CN115211420A - 一种添加抗冻蛋白利用pcr仪和pcr管实现的鸡精液冷冻方法及其应用 - Google Patents

一种添加抗冻蛋白利用pcr仪和pcr管实现的鸡精液冷冻方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种添加抗冻蛋白利用PCR仪和PCR管实现的鸡精液冷冻方法及其应用，所述方法可以利用PCR仪和PCR管实现可控降温平衡,实现优化的鸡精液冷冻曲线。利用上述方法获得的冻精可以实现受精率达到80%以上，DNA完整性更高的冷冻保存效果。与新鲜鸡精的相关数据相比，其精子活力、孵化率、DNA完整性上均接近于鲜精的人工授精效果，具有广泛的应用前景。

Description

一种添加抗冻蛋白利用PCR仪和PCR管实现的鸡精液冷冻方法 及其应用
技术领域
本发明涉及生物领域，涉及一种添加抗冻蛋白利用PCR仪和PCR管实现的鸡精液冷冻方法及其应用，及其进一步的涉及利用实验室常见仪器PCR仪和耗材PCR管实现可控降温平衡,实现优化的鸡精液冷冻曲线和优化的解冻方法。
背景技术
精液冷冻保存是人工授精技术的一项重大革新。它解决了精液长期保存的问题，使精液不受时间、地域和种畜生命的限制，可充分利用良种最佳阶段的遗传性能，极大限度的发挥和提高优良种公鸡的利用率，大大提高遗传进展，加速品种的育成和改良步伐。同时，对优良种公鸡在短期进行后裔测定，保留和恢复某一品种或个体公鸡的优秀特性，以及在进行血统更新、引种、减低生产成本和品种资源保护等方面都具有重要意义和应用价值。
近50多年来，国内外学者及动物繁殖技术研究者对家畜、家禽的精液冷冻保存和人工授精技术进行了大量的研究。尤其，自1949年英国Polge等发现甘油(丙三醇)对牛精子具有抗冻保护作用后，该技术研究与应用取得了飞速的发展，尤其在乳牛上的应用效果已同鲜精无明显差异。因此国内外畜牧工作者已相继在牛、羊、马、猪、鸡、鸭、火鸡等种畜禽上开展了精液冷冻保存的研究，均取得了重大进展和显著效果。在家禽(鹅、鸡、鸭、火鸡等)主要从如下几方面进行了大量研究：目前鸡精液冷冻保护剂主要有甘油、DMSO(二甲亚砜)、DMA(N，N-二甲基乙酰胺)以及EG(乙二醇)等。但另一方面也发现这些化学成分对精子也有一定的毒害作用(即抗受精作用)。尤其是本发明的前期试验表明，甘油、DMSO、DMA、EG对精子的存活都会产生较显著的毒害作用(P＜0.05)，其中以DMA的毒性最小，乙二醇和DMSO次之。可见，筛选出高效、无毒的、优良冷冻保护剂是种公鸡精液冷冻的重要环节之一。而且精液冷冻保存不仅涉及到保存液，还涉及到冷冻的具体步骤、解冻的具体步骤，这些都会直接影响到最终的受精效果。
在具体的生产实践中，例如大规模化的养鸡场中，鸡精液过程可以分为采精、一次稀释、平衡、二次稀释、分装、冷冻、解冻检测、保存等几个步骤，整个过程中温度时间控制、试剂、稀释比例和稀释方法等许多方面都会对最终解冻活力和配种效果产生影响。现在鸡冻精技术的自动化程度还很低，只有冷冻过程对自动化设备有所应用，标准化程度很低，这就使得不同学者做出来的效果差异很大。
而常规的鸡冻精按照剂型大致可以分为颗粒冻精和细管冻精两种方式。按照冷冻方法，可以分为简易熏蒸、专用程序冷冻仪冷冻两种方式，前者不需要专用设备，但冷冻效果因人而异，受技术员个人因素影响很大。后者根据需要设定降温曲线，设备自动控温，可以减少人为因素的影响，但是操作繁琐，效果不稳定。
现有技术中对此有很多研究，但大多都效果不理想，例如：现在最常用的方法是精液平衡采用纱布包裹或置于盛水烧杯中再放冰箱冷藏，自然降温，这种方法简单易操作，但是效果极其不稳定，不能精准控制降温速率，由于降温速率与温差成正比，降温过程先快后慢，容易导致低温打击。或者用简易熏蒸架子和泡沫箱熏蒸，根据距离液面的高度来调整冷冻速率，从而改变冷冻效果，但是这种方法中由于空气流动性特别强，很容易产生强烈的扰动，加上不同泡沫箱的保温性能不同，深度不同，环境温度不同，距液氮面同一高度的位置温度都会不一样，并且随着液氮的蒸发，同一套装置在不同时间的温度分布也会产生显著遍变化。