DE602005003507T2

DE602005003507T2 - Aus Kefirkörnern abgetrennter Mikroorganismus, Mikroorganismenkultur, die durch Kultur dieses Mikroorganismus oder diesen einschließenden Mikroorganismen erhalten wurde, und Produkt, das solche Mikroorganismen oder Mikroorganismenkulturen verwendet

Info

Publication number: DE602005003507T2
Application number: DE602005003507T
Authority: DE
Inventors: Kazunori Takeda
Original assignee: KK Yonezawa Biru Shisutemu Sabisu Hakusan; YONEZAWA BIRU SHISUTEMU SABISU
Current assignee: CARROZZERIA JAPAN CO.,LTD.,, TOKIO, JP
Priority date: 2004-06-14
Filing date: 2005-06-03
Publication date: 2008-07-03
Anticipated expiration: 2025-06-04
Also published as: JP2005348698A; EP1607476B1; CY1107129T1; HK1084416A1; PT1607476E; DE602005003507D1; PL1607476T3; ES2296006T3; US20060002909A1; EP1607476A1; DK1607476T3; SI1607476T1

Description

[TECHNISCHES GEBIET DER ERFINDUNG]
Diese Erfindung betrifft einen antioxidativen Mikroorganismus, der von einer natürlichen Substanz abstammt, der als Rohmaterial verwendet wird oder zu Getränken, Lebensmitteln, Kosmetika oder Tierfuttern zugesetzt wird, dadurch deren Verschlechterung durch Oxidation verhindert und aktive Sauerstoffe und Freie Radikale abfängt oder deren Erzeugung verhindert, die in vivo von Menschen und Tieren erzeugt werden, die solche Getränke, Lebensmittel, Kosmetika oder Tierfutter verwenden. Die Erfindung betrifft ebenfalls eine Mikroorganismenkultur, die durch die Kultur des Mikroorganismus oder von Mikroorganismen, die diesen einschließen, erhalten wird. Die Erfindung betrifft weiter Getränke, Lebensmittel, Kosmetika und Tierfutter, die solche Mikroorganismen oder Mikroorganismenkulturen verwenden.
[STAND DER TECHNIK]
Lebensstil-bezogene Erkrankungen, wie etwa maligne Neoplasmen (Krebs), Hirngefäßerkrankungen und Diabetes gehören in den letzten Jahren zu den Haupttodesursachen. Die Hauptgründe für Lebensstil-bezogene Erkrankungen umfassen aktive Sauerstoffe und Freie Radikale. Es gibt unterschiedliche Arten von Antioxidantien: jene, die Getränken, Lebensmitteln, Kosmetika und Tierfuttern zugesetzt werden, um ihre Verschlechterung zu verhindern und ihre Qualität zu bewahren; und jene, die verwendet werden, um aktive Sauerstoffe und Freie Radikale, die in vivo erzeugt werden, abzufangen oder deren Erzeugung zu verhindern.
Wenn Öle und Fette, die in einem Getränke-, Lebensmittel-, Kosmetik- oder Tierfutterprodukt enthalten sind, oxidiert werden, beeinträchtigen sie nicht nur die Farbe und das Aroma des Produkts, sondern bewirken ebenfalls, dass die Farbe des Produkts braun wird oder ausbleicht und sein Nährwert abnimmt. Aus diesem Grund werden viele Getränke, Lebensmittel, Kosmetika und Tierfutter mit Antioxidantien versetzt, um ihre Qualität zu bewahren.
Antioxidantien, die für solche Zwecke in den Gebieten von Getränken, Lebensmitteln und Tierfuttern verwendet werden, umfassen natürliche Antioxidantien, wie etwa L-Ascorbinsäure (Vitamin C), Erythorbat (Isoascorbinsäure) und Tocopherol (Vitamin E) sowie phenolische synthetische Antioxidantien, wie etwa Di-n-butylhydroxytoluol (BHT) und butyliertes Hydroxyanisol (BHA).
[OFFENBARUNG DER ERFINDUNG]
[DURCH DIE ERFINDUNG ZU LÖSENDE AUFGABEN]
L-Ascorbinsäure ist in Wasser leicht löslich und wird häufig wegen ihrer starken Oxido-Reduktionseigenschaften verwendet. Sie lässt sich jedoch schwierig in Speiseöl und – fett verwenden, da ihre Säure (Azidität) den Geschmack des Lebensmittels verändert. Aus diesem Grund ist die Verwendung von L-Ascorbinsäure auf verarbeitete Früchte und Essigfrüchte (Pickles) usw. eingeschränkt. Tocopherole werden häufig verwendet, da sie eine unnötige Oxidation von Ölbestandteilen verhindern können. Ihre antioxidativen Eigenschaften sind jedoch nicht sehr stark, so dass sie in Kombination mit anderen Antioxidantien verwendet werden müssen.
Natürliche Antioxidantien sind im Allgemeinen synthetischen Antioxidantien hinsichtlich ihrer antioxidativen Eigenschaften unterlegen. Während synthetische Antioxidan tien wie etwa Di-n-butylhydroxytoluol (BHT) und butyliertes Hydroxyanisol (BHA) starke antioxidative Eigenschaften aufweisen, werden sie auf der anderen Seite wegen ihrer krebsinduzierenden Eigenschaften, wie sie durch Genschädigung, Mutagenität und abnormale Chromosomen veranschaulicht werden, für fragwürdig gehalten. Ihre Sicherheit ist in Frage gestellt worden.
Sowohl natürliche als auch synthetische Antioxidantien werden in Kosmetika verwendet, um die Oxidation von Ölen und Fetten zu verhindern, die darin verwendet werden. Diese Antioxidantien werden jedoch als nachteilig für die Haut betrachtet; sie verursachen raue Haut. Ihre Sicherheit ist ebenfalls in Frage gestellt worden.
Aus diesem Grund ist die Entwicklung eines Antioxidans erwünscht, das starke antioxidative Eigenschaften aufweist, sehr vielseitig ist und von einer natürlichen Substanz abstammt.
Natürliche Substanzen, über die berichtet wurde, dass sie antioxidative Eigenschaften aufweisen, umfassen Bräunungssubstanzen, Aminosäuren, Zuckeralkohole, Fructose (Fruchtzucker), Fruchtschalen, Wasabi (japanischer Meerrettich) und Katechine. Antioxidantien, die aus Mikroorganismenkulturen stammen, umfassen Milchsäurebakterienextrakte, die antioxidative Effekte zeigen.
