CN116235847A - 一种低温冷冻保存管和石斑鱼低温冷冻保存方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本申请属于超低温冷冻保存技术领域，尤其涉及一种低温冷冻保存管和石斑鱼低温冷冻保存方法和应用。本申请的低温冷冻保存管的管身底部内凹向上形成超过管身顶部的中空管且中空管的两端贯通，由于中空管两端无封堵，气流流通顺畅，并且中空管还增加了中空冷冻保存管的表面积，从而能加快降温/升温速率，提高降温/升温的均匀性，提高了冻存效果，解冻后的精子活率高，从而解决现有技术中冻存管冻存精子效果较差的技术问题。
Description
技术领域
本申请超低温冷冻保存技术领域，尤其涉及一种低温冷冻保存管和石斑鱼低温冷冻保存方法和应用。
背景技术
超低温冷冻保存是精子体外保存的有效方法，保存方法主要通过精子与稀释液和保护液的混合，通过一系列的程序降温后，最终保存于液氮的过程。超低温冷冻保存技术不但可以有利于遗传资源的保存和利用，而且在养殖业中也具有重要作用。
石斑鱼是名贵海产鱼类，肉质鲜美，营养丰富，经济价值很高，具有重要的生产应用价值，是南方重要的海水养殖鱼类，然而石斑鱼雄鱼需要4-5年才能性成熟，存在雌、雄亲鱼性成熟不同步的问题，不利于苗种的稳定供应，严重制约了石斑鱼养殖业的发展；超低温冷冻保存技术是解决石斑鱼雌、雄亲鱼性成熟不同步的有效手段，将性成熟的石斑鱼雄鱼精液收集并超低温冷冻长期保存，根据生产需要随时使用，克服了雄鱼不足及雌雄性成熟不同步等问题，保障了苗种的供给。
超低温冷冻保存技术使用的冻存容器主要是麦管和冻存管；麦管在精子冻存中具有更好的效果，但是因为结构复杂、容量较小，难以冻存大量精液；冻存管容积较大，降温效果不好，精液冻存效果较差。
发明内容
有鉴于此，本申请提供了一种低温冷冻保存管和石斑鱼低温冷冻保存方法和应用，用于解决现有技术中冻存管冻存精子效果较差的技术问题。
本申请第一方面提供了一种低温冷冻保存管，包括管身和管盖；
所述管身的底部内凹向上形成超过管身的顶部的中空管；
所述中空管的两端贯通；
所述管盖设置有与中空管对应的管盖通孔；
所述管盖和管身螺纹连接。
优选的，所述低温冷冻保存管还包括橡皮封闭圈；
所述橡皮封闭圈位于所述管身的顶部；
所述橡皮封闭圈的外径和所述管身的外径相同。
需要说明的是，通过橡皮封闭圈能提高低温冷冻保存管的密封性。
优选的，所述管身的外径为1～1.5cm，所述管身的厚度为0.05～0.1cm，所述管身的高度为3.5～4cm；
所述中空管的外径为0.2～0.4cm，高度为4.2～4.8cm；
所述管盖通孔的直径为0.2～0.4cm。
本申请第二方面提供了一种石斑鱼超低温冷冻保存方法，采用上述中空冷冻保存管作为冻存容器进行超低温冷冻保存，包括以下步骤：
步骤S1.将石斑鱼精液与冷冻保护剂混合后，装入所述低温冷冻保存管中密封；
步骤S2.将装有石斑鱼精液与冷冻保护剂的低温冷冻保存管在液氮面上方预冻存；
步骤S3.将预冻存后的装有石斑鱼精液与冷冻保护剂的低温冷冻保存管装入液氮中超低温冷冻保存；
所述冷冻保护剂包括抗冻剂和保护液。
优选的，步骤S1中，所述抗冻剂包括二甲亚砜；
所述保护液包括葡萄糖和氯化钠。
优选的，步骤S1中，所述保护液中葡萄糖的浓度为0.3mol/L，氯化钠的浓度为0.1mol/L；
所述冷冻保护剂中二甲亚砜与保护液的体积比为1:10。
优选的，步骤S1中，所述石斑鱼精液与冷冻保护剂的体积比为2：1。
优选的，步骤S2中，所述预冻存的时间为10min，高度为3～7cm。
