KR101847707B1 - 전복 정액 냉동 보존을 이용한 전복 인공종묘 생산방법 - Google Patents
전복 정액 냉동 보존을 이용한 전복 인공종묘 생산방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 성숙한 수컷 전복을 25~30℃에서 2시간 동안 간출 자극시키는 단계, 간출자극 후, 곧바로 18~21℃에서 각각 1시간씩 자외선 조사하는 단계, 자외선 자극이 끝난 수컷 전복의 생식소를 압박하여 정자를 채취하는 단계 및 채취한 전복 정자를 디메틸설폭사이드(DMSO) 2.5~15 v/v%를 포함하는 동결액에서 -196℃로 냉동하는 단계를 포함하는 전복 정액의 냉동 보존방법 및 냉동보존된 전복 정자를 40℃ 수욕조에서 해동하는 단계, 해동된 전복 정자를 20만~30만/㎖으로 희석하여 2000/㎖의 전복란에 부피비 1:1로 혼합하여 인공수정시키는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 전복 정액 냉동 보존을 이용한 전복 인공종묘 생산방법을 제공한다.
Description
본 발명은 환경변화에 취약한 전복의 인공종묘생산 및 유전자원확보와 우량종 개발을 위한 전복 정액의 냉동 보존 기술 및 냉동된 전복 정액을 이용한 전복 인공종묘 생산방법에 관한 것이다.
전복은 옛날부터 고가의 기호식품으로서 산업적으로 전망이 밝은 고부가가치 양식품종으로 전복의 생체는 전통적으로 고단백의 고급 수산식품이며, 무지개색의 진주광택을 갖는 내측 껍질면의 패각은 고급 자개용 공예품으로 사용되어 왔다. 또한 전복 양식은 진주 양식을 위한 모패로도 활용된다.
일반적으로 전복의 종류는 현재 세계적으로 약 100여종 이상이 알려져 있고, 우리나라의 연안에는 북방전복을 비롯하여, 말전복, 둥근전복, 시볼트전복, 오분자기 및 마대오분자기 등이 분포하고 있다. 이러한 전복은 뛰어난 식감과 풍부한 영양소로 인하여 비싼 가격에도 불구하고 많은 사람들이 선호하는 해산물의 일종이다. 그러나, 전복의 무분별한 채취와 함께 연안해역의 오염으로 인하여 발생하는 백화현상 등으로 말미암아, 자연에서 채취할 수 있는 전복의 양이 크게 줄어들고 있으며, 이에 따라 전복의 치패(稚貝: 어린조개)를 대량으로 방류하거나, 채롱이나 파판 등에 전복 치패를 부착시켜 수하식 또는 가두리 양식방법 등의 인공양식을 통하여 전복 생산량을 늘리는 노력이 시도되고 있다.
상기와 같은 치패의 방류나 인공양식에 있어 전복의 종묘 수급문제는 가장 기초적이고 중요한 문제로, 1970년 이후 전복의 인공종묘에 대한 많은 연구가 활발히 이루어졌다. 특히 1970년대 일본에서 성숙유효적산수온개념의 확립으로 모패으 인위적인 성숙이 가능해지고, 자외선조사에 의한 산란유발 기법이 확립됨에 따라 인공종묘의 대량생산 기틀이 마련되었다.
우리나라에서는 1970년 이후, 여수 근해산 참전복의 춘계채묘 시험을 실시하여 산란유발자극, 수정율, 유생발생, 부착재료 및 치패의 생존율에 대한 연구 등으로 전복종묘의 대량생산의 길이 열렸고 산란유발방법, 생사육 및 채묘기술 등이 개발되면서 1970년대 후반부터 국립수산과학원 북제주종묘시험장, 여수수산종묘시험장, 포항수산종묘시험장 등에서 전복인공종묘의 대량생산을 하기 시작하였다.
전복 인공종묘의 생산은 먼저 환경변화에 강한 둥근전복이나 북방전복을 대상으로, 각장 13 cm 이상의 성숙한 모패를 선택하여 수온자극, 간출자극, 자외선 조사, 해수 자극, pH 상승, 과산화수소 첨가 자극 및 오존통기 해수 방법 등으로 산란을 유발하고 정충에 노출시켜 수정을 유도한다. 수정란은 부화조에서 부화, 채묘되어 양식 가능한 종패로 성장하게 된다.
