KR102393420B1 - 산업배지로 배양된 케피어를 함유하는 이유자돈 면역증진용 기능성 사료 첨가제 및 이의 제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명의 일 예는 산업배지로 배양된 케피어(Kefir)를 유효성분으로 포함하는 조성물로 이루어진 이유자돈용 사료 첨가제를 제공한다. 본 발명의 일 예에 따른 사료 첨가제는 이유자돈의 사양시 사료요구율을 감소시키면서 증체를 유도하는 측면과 면역력을 증가시키는 측면 모두에서 우수한 효과를 가진다. 따라서, 본 발명의 일 예에 따른 사료 첨가제를 사용하면 양돈농가에서 가장 큰 원가를 차지하고 있는 사료에 대한 원가부담을 낮출 수 있고, 이유자돈의 장내 유산균군을 증가시켜 장내환경 개선을 유도할 수 있으며, 이유자돈의 면역력 증가를 가져옴으로써 외부 병원균에 의한 감염이 될 경우 효과적으로 병원균을 제거할 수 있을 것으로 기대된다.

Description

산업배지로 배양된 케피어를 함유하는 이유자돈 면역증진용 기능성 사료 첨가제 및 이의 제조방법{Functional feed additive for enhancement of piglet immunity comprising kefir cultured with industrial medium}

본 발명은 기능성 사료 첨가제 등에 관한 것으로서, 더 상세하게는 산업배지로 배양된 케피어를 함유하여 이유자돈의 면역력을 향상시킬 수 있는 기능성 사료 첨가제 및 이를 제조하는 방법에 관한 것이다.

국내 축산업의 경쟁력은 축산선진국과 비교하여 생존을 걱정할 정도로 가격 및 품질경쟁력이 상실되었다. 한우의 경우 브랜드화가 비교적 잘 되어 있고 소비자의 감성과 실제적 품질 사이의 적정선에서 고급화가 이루어질 것으로 예측되지만, 양돈의 경우 유럽의 친환경적인 높은 품질경쟁력, 높은 생산성과 경쟁하기 어려운 실정이다. 항생제 사용량은 미국의 3배, 유럽의 10-20배이고 한국은 이제야 친환경 축산에 대한 관심을 가지기 시작했지만 이에 대한 기술개발과 농가보급체계를 갖추지 못하였다. 성장촉진용 및 질병예방차원의 항생제를 제거한 양돈의 위험성에 대해 과대포장되어 있고, 농가차원에서는 두려움에 접근하지 못하며 일부 농가들이 무항생제 처리라는 용어를 사용하고 있지만 엄밀한 의미의 무항생제는 치료목적의 항생제도 사용하지 않는 형태를 말한다. 그러나 이는 동물의 웰빙차원에서 용납하기 어려운 방식이고 일반농가에서 접근하기 어려운 방식이다. 관련되는 항생물질 시장을 살펴보면 기존 항생제에 대하여 내성을 보이는 균주가 출현하면서 현재는 기존 항생제로 치료가 불가능한 경우가 다소 보고되고 있으며 기존 항생제에 대해 내성을 지닌 세균들에 의한 질병 발병 횟수의 증가로 새로운 종류의 항생제를 얻으려는 노력이 계속되고 있으나 최근 잇따르고 있는 새로운 항생제의 출시는 지금껏 사용하던 항생제를 더 강한 제형으로 개선시킨 것이 보통이다. 그러나 이는 더욱 심한 항생제 내성 문제를 초래할 것이고 이러한 신규 항생물질들에 대한 내성도 매우 빨리 발생할 것이기 때문에 현재의 시도는 내성 문제에 대한 근본적 해결책을 제시할 수 없으며 이것들을 활용하여 제품화를 한다고 해도 제품수명이 매우 짧을 것이다. 이에 따라 자연친화적이면서도 기존 항생제의 사용에서 발생한 문제를 해결해줄 수 있는 새로운 항생물질의 개발이 필요하다. 현재 국내 기능성 사료첨가제 산업은 약 130여개의 회사가 각축하고 있는 완전경쟁 시장으로 생산품이 거의 전량 국내 축산업에 소요되고 있지만, 항생제 대체용 제제가 온전히 항생제를 대체하는 것이 아니라 통상 항생제와 병행하여 사용하고 있는 실정이다.

