함에 있어서 관련된 공지 기술에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 흐릴 수 있다고 판단되는 경우 그 상세한 설명을 생략한다.
이하, 본 발명에 따른 발효나노유화제 조성물 및 그 제조방법에 대하여 상세히 설명한다.
본 발명은, 피부에 서식하고 있는 다양한 미생물들 중, 피부에 유익한 영향을 주면서 공생하고 있는 피부상재균을 이용하여 유화력을 향상시킨 나노유화제 조성물을 제공한다.
구체적으로 본 발명은,
피부상재균으로 기탁번호 KCCM 11843P(한국미생물보존센터(국외), 2016.06.08.)의 미생물을 종균배양하여 종균배양물을 제조하는 단계;
상기 종균배양물을 전배양하여 전배양물을 제조하는 단계; 및
상기 전배양물을 발효하여 발효물을 제조하는 단계를 포함하는, 발효나노유화제 조성물의 제조방법을 제공한다.
본 발명에 사용되는 피부상재균은 기탁번호 KCCM 11843P(한국미생물보존센터(국외), 2016.06.08.)의 미생물로, 스포리치아과(Sporichthyaceae)에 속하는 에피더미디박테리움 케라티니(Epidermidibacterium keratini sp.)에 포함된다.
일구현예에 따르면, 상기 종균배양물을 제조하는 단계에서 사용하는 배지는 R2A(BD Difco, USA) 배지를 사용할 수 있다.
또한, 상기 전배양물을 제조하는 단계에서 사용하는 배지는 이스트 추출물, 글리세롤, 카제인 펩톤, 식물성오일, K2HPO4, KH2PO4, MgSO4 및 MgCl2를 포함할 수 있다.
또한, 상기 발효물을 제조하는 단계에서 사용하는 배지는 이스트 추출물, 글리세롤, 카제인 펩톤, 식물성오일, K2HPO4 KH2PO4, MgSO4 및 MgCl2를 포함할 수 있다.
구체적인 구현예에 따르면, 상기 종균배양물을 제조하는 단계에서 사용하는 배지는 카제인 가수분해물(casein acid hydrolysate) 0.1 내지 5 g/L, 예를 들면 0.1 내지 1 g/L, 이스트 추출물 0.1 내지 10 g/L, 예를 들면 0.1 내지 5, 예를 들면 0.1 내지 1 g/L, 글루코스 0.1 내지 10 g/L, 예를 들면 0.1 내지 1 g/L, 가용성 전분 0.1 내지 5 g/L, 예를 들면 0.1 내지 1 g/L, K2HPO4 0.1 내지 5 g/L, 예를 들면 0.1 내지 1 g/L, 피루브산나트륨 0.05 내지 5 g/L, 예를 들면 0.1 내지 1 g/L, 카제인 펩톤 0.1 내지 5 g/L, 예를 들면 0.1 내지 1 g/L, MgCl2 0.01 내지 1 g/L, 예를 들면 0.01 내지 0.1 g/L를 포함할 수 있다.
또한, 상기 전배양물을 제조하는 단계는 이스트 추출물 1 내지 100 g/L, 예를 들면 1 내지 50 g/L, 글리세롤 0.1 내지 10 g/L, 예를 들면 0.5 내지 5 g/L, 카제인 펩톤 1 내지 100g/L, 예를 들면 1 내지 50g/L, 예를 들면 1 내지 30 g/L, 예를 들면 5 내지 20 g/L, 식물성오일 10 내지 500 g/L, 예를 들면 10 내지 300 g/L, 예를 들면 10 내지 200 g/L, K2HPO4 1 내지 10 g/L, 예를 들면 3 내지 8 g/L, 예를 들면 5 내지 8 g/L, KH2PO4 1 내지 10 g/L, 예를 들면 1 내지 5 g/L, MgSO4 1 내지 10 g/L, 예를 들면 1 내지 5 g/L, 예를 들면 1 내지 3 g/L 및 MgCl2 0.01 내지 3 g/L, 예를 들면 0.1 내지 1 g/L를 포함하는 배지에 상기 종균배양물 0.1 내지 50g/L, 예를 들면 1 내지 30 g/L, 예를 들면 5 내지 20 g/L을 첨가하는 단계를 포함할 수 있다.
