CN114467920B - 一种豹纹鳃棘鲈精液低温保存稀释液、保存方法及应用 - Google Patents

一种豹纹鳃棘鲈精液低温保存稀释液、保存方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种豹纹鳃棘鲈精液低温保存稀释液、保存方法及应用，属于豹纹鳃棘鲈人工繁育领域。所述稀释液包括如下重量份的组分：氯化钠3.5份，碳酸氢钠1.68份，氯化钾2份，还原性谷胱甘肽2份，葡萄糖0.44份以及胎牛血清10份。将所述豹纹鳃棘鲈精液与所述稀释液按照稀释比例为1:9～1:99稀释后，于0～4℃保存。本发明首次确认并提出了豹纹鳃棘鲈精液0～4℃低温保存的新型配方，对精子无毒害作用，精子保存时间最长可达72h，保存24h时受精率和孵化率仍旧具有71.54％和61.84％，与鲜精相比，有效延长了精子保存时间，保证精子活率，可满足豹纹鳃棘鲈人工良种选育时精子低温短期储存的要求。

Description

一种豹纹鳃棘鲈精液低温保存稀释液、保存方法及应用
技术领域
本发明涉及豹纹鳃棘鲈人工繁育领域，特别是涉及一种豹纹鳃棘鲈精液低温保存稀释液、保存方法及应用。
背景技术
鱼类生殖方式为体外受精，精子在精巢或精浆中是不活动的，一旦排入水中立即获能激活，进而开始运动，具有受精能力。豹纹鳃棘鲈俗称东星斑，是南方沿海重要的名贵海水养殖品种，许多养殖厂为了追求利润最大化，其养殖密度逐步升高，导致近亲繁殖程度加深，进一步使得种质退化和病害等问题显露。离体精子的有效保存手段可为人工授精甚至全人工繁育开创条件。在实际生产中，经常会遇到雌雄性腺发育不同步或雄鱼精液量不足等问题，那么就需要一种将精液短期储存数天甚至数十天的方法，除此之外，精子从亲鱼排出后，失去机体对营养物质的供应，所需能量仅来自精浆，便会很快就停止运动。因此在获取精子时应尽量避免受到污染，并置于低温(0～4℃)以减少精子能量消耗，添加合适的稀释液可减少精子黏稠性、维持内环境稳态、补充营养等，从而有效延长精子体外保存时间。合适的稀释倍数同样影响保存时间，当稀释倍数过小时，导致精液浓度过高、粘稠，从而活力变低；稀释倍数过大时，精子外部形态结构易发生变化，降低活力。
迄今为止，未见有豹纹鳃棘鲈精子低温(0～4℃)保存的报道或研究，仅见于中山大学蒙子宁团队关于“豹纹鳃棘鲈冷冻保存液及其保存方法”(专利号：ZL201410473950.6)，但其适用于冷冻保存且操作较为复杂，一般养殖场不会常备液氮和液氮罐，不同人员操作上存在差异，冻存精子解冻时间受主观影响大，会直接影响精子冷冻保存效果，即便有些精子解冻后具有活力，但其内外部生理生化功能受到冷冻损伤，而不具备受精能力。
发明内容
本发明的目的是提供一种豹纹鳃棘鲈精液低温保存稀释液、保存方法及应用，以解决上述现有技术存在的问题，该稀释液延长了低温保存时间，提高了受精率和孵化率，有效满足了豹纹鳃棘鲈人工良种选育时精子低温短期储存的要求。
为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
本发明提供一种豹纹鳃棘鲈精液低温保存稀释液，包括如下重量份的组分：氯化钠3.5份，碳酸氢钠1.68份，氯化钾2份，还原性谷胱甘肽2份，葡萄糖0.44份以及胎牛血清10份。
该配方适合豹纹鳃棘鲈精液低温保存，包含了无机盐，用来保持pH、维持渗透压、抑制精子被激活，还添加了葡萄糖作为外部营养物质来源；还原性谷胱甘肽可降低精子呼吸代谢时产生的代谢产物导致的氧化损伤；胎牛血清(FBS)除了具有上述功能外，还能够减少精子在低温下产生的低温损伤。
