JP2019154312A - 非光栄養性c1代謝微生物での遺伝子発現制御のための核酸およびベクター、およびそれらの形質転換体 - Google Patents
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Abstract
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特許文献2: WO2015/195972号パンフレット
特許文献3: 特表2006−515166号公報
非特許文献2: Henard,C.A. et al.,Biological conversion of methane to lactate by an obligate methanotrophic bacterium.,Sci.Rep.,Vol.6,21585(2016)
非特許文献3: Irla,M. et al.,Genome−based genetic tool development for Bacillus methanolicus: theta− and rolling circle−replicating plasmids for inducible gene expression and application to methanol−based cadaverine production.,Front.Microbiol.,Vol.7,1481(2016)
非特許文献4: Salis,H.M.,The ribosome biding site calculator.,Methods Enzymol.,Vol.498,19−42(2011)
(1)非光栄養性C1代謝微生物での遺伝子発現制御のための核酸であって、リボスイッチをコードする配列を含むことを特徴とする前記核酸;
(2)リボスイッチがテオフィリン結合性リボスイッチであることを特徴とする、上記(1)の核酸;
(3)前記テオフィリン結合性リボスイッチが、5’−GGTACCGGTGATACCAGCATCGTCTTGATGCCCTTGGCAGCACCCTGCTAAGGAGGCAACAAG−3’(配列番号:1)の配列を有することを特徴とする、上記(2)の核酸;
(4)前記リボスイッチが、天然もしくは人工的なプロモーターの下流に配置されていることを特徴とする、上記(1)〜(3)のいずれかの核酸;
(5)前記プロモーターが、誘導性プロモーターであることを特徴とする上記(4)の核酸;
(6)前記プロモーターが、恒常性プロモーターであることを特徴とする上記(4)の核酸;
(7)前記プロモーターが、trcプロモーターであることを特徴とする上記(5)又は(6)の核酸;
(8)天然もしくは人工的なリボソーム結合配列を含むことを特徴とする上記(1)〜(7)の核酸;
(9)前記リボソーム結合配列が、5’−AAGGAGG−3’の配列を有することを特徴とする上記(8)の核酸;
(10)前記リボソーム結合配列が、スペーサーを介しリボスイッチの下流に配置されていることを特徴とする、上記(8)又は(9)の核酸;
(11)更に発現されるべき遺伝子を含み、該遺伝子が、ターミネーターの上流に配置されていることを特徴とする、上記(1)〜(10)のいずれかの核酸;
(13)上記(1)〜(11)のいずれかの核酸を含む非光栄養性C1代謝微生物の形質転換体;
(14)前記核酸が、宿主微生物の染色体上に組み込まれている、上記(13)の形質転換体;
(15)前記核酸が、該核酸を含むベクターとして宿主微生物に導入されている、上記(13)の形質転換体;
(16)非光栄養性C1代謝微生物が、メタン資化性菌またはメタノール資化性菌であることを特徴とする、上記(13)〜(15)のいずれかの形質転換体;
(17)非光栄養性C1代謝微生物が、メチロモナス(Methylomonas)、メチロバクター(Methylobacter)、メチロコッカス(Methylococcus)、メチロサイナス(Methylosinus)、メチロシスチス(Methylocystis)、メチロマイクロビウム(Methylomicrobium)、メチロフィラス(Methylophilus)、メチロバチルス(Methylobacillus)、メチロバクテリウム(Methylobacterium)、キサントバクター(Xanthobacter)及びパラコッカス(Paracoccus)からなる群から選択されることを特徴とする、上記(13)〜(15)のいずれかの形質転換体;
(18)非光栄養性C1代謝微生物が、Methylococcus capsulatus Bath(NCIMB 11132)、Methylophilus methylotrophus AS1(NCIMB 10515)、Methylobacillus glycogenes(NCIMB 11375)及びParacoccus denitrificans(NCIMB 11627)からなる群から選択されることを特徴とする、上記(13)〜(15)のいずれかの形質転換体;
