KR20230169718A

KR20230169718A - 신규 아이에미아씨에와과 미생물 및 이의 용도

Info

Publication number: KR20230169718A
Application number: KR1020220070195A
Authority: KR
Inventors: 조형우; 이동걸; 강승현
Original assignee: 코스맥스 주식회사
Priority date: 2022-06-09
Filing date: 2022-06-09
Publication date: 2023-12-18
Also published as: WO2023239024A1

Abstract

아이에미아씨에와과에 속하는 미생물에 관한 것으로, 다른 또는 동일한 다른 속의 균주와 비교하여 계통분류학적, 화학분류학적 구분된 특성을 갖고 있다.

Description

신규 아이에미아씨에와과 미생물 및 이의 용도{Novel Iamiaceae bacteria microorgamism and uses thereof}

일루마토박터에씨과 미생물에 관한 것이다.

피부는 외부환경과의 접촉하는 지점이 되며, 다양한 미생물들(진균, 세균, 바이러스 및 작은 유충)의 집합소이기도 하다. 물리적, 화학적 기능의 선택에 맞게 미생물들은 특화된 틈새에 적응하여 서식처를 마련한다.

일반적인 피부의 특성으로 표면은 차갑고, 약산성의 성질을 나타내며, 건조한 상태로 유지된다. 구조적으로 표피(epidermis)는 피부 장벽을 이루고 있으며, 미생물과 독소가 침투하는 것을 차단하고, 수분을 유지하는 중요한 역할을 한다. 표피의 최상위층은 각질층(stratum corneum)으로 구성되어 있다. 표피는 일명 '벽돌과 몰탈 구조'라고 불리는 형태를 띠고 있는데, 피부 조직은 계속적인 자가 회복 과정을 거치고, 분화 과정의 마지막을 거친 비늘(squames)은 끊임없이 피부조직에서 탈락되는 과정을 반복하게 되는데, 이러한 피부의 변화에는 미생물이 영향을 준다는 것들이 밝혀지고 있다.

프로바이오틱스(Probiotics)는 인체에 유익한 작용을 하는 미생물을 총칭하는 말로 우리 몸에 유익(benefit)을 주는 미생물을 말한다. 현재까지 알려진 대부분의 프로바이오틱스는 유산균으로 알려져 있다. 프로바이오틱스는 인체에 여러 가지 유익작용을 통해 효과적인 효능이 발생되는 것으로 보고되었지만, 피부상재균과 피부의 상호 관계에 대한 연구는 미비한 실정이다.

피부 장벽은 죽은 각질 세포와 세포간 지질로 구성되어 있고, 외부 자극으로부터 피부를 보호하며 피부에서 수분 이 증발하는 것을 막아주는 피부 보호막으로서 피부건강에 핵심적인 기능을 담당한다. 즉, 체내에서 지나친 수 분 방출을 막고 화학물질이나 미생물처럼 해로운 물질이 우리 몸 안으로 들어오는 것을 막아준다. 죽은 각질 세포의 표면을 구성하는 각질 세포 외피에는 세포간 지질의 안정성에 중요한 역할을 한다. 각질형성세포는 분화를 통해 각질화 과정을 통해 피부 장벽을 만든다. 피부 장벽 기능은 노화가 진행되거나 외부 요소들에 의해 파괴될 수 있으며, 피부 장벽의 손상은 피부 수분량 감소와 주름을 일으킬 수 있다.

이에, 본 발명자들은 피부상재균의 변화에 의해 피부에서 어떤 변화를 나타내는지 관찰하고 더 나아가 피부상재균의 변화를 유도하여 잠재적인 피부환경의 개선효과를 나타낼 수 있는지 연구하던 중, 건강한 성인의 피부로부터 아이에미아씨에와(Iamiaceae)과 균주를 분리 및 동정하였으며, 피부 관련된 상태에 유용하게 사용될 수 있음을 확인 하고, 본　발명을 완성하게 되었다.

일 양상은 아이에미아씨에와(Iamiaceae)과에 속하는 신규 더마토박터 호니미스(Dermatobacter hominis) 균주를 제공하는 것이다.

다른 양상은 상기 균주의 파쇄액, 배양액, 또는 배양액의 추출물을 제공하는 것이다.

또 다른 양상은 더마토박터 호니미스(Dermatobacter hominis) 균주, 그의 파쇄액, 배양액, 배양액의 추출물 또는 이들의 혼합물을 포함하는 조성물을 제공한다.

일 양상은 아이에미아씨에와(Iamiaceae)과에 속하는 신규 더마토박터 호니미스(Dermatobacter hominis) 균주를 제공한다.

아이에미아씨에와(Iamiaceae)과에 속하는 균주는 하기 균학적 성질 중 어느 하나 이상을 갖는 것일 수 있다;

(1) 막대기형(Rod-Shaped);

(2) 비운동성(Non-motile);

(3) 그람 양성;

(4) 비포자 생성(non-motile);

(5) DNA G+C 함량은 72.2 mol%이다;

(6) MK-9(H8)(9 유닛을 갖는 테트라히드로제네이티드 메나퀴논(tetrahydrogenated menaquinone with nine unit))이 검출된 이소프레노이드 퀴논이다;

(7) 주요 극성 지질은 디포스파티딜글리세롤(Diphosphatidylglycerol, DPG), 세 개의 확인되지 않은 지질(three unidentified phosphoglycolipid, PGL), 확인되지 않은 아미노인지당지질(unidentified aminophosphoglycolipid, APGL), 및 확인되지 않은 아미노인지질(unidentified aminophospholipid, APL)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상이다; 및

(8) 카탈레이즈 양성(Catalase positive)이다.

상기 아이에미아씨에와(Iamiaceae)과에 속하는 균주의 계통분류학적 특성은 다른 균주가 속하는 다른 속과 뚜렷한 차이를 보이고, 화학분류학적 특성도 뚜렷한 차이를 보이는 바, 신규 더마토박터(Dermatobacter) 속으로 동정하였다.

상기 더마토박터(Dermatobacter) 균주는 더마토박터 호니미스(Dermatobacter hominis)를 포함하는 것일 수 있다.

상기 더마토박터 호니미스(Dermatobacter hominis)는 하기의 균학적 성질 중 어느 하나 이상을 갖는 것일 수 있다;

(1) 세포의 길이는 0.8~1.4 ㎛이고, 직경은 0.4~0.7 ㎛이다;

(2) 콜로니 형태는 타원형이며, 흰색이다;

(3) R2A(Reasoner's 2A) 아가, TSA (Tryptic Soy Agar), NA (Nutrient Agar), LBA (Lysogeny Broth Agar)에서는 성장한다;

(4) R2A 배지의 18℃ 내지 37℃에서 성장(최적 25℃)하나, 이를 벗어난 온도에서는 성장하지 않는다;

(5) pH 6.0 내지 pH 8.0에서 성장하고, 0~1%의 염도(NaCl)에서 성장한다 (최적 pH: 7.0%, 최적 NaCl 농도: 0%);

(6) 질삼염은 아질산염으로 환원되지 않는다;

(7) 카세인, 전분, DNA, 셀룰오로스, Tween 80은 분해하지 않는다;

(8) 표 1 내지 3에 기재된 특성을 갖는다;

(9) N-아세틸-D-글루코사민, N-아세틸--D-만노사민, α-D-글루코스, D-만노스(mannose), D-프룩토오스 (fructose), D-갈락토오스(galactose), 덱스트린(dextrin), D-푸코오스(fucose), 이노신(inosine), 락타미드 (lactamide), 말토트리오스(maltotriose), D-프시코오스(psicose), D-리보오스(ribose), α-케토발레린산 (ketovaleric Acid), D-프룩토오스(fructose)-6-PO4, L-세린(serine), 펙틴(pectin), 피루브산(pyruvic acid), 아데노신(adenosine), 티미딘(thymidine), 2'-디옥시 아데노신(deoxy adenosine), 아데노신-5'-모노포스페이트, p-히드록시- 페닐아세트산(phenylacetic acid), 메틸 피루베이트(methyl 공개특허 10-2018-0001459 - 5 - pyruvate), D-락트산 메틸 에스터(lactic acid methyl ester), L-락트산(lactic acid), 시트르산(citric acid), α-케토-글루타르산, D-말산(malic Acid), L-말산, 브로모-숙신산, 트윈 40, 트윈 80, α-히드록시-부 티르산(butyric acid), β-히드록시-D,L-부티르산, α-케토-부티르산, 프로피온산(propionic acid) 및 아세트 산 활성으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 동화(assimilation) 양성(positive);