优选的，所述S1中，所述石斑鱼精液与冷冻保护剂的总体积为700μL～1800μL。
本申请第三方面提供了所述石斑鱼超低温冷冻保存方法在石斑鱼养殖中的应用，所述应用具体包括步骤：
步骤S4.将装有石斑鱼精液与冷冻保护剂的低温冷冻保存管从液氮中取出解冻；
步骤S5.将解冻后的石斑鱼精液与石斑鱼卵在清水中混合搅拌至石斑鱼卵受精。
优选的，步骤S4中，所述解冻为将装有石斑鱼精液与冷冻保护剂的中空冷冻保存管在40℃水浴2分钟。
综上所述，本申请提供了一种低温冷冻保存管和石斑鱼超低温冷冻保存方法和应用，低温冷冻保存管包括管身和管盖，管身底部内凹向上形成超过管身顶部的中空管且中空管的两端贯通，管盖上设置有与中空管对应的通孔，管盖和管身螺纹连接，由于中空管两端无封堵，气流流通顺畅，并且中空管还增加了中空冷冻保存管的表面积，从而能加快降温/升温速率，提高降温/升温的均匀性，在冻存大体积的精液，例如冻存体积大于900μL时，中空管通过提高气流的流通顺畅性，提高比表面积，防止热的空气积压在中空管状结构内导致降温/升温不均匀，提高了冻存效果，解冻后的精子活率高，用于解决现有技术中冻存管冻存精子效果较差的技术问题。
附图说明
为了更清楚地说明本申请具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本申请的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本申请实施例提供的低温冷冻保存管中管身、管盖以及橡皮封闭圈示意图；
图2为本申请实施例提供的低温冷冻保存管横切面示意图；
图3为本申请实施例3提供的不同保护液的低温冷冻保存效果对比图；
图4为本申请实施例3提供的不同抗冻液的低温的冷冻保存效果对比图；
图5为本申请实施例3提供的不同抗冻剂稀释比例的低温冷冻保存效果对比图；
图6为本申请实施例3提供的不同冷冻保护剂稀释比例的低温冷冻保存效果对比图；
图7为本申请实施例3提供的低温冷冻保存管距液氮液面不同高度的低温冷冻保存效果对比图；
图8为本申请实施例提供的实施例1所述低温冷冻保存管和不具有中空管的常规冻存管的低温冷冻保存效果对比图。
具体实施方式
本申请提供了一种低温冷冻保存管和石斑鱼超低温冷冻保存方法和应用，用于解决现有技术中冻存管冻存精子效果较差的技术问题。
下面将结合附图对本申请的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本申请保护的范围。
实施例1
本实施例提供了一种低温冷冻保存管，其结构如图1-2所示，低温冷冻保存管包括管身和管盖；管身的底部内凹向上形成超过管身的顶部的中空管；中空管的两端贯通，管盖设置有与中空管对应的管盖通孔，管盖和管身螺纹连接，螺纹连接方式为管盖上设有外螺纹，管身的顶部设有对应的内螺纹，使得管盖和管身螺纹连接。
作为进一步的改进，低温冷冻保存管还包括橡皮封闭圈，橡皮封闭圈位于所述管身的顶部，且橡皮封闭圈的外径和所述管身的外径相同，从而在管盖和管身螺纹连接后能够密封管盖和管身螺纹连接位置，提高低温冷冻保存管的密封性。
对于低温冷冻保存管的尺寸，低温冷冻保存管管身的外径可以为1～1.5cm，管身的厚度可以为0.05～0.1cm，管身的高度可以为3.5～4cm，中空管的外径可以为0.2～0.4cm，高度可以为4.2～4.8cm，管盖通孔的直径可以为0.2～0.4cm，中空管的外径与管盖通孔的直径相同，作为低温冷冻保存管的尺寸的优选，低温冷冻保存管管身的外径为1.25cm，管身的厚度为0.08cm，管身的高度为4cm，中空管的外径为0.33cm，高度可以为4.6cm，管盖通孔的直径为0.33cm，该优选尺寸的低温冷冻保存管可以保存1.8mL的精液，保证了大的精液容量，同时可以适配市场上常见的冻存盒。
