CN110055183B - 一种扩展青霉及其应用 - Google Patents

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Abstract

一种扩展青霉及其应用，属于生物工程技术领域。本发明一方面提供了一种扩展青霉(Penicillium expansum)WH‑3，该菌株于2018年12月03日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号为CGMCC No.16798，保藏单位地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号；本发明另一方面提供了该扩展青霉在制备L(+)‑酒石酸或其盐中的应用，为获得L(+)‑酒石酸或其盐提供了新的方法。

Description

一种扩展青霉及其应用
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种扩展青霉及其应用。
背景技术
酒石酸有三种旋光异构体，L(+)-酒石酸(右旋酒石酸)、D(-)-酒石酸(左旋酒石酸)和meso-酒石酸(内消旋酒石酸)。L(+)-酒石酸广泛存在于自然界中，故又被称为“天然酒石酸”，在罗望子果和葡萄中含量较高，是重要的食品乳化剂、饮料酸味剂、医药拆分剂、石膏缓凝剂、印染防染剂、照相显影剂、金属抛光剂，广泛应用于食品工业、医药化工及建筑业中。微生物转化法是目前L(+)-酒石酸工业化生产的主流方法，即以顺酐为原料，通过水解和环氧化反应变为顺式环氧琥珀酸或其盐，然后利用含有顺式环氧琥珀酸水解酶的微生物，催化顺式环氧琥珀酸或其盐生成L(+)-酒石酸或其盐。
目前已报道的产L(+)-酒石酸的菌种有：诺卡氏菌属(Nocardia)、棒杆菌属(Coryncbacterium)、红球菌属(Rhodococcus)、根瘤菌属(Rhizobium)、假单胞菌属(Pseudomonas)、无色杆菌属(Achromobacter)、醋酸杆菌属(Acetobacter)、土壤杆菌属(Agrobacterium)、产碱杆菌属(Alcaligenes)、不动杆菌属(Acinetobacter)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)和双头菌(Labrys)。其中诺卡氏菌、棒状杆菌和红球菌是工业生产菌，其转化率可达到90％以上，产酸130g/L以上。这些已报道的生产L(+)-酒石酸的菌种均为细菌，未见利用真菌生产L(+)-酒石酸的报道。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明的目的在于设计提供一种扩展青霉及其应用的技术方案。
所述的一种扩展青霉(Penicillium expansum)WH-3，该菌株于2018年12月03日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号为CGMCC No.16798，建议的分类命名为：扩展青霉Penicillium expansum，保藏单位地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
所述的一种扩展青霉WH-3在制备L(+)-酒石酸或其盐中的应用。
所述的应用，其特征在于包括以下步骤：
1)在斜面培养基中培养扩展青霉WH-3，25℃培养7天至长出浓密孢子，无菌生理盐水悬浮孢子并振荡混匀，用无菌的三层擦镜纸过滤除去菌丝体；
2)过滤后的上述孢子液接种至种子培养基中，25℃振荡培养24～36h，得到扩展青霉种子液；
3)取上述扩展青霉种子液转接至产酶培养基中，25℃振荡培养5天，获得相应的扩展青霉细胞和发酵液，然后分别将得到的扩展青霉细胞和发酵液加入到顺式环氧琥珀酸或其盐溶液中，30℃振荡培养，转化5天，得到细胞转化液和发酵液转化液；
4)向两种转化液中分别加入过量的CaCl2，得到酒石酸钙沉淀，过滤并用蒸馏水冲洗酒石酸钙沉淀，再用硫酸酸解酒石酸钙沉淀，然后过滤后得到的酸解液经过阴阳离子交换精制、浓缩、结晶、烘干后得到L(+)-酒石酸或其盐的成品。
所述的应用，其特征在于所述的斜面培养基为PDA培养基；所述的种子培养基为PDB培养基；所述的产酶培养基为YSM培养基。
所述的应用，其特征在于所述的顺式环氧琥珀酸盐选用顺式环氧琥珀酸钠或顺式环氧琥珀酸钾。
本发明的发明人经过长期和深入的研究，从发霉的顺式环氧琥珀酸钠溶液中分离获得了一种新的微生物菌株，该新的菌株经鉴定为扩展青霉(Penicillium expansum)。本发明的扩展青霉菌株及其发酵液可通过水解顺式环氧琥珀酸或其盐生成L(+)-酒石酸或其盐。从而为获得L(+)-酒石酸或其盐提供了新的方法。
具体实施方式
本发明结合实施例作进一步的说明。
所用的各种培养基的组成如下：
(1)PDA培养基：称取200g马铃薯，加水煮沸20min，双层纱布趁热过滤，往滤液中加入20g葡萄糖和20g琼脂，蒸馏水定容至1000ml，121℃高压灭菌20min。
(2)PDB培养基：称取200g马铃薯，加水煮沸20min，双层纱布趁热过滤，往滤液中加入20g葡萄糖，蒸馏水定容至1000ml，121℃高压灭菌20min。。
(3)产酶培养基为酵母浸膏蔗糖(YSM)培养基：酵母浸膏40g，蔗糖160g，加蒸馏水定容至1000ml，121℃高压灭菌20min。
实施例1：扩展青霉(Penicillium expansum)WH-3的筛选
于发霉的顺式环氧琥珀酸钠溶液中，挑取发霉的絮状物，迅速倒入装有玻璃珠的无菌生理盐水三角瓶中，混匀，然后用移液管稀释不同倍数。分别吸取稀释液注入到PDA培养基平板上，均匀涂布后倒置于25℃培养7天。挑取平板上生长的单菌落接种于产酶培养基中，25℃、150rpm振荡培养5天，分别收集菌体和发酵液。在收集的细胞和发酵液中分别加入10ml 1M pH8.0顺式环氧琥珀酸钠悬浮，30℃振荡反应3天后，用偏钒酸铵显色法(刘叶青,严文康,周文龙,等.酒石酸的比色测定法.工业微生物,1983,13:32-37.)鉴定反应液中有无酒石酸产生。
本发明在进行大量筛选后，得到了一株具有将顺式环氧琥珀酸或其盐水解为L(+)-酒石酸或其盐特性的菌株，将其保存于PDA斜面培养基中，经CGMCC证明成活。该菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏登记号为CGMCCNo.16798,命名为扩展青霉(Penicillium expansum)WH-3，保藏日：2018年12月03日，保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院中国科学院微生物研究所(邮编：100101)。
实施例2：扩展青霉(Penicillium expansum)WH-3的鉴定
步骤1：菌的形态学鉴定
