CN104293822A - 一种用于DisA表达的pEX-MBP重组质粒 - Google Patents

Abstract

本发明属于基因工程技术领域，涉及一种DisA表达过程中所使用的重组质粒pEX-MBP及其制备。所述pEX-MBP重组质粒的碱基序列如序列表所示。该重组质粒是在pBbB3a-GFP的基础上改造而成的。将该重组质粒用于制备可溶性的DisA蛋白时，以丙酸钠作为诱导剂。本发明所提供的pEX-MBP重组质粒，特异性的用于DisA蛋白的表达纯化，与传统的pET28α（+）载体所构建的重组质粒表达体相比，所表达的DisA蛋白可溶度较高；其次所构建的表达系统以丙酸钠作为诱导剂，成本低廉，而且对细菌没有毒性，因而适于表达DisA蛋白，且表达后的蛋白可特异性的切除相关标签蛋白，获得的DisA蛋白纯度较高。

Description

一种用于DisA表达的pEX-MBP重组质粒

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，涉及一种DisA（DNA integrity scanning protein A，DNA损伤修复蛋白）表达过程中所使用的重组质粒pEX-MBP及其制备和用途。 

背景技术

DisA（DNA integrity scanning protein A）是DNA损伤修复蛋白的简写，它能够发现机体的DNA损伤，并且来进行修复，从而保持DNA的完整性。研究发现，它具有二腺嘌呤环化酶（diadenylate cyclase，DAC）活性，能够催化两个ATP生成环二腺嘌呤核苷酸c-di-AMP，c-di-AMP是细菌的第二信使，不但与细胞形态的调控和细胞壁的合成有密切的关系，还与病原菌的致病性和细菌的耐药性有关，因而，c-di-AMP在免疫学上也有很好的实用价值。

目前在大肠杆菌的蛋白表达系统中，广泛采用的是T7表达系统（Kang Y，Son MS，Hoang TT.；One step engineering of T7-expression strains for protein production：increasing the host-range of the T7-expression system；Protein Expr Purif，2007，55 (2)：325~333），它含有T7启动子，T7启动子是通过诱导型的启动子比如lacUV5来调控的，因而宿主必须携带T7基因并且能够编码T7RNA聚合酶，一般广泛使用的宿主菌是BL21(DE3)。

T7表达系统表达蛋白过程中，影响蛋白表达效果的一个主要原因是诱导剂的使用。例如常见的以IPTG为诱导剂表达蛋白过程中，lacUV5启动子在IPTG的诱导作用下使宿主菌表达T7 RNA聚合酶，使T7启动子与目的蛋白高效率的进行表达。但是由于IPTG成本较高，因而限制了IPTG诱导的T7表达系统在大规模蛋白表达过程中的使用。另外，由于IPTG很难被细菌细胞消化而易使表达的蛋白污染，加之IPTG的毒性作用，因而无法使用IPTG诱导的T7表达系统来表达人类的蛋白。现有技术中，有研究尝试采用乳糖代替IPTG作诱导剂，或者使用温度控制的表达系统来进行蛋白诱导表达的，但也存在各种需要进一步完善的问题（Neubauer P，Hofmann K，Holst O. et al.；Maximizing the expression of a recombinant gene in Escherichia coli by manipulation of induction time using lactose as inducer；Appl Micro- biol Biotechnol，1992，36(6)：739~744）。例如，采用温控表达系统所表达的蛋白易形成包涵体，可溶性蛋白的量仅为总蛋白量的13%。

另一个影响T7表达系统的因素是部分蛋白表达不稳定，这主要是因为T7RNA聚合酶有时候会缺失表达，即使将基因直接放在lacUV5启动子的后面，RNA聚合酶有时也会缺失表达。因此为了减少RNA聚合酶缺失的影响，研究人员采取了各种措施来防止不诱导时RNA聚合酶的表达，或者在不诱导时来抑制RNA聚合酶的活性，但是效果都不太理想。

为了克服现有T7表达系统存在的一些问题，有研究人员构建了新的T7表达系统，称为PBAD-T7系统，但它也并不是没有问题的。该系统是通过阿拉伯糖进行诱导的（Khlebnikov A，Risa O，Skaug T. et al.；Regulatable arabinose-inducible gene expression system with consistent control in all cells of a culture，J Bacteriol，2000，182(24)：7029~7034），首先的问题是阿拉伯糖不能够通过细胞膜进行自由扩散，其次阿拉伯糖的价格虽然比IPTG便宜，但是如果要大量表达蛋白的话，代价还是会很高。

现有技术中，关于DisA蛋白的表达仍然采用传统的T7表达系统，即通过pET28α（+）载体将DisA基因转入大肠杆菌BL21表达菌株中，这种方法所制备DisA蛋白可溶度较差，而且诱导表达时以IPTG作为诱导剂，存在蛋白制备成本高，无法大量制备的弊端，因而急需开发一种适于DisA蛋白大量表达的表达系统。 

