KR20180001460A

KR20180001460A - 스포리치아과 미생물의 용도

Info

Publication number: KR20180001460A
Application number: KR1020170076820A
Authority: KR
Inventors: 이동걸; 박진주; 강승현; 김연준
Original assignee: 코스맥스 주식회사
Priority date: 2016-06-27
Filing date: 2017-06-16
Publication date: 2018-01-04
Also published as: KR101910791B1; EP3476932A4; KR101910790B1; EP3476932A2; KR20180001459A

Abstract

스포리치아과(Sporichthyaceae)에 속하는 에피더미디박테리움 속(Epidermidibacterium gen.) 균주 또는 그의 배양액을 포함하는 피부 상태 또는 염증성 질환의 예방, 개선, 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.

Description

스포리치아과 미생물의 용도 {Uses of microorganism a member of family Sporichthyaceae}

스포리치아과 미생물 및 그의 용도에 관한 것이다.

피부의 생태계는 미생물에게 다양한 형태의 서식처를 제공하며, 광범위한 미생물들이 살고 있다. 숙주인 인간은 이들과 공생관계를 이루고 있으며, 숙주에 많은 긍정적인 영향을 미친다고 알려져 있다. 피부는 함입부, 특화되어있는 틈새 등 다양한 형태의 서식처를 구성하고 있으며, 넓은 분포의 미생물이 자랄 수 있도록 돕는다. 기본적으로 피부는 물리적인 막을 형성하며, 외부로부터 잠재적인 위험요소 및 독성물질들로부터 방어를 하도록 도와준다. 피부는 외부환경과의 접속지점이 되며, 다양한 미생물들(진균, 세균, 바이러스 및 작은 유충)의 집합소이기도 하다. 물리적, 화학적 기능의 선택에 맞게 미생물들은 특화된 틈새에 적응하여 서식처를 마련한다. 일반적으로 피부는 차갑고, 산성 성질을 나타내며, 건조된 상태로 유지된다. 구조적으로 표피(epidermis)는 피부장벽을 이루고 있으며, 미생물과 독소가 침투하는 것을 차단하고, 수분을 유지하는 중요한 역할을 한다. 표피의 최상위층은 각질층(stratum corneum)으로 구성되어있다. 표피는 일명 '벽돌과 몰탈 구조'라고 불리는 형태를 띠고 있는데, 피부 조직은 계속적인 자가 회복 과정을 거치고, 분화과정의 마지막을 거친 비늘(squames)은 끊임없이 피부조직에서 탈락되는 과정을 반복하게 된다.

프로바이오틱스(Probiotics)는 인체에 유익한 작용을 하는 미생물을 총칭하는 말로 우리 몸에 유익(benefit)을 주는 미생물을 말한다. 현재까지 알려진 대부분의 프로바이오틱스는 유산균으로 알려져 있다. 프로바이오틱스는 인체에 여러 가지 유익작용을 통해 효과적인 효능이 발생되는 것으로 보고되었지만, 피부상재균과 피부의 상호관계에 대한 연구는 미비한 실정이다.

피부장벽은 죽은 각질세포와 세포간 지질로 구성되어 있고, 외부 자극으로부터 피부를 보호하며 피부에서 수분이 증발하는 것을 막아주는 피부 보호막으로서 피부건강에 핵심적인 기능을 담당한다. 즉, 체내에서 지나친 수분 방출을 막고 화학물질이나 미생물처럼 해로운 물질이 우리 몸 안으로 들어오는 것을 막아준다. 죽은 각질세포의 표면을 구성하는 각질세포 외피에는 세포간 지질의 안정성에 중요한 역할을 한다. 각질형성세포는 분화를 통해 각질화 과정을 통해 피부 장벽을 만든다. 피부장벽 기능은 노화가 진행되거나 외부 요소들에 의해 파괴될 수 있으며, 피부 장벽의 손상은 피부 수분량 감소와 주름을 일으킬 수 있다.

이에, 본 발명자들은 피부상재균의 변화에 의해 피부에서 어떤 변화를 나타내는지 관찰하고 더 나아가 피부상재균의 변화를 유도하여 잠재적인 피부환경의 개선효과를 나타낼 수 있는지 연구하던 중, 건강한 성인의 피부로부터 신규한 스포리치아과 균주를 분리 및 동정하였으며, 상기 신규한 균주 또는 이의 배양물이 피부 미생물군집의 변화를 유도함으로써 피부환경을 개선시킬 뿐만 아니라 피부 관련된 상태에 유용하게 사용될 수 있음을 확인하고, 본　발명을 완성하게 되었다.

일 양상은 스포리치아과(Sporichthyaceae)에 속하는 신규 에피더미디박테리움 속(Epidermidibacterium gen.) 균주를 제공한다.

다른 양상은 상기 균주의 배양액을 제공한다.

또 다른 양상은 에피더미디박테리움 속(Epidermidibacterium gen.) 균주 또는 그의 배양액을 포함하는 조성물을 제공한다.

에피더미디박테리움 속 균주는 아래의 균학적 성질 중 어느 하나 이상을 갖는 것일 수 있다:

(1) 막대기형(Rod-Shaped);

(2) 비운동성(non-motile);

(3) 그람 양성;

(4) 비포자 생성(non-spore forming);

(5) 옥시다아제, 및/또는 카탈라아제 활성 음성;

(6) MK-9(H4)이 검출된다;

(7) 극성 지질은 포스파티딜에탄올아민(phosphatidylethanolamine) (PE), 포스파티딜이노시톨(phosphatidylinositol) (PI), 포스파티딜글리세롤(phosphatidylglycerol) (PG), 포스파티딜콜린(phosphatidylcholine)(PC), 및 세 개의 확인되지 않은 지질 (three unidentified lipids)(UL)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상이다; 및

(8) DNA G+C 함량은 68.9 mol%이다.

상기 에피더미디박테리움 속 균주는 계통분류학적 특성은 다른 균주가 속하는 다른 속과 뚜렷한 차이를 보이고, 화학분류학적 특성도 뚜렷한 차이를 보여 신규 에피더미디박테리움 속으로 동정되었다.

상기 에피더미디박테리움 속 균주는 에피더미디박테리움 케라티니를 포함하는 것일 수 있다.

상기 에피더미디박테리움 케라티니는 아래의 균학적 성질 중 어느 하나 이상을 갖는 것일 수 있다:

(1) 세포의 길이는 0.5-0.3um이고, 직경은 0.3-0.1um이다;

(2) 콜로니 형태가 둥글고, 볼록하며, 옅은 노란색 (pale yellow)이다;.

(3) R2A(Reasoner's 2A) 아가에서 성장하나, NA(Nutrient Agar), ISP 2(Yeast Extract Malt Extract Agar) 및 TSA(trypticase soy agars)에서는 성장하지 않는다;

(4) R2A 아가에서 15℃ 내지 35℃ 에서 성장(최적 25℃ )하나, 10℃ 또는 40℃ 에서 성장하지 않는다;

(5) pH 5.0 내지 6.5에서 성장하고, 10%까지의 NaCl 농도에서 성장한다(최적은 pH 6.0, 0% NaCl);

(6) 질산염은 아질산염으로 환원된다;

(7) 카세인과 스타치는 분해되나, DNA 및 카르복시메틸셀룰오로스는 분해되지 않는다;

(8) 표 1 내지 3에 기재된 특성을 갖는다;

(9) N-아세틸-D-글루코사민, N-아세틸-β-D-만노사민, α-D-글루코스, D-만노스(mannose), D-프룩토오스(fructose), D-갈락토오스(galactose), 덱스트린(dextrin), D-푸코오스(fucose), 이노신(inosine), 락타미드(lactamide), 말토트리오스(maltotriose), D-프시코오스(psicose), D-리보오스(ribose), α-케토발레린산(ketovaleric Acid), D-프룩토오스(fructose)-6-PO₄, L-세린(serine), 펙틴(pectin), 피루브산(pyruvic acid), 아데노신(adenosine), 티미딘(thymidine), 2'-디옥시 아데노신(deoxy adenosine), 아데노신-5'-모노포스페이트, p-히드록시- 페닐아세트산(phenylacetic acid), 메틸 피루베이트(methyl pyruvate), D-락트산 메틸 에스터(lactic acid methyl ester), L-락트산(lactic acid), 시트르산(citric acid), α-케토-글루타르산, D-말산(malic Acid), L-말산, 브로모-숙신산, 트윈 40, 트윈 80, α-히드록시-부티르산(butyric acid), β-히드록시-D,L-부티르산, α-케토-부티르산, 프로피온산(propionic acid) 및 아세트산 활성으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 동화(assimilation) 양성(positive);

(10) D-말토오스, D-셀로바이오스(cellobiose), 젠티오바이오스(gentiobiose), 수크로오스, D-투나노오스(turanose), 스타키오스(stachyose), D-라피노오스(raffinose), α-D-락토오스, D-멜리비오스(melibiose), β-메틸-D-글루코시드, D-살리신(salicin), N-아세틸-D-갈락토사민, N-아세틸 뉴라미닌산(acetyl neuraminic acid), D-소비톨(sorbitol), D-만니톨(mannitol), D-아라비톨(arabitol), 미오-이노시톨(myo-inositol), 글리세롤(glycerol), D-글루코스-6-PO₄, D-아스파틴산(aspartic acid), D-세린, 젤라틴(gelatin), 글리시일(glycyl)-L-프롤린(proline), L-알라닌, L-아르지닌, L-아스파틴산(aspartic acid), L-글루타민산(glutamic acid), L-히스티딘, L-파이로글루타민산(pyroglutamic), D-갈락투로닌산(galacturonic acid), L-갈락토닌산 락톤(galactonic acid lactone), D-글루코닌산(gluconic acid), D-글루쿠로닌산(glucuronic acid), 글루쿠로나미드(glucuronamide), 뮤신산(mucic acid), 퀴닌산(quinic acid), D-사카린산(saccharic acid), γ-아미노-부티르산(butyric acid), 포름산(formic acid), a-시클로덱스트린(cyclodextrin), β-시클로덱스트린, 글리코젠(glycogen), 이눌린(inulin), 만난(mannan), N-아세틸-D-글루코사민, N-아세틸-β-D-만노사민, 아미그달린(amygdalin), L-아라비노오스(arabinose), 아르부틴(arbutin), L-푸코오스(fucose), D-갈락토오스(galactose), D-갈락투로닌산(galacturonic), D-글루코닌산(gluconic), 락투로오스(lactulose), D-멜레지토오스(melezitose), α-메틸-D-갈락토시드(galactoside), β-메틸-D-갈락토시드, 3-메틸 글루코오스, α-메틸-D-글루코시드, β-메틸-D-글루코시드, α-메틸-D-만노시드, 팔라티노오스(palatinose), L-람노오스(rhamnose), 살리신(salicin), 세도헵툴로산(sedoheptulosan), D-타가토오스(tagatose), D-트레할로오스(trehalose), 투라노오스(turanose), 자일리톨(xylitol), D-자일로오스(xylose), 아세트산, γ-히드록시부티르산(hydroxybutyric acid), p-히드록시-페닐아세트산, D-락트산 메틸 에스터, D-말산(malic acid), L-말산, 피루바틴산 메틸 에스터(pyruvatic acid methyl ester), 숙신산 모노-메틸 에스터(succinic acid mono-methyl ester), 프로피온 산(propionic acid), 숙시나민산(succinamic acid), N-아세틸-L-글루탐산(glutamic acid), L-알라닌아민(alaninamine), D-알라닌(alanine), L-알라닐-글리세린, 글리실일-L-글루탐산, L-파이로글루탐산(pyroglutamic acid), 푸트레신(putrescine), 2,3-부탄디올(butanediol), 우리딘(uridine), 티미딘-5'-모노포스페이트, 우리딘-5'-모노포스페이트, D-프룩토오스-6-포스페이트, α-D-글루코오스-1-포스페이트, D-글루코오스-6-포스페이트, 및 D-L-α-글리세롤 포스페이트로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 동화에 대한 음성;