또한, 상기 발효물을 제조하는 단계는 이스트 추출물 1 내지 100 g/L, 예를 들면 1 내지 50 g/L, 글리세롤 0.1 내지 10 g/L, 예를 들면 0.5 내지 5 g/L, 카제인 펩톤 1 내지 100g/L, 예를 들면 1 내지 50g/L, 1 내지 30 g/L, 예를 들면 5 내지 20 g/L, 식물성오일 10 내지 500 g/L, 예를 들면 10 내지 300 g/L, 예를 들면 10 내지 200 g/L, K2HPO4 1 내지 10 g/L, 예를 들면 3 내지 8 g/L, 예를 들면 5 내지 8 g/L, KH2PO4 1 내지 10 g/L, 예를 들면 1 내지 5 g/L, MgSO4 1 내지 10 g/L, 예를 들면 1 내지 5 g/L, 예를 들면 1 내지 3 g/L 및 MgCl2 0.01 내지 3 g/L, 예를 들면 0.1 내지 1 g/L를 포함하는 배지에 상기 전배양물 1 내지 300 g/L, 예를 들면 50 내지 200 g/L를 첨가하는 단계를 포함할 수 있다.
일구현예에 따르면, 상기 식물성오일은 해바라기씨, 포도씨, 카놀라, 쌀눈, 올리브, 대두, 아르간, 현미, 들깨, 참깨, 아몬드, 땅콩, 옥수수, 홍삼, 아보카도, 마카다미아, 코코넛, 로즈힙, 비타민나무씨, 시어나무열매, 기름야자, 베르가모트열매, 동백씨, 홍화씨, 살구씨, 양귀비씨, 달맞이꽃씨, 피마자씨, 녹차씨, 메도우폼씨, 아마씨 및 햄프씨 등의 식용 가능 또는 인체 친화적인 오일 중 하나 이상을 포함할 수 있으나, 상기한 종류에 특별히 한정되지는 않는다.
일구현예에 따르면, 상기 종균배양물을 제조하는 단계는 15 내지 35℃, 예를 들면 20 내지 30℃의 호기 조건에서 배양하는 단계를 포함하고, 종균배양은 600nm 파장에서 분광광도계의 흡광도가 0.5인 시점에 종료할 수 있다.
일구현예에 따르면, 상기 전배양물을 제조하는 단계는 15 내지 35℃, 예를 들면 20 내지 30℃의 호기 조건에서 배양하는 단계를 포함하고, 전배양은 600nm 파장에서 분광광도계의 흡광도가 1인 시점에 배양 종료할 수 있다.
일구현예에 따르면, 상기 발효물을 제조하는 단계는 15 내지 35℃, 예를 들면 20 내지 30℃에서 24시간 내지 240시간, 예를 들면 72시간 내지 240시간, 예를 들면 120시간 내지 240시간 동안 배양하는 단계를 포함할 수 있다.
상기 "발효물"은 균주를 배양하여 수득된 배양액 자체, 그의 농축물, 또는 동결건조물일 수 있다. 상기 발효물은 발효나노유화제를 포함한다.
일구현예에 따르면, 본 발명에 따른 발효나노유화제의 평균입경은 100 내지 200nm, 예를 들면 150 내지 200nm, 예를 들면 160 내지 190nm일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예에 따르면, 상기한 바와 같은 발효나노유화제 조성물을 포함하는 화장료 조성물을 제공한다.
화장료 조성물은 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료, 향료, 보조제, 담체 등 화장료 조성물에 통상적으로 이용하는 성분들을 포함할 수 있다.
일구현예에 따르면, 본 발명의 화장료 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되며, 피부학적으로 적용이 가능한 어떠한 제형으로도 제조될 수 있다.