发明内容

本发明目的在于提供一种用于DisA蛋白表达的pEX-MBP重组质粒，通过将该质粒引入T7表达系统，同时结合诱导系统的改变，可以大量制备DisA蛋白。

本发明采取的技术方案如下：

一种用于DisA蛋白表达的pEX-MBP重组质粒，其碱基序列如序列表所示。

用于DisA蛋白表达的pEX-MBP重组质粒的制备方法，该重组质粒是在pBbB3a-GFP的基础上改造而成的，包括以下步骤：

（1）将质粒pBbB3a-GFP上的SspⅠ位点进行突变；

（2）用NdeⅠ和BamHⅠ双酶切步骤（1）中突变后的pBbB3a-GFP；

（3）用NdeⅠ和BamHⅠ双酶切pMD19-T-His6 -MBP-TEV-LIC质粒；其中His6表示6个组氨酸标签，MBP（Maltose-binding protein）表示麦芽糖酶结合蛋白，TEV表示烟草蚀刻病毒蛋白酶序列，LIC表示非酶连接位点；

（4）将步骤（2）和步骤（3）双酶切产物进行连接即得pEX-MBP重组质粒。

步骤（1）中SspⅠ位点突变为将质粒pBbB3a-GFP上的279和5099处的SspⅠ点进行突变，将AAT/ATT突变为TAT/ATT。

所述用于DisA蛋白表达的pEX-MBP重组质粒用于制备可溶性的DisA蛋白，包括以下步骤：

（1）PCR克隆、扩增DisA基因；

（2）非酶连接方法将步骤（1）中扩增后DisA基因连接到pEX-MBP重组质粒上，构建重组质粒表达载体pEX-MBP-DisA；

（3）将重组质粒表达载体pEX-MBP-DisA转化进入大肠杆菌BL21诱导表达，表达完成后破碎、离心、提纯即可获得DisA蛋白。

步骤（3）中所述诱导采用丙酸钠作为诱导剂。

现有技术中，为增加表达后蛋白的可溶性，可以在载体上增加可溶性标签以避免包涵体的形成（刘爽；原核表达可溶性表达策略；生物技术通讯，2005，16(2)：172-175），而且有些标签不仅能够增加蛋白的可溶性而且还可以进行蛋白纯化，比如GST、MBP等。然而需要注意的是，由于许多标签都是分子量大的蛋白，当使用它们做可溶性融合标签后通常需要进一步考虑将它们移除的问题。对于本发明而言，为增加表达后蛋白的可溶性，同样采用了增加标签的做法，本发明采用的是分子量为42kd的MBP标签，它能有效增加表达后的DisA蛋白的可溶性。但本发明所增加的标签是构建于重组后的质粒上的，即将标签与质粒重组后，然后再连接DisA基因进行表达，并非表达DisA蛋白后才增加的标签，与现有技术差别较大。

多聚组氨酸标签所表达的是一种带有多个组氨酸的小肽，作为一种融合标签，用来表达融合蛋白非常方便，而且易于纯化，本发明所添加的6×His标签就是利用了这个优点，利用该标签可以准确地识别和纯化目的蛋白。

增加标签虽然可以提供蛋白的可溶性，但是生物化学研究和用于治疗作用的蛋白则仍需要移除这些标签而保留稳定的、可溶性的目的蛋白。为了达到这样的目的，最常用的措施是在可溶性标签和目的蛋白之间设计一个蛋白酶切割位点，还要确保目的蛋白在移除标签后具有活性。本发明通过在融合部位的N端放置一个TEV标签，它的特异性很高，作为蛋白酶切割位点，在获得高纯度蛋白后，便于从N端进行切割来获得目的蛋白。

为了克服现有的T7表达系统中采用IPTG作为诱导剂成本较高、且存在毒性的弊端，在将重组质粒表达载体pEX-MBP-DisA转化大肠杆菌后，可采用低成本的丙酸钠诱导表达系统。丙酸钠是一种膜通透性弱酸盐，可以通过细胞膜渗透出来，在酶的作用下转变为2-甲基枸橼酸，从而进一步激活prpBCDE操纵子的转录，诱导目的蛋白的表达。由于丙酸钠诱导表达系统可以在不同的诱导物浓度下有效的调控蛋白表达，而且当诱导物浓度很高时也可以高效表达蛋白，因而适于大规模制备DisA蛋白。

本发明是先将pBbB3a-GFP进行位点突变，突变后进行双酶切。重组的His6 -MBP-TEV-LIC标签是连接于pMD19-T质粒载体中的，将pMD19-T-His6 -MBP-TEV-LIC质粒进行双酶切，然后将其与切开的pBbB3a-GFP进行连接，这样就得到了本发明的重组质粒。具体表达DisA蛋白时，首先将本发明所提供的pEX-MBP重组质粒连接DisA基因，构建pEX-MBP-DisA重组表达质粒载体，然后转化大肠杆菌BL21细胞诱导表达，表达完成后破碎、离心、提纯即可获得DisA蛋白。pEX-MBP-DisA重组表达质粒载体中，LIC是非酶连接位点，DisA基因是在该位点连入，而TEV正好在LIC位点的N端，而TEV是蛋白酶切割位点，因而蛋白表达完成后便于将相关标签切除。