유산균(lactic acid bacteria)은 기원전부터 인간이 이용하여 온 식품의 일종으로 영양적 가치뿐만 아니라 여러 가지 생리적인 효과가 있는 것으로 알려져 있으며, 장내에서 장 상피세포에 부착하여 병원균 증식을 억제하고, 면역세포로 하여금 면역 능력을 조절하는 물질을 생성시키며, 병원균과 경합하여 병원균의 증식을 억제하고, 이차적으로는 항생제 치료나 외부환경 변화에 대해 장내 세균총의 항상성을 유지하게 하는 것으로 보고되어 있다. 그러나 이러한 유산균은 당질을 발효해 젖산(lactic acid)를 생성하는 세균으로서, 영양 요구성이 매우 까다롭고 각종 영양소를 배합하여 만든 인공 배지로 배양하여도 극미량의 한 가지 영양소만 결핍되어도 잘 자라지 않는다. 또한, 시판중인 젖산균 전용 배양 배지는 고가이어서 좀 더 저렴한 비용으로 제조가 가능하고, 균체의 회수가 용이할 뿐만 아니라 유산균 활성이 높은 균체를 얻을 수 있는 경제적 유리한 배양 배지가 필요하다.

따라서, 유산균 등을 경제적으로 유리하게 배양하는 배양 배지와 이의 사료 첨가제로서의 다양한 용도를 개발하는 것이 필요하다. 유산균 배양 배지 및 이의 사료 첨가제로서의 다양한 용도와 관련하여 대한민국 등록특허공보 제10-1852336호에는 산업배지로 배양된 유산균 복합체를 유효성분으로 함유하고, 상기 산업배지는 전제 중량을 기준으로, 글루코스 2 중량%, 락토오스 2 내지 10 중량 %, 유청 단백질 4 내지 15 중량 %, 효모 추출물 2 중량 %, 암모늄 설페이트 0.1 내지 0.5 중량 %, 디포타슘 포스페이트 0.02 중량%, 마그네슘 설페이트 0.01 중량 %, 망가니즈 설페이트 0.005 중량 %를 포함하고, 상기 유산균 복합체는 락토바실러스 락티스, 락토바실러스 아시도필루스, 락토바실러스 플란타륨 및 류코노스톡메센테로이데스의 복합체 이고, 상기 락토바실러스 락티스, 락토바실러스 아시도필루스, 락토바실러스 플란타륨 및 류코노스톡 메센테로이데스의 비율은 1:1:1:1인 것을 특징으로 하는 새우용 사료 첨가제 조성물이 개시되어 있다.

본 발명은 종래의 기술적 배경하에서 도출된 것으로서, 본 발명의 목적은 이유자돈의 면역력을 증진시킬 수 있는 사료 첨가제 및 이의 제조방법 등을 제공하는데에 있다.

본 발명의 발명자들은 새우용 사료 첨가제를 제조하기 위한 산업배지 및 배양 방법 등을 개발하고 선행기술로 제시한 대한민국 등록특허 제10-1852336호를 획득한바 있다. 본 발명의 발명자들은 대한민국 등록특허 제10-1852336호에 개시된 새우용 사료 첨가제를 이유자돈의 사양에 적용한 결과, 갑각류와 포유류간의 면역 체계 등의 차이로 인해 동일한 효능이 발휘되지 않는다는 것을 확인하였다. 이에 본 발명자는 이유자돈의 면역력을 증진시킬 수 있는 케피어와 산업배지 등을 활용한 사료 첨가제 및 이의 제조방법을 연구하고, 본 발명을 완성하였다.

상기 목적을 해결하기 위하여, 본 발명의 일 예는 산업배지로 배양된 케피어(Kefir)를 유효성분으로 포함하는 조성물로 이루어진 이유자돈용 사료 첨가제를 제공한다.

상기 목적을 해결하기 위하여, 본 발명의 일 예는 케피어를 전지분유에 접종하고 배양하여 1차 배양액을 제조하는 제1공정; 및 상기 1차 배양액을 산업배지에 접종하고 배양하여 2차 배양액을 제조하는 제2공정을 포함하는 이유자돈용 사료 첨가제의 제조방법을 제공한다.

본 발명의 일 예에 따른 사료 첨가제는 이유자돈의 사양시 사료요구율을 감소시키면서 증체를 유도하는 측면과 면역력을 증가시키는 측면 모두에서 우수한 효과를 가진다. 따라서, 본 발명의 일 예에 따른 사료 첨가제를 사용하면 양돈농가에서 가장 큰 원가를 차지하고 있는 사료에 대한 원가부담을 낮출 수 있고, 이유자돈의 장내 유산균군을 증가시켜 장내환경 개선을 유도할 수 있으며, 이유자돈의 면역력 증가를 가져옴으로써 외부 병원균에 의한 감염이 될 경우 효과적으로 병원균을 제거할 수 있을 것으로 기대된다.