这些不可控的因素导致简易熏蒸方式效果不稳定。期刊论文《Effect of theInteraction Between Cryoprotectant Concentration and Cryopreservation Methodon Frozen/Thawed Chicken Sperm Variables》中公开了一种使用程序冷冻仪冷冻的冷冻曲线，以7℃/min从5℃降至-35℃，然后以-60℃/min的速率降低-140℃，这种方法虽然可以精确控温，但是形成冰晶的危险温度区间是0～-60℃，降温过程中精子细胞外会先冻结，导致水分析出，未冻结部分溶液浓度增大，进而导致精子脱水，若降温速率太慢，精子脱水太严重，从而导致细胞损伤。另外，本领域内常采用采用0.25ml麦管作为容器，使用注射器或者移液器等工具手动灌装的方法进行操作，但是由于鸡的精液量特别少，即使稀释完后也只能灌装几支麦管，难以使用自动灌装封口机进行灌装封口，手动灌装通常很难控制灌装量。灌装后还需进行封口操作，额外需要手动封口机。细管冻精解冻后还需要解冻至离心管中才能用于种鸡输精，增加了精液损耗和操作过程。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明的目的是：提供一种精液平衡过程精准可控、灌装封口简便易行、冷冻曲线优化的鸡冻精方案及配套的解冻方法。
所述方法是基于发明人在前期研究中通过技术突破获得了一种鸡精液冷冻保存稀释液，分为I液和II液；I液包括：果糖5~10g、海藻糖8~20g、一水柠檬酸钾1~3g、四水醋酸镁4~6g、谷氨酸钠11~19g、Tris（三羟甲基氨基甲烷）8~13g、还原型谷胱甘肽0.1~0.5g、氧化型谷胱甘肽0.05~0.1g，溶于1000ml水，然后加入松针抗冻多肽（1mg/ml,溶于0.01M PBS缓冲液）1~5ml。取I液660ml加入DMA 80~120ml，即为II液；
所述松针抗冻多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示(Ser-Ala-Arg-Glu-Arg-Thr-Cys-Thr-Ser-Ser-Thr-Asn-Ser-Lys-Ala-Cys-Ala-Lys-Tyr-Thr-Pro-Thr-Asp-Thr-Cys-Thr)
进一步的，本发明提供一种利用上述稀释液对鸡精进行冷冻的优化方法，包括步骤：
将松针抗冻多肽，果糖、海藻糖、一水柠檬酸钾、四水醋酸镁、谷氨酸钠、Tris、还原型谷胱甘肽、氧化型谷胱甘肽，溶于双蒸水，定容至1000ml，充分溶解，为I液，取I液660ml，加入DMA 80~120ml，为II液，I、II液均用0.22um滤器过滤除菌，分装至2ml离心管保存。
使用时用将I液于37℃预热，充分混匀后与原精进行等温稀释，原精:I液=1:2，用移液器将上述稀释后的精液按每份80ul的量分装至200ul PCR管，然后将其置于PCR仪上，设定降温速度0.5~3℃/min，使精液降温至3~6℃，然后加入预冷的II液进行1:1稀释，继续平衡10~20min，平铺在直径15~20cm的粗网筛，用冷冻仪冷冻，冷冻曲线以3~10℃/min从5℃降至-10℃，然后以-30~ -40℃/min的速率降低至-100℃以下，随后投入液氮保存。
进一步的，本发明提供一种针对上述冷冻后鸡精的解冻方法，所述方法为：采用水浴锅水浴解冻，解冻温度60℃ 12s。
有益效果
本发明借助前期研究成果，在此基础上进一步利用实验室普遍使用的PCR管和PCR仪实现了鸡精液的可控降温平衡，并同时避免了细管法手动灌装封口的不便之处,提高了处理效率。并发明还优化了冷冻曲线，提高了冷冻效果。在解冻后精液处理或者配种也更方便，不用再更换一次容器，更适合鸡配种使用。
附图说明
图1 不同冷冻曲线冷冻鸡精解冻后的精子活动轨迹图，其中A为对照2组；B为对照1组；C为实验组。
具体实施方式