综上所述，本发明所提供的用于DisA蛋白表达的pEX-MBP重组质粒，特异性地用于DisA蛋白的表达纯化，与传统的pET28α（+）载体所构建的重组质粒表达载体相比，由于加入了可溶性的标签麦芽糖结合蛋白（MBP），因而所表达的DisA蛋白可溶度较高；其次所构建的表达系统以丙酸钠作为诱导剂，成本低廉，而且对细菌没有毒性，因而适于表达DisA蛋白，且表达后的蛋白可特异性的切除相关标签蛋白，获得的DisA蛋白纯度较高，因而具有较好的适用性。

附图说明

图1为突变后质粒pBbB3a-GFP-M的NdeⅠ和BamHⅠ双酶切电泳结果，其中1是DNA分子质量标准DL5000，2是双酶切电泳结果；

图2是质粒pMD19-T-His6 -MBP-TEV-LIC的NdeⅠ和BamHⅠ双酶切结果，其中1是DNA分子质量标准DL5000，2是双酶切电泳结果；

图3为重组质粒菌液PCR鉴定结果，其中1是DNA分子质量标准DL5000，2~6是菌液PCR结果；

图4为构建pEX-MBP-DisA重组质粒表达载体流程示意图；

图5为DisA基因PCR扩增结果，其中1为DNA分子质量标准DL2000，2为DisA基因PCR扩增结果；

图6为重组质粒pEX-MBP的SspⅠ单酶切结果，其中1为DNA分子质量标准DL15000 ，2为重组质粒pEX-MBP的SspⅠ单酶切结果；

图7为重组表达质粒载体pEX-MBP-DisA的酶切鉴定结果，其中1为重组表达质粒载体的EcoRⅠ单酶切鉴定，2为DNA分子质量标准DL5000；

图8为pEX-MBP-DisA和pET28α(+)-DisA诱导后的菌体破碎后的上清的Western Blotting结果，其中1为pET28α(+)-DisA诱导后的菌体破碎后的上清的Western Blotting结果，2为pEX-MBP-DisA诱导后的菌体破碎后的上清的Western Blotting结果。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步的解释说明，以使本领域技术人员便于理解和实施本发明。

实施例1

用于DisA蛋白表达的pEX-MBP重组质粒，该质粒是在pBbB3a-GFP的基础上进行改造的，首先按照Quik Change Site-Directed Mutagenesis Kit(Agilent Technologies公司，200518) 试剂盒说明，对pBbB3a-GFP上的279和5099处的SspⅠ点进行突变，将AAT/ATT突变为TAT/ATT，突变后载体暂时命名为pBbB3a-GFP-M，然后用NdeⅠ和BamHⅠ双酶切pBbB3a-GFP-M。His6 -MBP-TEV-LIC序列由上海生工生物工程有限公司合成，合成后序列连入pMD19-T质粒载体中，与pBbB3a-GFP-M连接时，将pMD19-T-His6-MBP-TEV-LIC质粒双酶切，然后与双酶切后的pBbB3a-GFP-M连接即可得到本发明用于DisA蛋白表达的pEX-MBP重组质粒，命名为pEX-MBP，其中His6表示6个组氨酸标签，MBP（Maltose-binding protein）表示麦芽糖酶结合蛋白，TEV表示烟草蚀刻病毒蛋白酶序列，LIC表示非酶连接位点。

具体制备过程简要介绍如下：

（1）突变pBbB3a-GFP质粒上的SspⅠ位点

①引物的设计和合成

SspI 279 Mutation F：CATATTACGCAGTTCGCGTATATTACCGGGCCAGCGC；

SspI 279 Mutation R：GCGCTGGCCCGGTAATATACGCGAACTGCGTAATATG；

SspI 5099 Mutation F：TCATACTCTTCCTTTTTCTATATTATTGAAGCATTTA；

SspI 5099 Mutation R：TAAATGCTTCAATAATATAGAAAAAGGAAGAGTATGA。

②位点突变

按Quik Change Site-Directed Mutagenesis Kit(Agilent Technologies公司，200518) 试剂  盒说明书对pBbB3a-GFP上的279和5099处的SspⅠ进行突变，将AAT/ATT突变为TAT/ATT，突变后载体暂时命名为pBbB3a-GFP-M。