이러한 전복의 인공종묘 생산은 다른 수산생물의 인공종묘 생산과 같은 문제를 갖고 있다. 즉, 대부분 체외수정을 하는 수산생물은 일정한 방란 및 방정 시기를 갖고 있어 시기를 적절히 조절하여 수정시켜야하는 문제가 있으며, 자연산 어매 유래의 수정란 확보가 자연자원의 급격한 감소로 어려움이 있어 우량종 획득을 위한 선택적 교배가 용이하지 않다. 또한 전복의 종에 따라 번식기간 동안만 정액의 채취가 가능하므로 종간 교잡종 연구에 어려움이 있으며, 단일 종이라도 번식기간에만 인공종묘를 생산할 수 있는 문제가 있다.
한편 정액의 냉동보존방법은 축산업 분야에서는 종 다양성의 확보 및 육종 등을 위하여 발달하여 왔다. 그러나 어류, 패류를 포함하는 수산양식업에서는 그 연구가 아직 미진한 실정이다. 세계적으로는 멸종위기 종의 보호 및 어류자원 확보의 측면에서 어류 정자의 냉동보존을 이용하여 종묘생산에 이용하고 있으며, 특히 방란, 방정 시기가 불일치하거나 성비가 고르지 못할 때 발생하는 채란, 채정의 비동시화 문제를 해결하는 데에 이용하고 있다. 또한 수컷 어미의 사육관리에 소요되는 노력과 경비를 절약할 수 있으며, 우량종의 선택교배를 가능하게 하고, 우량종과 유전공학에 의해 생산된 신품종 어류의 격리보존이나 멸종위기에 놓인 재래종의 보존을 간편하게 할 수 있다. 그러나 환경변화에 취약한 전복 종의 정액 냉동보존에 관한 연구는 아직 전무한 실정이어서 이에 대한 연구가 시급하다.
본 환경변화에 취약한 전복의 인공종묘생산 및 유전자 자원확보와 우량종 개발을 위한 전복 정액의 냉동 보존 기술 및 냉동된 전복 정액을 이용한 전복 인공종묘 생산방법을 제공한다.
전복의 인공종묘생산 및 유전자 자원확보와 우량종 개발을 위한 전복 정액의 냉동 보존 기술 및 냉동된 전복 정액을 이용한 전복 인공종묘 생산방법을 제공하기 위하여 본 발명은 성숙한 수컷 전복을 25~30℃에서 2시간 동안 간출 자극시키는 단계(1), 간출자극 후, 곧바로 18~21℃에서 각각 1시간씩 자외선을 조사하는 단계(2), 자외선 자극이 끝난 수컷 전복의 생식소를 압박하여 정자를 채취하는 단계(3) 및 채취한 전복 정자를 디메틸설폭사이드(DMSO) 2.5~15 v/v%를 포함하는 동결액에서 -196℃로 냉동하는 단계(4)를 포함하는 전복 정액의 냉동 보존방법을 제공한다.
환경변화에 취약한 전복의 인공종묘생산 및 유전자 자원확보와 우량종 개발을 위한 전복 정액의 냉동 보존 기술 및 냉동된 전복 정액을 이용한 전복 인공종묘 생산방법을 제공함으로써, 환경변화에 취약한 전복의 인공종묘생산방법을 확립하여, 안정적인 전복양식을 수행할 수 있으며, 종간 산란시기가 달라 교잡종 생산 및 유전자 자원확보가 어려웠던 전복 종의 우량종 개발 등 전복 자원 연구에 이용할 수 있다.
도 1은 전복의 모패를 선별하여 산란유발자극을 실시하고 있는 모습을 나타낸 사진이다. A는 모패성숙도를 관찰하는 모습, B는 간출자극 중인 모패, C는 모패수용, D는 자외선 조사 및 해수자극의 모습을 나타낸 사진이다.