(20)前記リガンドが、テオフィリンであることを特徴とする上記(19)の方法;
(21)前記リガンドが、形質転換体により自律的に供給されることを特徴とする、上記(19)又は(20)の方法;および、
(22)上記(1)〜(11)のいずれかの核酸を含む、非光栄養性C1代謝微生物の形質転換のためのキット。
組成は次のとおりである:20g/L LB培地、レノックス(ディフコ社製)。
[120℃、20分間蒸気滅菌を行った。必要に応じて、終濃度50mg/L カナマイシン硫酸塩、1.5% Bacto agar(ディフコ社製)を加えた。]
組成は次のとおりである:0.8mM MgSO4・7H2O、10mM NaNO3、0.14mM CaCl2、1.2mM NaHCO3、2.35mM KH2PO4、3.4mM K2HPO4、20.7μM Na2MoO4・2H2O、1μM CuSO4・5H2O、10μM FeIII−Na−EDTA、1mL trace metal solution(500mg/L FeSO4・7H2O、400mg/L ZnSO4・7H2O、20mg/L MnCl2・7H2O、50mg/L CoCl2・6H2O、10mg/L NiCl2・6H2O、15mg/L H3BO3、250mg/L EDTA)
[Phosphate、bicarbonate、CuSO4・5H2O、FeIII−Na−EDTA、NaHCO3は、120℃、20分間蒸気滅菌後、添加した。必要に応じて、7.5〜10mg/L カナマイシン硫酸塩、25mg/L ナリジクス酸、1.5% Bacto agarも、滅菌後加えた。]
組成は次のとおりである:0.2g/L MgSO4・7H2O、0.5g/L (NH4)2SO4、2.53g/L K2HPO4、2.59g/L NaH2PO4、1mL trace metal solution(2.2g/L ZnSO4・7H2O、5g/L Na2EDTA、733mg/L CaCl2・2H2O、506mg/L MnCl2・7H2O、110mg/L (NH4)6Mo7O24・4H2O、162mg/L CuSO4・5H2O、161mg/L CoCl2・6H2O、499mg/L FeSO4・7H2O)
[120℃、20分間蒸気滅菌を行った。必要に応じて、0.5% メタノール、10mg/L カナマイシン硫酸塩、25mg/L ナリジクス酸、1.5% Bacto agarも、滅菌後に加えた。]
(プラスミドの構築)
プラスミド構築に必要な核酸断片のPCR増幅には、Phusion polymerase(New England BioLabs社製)を用いた。プラスミド構築には、In−Fusion HD Cloningキット(Clontech社製)を用いた。広域宿主ベクターであるpBHR1(MoBiTec社製)へリボスイッチとtrcプロモーターのハイブリッド(Ptrc E*)、sfGFP遺伝子をクローニングすることによりpmk61Aを構築した。Ptrc E*およびsfGFPは、Genscript社により合成された。まず、Ptrc E*断片をmk316およびmk173Rにより増幅した。次に、sfGFP断片をmk176およびmk317Rにより増幅した。最後に、ベクター骨格をmk318およびmk319Rにより増幅した。これらの3つの断片をIn−Fusion HD Cloningキットにより連結し、pmk61Aを有するE.coli XL1−Blue(ニッポン・ジーン社製)のクローンを得た。プラスミドDNAを細胞から抽出・精製後、シーケンス解析により、pmk61Aが正しく得られていることを確認した。図1にpmk61Aの概要を示す。また、上記配列を以下に示す。
pmk61Aをカルシウムイオン法によりEscherichia coli S17−1株(バイオメダル社製)へ導入し、形質転換体を得た。プラスミドの導入をPCRにより確認した。形質転換体コロニーを、50mg/Lカナマイシンを含むLB培地3mLにて37℃で終夜振盪培養した後、0、0.1、2または5mMいずれかの濃度のテオフィリンを加えた3mLの同培地へ植え継ぎ、37℃で6時間振盪培養した。また、コントロールとして、野生株をテオフィリンを含まない同培地で培養した。遠心分離により培養上清を除去した後、得られた菌体を蒸留水へ懸濁し、適当に希釈した。蛍光強度(Ex:488nm、Em:530nm)を蛍光プレートリーダー(infinite200Pro、Tecan社製)で測定した。蛍光強度値はそれぞれのOD600で割った後、野生株(ブランク)におけるそれから差し引いた。図2に結果を示す。