(11) 에스터라아제(C4), 에스터라아제 리파아제(C8), 류신 아릴아미다아제(leucine arylamidase), 크리스틴 아릴아미다아제(crystine arylamidase), 산 포스파타아제(acid phosphatase) 및 나프톨-AS-BI-포스포히드로라아제(phosphohydrolase) 활성으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 활성이 존재한다;

(12) 약한(weak) 알칼린 포스파타아제(alkaline phosphatase), 발린 아릴아미다아제(valine arylamidase) 또는 α-키모트린신 활성이 존재한다;

(13) 리파아제(C14), 트린신, α-갈락토시다아제, β-글루쿠로니다아제(glucuronidase), β-글루코시다아제(glucosidase), α-글루코시다아제, N-아세틸-β-글루코사미니다아제(glucosaminidase), α-만노시다아제(mannosidase) 및 α-푸코시다아제(fucosidase) 활성으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 활성이 존재하지 않는다(absent); 및

(14) 주요 지방산은 C17:1ω8c, C16:0, iso-C15:0 또는 summed feature 3 (C_16:1 ω6c 및/또는 C_16:1 ω7c) 이다.

상기 에피더미디박테리움 속 균주 또는 에피더미디박테리움 케라티니는 다음과 같은 형태학적 특징 중 어느 하나 이상을 가질 수 있다.

(1) 막대기형(Rod-Shaped);

(2) 비운동성(non-motile);

(3) 편모 없음;

(4) 그람 양성;

(5) 비포자 생성(non-spore forming);

(6) 세포의 길이는 0.5-0.3um이고, 직경은 0.3-0.1um이다; 및

(7) 콜로니 형태가 둥글고, 볼록하며, 옅은 노란색 (pale yellow)이다.

상기 에피더미디박테리움 속 균주 또는 에피더미디박테리움 케라티니는 다음과 같은 배양 및 생리학적 특징 중 어느 하나 이상을 가질 수 있다;

(1) 호기성;

(2) 종속영양성;

(3) 옥시다아제, 및/또는 카탈라아제 활성 음성(oxidase and/or catalase-negative)

(4) 표 1의 특성;

(5) R2A(Reasoner's 2A) 아가에서 성장하나, NA(Nutrient Agar), ISP 2(Yeast Extract Malt Extract Agar) 및 TSA(trypticase soy agars)에서는 성장하지 않는다;

(6) R2A 아가에서 15℃ 내지 35℃ 에서 성장(최적 25℃ )하나, 10℃ 또는 40℃ 에서 성장하지 않는다;

(7) pH 5.0 내지 6.5에서 성장하고, 10%까지의 NaCl 농도에서 성장한다(최적은 pH 6.0, 0% NaCl)

(8) 질산염은 아질산염으로 환원된다; 및

(9) 카세인과 스타치는 분해되나, DNA 및 카르복시메틸셀룰오로스는 분해되지 않는다.

상기 에피더미디박테리움 속 균주 또는 에피더미디박테리움 케라티니는 다음과 같은 생화학적 특징 중 어느 하나 이상을 가질 수 있다:

(1) MK-9(H4)(9 유닛을 갖는 테트라히드로제네이트 메나퀴논(tetrahydrogenated menaquinone with nine units))이 검출된 유일한 이소프레노이드 퀴논이다;

(2) 주요 극성 지질은 포스파티딜에탄올아민(phosphatidylethanolamine) (PE), 포스파티딜이노시톨(phosphatidylinositol) (PI), 세 개의 확인되지않은 인지질(three unidentified phospholipids)(UPL), 포스파티딜글리세롤(phosphatidylglycerol) (PG), 포스파티딜콜린(phosphatidylcholine)(PC), 두 개의 확인되지 않은 아미노지질(two unidentified aminolipids) (AL) 및 세 개의 확인되지 않은 지질 (three unidentified lipids)(UL)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상이다;

(3) DNA G+C 함량은 68.9 mol%이다; 및

(4) 표 2의 지방산 조성.

상기 에피더미디박테리움 케라티니는 서열번호 1에 기재된 염기서열을 갖는 16s rRNA 유전자를 포함할 수 있다.

상기 에피더미디박테리움 케라티니는 기탁번호 KCCM 11843P로 기탁된 것일 수 있다.

또한, 다른 양상은 에피더미디박테리움 속 또는 에피더미디박테리움 케라티니의 배양액을 제공한다.

본 명세서에서 사용된 용어 "배양액"은 균주를 배양하여 수득된 배양액 자체, 그의 농축물, 또는 동결건조물 또는 배양액로부터 균주를 제거하여 수득된 배양 상층액, 그의 농축물 또는 동결건조물을 지칭하며, "배양 상층액", "조건 배양액" 또는 "조정 배지"와 호환적으로 사용될 수 있다.

상기 배양액은 에피더미디박테리움 속 또는 에피더미디박테리움 케라티니를 R2A 배지에서 10℃ 초과 또는 40℃ 미만 중 어느 온도에서 일정 시간, 예를 들면, 4 내지 50시간 동안 배양하여 수득된 것일 수 있다.

일 구체예에서, 균주의 배양 상층액은 균주 배양액을 원심분리나 여과시켜 균주를 제거하는 단계에 의해 수득될 수 있다.

다른 구체예에서, 농축물은 상기 균주 배양액 자체, 또는 상기 배양액을 원심분리나 필터를 이용하여 여과한 후 수득된 상층액을 농축하는 단계에 의해 수득될 수 있다.

상기 에피더미디박테리움 속을 배양하기 위한 배양용 배지 및 배양 조건은 통상의 지식을 가진 자가 적절하게 선택하거나 변형하여 이용할 수 있다.

또 다른 양상은 에피더미디박테리움 속 또는 그의 배양액의 용도를 제공한다. 상세하게는, 에피더미디박테리움 속 또는 그의 배양액을 포함하는 조성물을 제공한다.

상기 에피더미디박테리움 속 또는 그의 배양액에 대해서는 상기한 바와 같다.

일 구체예에 있어서, 상기 에피더미디박테리움 속 균주 또는 그의 배양액은 피부 세포에서 필라그린, 클루아딘, αSMase, CerS3, 트랜스글루타미나아제-1, 및 HAS의 발현을 증가시키고, 염증 관련 인자 및 가려움증 관련 인자의 발현을 감소시키는 것일 수 있다. 따라서, 상기 에피더미디박테리움 속 균주는 피부와 관련된 상태, 또는 염증과 관련된 상태에 유용하게 사용될 수 있다.

상기 피부와 관련된 상태의 예는, 피부 노화, 상처, 피부염, 아토피 피부염, 소양증, 습진성 피부질환, 건성 습진, 홍반, 두드러기, 건선, 약발진, 구진인설질환, 곤충 및 기생충 매개 질환, 표재성 피부 진균증, 세균 감염 질환, 바이러스 질환, 성인성 질환, 자가면역 수포성 질환, 결체조직 질환, 색소이상증, 색소성 건피증, 여드름 등을 포함할 수 있다.

상기 염증과 관련된 상태의 예는 피부염, 알레르기, 아토피, 결막염, 치주염, 비염, 중이염, 인후염, 편도염, 폐렴, 위궤양, 위염, 크론병, 대장염, 통풍, 강직성 척추염, 류마티스 열, 루푸스, 섬유근통(fibromyalgia), 건선관절염, 골관절염, 류마티스 관절염, 견관절주위염, 건염, 건초염, 건주위염, 근육염, 간염, 방광염, 신장염, 쇼그렌 증후군(sjogren's syndrome), 다발성 경화증 및 급성 및 만성 염증 질환을 포함할 수 있다.

상기 조성물은 조성물 총 중량에 대하여 0.001 중량% 내지 80 중량%, 예를 들면, 0.01 중량% 내지 60 중량%, 0.01 중량% 내지 40 중량%, 0.01 중량% 내지 30 중량%, 0.01 중량% 내지 20 중량%, 0.01 중량% 내지 10 중량%, 0.01 중량% 내지 5 중량%, 0.05 중량% 내지 60 중량%, 0.05 중량% 내지 40 중량%, 0.05 중량% 내지 30 중량%, 0.05 중량% 내지 20 중량%, 0.05 중량% 내지 10 중량%, 0.05 중량% 내지 5 중량%, 0.1 중량% 내지 60 중량%, 0.1 중량% 내지 40 중량%, 0.1 중량% 내지 30 중량%, 0.1 중량% 내지 20 중량%, 0.1 중량% 내지 10 중량%, 또는 0.1 중량% 내지 5 중량%의 균주 또는 이의 배양액을 포함할 수 있다.

이하에서, 조성물에 따른 에피더미디박테리움 속 균주의 용도를 상세히 설명한다.

상기 조성물은 화장료 조성물일 수 있다.

일 구체예에 있어서, 상기 화장료 조성물은 피부장벽을 강화시키고, 노화를 예방, 개선 또는 억제하며, 가려움증을 예방 또는 개선하고, 염증을 예방 또는 개선시킬 수 있다.

본 명세서에서 용어 "피부 노화"란 나이가 들어가면서 피부에 나타나게 되는 유형과 무형상의 변화를 통틀어 말하는 것으로, 예컨대 표피 두께가 얇아지는 현상, 진피의 세포 수나 혈관 수, DNA 손상복구 능력, 세포교체주기, 상처회복, 피부장벽기능, 표피의 수분 유지, 땀분비, 피지분비, 비타민D 생산, 물리적 손상방어, 화학물질 제거능력, 면역반응, 감각 기능, 체온조절의 감소를 말한다. 상기 에피더미디박테리움 속 균주 또는 이의 배양액은 외인성 요인 또는 내인성 요인에 의해 유발되는 피부 노화 개선용일 수 있다. 상기 외인성 요인은 여러 가지 외부 요인, 예컨대 자외선(광)을 말하고 내인성 요인은 연대기적 요인이라고도 지칭되며 주로 시간의 흐름에 의해 발생하는 요인을 말한다. 즉, 상기 피부 노화는 구체적으로는 자외선, 공해, 담배연기, 화학물질 등에 의한 외부 자극에 의해 유도되는 조기 노화 증상 뿐만 아니라, 나이가 들어감에 의해 피부세포의 증식이 감소함에 따라 발생하는 자연노화 현상을 포함하며 주름, 탄력 감소, 피부 쳐짐 및 건조 현상 등을 모두 포함하는 개념이다. 또한 주름은 내ㆍ외부 요인의 변화에 의한 자극이 피부조직을 구성하고 있는 성분을 변화시켜 주름을 유발하는 것을 포함한다.