In der Vergangenheit wurden diese Antioxidantien Getränken, Lebensmitteln, Kosmetika und Tierfutter zugesetzt, um deren Verschlechterung zu verhindern und ihre Qualität zu bewahren. Man hat ebenfalls herausgefunden, dass diese Antioxidantien aktive Sauerstoffe und Freie Radikale, die in vivo erzeugt werden, abfangen oder ihre Erzeugung verhindern. Um diese Eigenschaften auszunutzen, werden natürliche Extrakte mit stark antioxidativen Eigenschaften in vivo gesucht.
Vier Arten von aktiven Sauerstoffen sind bekannt, die durch Oxidation in vivo erzeugt werden. Dies sind: Singulettsauerstoffe, Superoxide, Hydroxylradikale und Wasserstoffperoxide. Mehr als zehn Arten von Freien Radikalen, die Alkylhydroperoxide und Hydroperoxylradikale einschließen, sind bekannt, die durch Oxidation in vivo erzeugt werden. Die antioxidativen Eigenschaften können bestimmt werden, indem das Radikalabfangvermögen unter Verwendung von 1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazin (DPPH) gemessen wird.
Man hält Oxidation in vivo für einen Grund, der das Altern, Lebensstil-bezogene Erkrankungen und Krebs auslöst. Alter verursacht eine Schwächung physischer Funktionen nicht so sehr wie Krankheit, wie etwa Hypokinese, Unterfunktionen innerer Organe, Versagen des Gedächtnisses, Katarakt und Falten. Es bewirkt ebenfalls, dass sich die Blutgefäße verschlechtern, was die Anfälligkeit für Arteriosklerose steigert. Lebensstilbezogene Erkrankungen, die für die Oxidation in vivo für besonders relevant gehalten werden, umfassen Arteriosklerose und Diabetes sowie Leberschäden und rheumatische Arthritis.
Hinsichtlich der Relevanz für Krebs wird die Oxidation in vivo für eine der Ursachen gehalten, welche die Substanzen, welche DNA aufbauen, umwandeln und schädigen und andere Zellen mutieren, wenn sie regeneriert werden. Um solche Erkrankungen zu verhindern, haben Antioxidantien, welche die Oxidation in vivo verhindern oder hemmen, Aufmerksamkeit auf sich gezogen. Sie werden erforscht und entwickelt in Form von Lebensmitteln mit Funktionsbehauptungen, Lebensmitteln für spezielle Gesundheitsverwendungen und Ergänzungsstoffe.
Antioxidantien für solche Zwecke umfassen pflanzliche Derivate, wie etwa Carotinoide (Betacarotin, Lycopen, Fucoxanthin), phenolische Verbindungen (Flavonoide, Anthocyanin, Katechin), Sulfide und Betadiketone und Mikroorganismenkulturen, wie etwa DHA (Docosahexaensäure) und EPA (Eicosapentaensäure).
Eine Aufgabe dieser Erfindung ist es, einen Mikroorganismus bereitzustellen, der ein natürlicher Extrakt mit starken antioxidativen Eigenschaften, sehr vielseitig für Getränke, Lebensmittel, Kosmetika und Tierfutter ist und den ursprünglichen Geschmack und das Aroma des Produkts bewahren kann, während er antioxidative Eigenschaften in vivo aufweist, sowie eine Mikroorganismenkultur bereitzustellen, die durch Kultur dieses Mikroorganismus erhalten wird. Eine weitere Aufgabe dieser Erfindung ist es, verschiedene Getränke, Lebensmittel, Kosmetika und Tierfutter bereitzustellen, die solche Mikroorganismen verwenden.
Kefir ist ein traditionelles gemischtes fermentiertes Milchprodukt aus Milchsäurebakterien und Hefeorganismen, dessen Ursprung im Kaukasus vermutet wird, und wird durch die Kultur von Kefirkörnern in Milch hergestellt.
Der Erfinder dieser Erfindung hat entdeckt, dass natürliche Kefirkörner sichere Produkte für Menschen und Tiere darstellen, wenn sie in Getränken, Lebensmitteln, Kosmetika und Tierfutter verwendet werden, und hat die Erforschung hinsichtlich unterschiedlicher Verwendungen von Kefir fortgeführt. Der Erfinder hat weiter entdeckt, dass eine kultivierte Flüssigkeit, die durch die Kultur von Kefirkörnern in einem Grünteeextrakt und das Entfernen der Bakterien aus der Mikroorganismenkultur hergestellt wurde, einen Hautbleichungseffekt aufweist, und dass Kefirkörner selbst antioxidative Eigenschaften aufweisen. Auf diesen Erkenntnissen basierend hat der Erfinder ein Patent in Form eines Kosmetikums beantragt, das solche Eigenschaften von Kefir ausnutzt ( japanische Patentanmeldung Nr. 2002-315520 , Anmeldetag: 30. Oktober 2002 und Veröffentlichungsnummer JP 2004 149442 (27.05.2004)).
Als Ergebnis weiterer Forschung hat der Erfinder einen Mikroorganismus identifiziert, der von einer natürlichen Substanz abstammt und antioxidative Eigenschaften aufweist, der als Ausgangsmaterial für Getränke, Lebensmittel, Kosmetika und Tierfutter verwendet werden kann oder ihnen zugesetzt werden kann, so dass er deren Verschlechterung durch Oxidation verhindert und aktive Sauerstoffe und Freie Radikale, die in Menschen und Tieren in vivo erzeugt werden, abfängt oder deren Erzeugung verhindert. Der Erfinder hat ebenfalls entdeckt, dass eine Mikroorganismenkultur, die durch Kultur dieses Mikroorganismus oder von Mikroorganismen erhalten wird, diese Aufgaben lösen kann. Der Erfinder hat ebenfalls ein Produkt entwickelt, das antioxidative Eigenschaften aufweist, indem er die Mikroorganismen Getränken, Lebensmitteln, Kosmetika und Tierfuttern zugesetzt hat.
[MITTEL ZUM LÖSEN DER AUFGABEN]
Diese Erfindung betrifft:

