CN103333855A - 一种羊胚胎细胞培养液 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种羊胚胎细胞培养液，所述的培养液的组分如下：二水氯化钙，无水硫酸镁，氯化钾，磷酸二氢钾，碳酸氢钠，氯化钠，牛血清白蛋白，葡萄糖，丙酮酸钠，乳酸钠和酚红钠。为了使本发明的培养液具有更好的细胞培养效果，在上述的培养液中还添加有体积比浓度为10%的胎液。本发明的培养液通过组分之间的协同作用，减少了对早期胚胎的刺激作用，更利于胚胎的发育。而且，在培养液中还添加了10%的母羊的子宫胎液，能显著提高重构胚的融合率。与不加胎液的培养液相比，添加胎液的培养液能显著提高体外培养胚胎的存活率、囊胚率。同时，本发明的培养液能增加子宫容受性，显著提高了产羔率。
Description
技术领域
本发明属于细胞体外培养技术领域，具体涉及一种羊胚胎细胞培养液。
技术背景
自20世纪80年代以来，转基因动物研究在改良生长发育速度、营养成分、对环境条件的抗性及环境污染指示物等领域取得重大进展，尤其是转基因动物乳腺生物反应器技术在生产药用蛋白及功能食品等领域的应用，彰显了转基因动物研究技术的强大应用潜力。
而胚胎体外培养是转基因动物研究领域的一个重要环节。体外培养胚胎的环境直接影响胚胎的发育及移植后的出生率等。大量长期的研究表明，体外培养环境的主要因素之一是胚胎体外正常发育的培养基。目前体外培养通常以M16为基础培养基，然后添加氨基酸、细胞生长因子、EDTA等添加剂。但是早期胚胎在体外培养过程中对环境变化相当敏感，与体内胚胎相比，存在质量差、移植受胎率低等问题，束缚着转基因动物研究技术的发展。
发明内容
本发明的目的是提供一种羊胚胎细胞培养液，以弥补现有培养技术的不足。
本发明的培养液，为包含有如下组分的水溶液：0.25g/L的二水氯化钙，0.16g/L的无水硫酸镁，0.35g/L的氯化钾，0.16g/L的磷酸二氢钾，2.10g/L的碳酸氢钠，5.53g/L的氯化钠，4.00g/L的牛血清白蛋白，1.00g/L的葡萄糖，0.036g/L的丙酮酸钠，2.95g/L的乳酸钠和0.01g/L的酚红钠。
另外，根据胚胎培养的不同阶段，选择性的添加如下浓度的组分：5μmol/L的离子霉素、2mmol/L的6-二甲基苯胺嘌呤、5μg/ml的细胞松弛素。
为了使本发明的培养液具有更好的细胞培养效果，在上述的培养液中还添加有体积比浓度为10%的胎液。
上述胎液为怀孕中期的母羊的子宫胎液。
本发明的培养液用于对羊的胚胎或重组胚胎细胞的体外培养。
本发明的培养液通过组分之间的协同作用，减少了对早期胚胎的刺激作用，更利于胚胎的发育。而且，在培养液中还添加了10%的母羊的子宫胎液，能显著提高重构胚的融合率。与不加胎液的培养液相比，添加胎液的培养液能显著提高体外培养胚胎的存活率、囊胚率。同时，本发明的培养液能增加子宫容受性，显著提高了产羔率。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的培养基进行详细的描述。
1、 胎液的制备：
胎液按照目前已有的方法来制备，首先为孕羊做B超，确定胎盘位置，避免误伤胎盘。选好进针点，消毒皮肤，用腰穿针在选好的点垂直刺入。针穿过腹壁和子宫壁，抽取胎液，然后分别装在消毒试管内，加盖，备用。
2、 基础培养液及添加剂
本发明基础培养液配制所需的各相关成分详见表1。分别取各相关成分所需的量，加入到1000ml重蒸馏水中充分混合均匀。
配制5μmol/L的 Ionomycin、2mmol/L的6-DAMP、5μg/ml的CB。
3、将上述溶液分别混合
混合液（1）：基础培养液+10%胎液+5μmol/L的 Ionomycin；混合液（2）基础培养液+10%胎液+2mmol/L的6-DAMP+5μg/ml的CB；混合液（3）基础培养液+10%胎液。
不同的混合液在胚胎培养的不同阶段使用。
表1：本发明的基础培养液各成分含量