도 2는 수컷 전복으로부터 정자를 채취하는 과정을 나타낸 사진이다. A는 압박재취법에 의한 정자채취, B는 절개채취법에 의한 정자채취의 모습을 나타낸 사진이며, C는 압박채취로 얻은 정자(200배), D는 절개채취법으로 얻은 정자(200배)의 현미경사진이다.
도 3은 본 발명에 따라 냉동 보존되었던 전복 정액을 전복란에 수정시키는 과정을 나타낸 사진이다. A는 냉동 보존되었던 전복 정액의 해동과정, B는 해동된 전복 정자를 수득한 모습, C는 해동된 정자의 수정과정, 그리고 D는 해동된 정자에 의하여 수정된 수정란의 현미경 사진이다.
도 4는 본 발명에 따라 냉동 보존되었던 전복 정액을 이용한 수정란의 발생과정을 나타낸 사진이다. A는 동결되었던 정자가 난막을 침투하고 있는 모습을, B는 수정란이 세포분열을 개시한 후, 4세포기의 모습을, C는 수정 24시간 후, 면반이 완성된 모습을, 그리고 D는 수정 40시간 후, 유각이 완성된 모습을 보이고 있다.
도 5는 본 발명에 따라 냉동 보존되었던 전복 정액을 이용한 수정란이 발생 후, 채묘된 모습을 나타낸 사진이다. A는 수정 96시간 후, 소돌기가 출현한 유생으로 발생한 모습을, B는 실험실적 규모의 전복 파판에 전복 유생이 채묘된 모습을 나타낸 사진이다.
도 2는 수컷 전복으로부터 정자를 채취하는 과정을 나타낸 사진이다. A는 압박재취법에 의한 정자채취, B는 절개채취법에 의한 정자채취의 모습을 나타낸 사진이며, C는 압박채취로 얻은 정자(200배), D는 절개채취법으로 얻은 정자(200배)의 현미경사진이다.
도 3은 본 발명에 따라 냉동 보존되었던 전복 정액을 전복란에 수정시키는 과정을 나타낸 사진이다. A는 냉동 보존되었던 전복 정액의 해동과정, B는 해동된 전복 정자를 수득한 모습, C는 해동된 정자의 수정과정, 그리고 D는 해동된 정자에 의하여 수정된 수정란의 현미경 사진이다.
도 4는 본 발명에 따라 냉동 보존되었던 전복 정액을 이용한 수정란의 발생과정을 나타낸 사진이다. A는 동결되었던 정자가 난막을 침투하고 있는 모습을, B는 수정란이 세포분열을 개시한 후, 4세포기의 모습을, C는 수정 24시간 후, 면반이 완성된 모습을, 그리고 D는 수정 40시간 후, 유각이 완성된 모습을 보이고 있다.
도 5는 본 발명에 따라 냉동 보존되었던 전복 정액을 이용한 수정란이 발생 후, 채묘된 모습을 나타낸 사진이다. A는 수정 96시간 후, 소돌기가 출현한 유생으로 발생한 모습을, B는 실험실적 규모의 전복 파판에 전복 유생이 채묘된 모습을 나타낸 사진이다.
본 발명은 환경변화에 취약한 전복의 인공종묘생산과 유전자 자원확보를 통해 연중 안정적인 전복 종묘의 생산 및 우량종 개발을 위한 전복 정액의 냉동 보존 기술 및 냉동된 전복 정액을 이용한 전복 인공종묘 생산방법에 관한 것이다. 이하 본 발명을 구체적인 실시예를 들어 자세히 설명한다. 전복 정액 냉동 보존 및 인공종묘생산 실험은 2014. 12. 8 ~ 2016. 4. 8까지 전라남도 해양수산과학원 전복연구소에서 실험을 실시하였다.
1. 전복 생식세포(정자) 동결보존 실험
1.1 산란유발 및 생식세포 수집
도 1은 전복의 모패를 선별하여 산란유발자극을 실시하고 있는 모습을 나타낸 사진이다. A는 모패성숙도를 관찰하는 모습, B는 간출자극 중인 모패, C는 모패수용, D는 자외선 조사 및 해수자극의 모습을 나타낸 사진이다.