피부학적으로 적용이 가능하다는 것은 적용 대상에게 비교적 비독성이고 무해한 유효작용을 할 수 있는 조성물로서, 피부에 적용할 수 있는 외용제를 포함할 수 있으며, 상기 조성물로부터 기인하는 부작용이 유효 성분의 효능을 저하시키기 않고, 적용 대상에 심각한 자극을 유발하지 않으면서 유효성분들의 활성 및 물성을 손상시키지 않는다는 것을 의미할 수 있다. 본 발명의 피부학적으로 적용이 가능한 화장료 조성물로는 예를 들어, 용액, 현탁액, 유액, 유탁액, 페이스트, 겔, 팩, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클렌징, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션, 스프레이 및 모발 화장료 등으로 제형화될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
구체적으로, 상기 화장료 조성물은 스킨로션, 스킨소프너, 스킨토너, 아스트린젠트, 로션, 겔, 밀크로션, 모이스쳐 로션, 영양로션, 맛사지크림, 영양크림, 모이스처크림, 핸드크림, 파운데이션, 에센스, 엠플, 영양에센스, 팩, 비누, 헤어샴푸, 풋샴푸, 클렌징폼, 클렌징로션, 클렌징크림, 바디로션 및 바디클린저의 제형 등으로 제조될 수 있다.
이하, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 본 발명의 실시예에 대하여 상세히 설명한다. 그러나 본 발명은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 실시예에 한정되지 않는다.
실시예: 발효나노유화제 제조
종균배양
피부상재균으로 기탁번호 KCCM 11843P(한국미생물보존센터(국외), 2016.06.08)의 미생물을 종균배양하였다. R2A(BD Difco, USA)배지에 접종하여 25℃의 호기적인 조건에서 정치배양을 진행하여 종균배양물을 제조하였다. 구체적으로, 배지 조성은 카제인 가수분해물(Casein acid hydrolysate) 0.5 g/L, 이스트 추출물(yeast extract) 0.5 g/L, 글루코스(glucose) 0.5 g/L, 가용성 전분(soluble starch) 0.5 g/L, K2HPO4 0.3 g/L, 피루브산나트륨(sodium pyruvate) 0.3 g/L, 카제인펩톤(casein peptone) 0.5 g/L 및 MgCl2 0.05 g/L이다.
종균배양은 분광광도계로 600nm 파장에서 0.5 흡광도를 보이는 시점에서 종료하였다.
전배양
표 1 및 2와 같은 조성의 배지에 종균배양물 10 g/L을 투입하고, 25℃ 호기적인 조건으로 배양을 진행하여 전배양물을 제조하였다. 전배양은 분광광도계로 600nm 파장에서 흡광도 1.0인 시점에서 종료하였다.
발효
표 1 및 2와 같은 조성의 배지의 온도가 25℃일 때, 전배양물 100 g/L를 투입하고, 180시간 동안 발효를 진행하여 발효물(배양액)을 제조하였다. 실시예 19의 배지에 따른 배지를 사용하여 발효가 완료된 상태를 도 1에 나타내었으며, 발효 전과 비교하였다.
분리 및 정제
상기의 발효물을 고속연속원심분리하여 미생물 균체를 제거하였으며, 균체를 제거한 발효물을 오일상과 수상으로 분리하였다. 이 수상을 0.45 um, 0.2 um 폴리에테르설폰(Polyethersulfone, PES) 멤브레인 필터에 순차적으로 제균여과하여 발효나노유화제를 수득하였다.
실시예 19에 따른 발효나노유화제를 도 2에 나타내었다.