利用本发明方法进行胚胎的体外培养，并比较了该培养液对胚胎的囊胚率及产羔率的影响。实验设置了3个组，分别为：按本发明配制的胚胎培养液（处理1）；按本发明组分配制，但是未添加胎液的胚胎培养液（处理2）；用商品化的M199作为胚胎培养液（处理3）。每个处理重复4次。
1. 不同培养液对胚胎发育的影响，实验如下：
融合后的胚胎培养在混合液（1）的培养液里，培养5分钟。然后洗涤数次，再置于混合液（2）的培养液里培养4小时。然后转移至混合液（3）的微滴液中培养5小时。按上述方法，将混合液（1）、（2）、（3）作对应处理，实验结果用融合率及卵裂率来评定。
2. 采用体内暂培养的方式，比较不同处理方法的培养液对转基因动物出生率的影响
将实验1的重构胚，用1%去琼脂糖包埋二次后，移植至同步发情的寄母羊的经结扎的输卵管中暂培养，5-6天后回收，统计其发育率。将发育至囊胚期的胚胎再移植至同步情期的子宫中待其出生。试验结果用囊胚率、出生率来评定。
3. 采用直接移植的方式，比较不同处理方法的培养液对转基因动物出生率的影响
将实验1的重构胚，直接移植至同步情期的寄母羊的输卵管中待其出生，试验结果用出生率来评定。
同一列上标字母不同的数据之间差异显著（P＜0.05）
从上面的数据可以看出，对应不同阶段的培养液，添加了胎液的培养液（处理1）里，胚胎的融合率高于未添加胎液的培养液（处理2），且差异显著。卵裂率也高于未添加胎液的培养液里胚胎的生长。前两种处理方法配制的培养液里，胚胎的融合率和卵裂率均显著高于M199培养液（处理3）里胚胎的融合率和卵裂率。说明相比于M199培养液，本方法配制的基础培养液更有利于胚胎的培养，而胚胎在本发明的基础培养液中添加了胎液的培养液里发育最好。
体外培养后移植到体内暂培养，回收后，胚胎的囊胚率在添加了胎液的培养液（处理1）里比未添加胎液的培养液（处理2）里高出24%左右，而在M199培养液里，囊胚率极低，说明本发明配制的基础培养液相比于M199培养液更利于胚胎的生长，而添加了胎液的培养液，胚胎的发育更好；说明本发明配制的培养液更有利于胚胎在体内的发育。
另外，将发育至囊胚期的胚胎移植至子宫，待其出生；将融合后培养5小时的胚胎直接移植到输卵管里，待其出生。结果发现，添加了胎液的培养液（处理1）里培养的胚胎，出生率显著高于未添加胎液的培养液（处理2）里培养的胚胎，而在M199培养液（处理3）里，胚胎的出生率均为0。说明按本发明配制的基础培养液更有利于胚胎的生长发育，而在此基础上添加了胎液的培养液更利于胚胎的着床和发育，从而提高了出生率。
Claims (7)
1.一种羊胚胎细胞培养液，其特征在于，所述的培养液的组分如下：二水氯化钙，无水硫酸镁，氯化钾，磷酸二氢钾，碳酸氢钠，氯化钠，牛血清白蛋白，葡萄糖，丙酮酸钠，乳酸钠和酚红钠。
2.如权利要求1所述的培养液，其特征在于，所述的培养液中组分的配比如下：0.25g/L的二水氯化钙，0.16g/L的无水硫酸镁，0.35g/L的氯化钾，0.16g/L的磷酸二氢钾，2.10g/L的碳酸氢钠，5.53g/L的氯化钠，4.00g/L的牛血清白蛋白，1.00g/L的葡萄糖，0.036g/L的丙酮酸钠，2.95g/L的乳酸钠和0.01g/L的酚红钠。
3.如权利要求1所述的培养液，其特征在于，所述的培养液还添加有离子霉素、6-二甲基苯胺嘌呤、细胞松弛素中的任一种或几种。
4.如权利要求3所述的培养液，其特征在于，所述的离子霉素、6-二甲基苯胺嘌呤、细胞松弛素的添加浓度如下：5μmol/L的离子霉素、2mmol/L的6-二甲基苯胺嘌呤、5μg/ml的细胞松弛素。
5.权利要求1或3所述的培养液，还添加有体积比浓度为10%的胎液。
6.如权利要求5所述的培养液，其特征在于所述的胎液为怀孕中期母羊的子宫胎液。
7.权利要求5所述的培养液用于对羊的胚胎或重组胚胎细胞的体外培养。
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