따라서, 상기 조성물은 상기의 효과를 가짐으로써, 피부 개선, 예컨대 피부 보습, 피부 노화 억제, 피부장벽 강화, 피부 상처 개선, 피부 염증 억제에 유용하게 사용될 수 있다.

상기 화장료 조성물은 예를 들면, 유연화장수, 영양화장수, 마사지크림, 영양크림, 에센스, 팩, 젤, 앰플 또는 피부 점착 타입의 화장료 제형을 갖는 것일 수 있다.

상기 화장료 조성물에 포함되는 성분은 유효성분으로서 상기 조성물 이외에 화장료 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함할 수 있으며, 예를 들면, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제 및 담체를 포함할 수 있다.

또한, 상기 조성물은 피부외용제용 조성물일 수 있다.

본 명세서에서, 상기 피부외용제는 크림, 겔, 연고, 피부 유화제, 피부 현탁액, 경피전달성 패치, 약물 함유 붕대, 로션, 또는 그 조합일 수 있다. 상기 피부외용제는 통상 화장품이나 의약품 등의 피부외용제에 사용되는 성분, 예를 들면 수성성분, 유성성분, 분말성분, 알코올류, 보습제, 증점제, 자외선흡수제, 미백제, 방부제, 산화방지제, 계면활성제, 향료, 색제, 각종 피부 영양제, 또는 이들의 조합과 필요에 따라서 적절하게 배합될 수 있다. 상기 피부외용제는, 에데트산이나트륨, 에데트산삼나트륨, 시트르산나트륨, 폴리인산나트륨, 메타인산나트륨, 글루콘산 등의 금속봉쇄제, 카페인, 탄닌, 벨라파밀, 감초추출물, 글라블리딘, 칼린의 과실의 열수추출물, 각종생약, 아세트산토코페롤, 글리틸리틴산, 트라넥삼산 및 그 유도체 또는 그 염등의 약제, 비타민 C, 아스코르브산인산마그네슘, 아스코르브산글루코시드, 알부틴, 코지산, 글루코스, 프룩토스, 트레할로스 등의 당류등도 적절하게 배합할 수 있다.

다른 구체예에 있어서, 상기 조성물은 약학적 조성물일 수 있다.

상기 약학적 조성물은 약제학적으로 허용가능한 희석제 또는 담체를 추가적으로 포함할 수 있다. 상기 희석제는 유당, 옥수수 전분, 대두유, 미정질 셀룰로오스, 또는 만니톨, 활택제로는 스테아린산 마그네슘, 탈크, 또는 그 조합일 수 있다. 상기 담체는 부형제, 붕해제, 결합제, 활택제, 또는 그 조합일 수 있다. 상기 부형제는 미결정 셀룰로오즈, 유당, 저치환도 히드록시셀룰로오즈, 또는 그 조합일 수 있다. 상기 붕해제는 카르복시메틸셀룰로오스 칼슘, 전분글리콜산 나트륨, 무수인산일수소 칼슘, 또는 그 조합일 수 있다. 상기 결합제는 폴리비닐피롤리돈, 저치환도 히드록시프로필셀룰로오즈, 히드록시프로필셀룰로오즈, 또는 그 조합일 수 있다. 상기 활택제는 스테아린산 마그네슘, 이산화규소, 탈크, 또는 그 조합일 수 있다.

상기 약학적 조성물은 경구 또는 비경구 투여 제형으로 제형화될 수 있다. 경구 투여 제형은 과립제, 산제, 액제, 정제, 캅셀제, 건조시럽제, 또는 그 조합일 수 있다. 비경구 투여 제형은 주사제일 수 있다.

상기 조성물은 건강기능식품 조성물을 일 수 있다.

상기 건강기능식품 조성물은 에피더미디박테리움 속 균주 또는 이의 배양액 단독 또는 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효 성분의 혼합양은 사용 목적 (예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 식품 또는 음료의 제조시에 본 명세서의 조성물은 원료에 대하여 15 중량부 이하의 양으로 첨가될 수 있다. 상기 건강기능식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 건강기능식품의 종류 중 음료 조성물은 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상기 천연 탄수화물은 포도당, 과당과 같은 모노사카라이드, 말토스, 슈크로스와 같은 디사카라이드, 및 덱스트린, 사이클로덱스트린과 같은 폴리사카라이드, 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 감미제로서는 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 감미제나, 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있다. 상기 건강식품 조성물은 또한 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제, 또는 그 조합을 함유할 수 있다. 상기 건강기능식품 조성물은 또한, 천연 과일쥬스, 과일쥬스 음료, 야채 음료의 제조를 위한 과육, 또는 그 조합을 함유할 수 있다.

또한, 다른 양상은 유효한 양의 상기한 조성물을 그를 필요로 하는 개체에 처리 또는 투여하는 단계를 포함하는 개체의 상태를 예방, 개선, 또는 치료하는 방법을 제공한다.

상기 개체의 상태는 피부와 관련된 상태, 또는 염증과 관련된 상태일 수 있다. 상기 조성물에 대해서는 상술한 바와 동일하다. 상기 개체는 포유동물, 예를 들면, 사람, 소, 말, 돼지, 개, 양, 염소, 또는 고양이일 수 있다.

일 양상에 신규 스포리치아과 균주는 다른 또는 동일과의 다른 속과 비교하여 계통분류학적, 화학분류학적 구분된 특성을 갖고 있으며, 신규 스포리치아과 균주 또는 그의 배양액은 피부 관련 상태 또는 염증 관련 상태의 예방, 개선, 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있는 효과가 있다.

도 1은 EPI-7의 계통분류 결과를 나타낸 도면이다.
도 2는 EPI-7의 형태학적 특성을 관찰한 도면이다.
도 3은 EPI-7의 처리에 따른 피부 상재균의 변화를 나타낸 도면이다.
도 4는 EPI-7의 처리에 따른 피부 상재균의 변화를 나타낸 도면이다.
도 5는 인간 각질세포에서 EPI-7이 필라그린의 발현에 미치는 영향을 양성 대조군과 비교하여 나타낸 그래프이다.
도 6은 인간 각질세포에서 EPI-7이 클라우딘 4의 발현에 미치는 영향을 양성 대조군과 비교하여 나타낸 그래프이다.
도 7은 인간 각질세포에서 EPI-7이 그의 용량에 따라 클라우딘 4의 발현에 미치는 영향을 나타낸 그래프이다.
도 8은 인간 각질세포에서 EPI-7이 CerS3의 발현에 미치는 영향을 양성 대조군과 비교하여 나타낸 그래프이다.
도 9는 인간 각질세포에서 EPI-7이 그의 용량에 따라 CerS3의 발현에 미치는 영향을 나타낸 그래프이다.
도 10은 인간 각질세포에서 EPI-7이 αSMase의 발현에 미치는 영향을 양성 대조군과 비교하여 나타낸 그래프이다.
도 11은 인간 각질세포에서 EPI-7이 그의 용량에 따라 αSMase의 발현에 미치는 영향을 나타낸 그래프이다.
도 12는 인간 각질세포에서 EPI-7이 HAS의 발현에 미치는 영향을 양성 대조군과 비교하여 나타낸 그래프이다.
도 13은 인간 각질세포에서 EPI-7이 그의 용량에 따라 HAS의 발현에 미치는 영향을 나타낸 그래프이다.
도 14는 인간 각질세포에서 EPI-7이 트랜스글루타미나아제 1의 발현에 미치는 영향을 양성 대조군과 비교하여 나타낸 그래프이다.
도 15는 인간 각질세포에서 EPI-7이 그의 용량에 따라 클라우딘 1의 발현에 미치는 영향을 나타낸 그래프이다.
도 16은 인간 각질세포에서 EPI-7이 그의 용량에 따라 아쿠아포린 3의 발현에 미치는 영향을 나타낸 그래프이다.
도 17은 EPI-7이 염증 인자의 발현에 미치는 영향을 나타낸 그래프이다.
도 18은 인간 각질세포에서 EPI-7이 그의 용량에 따라 TSLP의 발현에 미치는 영향을 나타낸 그래프이다.
도 19는 인간 각질세포에서 EPI-7이 그의 용량에 따라 TARC의 발현에 미치는 영향을 나타낸 그래프이다.
도 20은 EPI-7이 세포 생존율에 미치는 영향을 나타낸 도면이다.

이하 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 하나 이상의 구체예를 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 균주의 분리

건강한 여성의 피부를 멸균 증류수로 세척하여 확보된 샘플(human epidermal keratinocyte)을 R2A(Reasoner's 2A) 배지(Becton Dickinson, Cockeysville, MD)에 접종하였다. 접종 후 48시간 동안 28℃ 인큐베이터에서 배양한 뒤 형성된 집락 100개를 순수 분리 배양하여, 48시간 동안 28℃ 인큐베이터에서 재배양 하였다. 배양이 완료된 집락은 16s rRNA 유전자 서열 동정을 실시하였다. 이때 사용된 프라이머는 박테리아에만 반응하여 증폭하도록 고안(서열번호 2 및 3)되었다. PCR 증폭은 95℃ 1분, 55℃ 1분, 75℃ 1분30초씩 30 사이클로 실시 하였으며, 마지막으로 72℃에서 8분간 처리한 후 4℃에서 보관하였다. PCR 반응이 끝난 뒤 분리 배양된 종들의 DNA 서열은 ABI-3730XL(ABI, USA)를 이용하여 결정하였다. 분리 배양된 미생물 집락 중 결정된 16S rRNA부위의 염기서열을 미국 국립생물정보센터(NCBI, National Center for Biotechnology Information) 홈페이지에서 제공되는 BLAST 프로그램으로 등록된 다른 균주들과 비교 분석 하였다. 상동성 97% 이하의 신규성 있는 종들만 선별하여 사용하였고, 그 중 상동성 94% 이하의 신규 미생물(이하 "EPI-7"이라 함)을 선별하였다. EPI-7은 서열번호 1(complementary DNA)의 16s rRNA 서열을 갖는다.

실시예 2. 신규 미생물의 분류학적 성질 및 균학적 성질

2.1. 분류학적 성질

16S rRNA 상동성 분석은 ExTaxon-e server(Yoon S. H et al., (2017))를 사용하여 계산되었다. 서열 데이터는 소프트웨어 패키지 BioEdit(Hall T. A. (1999))을 사용하여 정렬되었고, 계통 분석은 MEGA version 5.05(Tamura, K et al.(2011))를 사용하여 수행하였다. 계통수(phylogenetic trees)는 Neighbor-joining 분석(Sitou and Nei (1987)), maximum-likelihood 및 maixmum-parsimony 알고리즘을 사용하여 그려졌고, bootstrap 분석(1000 replication)(Felsenstein 1985)을 사용하여 계통수의 안정성을 평가하였다.