本发明还提供所述的稀释液低温保存豹纹鳃棘鲈精液的方法，包括将所述豹纹鳃棘鲈精液与所述稀释液按照稀释比例为1:9～1:99稀释后，于0～4℃保存的步骤。
优选的是，还包括制备所述稀释液的步骤，具体为：
S1：按照各组分的用量称量氯化钠、碳酸氢钠、氯化钾、还原性谷胱甘肽、葡萄糖，常温溶解于超纯水，制备基础稀释液，4℃保存待用；
S2：将胎牛血清与所述基础稀释液按照体积比1:9混合，获得所述稀释液。
优选的是，所述超纯水在120℃高温灭菌30min。
优选的是，所述基础稀释液4℃保存不超过7天。
优选的是，所述胎牛血清使用前，先解冻完全溶解后，再与所述基础稀释液混合以保证现配现用。
本发明还提供根据所述的稀释液在延长豹纹鳃棘鲈精液体外保存时间以及提高体外保存后受精率和孵化率中的应用。
本发明公开了以下技术效果：
采用本发明精液低温保存稀释液配方对精子无毒害作用，其使用方法可有效延长离体豹纹鳃棘鲈精子时间至3天。
本发明保存方法操作简便易行，配好低温保存稀释液后，带上冰袋即可在野外保存精子，避免因0℃以下时精子形成冰晶对其产生损伤。
本发明能够高效保存优质雄鱼亲本精子，提高稀释后精液体外保存后的受精率和孵化率，为个人、企业和科研单位对豹纹鳃棘鲈进行人工授精提供技术支持，满足生产研究的需求。
附图说明
图1为本发明使用低温保存稀释液保存豹纹鳃棘鲈精液的技术方案操作流程图。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见的。本申请说明书和实施例仅是示例性的。
关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
本发明使用低温保存稀释液保存豹纹鳃棘鲈精液的技术方案操作流程如下(见图1)：(1)配制低温保存稀释液；(2)获取精液(精液质检)；(3)稀释、低温保存精液(0-4℃)，精子质检；(4)人工授精；(5)统计受精率和孵化率。
实施例1豹纹鳃棘鲈精液低温保存稀释液配制
1、分析天平称量氯化钠3.5g，碳酸氢钠1.68g，氯化钾2g，还原性谷胱甘肽2g，葡萄糖0.44g，常温下溶解于已在高压灭菌锅120℃下灭菌30min的超纯水中，定容至0.9L，得到基础稀释液，4℃下保存待用，最好保存时间不超过7天。
2、临用前，将胎牛血清于-20℃内取出，至完全溶解后移取0.1L于基础稀释液中，即获得低温保存稀释液。
实施例2精液的采集和稀释
1、在繁殖季节，选取经过营养强化、生长良好、精巢发育成熟的20尾豹纹鳃棘鲈雄鱼，丁香酚麻醉后用干毛巾搽干泄殖孔周围，延鱼头至泄殖孔轻压腹部，待流出乳白色、干净无污染的精液后，使用量程为200μL移液枪立即吸取，并轻轻打入无任何液体的5mL无菌EP管底部，将采集到的豹纹鳃棘鲈精液混合处理，以便消除个体间差异。
2、将精液与实施例1制备的低温保存稀释液比例为1:9，1:29，1:49，1:69，1:99进行稀释装入5mL无菌EP管内，此为实验组，每种稀释后的精液总体积均为2.1mL。剩余的未添加任何试剂的鲜精精液作为对照组。
3、上述所有EP管先用锡箔纸包裹避光，防止光激活，再包裹脱脂棉，最外层纱布裹紧，放入含冰袋的冰盒内，温度约4℃。
实施例3精子活力检测
1、鲜精活力检测：根据实施例2中的步骤2采集的鲜精，于从亲本雄鱼取出后10min，2h，4h，6h，12h，24h，48h，72h，96h，每次检测具体操作步骤如下：在200μL EP管中用200μL移液枪加入99μL豹纹鳃棘鲈精液低温保存稀释液，用2.5μL移液枪吸取1μL鲜精精液并轻轻吹打混匀；吸取1μL混合液于载玻片，调节焦距至显示屏成像清晰，加入2μL过滤天然海水激活精子，即最终精液稀释300倍后使用精子活力检测系统(CASA)检测精子活力，主要记录运动率。