(1) eine neue Mikroorganismenart mit antioxidativen Eigenschaften, die aus Kefirkörnern abgetrennt wird und zu Lactobacillaceae der SIID1719-6b gehört;
(2) eine Mikroorganismenkultur mit antioxidativen Eigenschaften, die in einer Einzelkultur einer neuen Mikroorganismenart, die aus Kefirkörnern abgetrennt wird und zu Lactobacillaceae gehört, erhalten wird;
(3) eine Mikroorganismenkultur, die antioxidative Eigenschaften aufweist, die durch Kultur von Mikroorganismen erhalten wird, die aus Kefirkörnern abgetrennt werden und zu Lactobacillaceae SIID1719-6b gehört;
(4) ein Getränk mit antioxidativen Eigenschaften, das mit Kulturen oder Bakterien versetzt ist, die durch die Kultur von Mikroorganismen erhalten werden, die aus Kefirkörnern abgetrennt sind, und einer neuen Mikroorganismenart, die zu Lactobacillaceae SIID1719-6b gehört;
(5) ein Lebensmittel mit antioxidativen Wirkungen, das mit Kulturen oder Bakterien versetzt ist, die durch die Kultur von Mikroorganismen erhalten werden, die aus Kefirkörnern abgetrennt sind, und einer neuen Mikroorganismenart, die zu Lactobacillaceae SIID1719-6b gehört;
(6) ein Kosmetikum mit antioxidativen Wirkungen, das mit Kulturen oder Bakterien versetzt ist, die durch Kultur von Mikroorganismen erhalten werden, die aus Kefirkör nern abgetrennt sind, und einer neuen Art von Mikroorganismen, die zu Lactobacillaceae SIID1719-6b gehört; und
(7) ein Tierfutter mit antioxidativen Wirkungen, das mit Kulturen oder Bakterien versetzt ist, die durch Kultur von Mikroorganismen erhalten werden, die aus Kefirkörnern abgetrennt wurden, und einer neuen Mikroorganismenart, die zu Lactobacillaceae SIID1719-6b gehört.