(10) D-말토오스, D-셀로바이오스(cellobiose), 젠티오바이오스(gentiobiose), [0031] 수크로오스, D-투나노오스 (turanose), 스타키오스(stachyose), D-라피노오스(raffinose), α-D-락토오스, D-멜리비오스(melibiose), β- 메틸-D-글루코시드, D-살리신(salicin), N-아세틸-D-갈락토사민, N-아세틸 뉴라미닌산(acetyl neuraminic acid), D-소비톨(sorbitol), D-만니톨(mannitol), D-아라비톨(arabitol), 미오-이노시톨(myo-inositol), 글리 세롤(glycerol), D-글루코스-6-PO4, D-아스파틴산(aspartic acid), D-세린, 젤라틴(gelatin), 글리시일 (glycyl)-L-프롤린(proline), L-알라닌, L-아르지닌, L-아스파틴산(aspartic acid), L-글루타민산(glutamic acid), L-히스티딘, L-파이로글루타민산(pyroglutamic), D-갈락투로닌산(galacturonic acid), L-갈락토닌산 락 톤(galactonic acid lactone), D-글루코닌산(gluconic acid), D-글루쿠로닌산(glucuronic acid), 글루쿠로나미드(glucuronamide), 뮤신산(mucic acid), 퀴닌산(quinic acid), D-사카린산(saccharic acid), γ-아미노-부티 르산(butyric acid), 포름산(formic acid), a-시클로덱스트린(cyclodextrin), β-시클로덱스트린, 글리코젠 (glycogen), 이눌린(inulin), 만난(mannan), N-아세틸-D-글루코사민, N-아세틸-β-D-만노사민, 아미그달린 (amygdalin), L-아라비노오스(arabinose), 아르부틴(arbutin), L-푸코오스(fucose), D-갈락토오스(galactose), D-갈락투로닌산(galacturonic), D-글루코닌산(gluconic), 락투로오스(lactulose), D-멜레지토오스 (melezitose), α-메틸-D-갈락토시드(galactoside), β-메틸-D-갈락토시드, 3-메틸 글루코오스, α-메틸-D-글루코시드, β-메틸-D-글루코시드, α-메틸-D-만노시드, 팔라티노오스(palatinose), L-람노오스(rhamnose), 살리신(salicin), 세도헵툴로산(sedoheptulosan), D-타가토오스(tagatose), D-트레할로오스(trehalose), 투라노오스(turanose), 자일리톨(xylitol), D-자일로오스(xylose), 아세트산, γ-히드록시부티르산(hydroxybutyric acid), p-히드록시-페닐아세트산, D-락트산 메틸 에스터, D-말산(malic acid), L-말산, 피루바틴산 메틸 에스터 (pyruvatic acid methyl ester), 숙신산 모노-메틸 에스터(succinic acid mono-methyl ester), 프로피온산(propionic acid), 숙시나민산(succinamic acid), N-아세틸-L-글루탐산(glutamic acid), L-알라닌아민 (alaninamine), D-알라닌(alanine), L-알라닐-글리세린, 글리실일-L-글루탐산, L-파이로글루탐산(pyroglutamic acid), 푸트레신(putrescine), 2,3-부탄디올(butanediol), 우리딘(uridine), 티미딘-5'-모노포스페이트, 우리딘-5'-모노포스페이트, D-프룩토오스-6-포스페이트, α-D-글루코오스-1-포스페이트, D-글루코오스-6-포스페이트, 및 D-L-α-글리세롤 포스페이트로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 동화에 대한 음성;

(11) 에스터라아제(C4), 에스터라아제 리파아제(C8), 류신 아릴아미다아제(leucine arylamidase), 크리스틴 아릴아미다아제(crystine arylamidase), 산 포스파타아제(acid phosphatase) 및 나프톨-AS-BI-포스포히드로라아 제(phosphohydrolase) 활성으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 활성이 존재한다;

(12) 리파아제(C14), 트린신, α-갈락토시다아제, β-글루쿠로니다아제(glucuronidase), β-글루코시다아제 (glucosidase), α-글루코시다아제, N-아세틸-β-글루코사미니다아제(glucosaminidase), α-만노시다아제 (mannosidase) 및 α-푸코시다아제(fucosidase) 활성으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 활성 이 존재하지 않는다(absent);

(13) 주요 지방산은 C_16:0, C_18:0,C_18:1 ω9c 또는 C_20:1 ω9c이다; 및

(14) 카탈레이즈 양성(Catalase positive)이다.

상기 더마토박터 호니미스(Dermatobacter hominis)는 서열번호 1로 표시되는 염기서열을 포함하는 16s rRNA를 포함할 수 있다. 또한, 상기 더마토박터 호니미스(Dermatobacter hominis)는 기탁번호 KACC 22415로 기탁된 것일 수 있다.

다른 양상은 상기 균주의 파쇄물, 배양액, 또는 배양액의 추출물을 제공한다.

상기 균주의 구체적인 내용은 전술한 바와 같다.

본 명세서에서 용어"배양액"은 "배양 상층액", "조건 배양액" 또는 "조정 배지"와 호환적으로 사용될 수 있고, 상기 균주가 시험관 내에서 성장 및 생존할 수 있도록 영양분을 공급할 수 있는 배지에 상기 균주를 일정기간 배양하여 얻는 상기 균주, 이의 대사물, 여분의 영양분 등을 포함하는 전체 배지를 의미할 수 있다. 또한, 상기 배양액은 균주를 배양하여 얻은 균체 배양액에서 균체를 제거한 배양액을 의미할 수 있다. 　한편, 상기　배양액　중 균체를 제거한 액체를 "상등액"이라고도 하며,　배양액을 일정시간 가만히 두어 하층에 가라앉은 부분을 제외한 상층의 액체만을 취하거나, 여과를 통해 균체를 제거하거나,　배양액을 원심분리하여 하부의 침전을 제거하고 상부의 액체만을 취하여 획득할 수 있다. 상기 "균체"는 본 발명의　균주　자체를 의미하는 것으로 피부 샘플 등으로부터 분리하여 선별한　균주　자체 또는 상기　균주를 배양하여　배양액으로부터 분리한　균주를 포함한다. 상기 균체는　배양액을 원심분리하여 하층에 가라앉은 부분을 취하여 획득할 수 있고, 또는 중력에 의해　배양액의 하층으로 가라앉으므로 일정 시간동안 가만히 두었다가 상부의 액체를 제거함으로써 획득할 수 있다.

상기 배양액은 아이에미아씨에와(Iamiaceae)과에 속하는 균주를 배양하여 수득된 배양액 자체, 그의 농축물, 또는 동결건조물 또는 배양액로부터 균주를 제거하여 수득된 배양 상층액, 그의 농축물 또는 동결건조물을 포함할 수 있다.

상기 배양액은 균주를 배지(예를 들면, R2A 배지 또는 TSA 배지) 에서 10 ℃ 초과 또는 40 ℃ 미만 중 어느 온도에서 일정 시간, 예를 들면, 4 내지 50시간 동안 배양하여 수득된 것일 수 있다.

일 구체예에서, 균주의 배양 상층액은 균주 배양액을 원심분리나 여과시켜 균주를 제거하는 단계에 의해 수득될 수 있다.

다른 구체예에서, 농축물은 상기 균주 배양액 자체, 또는 상기 배양액을 원심분리나 필터를 이용하여 여과한 후 수득된 상층액을 농축하는 단계에 의해 수득될 수 있다.

상기 아이에미아씨에와(Iamiaceae)과에 속하는 KERA-3 균주를 배양하기 위한 배양용 배지 및 배양 조건은 통상의 지식을 가진 자가 적절하게 선택하거나 변형하여 이용할 수 있다.