구분
(g/L)		 실시예1 실시예2 실시예3 실시예4 실시예5 실시예6 실시예7 실시예8 실시예9 실시예10 실시예11 실시예12 실시예13 실시예14
Glycerol 1 5 1 1 1 1 1 5 1 1 5 1 5 1
Yeast extract 1 1 1 10 50 1 10 10 50 1 1 10 10 50
Casein peptone 1 1 10 10 10 20 20 20 20 50 50 50 50 50
쌀눈오일 10 10 10 50 100 10 50 50 100 10 10 50 50 100
K2HPO4 7 7 7 7 7 7 7 7 7 7 7 7 7 7
KH2PO4 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3
MgSO4 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2
MgCl2 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5
정제수 974.5 970.5 965.5 916.5 826.5 955.5 906.5 902.5 816.5 925.5 921.5 876.5 872.5 786.5
구분
(g/L)		 실시예15 실시예16 실시예17 실시예18 실시예19 실시예20 실시예21 실시예22 실시예23 실시예24 실시예25 실시예26 실시예27 실시예28 실시예29
Glycerol 1 1 1 1 1 1 1 1 5 1 1 1 1 1 5
Yeast extract 1 10 50 1 10 25 50 1 1 50 1 50 1 50 50
Casein peptone 100 100 100 10 10 10 10 20 20 20 50 50 100 100 100
쌀눈오일 10 50 100 50 100 100 100 50 10 100 50 100 50 100 100
K2HPO4 7 7 7 7 7 7 7 7 7 7 7 7 7 7 7
KH2PO4 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3
MgSO4 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2
MgCl2 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5
정제수 875.5 826.5 736.5 925.5 866.5 851.5 826.5 915.5 951.5 816.5 885.5 786.5 835.5 736.5 732.5
실험예 1: 조성물에 따른 최적 발효 조건 평가
선행실험으로 KCCM 11843P의 균주를 배양할 때, 식물성 오일을 첨가한 결과, 오일을 첨가하지 않은 군보다 첨가한 군의 배양액 혼탁도가 더 높게 나타났다. 단, 배양액의 혼탁도는 균을 제거한 수층을 대상으로 측정하였다. 따라서, 해당 선행실험을 통하여 KCCM 11843P의 균주가 식물성 오일을 기질로 대사하며, 또한 유화 성분을 생성할 것이라고 판단하였다. 이를 토대로 배지의 탄소원, 질소원의 함량을 조절함으로써 유화 성분을 최대로 생성할 수 있는 최적발효조건을 찾고자 하였다.
실시예 1 내지 29에 대하여, 배양액의 혼탁도와 미생물 균체량을 측정함으로써 최적발효조건을 평가하였다. 종균배양은 상기한 방법으로 실시하였으며, 각 실시예에 나타낸 조성물로 전배양을 실시하였고, 동일한 조성물로 25℃에서 200rpm으로 140시간 발효 후 평가하였다.
배양액의 혼탁도 측정법은 다음과 같다. 배양액을 3,088 g, 15분 원심분리하여 미생물 균체를 제거하였으며, 균체를 제거한 배양액을 오일층과 수층으로 분리하였다. 이 수층을 0.45 um, 0.2 um 폴리에테르설폰(polyethersulfone, PES) 멤브레인 필터에 순차적으로 제균 여과하였다. 상기 방법으로 균체를 제거한 배양액에 0.2 um 이하의 사이즈를 가진 나노에멀젼이 분산되어 있는 것이 관찰되었다. 유화 성분의 함량이 높을수록 형성된 나노에멀젼의 밀도가 높고, 이것을 혼탁도로 비교할 수 있을 것으로 판단하였다. 그래서 발효 후 균체를 제거한 수층을 정제수로 10배 희석 후 0.2 um 멤브레인 필터로 여과하여 600nm 파장에서 흡광도를 측정하였으며, 결과를 표 3에 나타내었다. 측정기기로는 분광광도계(BIO Teck, Korea)를 이용하였다.
이와 더불어, 배양액의 균체량을 측정하였다. 각 실시예 별로 배양액을 취하여 13,000g, 30분 동안 원심분리한 후, 상등액은 버리고 미생물 균체만을 수득하였다. 이를 0.85% NaCl에 1회 세척한 후, 배양액과 동일한 부피의 0.85% NaCl에 현탁하였으며, 이를 정제수로 10배 희석하여 600nm 파장에서 흡광도를 측정하였으며, 결과는 표 3에 나타내었다. 측정기기는 분광광도계(BIO Teck, Korea)를 이용하였다.