Die "antioxidativen Eigenschaften" sind so definiert, dass sie die Fähigkeit zur Verhinderung von Oxidation einschließen, so dass sie die Qualität des Produkts bewahren, sowie die Fähigkeit, aktive Sauerstoffe und Freie Radikale, die in vivo erzeugt werden, abzufangen oder zu inhibieren, so dass sie die Oxidation in vivo verhindern, wenn sie Menschen oder Tieren als Getränke, Lebensmittel oder Tierfutter verabreicht werden. Die "Mikroorganismenkultur" bedeutet eine Kultur von Mikroorganismen oder einem einzelnen Mikroorganismus, die aus Kefirkörnern abgetrennt wurden.
[WIRKUNGEN DER ERFINDUNG]
Die in Anspruch 1 beschriebene Erfindung hat die Wirkung, dass sie eine neue Mikroorganismenart bereitstellt, die antioxidative Eigenschaften aufweist, die von Kefirkörnern abgetrennt wird und zu Lactobacillaceae SIID1719-6b gehört. Durch Verwendung dieses Mikroorganismus, die antioxidative Eigenschaften aufweist, als Ausgangsmaterial für Getränke, Nahrungsmittel, Kosmetika oder Tierfutter oder durch dessen Zugabe zu diesen Produkten oder ihren Ausgangsmaterialien ist es möglich, deren Verschlechterung durch Oxidation zu verhindern und aktive Sauerstoffe und Freie Radikale, die in vivo von Menschen und Tieren, die sie verwenden, erzeugt werden, abzufangen oder ihre Erzeugung zu hemmen.
Die in Anspruch 2 beschriebene Erfindung weist die Wirkung auf, dass sie eine Mikroorganismenkultur bereitstellt, die antioxidative Eigenschaften aufweist, die eine neue Mikroorganismenart einschließt, die aus Kefirkörnern abgetrennt wird und zu Lactobacillaceae SIID1719-6b gehört. Diese Kultur, die nicht toxisch ist und keine nachteilige Wirkung aufweist, weist eine Vielzahl von Anwendungen auf, einschließlich Ausgangsmaterialien und Zusatzstoffen für Getränke, Lebensmittel, Kosmetika, Tierfutter usw.
Die in Anspruch 3 beschriebene Erfindung weist die Wirkung auf, dass sie eine Mikroorganismenkultur bereitstellt, die antioxidative Eigenschaften aufweist, die durch Kultur von Mikroorganismen erhalten wird, die aus Kefirkörnern abgetrennt werden, die zu Lactobacillaceae SIID1719-6b gehören. Diese Kultur, die nicht toxisch ist und keinen nachteiligen Effekt aufweist, weist eine Vielzahl von Anwendungen auf, einschließlich Ausgangsmaterialien und Zusatzstoffen für Getränke, Lebensmittel, Kosmetika und Tierfutter.
Die in den Ansprüchen 4 bis 7 beschriebenen Erfindungen weisen die Wirkungen auf, dass sie antioxidative Getränke, Lebensmittel, Kosmetika und Tierfutter bereitstellen, die mit Kulturen oder Bakterien versetzt sind, die durch Kultur von Mikroorganismen erhalten werden, die von Kefirkörnern abgetrennt sind, und einer neuen Art von Mikroorganismus, die zu Lactobacillaceae SIID1719-6b gehört.
[KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN]
1 ist ein Graph, der die Beziehung zwischen der Kulturzeit und dem Wachstum des Mikroorganismus zeigt.
2 ist ein Graph, der die Beziehung zwischen der Kulturzeit (Wachstum des Mikroorganismus) und den Veränderungen des pH-Werts zeigt.
3 ist ein Graph, der die Beziehung zwischen der Kulturzeit (Wachstum des Mikroorganismus) und den antioxidativen Eigenschaften zeigt.
4 ist eine Fotografie gram-gefärbter SIID1719-6b.
5 zeigt die Ergebnisse der molekularen Abstammungsanalyse von SIID1719-6b.
[BESTE AUSFÜHRUNGSFORMEN DER ERFINDUNG]
Im Folgenden werden bevorzugte Ausführungsformen dieser Erfindung erläutert.
Aus Kefirkörnern abgetrennte Mikroorganismen umfassen Acetobacter cerevisiae SIID1719-2b, Gluconobacter oxydans SIID1719-3b, Lactobacillus sp. SIID1719-6b, der eine neue Art der Lactobacillaceae-Familie ist, Pichiamembrani faciens SIID1719-1y, Saccharomyces cerevisiae SIID1719-4y und Pichia anomala SIID1719-5y.
Um herauszufinden, ob aus Kefirkörnern abgetrennte Mikroorganismen und eine Mikroorganismenkultur, die in einer Einzelkultur von Lactobacillus sp. SIID1719-6b, der eine neue Art des Stamms der Lactobacillaceae-Familie ist, erhalten wurde, antioxidative Eigenschaften aufweisen, führten wir die folgenden Beurteilungstests durch. Als Ergebnis fanden wir heraus, dass diese Mikroorganismen und der Lactobacillus sp. SIID1719-6b selbst antioxidative Eigenschaften aufweisen. Darüber hinaus wurde herausgefunden, dass Wirkstoffe der Kultur, aus der Bakterien in einer Trennzentrifuge entfernt wurden und die unter Verwendung eines sterilisierenden Filters sterilisiert wurde, ebenfalls antioxidative Eigenschaften aufweisen. Erfindungsgemäß kann irgendetwas, das dieselben Eigenschaften in Symbiose mit Mikroorganismen, deren Sicherheit mit Lactobacillus sp. SIID1719-6b bestätigt ist, zeigt, verwendet werden. Das Lactobacillus sp. SIID1719-6b, das eine neue Art der Lactobacillaceae-Familie ist, ist bei der internationalen Patentorganismen-Hinterlegungsstelle des Nationalen Instituts fortgeschrittener industrieller Wissenschaft und Technologien hinterlegt.
Als typisches Beispiel wurde ein Stamm von Lactobacillus sp. SIID1719-6b, der eine neue Art der Familie der Lactobacillaceae ist, kultiviert, und seine antioxidativen Eigenschaften wurden beurteilt, wie in den folgenden Absätzen beschrieben.