본 명세서에서 용어 "파쇄액"은 균주 자체를 화학적 또는 물리적 힘에 의하여 균주의 세포벽을 파쇄하여 얻은 산물을 의미할 수 있다.

본 명세서에서 용어 "배양액 추출물"은 상기 배양액 또는 그의 농축액로부터 추출한 것을 의미하며, 추출액, 추출액의 희석액 또는 농축액, 추출액을 건조하여 얻어지는 건조물, 또는 이들 조정제물 또는 정제물, 이를 분획한 분획물을 포함할 수 있다.

또 다른 양상은 상기 균주, 상기 균주의 파쇄액, 배양액, 또는 배양액의 추출물의 용도를 제공한다. 상세하게는, 상기 균주, 그의 파쇄액, 배양액 또는 그의 배양액의 추출물을 포함하는 조성물을 제공한다.

상기 균주의 용도는 피부 상태 개선, 피부 미용 개선, 피부 질환의 예방, 개선 또는 치료 등을 포함할 수 있다.

상기 피부 상태 개선 또는 피부 미용 개선은 피부 노화 억제 또는 개선, 항 주름, 피부 미백, 피부 장벽 강화, 또는 피부 보습일 수 있다.

본 명세서에서 용어 "피부 노화"란 나이가 들어가면서 피부에 나타나게 되는 유형과 무형상의 변화를 통틀어 말하는 것으로, 예컨대 표피 두께가 얇아지는 현상, 진피의 세포 수나 혈관 수, DNA 손상복구 능력, 세포교체주기, 상처 회복, 피부장벽기능, 표피의 수분 유지, 땀분비, 피지분비, 비타민D 생산, 물리적 손상방어, 화학물질 제거능력, 면역반응, 감각 기능, 체온조절의 감소를 말한다.

상기 균주 또는 이의 배양액은 외인성 요인 또는 내인성 요인에 의해 유발되는 피부 노화 개선용일 수 있다. 상기 외인성 요인은 여러 가지 외부 요인, 예컨대 자외선(광)을 말하고 내인성 요인은 연대기적 요인이라고도 지칭되며 주로 시간의 흐름에 의해 발생하는 요인을 말한다. 즉, 상기 피부 노화는 구체적으로는 자외선, 공해, 담배연기, 화학물질 등에 의한 외부 자극에 의해 유도되는 조기 노화 증상 뿐만 아니라, 나이가 들어감에 의해 피부세포의 증식이 감소함에 따라 발생하는 자연노화 현상을 포함하며 주름, 탄력 감소, 피부 쳐짐 및 건조 현상 등을 모두 포함하는 개념이다. 또한 주름은 내ㆍ외부 요인의 변화에 의한 자극이 피부조직을 구성하고 있는 성분을 변화시켜 주름을 유발하는 것을 포함한다.

상기 노화는 광노화일 수 있다. 용어 "광노화(Photoaging)"는 외부 환경적인 요인에 의해 유발되는 현상으로, 가장 대표적인 인자로는 자외선이 있다. 자외선은 단백질 분해효소의 활성화와 기질단백질의 사슬절단 및 비정상적인 교차결합 등의 생체 구성 성분들의 손상을 가져오고, 이러한 메커니즘의 반복은 외관상으로도 확연한 피부노화를 초래하게 된다.

본 명세서에서 용어 "주름"은 피부의 탄력성이 상실되어 느슨해진 상태를 의미하며, 예를 들면 피부가 접히는 것일 수 있다. 상기 "피부 주름 예방 또는 개선"이란 주름과 관련된 인자의 발현을 억제하여 주름을 방지 또는 개선하거나, 콜라겐 총량을 증가시키는 모든 작용을 의미할 수 있다.

상기 "피부 장벽 강화"는 피부 가장 바깥쪽에 위치하여 수분과 영양 손실을 막아주는 피부 장벽의 기능이 증진되는 모든 작용을 의미할 수 있다.

상기 "피부 보습"은 피부 수분을 유지하거나 수분 손실을 방지하는 모든 작용을 의미할 수 있다.

상기 "피부 질환"은 피부 장벽 기능 손상에 의한 질환, 피부 노화, 피부 상처, 피부 흉터, 또는 피부 염증일 수 있다. 용어, "예방"은 질병의 발생을 억제하는 것을 포함한다. 용어, "치료"는 질병의 발전의 억제, 경감, 또는 제거를 포함한다.

상기 피부 장벽 기능 손상은 피부 장벽의 기능이 저하되거나 손상되어 피부에 나타나는 모든 변화를 의미할 수 있다. 예를 들어, 피부 주름 증가, 건조, 피부염, 아토피 피부염, 알레르기성 피부염, 여드름 등을 포함할 수 있다.

또 다른 구체예에 있어서, 상기 균주는 피부 개선 효과를 갖는 다른 아이에미아씨에와(Iamiaceae)에 속하는 균주와 함께 사용되어 시너지 효과를 나타낸 것일 수 있다. 상기 아이에미아씨에와과에 속하는 균주는 예를 들어, 데저티모나스(Desertimonas) 속(예를 들어, 데저티모나스 플라바(Desertimonas flava)), 일루마토박터(Ilumatobacter) 속(예를 들어, 일루마토박터 코씨니우스(Ilumatobacter coccineus), 일루마토박터 플루미니스(Ilumatobacter fluminis), 일루미박터 노나미엔시스(Ilumatobacter nonamiensis) 등을 포함할 수 있다.

상기 조성물은 조성물 총 중량에 대하여 0.001 중량% 내지 80 중량%, 예를 들면, 0.01 중량% 내지 60 중량%, 0.01 중량% 내지 40 중량%, 0.01 중량% 내지 30 중량%, 0.01 중량% 내지 20 중량%, 0.01 중량% 내지 10 중량%, 0.01 중량% 내지 5 중량%, 0.05 중량% 내지 60 중량%, 0.05 중량% 내지 40 중량%, 0.05 중량% 내지 30 중량%, 0.05 중량% 내지 20 중량%, 0.05 중량% 내지 10 중량%, 0.05 중량% 내지 5 중량%, 0.1 중량% 내지 60 중량%, 0.1 중량% 내지 40 중량%, 0.1 중량% 내지 30 중량%, 0.1 중량% 내지 20 중량%, 0.1 중량% 내지 10 중량%, 또는 0.1 중량% 내지 5 중량%의 균주, 이의 파쇄액, 배양액, 또는 이의 배양액의 추출물을 포함할 수 있다. 이때, 균주, 이의 파쇄액, 배양액, 또는 이의 배양액의 추출물의 함량이 상기 범위 미만인 경우, 피부 상태 개선 효과, 예를 들면, 피부 노화 억제, 피부 미백, 피부 장벽 강화, 피부 주름 억제, 또는 피부 보습 효과가 충분히 발휘되지 않는다는 문제점이 있다.

본 명세서에서 용어, "유효성분으로 포함"은 상기에서 언급한 효과를 나타낼 수 있는 정도로 본 명세서의 균주, 이의 파쇄액, 배양액, 또는 이의 배양액의 추출물이 첨가되는 것을 의미하고, 약물전달 및 안정화 등을 위하여 다양한 성분을 부성분으로 첨가하여 다양한 형태로 포뮬레이션 (formulation)되는 것을 포함하는 의미이다.

상기 조성물은 화장료 조성물일 수 있다.

상기 화장료 조성물은 예를 들면, 유연화장수, 영양화장수, 마사지크림, 영양크림, 에센스, 팩, 젤, 앰플 또는 피부 점착 타입의 화장료 제형을 갖는 것일 수 있다.

상기 화장료 조성물에 포함되는 성분은 유효성분으로서 상기 조성물 이외에 화장료 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함할 수 있으며, 예를 들면, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제 및 담체를 포함할 수 있다.

또한, 상기 조성물은 피부외용제용 조성물일 수 있다.