在本发明中所使用的术语，除非有另外说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。下面结合具体的实施例，并参照数据进一步详细地描述本发明。应理解，这些实施例只是对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限定，该领域的技术工程师可根据上述发明的内容对本发明作出一些非本质的改进和调整。
实施例1 鸡精液冷冻保存体系的构建
按照如下组分进行鸡精液冷冻保存稀释液的配置
I液的配制：将如SEQ ID NO.1所示的松针抗冻多肽溶解在PBS缓冲液（0.01MpH7.4）中配置成1mg/ml,的预制液，之后将果糖6g、海藻糖12g、一水柠檬酸钾2g、四水醋酸镁5g、谷氨酸钠11、Tris（三羟甲基氨基甲烷）8g、还原型谷胱甘肽0.1g、氧化型谷胱甘肽0.05g，溶于双蒸水，充分溶解，然后加入松针抗冻多肽（1mg/ml,溶于0.01M PBS缓冲液）1~5ml混匀，然后用双蒸水补齐1000ml，用0.22um滤器过滤除菌，分装至2ml离心管保存；
II液的配置：取I液660ml，加入DMA 80ml，为II液，用0.22um滤器过滤除菌，分装至2ml离心管保存；
使用时用将I液于37℃预热，充分混匀后与原精进行等温稀释，原精:I液=1:2，用移液器将上述稀释后的精液按每份80ul的量分装至200ul PCR管，然后将其置于PCR仪上，设定降温速度0.5~3℃/min，使精液降温至3~6℃，然后加入预冷的II液进行1:1稀释，继续平衡10~20min，平铺在直径15~20cm的粗网筛，用冷冻仪冷冻，冷冻曲线以3~10℃/min从5℃降至-10℃，然后以-30~ -40℃/min的速率降低-100℃以下，随后投入液氮保存。
实施例1的解冻方法为水浴解冻60℃ 12s。
对照实验1使用的冷冻方法为：
首先如上方法配制冷冻缓冲液I液和II液，使用时将I液预热混匀后与原精进行等温稀释，原精:I液=1:2，用纱布包裹放入冰箱，使其1h内缓慢降温平衡至4℃，然后加入II液进行1:1稀释，装入0.25ml细管，用冷冻仪冷冻，冷冻曲线以7℃/min从5℃降至-35℃，然后以-60℃/min的速率降低至-140℃，随后投入液氮。
对照组1的解冻方法为50℃ 8s水浴解冻。
对照试验2使用的冷冻方法为：
期刊论文《Effect of the Interaction Between CryoprotectantConcentration and Cryopreservation Method on Frozen/Thawed Chicken SpermVariables》中的平衡、冷冻和解冻方法，所使用的冷冻保护液同样为添加了松针抗冻多肽的鸡精液冷冻保存稀释液。
对上述不同方案获得的解冻的鸡精液进行相应的指标检测（冷冻保藏时间为10天），
活力检查：取10ul精液用I液稀释至100ul后（原精稀释至500ul），使用精液质量分析系统检测，结果见表1。
种蛋的受精率：取200日龄、健康无病、产蛋率高的种母鸡400只，供输精试验。母鸡每隔3天输精一次，每次输精0.2ml，从第二次输精后的第7天开始收集种蛋，连续收集7天。所收集的种蛋在18℃恒温条件下保存，在7天以内入孵。孵化方式采用常用的人工孵化程序进行，于孵化第7天检验种蛋的受精情况，统计种蛋的受精率。
实验结果如表1所示，
Figure 540411DEST_PATH_IMAGE001
从上述数据可以明显看出，本申请所提供的这种冷冻曲线可以在很大程度上提升鸡精液冷冻保藏稀释液的冷冻保藏效果，与新鲜鸡精的相关数据相比，其精子活力与鲜精的活力（82.1±2.9%）的差距已经不显著（80.2±3.5），而且精子的孵化率、DNA完整性等都较之前有了大幅提升，可以接近鲜精的水平，精子活力在0.70以上，远超过了用于人工授精的标准(0.3)。可以利用本申请提供的方法和试剂实现了冷冻保藏的效果，而且即便对其进行了冷冻保藏，在各项数据上均接近于鲜精的人工授精效果。
而且与常规的利用麦管进行操作的方法作比较，本申请的方法还具有封口简单、封口时间短、误差小、较少损耗等优势（见表2）。
Figure DEST_PATH_IMAGE003