（2）构建pEX-MBP重组质粒

 将pBbB3a-GFP-M用NdeⅠ和BamHⅠ双酶切，结果如图1所示，回收4500bp左右片段，然后将上海生工生物工程有限公司所提供的pMD19-T-His6 -MBP-TEV-LIC质粒也使用NdeⅠ和BamHⅠ双酶切，结果如图2所示，回收1200bp左右片段，然后将所回收片段用T4 DNA连接酶进行连接。

 pBbB3a-GFP-M双酶切体系：NdeⅠ（Fermentas，FD0584），1μL；

                           BamHⅠ(Fermentas，FD0054)，1μL；          

                           10×酶切缓冲液(Fermentas，FD0054)，2μL；

                           pBbB3a-GFP-M（150ng/μL），10μL；

                           ddH₂O，6μL；

37℃酶切1h。

pMD19-T-His6 -MBP-TEV-LIC双酶切体系：

                             NdeⅠ（Fermentas，FD0584），1μL；

                         BamHⅠ(Fermentas，FD0054)，1μL；           

                         10×酶切缓冲液(Fermentas，FD0054)，2μL；

                         pMD19-T-His6-MBP-TEV-LIC(150ng/μL)，10μL；

                             ddH₂O，6μL；

37℃酶切1h。

T4 DNA连接酶连接体系：

T4 DNA连接酶（Fermentas，EL0014），1 μL；

                      10×连接酶缓冲液（Fermentas，EL0014），1μL；

pBbB3a-GFP-M切胶回收产物 (20ng/μL)，2μL；

                       pMD19-T-His6-MBP-TEV-LIC切胶回收产物(15ng/μL)，2μL；

ddH₂O，4μL；

22℃连接20min，然后转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞。

转化后菌液铺于含氨苄青霉素（100μg/mL）的固体LB平板上，所培养的单菌落用含氨苄青霉素（100μg/mL）的液体LB进行扩大培养，培养后菌液进行PCR鉴定，鉴定结果如图3所示，将鉴定结果为阳性的菌落用质粒小量提取试剂盒（上海生工，SK8192）进行提取，提取所得即为本发明所提供的用于DisA蛋白表达的pEX-MBP重组质粒，其碱基序列如序列表所示。

实施例2

将实施例1所制得的用于DisA蛋白表达的pEX-MBP重组质粒构建pEX-MBP-DisA，构建过程如图4所示，然后诱导表达DisA蛋白，具体过程简述如下：

首先PCR克隆DisA基因，然后通过非酶连接方法将DisA基因连接到实施例1所制得的pEX-MBP重组质粒上，构建pEX-MBP-DisA重组质粒表达载体，将该载体转化进入大肠杆菌BL21中进行诱导表达，诱导表达时以丙酸钠作为诱导剂，表达完成后破碎、离心、提纯即可获得DisA蛋白。

详细的制备步骤简要介绍如下：

（1）PCR克隆DisA基因

①引物的设计和合成

根据DisA基因的核苷酸序列和表达载体克隆位点的要求，设计引物，具体序列如下：

F：5’-TACTTCCAATCCAATGCAATGGTTGCTCCGGGTACCGC-3’；

R：5’-TTATCCACTTCCAATGTTATTAACCCATGTAACGTTCCAGC-3’。

引物由上海生工生物工程有限公司合成。

②PCR扩增目的片段

PCR体系： Q5聚合酶（NEB，M0493L），0.25μL；

5×Q5聚合酶缓冲液（NEB，M0493L），5μL；

5×Q5聚合酶Enhancer（NEB，M0493L），5μL；

Primer-F（20 μmol/L），0.5μL；

Primer-R（20 μmol/L），0.5μL； 

pMD19-T-DisA质粒（购自上海生工生物工程有限公司）（100ng/μL），1μL；

2.5mM dNTP（TAKARA,RR001A），2μL；

ddH₂O，10.75μL。

反应条件：95℃ 5min，95℃ 30s，65℃ 30s，72℃ 70s，反应35个循环，72℃ 10min。

将PCR产物跑1%的琼脂糖凝胶电泳，结果见图5，用切胶纯化试剂盒（上海生工，SK8132）进行回收。

③DisA基因与pEX-MBP重组质粒连接构建pEX-MBP-DisA重组质粒表达载体

    将步骤②回收的DisA基因与实施例1制备的pEX-MBP重组质粒连接，构建pEX-MBP-DisA重组质粒表达载体，并筛选，鉴定，过程如下： 

将实施例1制备的pEX-MBP重组质粒用SspⅠ酶(Fermentas，FD0774)进行单酶切，酶切后产物跑1%的琼脂糖凝胶电泳，结果见图6，用切胶纯化试剂盒（上海生工，SK8132）进行回收。