본 명세서에서, 상기 피부외용제는 크림, 겔, 연고, 피부 유화제, 피부 현탁액, 경피전달성 패치, 약물 함유 붕대, 로션, 또는 그 조합일 수 있다. 상기 피부외용제는 통상 화장품이나 의약품 등의 피부외용제에 사용되는 성분, 예를 들면 수성성분, 유성성분, 분말성분, 알코올류, 보습제, 증점제, 자외선흡수제, 미백제, 방부제, 산화방지제, 계면활성제, 향료, 색제, 각종 피부 영양제, 또는 이들의 조합과 필요에 따라서 적절하게 배합될 수 있다. 상기 피부외용제는, 에데트산이나트륨, 에데트산삼나트륨, 시트르산나트륨, 폴리인산나트륨, 메타인산나트륨, 글루콘산 등의 금속봉쇄제, 카페인, 탄닌, 벨라파밀, 감초추출물, 글라블리딘, 칼린의 과실의 열수추출물, 각종생약, 아세트산토코페롤, 글리틸리틴산, 트라넥삼산 및 그 유도체 또는 그 염등의 약제, 비타민 C, 아스코르브산인산마그네슘, 아스코르브산글루코시드, 알부틴, 코지산, 글루코스, 프룩토스, 트레할로스 등의 당류등도 적절하게 배합할 수 있다.

다른 구체예에 있어서, 상기 조성물은 약학적 조성물일 수 있다.

상기 약학적 조성물은 약제학적으로 허용가능한 희석제 또는 담체를 추가적으로 포함할 수 있다. 상기 희석제는 유당, 옥수수 전분, 대두유, 미정질 셀룰로오스, 또는 만니톨, 활택제로는 스테아린산 마그네슘, 탈크, 또는 그 조합일 수 있다. 상기 담체는 부형제, 붕해제, 결합제, 활택제, 또는 그 조합일 수 있다. 상기 부형제는 미결정 셀룰로오즈, 유당, 저치환도 히드록시셀룰로오즈, 또는 그 조합일 수 있다. 상기 붕해제는 카르복시메틸셀룰로오스 칼슘, 전분글리콜산 나트륨, 무수인산일수소 칼슘, 또는 그 조합일 수 있다. 상기 결합제는 폴리비닐피롤리돈, 저치환도 히드록시프로필셀룰로오즈, 히드록시프로필셀룰로오즈, 또는 그 조합일 수 있다. 상기 활택제는 스테아린산 마그네슘, 이산화규소, 탈크, 또는 그 조합일 수 있다.

상기 약학적 조성물은 경구 또는 비경구 투여 제형으로 제형화될 수 있다. 경구 투여 제형은 과립제, 산제, 액제, 정제, 캅셀제, 건조시럽제, 또는 그 조합일 수 있다. 비경구 투여 제형은 주사제일 수 있다.

상기 조성물은 건강기능식품 조성물일 수 있다.

상기 건강기능식품 조성물은 상기 균주 또는 이의 배양액 단독 또는 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효 성분의 혼합양은 사용 목적 (예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 식품 또는 음료의 제조시에 본 명세서의 조성물은 원료에 대하여 15 중량부 이하의 양으로 첨가될 수 있다. 상기 건강기능식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 건강기능식품의 종류 중 음료 조성물은 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상기 천연 탄수화물은 포도당, 과당과 같은 모노사카라이드, 말토스, 슈크로스와 같은 디사카라이드, 및 덱스트린, 사이클로덱스트린과 같은 폴리사카라이드, 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 감미제로서는 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 감미제나, 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있다. 상기 건강식품 조성물은 또한 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제, 또는 그 조합을 함유할 수 있다. 상기 건강기능식품 조성물은 또한, 천연 과일쥬스, 과일쥬스 음료, 야채 음료의 제조를 위한 과육, 또는 그 조합을 함유할 수 있다.

또한, 다른 양상은 유효한 양의 상기한 조성물을 그를 필요로 하는 개체에 처리 또는 투여하는 단계를 포함하는 개체의 상태를 예방, 개선, 또는 치료하는 방법을 제공한다.

상기 개체의 상태는 피부와 관련된 상태, 또는 염증과 관련된 상태일 수 있다.

본 명세서에서 용어, "투여하는", "도입하는", 및 "이식하는"은 상호교환적으로 사용되고 일 구체예에 따른 조성물의 원하는 부위로의 적어도 부분적 국소화를 초래하는 방법 또는 경로에 의한 개체 내로의 일 구체예에 따른 조성물의 배치를 의미할 수 있다.

투여는 당업계에 알려진 방법에 의하여 투여될 수 있다. 투여는 예를 들면, 정맥내, 근육내, 경구, 경피 (transdermal), 점막, 코안 (intranasal), 기관내 (intratracheal) 또는 피하 투여와 같은 경로로, 임의의 수단에 의하여 개체로 직접적으로 투여될 수 있다. 상기 투여는 전신적으로 또는 국부적으로 투여될 수 있다.

상기 개체는 포유동물, 예를 들면, 사람, 소, 말, 돼지, 개, 양, 염소, 또는 고양이일 수 있다. 상기 개체는 피부미용 개선, 예를 들어 피부 보습, 피부 장벽 강화, 피부 염증 억제, 피부 주름 개선 효과를 필요로 하는 개체일 수 있다.

상기 투여는 일 구체예에 따른 조성물을 개체당 일당 0.1 ㎎ 내지 1,000 ㎎, 예를 들면, 0.1 ㎎ 내지 500 ㎎, 0.1 ㎎ 내지 100 ㎎, 0.1 ㎎ 내지 50 ㎎, 0.1 ㎎ 내지 25 ㎎, 1 ㎎ 내지 1,000 ㎎, 1 ㎎ 내지 500 ㎎, 1 ㎎ 내지 100 ㎎, 1 ㎎ 내지 50 ㎎, 1 ㎎ 내지 25 ㎎, 5 ㎎ 내지 1,000 ㎎, 5 ㎎ 내지 500 ㎎, 5 ㎎ 내지 100 ㎎, 5 ㎎ 내지 50 ㎎, 5 ㎎ 내지 25 ㎎, 10 ㎎ 내지 1,000 ㎎, 10 ㎎ 내지 500 ㎎, 10 ㎎ 내지 100 ㎎, 10 ㎎ 내지 50 ㎎, 또는 10 ㎎ 내지 25 ㎎을 투여하는 것일 수 있다. 다만, 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성별, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있고, 당업자라면 이러한 요인들을 고려하여 투여량을 적절히 조절할 수 있다. 투여 횟수는 1일 1회 또는 임상적으로 용인가능한 부작용의 범위 내에서 2회 이상이 가능하고, 투여 부위에 대해서도 1개소 또는 2개소 이상에 투여할 수 있으며, 매일 또는 2 내지 5일 간격으로 총 투여 일수는 한번 치료 시 1일에서 30일까지 투여될 수 있다. 필요한 경우, 적정 시기 이후에 동일한 치료를 반복할 수 있다. 인간 이외의 동물에 대해서도, kg당 인간과 동일한 투여량으로 하거나, 또는 예를 들면 목적의 동물과 인간과의 기관(심장 등)의 용적비(예를 들면, 평균값) 등으로 상기의 투여량을 환산한 양을 투여할 수 있다.