도 1은 본 발명의 실시예 3에서 수행한 이유자돈 사양 시험의 결과로서, 사양 시험 기간 중의 일당증체량 및 사료요구율를 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 실시예 3에서 수행한 이유자돈 사양 시험의 결과로서, 분변 미생물군 중 유산균군 분석 결과이다.
도 3은 본 발명의 실시예 3에서 수행한 이유자돈 사양 시험의 결과로서, 분변 미생물군 중 바실러스군 분석 결과이다.
도 4는 본 발명의 실시예 3에서 수행한 이유자돈 사양 시험의 결과로서, 분변 미생물군 중 효모군 분석 결과이다.
도 5는 본 발명의 실시예 3에서 수행한 이유자돈 사양 시험의 결과로서, 분변 미생물군 중 대장균군 분석 결과이다.
도 6은 본 발명의 실시예 3에서 수행한 이유자돈 사양 시험의 결과로서, 혈청 내 면역지표 중 TNF-α 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 본 발명의 실시예 3에서 수행한 이유자돈 사양 시험의 결과로서, 혈청 내 면역지표 중 IL-6 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 8은 본 발명의 실시예 3에서 수행한 이유자돈 사양 시험의 결과로서, 혈청 내 면역지표 중 IgA 분석 결과를 나타낸 것이다. 도 8에서 보이는 바와 같이 혈청 내 IgA 분석 결과, 대조군과 2개의 시험군 모두 0주차에 비해 4주차에서 증가하는 양상을 확인할 수 있다.
도 9는 본 발명의 실시예 3에서 수행한 이유자돈 사양 시험의 결과로서, 혈청 내 면역지표 중 IgG 분석 결과를 나타낸 것이다.

이하, 본 발명을 구체적으로 설명한다.

본 발명에서 사용되는 용어 "케피어(Kefir)"는 캅카스(Kavkaz) 지방에서 염소, 양, 소의 젖을 발효시켜 만든 유제품으로서, Saccharomyces kefir 등의 젖당발효성효모 및 젖산균을 포함하는 케피아종을 종균(starter)으로 이용하여 제조한다. 예를 들어, 온수에 녹인 케피어(Kefir) 종균에 가열해서 식힌 우유를 넣고, 20℃에서 1주일 방치해서 술밑을 만들고, 거기에 다시 약 5배의 가열 냉각유를 첨가하고 혼합한 후 2~3일 후 배양하며 케피어가 제조된다.

본 발명에서 사용되는 용어 "이유자돈"은 어미에게서 젖을 막 떼고 격리되어 다른 돼지들과 합사하게 되는 새끼돼지를 말한다.

본 발명의 일 측면은 이유자돈의 면역력을 향상시킬 수 있는 사료 첨가제에 관한 것이다. 본 발명의 일 예에 따른 사료 첨가제는 산업배지로 배양된 케피어(Kefir)를 유효성분으로 포함하는 조성물로 이루어진다.

상기 산업 배지는 글루코스, 전지분유, 효모 추출물, 암모늄설페이트[(NH₄)₂SO₄], 디포타슘포스페이트(K₂HPO₄), 마그네슘설페이트(MgSO₄) 및 망가니즈설페이트(MnSO₄)를 포함하고, 바람직하게는 전체 중량을 기준으로 글루코스 1~4 중량%, 전지분유 1~6 중량%, 효모 추출물 1~4 중량%, 암모늄설페이트[(NH₄)₂SO₄] 0.02~0.8 중량%, 디포타슘포스페이트(K₂HPO₄) 0.02~0.5 중량%, 마그네슘설페이트(MgSO₄) 0.005~0.05 중량% 및 망가니즈설페이트(MnSO₄) 0.01~0.2 중량%를 포함하고, 더 바람직하게는 전체 중량을 기준으로 글루코스 1.5~3 중량%, 전지분유 1.5~5 중량%, 효모 추출물 1.5~3 중량%, 암모늄설페이트[(NH₄)₂SO₄] 0.05~0.6 중량%, 디포타슘포스페이트(K₂HPO₄) 0.05~0.4 중량%, 마그네슘설페이트(MgSO₄) 0.008~0.02 중량% 및 망가니즈설페이트(MnSO₄) 0.02~0.1 중량%를 포함한다.