Ein Stamm von Lactobacillus sp. SIID1719-6b, der eine neue Art der Familie der Lactobacillaceae ist, wird in einem Medium M. R. S. Broth (Oxoid England, UK) kultiviert. Die Zusammensetzung des Mediums M. R. S. ist in Tabelle 1 gezeigt. 2 × 10⁶ Zellen/ml der Bakterien werden statisch bei einer Kulturtemperatur von 30°C kultiviert und alle 24 Stunden werden Proben entnommen, um die Bakterienzahl und den pH-Wert zu messen. Die Wachstumsänderungen der Bakterienzahl sind in 1 gezeigt, und die Änderungen des pH-Werts sind in 2 gezeigt. Es gibt keine Einschränkung hinsichtlich der Zusammensetzung des Mediums, des Substrats und der Temperatur der Kultur, solange die Bedingungen erlauben, dass die Bakterien gut wachsen. Tabelle 1 Zusammensetzung des MRS-Mediums in 1 Liter gereinigtem Wasser

Zutaten des Mediums	Zugegebene Menge
Pepton	10,0 g
Lab-Lemco'-Pulver	8,0 g
Hefeextrakt	4,0 g
Glucose	20,0 g
Sorbitanmonooleat	1 ml
Dikaliumhydrogenphosphat	2,0 g
Natriumacetat 3H₂O	5,0 g
Triammoniumcitrat	2,0 g
Magnesiumsulfat 7H₂O	0,2 g
Mangansulfat 4H₂O	0,05 g

