CN110521641B

CN110521641B - 一种生长快石斑鱼的人工杂交育种方法

Info

Publication number: CN110521641B
Application number: CN201910976714.9A
Authority: CN
Inventors: 田永胜; 李振通; 吴玉萍; 张晶晶; 李子奇; 王林娜
Original assignee: Yellow Sea Fisheries Research Institute Chinese Academy of Fishery Sciences
Current assignee: Yellow Sea Fisheries Research Institute Chinese Academy of Fishery Sciences
Priority date: 2019-10-15
Filing date: 2019-10-15
Publication date: 2021-02-12
Anticipated expiration: 2039-10-15
Also published as: CN110521641A

Abstract

本发明涉及一种生长快石斑鱼的人工杂交育种方法，属于水产养殖技术领域。所述方法包括亲本选择、赤点石斑鱼亲鱼的网箱培育、蓝身大斑石斑鱼亲鱼的工厂化培育、蓝身大斑石斑鱼性别转化、蓝身大斑石斑鱼精液冷冻保存、赤点石斑鱼亲鱼催产、人工授精、受精卵的孵化。本发明利用精子冷冻保存技术建立蓝身大斑石斑鱼精子库，突破了两种鱼之间的生殖隔离，获得一种生长速度快的优良杂交新品种，解决了因蓝身大斑石斑鱼雄性亲鱼产精量少而阻碍生产进行的问题，极大地提高生产力，促进石斑鱼育种工作的进行。

Description

一种生长快石斑鱼的人工杂交育种方法

技术领域

本发明涉及水产养殖技术领域，具体涉及一种生长快石斑鱼的人工杂交育种方法。

背景技术

石斑鱼是我国重要的海水经济鱼类。近些年来，海水养殖业迅速发展，石斑鱼养殖产业也蓬勃发展，遍及中国南北方沿海地区。但是在石斑鱼养殖过程中存在一些难题，如苗种培育、较高的畸形率、病害多以及种质资源退化。为促进石斑鱼养殖业健康可持续发展，杂交育种作为新品种的培育方法被国内外学者及养殖企业所应用。

赤点石斑鱼(Epinephelus akaara)和蓝身大斑石斑鱼(Epinephelus tukula)同属于鲈形目(Perciformes)，鮨科(Serranidae)，石斑鱼亚科(Epinephelinae)，石斑鱼属(Epinephelus)。赤点石斑鱼，俗称红斑，主要分布于太平洋西部，为暖水性中下层鱼类，多生活在岩礁底质海区。肉质鲜美，经济价值高，广得人民喜欢。蓝身大斑石斑鱼，俗名金钱斑，体型较大仅次于鞍带石斑鱼，生长速度快。分布于印度西太平洋区，从红海、东非至澳洲昆士兰海域，为世界名贵暖水性鱼类。

赤点石斑鱼与蓝身大斑石斑鱼均为雌雄同体，雌性先熟，具有性转换特征。同一石斑鱼群体中雄性数量较少，在石斑鱼繁殖中很难获得雄鱼的精子。不同的石斑鱼地理分布不同、性成熟时间有差异，对石斑鱼的杂交育种带来较大困难。

将赤点石斑鱼雌性亲本与蓝身大斑石斑鱼雄性亲本进行杂交，可获得兼具亲本优良特点的杂交子一代，提供一种生长快石斑鱼的人工杂交育种方法。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明涉及一种生长快石斑鱼的人工杂交育种方法，获得一种生长速度快的优良杂交新品种。

本发明是通过以下技术方案来实现的：

一种生长快石斑鱼的人工杂交育种方法，它包括亲本选择、赤点石斑鱼亲鱼的网箱培育、蓝身大斑石斑鱼亲鱼的工厂化培育、蓝身大斑石斑鱼性别转化、蓝身大斑石斑鱼精液冷冻保存、赤点石斑鱼亲鱼催产、人工授精、受精卵的孵化；

