WO2018074938A1 - Procedimiento para generación de gemelos homocigóticos por bipartición embrionaria - Google Patents
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Classifications
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- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
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- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
- C12N15/873—Techniques for producing new embryos, e.g. nuclear transfer, manipulation of totipotent cells or production of chimeric embryos
- C12N15/877—Techniques for producing new mammalian cloned embryos
Definitions
- the present invention relates to a method of generating homozygous twins by embryonic bipartition in mammals, suitable for obtaining twins from embryos, can be applied in the production of animals, especially for the reproduction of cattle.
- reproductive biotechnologies which have received greater attention are superovulation, embryo transfer, cryopreservation of gametes and embryos, in vitro culture of embryos, as well as embryonic micromanipulation (embryonic bipartition) for research purposes, or genetic improvement.
- Bipartition of mammalian embryos and the isolation of blastomeres is a very useful technique to generate twins or multiples.
- Identical twins of several species have been seen throughout history and progress in recent decades to a variety of applications in veterinary and human medicine is very important (illmensee et al., 2005).
- Micromanipulation in mammals for the purpose of producing identical twins is performed in the early stages of the embryo (Navarro, 2003).
- embryonic micromanipulation used in farm and / or laboratory animals, to produce genetically identical twins (Merchant et al., 1997), the most important being, embryonic partitioning by microsurgery and separation and cultivation of blastomeres isolated by enzymatic and mechanical methods (Agca et al., 1988;
- the recipients are visually evaluated and the recipients are selected taking into account conditions such as: optimal sanitary conditions, age, number of births and body condition. Then it is contrasted with ultrasound to rule out pregnancy and abnormalities; at the same time, they are classified according to the crosses.
- the collection of the first artificial insemination was carried out using the technique detailed below. First, the cervix is dilated and then the foley catheter is fixed on the right and posterior horn on the left. Each horn is washed using a collection medium, the evacuated medium goes to a filter where the structures are retained; Once the collection process is finished, the filter is taken to the laboratory where it is deposited in Petri dishes, to subsequently perform the search.
- TCM-Hepes Cell culture medium with hepes
- SFB fetal bovine serum
- BSA bovine serum albumin
- Bipartition was carried out considering the partition into two parts of the morula cell massif and the embryoblast in the case of the blastocyst.
- the halves were transferred to Petri dishes with cellular restoration medium composed of SOF base (synthetic oviduct fluid), supplemented with sodium pyruvate, L-glutamine, essential and non-essential amino acids, EGF (epidermal growth factor), SFB (serum fetal bovine), citric acid, myo-lnositol and Bovine serum albumin (BSA) free of fatty acids.
- SOF base synthetic oviduct fluid
- EGF epidermal growth factor
- SFB serum fetal bovine
- BSA Bovine serum albumin
- the morula halves were transferred to a straw (the same was done with the halves of the blastocyst) with the transfer medium composed of base SOF (synthetic oviduct fluid), supplemented with sodium pyruvate, L-glutamine, amino acids essential and non-essential, EGF (epidermal growth factor), SFB (fetal bovine serum), citric acid, myo-lnositol and bovine serum albumin (BSA) free of fatty acids.
- base SOF synthetic oviduct fluid
- EGF epidermal bovine serum
- SFB fetal bovine serum
- citric acid citric acid
- BSA bovine serum albumin
- the corpus luteum is located by palpation, which indicated being suitable as an embryo recipient. Having the embryos already identified according to registration and quality, the transfers were made using an embryo transfer gun, where the gun is directed to the lateral lipso horn of the functional corpus luteum (CL), so that the embryo is deposited in the cranial third of the horn uterine.
- CL functional corpus luteum
- TCM cell culture medium
- Hepes 4- (2-hydroxyethyl) -1 -piperazine-ethanesulfonic acid.