Wir testeten die antioxidativen Eigenschaften dieser Kultur. Zunächst wurden 190 μl 0,1 mM DPPH (gelöst in 100 % Ethanol) zu jeder der 96 Vertiefungen auf einer Mikroplatte gegeben. Als Nächstes wurden Proben der Kultur (0, 24, 48, 72, 96 und 120 Stunden) und 10 μl des MRS-Mediums (Blindprobe) zu jeder Vertiefung gegeben, um Radikal-Abfangreaktionen zu beginnen. Die Lichtabsorption unmittelbar nach (0 Minuten) und 30 Minuten nach der Zugabe der Proben wurde mit einem Mikroplattenlesegerät gemessen. Die Radikal-Abfangrate wurde aus der Lichtabsorption der Blindproben und Proben berechnet.
Die Ergebnisse sind in 3 gezeigt. Während die Kulturzeit zunimmt, wachsen die Mikroorganismen und ihr pH-Wert ändert sich. Während die Mikroorganismen wachsen, werden ebenfalls die antioxidativen Eigenschaften deutlicher.
Wir haben Lactobacillus sp. SIID1719-6b als eine neue Art identifiziert. Unser Verfahren zur Identifizierung und die Ergebnisse des Mikroorganismentests sind in den folgenden Absätzen beschrieben.
In einem ersten Stadium des Bakterientests beobachteten wir die Zellform, gram-Färbbarkeit, die Existenz von Sporen und die Beweglichkeit der Geißeln unter Verwendung eines optischen Mikroskops (U-LH1000, Olympus, Japan). Wir beobachteten ebenfalls die Formen von Kolonien auf einem MRS Broth (Oxoid, England, UK) + Agar. Wir testeten hinsichtlich Katalasereaktionen, Oxidasereaktionen, Säure- und Gaserzeugung aus Glucose und Oxidation und Fermentierung von Glucose.

Die Ergebnisse des mykologischen Eigenschaftstests sind in Tabelle 2 gezeigt, und ein Foto einer gram-gefärbten Kultur ist in 4 gezeigt. Tabelle 2 Ergebnisse des mykologischen Eigenschaftstests

Testgegenstand	Ergebnis
Zellform	Bacillus (0.6–0.7 × 1,5–2,0 μm
gram-Färbung	+
Spore	–
Beweglichkeit	–
Kolonieform	Kulturzeit: 24 Stunden
	kreisförmig
	glatte Ränder
	konvex
	glänzend
	milchweiß
Kulturtemperatur °C 37	+
45	–
Katalase	–
Oxidase	–
Säure-/Gaserzeugung (Glucose)	+/–
Oxidation-Fermentation (O/F) Test	+/+
(Glucose)

Wir führten einen physiologischen und biochemischen Test durch. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 gezeigt. Tabelle 3 Physiologische und biologische Testergebnisse

Zutaten	Ergebnis	Zutaten	Ergebnis	Zutaten	Ergebnis
Glycerol*	–	Mannitol*	+	Raffinose*	–
Erythritol*	–	Sorbitol*	+	Stärke*	–
D-Arabinose*	–	α-Methyl-D-mannose*	–	Glykogen*	–
L-Arabinose*	–	α-Methyl-D-glucose*	+	Xylitol*	–
Ribose*	–	N-Acetyl-glucosamin*	+	Gentiobiose*	+
D-Xylose*	–	Amygdalin*	–	D-Turanose*	+
L-Xylose*	–	Arbutin*	+	D-Lyxose*	–
Adonitol*	–	Esculin*	+	D-Tagatose*	–
β-Methyl-D-xylose*	–	Salicin*	+	D-Fucose*	–
Galactose*	–	Cellobiose*	–	L-Fucose*	–
Glucose*	+	Maltose*	–	D-Arabitol*	–
Fructose*	+	Lactose*	–	L-Arabitol*	–
Mannose*	+	Melibiose*	–	Gluconat*	–
Sorbose*	+	Saccharose*	+	2-Ketogluconsäure*	–
Rhamnose*	+	Trehalose*	+	5-Ketogluconsäure*	–
Dulcitol*	–	Inulin*	–
Inositol*	–	Melezitose*	–