그 결과, EPI-7은 모데스토박터 라피디스(Modestobacter lapidis) MON 3.1 , 스포리치아 폴리모파(Sporichthya polymorpha)DSM 43042 및 모데스토박터 마리너스(Modestobacter marinus) 42H12-1 모데스토박터 로세우스(Modestobacter roseus) KLBMP1279, 및 모데스토박터 버시칼라(Modestobacter versicolor) CP153-2와 각각 93.4%, 93.2%, 93.0%, 93.0% 및 92.9%의 상동성을 갖는 것을 확인하였다. 또한, 도 1에 나타낸 바와 같이 구성된 계통수의 결과에서 확인된 바와 같이, EPI-7은 이제까지 보고된 바 없는 스포리치아과(Sporichthyaceae)에 속하는 신규 속임을 확인하였다.

2.2. 균학적 성질

2.2.1. 형태학적 특성

EPI-7의 형태학적 특성은 다음과 같이 분석하였다.

먼저, EPI-7의 세포 형태는 R2A 배지에서 25 ℃에서 5일 동안 배양한 후, 현미경(Olympus microscope, GX71)을 사용하여 1000 배율에서 관찰하였다.

활주 운동성(gliding motility)은 R2A 배지 중 신선한 EPI-7 세포에 대해 행잉 드롭 기법(hanging-drop technique)을 사용하여 평가하였다.

SEM(Scanning Electron Microscopy)을 관찰하기 위하여 시료를 다음과 같이 전처리 하였다. R2A(Becton Dickinson, Cockeysville, MD) 고체 배지에 EPI-7을 접종하고 3일간 배양 뒤 형성된 콜로니에 막 필터(membrane filter)를 부착시켰다. 콜로니가 부착된 막 필터를 분리하여 2.5% 글루타알데하이드(glutaraldehyde) 용액에 2시간 동안 처리하여 고정한 후, PBS로 5분씩 담가서 세척하였다. 이후에, 2% 오스뮴 테트록시드(osmium tetroxide) 용액에 1시간 처리하고 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100% 에탄올로 탈수 처리 하였다. 탈수처리가 완료된 시료는 에탄올을 제거하기 위해 이소아밀아세테이트(Isoamylacetate)를 사용하여 제거하였다. 전처리가 완료된 샘플은 자연건조를 시키고, 스퍼터 코팅기(SC502, Polaron)로 금을 스퍼터링 하였다. 이후에, 이를 SEM(Hitachi S4300N, Hitachi, Japan)로 10000배, 100000배율로 촬영하였고, 그 결과를 도 2에 나타내었다.

그람 양성 음성 판별을 위해 다음과 같은 방법으로 실험을 진행하였다. 구체적으로, R2A 고체배지를 사용하여 잘 배양된 EPI-7 콜로니 하나를 수집하여 슬라이드글라스에 고정 시켰다. 슬라이드글라스를 완전 건조 시킨 뒤크리스탈 바이올렛으로 1~ 2분간 염색시키고 흐르는 물에 세척하고 다시 건조시켰다. 건조된 슬라이드를 다시 요오드-요오드화칼륨에 1분간 염색시켰다. 이후, 에틸알코올을 이용하여 탈색시켜주고 슬라이드를 흐르는 물로 씻어준 뒤 건조시켰다. 그람양성 음성을 판별하기 위해 사프라닌 등 붉은색 계통의 염색약으로 1 ~ 3분간 2차 염색을 하고 물에 씻은 뒤 현미경(Olympus microscope, GX71)으로 관찰하였다.

그 결과, EPI-7은 다음과 같은 형태학적 특징을 가짐을 확인하였다:

(1) 막대기형(Rod-Shaped);

(2) 비운동성(non-motile);

(3) 편모 없음;

(4) 그람 양성;

(5) 비포자 생성(non-spore forming);

(6) 세포의 길이는 0.5-0.3um이고, 직경은 0.3-0.1um이다; 및

(7) 콜로니 형태가 둥글고(round), 볼록하며(convex), 옅은 노란색 (pale yellow)이다.

2.2.2. 배양 및 생리학적 특성

EPI-7의 배양 조건을 확인하기 위해 최적 생장온도는 5℃에서부터 40℃까지 (5℃ 간격) 설정하여 최적배양온도를 확인하였으며, 최적 염농도는 NaCl 0 내지 15%(w/v)(0.5% 간격)로 배지에 추가하여 25℃에서 5일간 배양하여 확인하였다. pH는 다음의 버퍼 시스템을 사용하여 확인하였다; 소듐 아세테이트/아세트산(pH<6), 트리스/HCl (pH 6 내지 9), 및 글라이신/소듐 히드록시드(pH>9).

또한, 카탈라아제 활성은 3%(v/v) H₂O₂ 중 버블 생산을 평가함으로써 결정하였고, 옥시다아제 활성은 1% (w/v) 테트라메틸 페닐렌디아민(tetramethyl phenylenediamine)을 사용하여 결정하였다.

또한, 성장 배지를 확인하기 위하여 NA(Nutrient Agar), ISP 2(Yeast Extract Malt Extract Agar) 및 트립티케이즈 소이 아가(trypticase soy agars) 배지(BD, USA)를 사용하여 25℃에서 5일간 배양하여 확인하였다.

또한, EPI-7의 물질 이용능을 확인하기 위해서 BioLog GP2, BioLog Gen III, API 20NE 및 API ZYM(biomeriuex, France)를 사용하였다. 사용 방법은 제조사에서 제공되는 매뉴얼에 따라 실시하였다. 판정의 경우 양성반응이 일어났을 때 보라색으로 발색이 일어나고, 육안으로 판정한 뒤 마이크로플레이트 비색계(Microplate spectrophotometer)를 사용하여 성장 정도를 정확하게 판정하였다. API ZYM 테스트는 25℃ 에서 4시간 배양 후에 판독하였고, 다른 API 테스트는 25℃ 에서 적어도 48시간 배양 후에 판독하였고, 다른 종과의 비교 결과를 아래 표 1에 나타내었다.

호기성 성장은 소듐티오글리콜레이트(sodium thioglycollate)(1 g/l)을 R2A 배지에 첨가하고, 위쪽 공기 부분은 질소 가스로 대체하여 혈청병(serum bottle) 중 수행하였다.

DNA, 카세인, 스타치, 트윈 80, 및 카르복시메틸셀룰로우스의 분해능에 대한 시험은 25℃ 에서 7일 동안 배양 후에 평가하였다.

Characteristic	1	2	3	4
API- ZYM test
esterase(C4)	+	+	+	-
esterase lipase(C8)	+	-	+	-
Lipase(C14)	-	-	+	-
Valine arylamidase	-	+	+	+
acid phosphatase	+	+	-	+
α-Glucosidase	-	+	-	+
β-glucosidase	-	+	-	+
BIOLOG GP2 / GENⅢ tests Assimilation of
Dextrin	+	+	-	-
Tween 40	+	+	+	+
Tween 80	+	+	-	-
D-Fructose	+	-	-	+
Maltotriose	+	-	-	-
α-D-Glucose	-	+	+	+
3-Methyl Glucose	-	-	+	-
D-Glucose-6-PO4	-	+	+	-
D-Galactose	-	-	-	+
D-Fructose-6-PO4	-	+	-	+
D-Glucuronic Acid	-	-	-	+
D-Mannose	+	-	-	-
D-Psicose	+	+	-	-
D-Ribose	+	+	-	-
D-Sorbitol	-	+	-	+
L-Histidine	-	-	+	-
Pectine	-	+	+	+
Citric acid	-	+	+	+
L-Malic Acid	-	+	+	+
α-Hydroxybutyric Acid	+	-	-	+
α-Ketoglutaric Acid	+	+	-	-
β-Hydroxy-D,L-Butyric Acid	-	-	+	-
Acetoacetic Acid	-	+	+	+
Acetic acid	-	+	-	+
D-Fructose-6-PO4	-	+	+	-
D-Galacturonic Acid	-	+	+	-
Glucuronamide	-	+	+	-
L-Lactic Acid	-	-	-	+
L-Serine	+	-	-	-
Growth in presence of inhibitory compounds
Aztreonam	-	-	+	+
Guanidine HCl	-	-	-	-
Lithium chloride	+	+	-	+
Niaproof 4	-	-	-	-
Tetrazolium blue	+	+	-	-
Tetrazolium violet	+	+	-	+
Troleandomycin	+	+	-	-
Vancomycin	+	+	-	-
Nalidixic Acid	+	+	+	+
Rifamycin SV	-	+	+	-
Potassium Tellurite	-	+	+	+
Growth at pH 5.0	+	-	-	-
Growth in the presence of 10% (w/v) NaCl	+	-	-	-

1: EPI-7

2: 모데스토박터 라피디스(Modestobacter lapidis MON 3.1)

3: 스포리치아 폴리모파(Sporichthya polymorpha DSM 43042)

4: 모데스토박터 마리너스 (Modestobacter marinus 42H12-1)

+: 양성, -: 음성

그 결과, EPI-7은 다음과 같은 배양 및 생리학적 특징을 가짐을 확인하였다:

(1) 호기성;

(2) 종속영양성;

(4) 표 1의 특성;

(6) R2A 아가에서 15℃ 내지 35℃에서 성장(최적 25℃ )하나, 10℃ 또는 40℃ 에서 성장하지 않는다;

(7) pH 5.0 내지 6.5에서 성장하고, 10%까지의 NaCl 농도에서 성장 한다(최적은 pH 6.0, 0% NaCl)

(8) 질산염은 아질산염으로 환원된다; 및

2.2.3. 생화학적 특성

EPI-7의 DNA G+C 함량은 HPLC를 이용하여 분석하였다. 구체적으로, 세포 지방산 조성물(Cellular Fatty Acid composition), G+C 조성물(G+C composition), 퀴논(Quinone) 분석 시험방법 및 조건은 다음과 같다.

먼저 분리 균주의 세포 지방산 조성은 Miller의 방법에 따라 수행하였다. 배양한 약 40mg의 세포를 튜브에 옮긴 후, 50% 메탄올에 15% NaOH를 첨가한 용액 1ml을 첨가하여 100℃에서 30분간 가열하여 실온에서 식혀주었다. 여기에 메탄올(methanolic)-HCl 2ml (6.0N HCl 325 ml과 메탄올 275 ml 혼합용액)을 첨가하여 80℃에서 10분간 가열한 뒤 급냉한 후 1.25 ml의 헥산/메틸-터트-부틸에테르(hexane/methyl-tert-butylether)(1:1, v/v)을 넣고 10분간 잘 섞어준다. 실온에 정치한 후 반응액이 2개의 층으로 분리되면 하등액만을 제거하고 3 ml의 dilute NaOH(10.8g NaOH/900 ml D.W)를 첨가하여 10분간 잘 섞어준 후 실온에 정치하였고, 상등액의 2/3 정도를 바이알(screw-capped sample vial)(12 X 32mm, Agilent technologies)로 옮겨 캡핑(capping) 하여 시료로 사용하였다. 시료는 셜록 MIS 소프트웨어(Sherlock MIS Software)의 표준 프로토콜에 따라 사포닌화, 메틸화 및 추출되었다. 지방산은 아질런트 테크놀로지스 6890 가스 크로마토그래피(Agilent technologies 6890 Gas chromatography) 와 A30m X 0.320mm X 0.25μm 가교 메틸 실록산 컬럼(Crosslinked Methyl siloxane column) (HP-1)을 사용하여 분석하였으며, MIS 패키지의 TSBA40 데이터베이스(MIDI, Version 4.5)를 사용하여 확인되었다. 모든 실험은 최소 3번 수행하였고, 그 결과를 아래 표 2에 나타내었다.