또한, 상기 산업배지로 배양된 케피어는 락토바실러스속 생균, 바실러스속 생균 및 효모 생균을 포함한다. 상기 산업배지로 배양된 케피어에 함유된 락토바실러스속 생균, 바실러스속 생균 및 효모 생균의 균수비는 1 : (0.5~1.2) : (0.5~1.2)에서 선택될 수 있고, 바람직하게는 1 : (0.6~1.0) : (0.6~1.0)에서 선택될 수 있다. 상기 락토바실러스속 생균은 락토바실러스 락티스, 락토바실러스 아시도필루스, 락토바실러스 플란라륨 등과 같은 다양한 유산균으로 구성될 수 있다.

또한, 본 발명의 일 예에 따른 사료 첨가제는 산업배지로 배양된 케피어(Kefir) 외에 탈지분유 등과 같은 다양한 부형제를 더 포함할 수 있다.

본 발명의 일 예에 따른 사료 첨가제는 이유자돈의 면역 활성을 증진시킬 수 있고, 이유자돈의 장내 미생물군의 변화를 일으켜 장내 환경의 개선을 유도할 수 있다. 구체적으로 본 발명의 일 예에 따른 사료 첨가제는 염증성 cytokine인 TNF-α, IL-6의 변화와 포유동물의 면역에 중요한 역할을 하는 IgA,IgG의 변화를 통해 이유자돈의 면역 활성을 증진시킨다.

본 발명의 일 측면은 이유자돈의 면역력을 향상시킬 수 있는 사료 첨가제의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명의 일 예에 따른 사료 첨가제의 제조방법은 케피어를 전지분유에 접종하고 배양하여 1차 배양액을 제조하는 제1공정; 및 상기 1차 배양액을 산업배지에 접종하고 배양하여 2차 배양액을 제조하는 제2공정을 포함한다. 또한, 본 발명의 일 예에 따른 사료 첨가제의 제조방법은 바람직하게는 상기 2차 배양액으로부터 케피어를 회수하고 탈지분유로 케피어 현탁액을 제조하는 제3공정; 및 상기 현탁액을 동결건조하여 케피어 생균제를 제조하는 제4공정을 더 포함할 수 있다.

본 발명의 일 예에 따른 사료 첨가제의 제조방법을 더 구체적으로 설명하면, 상기 제1공정은 케피어를 멸균된 전지분유에 접종하여 1차 배양을 실시하는 단계로, 단백질 성분이 응고된 상태가 확인 될 때 1차 배양을 완료 하는 것일 수 있다. 바람직하게 1차 배양 완료는 전지분유의 단백질 성분이 응고된 상태인 것으로서, 단백질 성분이 분리되어 배양액 상층부에 떠오르게 되었을 때 1차 배양이 완료된 것일 수 있다. 또한, 상기 제2공정은 1차 배양된 케피어를 특수 고안된 산업배지에 접종하여 2차 배양을 실시하는 단계로, 1차 배양이 완료되어 전지분유의 단백질 성분이 응고된 상태가 되면 특수하게 고안된 산업배지에 이를 접종하고 공기를 주입하며 2차 배양을 완료하는 것일 수 있다. 또한, 제3공정은 2차 배양액에서 회수한 케피어를 멸균 탈지분유에 현탁하는 단계로, 산업배지로 2차 배양된 케피어를 원심분리를 통해 회수하고, 멸균 탈지분유에 회수한 케피어를 현탁하는 것일 수 있다. 바람직하게 멸균 탈지분유는 케피어의 무게와 동일하게 첨가하여 현탁할 수 있다. 상기 제4공정은 제3공정에서 제조된 현탁액을 동결건조체 형태의 케피어 생균제로 제조하는 것으로, 케피어가 현탁된 멸균 탈지분유 현탁액을 -70℃에서 1차 동결건조를 실시하고, 진공상태에서 2차 동결건조를 실시하는 것일 수 있다. 바람직하게, 1차 동결건조는 -70℃에서 1일간 동결하는 것일 수 있으며, 2차 동결건조는 진공상태에서 6일 동안 실시 할 수 있으며, 더욱 바람직하게 2차 동결건조는 -20℃에서 1일, -10℃에서 1일, 0℃에서 1일, 10℃에서 1일, 20℃에서 2일 동안 실시할 수 있다. 이는 미생물이 동결건조 기간 동안 사멸하는 것을 최대한 막기 위한 최적의 조건일 수 있다.