Wir verwendeten das PrepMan-Verfahren (Applied Biosystems, CA, USA) zur Extraktion der genomischen DNAs. Unter Verwendung der extrahierten genomischen DNAs als Template amplifizierten wir den Bereich von ungefähr 1500 bis 1600 bp der gesamten Basensequenz der 16S ribosomalen RNA-Gene (16S rDNA) mittels PCR. Danach sequenzierten wir die amplifizierten 16S rDNAs und erhielten eine Basensequenz. Zur Reinigung der PCR-Produkte und Zyklusfolge verwendeten wir das MicroSeq Full 16S rDNA Bacterial Sequencing Kit (Applied Biosystems, CA, USA) (MicroSeq ist eine eingetragene Marke). Als Wärmezyklusgerät verwendeten wir das GeneAmp PCR SYSTEM 9600 (Applied Biosystems, CA, USA) und als DNA-Sequenzierer verwendeten wir den ABI PRISM 3100 DNA Sequencer (Applied Biosystems, CA, USA). Für die Grundoperationen von der Extraktion der genomischen DNAs bis zu der Zyklussequenz folgten wir dem Protokoll von Applied Biosystems (P/N4308132 Rev. A).
Die Basensequenz der 16S rDNA der SIID1719-6b ist in Tabelle 4 gezeigt.
Tabelle 4

Unter Verwendung von BLAST führten wir eine Homologiesuche der oben beschriebenen Basensequenz durch einen Vergleich mit der DNA-Basensequenzdatenbank Gen-Bank durch. Ausgehend von der Basensequenz der 16S rDNA, die erhalten wurde, führten wir eine Homologiesuche nach Arten durch, die als enge Verwandte der Probe betrachtet werden, und identifizierten die obersten fünf Stämme. Die Ergebnisse der Homologiesuche sind in Tabelle 5 gezeigt. Tabelle 5

Homologiesuchergebnisse		Stand 10. Mai 2004
Einträge	Stämme	Hinterlegungs-Nr.	Identität
Lactobacillus mali		M58824	1424/1495 = 95,3%
Lactobacillus sp. CECT5924	CECT5924	AJ576009	1364/1407 = 96,9%
Lactobacillus nageli	NRICO559	AB162131	1440/1511 = 95,3%
Lactobacillus sp.		AB016864	1317/1364 = 96,6%
Pediococcus damnosus	DSM20331	AJ318414	1351/1423 = 94,9%

Basierend auf der soweit erhaltenen Information erstellten wir einen molekularen Stammbaum unter Verwendung der 16S rDNA Basensequenz und der 16S rDNA Basensequenz von Stämmen, die als enge Verwandte betrachtet werden. Wir luden den Basensequenzvergleich (alignment) und die bei der Erstellung des molekularen Stammbaums verwendete 16S rDNAs von der GenBank/DDBJ/EMBL auf Basis des Stamm-Abkömmling-Vergleichs herunter. Zur Berechnung des molekularen Stammbaums verwendeten wir das Nachbar-Verbindungsverfahren (neighbor-joining), in welchem 1.000 Bootstraps erzeugt wurden, um die Validität der Topologie zu überprüfen. Zur Analyse verwendeten wir DNASIS Pro (Hitachi Software Engineering, Yokohama). Die Analyseergebnisse des molekularen Stammbaums sind in 5 gezeigt.
Wir extrahierten und reinigten DNAs aus kultivierten Bakterien und erhielten DNAs zum Messen des G + C-Gehalts. Wir verwendeten Hochleistungsflüssigchromatographie (HPLC). Wir gaben 20 Liter Nuclease-P1-Lösung (0,1 mg/ml Nuclease P1 (DNA-GC Kit, hergestellt von Yamasa Corporation, verkauft von Seikagaku Corporation), 40 mM Natriumacetat und 2 mM Zinksulfat [pH 5,3]) zu derselben Menge an DNAs (350 g/ml), die in sterilisiertem Wasser gelöst und thermisch denaturiert war, und behandelten die Lösung für eine Stunde bei 50°C, um sie in die Nucleotide zu lösen und verwendeten sie als Probe für die HPLC-Messung. Wir führten die Messung unter Verwendung eines HPLC-Geräts (LC-10, Shimadzu, Kyoto) unter den folgenden Bedingungen durch.

Mobile Phase: 10 mM Phosphatpuffer (10 mM Kaliumphosphat, 10 mM einbasisches
Kaliumphosphat [pH 7,0]).
Säule: Develosil RPAQUEOUS, ϕ 4,6 mm × 250 mm (Nomura Chemical, Co., Ltd., Aichi).
Fließgeschwindigkeit: 1,5 ml/Min.
Erfasste Wellenlänge: 270 mm.