일 양상에 따른 신규 아이에미아씨에와과 균주는 다른 도는 동일 과의 다른 속의 균주와 비교하여 계통분류학적, 화학분류학적으로 구분된 특성을 갖는다. 또한, 상기 균주 또는 그의 배양액은 피부 관련 상태의 예방, 개선 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 KERA-3의 계통 분류 결과를 나타낸 도면이다.
도 2는 KERA-3의 형태학적 특성을 확인한 결과이다.
도 3은 인간 각질세포에서 KERA-3 균주가 필라그린의 발현에 미치는 영향을 나타낸 결과이다.
도 4는 인간 각질세포에서 KERA-3 균주가 HAS-3의 발현에 미치는 영향을 나타낸 결과이다.
도 5는 인간 각질세포에서 KERA-3 균주가 ABCA12의 발현에 미치는 영향을 나타낸 결과이다.
도 6은 인간 각질세포에서 KERA-3 균주가 ELOVL4의 발현에 미치는 영향을 나타낸 결과이다.
도 7은 인간 각질세포에서 KER-3 균주가 CERS3의 발현에 미치는 영향을 나타낸 결과이다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

[실시예]

실시예 1. 균주의 분리

건강한 성인의 피부를 멸균 증류수로 세척하여 확보된 샘플(human epidermal keratinocyte)을 1/10 희석된 R2A(Reasoner's 2A) 배지(Becton Dickinson, Cockeysville, MD)에 접종하였다. 접종 후 240시간 동안 30℃ 인큐베이터에서 배양 한 뒤 형성된 집락 100개를 순수 분리 배양하여, 240시간 동안 30℃ 인큐베이터에서 재배양 하였다. 배양이 완료된 집락에 대하여 16s rRNA 유전자 서열 동정을 실시하였다. 이때 사용된 프라이머는 박테리아에만 반응하여 증폭하도 록 고안(서열번호 2 및 3)되었다. PCR 증폭은 95℃ 1분, 55℃ 1분, 75℃ 1분30초씩 30 사이클로 실시하였으며, 마지막으로 72℃ 에서 8분간 처리한 후 4℃에서 보관하였다. PCR 반응이 끝난 뒤 분리 배양된 종들의 DNA 서열은 ABI-3730XL(ABI, USA)를 이용하여 결정하였다. 분리 배양된 미생물 집락 중 결정된 16s rRNA부위의 염기서열을 미국 국립생물정보센터(NCBI, National Center for Biotechnology Information) 홈페이지에서 제공되는 BLAST 프로그램으로 등록된 다른 균주들과 비교 분석하였다. 상동성 97% 이하의 신규성 있는 종들만 선별하여 사용하였고, 그 중 상동성 94% 이하의 신규 미생물(이하 "KERA-3"이라 함)을 선별하였다. KERA-3은 서열번호 1(complementary DNA)의 16s rRNA 서열을 갖는다.

실시예 2. 신규 미생물의 분류학적 성질 및 균학적 성질 확인

2-1. 분류학적 성질

16s rRNA 유전자에 대한 상동성 분석은 Ezbiocloud server를 사용하여 계산하였다. 서열 데이터는 및 계통 분석은 MEGA-X를 사용하여 수행하였다. 계통수(phylogenetic trees)는 Neighbor-joining 분석 (Sitou and Nei (1987)), maximum-likelihood 및 maixmum-parsimony 알고리즘을 사용하여 그려졌고, bootstrap 분석(1000 replication)(Felsenstein 1985)을 사용하여 계통수의 안정성을 평가하였다.

그 결과, KERA-3은 엑티노마리니콜라 트로피카(Actinomarinicola tropica) SCSIO 58843, 아퀴해비탄스 대청엔시스(Aquihabitans daechungensis) CH22-21, 아이에미아 마자노하멘시스(Iamia majanohamensis) F12, 일루마토박터 플루미니스(Ilumatobacter fluminis) YM22-133와 각각 90.94%, 90.39%, 89.56%, 89.20%의 상동성을 갖는 것을 확인하였다.

도 1은 KERA-3의 계통 분류 결과를 나타낸 도면이다.

도 1에 나타낸 바와 같이, KERA-3는 이제까지 보고된 바 없는 아이에미아씨에와(Iamiaceae)과에 속하는 신규 속임을 확인하였다.

2-2. 균학적 성질

2-2-1. 형태학적 성질

KERA-3의 형태학적 특성은 다음과 같이 분석하였다.

먼저, KERA-3의 세포 형태는 R2A에서 25℃에서 5일 동안 배양한 후, 현미경(현미경(Olympus microscope, GX71)을 사용하여 1000 배율에서 관찰하였다

균주의 활동성(motility)은 배양한 신선한 KERA-3 세포를 0.3% agar slant 배지에 접종하여 평가하였다.

SEM(Scanning Electron Microscopy)을 관찰하기 위하여 시료를 다음과 같이 전처리 하였다. R2A(Becton Dickinson, Cockeysville, MD) 고체 배지에 EPI-7을 접종하고 5일간 배양 뒤 형성된 콜로니에 막 필터 (membrane filter)를 부착시켰다. 콜로니가 부착된 막 필터를 분리하여 2.5% 글루타알데하이드 (glutaraldehyde) 용액에 2시간 동안 처리하여 고정한 후, PBS로 5분씩 담가서 세척하였다. 이후, 2% 오스뮴 테트록시드(osmium tetroxide) 용액에 1시간 동안 처리하고 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100% 에탄올을 이용하여 탈수 처리하였다. 탈수 처리가 완료된 시료에 잔류하는 에탄올을 제거하기 위해 이소아밀아세테이트(Isoamylacetate)를 사용하여 제거하였다. 전처리가 완료된 샘플은 자연건조를 시키고, 스퍼터 코팅기(SC502, Polaron)로 금으로 코팅하였다. 이 후에, 이를 SEM(Hitachi S4300N, Hitachi, Japan)로 10000배율로 촬영하였고, 그 결과를 도 2에 나타내었다.

그람 양성 음성 판별을 위해 다음과 같은 방법으로 실험을 진행하였다. 구체적으로, R2A 고체배지를 사용하여 잘 배양된 KERA-3 콜로니 하나를 수집하여 슬라이드글라스에 고정하였다. 슬라이드글라스를 완전 건조 시킨 뒤 크리스탈 바이올렛으로 1~2분간 염색하고 흐르는 물에 세척하여 다시 건조 시켰다. 건조된 슬라이드를 다시 요오드-요오드화칼륨에 1분간 염색시켰다. 이후, 에틸알코올을 이용하여 탈색시켜주고 슬라이드를 흐르는 물로 씻어준 뒤 건조시켰다. 그람 양성 및 음성을 판별하기 위해 사프라닌 등 붉은색 계통의 염색약으로 1~3분간 2차 염색을 하고 물에 씻은 뒤 현미경(Olympus microscope, GX71)으로 관찰하였다.

그 결과, KERA-3은 다음과 같은 형태학적 특징을 가짐을 확인하였다

(1) 막대기형(rod-shaped);

(2) 비운동성(non-motile);

(3) 편모 없음;

(4) 그람 양성;

(5) 비포자 생성(non-spore forming);

(6) 세포의 길이는 0.8~1.4 ㎛이고, 직경은 0.4~0.7 ㎛이다.

(7) 콜로니 형태는 타원형이며, 흰색이다.

(8) 카탈레이즈 양성(Catalase positive)이다.

2-2-2. 배양 및 생리학적 특성

KERA-3의 배양 조건을 확인하기 위해 최적 생장온도는 4℃에서부터 50℃까지 설정하여 최적배양온도를 확인하였으며, 최적 염농도는 NaCl 0%에서 10%(w/v)까지 배지에 추가하여 25℃에서 10일간 배양하여 확인하였다. pH는 다음의 버퍼 시스템을 사용하여 확인하였다; 소듐 아세테이트/아세트산(pH<6), 트리스/HCl (pH 6 내지 9), 및 글라이신/소듐 히드록시드(pH>9).

또한, 성장 배지를 확인하기 위하여 R2A(Reasoner's 2A) 아가, TSA (Tryptic Soy Agar), NA (Nutrient Agar), LBA (Lysogeny Broth Agar)를 사용하여 25℃에서 10일간 배양하여 확인하였다.

또한, KERA-3의 물질 이용능을 확인하기 위해서 BioLog GP2, BioLog Gen III, API 20NE 및 API ZYM(biomeriuex, France)를 사용하였다. 사용 방법은 제조사에서 제공되는 매뉴얼에 따라 실시하였다. 판정의 경우 양성반응이 일어났을 때 보라색으로 발색이 일어나고, 육안으로 판정한 뒤 마이크로플레이트 비색계(Microplate spectrophotometer)를 사용하여 성장 정도를 정확하게 판정하였다. API ZYM 테스트는 25℃에서 4시간 배양 후에 판독하였고, 다른 API 테스트에서는 25℃에서 적어도 48시간 배양 후에 판독하였고, 결과를 아래 표 1에 나타내었다.