实施例2
本实施例提供了利用实施例1所述低温冷冻保存管进行石斑鱼低温冷冻保存方法，方法包括石斑鱼精液采集的步骤、装入冷冻保护剂低温冷冻保存管的步骤、预冻存的步骤以及超低温冷冻保存的步骤。
其中，石斑鱼精液采集的步骤包括用丁香酚麻醉石斑鱼性成熟雄鱼，擦干鱼体表面海水，轻压腹部挤出精液，起始挤出的精液去除，收集干净精液于试管中。
装入冷冻保护剂低温冷冻保存管的步骤包括将冷冻保护剂与试管中石斑鱼精液混合，灌装入实施例1所述低温冷冻保存管。
预冻存的步骤包括将装有石斑鱼精液与冷冻保护剂的低温冷冻保存管在液氮面上方一定高度停留10分钟进行预冻存。
超低温冷冻保存的步骤包括将预冻存后的装有石斑鱼精液与冷冻保护剂的低温冷冻保存管投入液氮中保存。
冷冻保护剂为保护液和抗冻剂的混合物，保护液和抗冻剂的混合物能使低温冷冻保存过程中对石斑鱼精液的损害降到最小程度，保护液可以选择TS19、蔗糖、葡萄糖、0.2mol/L葡萄糖+0.1mol/L氯化钠、0.25mol/L葡萄糖+0.1mol/L氯化钠、0.3mol/L葡萄糖+0.1mol/L氯化钠、0.35mol/L葡萄糖+0.1mol/L氯化钠、0.4mol/L葡萄糖+0.1mol/L氯化钠中的任意一种。
抗冻剂包括二甲亚砜(DMSO)、丙二醇(PG)、乙二醇(EG)、甘氨酸(GLY)、N-甲酰二甲胺二甲基甲酰胺(DMF)、二甲基乙酰胺(DMA)、甲醇(ME)中的任意一种。
冷冻保护剂中保护液和抗冻剂的体积比可以选择100：5～25。
冷冻保护剂与石斑鱼精液的体积比可以选择1:2～19:1。
预冻存过程中，装有石斑鱼精液与冷冻保护剂的低温冷冻保存管在液氮面上方高度可以选择不大于9cm。
实施例3
鉴于不同鱼类生理特性侧差异，其它鱼类的冷冻保护剂保存石斑鱼的精子效果并不理想，本实施例对实施例2提供的石斑鱼低温冷冻保存方法中冷冻保护剂进行改进。
改进包括冷冻保护剂中保护液的改进、冷冻保护剂中抗冻剂的改进、冷冻保护剂中抗冻剂稀释比例的改进以及冷冻保护剂稀释比例的改进。
冷冻保护剂中保护液的改进试验包括将TS19、蔗糖、葡萄糖、0.2mol/L葡萄糖+0.1mol/L氯化钠、0.25mol/L葡萄糖+0.1mol/L氯化钠、0.3mol/L葡萄糖+0.1mol/L氯化钠、0.35mol/L葡萄糖+0.1mol/L氯化钠、0.4mol/L葡萄糖+0.1mol/L氯化钠中的任意一种中分别加入10％的二甲亚砜混合后实施例1所述低温冷冻保存管，石斑鱼精液与保护剂的稀释比例为1:1，冷冻条件为平放距液氮面7cm的浮板上熏蒸l0 min后投入液氮中保存，然后在40℃水浴2分钟，分析解冻后的石斑鱼精液中精子活力，其结果如图3所示，结果显示，0.3mol/L葡萄糖+0.1mol/L氯化钠是最好的石斑鱼精液保护液。
冷冻保护剂中抗冻剂的改进包括将0.3mol/L葡萄糖+0.1mol/L氯化钠保护液与二甲亚砜(DMSO)、丙二醇(PG)、乙二醇(EG)、甘氨酸(GLY)、N-甲酰二甲胺二甲基甲酰胺(DMF)、二甲基乙酰胺(DMA)、甲醇(ME)、体积比为1:1的丙二醇和二甲亚砜、体积比为1:1的丙二醇和二甲亚砜、体积比为1:1的丙二醇和二甲亚砜混合抗冻剂、体积比为1:1的乙二醇和二甲亚砜混合抗冻剂、体积比为1:1的甘氨酸和二甲亚砜混合抗冻剂、体积比为1:1的甲醇和二甲亚砜混合抗冻剂、体积比为1:1:2的丙二醇、乙二醇和二甲亚砜混合抗冻剂、体积比为1:1：2的丙二醇、甲醇和二甲亚砜混合抗冻剂、体积比为1:1:1:1:1的丙二醇、甲醇、二甲亚砜、甘氨酸以及乙二醇混合抗冻剂中的任意一种混合后装入实施例1所述低温冷冻保存管，精子与保护剂的稀释比例为1:1，冷冻条件为平放距液氮面7cm的浮板上熏蒸l0min置于液氮中保存，解冻条件为40℃水浴2分钟，分析解冻后的石斑鱼精液中精子活力，其结果如图4所示，结果显示，二甲亚砜是最好的石斑鱼精液抗冻剂。