将回收物用非酶连接试剂盒进行连接，连接体系：

Exnase Ⅱ（Vazyme，C112-01），2 μL；

5×ExnaseⅡ 缓冲液（Vazyme,C112-01），4 μL；

pEX-MBP 单酶切产物(10ng/μL) ，10μL； 

步骤②的DisA的PCR产物（40ng/μL），1μL；

ddH₂O，3μL。

37℃连接30min，然后冰上放置5min。

取10μL转化入大肠杆菌DH5α感受态细胞中，将转化后细胞均匀涂在含氨苄青霉素（100μg/mL）的LB培养平板上培养。挑取单个菌落于含2ml氨苄青霉素（100μg/mL）的LB培养液中扩增培养，220rpm振荡条件下，37℃培养16h后提取质粒，用EcoRⅠ进行单酶切鉴定。

酶切体系：

 EcoRⅠ(Fermentas，FD0274) ，0.5 μL；

10×反应缓冲液(Fermentas,FD0274)，1 μL；

扩增培养的pEX-MBP-DisA重组质粒表达载体（500ng/μL)，1 μL； 

ddH₂O，8μL；

37℃酶切10min。

所构建的pEX-MBP-DisA重组质粒表达载体结构示意图见图4，重组质粒表达载体酶切鉴定图谱见图7。

④将所构建的pEX-MBP-DisA重组质粒表达载体进一步转化表达DisA蛋白

为检验所构建的pEX-MBP-DisA重组质粒表达载体所制备的DisA蛋白的可溶性效果，发明人做了进一步的对比实验。以构建的pEX-MBP-DisA重组质粒表达载体和现有技术中的pET28α(+)-DisA重组质粒表达载体分别转化进BL21感受态细胞。

具体培养过程简介如下：

将pEX-MBP-DisA重组质粒表达载体转化细胞在涂覆有氨苄青霉素（100μg/mL）的LB平板上进行培养过夜，挑取单个菌落进行过夜培养，按1︰100的体积比接种到50mL含有氨苄青霉素（100μg/mL）的LB液体培养基中，30℃培养到OD₆₀₀=0.6~0.8，加入1mol/L丙酸钠溶液1mL，180rpm振荡条件下诱导过夜。4℃、10000rpm离心10min收菌。超声波破碎，功率160W，工作4s，间歇8s，共持续25min。

将pET28α(+)-DisA重组质粒表达载体转化细胞在卡那霉素（50μg/mL）的LB平板上进行培养过夜，挑取单个菌落进行过夜培养，按1︰100的体积比接种到50mL含有卡那霉素（50μg/mL）的LB液体培养基中，30℃培养到OD₆₀₀=0.6~0.8，加入100mg/mL的IPTG溶液120μL，180rpm振荡条件下诱导过夜。4℃、10000rpm离心10min收菌。超声波破碎，功率160W，工作4s，间歇8s，共持续25min。

将上述超声波破碎后上清分别用BCA蛋白定量试剂盒(北京鼎国昌盛生物技术公司，43B00150)进行定量处理，结果如下表。

重组质粒表达载体	蛋白浓度（μg/mL）
		对照 pET28α(+)-DisA	4688.62
本发明 pEX-MBP-DisA	5535.74

配置12%的SDS-PAGE胶，每孔各加50μg的蛋白上清液样品，进行Western Blotting检测，结果见图8，将Western Blotting结果进行灰度扫描分析（Gel-Pro analyzer4软件），结果如下表。

重组质粒表达载体	灰度值
		对照 pET28α(+)-DisA	252.5
本发明 pEX-MBP-DisA	537.83

   从上表可以看出，重组质粒表达载体pEX-MBP-DisA所表达的蛋白的灰度值是现有的重组质粒表达载体pET28α(+)-DisA所表达蛋白的2.13倍，即与现有的质粒pET28α(+)相比，本发明所提供的重组质粒pEX-MBP用于表达DisA蛋白时，使表达蛋白的可溶度提高了113%，因而具有较好的技术进步效果。 

                         SEQUENCE LISTING

 

<110>  河南农业大学

 

<120>  一种用于DisA表达的pEX-MBP重组质粒

 

<130>  none

 

<160>  1    

 

<170>  PatentIn version 3.5

 

<210>  1

<211>  6729

<212>  DNA

<213>  pEX-MBP重组质粒

 

<400>  1

gacgtcttaa ttacccgact ggtctttggc accagctttt aaacgacgcc acagagtggt       60

 

gcggctaatc cccagataac gcgccgcggc ggtcttatcg cccttaaagc gcgccagtac      120

 

atcctgtaac gcgttcgcat ccacggttga aggcgtcagt tctgctgtgt tcaccataag      180

 

ctcaggtaat aactgccgca taaattgcct gtccagcgtt ggcgcgggat cgacgcttaa      240

 

aaaaagcgcc aggcgctcca tcatattacg cagttcgcgt atattaccgg gccagcgcca      300

 

ggccagcaaa agcggctgac actgtgtcaa tccatgacgt atcgattcgg taaacggaat      360

 

ttccatcgcc gccagcgact gttttaaaaa gctttccgcc agcggcaaaa tatcagcctg      420

 