所述的亲本选择

a.赤点石斑鱼雌性亲本：选择4龄以上体型正常、无病害、活力好的赤点石斑鱼；

b.蓝身大斑石斑鱼雄性亲本：选择8龄以上、体型正常、无病害、活力好的蓝身大斑石斑鱼雌鱼。

所述的赤点石斑鱼亲鱼的网箱培育

a.培育环境：年最低水温不低于17℃，海水盐度不低于16，pH为7～9，水流在0.3-0.8m/s，水深为5-7m，培育密度为200-400尾/箱；

b.非繁殖季节的培育

每天投喂一次，饵料以新鲜小杂鱼为主，投喂量为1.0-2.0％；

c.繁殖前的强化培育

每天投喂两次，饵料以拌有营养强化剂的新鲜小杂鱼为主，投喂量为3～5％；

所述的蓝身大斑石斑鱼亲鱼的工厂化培育

a.培育环境

水泥池中培养，每天换水量为10m³/h，溶氧在6mg/L以上，盐度为28～30，pH为7.5～8.2，培育密度为25～30尾/池；

b.蓝身大斑石斑鱼的性别转化

在9-10月，选取8龄以上、体型正常、无病害、活力好的蓝身大斑石斑鱼雌性亲鱼进行性别转化操作；对挑选的雌性亲鱼进行肌体埋植17α-甲基睾酮缓释胶条，用量为5-10mg/kg，然后进行培育管理；培育水温从24℃逐渐降至20℃，每8-12天降低1℃，培育至12月底；每天上午投喂一次冰鲜饵料，投喂量为1.0～1.5％；

c.繁殖前的强化培育

亲本在次年1月份开始进行强化培育；水温由20℃升高至25℃，每8-12天升高1℃；每天上午投喂一次，投喂拌有营养强化剂的冰鲜饵料，投喂量为1.8～2.5％；

所述的蓝身大斑石斑鱼精液的冷冻保存

对亲鱼进行性逆转情况检查，对成功转化雄鱼进行精液采集，镜检精子活力，对精子活力高于90％的精液冷冻保存；冷冻保存方法为：将镜检合格的精液与冷冻液按照1:2的体积比进行混合，注入冷冻管中，投入液氮冷冻保存；所述的冷冻液的成分及终浓度为：葡萄糖15.0-20.0g/L，NaCl 6.0-8.0g/L，KCl 0.5-0.8g/L，10.0-15.0％1,2-丙二醇，利用蒸馏水配制；

所述的赤点石斑鱼亲鱼催产

挑选性腺发育至IV期的赤点石斑鱼雌性亲本进行催熟、催产，所用催产激素为绒毛膜促性腺激素与促黄体激素释放激素类似物，使用量分别为300-600IU/kg、30-50μg/kg；

所述的人工授精

挑选催产后上腹部隆起，生殖孔微红的赤点石斑鱼雌鱼进行挤卵，将成熟卵子置于容器中；挤卵的同时对蓝身大斑石斑鱼的冷冻精子进行解冻，解冻方法为将冷冻管从液氮中取出，置于37℃水中进行解冻，当固体刚刚融化完时取出；然后镜检，当精子活力大于70％时，将精子与卵子按照体积比为1:500的比例进行授精，搅拌均匀后迅速加入海水，静置15分钟，取上浮卵然后用新鲜海水冲洗，最后将受精卵置于孵化器中孵化；

所述的孵化和培育

首先将受精卵放入孵化网箱中孵化，孵化条件为水温20～24℃，盐度28～30，pH7.5～8.2，溶解氧大于6mg/L，持续微充气、微流水；待发育至尾芽期时；收集受精卵移至育苗池中孵化，放卵密度为6.0～9.0克/米³，溶氧在6mg/L以上，pH7.5～8.2，水温在20～24℃，盐度28～30。

进一步，所述的营养强化剂为维生素C和维生素E混合物，混合物中维生素C和维生素E的含量为6～10g/kg，混合质量比为1:1。

所述的蓝身大斑石斑鱼雌性亲鱼的性逆转，埋植的雄性激素条的剂量为5-10mg/kg。

优选的，在人工授精步骤，进行授精操作后，先添加适量海水，静置10分钟，然后加入盐度为35的海水，再静置15分钟，然后取上浮卵置于孵化器中孵化。

优选的，孵化过程中，在第一步中，每两个小时吸除沉卵，避免因死卵影响水质。

本发明的原理是：将不同地理分布环境、不同繁殖时间和不同繁殖生物学特性的两石斑鱼借助性逆转以及精子冷冻保存技术，进行种间远源杂交，从而获得具有优良生长性状的杂交新品种，采用亲鱼培育、温度调控和营养强化，是保证亲本以及子代具备健康体质、以及具有明显杂种优势的优良杂交子代。