冷冻保护剂中抗冻剂稀释比例的改进包括分别将5体积份、10体积份、15体积份、20体积份以及25体积份的二甲亚砜分别与100体积份0.3mol/L葡萄糖+0.1mol/L氯化钠保护液混合后装入实施例1所述低温冷冻保存管，精子与保护剂的稀释比例为1:1，冷冻条件为平放距液氮面7cm的浮板上熏蒸l0min，解冻条件为40℃水浴2分钟，分析解冻后的石斑鱼精液中精子活力，其结果如图5所示，结果显示，二甲亚砜与保护液的体积比为1:10，即体积分数为10％二甲亚砜是最好的石斑鱼精液抗冻剂。
冷冻保护剂稀释比例的改进包括分别将冷冻保护剂与石斑鱼精液混合后装入实施例1所述低温冷冻保存管，距液氮面冷冻高度设置为7cm，蒸时间为l0 min，解冻条件为40℃水浴2分钟，石斑鱼精液与冷冻保护剂的稀释比例为2:1、1:1、1:3、1:5、1:7、1:9或1:19，分析解冻后的石斑鱼精液中精子活力，结果如图6所示，结果显示，冷冻保护剂稀释比例为50％，即石斑鱼精液与冷冻保护剂的比例为2:1时，冷冻保护剂对石斑鱼精液的低温保存效果最好。
需要说明的是，淡水鱼和海鱼存在较大生理差异，海鱼之间也存在生理特性，而且石斑鱼雌雄同体的生理特性与常规海鱼存在巨大差异，这使得石斑鱼精液与常规鱼类的生理差异巨大，迄今尚未见石斑鱼精子超低温冷冻保存的研究报道，而且由于不同种鱼类精子的生理特性差别很大，利用已报道其它鱼类的冷冻保护剂及方法保存石斑鱼的精子效果并不理想，本申请实施例3通过实验，改进得到性能最优的抗冻剂二甲亚砜和保护液葡萄糖和氯化钠。
实施例4
本实施例对实施例3提供的石斑鱼低温冷冻保存方法中冷冻保存方法进行改进。
包括预冻存的步骤中低温冷冻保存管距液氮冷冻高度的改进。
低温冷冻保存管距液氮冷冻高度的改进包括将0.3mol/L葡萄糖+0.1mol/L氯化钠保护液、10％二甲亚砜与石斑鱼精液装入实施例1所述低温冷冻保存管，石斑鱼精液和冷冻保护剂的稀释比例为2:1，距液氮面冷冻高度设置为0，1，3，5，7，9cm，熏蒸时间为l0 min，解冻条件为40℃水浴2分钟，结果如图7所示，结果显示，距液氮面冷冻高度设置为3，5，7cm时，冷冻保护剂对石斑鱼精液的低温保存效果较好，低温保存效果最好的高度为3cm。
实施例5
本实施例对实施例1提供的低温冷冻保存管和不具有中空管的常规冻存管进行性能实验，
试验包括将0.3mol/L葡萄糖+0.1mol/L氯化钠保护液、10％二甲亚砜与300～1800微升石斑鱼精液装入实施例1所述低温冷冻保存管和不具有中空管的常规冻存管，石斑鱼精液和冷冻保护剂的稀释比例为2:1，距液氮面冷冻高度设置为7cm，熏蒸时间为l0 min，解冻条件为40℃水浴2分钟，结果如图8所示，结果显示，当冻存体积小于700微升时，实施例1所述低温冷冻保存管和不具有中空管的常规冻存管的冻存效果没有显著性差异；当冻存体积大于900微升时，使用不具有中空管的常规冻存管冻存的精子活率会显著下降，而使用实施例1所述低温冷冻保存管的精子的活率没有明显变化，这说明由于中空管两端无封堵，气流流通顺畅，并且中空管还增加了中空冷冻保存管的表面积，从而能加快降温/升温速率，提高降温/升温的均匀性，在冻存大体积的精液，例如冻存体积大于900μL时，中空管通过提高气流的流通顺畅性，提高比表面积，防止热的空气积压在中空管状结构内导致降温/升温不均匀，提高了冻存效果，解冻后的精子活率高，用于解决现有技术中冻存管冻存精子效果较差的技术问题。