상기 본 발명의 일 예에 따른 사료 첨가제는 바람직하게는 고체상의 조성물 형태를 가진다. 상기 사료 첨가제가 액상의 조성물 형태로 이유자돈 농가에 공급되는 경우 이유자돈이 관련 미생물을 섭취할 가능성이 매우 낮아져, 관련 기능을 발휘하기가 어려울 수 있는 반면, 동결건조체와 같은 고체상의 조성물 형태로 공급되는 경우 이유자돈 농가에서 사용하는 주요 분말 형태의 사료와 혼합이 비교적 자유로워, 이유자돈이 이를 섭취하기가 용이하다.

본 발명의 일 측면은 이육자돈 사양에 급여되는 사료 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 일 예에 따른 이육자돈용 사료 조성물은 전술한 사료 첨가제와 이육자돈의 사양시 통상적으로 사용되는 일반사료를 혼합하여 제조될 수 있다. 본 발명의 일 예에 따른 이육자돈용 사료 조성물에서 사료 첨가제의 함량은 크게 제한되지 않으며, 이육자돈의 체중 증가, 장내 균총 환경 개선, 면역력 증가, 경제성 등을 고려할 때 일반사료 100 중량부 당 0.1~10 중량부인 것이 바람직하고, 일반사료 100 중량부 당 0.2~5 중량부인 것이 더 바람직하고, 일반사료 100 중량부 당 0.4~2 중량부인 것이 가장 바람직하다.

이하, 본 발명을 실시예를 통하여 보다 구체적으로 설명한다. 다만, 하기 실시예는 본 발명의 기술적 특징을 명확하게 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 보호범위를 한정하는 것은 아니다.

실시예 1 : 산업배지를 이용한 케피어(Kefir)의 배양

멸균된 15% 전지분유(w/v) 1ℓ에 케피어 1g(wet weight)을 접종하고 상온에서 2일 동안 1차 배양을 실시하였다. 이후, 하기 표 1의 성분표를 가지는 멸균된 산업배지 10ℓ에 1차 배양액을 접종하고, 공기를 주입하면서 상온에서 3일 동안 2차 배양을 실시하였다.

산업배지 성분	각 성분의 함유량(%, w/v)
Glulose	2
Whole fat milk	2~4
Yeast Extract	2
Ammonium Sulfate	0.1~0.5
Dipotassium Phosphate	0.1
Magnesium Sulfate	0.01
Manganese Sulfate	0.05

2차 배양액 내의 케피어 배양 상태 확인은 캐피어 내 주요 미생물인 유산균 균수를 측정하는 것으로 진행되었다. 균수를 측정하기 위하여 2차 배양액을 멸균된 0.85% NaCl 수용액에 넣어 희석하고 MRS 한천 배지에 도말한 후 37℃에서 2일 동안 배양하고, 균수를 측정하였다. 2차 배양액 내의 유산균 균수는 3.5×10⁹ CFU/㎖ 이었다.

실시예 2 : 케피어 생균제의 제조

본 발명의 실시예 1에서 제조한 유산균 균수가 3.5×10⁹ CFU/㎖인 2차 배양액을 4℃에서 약 30분 동안 원심분리하여(6,000 g) 케피어를 회수하였다. 이후, 회수된 케피어를 동일한 무게의 멸균된 10% 탈지분유로 현탁하여 케피어 현탁액을 제조하였다. 이후, 케피어 현탁액을 동결건조하여 조성물 형태의 케피어 생균제를 제조하였다. 상기 동결건조는 -70℃에서 1일, 진공상태의 -20℃에서 1일, 진공상태의 -10℃에서 1일, 진공상태의 0℃에서 1일, 진공상태의 10℃에서 1일, 진공상태의 20℃에서 2일 조건으로 동결건조기에서 진행하였다. 케피어 생균제 내의 케피어 균수를 측정하기 위하여 케피어 생균제를 멸균된 0.85% NaCl 수용액에 넣어 현탁 또는 희석하고 MRS 한천 배지에 도말한 후 37℃에서 2일 동안 배양하고, 균수를 측정하였다. 케피어 생균제 내의 락토바실러스속 유산균수는 약 6.92×10⁹ CFU/g 이었고, 바실러스속 균수는 약 6.46×10⁹ CFU/g이었고, 효모 균수는 약 5.89×10⁹ CFU/g이었다. 이후, 실험에서 상기 케피어 생균제를 사료 첨가제로 사용하였다.

실시예 3 : 케피어 생균제를 이용한 이유자돈(離乳仔豚)의 사양(飼養) 시험

(1) 이유자돈 사양 시험 설계

본 발명의 실시예 2에서 제조한 케피어 생균제를 부형제와 혼합하여 사료 첨가제를 준비하였다. 이후, 4주령의 이유자돈을 아래와 같이 총 3개의 그룹으로 구분하고, 한 그룹당 7 마리의 이유자돈을 배치하였다.