- BSA bovine serum albumin
- EGF Epidermal or epidermal growth factor
- the recipients were subjected to an estrous synchronization protocol, where progesterone 1.38 gr (CIDR®, Pfizer) plus estradiol benzoate 2 mg (Estovet®, Montana) was applied on day zero.
- day five prostaglandin F2a is applied as a luteolytic 25 mg (Lutalyse®, Pfizer) plus 400 Ul of EcG (Folligon®, Intervet);
- day eight the progesterone is removed, on day nine 1 mg of estradiol benzoate is applied in order to synchronize ovulation, day ten the recipients have estrus, day 17 embryo transfer is performed.
- the collection was made seven days after the first artificial insemination, using the technique detailed below. First the cervix is dilated and then the foley catheter is fixed on the right horn and then on the left, the washing of each horn is performed using commercial collection medium (BioLife TM, Agtech), the evacuated medium goes to the filter (Zone TM Filter, Agtech) where structures are retained; Once the collection process is finished, the filter is taken to the laboratory where it is deposited in 100mm Petri dishes, for later searching.
- Bipartition was performed considering two parts of the morula and embryoblast cell mass in the case of the blastocyst.
- the halves were transferred to 35 mm plates with cellular restoration medium composed of SOF base (synthetic oviduct fluid), supplemented with 0.4 mM sodium pyruvate, 0.2 mM L-glutamine, 1% essential amino acids and non-essential, 10 ng / mL EGF (Epidermal growth factor), 10% SFB (fetal bovine serum), 0.1 mg / mL citric acid, 0.5 mg / mL myo-lnositol and 0.3 % bovine serum albumin (BSA) free of fatty acids.
- SOF base synthetic oviduct fluid
- SFB fetal bovine serum
- the morula halves were transferred to a 0.25 ce straw (the same was done with the halves of the blastocyst) with the transfer medium composed of SOF base (synthetic oviduct fluid), supplemented with 0.4 mM sodium pyruvate, 0.2 mM L-glutamine, 1% essential and non-essential amino acids, 10 ng / mL EGF (Epidermal growth factor), 2% SFB (s (bovine fetal serum), 0.1 mg / mL of citric acid, 0.5 mg / mL of myo-lnositol and 0.3% of bovine serum albumin (BSA) free of fatty acids.
- SOF base synthetic oviduct fluid
- SFB s (bovine fetal serum)
- 0.1 mg / mL of citric acid 0.5 mg / mL of myo-lnositol and 0.3% of bovine serum albumin (BSA) free of fatty acids.
- BSA bovine serum
- the corpus luteum is located by palpation (CL> 16mm), which indicated being suitable as an embryo recipient; Having the embryos already identified according to registration and quality, the transfers were made using an embryo transfer gun (21 ”) with steel tip covers (Agtech, USA) covered with sanitary t-shirt, where the gun is directed to the lateral lipso horn of the corpus luteum (CL) functional, so that the embryo is deposited in the cranial third of the uterine horn.
- an embryo transfer gun 21
- steel tip covers Agtech, USA
- the applicability of the present invention also suggests the possibility of using it as a tool to achieve multiple benefits such as obtaining biological material for sexing and identification of genes of interest or defective, increase in pregnancy percentage, genetic progress, experimental models, among others.
- the artificial production of homozygous twins can be carried out with minimal equipment and the use of these means in the field from embryos in the morula stage and can be applied in genetic improvement centers, universities, institutes, technology and especially in livestock farmers from the country.
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Abstract
La presente invención describe un procedimiento de generación- de gemelos homocigóticos por bipartición embrionaria sin el uso de micromanipuladores. Los embriones utilizados fueron en estado de mórula los cuáles fueron divididos manualmente con microcuchilla en un medio de fijación/manipulación. Luego de la división, los embriones fueron transferidos a un medio de cultivo, para ser luego transferidos a un mamífero receptor. La producción artificial de gemelos homocigóticos puede realizarse aún en condiciones de campo a partir de embriones en estadio de mórula.