(Methylococcus capsulatus Bathへのpmk61Aの導入)
pmk61Aは、Aliらにより報告された接合伝達を用いた形質転換法により、Methylococcus capsulatus Bathへ導入した(Ali et al.,Microbiology,Vol.152,2931−2942(2009))。
形質転換体コロニーを、10mg/Lカナマイシンおよび0、0.1、2、5、7.5または10mMいずれかの濃度のテオフィリンを加えたNMS培地10mLを含んだ130mL容の血清ボトルへ植菌した。また、コントロールとして、野生株をテオフィリンを含まない同培地へ植菌した。ボトルはブチルゴムセプタムで密閉し、60mLのボトル内空気を同体積の10%メタン/90%窒素の混合ガスと交換した。ボトルは、43℃で24時間培養した。培養液を新鮮なNMS培地で10倍希釈し、蛍光強度(Ex:488nm、Em:530nm)を蛍光プレートリーダー(infinite200Pro、Tecan社製)で測定した。蛍光強度値はそれぞれのOD600で割った後、野生株(ブランク)におけるそれから差し引いた。図3に結果を示す。大腸菌を用いた実験結果(図2)とは対照的に、非誘導時の蛍光は検出されなかった。同時に、テオフィリン濃度依存的に良好な発現誘導も示し、2mMのテオフィリン添加時の蛍光強度は、大腸菌におけるそれと同等であった(図2)。
(Methylophilus methylotrophus AS1へのpmk61Aの導入)
pmk61Aは、Kimらにより報告された接合伝達を用いた形質転換法により、Methylophilus methylotrophus AS1(NCIMB 10515)へ導入した(Kim et al.,Applied Biochemistry and Biotechnology,Vol.73,81−88(1998))。
形質転換体コロニーを、0.5%メタノール、10mg/Lカナマイシンおよび0または2mMいずれかの濃度のテオフィリンを加えたMM1培地25mLへ植菌した。また、コントロールとして、野生株をテオフィリンを含まない同培地へ植菌した。30℃で24時間培養後、培養液を新鮮なMM1培地で10倍希釈し、蛍光強度(Ex:488nm、Em:530nm)を蛍光プレートリーダー(infinite200Pro、Tecan社製)で測定した。蛍光強度値はそれぞれのOD600で割った後、野生株の自然蛍光値から差し引いた。図4に結果を示す。2mMのテオフィリンで発現誘導した場合の発現強度は、非誘導時の21倍であった。
(Methylobacillus glycogenesへのpmk61Aの導入)
pmk61Aは、Kimらにより報告された接合伝達を用いた形質転換法により、Methylobacillus glycogenes(NCIMB 11375)へ導入した(Kim et al.,Applied Biochemistry and Biotechnology,Vol.73,81−88(1998))。
形質転換体コロニーを、1%メタノール、10mg/Lカナマイシンおよび0または2mMいずれかの濃度のテオフィリンを加えたMM1培地25mLへ植菌した。また、コントロールとして、野生株をテオフィリンを含まない同培地へ植菌した。30℃で24時間培養後、培養液を新鮮なMM1培地で10倍希釈し、蛍光強度(Ex:488nm、Em:530nm)を蛍光プレートリーダー(infinite200Pro、Tecan社製)で測定した。蛍光強度値はそれぞれのOD600で割った後、野生株の自然蛍光値から差し引いた。図5に結果を示す。2mMのテオフィリンで発現誘導した場合の発現強度は、非誘導時の45倍であった。
(Paracoccus denitrificansへのpmk61Aの導入)
pmk61Aは、エレクトロポレーション法により、Paracoccus denitrificans(NCIMB 11627)へ導入した(Kim et al.,Applied Biochemistry and Biotechnology,Vol.73,81−88(1998))。
形質転換体コロニーを、10mg/Lカナマイシンおよび0または2mMいずれかの濃度のテオフィリンを加えたLB培地5mLへ植菌した。また、コントロールとして、野生株をテオフィリンを含まない同培地へ植菌した。30℃で3時間培養後、菌体を遠心分離により回収し、蒸留水へ懸濁した。蛍光強度(Ex:488nm、Em:530nm)を蛍光プレートリーダー(infinite200Pro、Tecan社製)で測定した。蛍光強度値はそれぞれのOD600で割った後、野生株の自然蛍光値から差し引いた。図6に結果を示す。非誘導時の蛍光強度は小さく、2mMのテオフィリンで発現誘導した場合の発現強度は、非誘導時の15倍であった。