API-ZYM test
control	-
Alkaline phosphatase	-
Esterase (C4)	+
Esterase Lipase (C8)	+
Lipase (C14)	-
Leucine arylamidase	+
Valine arylamidase	-
Cystine arylamidase	-
Trypsin	-
a-chymotrypsin	-
Acid phosphatase	-
Naphtol-AS-BI-phosphohydrolase	+
α - galactosidase	-
β - galactosidase	-
β - glucuronidase	-
α - glucosidase	-
β - glucosidase	-
N -acetyl -β- glucosaminidase	-
a - mannosidase	-
a - fucosidase	-
탄소원 사용
Glucose,	+
Sucrose,	+
Pyruvate,	+
Soluble starch,	+
Xylose,	-
Galactose,	-
Mannose,	+
Mannitol,	-
Lactose,	+
Fructose	+

+: 양성, -:음성

또한, 영양원을 확인하기 위하여 최소염배지(proteose peotone 0.05%, Casamino acids 0.05%, Dipotassium phosphate, Magnesium sulfate)에 탄소원(Glucose, Sucrose, Pyruvate, Soluble starch, Xylose, Galactose, Mannose, Mannitol, Lactose, Fructose)을 별도로 0.02%(w/)가 되도록 넣어서 탄소 사용능을 확인하였다.

호기성 성장 확인은 호기배양 조건 및 혐기 배양 조건(anaerobic pack 이용)에서 배양하여 확인하였다.

DNA, 카세인, 스타치, 트윈 80, 및 카르복시메틸셀룰로우스의 분해능에 대한 시험은 25℃에서 7일 동안 배양 후에 평가하였다.

그 결과, EPI-7은 다음과 같은 배양 및 생리학적 특징을 가짐을 확인하였다.

(1) 호기성:

(2) 종속영양성:

(3) 표 1의 특성;

(4) R2A(Reasoner's 2A) 아가, TSA (Tryptic Soy Agar), NA (Nutrient Agar), LBA (Lysogeny Broth Agar)에서는 성장한다;

(5) 최적 생육배지는 R2A 배지이며, 18℃내지 37℃에서 성장(최적 25℃)하나, 이를 벗어난 온도에서는 성장하지 않는다;

(6) pH 6.0 내지 pH 8.0에서 성장하고, 0-1%의 염도(NaCl)에서 성장한다 (최적 pH: 7.0%, 최적 NaCl 농도: 0%);

(7) 질삼염은 아질산염으로 환원되지 않는다; 및

(8) 카세인, 전분, DNA, 카르복시메틸셀룰오로스, Tween 80은 분해되지 않는다.

2-2-3. 생화학적 특성

KERA-3의 DNA G+C 함량은 Illumina Miseq 장비를 이용하여 whole genome sequencing 진행하여 확인하였다. 또한, 세포 지방산 조성물(Cellular Fatty Acid composition), G+C 조성물(G+C composition), 퀴논(Quinone) 분석 시험방법 및 조건은 다음과 같다.

먼저 분리 균주의 DNA G+C 함량을 확인하기 위하여 KERA-3 세포를 다량 수득한 후, QIAamp PowerFecal Pro DNA Kit를 이용하여 사용자 메뉴얼에 따라 DNA를 추출하였다. 추출한 DNA는 유전체 분석 장비인 Miseq에 적합하게 DNA library를 제작하였으며, 이를 이용하여 전장 유전체 분석을 진행하였다. 분석이 완료된 데이터는 HGAP 3 version 2.3을 이용하여 assemble 하여 하나의 유전체로 만들어주었으며, NCBI prokaryotic genome annotation pipeline (PGAP) 파이프라인에서 Best-placed reference protein set; GeneMarkS-2+ 방법을 이용하여 하나의 전장 유전체로 만들어주었다.

분리 균주의 세포 지방산 조성은 Miller의 방법에 따라 수행하였다. 배양한 약 40 ㎎의 세포를 튜브에 옮긴 후, 50% 메탄올에 15% NaOH를 첨가한 용액 1 ㎖을 첨가하여 100℃에서 30분간 가열하여 실온에서 식혀주었다. 여기에 메탄올(methanolic)-HCl 2 ㎖ (6.0N HCl 325 ㎖ 및 메탄올 275 ㎖의 혼합 용액)을 첨가하여 80℃에서 10분간 가열한 뒤 급냉 하였다. 이후, 1.25 ㎖의 헥산/메틸-터트-부틸에테르(hexane/methyl-tert-butylether)(1:1, v/v)을 넣고 10분간 잘 섞어주었다. 실온에 정치한 후 반응액이 2개의 층으로 분리되면 하등액만을 제거하고 3 ㎖의 dilute NaOH(10.8g NaOH/900㎖ D.W)를 첨가하여 10분간 잘 섞어준 후 실온에 정치하였고, 상등액의 2/3 정도를 바이알(screw-capped sample vial)(12 X 32mm, Agilent technologies)로 옮겨 캡핑(capping) 하여 시료로 사용하였다. 시료는 셜록 MIS 소프트웨어(Sherlock MIS Software)의 표준 프로토콜에 따라 사포닌화, 메틸화 및 추출되었다. 지방산은 아질런트 테크놀로지스 6890 가스 크로마토그래피(Agilent technologies 6890 Gas chromatography)와 A30m X 0.320mm X 0.25㎛ 가교 메틸 실록산 컬럼(Crosslinked Methyl siloxane column) (HP-1)을 사용하여 분석하였으며, MIS 패키지의 TSBA40 데이터베이스(MIDI, Version 4.5)를 사용하여 확인하였다. 모든 실험은 최소 3번 수행하였고, 그 결과를 하기 표 2에 나타내었다.

Fatty Acids(%)
Saturated Fatty acid
C_10:0	ND
C_12:0	0.47
C_14:0	1.17
C_16:0	46.82
C_17:0	3.75
C_18:0	6.81
C_19:0	1.40
C_20:0	3.21
Unsaturated Fatty acids
C_15:1 ω6c	ND
C_16:1 ω5c	2.72
C_17:1 ω6c	ND
C_17:1 ω8c	ND
C_18:1 ω5c	ND
C_18:1 ω9c	12.62
C_20:1 ω9c	6.24
Branched -chain fatty acid
C_16:0iso	4.22
C_16:1iso H	ND
C_18:0 iso	1.17
C_18:1iso H	ND
C_17:1 anteiso ω9c	0.55
C_17:0 10-methyl	ND
C_18:1 ω7c 11-methyl	ND
Hydroxy fatty acids
C_16:0 3OH	1.43
Cyclo
C_19:0 cyclo ω8c	ND
Other
C_12:1 at 11-12	0.55
C_13:1 at 12-13	3.96
Summed feature
2;C_14:0 3OH/C_16:1 iso I	2.13
3; C_16:1 ω7c/C_16:1 ω6c	0.76
8; C_18:1 ω7c/C_18:1 ω6c
Total	99.98

퀴논은 다음과 같이 분석하였다. 균주를 25℃에서 96시간 동안 R2A 배지에서 배양한 후, 균체만 모아서 동결건조를 수행하였다. 동결건조된 샘플을 다음조건으로 추출하였다. 클로로폼:메탄올 (2:1)용액을 첨가하여 3 내지 4시간 동안 흔들어주었다. 필터지(whatman No.2)를 이용하여 필터링을 하여 세포를 제거하였고, 여과된 용액을 농축시켰다. 이후에 이를 클로로폼:메탄올(8.5:1.5) 100㎕로 녹인 후, 14000rpm에서 5분 동안 원심분리한 후 상 등액을 수집하여 HPLC 분석을 수행하였다. HPLC 조건은 다음과 같다;

HPLC : YOUNG LIN YL9100 (YL9111 Binary pump)

Detector : YOUNG LIN YL9120 UV/Vis Detector

Chromatograph data system : YOUNG LIN Autochro-3000

분석컬럼 : Waters Spherisorb 5um ODS2 4.6mmx150mm column(column temp. 40℃)

분석용매 : Methanol : Isopropyl ether (4 : 1)

유속: 1.0 mL/min

검출파장 : 254 ㎜.

극성지질(polar lipid) 분석은 균주를 25 ℃에서 96시간 동안 R2A 배지에서 배양한 후 수행하였다. 우선 균주로부터 극성 지질을 Minnikin D.E. et al(1984)(J Microbiol Methods 2, 233-241)에 기재된 방법에 따라 추출하였다. 이후에 2차원 TLC 법(Komakata K et al., 1987, Methods Microbiol 19, 161-206)을 사용하여 극성지질을 동정하였다.