구분 O.D 600nm
배양액 혼탁도 균체량
실시예 1 0.623 0.203
실시예 2 0.415 0.499
실시예 3 0.644 0.156
실시예 4 0.691 0.198
실시예 5 0.112 0.885
실시예 6 0.421 0.123
실시예 7 0.495 0.452
실시예 8 0.306 0.594
실시예 9 0.131 0.799
실시예 10 0.173 0.303
실시예 11 0.200 0.464
실시예 12 0.403 0.379
실시예 13 0.397 0.577
실시예 14 0.162 0.851
실시예 15 0.241 0.569
실시예 16 0.192 0.675
실시예 17 0.098 0.735
실시예 18 0.611 0.205
실시예 19 0.802 0.248
실시예 20 0.590 0.674
실시예 21 0.127 0.819
실시예 22 0.654 0.318
실시예 23 0.206 0.502
실시예 24 0.251 0.603
실시예 25 0.653 0.109
실시예 26 0.160 0.574
실시예 27 0.100 0.451
실시예 28 0.143 0.500
실시예 29 0.080 0.901
실험 결과, 실시예 19의 균체량은 각 실시예의 평균보다 낮은 수준으로 측정된 반면, 균체를 제거한 배양액의 혼탁도가 가장 높게 측정되었다. 이는 배양 배지에 첨가된 오일이 미생물에 의해 유화된 정도가 최적인 것으로 판단할 수 있으며, 가장 많은 유화성분이 포함된 것이다. 따라서, 실시예 19를 최적 발효 조건으로 선정하였다.
실험예 2: 피부상재균주 별 유화 성분의 생성 평가
균의 종류에 따른 유화 성분의 생성 정도를 비교 평가하기 위하여, 대표적인 피부상재균인 Acinetobacter calcoaceticus, Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus aureus, Cutibacterium acnes, 그리고 KCCM 11843P와 근연종인 Sporichthya spp.를 배양하여 KCCM 11843P의 균주와 비교하였다. 평가는 실험예 1과 동일한 방법으로 수행되었으며, 실시예 19와 동일한 조성물에 발효를 진행하였다. 그 결과는 표 4에서 나타내었다.
구분 접종균 배양액 혼탁도 균체량
실시예 19 KCCM 11843P 0.802 0.248
비교예 1 A. calcoaceticus 0.427 0.184
비교예 2 S. epidermidis 0.200 0.093
비교예 3 S. aureus 0.014 0.047
비교예 4 C. acnes 0.343 0.200
비교예 5 Sporichthya spp. 0.230 0.122
실험 결과, KCCM 11843P균주가 가장 많은 유화 성분을 생성시키는 것을 확인할 수 있었다.
또한, 배양액에서 비교예 2 및 비교예 4가 가장 역한 냄새가 나므로, 배양액 자체로 화장료 조성물에 적용하기 어려운 상태로 판단되었다.
반면, 실시예 19의 배양액은 무취에 가까워 화장료 조성물로 사용하기 용이한 것으로 판단하였다.
실험예 3: 실시예 19의 최적 발효시간 확인
실험예 1을 통하여 실시예 19가 최적의 전배양 배지 및 발효 배지 조건임을 확인하였으며, 배양 기간 동안 pH, 균체량, 배양액의 탁도를 측정함으로써, 미생물의 2차 대사산물이 생성하는 시점 및 발효 종료시점을 판단하기 위한 실험을 진행하였다.
pH 변화는 미생물이 발효하는 과정에서 대사산물의 생성 및 정도를 확인할 수 있다. 구체적으로, 시간별로 샘플링한 배양액을 3,088 g, 5분 원심분리한 후, 균체와 오일층을 제외한 수층을 취하여 pH meter(Mettler toledo, FP20)로 측정하였다.
시간별로 평가한 결과, pH는 총 2단계를 거쳐 초기 pH6.6에서 pH8.3까지 상승하는 경향을 보였으며, 이후 유지되는 경향을 나타내었다. 이를 도 3에 나타내었다.
미생물의 2차 대사산물 생성에 따른 pH 변화가 상승하는 경향이 있으며, 미생물 생장기 중에 대수기를 지나 정체기에서 대사산물이 생성됨을 알 수 있었다. 도 3에 따르면, 발효 80시간 전후로 pH가 다시 상승하기 시작하면서 혼탁도 또한 급격히 증가한다. 이 시기는 미생물 생장기 중 대수기 후반에서 정체기에 해당하므로 미생물의 2차 대사가 발생함을 알 수 있다.
따라서, 미생물의 2차 대사산물에 의해 배양액의 탁도가 증가하였으며, 이것이 유화제 성분의 일종임을 예상할 수 있다.