对分离得到的菌株，按照《真菌鉴定手册》(魏景超主编，上海科学技术出版社，1979)的方法，采用PDA平板、显微镜及扫描电镜对菌落、菌丝、孢子等结构进行观察。结果显示，25℃下，菌株在PDA培养基上生长迅速，培养3d和7d菌落直径分别为19mm和59mm左。菌丝起初为白色，约3d后颜色逐渐转草绿色，7d左右转为青绿色，质地绒状，外缘呈白色，背面肉桂色。显微镜下可见分生孢梗，其末端有2个帚状分枝，分枝上有许多呈放射状的小梗，分子孢子呈扁圆形。参照《真菌鉴定手册》，筛选菌株初步确定为扩展青霉(Penicilliumexpansum)。
步骤2：菌的分子生物学鉴定
使用真菌基因组试剂盒(购自Takara，Code No.9765)提取扩展青霉(Penicilliumexpansum)WH-3CGMCC No.16798的基因组DNA。然后以抽提的基因组DNA为模板，以F(5’TCCGTAGGTGAACCTGCG 3’)和R(5’TCCTCCGCTTATTGATATGC 3’)为引物，PCR扩增得到该菌的内转录间隔区(internal transcribed spacer，ITS)。
PCR反应为50ul体系：基因组DNA模板1ul，F和R引物各1ul，PrimeSTAR Max PremixDNA Polymerase(2X)25μl，ddH2O 22μl。扩增程序：94℃预变性5min，98℃变性30s，55℃退火15s，72℃延伸30s，30个循环，72℃延伸10min，4℃保温。用1％的琼脂糖凝胶电泳进行PCR产物验证，一般ITS区长度约为300～1000bp(碱基对)不等。PCR产物测序后与GenBank中已知的序列进行同源性比较，从而确定菌株的亲缘关系及分类地位。
测序结果显示，扩展青霉(Penicillium expansum)WH-3CGMCC No.16798的ITS核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，即本发明的扩展青霉具有SEQ ID NO:1所示的ITS序列。
将上述实施例2中得到的具有SEQ ID NO:1所示的ITS核苷酸序列，用BLAST程序在NCBI数据库中进行比对分析，其比对结果如表1所示，属于扩展青霉(Penicilliumexpansum)。
根据上述形态学和分子生物学的鉴定结果，所测试的菌株属于扩展青霉(Penicillium expansum)。
表1扩展青霉(Penicillium expansum)WH-3 CGMCC No.16798的ITS序列的BLAST比对结果
Figure BDA0002016991730000051
Figure BDA0002016991730000061
Figure BDA0002016991730000071
Figure BDA0002016991730000081
实施例3：利用顺式环氧琥珀酸钾和扩展青霉(Penicillium expansum)WH-3CGMCC No.16798生产L(+)-酒石酸
斜面培养基培养扩展青霉(Penicillium expansum)WH-3 CGMCC No.16798，25℃培养7天至长出浓密孢子，用接种环挑取孢子至无菌生理盐水中，振动混匀，用无菌的三层擦镜纸过滤除去菌丝体。过滤后的上述孢子液经稀释后用血球计数板计数，调整到孢子浓度1x106个/mL，接种1mL上述孢子液至装有50ml PDB培养基的250ml锥形瓶中，25℃，150rpm振荡培养24-36h。取上述20ml种子培养液于200ml产酶培养基中，25℃，150rpm振荡培养3天，获得相应的扩展青霉细胞和发酵液，然后分别将得到的扩展青霉细胞加入到200ml的浓度为1M的顺式环氧琥珀钾中，30℃，150rpm振荡培养，转化5天，得到细胞转化液和发酵液转化液。再分别向两种转化液中加入过量的CaCl2，得到酒石酸钙沉淀，过滤并用蒸馏水冲洗分别得到34.3g和39.7g酒石酸钙沉淀，再用硫酸酸解酒石酸钙沉淀，再次过滤后得到的酸解液经过阴阳离子交换精制、浓缩、结晶、烘干后分别得到20.8g和24.1g固体产物。经红外光谱、紫外光谱、核磁共振谱、质谱检测，确定该固体产物为酒石酸。
本实施例中，样品的红外光谱用Nicolet-Nexus670傅立叶转换式红外光谱仪检测；样品的核磁共振氢谱和碳谱用Bruker Avance DMX500核磁共振仪检测；样品的质谱用Bruker Esquire 3000plus质谱仪检测；样品的旋光度用WZZ-2B旋光仪检测。经旋光度检测，该固体产物的比旋光度
Figure BDA0002016991730000091
分别为+12.2°和+12.3°，证明该固体产物为右旋型酒石酸，即L(+)-酒石酸，且纯度均大于99.9％。
实施例4：利用顺式环氧琥珀酸钠和扩展青霉(Penicillium expansum)WH-3CGMCC No.16798生产L(+)-酒石酸
将实施例3中的顺式环氧琥珀钾替换为顺式环氧琥珀酸钠，其余步骤相同。细胞转化液和发酵液转化液分别得到35.9g和40.3g酒石酸钙，21.5g和25.2酒石酸，其比旋光度
Figure BDA0002016991730000092
分别为+12.1°和+12.3°，纯度大于99.9％。
综上可知，本发明的扩展青霉(Penicillium expansum)WH-3 CGMCC No.16798及其发酵液具有将顺式环氧琥珀酸或其盐水解为L(+)-酒石酸或其盐的特性。
需要说明的是，本发明所述的顺式环氧琥珀酸盐可以是上述的顺式环氧琥珀酸钾或顺式环氧琥珀酸钠，还可以是顺式环氧琥珀酸钙等其它顺式环氧琥珀酸的盐。
序列表
<110> 浙江科技学院
<120> 一种扩展青霉及其应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 579
<212> DNA
<213> 扩展青霉(Penicillium expansum)
<400> 1
ggtgaacctg cggaaggatc attaccgagt gagggccctt tgggtccaac ctcccacccg 60
tgtttattta cctcgttgct tcggcgggcc cgccttaact ggccgccggg gggctcacgc 120
ccccgggccc gcgcccgccg aagacacccc cgaactctgc ctgaagattg tcgtctgagt 180
gaaaatataa attatttaaa actttcaaca acggatctct tggttccggc atcgatgaag 240
aacgcagcga aatgcgatac gtaatgtgaa ttgcaaattc agtgaatcat cgagtctttg 300
aacgcacatt gcgccccctg gtattccggg gggcatgcct gtccgagcgt cattgctgcc 360
ctcaagcccg gcttgtgtgt tgggccccgt cctccgattc cgggggacgg gcccgaaagg 420
cagcggcggc accgcgtccg gtcctcgagc gtatggggct ttgtcacccg ctctgtaggc 480
ccggccggcg cttgccgatc aacccaaatt tttatccagg ttgacctcgg atcaggtagg 540
gatacccgct gaacttaagc atatcaataa gcggaggaa 579