2、精液不同稀释比例检测：
(1)根据实施例2中的2制备的稀释比例为1:9(稀释10倍)的精液进行检测时，于从亲本雄鱼取出后10min，2h，4h，6h，12h，24h，48h，72h，96h，每次检测具体操作步骤如下：在200μL EP管中用10μL移液枪加入9μL豹纹鳃棘鲈精液低温保存稀释液，用2.5μL移液枪吸取1μL根据实施例2中的2制备的稀释比例为1:9的稀释后精液，并轻轻吹打混匀；吸取1μL混合液于载玻片，调节焦距至显示屏成像清晰，加入2μL过滤天然海水激活精子，即最终精液稀释300倍后使用精子活力检测系统(CASA)检测精子活力，主要记录运动率。
(2)根据实施例2中的2制备的稀释比例为1:29(稀释30倍)的精液进行检测时，于从亲本雄鱼取出后10min，2h，4h，6h，12h，24h，48h，72h，96h，每次检测操作步骤如下：在200μL EP管中用2.5μL移液枪加入2.8μL豹纹鳃棘鲈精液低温保存稀释液，用2.5μL移液枪吸取1.2μL根据实施例2中的2制备的稀释比例为1:29的稀释后的精液，并轻轻吹打混匀；吸取1μL混合液于载玻片，调节焦距至显示屏成像清晰，加入2μL过滤天然海水激活精子，即最终精液稀释300倍后使用精子活力检测系统(CASA)检测精子活力，主要记录运动率；
(3)根据实施例2中的步骤2制备的稀释比例为1:49(稀释50倍)的精液进行检测时，于从亲本雄鱼取出后10min，2h，4h，6h，12h，24h，48h，72h，96h，每次检测具体操作步骤如下：在200μL EP管中用2.5μL移液枪加入1μL豹纹鳃棘鲈精液低温保存稀释液，用2.5μL移液枪吸取1μL根据实施例2中的2制备的稀释比例为1:49的稀释后的精液，并轻轻吹打混匀；吸取1μL混合液于载玻片，调节焦距至显示屏成像清晰，加入2μL过滤天然海水激活精子，即最终精液稀释300倍后使用精子活力检测系统(CASA)检测精子活力,主要记录运动率。
(4)根据实施例2中的步骤2制备的稀释比例为1:69(稀释70倍)的精液进行检测时，于从亲本雄鱼取出后10min，2h，4h，6h，12h，24h，48h，72h，96h，每次检测具体操作步骤如下：在200μL EP管中用2.5μL移液枪加入0.6μL豹纹鳃棘鲈精液低温保存稀释液，用2.5μL移液枪吸取1.4μL根据实施例2中的2制备的稀释比例为1:69的稀释后的精液，并轻轻吹打混匀；吸取1μL混合液于载玻片，调节焦距至显示屏成像清晰，加入2μL过滤天然海水激活精子，即最终精液稀释300倍后使用精子活力检测系统(CASA)检测精子活力，主要记录运动率。
(5)根据实施例2中的步骤2制备的稀释比例为1:99(稀释100倍)精液进行检测时，于从亲本雄鱼取出后10min，2h，4h，6h，12h，24h，48h，72h，96h，每次检测具体操作步骤如下：用2.5μL移液枪吸取根据实施例2中的2制备的稀释比例为1:99的稀释后的精液，并轻轻吹打混匀；吸取1μL混合液于载玻片，调节焦距至显示屏成像清晰，加入2μL过滤天然海水激活精子，即最终精液稀释300倍后使用精子活力检测系统(CASA)检测精子活力，主要记录运动率；
根据上述方法检测精子活力后，结果如表1所示，与鲜精相比，当豹纹鳃棘鲈精液与低温保存稀释液的稀释比例为1:49和1:69时，激活的运动率较高且极大延长了保存时间，当保存至72h时运动率为10％左右，此时大部分精子已经失活，即便是运动中的精子，也无法很好的与卵子受精。因此，可以推断本发明的豹纹鳃棘鲈低温保存精子稀释液最长保存时间为3天左右。为了提高每次采集精液后保存的效率，采用稀释比例为1:49最佳。