미생물의 2차 대사가 발생한 이후에 균체를 제거한 배양액의 혼탁도가 더이상 증가하지 않는 시점을 유화 성분이 최대로 생성된 시점으로 생각하였으며, 이를 발효 종료시점으로 판단하였다. 도 3에 따르면, 발효 180시간 이후 균체를 제거한 배양액의 혼탁도가 증가하지 않고 유지되는 경향을 보였다. 따라서, 180시간 전후를 발효 종료시점으로 판단하였다.
실험예 4: 입도 분석
입도측정은 실시예 19에 따른 발효나노유화제를 정제수로 10배 희석한 후, 샘플을 분석을 하였다. 측정기기는 입도분석기(HORIBA Scientific, Japan)를 이용하였다. 그 결과는 도 4에 나타내었으며, 평균입경은 약 181.7nm로 측정되었다.
실험예 5: 나노에멀젼 관찰
실시예 19에 따른 배양액을 분리 정제하여 얻은 발효나노유화제 내에 형성된 나노에멀젼을 투과전자현미경(JEM-F200, JEOL)으로 관찰하였다.
시료를 carbon으로 코팅된 Cu grid 위에 한 방울 떨어뜨려 상온에서 6시간 동안 건조하여 전처리하고 현미경으로 관찰하였다.
현미경 사진은 도 5에 나타내었다. 둥근 형태의 나노에멀젼(마이셀, micelle)이 형성된 것을 확인할 수 있다.
실험예 6: TLC 분석
배양 조건에 따른 유화 성분의 생성 여부 및 양적 비교를 위해 실시예 19에 대하여 TLC(Thin Layer Chromatography)로 분석하였다.
수득한 발효액에 1N HCl을 첨가하여 pH를 2 내지 3으로 조정하였다. 클로로포름(chloroform)과 메탄올(methanol)을 2:1(v/v) 비율로 혼합한 유기용제를 상기의 발효액과 2:1(v/v) 비율로 투입하여 25℃에서 2시간 교반한 후, 오버나잇(overnight) 정치함으로써, 유화성분을 하층액(클로로포름)으로 전이시켜 정제하였다. 수득한 클로로포름은 감압농축하여 휘발시키고, 남은 유화성분을 클로로포름(chloroform)에 용해시킴으로써 수득하였다.
실리카겔 TLC플레이트 (TLC Silica gel 60, Merck; 5 cm x 6.5 cm)에 상기의 정제물(유화성분)을 점적하고 클로로폼(chloroform), 메탄올(methanol), 아세트산(acetic acid) (6.5:2:0.2 v/v)를 포함한 이동상으로 종료기점까지 전개하였다. 자연 건조된 플레이트에 에탄올과 혼합된 10% 황산을 분무하고 건조 후, 100℃에서 5분간 가열하여 스팟(spot)을 가시화한 결과, 극성지질 스팟을 관찰할 수 있었으며, 도 6에 나타내었다.
비교군으로는 쌀눈오일을 클로로포름에 20% 용해한 것을 사용하였다. 비교예 4의 정제물과 비교했을 때, 실시예 19의 정제물에서 더 다양하고 많은 양의 극성지질이 관찰되었다.
실험예 7: 발효기간별 유화층 형성 정도
실시예 19의 발효를 진행함에 따라 실제 유화층이 형성되는 시기를 확인하고자 하였다. 발효기간별로 배양액을 10ml 취하여 3,088g, 5분 원심분리 후 관찰하였다.
실험 결과, 발효 84시간 전후로 오일층과 수층 사이에 유화층이 형성되었음을 확인하였으며, 이를 도 7에 나타내었다.
도 3과 비교하였을 때, 2차대사가 발생하기 시작하는 시기와 매우 유사한 시기에 유화층이 형성된다. 이를 통해, 2차 대사산물로서 유화성분이 형성됨을 알 수 있다.
실험예 8: 피부자극 평가
본 발명에 따른 실시예 19를 분리 정제한 발효나노유화제에 대하여 피부 자극 여부를 평가하고자 피부 일차 자극평가를 실시하였다. 평가 기관은 (주)코어덤으로 의뢰하여 진행하였다. 피험자 32명을 선정하여 등 부위에 24시간 첩포한 후 첩포 제거 30분, 24시간, 48시간에 각각 일차 피부자극 유무를 피부과 전문의가 판정하였다. 피부 반응 판정은 국제접촉피부염학회(ICDRG)기준 및 미국화장품협회(PCPC)의 기준에 의거하였으며, 그 결과는 표 5에 나타내었다.