本发明与其他海水鱼类育种方法的不同之处和有益效果如下：

1、赤点石斑鱼为暖温带中下层鱼类，肉质鲜美，营养价值高，外表性状优良，市场价值高，但生长速度慢，一般养殖两年以上才能达到商品规格；蓝身大斑石斑鱼为热带中下层鱼类，个体大、生长速度快，将两者进行杂交，杂交种生长速度快，当年就能达到300-500g，可极大的提高生产效率，且本发明能够获得批量的杂交子代，用于养殖生产。

2、蓝身大斑石斑鱼雄性数量少，而且亲鱼产精量少，本发明借助性逆转技术对雌性蓝身大斑石斑鱼进行性别转化操作，解决了因蓝身大斑石斑鱼雄性亲鱼产精量少而阻碍生产进行的问题，极大地提高了生产力，促进了石斑鱼育种工作的进行。

3、赤点石斑鱼与蓝身大斑石斑鱼存在地理隔离与生殖隔离，本发明利用精子冷冻保存技术建立蓝身大斑石斑鱼精子库，突破了两种鱼之间的生殖隔离，将冷冻精子应用于国内不同养殖地区、养殖厂家石斑鱼苗种杂交培育，极大地方便了生产的进行、新品种的培育。

附图说明

图1为本发明杂交种与赤点石斑鱼的生长对比。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚，但本发明的保护范围不限于以下实施例。

实施例1

2018年赤点石斑鱼和蓝身大斑石斑鱼杂交育种，包括以下步骤：

(1)亲本选择

a.赤点石斑鱼雌性亲本：选择4龄以上体型正常、无病害、活力好的赤点石斑鱼作为雌性亲本；

b.蓝身大斑石斑鱼雄性亲本：选择8龄以上、体型正常、无病害、活力好的蓝身大斑石斑鱼雌鱼，后经性逆转为雄性。

(2)赤点石斑鱼亲鱼的网箱培育

a.培育环境：水温不低于17℃，海水盐度28，pH为7～9，水流在0.3-0.8m/s，水深为5-7m，最大风浪为6级。网箱规格为3m×3m×3m，培育密度为200尾/箱。

b.非繁殖季节的培育

每天投喂一次，饵料以新鲜小杂鱼为主，投喂量为1.0-2.0％，实际投喂量受天气、水温等条件影响而增减。

c.繁殖前的强化培育

每天投喂两次，饵料以拌有营养强化剂的新鲜小杂鱼为主，每千克饵料添加维生素C 3克和维生素E 3克，投喂量为3～5％，实际投喂量受天气、水温等条件影响而增减。

(3)蓝身大斑石斑鱼的工厂化培育

a.培育环境：水泥池大小为5m×5m×3m，换水量为10m³/h，溶氧在6mg/L以上，盐度为30，pH为7.7，培育密度为25尾/池。

b.蓝身大斑石斑鱼的性别转化

在9-10月，选取8龄以上、体型正常、无病害、活力好的蓝身大斑石斑鱼雌性亲鱼进行性别转化操作。对挑选的雌性亲鱼进行肌体埋植17α-甲基睾酮缓释胶条(5mg/kg)，然后进行正常的培育管理。培育水温从24℃逐渐降至20℃，每8-12天降低1℃，培育至12月底。每天上午投喂一次，投喂冰鲜杂鱼、虾、鱿鱼，投喂量为1.0～1.5％，每天推底排污一次。

c.繁殖前的强化培育

于亲本选择后的次年1月份开始进行强化培育。水温由20℃升高至25℃，每10天升高1℃。每天上午投喂一次，投喂冰鲜杂鱼、虾、鱿鱼，每千克饵料添加维生素C 3克和维生素E 3克，投喂量为1.8～2.5％。每天推底排污一次。