또한, G+C mol%은 다음과 같이 수행하였다. 균주로부터 추출된 DNA 용액을 마이크로튜브에 옮긴 후, 14000 rpm에서 5분 동안 원심분리를 수행하였다. 이후에, 상등액 100㎕을 수집하여 새로운 튜브에 옮긴 후, 100에서 5분간 DNA 변성을 일으킨 후 냉각시켰다. P1 뉴클레아제 10㎕(0.1mg/mL)를 넣고 50℃에서 3시간 반응시켰다. 알칼라인 포스파타아제(버퍼 10㎕, 포스파타아제 5㎕)를 넣고 37℃에서 하룻밤 동안 인큐베이션 하였다. 14000rpm에서 5분 원심분리 후 분석을 실시하며 조건은 다음과 같다.

HPLC : YOUNG LIN YL9100 (YL9111 Binary pump)

Detector : YOUNG LIN YL9120 UV/Vis Detector

Chromatograph data system : YOUNG LIN Autochro-3000

분석컬럼 : Waters Spherisorb 5um ODS2 4.6mmx250mm column

용출액: 0.02M NH4H2PO4(pH무조정)-acetonitrile(20:1,v/v)

유속: 0.5mL/min

검출파장: 270nm

퀴논은 다음과 같이 분석하였다. 균주를 25 ℃에서 96시간 동안 R2A 배지에서 배양한 후, 균체만 모아서 동결건조를 수행하였다. 동결건조된 샘플을 다음조건으로 추출하였다. 클로로폼:메탄올 (2:1)용액을 첨가하여 3 내지 4시간 동안 흔들어주었다. 필터지(whatman No.2)를 이용하여 필터링을 하여 세포를 제거하였고, 여과된 용액을 농축시켰다. 이후에 이를 클로로폼:메탄올(8.5:1.5) 100㎕로 녹인 후, 14000rpm에서 5분 동안 원심분리한 후 상등액을 수집하여 HPLC 분석을 수행하였다. HPLC 조건은 다음과 같다;

HPLC : YOUNG LIN YL9100 (YL9111 Binary pump)

Detector : YOUNG LIN YL9120 UV/Vis Detector

Chromatograph data system : YOUNG LIN Autochro-3000

분석컬럼 : Waters Spherisorb 5um ODS2 4.6mmx150mm column

(column temp. 40℃)

분석용매 : Methanol : Isopropyl ether (4 : 1)

유속: 1.0mL/min

검출파장 : 254 mm.

극성지질(polar lipid) 분석은 균주를 25 ℃에서 96시간 동안 R2A 배지에서 배양한 후 수행하였다. 우선 균주로부터 극성 지질을 Minnikin D.E. et al(1984)(J Microbiol Methods 2, 233-241)에 기재된 방법에 따라 추출하였다. 이후에 2차원 TLC 법(Komakata K et al., 1987, Methods Microbiol 19, 161-206)을 사용하여 극성지질을 동정하였다.

Fatty Acids( % )	1	2	3	4
C_12:0	0.6	-	0.6	-
Iso-C_13:0	0.1	-	-	0.1
C_13:0	0.9	-	0.5	-
Iso-C_14:0	1.9	-	-	2.4
C_14:1 ω5c	0.2	-	-	-
C_14:0	1.6	6.8	1.7	0.5
Iso-C_15:0	10.1	13.1	-	4.5
Anteiso-C_15:0	3.2	1.6	-	6.5
C_15:1 ω8c	2.6	0.5	-	-
C_15:1 ω6c	1.1	-	-	1.2
C_14:0 2OH	0.2	-	-	-
Iso-C_16:1 H	1.0	0.4	-	9.2
Iso-C_16:0	8.5	4.6	1.7	28.4
C_16:1 ω9c	3.2	-	-	-
C_16:0	18.4	14.2	22.4	5.1
C_15:0 2OH	0.5	-		-
Iso-C_17:0	0.4	0.7		1.6
Anteiso-C_17:0	2.1	0.8		6.1
C_17:1 ω8c	19.9	5.8	21.2	11.8
C_17:0	7.1	4.4	11.8	4.9
10-methyl C_17:0	-	-	8.9	-
C_16:0 2OH	0.6	0.5	-	-
C_18:3 ω6c(6,9,12)	0.6	1.4	0.5	-
C_18:1 ω9c	2.5	5.4	10.4	1.1
C_18:0 ω5c	0.1	-	-	-
C_18:0	1.1	8.7	4.0	0.7
10-methyl C_18:0			4.7
11-methyl C_18:1 ω7c	0.1	-	-	-
C_19:0	-	3.6	-	-
C_20:0	-	6.9	-	-
Summed Feature 3	10.0	13.27	9.2	5.4
Summed Feature 4	0.2	-	-	-
Summed Feature 7	-	1.6	-	0.2
Summed Feature 8	1.2	1.9	0.7	1.4
Summed Feature 9	-	0.1	1.8	0.9

1: EPI-7

2: 모데스토박터 라피디스(Modestobacter lapidis MON 3.1)

3: 스포리치아 폴리모파(Sporichthya polymorpha DSM 43042)

4: 모데스토박터 마리너스 (Modestobacter marinus 42H12-1)

Summed Feature 3 : C_16:1 ω6c and/or C_16:1 ω7c

Summed Feature 4 : anteiso B-C_17:1 and/or Iso I-C_17:1

Summed Feature 7 : C_19:1 ω6c and/or ω7c and/or Cyclo C_19:0

Summed Feature 8 : C_18:1 ω6c

Summed Feature 9 : Iso-C_17:1 ω9c

그 결과, EPI-7은 다음과 같은 생화학적 특징을 가짐을 확인하였다:

(2) 주요 극성 지질은 포스파티딜에탄올아민(phosphatidylethanolamine) (PE), 포스파티딜이노시톨(phosphatidylinositol) (PI), 세 개의 확인되지않은 인지질(three unidentified phospholipids)(UPL), 포스파티딜글리세롤(phosphatidylglycerol) (PG), 포스파티딜콜린(phosphatidylcholine)(PC), 두 개의 확인되지 않은 아미노지질(two unidentified aminolipids) (AL) 및 세 개의 확인되지 않은 지질 (three unidentified lipids)(UL)이다;

(3) DNA G+C 함량은 68.9 mol%이다; 및

(4) 표 2의 지방산 조성.

또한, 최종적으로 다른 종과의 특성 비교를 정리하여 아래 표 3에 나타내었다.

	EPI-7	S.polymorpha	S.brevicatena	M.lapidis	M.versicolor	M.roseus	M.marinus
세포 형태	Whitish Yellow, Short rod	Greyish White, Short aerial hyphae	Greyish White, Short aerial hyphae	Dark Orange, short rods and cocci	Pink-Deep Orange, Short rod	Pink, Short rod or cocci	Resish Orange, Short rod
R2A 중 색소	-	-	-	-	+	-	+
10% NaCl 중 성장	+	-	-	-	W	+	-
주요 세포 지방산	C17:1ω8c, C16:0, iso-C15:0 and C16:1ω6c and/or C16:1 ω7c	C16:0 and C17:1	Iso-C16:0	iso-C15:0, iso-C16:0, C16:1, ω 9c and C16:0	iso-C15:0 iso-C16 : 0, anteiso-C15 : 0 and C18 : 1	Iso-C16:0 and iso-C15 : 0	iso-C16:0 and C1 :1 ω 8c.
세포-벽 디아미노산	meso-DAP	LL-DAP	LL-DAP	meso-DAP	meso-DAP	meso-DAP	meso-DAP
G+C mol%	68.9	71.0	71.6	72.0	73.0	71.7	72.3
세포벽 당	Galactose Arabinose	Inositol, Mannose, Glycerol Glucose	Glucosamine, Mannose, Galactose, Glucose	Glucose, Galactose, Ribose, Arabinose	Galactose Ribose Glucose	Galactose Ribose Glucose	Galactose Ribose Glucose
주요 퀴논	MK-9(H4)	MK-9(H6)	MK-9(H8)	MK-9(H4)	MK-9(H4)	MK-9(H4)	MK-9(H4)

표 3에 나타낸 바와 같이, EPI-7은 가장 가까운 종들과도 주요 생화학적 특성이 상이하며, 이러한 화학적 분류(chemotaxonomic) 결과의 조합은 상기 실시예 2.1.의 계통 분류의 결과와 함께 EPI-7이 새로운 종임을 입증한다.

이상의 결과로, 인간 상피 세포(human epidermal keratinocyte)로부터 분리된 EPI-7은 스포리치아과(Sporichthyaceae)에 속하는 신규 속의 미생물임을 확인하였고, 이를 계통학회 명명법에 따라 에피더미디박테리움 속(Epidermidibacterium gen.nov.)이라 명명하였다;

Epidermidibacterium [E.pi.der.mi.di.bac.te'ri.um. N.L. n.　epidermis, -idis　skin;　L. neut. n.　bacterium, (a small rod or staff); N.L. neut.　(Epidermidibacterium　a small rod from the skin)]

또한, 상기 실시예 2에서 확인한 바와 같이, 에피더미박테리움 속은 다음과 같은 특성을 갖는다.

(1) 막대기형(Rod-Shaped);

(2) 비운동성(non-motile);

(3) 그람 양성;

(4) 비포자 생성(non-spore forming);

(5) 옥시다아제, 및/또는 카탈라아제 활성 음성; 및

(7) MK-9(H4)이 검출된다;

(8) 주요 극성 지질은 포스파티딜에탄올아민(phosphatidylethanolamine) (PE), 포스파티딜이노시톨(phosphatidylinositol) (PI), 포스파티딜글리세롤(phosphatidylglycerol) (PG), 포스파티딜콜린(phosphatidylcholine)(PC), 및 세 개의 확인되지 않은 지질 (three unidentified lipids)(UL)이다; 및

(9) DNA G+C 함량은 68.9 mol%이다

계속해서, 이상의 결과로, 인간 상피 세포로부터 분리된 에피더미디박테리움 속(Epidermidibacterium gen.nov.) 균주는 하나의 종을 갖는 것을 확인하였고, 이를 계통학회 명명법에 따라 에피더미디박테리움 케라티니(Epidermidibacterium keratini sp. nov)로 명명하였다;

Epidermidibacterium keratini (ke.ra.ti'ni. N.L. gen. neut. n. keratini pertaining to keratin).