ccgctcgcgc aaaggaggaa gcgtcagacg cagaatactc aggcgataaa agagatcggg      480

 

gcgaaaacgt ccttgcatta tctcccgatc cagatcgcaa tgcgtagcgc tgatcacccg      540

 

gacatccacc gggatcggct ggtgtccgcc gacgcgagtg acggcttttt cctccagtac      600

 

gcgcaaaagt cgggtttgta acggcaaggg catttcgccg atttcatcca gaaacagcgt      660

 

gccgccgtgt gcgatttcaa acagccccgc ccggcctcct cgtcgtgaac cggtaaacgc      720

 

gccctcttca taaccaaaca gttccgcttc cagcaacgac tcggtaatcg cgccgcaatt      780

 

gacggcgaca aagggagggg atggcttatt ctgacggtga ggctggcggt gaaagaacgt      840

 

ctggtgaatc gcctgcgccg ccagctcttt tccggtccct gtttccccct gaatcagcac      900

 

tgccgcacgg gagcgggcat agagcgtaat cgtctggcgg agctgctcca tttgcggcga      960

 

ctggccgcgt atatcgccca gttcataccg ggtttgtaat cccttgccgg atgggtaatc     1020

 

cacgcgctgg cgccgtgtca gacgggtcat atccagcgca tcatgaaaag cctgacgaac     1080

 

ggtcgccgcg gaataaataa agatggcggt cattcctgcc tcttccgcca gatcggtaat     1140

 

taatcccgcg ccgacgacgg cctcaatacc gttggcctta agttcgttaa tttgcccgcg     1200

 

cgcgtcctct tcggtgacat agcttcgctg ttcaagacgg aggtgaaacg ttttctgaaa     1260

 

ggcaagtaaa gccggaatgg tctcctgata ggtcacgata ccgatagacg aggtgagctt     1320

 

tcccgctttc gccagcgcct gtaatacatc gaatccgctg ggcttgatga ggatcaccgg     1380

 

tattgacagg cggcttttta aataggcccc attcgaaccc gccgcgataa tcgcgtcgca     1440

 

gcgctcggtc gccagttttt tgcgaatgta ggtcaccgcc ttttcaaagc cgagttgaat     1500

 

aggcgtgatg gtcgccagat gatcaaattc caggctgata tcccgaaaca gttcgaacag     1560

 

acgcgttacg gagaccgtcc agatcaccgg tttatcgcta ttatcgcgcg gagcgctgtg     1620

 

ggcagtcgtc atcgcagtag attcatcttt aaggggcgat tttttgtttt aaacgtgttt     1680

 

cataaatgtt gcaatgaaac agggtgattc gtttcatgaa acgttagctg acacgttttt     1740

 

ttttccctta atcgcgctta ttcataacag aaatgactgt aattacctgt ttttaaatct     1800

 

cattgtattt aattttctcg ctgcctcttt gcctggcata gcctttgctt tggtgaatac     1860

 

atcttgaata acaatttact aacatggaat tcaaaagatc ttttaagaag gagatataca     1920

 

tatgaaatct tctcaccatc accatcacca tggttcttct atgaaaatcg aagaaggtaa     1980

 

actggtaatc tggattaacg gcgataaagg ctataacggt ctcgctgaag tcggtaagaa     2040

 

attcgagaaa gataccggaa ttaaagtcac cgttgagcat ccggataaac tggaagagaa     2100

 

attcccacag gttgcggcaa ctggcgatgg ccctgacatt atcttctggg cacacgaccg     2160

 

ctttggtggc tacgctcaat ctggcctgtt ggctgaaatc accccggaca aagcgttcca     2220

 

ggacaagctg tatccgttta cctgggatgc cgtacgttac aacggcaagc tgattgctta     2280

 

cccgatcgct gttgaagcgt tatcgctgat ttataacaaa gatctgctgc cgaacccgcc     2340

 

aaaaacctgg gaagagatcc cggcgctgga taaagaactg aaagcgaaag gtaagagcgc     2400

 

gctgatgttc aacctgcaag aaccgtactt cacctggccg ctgattgctg ctgacggggg     2460

 

ttatgcgttc aagtatgaaa acggcaagta cgacattaaa gacgtgggcg tggataacgc     2520

 

tggcgcgaaa gcgggtctga ccttcctggt tgacctgatt aaaaacaaac acatgaatgc     2580

 

agacaccgat tactccatcg cagaagctgc ctttaataaa ggcgaaacag cgatgaccat     2640

 

caacggcccg tgggcatggt ccaacatcga caccagcaaa gtgaattatg gtgtaacggt     2700

 

actgccgacc ttcaagggtc aaccatccaa accgttcgtt ggcgtgctga gcgcaggtat     2760

 

taacgccgcc agtccgaaca aagagctggc aaaagagttc ctcgaaaact atctgctgac     2820

 