* 대조군(Control) : 일반사료만을 4주 동안 급여함

* 시험군 1(0.1%) : 일반사료에 케피어 생균제의 함량이 0.1%(w/w) 수준이 되도록 사료 첨가제를 혼합하고, 이를 4주 동안 급여함

* 시험군 2(0.5%) : 일반사료에 케피어 생균제의 함량이 0.5%(w/w) 수준이 되도록 사료 첨가제를 혼합하고, 이를 4주 동안 급여함

사양 시험을 통해 사양 성적, 분변 내 미생물군 분석 및 혈중 면역반응 변화 등을 확인하기 위하여, 혈액 및 분변 샘플을 채취하고 체중 및 사료섭취량을 측정하다. 혈액 샘플은 시험군당 7두씩 채취하였으며, 이표를 부착하여 구별하였다.

(2) 사양 성적 및 결과

사양 시험 기간 동안 사양 성적을 확인하기 위하여, 사양 시험 개시 및

종료 시기의 체중을 측정하고 사료섭취량을 확인하여 일당증체량 및 사료요

구율을 확인하였다. 구체적으로, 이유자돈에 사료를 급여하고 4주 후에, 이유자돈의 개시 체중과 종료 체중을 측정하여 [시험기간 중 증체량/사양 시험 기간]의 공식을 이용하여 일당증체량을 산출하였으며, [시험기간 중 사료섭취량/시험기간 중 증체량]의 공식을 이용하여 사료 요구율을 산출하였다.

도 1은 본 발명의 실시예 3에서 수행한 이유자돈 사양 시험의 결과로서, 사양 시험 기간 중의 일당증체량 및 사료요구율를 나타낸 것이다. 도 1에서 보이는 바와 같이 케피어 생균제를 0.1% 및 0.5% 급여한 시험군은 대조군에 비해 일당증체량은 증가하고 사료요구율은 감소한 것으로 확인되었다.

(3) 분변 미생물군 분석 및 결과

사양 시험 기간 동안 분변 내 미생물군 변화를 확인하기 위하여, 분변 내 유산균군, 바실러스군, 대장균군, 효모군에 대한 생균수 분석을 실시하였다. 구체적으로 사양 시험 0주, 2주, 4주차에 각 그룹별 돈방 내 복수의 지점에서 분변을 채취하여 -70℃에 보관하였으며, 생균수 확인을 위한 배지는 MRS agar (BD Difco, USA), Nutrient agar (BD Difco, USA), MacConkey agar (BD Difco, USA), OGYE agar (2% Glucose, 0.5% Yeast extract, 1.2% Agar, 200 ug/ml Oxytetracycline)을 사용하였다. -70℃에 보관한 각 분변 샘플은 상온에서 서서히 녹여준 뒤, 분변을 균질하게 혼합하여 생리식염수에 십진 희석하였다. 각 분변 내 미생물군의 생균수 확인을 위하여, 준비한 각 고체배지에 분변 희석액 100㎕를 도말하여 37℃에서 콜로니가 육안으로 확인될 때까지 배양한 뒤, 생균수를 측정하였다.

도 2는 본 발명의 실시예 3에서 수행한 이유자돈 사양 시험의 결과로서, 분변 미생물군 중 유산균군 분석 결과이다. 도 2에서 보이는 바와 같이 대조군은 0주차에 비해 지속적으로 유산균군이 감소하는 양상이 확인되었으며, 케피어 생균제 0.1% 급여군은 시험기간 내 변화가 거의 없었으며, 0.5% 급여군은 0주차에 비해 4주차에는 다른 군에 비해 크게 증가하는 양상이 확인되었다.

도 3은 본 발명의 실시예 3에서 수행한 이유자돈 사양 시험의 결과로서, 분변 미생물군 중 바실러스군 분석 결과이다. 도 3에서 보이는 바와 같이 사양 시험 기간 동안 분변 내 바실러스군은 대조군, 케피어 생균제 0.1% 급여군 그리고 케피어 생균제 0.5% 급여군 모두에서 증가하였다. 케피어 급여군에서 바실러스 증가 폭이 크게 나타난 이유는 케피어 급여에 의한 것으로 판단된다.