또한, 상기 실시예 2에서 확인한 바와 같이, 에피더미박테리움 케라티니는 상기 에피더미박테리움 속이 갖는 특성이 이외에 다음과 같은 특성을 갖는다.

(1) 세포의 길이는 0.5-0.3um이고, 직경은 0.3-0.1um이다;

(5) pH 5.0 내지 6.5에서 성장하고, 10%까지의 NaCl 농도에서 성장한다(최적은 pH 6.0, 0% NaCl)

(6) 질산염은 아질산염으로 환원된다;

(7) 카세인과 스타치는 분해되나, DNA 및 카르복시메틸셀룰오로스는 분해되지 않는다; 및

(8) 표 1 내지 3에 기재된 특성을 갖는다;

(9) N-아세틸-D-글루코사민, N-아세틸-β-D-만노사민, α-D-글루코스, D-만노스(mannose), D-프룩토오스(fructose), D-갈락토오스(galactose), 덱스트린(dextrin), D-푸코오스(fucose), 이노신(inosine), 락타미드(lactamide), 말토트리오스(maltotriose), D-프시코오스(psicose), D-리보오스(ribose), α-케토발레린산(ketovaleric Acid), D-프룩토오스(fructose)-6-PO₄, L-세린(serine), 펙틴(pectin), 피루브산(pyruvic acid), 아데노신(adenosine), 티미딘(thymidine), 2'-디옥시 아데노신(deoxy adenosine), 아데노신-5'-모노포스페이트, p-히드록시- 페닐아세트산(phenylacetic acid), 메틸 피루베이트(methyl pyruvate), D-락트산 메틸 에스터(lactic acid methyl ester), L-락트산(lactic acid), 시트르산(citric acid), α-케토-글루타르산, D-말산(malic Acid), L-말산, 브로모-숙신산, 트윈 40, 트윈 80, α-히드록시-부티르산(butyric acid), β-히드록시-D,L-부티르산, α-케토-부티르산, 프로피온산(propionic acid) 및 아세트산 활성의 동화(assimilation) 양성(positive);

(10) D-말토오스, D-셀로바이오스(cellobiose), 젠티오바이오스(gentiobiose), 수크로오스, D-투나노오스(turanose), 스타키오스(stachyose), D-라피노오스(raffinose), α-D-락토오스, D-멜리비오스(melibiose), β-메틸-D-글루코시드, D-살리신(salicin), N-아세틸-D-갈락토사민, N-아세틸 뉴라미닌산(acetyl neuraminic acid), D-소비톨(sorbitol), D-만니톨(mannitol), D-아라비톨(arabitol), 미오-이노시톨(myo-inositol), 글리세롤(glycerol), D-글루코스-6-PO₄, D-아스파틴산(aspartic acid), D-세린, 젤라틴(gelatin), 글리시일(glycyl)-L-프롤린(proline), L-알라닌, L-아르지닌, L-아스파틴산(aspartic acid), L-글루타민산(glutamic acid), L-히스티딘, L-파이로글루타민산(pyroglutamic), D-갈락투로닌산(galacturonic acid), L-갈락토닌산 락톤(galactonic acid lactone), D-글루코닌산(gluconic acid), D-글루쿠로닌산(glucuronic acid), 글루쿠로나미드(glucuronamide), 뮤신산(mucic acid), 퀴닌산(quinic acid), D-사카린산(saccharic acid), γ-아미노-부티르산(butyric acid), 포름산(formic acid), a-시클로덱스트린(cyclodextrin), β-시클로덱스트린, 글리코젠(glycogen), 이눌린(inulin), 만난(mannan), N-아세틸-D-글루코사민, N-아세틸-β-D-만노사민, 아미그달린(amygdalin), L-아라비노오스(arabinose), 아르부틴(arbutin), L-푸코오스(fucose), D-갈락토오스(galactose), D-갈락투로닌산(galacturonic), D-글루코닌산(gluconic), 락투로오스(lactulose), D-멜레지토오스(melezitose), α-메틸-D-갈락토시드(galactoside), β-메틸-D-갈락토시드, 3-메틸 글루코오스, α-메틸-D-글루코시드, β-메틸-D-글루코시드, α-메틸-D-만노시드, 팔라티노오스(palatinose), L-람노오스(rhamnose), 살리신(salicin), 세도헵툴로산(sedoheptulosan), D-타가토오스(tagatose), D-트레할로오스(trehalose), 투라노오스(turanose), 자일리톨(xylitol), D-자일로오스(xylose), 아세트산, γ-히드록시부티르산(hydroxybutyric acid), p-히드록시-페닐아세트산, D-락트산 메틸 에스터, D-말산(malic acid), L-말산, 피루바틴산 메틸 에스터(pyruvatic acid methyl ester), 숙신산 모노-메틸 에스터(succinic acid mono-methyl ester), 프로피온 산(propionic acid), 숙시나민산(succinamic acid), N-아세틸-L-글루탐산(glutamic acid), L-알라닌아민(alaninamine), D-알라닌(alanine), L-알라닐-글리세린, 글리실일-L-글루탐산, L-파이로글루탐산(pyroglutamic acid), 푸트레신(putrescine), 2,3-부탄디올(butanediol), 우리딘(uridine), 티미딘-5'-모노포스페이트, 우리딘-5'-모노포스페이트, D-프룩토오스-6-포스페이트, α-D-글루코오스-1-포스페이트, D-글루코오스-6-포스페이트, D-L-α-글리세롤 포스페이트의 동화에 대한 음성;

(11) 에스터라아제(C4), 에스터라아제 리파아제(C8), 류신 아릴아미다아제(leucine arylamidase), 크리스틴 아릴아미다아제(crystine arylamidase), 산 포스파타아제(acid phosphatase) 및 나프톨-AS-BI-포스포히드로라아제(phosphohydrolase) 활성이 존재한다;

(12) 약한(weak) 알칼린 포스파타아제(alkaline phosphatase), 발린 아릴아미다아제(valine arylamidase) 및 α-키모트린신 활성이 존재한다;

(13) 리파아제(C14), 트린신, α-갈락토시다아제, β-글루쿠로니다아제(glucuronidase), β-글루코시다아제(glucosidase), α-글루코시다아제, N-아세틸-β-글루코사미니다아제(glucosaminidase), α-만노시다아제(mannosidase) 및 α-푸코시다아제(fucosidase) 활성이 존재하지 않는다(absent); 및

(14) 주요 지방산은 C17:1ω8c, C16:0, iso-C15:0 및 summed feature 3 (C_16:1 ω6c 및/또는 C_16:1 ω7c) 이다.

본 발명자들은 상기 에피더미디박테리운 속에 속하는 에피터미디박테리움 케라티니 균주를 2016년 06월 08일자로 한국생명공학연구원 생물자원센터에 기탁하여 기탁번호 KCCM 11843P를 부여받았다.

실시예 3. 균주의 활성

3.1. 피부 마이크로바이옴 (skin- mircrobiome ) 변화 분석

EPI-7이 피부 상재 미생물에 미치는 변화를 측정하기 위해 피험자를 대상으로 피부 마이크로바이옴 변화를 분석하였다.

구체적으로, EPI-7 배양물을 피험자의 피부에 6 시간 간격으로 적용시켜 총 72시간 동안 피부샘플을 채집하여 분석에 사용하였다. 배양물 처리 전(Epidermis A)과 처리 후 72시간(Epidermis B)으로 샘플을 수집하였다. 샘플은 멸균수와 스크래퍼를 이용하여 수집하였으며, 모든 작업은 클린 벤치(clean bench) 내에서 실시되었다. 피부로부터 채집된 샘플을 0.85% NaCl에 현탁한 후 상등액을 원심분리 (17,000 rpm/m)하여 균체를 취하고 멸균된 생리식염수에 균체를 1회 세척하였다. 이후에, FastDNA SPIN KIT(MP Biomedical, France)를 사용하여 DNA를 추출하였다. 추출된 DNA의 16S ribosomal DNA gene 증폭을 위하여 GC 클램프(서열번호 4)가 부착된 341F(서열번호 5)와 518R(서열번호 6)을 이용하였다. PCR 반응을 위해 0.4 mM dNTP, 0.5 units Taq polymerase, 4 mM Mg2+이 함유된 타카라 퍼펙트 프리믹스(Takara Perfect Premix) (Takara, Japan) 10㎕에 DNA 주형 (20 μg/mL) 1㎕, 1.0 μM 정방향 프라이머 및 1.0 μM 역방향 프라이머 1㎕를 혼합하고, 나머지는 증류수를 첨가하여 총 부피가 20㎕가 되도록 제조하였다. PCR 반응은 C1000-Dual (Bio-Rad,USA)를 이용하여 64℃에서 50℃까지 온도를 낮추면서 2 cycle씩 증폭을 실시하는 터치 다운 PCR 방법을 사용하였으며, 최종적으로 72℃에서 8분 처리 후, 4℃에 보관 하였다. 이후에, 얻어진 PCR 산물을 이용하여 DGGE(Denaturing gradient gel electrophoresis) 분석에 사용하였다. DGGE 분석에는 D-code system (Bio-rad, USA)을 사용하였다. 사용한 폴리아크릴아미드 겔 농도는 8%였고, 40% 폴리아크릴아미드 비스-용액(polyacrylamide bis-solution) 29:1 (3.3%C) (Bio-Rad, USA)이 40%~ 60% 사이의 농도 구배가 수직으로 형성되도록 제작하였다. 이때 사용된 변성제는 7 M 우레아와 40% (w/v) 포르아미드(formamide) (Sigma, USA)였다. Dcode system에 약 7 ℓ의 TAE buffer (20 mM Tris, 10 mM acetic acid, 0.5 mM EDTA, pH 8.0)를 채우고, 2X loading dye (0.05% bromophenol blue, 0.05% xylene cyanol, 70% glycerol)와 PCR 산물을 동량 혼합해 50V에서 800 분간 전기영동을 실시하였다. 전기영동을 마친 폴리아크릴아미드 겔은 레드세이프(Redsafe)(Intron, Korea) 용액에서 15 분간 염색 후 나타난 특정 밴드를 분석하였고, 그 결과를 도 3에 나타내었다. 또한, DGGE 결과의 밴드 강도는 GelCompar2 (Bionumeric, Belgium) 를 이용하여 이미지를 히스토그램 하고 수치화 하여 분석하였고, DGGE 겔 밴드는 는 마크로젠에 기탁의뢰하여 염기서열을 분석하였으며, 그 결과를 도 4에 나타내었다.

도 3 및 도 4에 나타낸 바와 같이, 배양물 처리 전(Epidermis A 대비 처리 후(Epidermis B)에서 밴드의 수가 감소하고, 특정 밴드가 강하게 발현되었다. 밴드의 발현 증가는 개체수의 증가를 나타낸다. DGGE 밴드에서 농도가 증가된 밴드들은 대부분이 피부에 공생하여 피부 장벽 강화 및 보습력에 효과가 알려진 피부상재균인 스타폴로코커스(staphylococcus) 속 의 미생물들이 대부분 이었다.