tgatgaaggt ctggaagcgg ttaataaaga caaaccgctg ggtgccgtag cgctgaagtc     2880

 

ttacgaggaa gagttggcga aagatccacg tattgccgcc actatggaaa acgcccagaa     2940

 

aggtgaaatc atgccgaaca tcccgcagat gtccgctttc tggtatgccg tgcgtactgc     3000

 

ggtgatcaac gccgccagcg gtcgtcagac tgtcgatgaa gccctgaaag acgcgcagac     3060

 

taatgggatc gaggaaaacc tgtacttcca atccaatgca atggttgctc cgggtaccgc     3120

 

tctgcgtgaa ggtctggact ctgttctgcg tgctaaaacc ggtgctctga tcgttgttgg     3180

 

tgacgctccg gaagttctgc gtttcgttga aggtggtttc cacatcgaca ccgaattcac     3240

 

cccggctggt ctgtacgaac tggctaaaat ggacggtgct atcgttctgt ctcgtgacgc     3300

 

tcgtcgtatc ctgtacgcta acgctcagct gatcccggac ccgtctatcc cgtctgaaga     3360

 

aaccggtatc cgtcaccgta ccgctgaacg tttcgctcgt cagaccggtg ctctggttat     3420

 

cgctatctct cagcgtcgtg gtgttatcac cctgtacaaa ggtgctgaac gttactctct     3480

 

gcaggacatc tctgttatcc tgtctaaagc taaccaggct gttcagaccc tggaaaaata     3540

 

caaaggtgtt ctggacaaag ctctgatcaa cctgaccgct ctggaattcg aagacctggt     3600

 

taccgtttac gacgttgctc gtgttgttca gcgtggtgtt atggttctgc aggttgttaa     3660

 

agaactggaa aactacatct gcgaactggg taccgaaggt cgtctgatca ccatgcaggt     3720

 

tgaagaactg ctggctaacg ttcgtgaaga actgtgctgc gttatccgtg actacctgga     3780

 

cgacgaaggt aaaaacgctg aagacgttct gcgtgttgtt tcttcttggc cgccggacga     3840

 

cctgctggac ctgaccggta tctctcgtat cctgggttac ggtgcttctt cttctatcct     3900

 

ggacctgtct gtttacccgc gtggttaccg tatcctgcag cgtatcccgc gtctgccggc     3960

 

tcagatcgtt gaaaacctga tccgtacctt caaaaacctg cagaacatcc tgaaagcttc     4020

 

tatcgaagaa ctggacgacg ttgaaggtat cggtgaagtt cgtgctaaag ctatcaaaaa     4080

 

cggtctgcac cgtctgcagg aacaggttat gctggaacgt tacatgggtt aataacattg     4140

 

gaagtggata acggatccaa actcgagtaa ggatctccag gcatcaaata aaacgaaagg     4200

 

ctcagtcgaa agactgggcc tttcgtttta tctgttgttt gtcggtgaac gctctctact     4260

 

agagtcacac tggctcacct tcgggtgggc ctttctgcgt ttatacctag gctacagccg     4320

 

atagtctgga acagcgcact tacgggttgc tgcgcaaccc aagtgctacc ggcgcggcag     4380

 

cgtgacccgt gtcggcggct ccaacggctc gccatcgtcc agaaaacacg gctcatcggg     4440

 

catcggcagg cgctgctgcc cgcgccgttc ccattcctcc gtttcggtca aggctggcag     4500

 

gtctggttcc atgcccggaa tgccgggctg gctgggcggc tcctcgccgg ggccggtcgg     4560

 

tagttgctgc tcgcccggat acagggtcgg gatgcggcgc aggtcgccat gccccaacag     4620

 

cgattcgtcc tggtcgtcgt gatcaaccac cacggcggca ctgaacaccg acaggcgcaa     4680

 

ctggtcgcgg ggctggcccc acgccacgcg gtcattgacc acgtaggcca acacggtgcc     4740

 

ggggccgttg agcttcacga cggagatcca gcgctcggcc accaagtcct tgactgcgta     4800

 

ttggaccgtc cgcaaagaac gtccgatgag cttggaaagt gtcttctggc tgaccaccac     4860

 

ggcgttctgg tggcccatct gcgccacgag gtgatgcagc agcattgccg ccgtgggttt     4920

 

cctcgcaata agcccggccc acgcctcatg cgctttgcgt tccgtttgca cccagtgacc     4980

 

gggcttgttc ttggcttgaa tgccgatttc tctggactgc gtggccatgc ttatctccat     5040

 

gcggtagggg tgccgcacgg ttgcggcacc atgcgcaatc agctgcaact tttcggcagc     5100

 

gcgacaacaa ttatgcgttg cgtaaaagtg gcagtcaatt acagattttc tttaacctac     5160

 

gcaatgagct attgcggggg gtgccgcaat gagctgttgc gtacccccct tttttaagtt     5220

 