Wir identifizierten jedes Nucleotid aus den Retentionszeiten der Standardnucleotidmischung (die gleiche Molzahlen von dCMP, dAMP, dGMP und dTMP enthielt), die in dem DNA-GC Kit (hergestellt von Yamasa Corporation, verkauft von Seikagaku Corporation) enthalten ist, und der Probe. Zur selben Zeit berechneten wir die DNA-Basenzusammensetzung der Probe ausgedrückt als GC-Gehalt aus dem Verhältnis der Signalflächen der Standardnucleotidverbindung und der Probe unter Verwendung der folgenden Gleichung. G + C mol-% = ((Cx/Cs + Gx/Gs)/(Cx/Cs + Ax/As + Gx/Gs + Tx/Ts)) × 100

Nx: Wert der Signalfläche von dCMP, dAMP, dGMP und dTMP der Probe.
Ns: Wert der Signalfläche von dCMP, dAMP, dGMP und dTMP, die in der Standardnucleotidmischung enthalten sind.

Die Ergebnisse der G + C-Gehaltmessung sind in Tabelle 6 gezeigt. Tabelle 6

G + C-Gehaltmessergebnisse

Probe GC-Gehalt (%)

1719-6b 40,5
Gemäß der Analyse der 16S rDNA-Basensequenz beträgt die Ähnlichkeit von SIID1719-6b gegenüber dem am engsten verwandten Stamm Lactobacillus mali 95,3 %. Während der G + C-Gehalt von Lactobacillus mali 32,5–33,0 % beträgt, beträgt jener von SIID1719-6b 40,5 %. In der Taxonomie gibt es eine Richtlinie, wann zwei Arten als dieselbe Art betrachtet werden. Gemäß dieser Richtlinie muss das Ergebnis ihres DNA-DNA-Hybridbildungstests 70 % oder höher sein, damit zwei beliebige Arten als dieselbe Art betrachtet werden. Dies ist die Definition von "dieselbe Art sein". Damit das Ergebnis des DNA-DNA-Hybridbildungstests 70 % oder höher ist, muss das Ergebnis einer 16S rDNA-Basensequenzanalyse 97 % überschreiten, und die Differenz des G + C-Gehalts zwischen den zwei verglichenen Arten muss kleiner als 3 % sein. Unsere Testergebnisse erfüllen nicht diese Anforderungen. Folglich ist herausgefunden worden, dass SIID1719-6b eine neue Art ist.
Sequenzprotokoll

Claims

Eine neue Mikroorganismenart mit antioxidativen Eigenschaften, die aus Kefirkörnern abgetrennt wird und zu Lactobacillaceae der SIID1719-6b mit der Hinterlegungseingangsnummer FERM ABP-10299 gehört.
Mikroorganismenkultur mit antioxidativen Eigenschaften, die in einer Einzelkultur der neuen Mikroorganismenart gemäß Anspruch 1 erhalten wurde.
Mikroorganismenkultur gemäß Anspruch 2, wobei die Bakterien durch eine Trennzentrifuge entfernt werden und durch Verwendung eines Sterilisierfilters sterilisiert wird.
Ein Getränk mit antioxidativen Wirkungen, versetzt mit Kulturen oder Bakterien, die durch Kultur von Mikroorganismen, die aus Kefirkörnern abgetrennt wurden, und einer neuen Mikroorganismenart gemäß Anspruch 1 erhalten wurden.
Ein Lebensmittel mit antioxidativen Wirkungen, das mit Kulturen oder Bakterien versetzt ist, die durch die Kultur von Mikroorganismen, die aus Kefirkörnern abgetrennt wurden, und einer neuen Mikroorganismenart gemäß Anspruch 1 erhalten wurden.
Ein Kosmetikum mit antioxidativen Wirkungen, das mit Kulturen oder Bakterien versetzt ist, die durch die Kultur von Mikroorganismen, die aus Kefirkörnern abgetrennt wurden, und einer neuen Mikroorganismenart gemäß Anspruch 1 erhalten wurden.
Ein Tierfutter mit antioxidativen Wirkungen, das mit Kulturen oder Bakterien versetzt ist, die durch die Kultur von Mikroorganismen, die von Kefirkörnern abgetrennt wurden, und einer neuen Mikroorganismenart gemäß Anspruch 1 erhalten wurden.