상기의 결과는 EPI-7이 상기 미생물들의 증가를 통해 피부의 장벽강화 및 보습력 증진에 영향력을 미쳤다는 것을 의미한다.

3.2. 피부 상처 치유, 피부장벽 강화 및 보습 활성 분석

피부 상처 치유, 피부 장벽 강화 및 보습 활성을 분석하기 위해, 인간 각질 세포주(HaCaT)에서 EPI-7의 처리에 따른 피부 장벽 강화 및 보습활성 관련 인자인 필라그린(filaggrin), HAS3 (hyaluronic acid synthase3), 클라우딘(claudin) 1, 클라우딘 4, αSMase, 아쿠아포린 3(Aquaporin 3, AQP3) 트랜스글루타미나아제 1(transglutaminase 1), 및 CerS3의 발현량을 RT-PCR로 확인하였다.

구체적으로, 인체 각질형성 세포주(human keratinocyte)인 HaCaT 세포를 10% 우혈청 (fetal bovin serum)을 포함한 DMEM 배지(Dulbecco’smodified Eagle’s Medium, Gibco 1210-0038)에서 배양하였고, 배양은 모두 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 수행하였다. 상기 배양된 세포주에 양성 대조군으로서, 레티놀을 1mM 용량으로 처리하였다. 또 다른 양성 대조군으로서, 세포 배양액 20 ml에 대하여, 비피도박테리움 애니말리스(Bifidobacterium animalis)(UB) 및 락토바실러스 아시도필러스(Lactobacillus acidophilus)(AB)의 배양액을 1%의 농도로 처리하였다. 또한, EPI-7의 배양물은 0.1%, 0.5%, 및 1.0%의 농도로 처리하였다.

이후에, HaCaT 세포를 24시간 동안 추가로 배양한 후, 회수하여 트리졸 (RNA iso, DAKARA, 일본) 1㎖을 첨가하여 RNA를 분리하였다. 또한, RT-PCR을 위해, Nanodrop 2000 (Thermo, USA)를 이용해 RNA를 정량한 후, 42 ℃ 에서 55 분, 70℃에서 15 분 동안 반응시켜 cDNA를 합성하였다(Reverse Transcriptase Mix, ELPIS biotech, 한국). RT-PCR은 Step One Plus(Applied Biosystems, 미국)를 이용하였고, 사이버그린(SYBR Green supermix,Applied Biosystems, 미국)을 프라이머 및 cDNA와 함께 첨가하여 94℃에서 5분 동안 중합효소를 활성화한 후, 95℃ 30초, 54℃ 1분, 72℃ 1분간 40 사이클로 중합반응 하였다. 필라그린(filaggrin)은 서열번호 7 및 8의 프라이머, HAS3 (hyaluronic acid synthase3)는 서열번호 9 및 10의 프라이머, 클라우딘(claudin) 1은 서열번호 11 및 12의 프라이머, 클라우딘 4은 서열번호 13 및 14의 프라이머, αSMase은 서열번호 15 및 16의 프라이머, 아쿠아포린 3(Aquaporin 3, AQP3)은 서열번호 17 및 18의 프라이머, 트랜스글루타미나아제 1(transglutaminase 1)은 서열번호 19 및 20의 프라이머, CerS3는 서열번호 21 및 22의 프라이머, 및 베타-액틴은 서열번호 23 및 24의 프라이머를 사용하였다.

도 5는 인간 각질세포에서 EPI-7이 필라그린의 발현에 미치는 영향을 양성 대조군과 비교하여 나타낸 그래프이다.

도 6은 인간 각질세포에서 EPI-7이 클라우딘 4의 발현에 미치는 영향을 양성 대조군과 비교하여 나타낸 그래프이다.

도 7은 인간 각질세포에서 EPI-7이 그의 용량에 따라 클라우딘 4의 발현에 미치는 영향을 나타낸 그래프이다.

도 8은 인간 각질세포에서 EPI-7이 CerS3의 발현에 미치는 영향을 양성 대조군과 비교하여 나타낸 그래프이다.

도 9는 인간 각질세포에서 EPI-7이 그의 용량에 따라 CerS3의 발현에 미치는 영향을 나타낸 그래프이다.

도 10은 인간 각질세포에서 EPI-7이 αSMase의 발현에 미치는 영향을 양성 대조군과 비교하여 나타낸 그래프이다.

도 11은 인간 각질세포에서 EPI-7이 그의 용량에 따라 αSMase의 발현에 미치는 영향을 나타낸 그래프이다.

도 12는 인간 각질세포에서 EPI-7이 HAS의 발현에 미치는 영향을 양성 대조군과 비교하여 나타낸 그래프이다.

도 13은 인간 각질세포에서 EPI-7이 그의 용량에 따라 HAS의 발현에 미치는 영향을 나타낸 그래프이다.

도 14는 인간 각질세포에서 EPI-7이 트랜스글루타미나아제 1의 발현에 미치는 영향을 양성 대조군과 비교하여 나타낸 그래프이다.

도 15는 인간 각질세포에서 EPI-7이 그의 용량에 따라 클라우딘 1의 발현에 미치는 영향을 나타낸 그래프이다.

도 16은 인간 각질세포에서 EPI-7이 그의 용량에 따라 아쿠아포린 3의 발현에 미치는 영향을 나타낸 그래프이다.

도 5에 나타낸 바와 같이, EPI-7은 각질 세포의 분화 마커 및 피부표면에서 보습을 담당하는 천연보습 인자의 전구 단백질인 필라그린 유전자의 발현을 유의적으로 증가시켰음을 확인할 수 있었다.

도 6, 7, 및 15에 나타낸 바와 같이, EPI-7은 외부 환경으로부터 내부기관을 보호하고 인체의 항상성을 유지하는 역할을 담당하는 밀착 연접(tight junction)의 구조물인 클라우딘 1 및 4의 발현을 유의적으로 증가시켰음을 확인할 수 있었다.

도 8 내지 11에 나타낸 바와 같이, EPI-7은 세라마이드 합성을 위해 필요한 효소인 CerS3와 aSMase의 발현을 유의적으로 증가시켰음을 확인할 수 있었다.

도 12 및 13에 나타낸 바와 같이, EPI-7 배양물은 피부 수분 유지 기능을 수행하는 세포외 기질 성분인 히알루론산의 합성을 담당하는 HAS3 유전자의 발현을 증가시켰으며, 양성 대조군인 레티놀보다 더 높은 효능을 보였음을 확인할 수 있었다.

도 14에 나타낸 바와 같이, EPI-7은 피부 각화막(cornified envelope) 형성에 결정적인 역할을 수행하는 트랜스글루타미아나제 1 유전자의 발현을 유의적으로 증가시켰음을 확인할 수 있었다.

도 16에 나타낸 바와 같이, EPI-7은 인간 피부의 수분공급에 역할을 할 뿐만 아니라, 수분 채널로서 세포 이동을 촉진하고, 글리세롤 트랜스포터로서 각질세포의 증식과 분화에 역할을 수행함으로써, 상처치료의 역할을 수행하는 AQP3의 발현을 유의적으로 증가시켰음을 확인할 수 있었다.

이상의 결과로, EPI-7은 피부의 유연성과 견고성을 높이고 피부의 수분보유능력을 증진시켜 피부 보습의 효과가 있으며, 세포간의 부착과 세포주위 공간을 통한 수분 함유 용질 및 수분의 이동의 조절이 더 효과적으로 일어남으로써 피부장벽기능을 강화하고, 각질세포의 증식과 분화, 및 이동능을 증가시켜 상처치료에 유의적인 효과가 있음을 알 수 있다.

3.3. 피부 항염증 활성 분석

EPI-7의 항염증 활성을 분석하기 위해, 염증유발물질로서, 스타필로코커스 아우레우스(S. aureus)를 HaCaT 세포에 처리하고, S. 에피더미디스 와 EPI-7을 사람 HaCaT 세포와 함께 공동배양 하여 염증 인자의 mRNA 발현 정도를 평가하였다.

구체적으로, HaCaT 세포를 배양하여 6 well 접시에 세포를 접종하고, 24시간 뒤 세포 단일층 상부에 미세막 웰을 설치한 후 생균(SA: S. aureus, SA_SE: S. aureus + S. epidermidis, SA_EPI-7: S. aureus + EPI-7) 을 1.0 x 10¹⁴ 세균수로 접종하였다. 24 시간 추가 공동 배양한 후 생균 및 배지를 제거하고, TNF-α, IL-1a, TSLP와 DDIT3에 대한 프라이머 서열로서, 서열번호 25 및 26의 조합, 서열번호 27 및 28의 조합, 서열번호 29 및 30의 조합, 및 서열번호 31 및 32의 조합을 사용한 것만을 제외하고는 상기 실시예 3.2.와 동일하게 RT-PCR을 수행하였다. 상기 결과는 도 17에 나타내었다.

도 17은 EPI-7이 염증 인자의 발현에 미치는 영향을 나타낸 그래프이다.

도 17에 나타낸 바와 같이 EPI-7은 피부 염증 인자인 TNF-α, IL-1a, TSLP 및 DDIT3의 발현을 유의적으로 억제시킴을 확인할 수 있었다. 이러한 결과는 EPI-7 및 그의 배양액이 피부 염증과 관련된 질환에 유용하게 사용될 수 있음을 의미한다.

3.4. 피부 항가려움 활성 분석

EPI-7의 항가려움 활성을 분석하기 위해, 항가려움증 인자인 TSLP(Thymic stromal pymphopoietin)와 TARC(Thymus and activation-regulated chemokine)의 mRNA 발현정도를 평가하였다. 구체적으로, HaCaT 세포에 인터페론 생산을 촉진하는 합성 리보핵산인 폴리 IC(polyinosinic:polycytidylic acid: Poly I:C)를 처리한 후 24시간 동안 배양하여 HaCaT 세포를 자극하였다. 배양 후, 자극에 의해 노화된 세포에 EPI-7의 배양물을 0.1%, 0.5%, 및 1.0%의 농도로 처리하였고, 추가적으로 24시간 동안 배양하였다. TARC 프라이머 서열로서 서열번호 33 및 34의 조합을 사용한 것만을 제외하고는 상기 실시예 3.3.과 동일하게 RT-PCR을 수행하였다.

상기 결과는 도 18 및 19에 나타내었다.

도 18은 인간 각질세포에서 EPI-7이 그의 용량에 따라 TSLP의 발현에 미치는 영향을 나타낸 그래프이다.

도 19는 인간 각질세포에서 EPI-7이 그의 용량에 따라 TARC의 발현에 미치는 영향을 나타낸 그래프이다.