Figure PCTKR2021006398-appb-img-000001
실시예 30: 에센스 제형 제조
하기 표의 조성에 따라 실시예 19를 분리 정제한 발효나노유화제를 포함하는 에센스 제형을 제조하였다. 구체적으로, 하기 표의 1번 원료에 2 내지 7번 원료를 순차적으로 투입하고, 교반하여 용해시켰다. 이후 1 내지 7번 원료 반응 용기에 8 내지 9번 원료를 순차적으로 투입하여 균일하게 용해 및 혼합하여 에센스 제형을 완성하였다.
구분 원료 중량 (%)
1 실시예19 74.22
2 카보머 0.1
3 다이프로필렌글라이콜 8.0
4 글리세린 5.0
5 부틸렌글라이콜 10.0
6 1,2 헥산다이올 1.5
7 잔탄검 0.08
8 트로메타민 0.1
9 하이알루로닉애씨드(1%) 1.0
합계 100
실시예 31: 스킨 제형 제조
하기 표의 조성에 따라 실시예 19를 분리 정제한 발효나노유화제를 포함하는 스킨 제형을 제조하였다. 구체적으로, 하기 표의 1번 원료에 2 내지 7번 원료를 순차적으로 투입하여 균일하게 용해 및 혼합하여 스킨 제형을 완성하였다.
구분 원료 중량 (%)
1 실시예19 85.92
2 글리세린 3.0
3 부틸렌글라이콜 7.0
4 1,2 헥산다이올 1.5
5 잔탄검 0.08
6 글리세레스-26 2.0
7 하이알루로닉애씨드(1%) 0.5
합계 100
실험예 9: 안정도 평가
보관 온도 조건에 따른 안정성을 평가하기 위하여, 실시예 30에 따른 에센스 및 실시예 31에 따른 스킨 제형 조성물의 조건 별 안정성을 확인하였다. 각각의 조성물을 일반조건은 상온, 25℃조건에서 3개월 동안, 가혹조건은 저온(-5℃), 고온(50℃), 순환(-5 내지 40℃/12 hr) 조건에서 1개월 동안 보관하여 pH 및 분리도 성상을 관찰하였다. 일반조건에서는 3개월 후 제형의 변화 유무를 관찰하였고, 가혹조건에서는 1개월 후 제형의 변화유무를 관찰하였다. 그 결과를 표 8 및 9에 나타내었다.
일반조건 에센스제형 스킨제형
상온 pH 변화없음 변화없음
분리도 변화없음 변화없음
25℃ pH 변화없음 변화없음
분리도 변화없음 변화없음
가혹조건
-5℃ pH
분리도
50℃ pH
분리도
순환
(-5 ~40℃hr		 pH
분리도
상기 결과로부터 실시예 30 및 31은 보관 조건에 따른 pH, 성상 분리도의 변화가 없음을 확인하였다. 이는 실시예 20의 발효나노유화제를 투입함으로써 합성 계면활성제 및 고압기기를 이용하지 않아도 조성물 상에서 에멀젼을 형성하여, 안정적인 제형으로 간편하게 화장품 제형을 제조할 수 있음을 보여주는 결과이다. 이를 통해, 합성 화학 화장품 성분을 최소화하여 피부에 더욱 안전한 제형을 제조할 수 있다.
상기한 바와 같이, 본 발명에서는 피부 상재균이 오일을 활용하여 발효나노유화제를 형성할 수 있음을 확인하였으며, 본 발명에 따른 발효나노유화제는 나노미터(nm)크기의 나노에멀젼을 형성함으로써 화학적 계면활성제를 사용하지 않아도 유화력을 향상시킬 수 있고, 조성물의 안정성을 향상시켜 다양한 제형으로 응용할 수 있으며, 피부 자극 최소화할 수 있음을 확인하였다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술한 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 상기 기재된 특정한 실시예에 본 발명의 범위가 제한되는 것은 아니다.