생식세포(정충) 채집을 위해 성숙한 우량 수컷(성숙도 80% 이상)을 25~30℃ 이상 실온에서 2시간 이상 간출 자극시켰다. 간출 후 곧바로 18, 19.5 및 21℃에서 각각 1시간씩 자외선 조사 해수를 이용하여 3시간 동안 자극을 실시하였다.
도 2는 수컷 전복으로부터 정자를 채취하는 과정을 나타낸 사진이다. A는 압박재취법에 의한 정자채취, B는 절개채취법에 의한 정자채취의 모습을 나타낸 사진이며, C는 압박채취로 얻은 정자(200배), D는 절개채취법으로 얻은 정자(200배)의 현미경사진이다.
전복의 생식소는 각정밑에 위치하며, 산란기에 암컷은 짙은 녹색, 수컷은 담황색을 띠고 있다. 산란 유발된 수컷 중 정충 방정의 징후가 관찰되는 개체를 수조에서 꺼내 생식소를 압박 또는 절개하여 정액을 채취 하였다. 수집한 시료는 원심분리기로 13,000RPM에서 10분간 원심분리 하였고, 하층에 모여진 정자를 분리 채집하여 4℃의 온도에서 냉장보관 하였다.
채집된 정액의 농도는 1㎖당 10억에서 15억 마리의 농도를 나타냈으며, 압박에 의한 채취가 절개법에 비해 이물질의 유입이 적고 정자의 활성도 및 생존율(압박 약 90%, 절개법 75%내외)이 높은 특징을 나타냈다.
1.2 적정 동해방어제의 종류 및 농도 실험
정자의 동결보존 전 단계로 동결보존시 적정 동해방어제의 종류를 확인하기 위해 등조액 3종{인공정장; ASP(Alsevers solution, marine fish ringer solution), 수크로오스(Sucrose), 글루코스(glucose)}와 동해방어제 4종{(dimethyl sulfoxide (DMSO), ethylene glycol(EG), glycerol, methyl alcohol)}을 5, 10 v/v% 농도로 제조하여 각각 1:1 비율로 희석한 다음, 표 1의 실험 조건 1 및 2의 방법으로 냉동보존하였다. 이하 %는 혼합 조성된 동결보존액 전체 부피의 동해방어제 부피 백분율(v/v%)을 나타낸다.
표 1은 본 발명의 전복 냉동 보존방법의 최적 조건을 확인하기 위한 실험 조건표이다. 해동은 수욕조를 사용하여 20~50℃의 온도에서 급속 해동하였으며, ASW(인공해수, 18)와 정자를 100:1 비율로 자극하여 활성개체를 형광현미경(OLIMPUS Bx-53)과 혈구 계산판으로 생존율을 비교 관찰하였다. 실험에 사용된 냉동 보존 방법은 표 1과 같다.
| 조 건 | 초기보관온도 | 동결 조건 | 해 동 | |||
| 1 | 4℃ | -196℃ 급속동결(액체질소 보관) | 20℃ 수욕조 해동 | |||
| 2 | 4℃ | -196℃ 급속동결(액체질소 보관) | 30℃ 수욕조 해동 | |||
| 3 | 4℃ | -196℃ 급속동결(액체질소 보관) | 40℃ 수욕조 해동 | |||
| 4 | 4℃ | -196℃ 급속동결(액체질소 보관) | 50℃ 수욕조 해동 | |||
| 5 | 4℃ | -76℃ 예비동결 | -196℃ 본동결 | 20℃ 수욕조 해동 | ||
| 6 | 4℃ | -76℃ 예비동결 | -196℃ 본동결 | 30℃ 수욕조 해동 | ||
| 7 | 4℃ | -76℃ 예비동결 | -196℃ 본동결 | 40℃ 수욕조 해동 | ||
| 8 | 4℃ | -76℃ 예비동결 | -196℃ 본동결 | 50℃ 수욕조 해동 | ||
| 9 | 4℃ | -30℃ 1차 예비동결 (3분) | -76℃ 2차 예비동결(10분) | -196℃ 본동결 | 20℃ 수욕조 해동 | |
| 10 | 4℃ | -30℃ 1차 예비동결 (3분) | -76℃ 2차 예비동결(10분) | -196℃ 본동결 | 30℃ 수욕조 해동 | |
| 11 | 4℃ | -30℃ 1차 예비동결 (3분) | -76℃ 2차 예비동결(10분) | -196℃ 본동결 | 40℃ 수욕조 해동 | |
| 12 | 4℃ | -30℃ 1차 예비동결 (3분) | -76℃ 2차 예비동결(10분) | -196℃ 본동결 | 50℃ 수욕조 해동 | |
1.3 냉동보존 방법별 동결보존 효과 분석
표 2는 동해 방어제 종류와 동결조건에 따른 생존율을 나타낸 표이다. 일반적으로 냉동보존에 사용하는 동해 방어제 농도 및 종류 실험에서는 전체적으로 비교적 낮은 생존율을 나타냈다. 상기 실험에서 생존율이 가장 높은 DMSO를 전복 정액 냉동보존의 최적의 동해방어제로 판단하였으며, 동결액 내의 DMSO 농도 10%보다 5%에서 생존율이 높은 것에 착안하여 DMSO 5% 이하의 농도범위에서 3~5번 냉동보존 방법으로 생존율을 비교 관찰하였다.