도 4는 본 발명의 실시예 3에서 수행한 이유자돈 사양 시험의 결과로서, 분변 미생물군 중 효모군 분석 결과이다. 도 4에서 보이는 바와 같이 사양 시험 기간 동안 분변 내 효모군은 10⁷ 승 수준으로 확인되었으며, 대조군은 거의 증가가 없는 것으로 확인되었다. 케피어 생균제 0.1% 및 0.5% 급여군은 사양 시험 기간 동안 효모군이 지속적으로 증가하는 양상이 확인되었다.

도 5는 본 발명의 실시예 3에서 수행한 이유자돈 사양 시험의 결과로서, 분변 미생물군 중 대장균군 분석 결과이다. 도 5에서 보이는 바와 같이 사양 시험기간 동안 분변 내 대장균군은 10⁶ 승 수준으로 확인되었으며, 대조군은 0주차에 비해 4주차에 증가하는 양상이 확인되었다. 케피어 생균제 0.1% 및 0.5% 급여군은 시험 기간 동안 지속적으로 감소하는 양상이 확인되었으며, 감소폭은 0.5% 급여군이 가장 큰 것으로 나타났다.

(4) 혈청 내 면역지표 분석

면역반응검사를 위하여, 사양 시험 개시 전과 종료 후 이유자돈의 경정맥에서 혈액 샘플을 채취하여 실험에 사용하였다. 채취된 혈액 샘플을 8,000 rpm에서 10분 동안 원심분리하여 상등액을 1차로 회수하고, 1차로 회수한 상등액을 13,000 rpm에서 10분 동안 다시 원심분리하여 상등액을 2차로 회수하여 혈청 샘플을 준비하였다. ELISA는 sandwich ELISA 방법을 이용한 Porcine TNF-α DuoSet ELISA (R&D System, USA), Porcine IL-6 DuoSet ELISA (R&D System, USA). Pig IgA ELISA Quantitation kit (Bethyl, USA), Pig IgG ELISA Quantitation kit (Bethyl, USA)를 이용하여 수행하였고, 각각의 ELISA 실험은 2-fold로 희석한 8가지 농도의 standard 샘플과 혈청 샘플을 이용하여 진행하였다. ELISA를 통해 각 시험군에서 채취한 혈액 샘플로부터 면역지표 4종을 분석하였다.

도 6은 본 발명의 실시예 3에서 수행한 이유자돈 사양 시험의 결과로서, 혈청 내 면역지표 중 TNF-α 분석 결과를 나타낸 것이다. 도 6에서 보이는 바와 같이 혈청 내 TNF-α 분석 결과, 대조군과 2개의 시험군 모두 0주차에 비해 4주차에서 증가하는 양상을 확인할 수 있지만 그 차이가 크지 않았다.

도 7은 본 발명의 실시예 3에서 수행한 이유자돈 사양 시험의 결과로서, 혈청 내 면역지표 중 IL-6 분석 결과를 나타낸 것이다. 도 7에서 보이는 바와 같이 혈청 내 IL-6 분석 결과, 대조군에서는 변화가 없었으며, 케피어 0.1% 및 0.5% 급여군에서는 4주차에 감소하는 것으로 확인되었으며 특히 0.5% 급여군에서 크게 감소하였다. 이러한 결과는 염증성 cytokine인 IL-6가 케피어 급여에 의해 직접적으로 감소한 것으로 판단된다.

도 8은 본 발명의 실시예 3에서 수행한 이유자돈 사양 시험의 결과로서, 혈청 내 면역지표 중 IgA 분석 결과를 나타낸 것이다. 도 8에서 보이는 바와 같이 혈청 내 IgA 분석 결과, 대조군과 2개의 시험군 모두 0주차에 비해 4주차에서 증가하는 양상을 확인할 수 있다.

도 9는 본 발명의 실시예 3에서 수행한 이유자돈 사양 시험의 결과로서, 혈청 내 면역지표 중 IgG 분석 결과를 나타낸 것이다. 도 9에서 보이는 바와 같이, 혈청 내 IgG 분석 결과, 대조군과 2개의 시험군 모두 0주차에 비해 4주차에서 증가하는 양상을 확인할 수 있었으며, 케피어 0.5% 급여군에서 증가 폭이 다소 크게 나타났다.

(5) 케피어 생균제를 이용한 이유자돈 사양 시험 결론

케피어 생균제를 이용한 이유자돈 사양 시험에서, 케피어 급여에 의해 일당증체량이 증가하고 사료요구율이 낮아진 결과는 바꾸어 말하면 적은 사료로 이유자돈의 증체를 유도할 수 있다는 것을 의미한다. 이는 양돈농가에서 가장 큰 원가를 차지하고 있는 사료에 대한 원가부담을 낮출 수 있다는 측면에서 케피어가 기능성 사료로서 가치가 있다라고 판단된다.