(プラスミドの構築)
リジン脱炭酸酵素をコードするcadA遺伝子をpmk61Aへクローニングすることによりpmk96およびpmk99を構築した。Kouらの報告をもとに、Aliivibrio salmonicida由来のcadAは、Genscript社により合成された(Kou et al.,Journal of Molecular Catalysis B:Enzymatic,Vol.133,88−94(2016))。
まず、pmk96およびpmk99をエレクトロポレーション法により、接合伝達の供与菌であるE.coli S17−1へ導入した。形質転換体は、50mg/Lカナマイシンを含むLB寒天培地での生育を指標に選択し、プラスミドの配列はシーケンス解析により確認した。50mg/Lカナマイシンを含んだLB培地に形質転換体のコロニーを懸濁し、37℃で終夜振盪培養した。500μLの終夜培養液を50mg/Lカナマイシンを含んだ25mLのLB培地へ植菌し、OD600が0.5付近となるまで37℃で振盪培養した。培養菌体を遠心分離により回収し、新鮮なNMS培地で3回洗浄後、1mLの同培地へ懸濁した。
まず、pmk96およびpmk99をエレクトロポレーション法により、接合伝達の供与菌であるE.coli S17−1へ導入した。形質転換体は、50mg/Lカナマイシンを含むLB寒天培地での生育を指標に選択し、プラスミドの配列はシーケンス解析により確認した。50mg/Lカナマイシンを含んだ5mLのLB培地に形質転換体のコロニーを懸濁し、37℃で終夜振盪培養した。培養菌体を遠心分離により回収し、新鮮なMM1培地で3回洗浄後、1mLの同培地へ懸濁した。
本明細書に記載したプラスミドpmk61Aは寄託番号NITE P−02625として、プラスミドpmk96は寄託番号NITE P−02626として、およびプラスミドpmk99は寄託番号NITE P−02627として、日本国独立行政法人製品評価技術基盤機構に2018年2月1日付けで寄託されている。
Claims (22)
- 非光栄養性C1代謝微生物での遺伝子発現制御のための核酸であって、リボスイッチをコードする配列を含むことを特徴とする前記核酸。
- リボスイッチがテオフィリン結合性リボスイッチであることを特徴とする、請求項1に記載の核酸。
- 前記テオフィリン結合性リボスイッチが、5’−GGTACCGGTGATACCAGCATCGTCTTGATGCCCTTGGCAGCACCCTGCTAAGGAGGCAACAAG−3’(配列番号:1)の配列を有することを特徴とする、請求項2に記載の核酸。
- 前記リボスイッチが、天然もしくは人工的なプロモーターの下流に配置されていることを特徴とする、請求項1〜3のいずれか1項に記載の核酸。
- 前記プロモーターが、誘導性プロモーターであることを特徴とする請求項4に記載の核酸。
- 前記プロモーターが、恒常性プロモーターであることを特徴とする請求項4に記載の核酸。
- 前記プロモーターが、trcプロモーターであることを特徴とする請求項5又は6に記載の核酸。
- 天然もしくは人工的なリボソーム結合配列を含むことを特徴とする請求項1〜7のいずれか1項に記載の核酸。
- 前記リボソーム結合配列が、5’−AAGGAGG−3’の配列を有することを特徴とする請求項8に記載の核酸。
- 前記リボソーム結合配列が、スペーサーを介しリボスイッチの下流に配置されていることを特徴とする、請求項8又は9に記載の核酸。
- 更に発現されるべき遺伝子を含み、該遺伝子が、ターミネーターの上流に配置されていることを特徴とする、請求項1〜10のいずれか1項に記載の核酸。
- 請求項1〜11のいずれか1項に記載の核酸を含むベクター。
- 請求項1〜11のいずれか1項に記載の核酸を含む非光栄養性C1代謝微生物の形質転換体。
- 前記核酸が、宿主微生物の染色体上に組み込まれている、請求項13に記載の形質転換体。
- 前記核酸が、該核酸を含むベクターとして宿主微生物に導入されている、請求項13に記載の形質転換体。
- 非光栄養性C1代謝微生物が、メタン資化性菌またはメタノール資化性菌であることを特徴とする、請求項13〜15のいずれか1項に記載の形質転換体。
- 非光栄養性C1代謝微生物が、メチロモナス(Methylomonas)、メチロバクター(Methylobacter)、メチロコッカス(Methylococcus)、メチロサイナス(Methylosinus)、メチロシスチス(Methylocystis)、メチロマイクロビウム(Methylomicrobium)、メチロフィラス(Methylophilus)、メチロバチルス(Methylobacillus)、メチロバクテリウム(Methylobacterium)、バチルス(Bacillus)、キサントバクター(Xanthobacter)及びパラコッカス(Paracoccus)からなる群から選択されることを特徴とする、請求項13〜15のいずれか1項に記載の形質転換体。