实施例6
本实施例为对石斑鱼超低温冷冻保存方法在石斑鱼养殖中的应用，所应用具体包括步骤：先将装有石斑鱼精液与冷冻保护剂的低温冷冻保存管从液氮中取出解冻；再将解冻后的石斑鱼精液与石斑鱼卵在清水中混合搅拌至石斑鱼卵受精，其中，解冻为将装有石斑鱼精液与冷冻保护剂的中空冷冻保存管在40℃水浴2分钟，石斑鱼卵体外受精后置于适宜温度中孵化。
以上各实施例仅用以说明本申请的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本申请进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本申请各实施例技术方案的范围。
Claims (10)
1.一种低温冷冻保存管，其特征在于，包括管身和管盖；
所述管身的底部内凹向上形成超过管身的顶部的中空管；
所述中空管的两端贯通；
所述管盖设置有与中空管对应的管盖通孔；
所述管盖和管身螺纹连接。
2.根据权利要求1所述的一种低温冷冻保存管，其特征在于，所述低温冷冻保存管还包括橡皮封闭圈；
所述橡皮封闭圈位于所述管身的顶部；
所述橡皮封闭圈的外径和所述管身的外径相同。
3.根据权利要求1所述的一种低温冷冻保存管，其特征在于，所述管身的外径为1～1.5cm，所述管身的厚度为0.05～0.1cm，所述管身的高度为3.5～4cm；
所述中空管的外径为0.2～0.4cm，高度为4.2～4.8cm；
所述管盖通孔的直径为0.2～0.4cm。
4.一种石斑鱼超低温冷冻保存方法，其特征在于，包括步骤：
步骤S1.将石斑鱼精液与冷冻保护剂混合后，装入权利要求1-3任一项所述低温冷冻保存管中密封；
步骤S2.将装有石斑鱼精液与冷冻保护剂的低温冷冻保存管在液氮面上方预冻存；
步骤S3.将预冻存后的装有石斑鱼精液与冷冻保护剂的低温冷冻保存管装入液氮中超低温冷冻保存；
所述冷冻保护剂包括抗冻剂和保护液。
5.根据权利要求4所述的一种石斑鱼超低温冷冻保存方法，其特征在于，步骤S1中，所述抗冻剂包括二甲亚砜；
所述保护液包括葡萄糖和氯化钠。
6.根据权利要求5所述的一种石斑鱼超低温冷冻保存方法，其特征在于，步骤S1中，所述保护液中葡萄糖的浓度为0.3mol/L，氯化钠的浓度为0.1mol/L；
所述冷冻保护剂中二甲亚砜与保护液的体积比为1:10。
7.根据权利要求4所述的一种石斑鱼超低温冷冻保存方法，其特征在于，步骤S1中，所述石斑鱼精液与冷冻保护剂的体积比为2：1。
8.根据权利要求4所述的一种石斑鱼超低温冷冻保存方法，其特征在于，步骤S2中，所述预冻存的时间为10min，高度为3～7cm。
9.根据权利要求4所述的一种石斑鱼超低温冷冻保存方法，其特征在于，所述S1中，所述石斑鱼精液与冷冻保护剂的总体积为700μL～1800μL。
10.权利要求4-9任一项所述的一种石斑鱼超低温冷冻保存方法在石斑鱼养殖中的应用，其特征在于，所述应用具体包括步骤：
步骤S4.将装有石斑鱼精液与冷冻保护剂的低温冷冻保存管从液氮中取出解冻；
步骤S5.将解冻后的石斑鱼精液与石斑鱼卵在清水中混合搅拌至石斑鱼卵受精。
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