또한, 케피어 생균제를 이용한 이유자돈 사양 시험에서, 분변 내 미생물군의 변화를 살펴보면 케피어 급여에 의해 유산균의 증가와 대장균군의 감소가 유의성 있게 나타났다. 이유자돈의 장내 유산균군의 증가는 유산균의 프로바이오틱스 특성에 의해 장내환경 개선을 유도할 수 있으며, 기회감염균으로서 역할을 할 수 있는 대장균군의 감소 역시 유산균이 분비하는 다양한 생리활성 물질(유산, 항생 펩타이드 등)에 의한 것으로 예상된다.

또한, 케피어 생균제를 이용한 이유자돈 사양 시험에서, 혈액 내 항체 및 cytokine 변화를 살펴보면 케피어 급여에 의해 염증성 cytokine인 IL-6의 감소와 포유동물의 면역에 중요한 역할을 하는 IgG가 증가하였다. 이는 이유자돈의 면역력 증가를 가져옴으로써 외부 병원균에 의한 감염이 될 경우 효과적으로 병원균을 제거할 수 있을 것으로 기대된다.

결론적으로 케피어는 이유자돈의 사양시 사료요구율을 감소시키면서 증체를 유도하는 측면과 면역력을 증가시키는 측면 모두에서 우수한 효과를 가진 기능성 사료 첨가제 원료로 기대된다.

이상에서와 같이 본 발명을 실시예를 통해 설명하였지만 본 발명이 반드시 여기에만 한정되는 것은 아니며 본 발명의 범주와 사상을 벗어나지 않는 범위 내에서 다양한 변형실시가 가능함은 물론이다. 따라서, 본 발명의 보호범위는 본 발명에 첨부된 특허청구의 범위에 속하는 모든 실시 형태를 포함하는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (10)

1. 케피어(Kefir)를 전지분유에 접종하고 배양하여 1차 배양액을 제조하는 제1공정;
   상기 1차 배양액을 산업배지에 접종하고 배양하여 2차 배양액을 제조하는 제2공정;
   상기 2차 배양액으로부터 생균을 함유하는 케피어를 회수하고 탈지분유로 케피어 현탁액을 제조하는 제3공정; 및
   상기 현탁액을 동결건조하여 케피어 생균제를 제조하는 제4공정을 포함하는 방법으로서,
   상기 산업배지는 전체 중량을 기준으로 글루코스 1~4 중량%, 전지분유 1~6 중량%, 효모 추출물 1~4 중량%, 암모늄설페이트[(NH₄)₂SO₄] 0.02~0.8 중량%, 디포타슘포스페이트(K₂HPO₄) 0.02~0.5 중량%, 마그네슘설페이트(MgSO₄) 0.005~0.05 중량% 및 망가니즈설페이트(MnSO₄) 0.01~0.2 중량%를 포함하고,
   상기 2차 배양액으로부터 회수된 케피어는 락토바실러스속 생균, 바실러스속 생균 및 효모 생균을 포함하고,
   상기 락토바실러스속 생균, 바실러스속 생균 및 효모 생균의 균수비는 1 : (0.5~1.2) : (0.5~1.2)인 것을 특징으로 하는 이유자돈용 사료 첨가제의 제조방법.
   
2. 제1항에 있어서, 상기 산업 배지는 전체 중량을 기준으로 전체 중량을 기준으로 글루코스 1.5~3 중량%, 전지분유 1.5~5 중량%, 효모 추출물 1.5~3 중량%, 암모늄설페이트[(NH₄)₂SO₄] 0.05~0.6 중량%, 디포타슘포스페이트(K₂HPO₄) 0.05~0.4 중량%, 마그네슘설페이트(MgSO₄) 0.008~0.02 중량% 및 망가니즈설페이트(MnSO₄) 0.02~0.1 중량%를 포함하는 것을 특징으로 하는 이유자돈용 사료 첨가제의 제조방법.
   
3. 제1항에 있어서, 상기 2차 배양액으로부터 회수된 케피어에 함유된 락토바실러스속 생균, 바실러스속 생균 및 효모 생균의 균수비는 1 : (0.6~1.0) : (0.6~1.0)인 것을 특징으로 하는 이유자돈용 사료 첨가제의 제조방법.
   
4. 제1항에 있어서, 상기 사료 첨가제는 이유자돈의 면역 활성을 증진시키는 것을 특징으로 하는 이유자돈용 사료 첨가제의 제조방법.
   
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