- 光栄養性C1代謝微生物が、Methylococcus capsulatus Bath(NCIMB 11132)、Methylophilus methylotrophus AS1(NCIMB 10515)、Methylobacillus glycogenes(NCIMB 11375)及びParacoccus denitrificans(NCIMB 11627)からなる群から選択されることを特徴とする、請求項13〜15のいずれか1項に記載の形質転換体。
- 請求項13〜18のいずれか1項に記載の形質転換体に、リボスイッチのリガンドを供給することで、該リボスイッチの制御下にある遺伝子の発現を誘導する方法。
- 前記リガンドが、テオフィリンであることを特徴とする請求項19に記載の方法。
- 前記リガンドが、形質転換体により自律的に供給されることを特徴とする、請求項19又は20に記載の方法。
- 請求項1〜11のいずれか1項に記載の核酸を含む、非光栄養性C1代謝微生物の形質転換のためのキット。
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Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2020157483A1 (en) * | 2019-01-28 | 2020-08-06 | The University Of Nottingham | Genetic construct |
CN111996185A (zh) * | 2020-08-04 | 2020-11-27 | 湖南科技学院 | 一种接合转移增强液及其在提高细菌接合转移效率中的应用 |
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20120244601A1 (en) * | 2011-03-22 | 2012-09-27 | Bertozzi Carolyn R | Riboswitch based inducible gene expression platform |
JP2013529073A (ja) * | 2010-05-03 | 2013-07-18 | フォルシャングスツェントラム ユーリッヒ ゲーエムベーハー | 細胞内代謝産物の検出のためのセンサー |
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2018
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Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2013529073A (ja) * | 2010-05-03 | 2013-07-18 | フォルシャングスツェントラム ユーリッヒ ゲーエムベーハー | 細胞内代謝産物の検出のためのセンサー |
US20120244601A1 (en) * | 2011-03-22 | 2012-09-27 | Bertozzi Carolyn R | Riboswitch based inducible gene expression platform |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
NAKAHIRA, Y. ET AL.: ""Theophylline-dependent riboswitch as a novel genetic tool for strict regulation of protein expressi", PLANT CELL PHYSIOL., vol. 54, JPN6021022218, 2013, pages 1724 - 1735, ISSN: 0004600758 * |
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2020157483A1 (en) * | 2019-01-28 | 2020-08-06 | The University Of Nottingham | Genetic construct |
CN111996185A (zh) * | 2020-08-04 | 2020-11-27 | 湖南科技学院 | 一种接合转移增强液及其在提高细菌接合转移效率中的应用 |
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