表1豹纹鳃棘鲈不同保存时间、不同稀释比例下精子运动率
Figure BDA0003494014870000081
注：“-”表示未激活，即运动率为0。
实施例4人工授精
根据实施例3所得的结果可以得知，豹纹鳃棘鲈精液与低温保存稀释液稀释比例为1:49保存时间可达到72h左右，在24h前依旧可激活47.51％的精子。因此，在人工授精实验中，以精液稀释50倍作为实验组，鲜精作为对照组。
采用湿法受精，将1μL鲜精或50μL稀释后的精液用海水激活后，立即倒入2mL卵子平铺在含激活精子的培养皿上数分钟，不断搅动，再转入26～28℃的干净海水中孵化。使用保存后2h，6h，12h，24h分别与卵子受精，并统计受精率和孵化率。具体公式为：
受精率＝(发育至4～16细胞期胚胎数/总卵数)×100％；
孵化率＝(初孵仔鱼数/已受精胚胎数)×100％。
需要特别说明的是，从亲本雌鱼挤出来的卵子需发育状况良好，外观上呈球形、均质且透明，大部分漂浮于海水表面。
依据上述人工授精步骤，计算不同保存时间段的受精率和孵化率，结果如表2所示，低温保存2h时，稀释后的精液的授精能力与鲜精相当；豹纹鳃棘鲈的鲜精6h时受精率降低迅速；稀释后的精液在低温保存24h时仍然具有较高的受精率和孵化率，分别为71.54％和64.84％，依旧能够满足实际生产需求。
表2不同时间段、不同稀释比例下人工授精后受精率和孵化率
Figure BDA0003494014870000091
注：“-”表示受精率或孵化率为0。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

Claims (6)

1.一种豹纹鳃棘鲈精液低温保存稀释液，其特征在于，包括：
称量氯化钠3.5g，碳酸氢钠1.68g，氯化钾2g，还原性谷胱甘肽2g和葡萄糖0.44g，常温下溶解于已在高压灭菌锅120℃下灭菌30min的超纯水中，定容至0.9L，得到基础稀释液，4℃下保存待用；
临用前，将胎牛血清于-20℃内取出，至完全溶解后移取0.1L于所述基础稀释液中，即获得低温保存稀释液。
2.根据权利要求1所述的稀释液低温保存豹纹鳃棘鲈精液的方法，其特征在于，包括将所述豹纹鳃棘鲈精液与所述稀释液按照稀释比例为1:9～1:99稀释后，于0～4℃保存的步骤。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，还包括制备所述稀释液的步骤，具体为：
S1：按照权利要求1各组分的用量称量氯化钠、碳酸氢钠、氯化钾、还原性谷胱甘肽、葡萄糖，常温溶解于已于120℃高温灭菌30min的超纯水中，定容到0.9L，制备基础稀释液，4℃保存待用；
S2：将胎牛血清与所述基础稀释液按照体积比1:9混合，获得所述稀释液。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述基础稀释液4℃保存不超过7天。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述胎牛血清使用前，先解冻完全溶解后，再与所述基础稀释液混合以保证现配现用。
6.根据权利要求1所述的稀释液在延长豹纹鳃棘鲈精液体外保存时间以及提高体外保存后受精率和孵化率中的应用。
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