前述内容出于解释目的描述了一些示例性实施方案。尽管前面的讨论已经给出了具体的实施方案，但是本领域技术人员将认识到，可以在形式和细节上做出改变，而不脱离本发明的更广泛的精神和范围。因此，说明书和附图应当以说明性的而不是限制性的意义考虑。因此，该详细描述不应以限制性意义理解，并且本发明的范围仅由所包括的权利要求书以及这些权利要求书所享有的等同方案的全部范围来限定。
〈110〉贵州省种畜禽种质测定中心
<120>一种添加抗冻蛋白利用PCR仪和PCR管实现的鸡精液冷冻方法及其应用
<160>1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211>26
<212> PRT
<213>松针抗冻多肽
Ser-Ala-Arg-Glu-Arg-Thr-Cys-Thr-Ser-Ser-Thr-Asn-Ser-Lys-Ala-Cys-Ala-Lys-Tyr-Thr-Pro-Thr-Asp-Thr-Cys-Thr

Claims (5)

1.一种利用PCR仪和PCR管实现可控降温平衡,实现优化的鸡精液冷冻曲线，其特征在于所述鸡精液冷冻曲线为：用移液器将利用鸡精液冷冻保存稀释液I液进行稀释的精液按每份80ul的量分装至200ul PCR管，然后将其置于PCR仪上，设定降温速度0.5~3℃/min，使精液降温至3~6℃，然后加入预冷的鸡精液冷冻保存稀释液II液进行1:1稀释，继续平衡10~20min，平铺在直径15~20cm的粗网筛，用冷冻仪冷冻，冷冻曲线以3~10℃/min从5℃降至-10℃，然后以-30~ -40℃/min的速率降低至-100℃以下，随后投入液氮保存。
2.如权利要求1所述的鸡精液冷冻曲线，其中所述鸡精液冷冻保存稀释液包括鸡精液冷冻保存稀释液I液和鸡精液冷冻保存稀释液II液，鸡精液冷冻保存稀释液I液包括：松针抗冻多肽、果糖、海藻糖、一水柠檬酸钾、四水醋酸镁、谷氨酸钠、Tris（三羟甲基氨基甲烷）、还原型谷胱甘肽、氧化型谷胱甘肽，其中，上述各成分的配比为（1000ml）：果糖5~10g、海藻糖8~20g、一水柠檬酸钾1~3g、四水醋酸镁4~6g、谷氨酸钠11~19g、Tris（三羟甲基氨基甲烷）8~13g、还原型谷胱甘肽0.1~0.5g、氧化型谷胱甘肽0.05~0.1g，余量为双蒸水，然后加入松针抗冻多肽（1ml/ml,溶于0.01M PBS缓冲液）1~5ml；所述松针抗冻多肽的氨基酸序列如SEQID NO.1所示；鸡精液冷冻保存稀释液II液由I液660ml加80~120ml二甲基乙酰胺（DMA）制成。
3.如权利要求1所述的鸡精液冷冻曲线，所述曲线还包括对上述冷冻后鸡精的解冻步骤，所述步骤为：采用水浴锅水浴解冻，解冻温度60℃ 12s。
4.一种利用权利要求1所述的鸡精液冷冻曲线进行鸡精液冷冻保藏的方法，所述方法包括如下步骤：
将果糖、海藻糖、一水柠檬酸钾、四水醋酸镁、谷氨酸钠、Tris、还原型谷胱甘肽、氧化型谷胱甘肽，溶于1000ml水，充分溶解，然后加入松针抗冻多肽（1mg/ml,溶于0.01M PBS缓冲液）1~5ml混匀，为I液；取I液660ml，加入DMA 80~120ml，为II液，I、II液均用0.22um滤器过滤除菌，分装至2ml离心管保存；用时用将I液于37℃预热，充分混匀后与原精进行等温稀释，原精:I液=1:2，用移液器将上述稀释后的精液按每份80ul的量分装至200ul PCR管，然后将其置于PCR仪上，设定降温速度0.5~3℃/min，使精液降温至3~6℃，然后加入预冷的II液进行1:1稀释，继续平衡10~20min，平铺在直径15~20cm的粗网筛，用冷冻仪冷冻，冷冻曲线以3~10℃/min从5℃降至-10℃，然后以-30~ -40℃/min的速率降低-100℃以下，随后投入液氮保存。
5.如权利要求4所述的方法，其中还包括对冷冻鸡精液的解冻步骤，所述步骤为：采用水浴锅水浴解冻，解冻温度60℃ 12s。
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