그 결과, KERA-3는 다음과 같은 생화학적 특징을 가짐을 확인하였다;

(1) DNA G+C 함량은 72.2 mol%이다;

(2) MK-9(H8)(9 유닛을 갖는 테트라히드로제네이티드 메나퀴논(tetrahydrogenated menaquinone with nine unit))이 검출된 이소프레노이드 퀴논이다;

(3) 주요 극성 지질은 디포스파티딜글리세롤(Diphosphatidylglycerol, DPG), 세 개의 확인되지 않은 인지질(three unidentified phosphoglycolipid, PGL), 확인되지 않은 아미노인지당지질(unidentified aminophosphoglycolipid, APGL), 및 확인되지 않은 아미노인지질(unidentified aminophospholipid, APL)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상이다; 및

(4) 표 2의 지방산 조성.

또한, 최종적으로 다른 종과의 특성을 비교 및 정리하여 하기 표 3에 나타내었다.

Characteristic

1

2

3

4

5

6

7

Cell morphology

Rod

Cocobacilli

Short rod

Rod

Short rod

Cell length (μm)

0.8~1.4

1.3~1.6

1.1

0.7~1.0

1.2-1.7

1.0-3.0

1.0-2.0

Cell with (μm)

0.4~0.7

0.4~0.5

0.7

0.3~0.5

0.5

0.3~0.6

Growth Condition

Temperature (℃)

18~37

26~31

15~37

10~37

10~45

35~43

10~45

Optimum

25

28

30

35

NaCl tolerance (w/v)

0~1.0

0~5.0

0.5

0~1.0

0~12.5

ND

0~5.0

pH range

6.0~8.0

7.0~11.0

6.0~7.0

6.0~8.0

6.0~9.0

1.4~2.0

6.0~9.0

Carbon utilization

Glucose

+

ND

-

ND

Maltose

ND

+

-

Ribose

+

-

ND

+

-

ND

Enzyme activity

Nitrate reduction

-

ND

+

-

+

ND

+

DNA G+C contents (%)

73.2

68.0

70.2

71.8

74.4

54.9

72.5

Chemotaxonomic characteristics

Major menaquinones

MK-9 (H₈)

MK-9 (H₆)
MK-9 (H₈)
MK-9 (H₄)

MK-9 (H₆)

MK-9 (H₁₀)

MK-9 (H₈)

Diaminopimelic acid(DAP)

meso-DAP

LL-DAP

meso-DAP

DD-DAP

Main polar lipids

DPG, APL APGL, PGL

ND

DPG

DPG, PI, PIM

ND

DPG, PI, PC, PIM

Major fatty acids

C16:0, C18:1w9c

Iso-C16:0(17.9),
Iso-C17:1 ω 9c(14.7),
Iso-C17:0(11.3)

C16 : 0, ,
iso-C16 : 0

16 : 1 ω 5c, 16:0,
17 : 1 ω8c ,18 : 1 ω 9c

C17:0, C17:1w8c

iso-C16 : 0,
iso-C14 : 0,
iso-C15 : 0,
ai-C15 : 0 ,C17 : 1 ω 6c.

17 : 1 ω8c, 17 : 0

1: KERA-3

2: 일루마박터 플루미니스(Ilumatobacter fluminis, YM22-133T)

3: 데저스티모나스 플라바(Desertimonas flava, SYSU D60003)

4: 아퀴하비탄스 다이춘제네시스(Aquihabitans daechungensis, KCTC19849T)

5: 이아미아 마자노하멘시스(Iamia majanohamensis, KCTC19879T)

6: 페리마이크로비움 애시디필룸(Ferrimicrobium acidiphilum, T23T)

7: 악티노마리니콜라 트로피카(Actinomarinicola tropica, KCTC49408T)

* -: 음성, +: 양성, ND: 결정되지 않음(Not Determined)

* DPG: 디포스파티딜글리세롤(diphosphatidylglycerol), PI: 포스파티딜이노시톨(phosphatidylinositol), PC: 포스파티딜콜린(phospatidylcholine), PIM: 포스파티딜이노시톨만노사이드(phosphatidylinositolmannoside), 확인되지 않은 인지질(unidentified phospholipids), PGL: 확인되지 않은 인당지질(unidentified phosphoglycolipid), APGL: 확인되지 않은 아미노인지당지지(unidentified aminophosphoglycolipid), APL: 확인되지 않은 아미노인지질(unidentified aminophospholipid)

표 3에 나타낸 바와 같이, KERA-3는 상기 표 3과 같은 특징을 가지는 것을 확인할 수 있었으며, 근현종과는 주요 생화학적 특성이 상이하며, 이러한 화학적 분류 결과의 조합은 해당 균주의 계통 분류의 결과와 함께 KERA-3가 새로운 종임을 입증한다.

이상의 결과로, 인간 상피 세포(human epidermal keratinocyte)로부터 분리된 KERA-3는 아이에미아씨에와(Iamiaceae)과에 속하는 신규 속의 미생물임을 확인하였고, 이를 계통학회 명명법에 따라 더마토박터(Dermatobacter) 속 호미니스(Hominis)이라 명명하였다. 또한, 상기 아이에미아씨에와 과에 속하는 더마토박터 호미니스(Dermatobacter Hominis) 균주를 2022년 2월 15일자로 국립농업과학원 미생물은행(Korean Agricultural Culture Collection, KACC)에 기탁하여 기탁번호 KACC 22415를 부여받았다.

실시예 3. 균주의 활성

상기 실시예 2에서 확인된 KERA-3 균주의 피부 장벽 강화 및 보습 활성을 분석하기 위해, 인간 각질 세포주(HaCaT)에서 KERA-3의 처리에 따른 피부 장벽 강화 및 보습 활성 관련 인자인 필라그린(filaggrin), HAS3(hyaluronic acid synthase3), ABCA12, ELOVL4 및 CERS3 발현량을 RT-PCR로 확인하였다.

구체적으로, 인체 각질형성 세포주(human keratinocyte)인 HaCaT 세포 및 인체유래의 Epidermal Keratinocyte 를 10% 우혈청 (fetal bovin serum)을 포함한 DMEM 배지(Dulbecco'smodified Eagle's Medium, Gibco 1210-0038)에서 배양하였고, 배양은 모두 37℃ 5% CO2 배양기에서 수행하였다. 상기 배양된 세포주에 양성 대조군으로서, 레티놀을 1mM 용량으로 처리하였다. 또한, KERA-3의 배양물은 1.0% 및 10.0%의 농도로 처리하였다. 이후, HaCaT 세포를 24시간 동안 추가로 배양한 후, 회수하여 트리졸 (RNA iso, DAKARA, 일본) 1㎖을 첨가하 여 RNA를 분리하였다. 또한, RT-PCR을 위해, Nanodrop 2000 (Thermo, USA)를 이용해 RNA를 정량한 후, 42 ℃에서 55 분, 70℃에서 15 분 동안 반응시켜 cDNA를 합성하였다(Reverse Transcriptase Mix, ELPIS biotech, 한국). RT-PCR은 Step One Plus(Applied Biosystems, 미국)를 이용하였고, 사이버그린(SYBR Green supermix,Applied Biosystems, 미국)을 프라이머 및 cDNA와 함께 첨가하여 94℃에서 5분 동안 중합효소를 활성 화한 후, 95℃ 30초, 54℃ 1분, 72℃ 1분간 40 사이클로 중합반응 하였다.

도 3은 인간 각질세포에서 KERA-3 균주가 필라그린의 발현에 미치는 영향을 나타낸 결과이다.

도 4는 인간 각질세포에서 KERA-3 균주가 HAS-3의 발현에 미치는 영향을 나타낸 결과이다.

도 5는 인간 각질세포에서 KERA-3 균주가 ABCA12의 발현에 미치는 영향을 나타낸 결과이다.

도 6은 인간 각질세포에서 KERA-3 균주가 ELOVL4의 발현에 미치는 영향을 나타낸 결과이다.