| 조건 | 동해 방어제 종류와 동결조건에 따른 생존율(%) | |||||||
| DMSO(%) | EG(%) | glycerol(%) | 메틸알콜(%) | |||||
| 5 | 10 | 5 | 10 | 5 | 10 | 5 | 10 | |
| 1 | - | - | - | - | - | - | - | - |
| 2 | 0.1 | 0.1 | - | - | - | - | - | - |
| 3 | 0.1 | 0.1 | - | - | 0.1 | 0.1 | - | - |
| 4 | - | - | - | - | - | - | - | - |
| 5 | 15.0 | 10.0 | 1 | 0.5 | 10.0 | 15.0 | - | - |
| 6 | 16.0 | 12.5 | 1 | 0.5 | 0.1 | - | - | - |
| 7 | 15.5 | 15.5 | 1.5 | 0.5 | 0.1 | 0.1 | - | - |
| 8 | 3.5 | 2.5 | 0.5 | 0.1 | - | - | - | - |
| 9 | 18.0 | 13.0 | 3.5 | 1.5 | 10.0 | 15.0 | - | - |
| 10 | 18.0 | 12.5 | 2 | 0.5 | 0.1 | - | - | - |
| 11 | 19.5 | 16.5 | 1.5 | 0.5 | 0.1 | 0.1 | - | - |
| 12 | 5.5 | 3.5 | 0.5 | 0.1 | - | - | - | - |
| 비고 | 생존개체 발견 | 생존개체 발견 | 생존개체 발견 | 생존개체 없음 | ||||
또한 상기 표 1의 11번 조건을 세분화하여 표 3과 같은 동결프로그램을 설정하고 이후 전복 정액 동결에 적용하였으며, 프로그램동결기를 이용하여 3~5 단계로 동결온도를 세분화하여 전복정자 동결을 실시하였다. 표 3은 프로그램동결기의 동결조건을 나타낸 표이다.
| 프로그램 | 구분 | 0 step | 1 step | 2 step | 3 step | 4 step | 5 step |
| 1 | 온도(℃) | 18 | 10 | 0 | -20 | -60 | -196 |
| 동결속도(℃/min) | - | -3 | -6 | -9 | -12 | end | |
| 2 | 온도(℃) | 18 | 0 | -11 | -38 | -60 | -196 |
| 동결속도(℃/min) | - | -6 | -5.5 | -27 | -4.4 | end | |
| 3 | 온도(℃) | 18 | 0 | -11 | -38 | -60 | -196 |
| 동결속도(℃/min) | - | -12 | -11 | -54 | -8.8 | end | |
| 4 | 온도(℃) | 0 | -60 | -196 | |||
| 동결속도(℃/min) | - | -4 | end |
표 4는 DMSO 농도(%)에 따른 생존율을 나타낸 표이다. 실험결과, DMSO 2.5~15% 범위에 걸쳐 3.2~80.5%의 생존율을 나타냈으며, 2.5% 농도에서 80.5%의 가장 높은 생존율을 나타내었다.