gttgattttt aagtctttcg catttcgccc tatatctagt tctttggtgc ccaaagaagg     5280

 

gcacccctgc ggggttcccc cacgccttcg gcgcggctcc ccctccggca aaaagtggcc     5340

 

cctccggggc ttgttgatcg actgcgcggc cttcggcctt gcccaaggtg gcgctgcccc     5400

 

cttggaaccc ccgcactcgc cgccgtgagg ctcggggggc aggcgggcgg gcttcgccct     5460

 

tcgactgccc ccactcgcat aggcttgggt cgttccaggc gcgtcaaggc caagccgctg     5520

 

cgcggtcgct gcgcgagcct tgacccgcct tccacttggt gtccaaccgg caagcgaagc     5580

 

gcgcaggccg caggccggag gcactagtgc ttggattctc accaataaaa aacgcccggc     5640

 

ggcaaccgag cgttctgaac aaatccagat ggagttctga ggtcattact ggatctatca     5700

 

acaggagtcc aagcgagctc gtaaacttgg tctgacagtt accaatgctt aatcagtgag     5760

 

gcacctatct cagcgatctg tctatttcgt tcatccatag ttgcctgact ccccgtcgtg     5820

 

tagataacta cgatacggga gggcttacca tctggcccca gtgctgcaat gataccgcga     5880

 

gacccacgct caccggctcc agatttatca gcaataaacc agccagccgg aagggccgag     5940

 

cgcagaagtg gtcctgcaac tttatccgcc tccatccagt ctattaattg ttgccgggaa     6000

 

gctagagtaa gtagttcgcc agttaatagt ttgcgcaacg ttgttgccat tgctacaggc     6060

 

atcgtggtgt cacgctcgtc gtttggtatg gcttcattca gctccggttc ccaacgatca     6120

 

aggcgagtta catgatcccc catgttgtgc aaaaaagcgg ttagctcctt cggtcctccg     6180

 

atcgttgtca gaagtaagtt ggccgcagtg ttatcactca tggttatggc agcactgcat     6240

 

aattctctta ctgtcatgcc atccgtaaga tgcttttctg tgactggtga gtactcaacc     6300

 

aagtcattct gagaatagtg tatgcggcga ccgagttgct cttgcccggc gtcaatacgg     6360

 

gataataccg cgccacatag cagaacttta aaagtgctca tcattggaaa acgttcttcg     6420

 

gggcgaaaac tctcaaggat cttaccgctg ttgagatcca gttcgatgta acccactcgt     6480

 

gcacccaact gatcttcagc atcttttact ttcaccagcg tttctgggtg agcaaaaaca     6540

 

ggaaggcaaa atgccgcaaa aaagggaata agggcgacac ggaaatgttg aatactcata     6600

 

ctcttccttt ttctatatta ttgaagcatt tatcagggtt attgtctcat gagcggatac     6660

 

atatttgaat gtatttagaa aaataaacaa ataggggttc cgcgcacatt tccccgaaaa     6720

 

gtgccacct                                                             6729

Claims (5)

1.一种用于DisA蛋白表达的pEX-MBP重组质粒，其特征在于，所述pEX-MBP重组质粒的碱基序列如序列表所示。

2.权利要求1所述用于DisA蛋白表达的pEX-MBP重组质粒的制备方法，其特征在于，该重组质粒是在pBbB3a-GFP的基础上改造而成的，包括以下步骤：

（1）将质粒pBbB3a-GFP上的SspⅠ位点进行突变；

（2）用NdeⅠ和BamHⅠ双酶切步骤（1）中突变后的pBbB3a-GFP；

（3）用NdeⅠ和BamHⅠ双酶切pMD19-T-His6 -MBP-TEV-LIC质粒；

（4）将步骤（2）和步骤（3）双酶切产物进行连接即得pEX-MBP重组质粒。

3.如权利要求2所述pEX-MBP重组质粒的制备方法，其特征在于，步骤（1）中SspⅠ位点突变为将质粒pBbB3a-GFP上的279和5099处的SspⅠ点进行突变，将AAT/ATT突变为TAT/ATT。

4.权利要求1所述用于DisA蛋白表达的pEX-MBP重组质粒在制备可溶性的DisA蛋白中的应用，其特征在于，制备可溶性的DisA蛋白包括以下步骤：

（1）PCR克隆、扩增DisA基因；

（2）非酶连接方法将步骤（1）中扩增后DisA基因连接到pEX-MBP重组质粒上，构建重组质粒表达载体pEX-MBP-DisA；

（3）将重组质粒表达载体pEX-MBP-DisA转化进入大肠杆菌BL21诱导表达，表达完成后破碎、离心、提纯即可获得DisA蛋白。

5.如权利要求4所述pEX-MBP重组质粒在制备可溶性的DisA蛋白中的应用，其特征在于，步骤（3）中所述诱导采用丙酸钠作为诱导剂。