[미생물기탁증]
Figure PCTKR2021006398-appb-img-000002

Claims (13)

  1. 피부상재균으로 기탁번호 KCCM 11843P(한국미생물보존센터(국외), 2016.06.08)의 미생물을 종균배양하여 종균배양물을 제조하는 단계;
    상기 종균배양물을 전배양하여 전배양물을 제조하는 단계; 및
    상기 전배양물을 발효하여 발효물을 제조하는 단계를 포함하는, 발효나노유화제 조성물의 제조방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 종균배양물을 제조하는 단계에서 사용하는 배지가 R2A(BD Difco, USA) 배지를 포함하는 것인, 발효나노유화제 조성물의 제조방법.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 전배양물을 제조하는 단계에서 사용하는 배지는 이스트 추출물, 글리세롤, 카제인 펩톤, 식물성오일, K2HPO4 KH2PO4, MgSO4 및 MgCl2를 포함하는 것인, 발효나노유화제 조성물의 제조방법.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 발효물을 제조하는 단계에서 사용하는 배지는 이스트 추출물, 글리세롤, 카제인 펩톤, 식물성오일, K2HPO4, KH2PO4, MgSO4 및 MgCl2를 포함하는 것인, 발효나노유화제 조성물의 제조방법.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 종균배양물을 제조하는 단계에서 사용하는 배지가 카제인 가수분해물 0.1 내지 5 g/L, 이스트 추출물 0.1 내지 10 g/L, 글루코스 0.1 내지 10 g/L, 가용성 전분 0.1 내지 5 g/L, K2HPO4 0.1 내지 5 g/L, 피루브산나트륨 0.05 내지 5 g/L, 카제인 펩톤 0.1 내지 5 g/L, MgCl2 0.01 내지 1 g/L를 포함하는 것인, 발효나노유화제 조성물의 제조방법.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 전배양물을 제조하는 단계가 이스트 추출물 1 내지 100 g/L, 글리세롤 0.1 내지 10 g/L, 카제인 펩톤 1 내지 100 g/L, 식물성오일 10 내지 500 g/L, K2HPO4 1 내지 10 g/L, KH2PO4 1 내지 10 g/L, MgSO4 1 내지 10 g/L 및 MgCl2 0.01 내지 3 g/L를 포함하는 배지에 상기 종균배양물 0.1 내지 50g/L을 첨가하는 단계를 포함하는 것인, 발효나노유화제 조성물의 제조방법.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 발효물을 제조하는 단계가 이스트 추출물 1 내지 100 g/L, 글리세롤 0.1 내지 10 g/L, 카제인 펩톤 1 내지 100 g/L, 식물성오일 10 내지 500 g/L, K2HPO4 1 내지 10 g/L, KH2PO4 1 내지 10 g/L, MgSO4 1 내지 10 g/L 및 MgCl2 0.01 내지 3 g/L를 포함하는 배지에 상기 전배양물 1 내지 300g/L를 첨가하는 단계를 포함하는 것인, 발효나노유화제 조성물의 제조방법.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 종균배양물을 제조하는 단계가 15 내지 35℃의 호기 조건에서 배양하는 단계를 포함하고,
    600nm 파장에서 분광광도계의 흡광도가 0.5인 시점에 배양 종료하는 것인, 발효나노유화제 조성물의 제조방법.
  9. 제1항에 있어서,
    상기 전배양물을 제조하는 단계가 15 내지 35℃의 호기 조건에서 배양하는 단계를 포함하고,
    600nm 파장에서 분광광도계의 흡광도가 1인 시점에 배양 종료하는 것인, 발효나노유화제 조성물의 제조방법.
  10. 제1항에 있어서,
    상기 발효물을 제조하는 단계가 15 내지 35℃에서 1 내지 10일 동안 배양하는 단계를 포함하는 것인, 발효나노유화제 조성물의 제조방법.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 방법으로 제조된 발효나노유화제 조성물.
  12. 제11항에 있어서,
    상기 발효나노유화제의 평균입경이 100 내지 200nm인 것인, 발효나노유화제 조성물.
  13. 제11항에 따른 발효나노유화제 조성물을 포함하는 화장료 조성물.
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