(4)蓝身大斑石斑鱼精液的冷冻保存

每2～3周对埋植雄性激素条的雌鱼进行性逆转情况检查，至繁殖期性转率可达到10-20％，对生殖孔微红、轻压腹部可挤出乳白色精液的鱼进行采集精液，镜检观察精子活力，对精子活力高于90％的精液冷冻保存。冷冻保存方法为：将镜检合格的精液与冷冻液按照1:2的体积比进行混合，注入冷冻管中，投入液氮冷冻保存。所述的冷冻液为：葡萄糖20.0g/L，NaCl 6.0g/L，KCl 0.5g/L，10.0％1,2-丙二醇，利用蒸馏水配制。

(5)赤点石斑鱼亲鱼催产

挑选性腺发育至IV期的赤点石斑鱼雌性亲本进行催熟、催产，所用催产激素为绒毛膜促性腺激素(450IU/kg)与促黄体激素释放激素类似物(40μg/kg)，激素用0.9％的生理盐水溶解，一次性注射，注射部位为胸鳍基部，效应期约为48小时。

(6)人工授精

挑选催产后上腹部隆起，生殖孔微红的赤点石斑鱼雌鱼进行挤卵，将成熟卵子置于容器中；挤卵的同时对蓝身大斑石斑鱼冷冻精子进行解冻，解冻方法为将冷冻管从液氮中取出，置于37℃水中进行解冻。镜检精子活力大于70％时可以使用。将精子与卵子按照体积比为1:500的比例进行授精，搅拌均匀后先添加2倍体积海水，静置10分钟，然后加入盐度为35的海水，再静置15分钟，然后取上浮卵置于孵化器中孵化。

(7)孵化

在孵化网箱中，孵化条件为水温20～23℃，盐度28～30，pH7.5～8.2，溶解氧大于6mg/L，孵化密度为2千克受精卵/m³，每两个小时吸除沉卵。至尾芽期时收集受精卵移至育苗池中孵化。在育苗池中，放卵密度为6.5克/厘米³，每1.5～2m²布置一个气石，持续充气，溶氧在6mg/L以上，pH7.7，水温在23℃，盐度30。本实例中，共获得受精卵3.2kg，孵化率为63.4％。

实施例2：

2018年杂交苗种与纯种赤点石斑鱼苗种对比养殖

于2018年4月份进行赤点石斑鱼和蓝身大斑石斑鱼的杂交育种，同时进行纯种赤点石斑鱼的育种作为对比。杂交种受精卵的获得与孵化等具体操作方法同实施例1，对照组纯种赤点石斑鱼苗种培育使用的精液为新鲜精液，受精卵的孵化同杂交种。使用10mL蓝身大斑石斑鱼冷冻精液与赤点石斑鱼卵授精，获得4kg受精卵，对照组获得3.8kg受精卵。杂交种与赤点石斑鱼的受精率与孵化率差异不显著。在工厂化养殖车间，水温25℃，溶氧6mg/L，pH7.7，盐度30的条件下进行对比养殖，至11月龄时，杂交种体质量与全长分别是赤点石斑鱼的2.2与1.3倍，杂交种具有明显的杂种优势，如表1所示。

表1 2018年杂交种与赤点石斑鱼培育情况

实施例3：

2019年杂交苗种与纯种赤点石斑鱼苗种对比养殖

杂交种受精卵的获得与孵化等具体操作方法同实施例1，对照组纯种赤点石斑鱼苗种培育使用的精液为新鲜精液，受精卵的孵化同杂交种。使用8mL蓝身大斑石斑鱼冷冻精液与赤点石斑鱼卵进行杂交，获得2.8kg受精卵，对照组获得3.2kg受精卵。杂交种受精卵孵化率为66.5％，纯种赤点石斑鱼孵化率为70.2％。对1-77日龄的杂交种与纯种赤点石斑鱼进行测量与统计(图1)。培育至77日龄时，杂交种全长平均为(49.6±3.5)mm，赤点石斑鱼全长平均为(43.4±4.1)mm。培育至3-5cm时，杂交种成活量为5.8万尾，赤点石斑鱼为5.2万尾。杂交苗种生长速度快、而且成活率较高。

附图说明：1-77日龄杂交种与赤点石斑鱼全长比较

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进，这些改进应视为本发明的保护范围。

Claims

1.一种生长快石斑鱼的人工杂交育种方法，其特征在于所述方法包括亲本选择、赤点石斑鱼亲鱼网箱培育、蓝身大斑石斑鱼亲鱼工厂化培育、蓝身大斑石斑鱼性别转化、蓝身大斑石斑鱼精液冷冻保存、赤点石斑鱼亲鱼催产、人工授精、孵化和培育；