도 18 및 도 19에 나타낸 바와 같이, EPI-7은 가려움증과 관련된 인자인 TSLP 및 TARC의 발현을 유의적으로 감소시킴을 확인할 수 있었다. 이러한 결과는 EPI-7 및 그의 배양액이 피부 염증과 관련된 질환에 유용하게 사용될 수 있을 뿐만 아니라, 소양증 등에도 유용하게 사용될 수 있음을 의미한다

3.5. 세포 독성 분석

EPI-7이 세포독성에 미치는 영향을 확인하기 위해 MTT 어세이를 수행하였다.

구체적으로, HaCaT 세포를 상기 실시예 3.1.과 동일하게 준비하고, 96-웰 플레이트에 3 x 10⁴ cells/well로 분주하여 24 시간 후에 FBS 제거 배지로 교환하였다. EPI-7 배양액을 FBS 제거 배지에 0.01, 0.1, 1, 10, 및 50%의 농도로 희석하여 제작한 후 처리하였다. 24 시간 배양 후 배지 제거하고 0.5 μg/mL 농도의 MTT (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) 용액을 넣어 결정화한 후 4시간 동안 더 배양하였다. MTT시약 제거 후 디메틸설폭시드 (DMSO, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)로 용해하여 540 nm에서 흡광도를 측정한 후 무처리군과 비교하여 생존율을 측정하였고, 그 결과를 도 20에 나타내었다.

도 20은 EPI-7이 세포 생존율에 미치는 영향을 나타낸 도면이다.

도 20에 나타낸 바와 같이, EPI-7은 고 농도의 범위에서도 세포에 전혀 독성을 미치지 않음을 알 수 있다.

한국미생물보존센터(국외)

KCCM11843P

20160608

SEQUENCE LISTING <110> COSMAX, INC. <120> Uses of microorganism a member of family Sporichthyaceae <130> PN117776 <150> KR 10-2016-0080231 <151> 2016-06-27 <150> KR 10-2016-0155981 <151> 2016-11-22 <160> 34 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 1450 <212> DNA <213> Epidermidibacterium keratini <400> 1 caggacgaac gctggcggcg tgcttaacac atgcaagtcg agcgaagctc tcctcttcgg 60 aggagatgac ttagcggcga acgggtgagt aacacgtggg caacctgccc ttagctctgg 120 gataagcgat ggaaacgtcg tctaataccg gatacgacac ggaacggcat cattaccgtg 180 tggaaagaat ttcggctaag gatgggcccg cggcctatca gcttgttggt ggggtaatgg 240 cctaccaagg cttcgacggg taaccggcct gagagggcga ccggtcacac tgggactgag 300 acacggccca gactcctacg ggaggcagca gtggggaata ttgcacaatg ggcgaaagcc 360 tgatgcagcg acgccgcgtg agggatgacg gccttcgggt tgtaaacctc tttcagcagg 420 gacgaagcga aagtgacggt acctgcagaa gaagcgccgg ccaactacgt gccagcagcc 480 gcggtaatac gtagggcgca agcgttgtcc ggaattattg ggcgtaaaga gctcgtaggc 540 ggtttatcac gtcggctgtg aaatcccgag gcttaacctc gggcctgcag tcgatacggg 600 ttgactagag tgaagcaggg gagactggaa ttcctggtgt agcggtgaaa tgcgcagata 660 tcaggaggaa caccggtggc gaaggcgggt ctctgggctt taactgacgc tgaggagcga 720 aagcgtgggt agcgaacagg attagatacc ctggtagtcc acgccgtaaa cggtgggcgc 780 taggtgtggg gaccattcca cggtctccgt gccgcagcta acgcattaag cgccccgcct 840 ggggagtacg gccgcaaggc taaaactcaa aggaattgac gggggcccgc acaagcggcg 900 gagtatgttg cttaattcga tgcaacgcga agaaccttac caaggcttga catataccga 960 aaactcatag agatatgagg tccttttggg cggtatacag gtggtgcatg gttgtcgtca 1020 gctcgtgtcg tgagatgttg ggttaagtcc cgcaacgagc gcaaccctcg ttctatgttg 1080 ccagcacgta atggtgggga ctcataggag actgccgggg tcaactcgga ggaaggtggg 1140 gatgacgtca aatcatcatg ccccttatgt cttgggctgc aaacatacta caatggccgg 1200 tacaaagggc tgcgataccg taaggtggag cgaatcccaa aaagccggtc tcagttcgga 1260 ttggggtctg caactcgacc ccatgaagtc ggagtcgcta gtaatcgcag atcagcaacg 1320 ctgcggtgaa tacgttcccg ggccttgtac acaccgcccg tcaagtcatg aaagtcggta 1380 acacccgaag ccggtggcct aacctttttg gagggagccg tcgaaggtgg gactggcgat 1440 taggactaag 1450 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for bacteria <400> 2 agagtttgat cmtggctcag 20 <210> 3 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for bacteria <400> 3 tacggytacc ttgttacgac tt 22 <210> 4 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GC clamp for amplification of 16s ribosomal DNA gene <400> 4 cgcccggggc gcgccccggg cggggcgggg gcacgggggg 40 <210> 5 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for amplification of 16s ribosomal DNA gene <400> 5 cctacgggag gcagcag 17 <210> 6 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for amplification of 16s ribosomal DNA gene <400> 6 attaccgcgg ctgctgg 17 <210> 7 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for filaggrin <400> 7 agtgcactca gggggctcac a 21 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for filaggrin <400> 8 ccggcttggc cgtaatgtgt 20 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for HAS3 <400> 9 cttaagggtt gcttgcttgc 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for HAS3 <400> 10 gttcgtggga gatgaaggaa 20 <210> 11 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for claudin 1 <400> 11 gctctagaat tctcacacgt agtctttccc gct 33 <210> 12 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for claudin 1 <400> 12 gctctagaat tctcacacgt agtctttccc gct 33 <210> 13 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for claudin 4 <400> 13 gctctagaat tccgagcgag tcatggccaa cgc 33 <210> 14 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for claudin 4 <400> 14 gctctagaat tctcacacgt agtctttccc gct 33 <210> 15 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for aSMase <400> 15 actttgataa ctgctcctct gac 23 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for aSMase <400> 16 ttcgtgtcca gcagagtacc 20 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for AQP3 <400> 17 agacagcccc ttcaggattt 20 <210> 18 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for AQP3 <400> 18 tcccttgccc tgaatatctg 20 <210> 19 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for TG1 <400> 19 ccccaagaga ctagcagtgg 20 <210> 20 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for TG1 <400> 20 agaccaggcc attcttgatg 20 <210> 21 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for CerS3 <400> 21 acattccaca aggcaaccat tg 22 <210> 22 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for CerS3 <400> 22 ctcttgattc cgccgactcc 20 <210> 23 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for b-actin <400> 23 ggccatctct tgctcgaagt 20 <210> 24 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for b-actin <400> 24 gacaccttca acaccccagc 20 <210> 25 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for TNF-a <400> 25 cttctccttc ctgatcgtgg 20 <210> 26 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for TNF-a <400> 26 gctggttatc tctcagctcc a 21 <210> 27 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for IL-1a <400> 27 tggctcattt tccctcaaaa gttg 24 <210> 28 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for IL-1a <400> 28 agaaatcgtg aaatccgaag tcaag 25 <210> 29 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for TSLP <400> 29 gctatctggt gcccaggcta t 21 <210> 30 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for TSLP <400> 30 cgacgccaca atccttgtaa t 21 <210> 31 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for DDIT3 <400> 31 tgcctttctc ttcggacact 20 <210> 32 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for DDIT3 <400> 32 tgtgacctct gctggttctg 20 <210> 33 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for TARC <400> 33 cttctctgca gcacatcc 18 <210> 34 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for TARC <400> 34 aagacctctc aaggctttg 19

Claims

에피더미디박테리움 속(Epidermidibacterium gen.) 균주 또는 그의 배양액을 포함하는 화장료 조성물.
청구항 1에 있어서, 상기 에피더미디박테리움 속(Epidermidibacterium gen.) 균주는 에피더미디박테리움 케라티니(Epidermidibacterium keratini sp.)인 것인 화장료 조성물.
청구항 2에 있어서, 상기 에피더미디박테리움 케라티니는 기탁번호 KCCM 11843P로 기탁된 것인 화장료 조성물.
청구항 2에 있어서, 상기 에피더미디박테리 케라티니는 서열번호 1에 기재된 염기서열을 갖는 16s rRNA 유전자를 포함하는 것인 화장료 조성물.
청구항 1에 있어서, 피부장벽 강화용, 피부 노화 예방 또는 개선용, 피부 보습용, 피부 상처 개선용, 또는 피부 염증 예방 또는 개선용인 것인 화장료 조성물.
청구항 1에 있어서, 피부 상처, 피부염, 아토피 피부염, 소양증, 습진성 피부질환, 건성 습진, 홍반, 두드러기, 건선, 약발진, 및 여드름으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나의 예방 또는 개선용인 것인 화장료 조성물.
에피더미디박테리움 속(Epidermidibacterium gen.) 균주 또는 그의 배양액을 포함하는 피부외용제 조성물.
청구항 7에 있어서, 상기 에피더미디박테리움 속(Epidermidibacterium gen.) 균주는 에피더미디박테리움 케라티니(Epidermidibacterium keratini sp.)인 것인 피부외용제 조성물.
청구항 7에 있어서, 피부 상태의 예방, 개선 또는 치료용인 것인 피부외용제 조성물.
청구항 7에 있어서, 상기 피부 상태는 피부 상처, 피부염, 아토피 피부염, 소양증, 습진성 피부질환, 건성 습진, 홍반, 두드러기, 건선, 약발진, 및 여드름으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상인 것인 피부외용제 조성물.
에피더미디박테리움 속(Epidermidibacterium gen.) 균주 또는 그의 배양액을 포함하는 피부 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물.
청구항 11에 있어서, 상기 에피더미디박테리움 속(Epidermidibacterium gen.) 균주는 에피더미디박테리움 케라티니(Epidermidibacterium keratini sp.)인 것인 약학적 조성물.
청구항 11에 있어서, 상기 피부 질환은 피부 상처, 피부염, 아토피 피부염, 소양증, 습진성 피부질환, 건성 습진, 홍반, 두드러기, 건선, 약발진, 및 여드름으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상인 것인 약학적 조성물.
에피더미디박테리움 속(Epidermidibacterium gen.) 균주 또는 그의 배양액을 포함하는 염증성 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물.
청구항 14에 있어서, 상기 염증성 질환은 피부염, 알레르기, 아토피, 결막염, 치주염, 비염, 중이염, 인후염, 편도염, 폐렴, 위궤양, 위염, 크론병, 대장염, 관절염, 강직성 척추염, 건염, 건초염, 건주위염, 근육염, 간염, 방광염, 및 신장염으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상인 것인 약학적 조성물.
에피더미디박테리움 속(Epidermidibacterium gen.) 균주 또는 그의 배양액을 포함하는 건강기능식품 조성물.
청구항 16에 있어서, 상기 에피더미디박테리움 속(Epidermidibacterium gen.) 균주는 에피더미디박테리움 케라티니(Epidermidibacterium keratini sp.)인 것인 건강기능식품 조성물.