| 프로그램 | 동해방어제 농도에 따른 생존율(%) | |||
| DMSO(%) | ||||
| 2.5 | 5 | 10 | 15 | |
| 1 | 5.3 | 5.3 | 9.5 | 3.2 |
| 2 | 21.5 | 9.5 | 10.5 | 4.5 |
| 3 | 80.5 | 45.5 | 30.5 | 12.5 |
| 4 | 20.0 | 18.0 | 15 | 8.5 |
2. 동결보존 정자를 이용한 인공종묘 생산
2.1 동결보존 정자를 이용한 인공수정
일반적인 전복 인공종묘의 생산과정에서 전복 모패의 암수비율 구성 및 방란된 알과 방정된 정충의 수를 맞추어 주어야 하는 정교한 작업이다. 방정, 방란 자극에 의하여 주로 수컷이 먼저 방정을 하게 되는데, 수컷의 방정은 모패의 출수공으로부터 유백색의 정액을 연기처럼 방출한다. 이렇게 방정된 정충은 이후 산란된 알에 대해 알 1립에 정충 10,000마리의 비율로 조용히 수정시켜야 하며, 수조의 알은 40립/㎖ 가 되도록 하는데, 이때 정충의 농도를 너무 높게 하면 발생도중 난막이 찢어져 버리게 된다.
본원발명에서는 암컷 전복으로부터 전복란의 수집은 정충과 같이 수온, 간출 및 자외선 조사 해수를 이용하여 수집하였으며, 최종 농도가 2000/㎖가 되도록 조절하였다. 동결보존 된 정충의 농도는 1㎖당 0.75억 ~ 1억 범위의 농도를 나타내었으며, 20만 ~ 30만/㎖으로 희석(㎖당 약 30㎖의 해수에 희석)후, 각 정충과 전복란을 부피비 1:1로 인공 수정시킨 다음, 수정된 개체를 광학현미경을 하에 카운팅하여 수정율을 측정하였다.
도 3은 본 발명에 따라 냉동 보존되었던 전복 정액을 전복란에 수정시키는 과정을 나타낸 사진이다. A는 냉동 보존되었던 전복 정액의 해동과정, B는 해동된 전복 정자를 수득한 모습, C는 해동된 정자의 수정과정, 그리고 D는 해동된 정자에 의하여 수정된 수정란의 현미경 사진이다. 해동방법에 따라 해동된 전복 정자를 원심분리에 의하여 모으고 동결보존액을 제거 및 수회 해수로 세척한 후, 인공수정에 사용하였다.
2.2 수정란의 발생 및 채묘
도 4는 본 발명에 따라 냉동 보존되었던 전복 정액을 이용한 수정란의 발생과정을 나타낸 사진이다. A는 동결되었던 정자가 난막을 침투하고 있는 모습을, B는 수정란이 세포분열을 개시한 후, 4세포기의 모습을, C는 수정 24시간 후, 면반이 완성된 모습을, 그리고 D는 수정 40시간 후, 유각이 완성된 모습을 보이고 있다.
수정난의 발생은 수온 20℃ 조건에서 정자와 전복란 혼합 후, 4~6시간 이후부터 관찰되었다. 또한 극체 분열 12시간 후 부유유생이 발생하였으며, 이후 12시간 정도 유각 형성단계를 거치며, 부유유생에서 채묘단계 까지는 통상 75~85시간이 소요되었다.
도 5는 본 발명에 따라 냉동 보존되었던 전복 정액을 이용한 수정란이 발생 후, 채묘된 모습을 나타낸 사진이다. A는 수정 96시간 후, 소돌기가 출현한 유생으로 발생한 모습을, B는 실험실적 규모의 전복 파판에 전복 유생이 채묘된 모습을 나타낸 사진이다. 두부촉각에서 제3소돌기 출현시점에 채묘를 시도하였다. 채묘 24시간 후, 파판에 부착된 부화유생의 개체수를 카운트하여 최종 채묘율을 측정하고 표 5에 나타내었다.