所述的亲本选择：

a.赤点石斑鱼雌性亲本：选择4龄以上身体健康的赤点石斑鱼；b.蓝身大斑石斑鱼雄性亲本：选择8龄以上身体健康的蓝身大斑石斑鱼雌鱼；

所述赤点石斑鱼亲鱼网箱培育：

a. 培育环境：年最低水温不低于17℃，海水盐度不低于16，pH为7~9，水流在0.3-0.8m/s，水深为5-7m，培育密度为200-400尾/箱；

b. 非繁殖季节的培育

每天投喂一次，饵料以新鲜小杂鱼为主，投喂量为体重的1.0-2.0%；

ｃ. 繁殖前的强化培育

每天投喂两次，饵料以拌有营养强化剂的新鲜小杂鱼为主，投喂量为体重的3~5%；

所述的蓝身大斑石斑鱼亲鱼工厂化培育：

水泥池中培育，每天换水量为10m³/h，溶氧在6mg/L以上，盐度为28~30，pH为7.5~8.2，培育密度为25~30尾/池；

所述的蓝身大斑石斑鱼性别转化：

在9-10月，选取8龄以上身体健康的蓝身大斑石斑鱼雌鱼进行肌体埋植17α-甲基睾酮缓释胶条，埋植的17α-甲基睾酮缓释胶条的剂量为5-10mg/kg；培育水温从24℃逐渐降至20℃，每8-12天降低1℃，培育至12月底；每天上午投喂一次冰鲜饵料，投喂量为亲鱼体重的1.0~1.5%；

在次年1月份开始进行强化培育；水温由20℃升高至25℃，每8-12天升高1℃；每天上午投喂一次拌有营养强化剂的冰鲜饵料，投喂量为亲鱼体重的1.8~2.5%；

所述的蓝身大斑石斑鱼精液冷冻保存：

采集性别转化成功的雄鱼精液，对精子活力高于90%的精液冷冻保存；将精液与冷冻液按照1:2的体积比混合，注入冷冻管之后，投入液氮中冷冻保存；所述的冷冻液的成分及终浓度为：葡萄糖15.0-20.0g/L，NaCl 6.0-8.0 g/L，KCl 0.5-0.8 g/L，10.0-15.0%1,2-丙二醇，利用蒸馏水配制；

所述的赤点石斑鱼亲鱼催产：

挑选性腺发育至IV期的赤点石斑鱼雌性亲本进行催熟、催产，所用催产激素为绒毛膜促性腺激素与促黄体激素释放激素类似物，使用量分别为300-600 IU/kg、 30-50 μg/kg；

所述的人工授精：

挑选催产后性腺发育成熟的赤点石斑鱼雌鱼进行挤卵；挤卵的同时对蓝身大斑石斑鱼的冷冻精子进行解冻，镜检，利用精子活力大于70%的精子与卵子授精，精卵体积比为1:500，搅拌均匀后迅速加入海水，静置15分钟，取上浮卵用新鲜海水冲洗，最后将受精卵置于孵化器中孵化；

所述的孵化和培育：

首先将受精卵放入孵化网箱中孵化，孵化条件为水温20~24℃，盐度28~30，pH7.5~8.2，溶解氧大于6mg/L，持续微充气、微流水；待发育至尾芽期时；收集受精卵移至育苗池中孵化，放卵密度为6.0~9.0克/米³，溶氧在6mg/L以上，pH7.5~8.2，水温在20~24℃，盐度28~30。

2.根据权利要求1所述的方法，所述的营养强化剂为维生素C和维生素E混合物，混合物中维生素C和维生素E的含量为6～10g/kg，维生素C和维生素E的质量比为1:1。

3.根据权利要求1所述的方法，在人工授精步骤，进行人工授精操作后，先添加2倍体积海水，静置10分钟，然后加入盐度为35的海水，再静置15分钟，然后取上浮卵置于孵化器中孵化。

4.根据权利要求1所述的方法，在孵化网箱中孵化时，每两个小时吸除沉卵。