Claims (5)

1.一种扩展青霉(Penicillium expansum)WH-3，保藏号为：CGMCC No.16798。
2.如权利要求1所述的一种扩展青霉WH-3在制备L(+)-酒石酸或其盐中的应用。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于包括以下步骤：
1)在斜面培养基中培养扩展青霉WH-3，25℃培养7天至长出浓密孢子，加入无菌生理盐水悬浮孢子，用无菌的三层擦镜纸过滤除去菌丝体；
2)过滤后的上述孢子液接种至种子培养基中，25℃振荡培养24～36h，得到扩展青霉种子液；
3)取上述扩展青霉种子液转接至产酶培养基中，25℃振荡培养5天，获得相应的扩展青霉细胞和发酵液，然后分别将得到的扩展青霉细胞和发酵液加入到顺式环氧琥珀酸或其盐溶液中，30℃振荡培养，转化5天，得到细胞转化液和发酵液转化液；
4)向两种转化液中分别加入过量的CaCl2，得到酒石酸钙沉淀，过滤并用蒸馏水冲洗酒石酸钙沉淀，再用硫酸酸解酒石酸钙沉淀，然后过滤后得到的酸解液经过阴阳离子交换精制、浓缩、结晶、烘干后得到L(+)-酒石酸或其盐的成品。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述的斜面培养基为PDA培养基；所述的种子培养基为PDB培养基；所述的产酶培养基为YSM培养基。
5.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述的顺式环氧琥珀酸盐选用顺式环氧琥珀酸钠或顺式环氧琥珀酸钾。
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