| 단계별 발생율 | 수정율 | 부화율 | 채묘율 |
| 난자 1만립(100%) | 6,000 (60%) | 4,800 (80%) | 2,640 (55%) |
표 5는 전복란 10,000립을 기준으로 냉동보존되었던 전복 정자의 수정율, 부화율, 채묘율을 나타낸 표이다. 전복란 10,000립 기준으로 수정된 개체는 60%에 달하여 양호한 수정율을 나타내었으며, 전체 수정 개체의 80%가 소돌기가 출현한 부화유생으로 발생하였다. 또한, 전복 파판에 부착 확인된 개체는 부화유생의 55%에 해당하여 본 발명의 전복 정액 냉동 보존방법에 의하여 높은 효율의 전복란 수정율과 부화율을 얻을 수 있음을 확인하고, 이를 전복 양식 등에 사용할 수 있음을 확인하였다.
환경변화에 취약한 전복의 인공종묘생산 및 유전자 자원확보와 우량종 개발을 위한 전복 정액의 냉동 보존 기술 및 냉동된 전복 정액을 이용한 전복 인공종묘 생산방법을 제공함으로써, 환경변화에 취약한 전복의 인공종묘생산방법을 확립하고, 말전복, 시볼트전복, 오분자전복 또는 마대오분자기 등의 전복의 종간 산란의 비동시성을 조절하여 교잡종 생산 및 유전자 자원확보와 우량종 개발이 용이하므로 산업상 이용가능성이 있다.
Claims (4)
- 성숙한 수컷 전복을 25~30℃에서 2시간 동안 간출 자극시키는 단계(1); 상기 간출자극 후, 곧바로 18~21℃에서 각각 1시간씩 자외선을 조사하는 단계(2); 상기 자외선 자극이 끝난 수컷 전복의 생식소를 압박하여 정자를 채취하는 단계(3);
상기 채취한 전복 정자를 디메틸설폭사이드(DMSO) 2.5 v/v%를 포함하는 동해방어제에서 냉동하며, 동결온도별 동결속도(℃/min)는 0℃까지 분당 동결속도 -12℃, -11℃까지 분당 동결속도 -11℃, -38℃까지 분당 동결속도 -54℃, -60℃까지 분당 동결속도 -8.8℃로 설정하여 최종 -196℃까지 냉동하는 단계(4);를 포함하는 것을 특징으로 하는 전복 정액의 냉동 보존방법.
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- 성숙한 수컷 전복을 25~30℃에서 2시간 동안 간출 자극시키는 단계(1); 상기 간출자극 후, 곧바로 18~21℃에서 각각 1시간씩 자외선을 조사하는 단계(2); 상기 자외선 자극이 끝난 수컷 전복의 생식소를 압박하여 정자를 채취하는 단계(3);
상기 채취한 전복 정자를 디메틸설폭사이드(DMSO) 2.5 v/v%를 포함하는 동해방어제에서 냉동하며 동결온도별 동결속도(℃/min)는 0℃까지 분당 동결속도 -12℃, -11℃까지 분당 동결속도 -11℃, -38℃까지 분당 동결속도 -54℃, -60℃까지 분당 동결속도 -8.8℃로 설정하여 최종 -196℃로 냉동하는 단계(4);
상기 냉동 보존된 전복 정자를 40℃ 수욕조에서 해동하는 단계(5); 상기 해동된 전복 정자를 20만~30만/㎖으로 희석하여 2000/㎖의 전복란에 부피비 1:1로 혼합하여 인공수정시키는 단계(6)를 포함하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 전복 정액의 냉동 보존방법을 이용한 전복 인공종묘 생산방법.
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Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| J. Gwo 외 2명, Semen cryopreservation of small abalone, 2002년 발간, p.1563-1578 |
| 정종균 외 5명, 결빙억제제의 종류, 농도 및 침지시간이 참전복 발생배의 생존활성에 미치는 영향, 2012년 발간, 15(4), p301-308 |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR102298287B1 (ko) | 2020-08-27 | 2021-09-03 | 목포대학교산학협력단 | 범가자미 정자의 동결보존방법 |
| KR20220168088A (ko) | 2021-06-15 | 2022-12-22 | 목포대학교산학협력단 | 줄가자미 정자의 동결보존 방법 |
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| KR20170122867A (ko) | 2017-11-07 |
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