도 7은 인간 각질세포에서 KER-3 균주가 CERS3의 발현에 미치는 영향을 나타낸 결과이다.

그 결과, 도 3 내지 7에 나타낸 바와 같이, KERA-3 배양액(실시예 1)은 무처리 대조군 및 KERA-3 배양 배지(비교예 1)과 비교하여 필라그린, HAS3, ABCA12, ELOVL4 및 CERS3의 발현이 현저하게 높은 것을 확인할 수 있었다.

따라서, 일 구체예에 따른 신규 아이에미아씨에와 과에 속하는 균주는 피부 노화 억제 또는 개선, 항 주름, 피부 장벽 강화, 또는 피부 보습과 같은 피부 상태 개선에 사용될 수 있다.

전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.

농업생명공학연구원

KACC22415

20220215

SEQUENCE LISTING <110> Cosmax, INC. <120> Novel Iamiaceae bacteria microorgamism and uses thereof <130> PN143323 <160> 3 <170> PatentIn version 3.2 <210> 1 <211> 1411 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> KERA-3 16s rRNA <400> 1 gcctaacaca tgcaagtcga acgaggtcca tgggagcttg ctcccggaag acctagtggc 60 gaacgggtga gtaacacgtg agaaacctgc cctggagtgg ggaataactc ggggaaactc 120 gagctaatac cgcataccct cggatggtcg catggccgac cgaggaaaga ttcatcgctc 180 taggagggtc tcgcggccta tcagctagtt ggtggggtaa cggcctacca aggcaacgac 240 gggtagctgg tttgagagaa cgatcagcca cactgggact gagacacggc ccagactcct 300 acgggaggca gcagtgggga atcttgcgca atgggcgaaa gcctgacgca gcaacgccgc 360 gtgcgggatg acggccttcg tggttgtaaa ccgctttcag cagggacgaa aatgacggta 420 cctgcagaag aagccccggc taactacgtg ccagcagccg cggtaatacg tagggggcaa 480 gcgttgtccg gattcattgg gcgtaaagag ctcgtaggcg gttcagtaag tcgggtgtga 540 aagctccgag ctcaactcgg agaggccacc cgatactgct gtgacttgag tccagtagag 600 gagcgtggaa ctcctggtgt agcggtggaa tgcgcagata tcaggaagaa cacctgcatg 660 cgaaggcggc gctctgggct ggaactgacg ctgaggagcg aaagcgtggg tagcaaacag 720 gattagatac cctggtagtc cacgccgtaa acgttgggca ctaggtgtgg ggagccgtca 780 acgctctccg tgccgtagct aacgcattaa gtgccccgcc tggggagtac ggccgcaagg 840 ctaaaactca aaggaattga cgggggcccg cacaagcggc ggagcatgtt gcttaattcg 900 aggcaacgcg aagaacctta cctaggttga actatgcagg aaaagccaca gagatgtggt 960 gtccttcggg gcctgcgata ggtggtgcat ggctgtcgtc agctcgtgtc gtgagatgtt 1020 gggttaagtc ccgcaacgag cgcaaccctt atcctatgtt gccagcgcgt aatggcgggg 1080 actcgtagga gactgccggg gtcaactcgg aggaaggtgg ggacgacgtc aagtcatcat 1140 gccccttatg tctagggctg caaacatgct acaatggccg gtacagaggg ctgcgaaacc 1200 gcgaggtcga gcgaatccca aaaagccggt ctcagttcgg attgaagtct gcaactcgac 1260 ttcatgaagc tggagtcgct agtaatcccg gatcagcaac gccggggtga atacgttccc 1320 gggccttgta cacaccgccc gtcacaccac gaaagttggc aacacccgaa gtcagtggcc 1380 gaaccctctg gggcggagct gccgaaggtg g 1411 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Forward primer <400> 2 agagtttgat cmtggctcag 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Reverse primer <400> 3 ggttaccttg ttacgacttc 20

Claims

아이에미아씨에와(Iamiaceae) 과에 속하고, 하기의 균학적 성질을 갖는 신규 더마토박터 호미니스(Dermatobacter Hominis) 균주;
(1) 막대기형(Rod-Shaped);
(2) 비운동성(Non-motile);
(3) 그람 양성; 및
(4) 비포자 생성(non-motile).
청구항 1에 있어서, 상기 균주는 하기의 균학적 성질 중 어느 하나를 더 갖는 것인 균주;
(1) DNA G+C 함량은 72.2 mol%이다;
(2) MK-9(H8)(9 유닛을 갖는 테트라히드로제네이티드 메나퀴논(tetrahydrogenated menaquinone with nine unit))이 검출된 이소프레노이드 퀴논이다; 및
(3) 주요 극성 지질은 디포스파티딜글리세롤(Diphosphatidylglycerol, DPG), 세 개의 확인되지 않은 지질(three unidentified phosphoglycolipid, PGL), 확인되지 않은 아미노인지당지질(unidentified aminophosphoglycolipid, APGL), 및 확인되지 않은 아미노인지질(unidentified aminophospholipid, APL)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상이다.
청구항 1에 있어서, 상기 균주는 하기의 균학적 성질 중 어느 하나 이상을 갖는 것인 균주;
(1) 세포의 길이는 0.8~1.4 ㎛이고, 직경은 0.4~0.7 ㎛이다;
(2) 콜로니 형태는 타원형이며, 흰색이다;
(3) R2A(Reasoner's 2A) 아가, TSA (Tryptic Soy Agar), NA (Nutrient Agar), LBA (Lysogeny Broth Agar)에서는 성장한다;
(4) R2A 배지의 18℃ 내지 37℃ 에서 성장(최적 25℃)하나, 이를 벗어난 온도에서는 성장하지 않는다;
(5) pH 6.0 내지 pH 8.0에서 성장하고, 0~1%의 염도(NaCl)에서 성장한다 (최적 pH: 7.0%, 최적 NaCl 농도: 0%);
(6) 질삼염은 아질산염으로 환원되지 않는다;
(7) 카탈레이즈 양성(Catalase positive)이다;
(8) 카세인, 전분, DNA, 셀룰오로스, Tween 80은 분해하지 않는다; 및
(9) 표 1 내지 3에 기재된 특성을 갖는다.
청구항 1에 있어서, 상기 균주는 더마토박터(Dermatobacter) 속 호미니스(Hominis)인 것인 균주.
청구항 4에 있어서, 상기 더마토박터 호미니스(Dermatobacter Hominis)는 서열번호 1로 표시되는 염기서열을 포함하는 16sRNA 서열을 갖는 것인 균주.
청구항 4에 있어서, 상기 더마토박터 호미니스(Dermatobacter Hominis)는 기탁번호 KACC22415로 기탁된 것인 균주.
청구항 1의 균주의 파쇄물, 배양액, 또는 배양액의 추출물.
청구항 7에 있어서, 상기 배양액은 균주를 배양하여 수득된 배양액 자체 또는 그의 농축물 또는 동결건조물, 또는 배양액으로부터 균주를 제거하여 수득된 배양 상층액, 그의 농출물 또는 동결건조물인 것인 배양액.
아이에미아씨에와(Iamiaceae) 과에 속하는 더마토박터 호미니스(Dermatobacter Hominis) 균주, 그의 파쇄액, 배양액, 배양액의 추출물 또는 이들의 혼합물을 포함하는 화장료 조성물.
청구항 9에 있어서, 피부 장벽 강화, 피부 노화 예방 또는 개선용, 피부 보습 또는 피부 탄력용인 것인 화장료 조성물.
아이에미아씨에와(Iamiaceae) 과에 속하는 더마토박터 호미니스(Dermatobacter Hominis) 균주, 그의 파쇄액, 배양액, 배양액의 추출물 또는 이들의 혼합물을 포함하는 피부 상태의 예방, 개선 또는 치료용 피부 외용제 조성물.
아이에미아씨에와(Iamiaceae) 과에 속하는 더마토박터 호미니스(Dermatobacter Hominis) 균주, 그의 파쇄액, 배양액, 배양액의 추출물 또는 이들의 혼합물을 포함하는 건강기능식품 조성물.