Description
PROCEDIMIENTO PARA GENERACIÓN DE GEMELOS HOMOCIGÓTICOS POR
BIPARTICIÓN EMBRIONARIA
CAMPO TÉCNICO
La presente invención se refiere a un procedimiento de generación de gemelos homocigóticos por bipartición embrionaria en mamíferos, adecuado para la obtención de gemelos a partir de embriones, se puede aplicar en la producción de animales, especialmente para la reproducción de ganado bovino.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
La presión económica y de conservación en la producción animal requiere que los avances tecnológicos en embriología sigan haciendo mejoras en la previsibilidad y la eficiencia en la utilización de embriones (Gray et al., 1991 ) .
En la década del 70 se pensaba que los embriones en fases tempranas de la segmentación no sobrevivirían después de una microcirugía (Willadsen y Godke, 1984). Fue en los años ochenta cuando se demostró que las mórulas y blastocistos de los animales domésticos eran capaces de desarrollarse después de una partición y producir nacimientos viables (Rorie et al, 1987) . Actualmente la partición de embriones permite la producción de gemelos idénticos al dividir el embrión original por métodos microquirúrgicos , con ayuda de un micromanipulador.
Entre las biotecnologías reproductivas, que mayor atención han recibido están la superovulación, transferencia embrionaria, criopreservacíón de gametos y embriones, cultivo in vitro de embriones, así como la micromanipulación embrionaria (bipartición embrionaria) con fines investigativos, o de mejora genética. La bipartición de embriones de mamíferos y el aislamiento de blastómeros es una técnica muy útil para generar gemelos o múltiplos. Se han visto gemelos idénticos de varias especies a lo largo de la historia y el avance en las últimas décadas a una variedad de aplicaciones en la medicina veterinaria y humana es muy importante (illmensee et al., 2005) . La micromanipulación en mamíferos con fines de producir gemelos idénticos se realiza en estadios tempranos del embrión (Navarro, 2003). En la actualidad, existe variación en la micromanipulación embrionaria empleada en animales de granja y/o de laboratorio, para producir gemelos genéticamente idénticos (Merchant et al., 1997), siendo la más importante, la partición embrionaria por microcirugía y la separación y cultivo de blastómeros aislados por métodos enzimáticos y mecánicos (Agca et al. , 1988;
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Rexroad y Powell, 1997). Sin embargo, a pesar de que las técnicas vienen desarrollándose desde hace décadas, aún no se cuenta con resultados óptimos, ni con información que pueda ser replicada sin un equipamiento sofisticado. DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
Evaluación y selección de receptoras
Se evalúan visualmente y se seleccionan las receptoras teniendo en cuenta las condiciones tales como: condiciones sanitarias óptimas, la edad, el número de partos y la condición corporal . Luego se contrasta con la ecografía para descartar preñez y anormalidades; al mismo tiempo, se clasifican según los cruces .
Sincronización de celo de receptoras
Las receptoras se someten a un protocolo de sincronización del estro con la finalidad sincronizar la ovulación, para esto se aplica progesterona más benzoato de estradiol; prostaglandina F2a como luteolítico más gonadotropina sérica de yegua preñada, EcG; se retira la progesterona, se aplica benzoato de estradiol, luego cuando las receptoras presentan estro, se realiza la transferencia de embriones.
Colecta de embriones
La colecta de la primera inseminación artificial, se realizó utilizando la técnica que a continuación se detalla. Primero se dilata la cérvix para luego fijar el catéter foley en el cuerno derecho y posterior en el izquierdo. Se realiza el lavado de cada cuerno utilizando un medio de colecta, el medio evacuado va a un filtro donde son retenidas las estructuras; acabado el proceso de colecta el filtro es llevado al laboratorio donde es depositado en placas Petri, para posteriormente realizar la búsqueda.
Búsqueda y clasificación de embriones
Se realizó mediante un estereoscopio, a un aumento de 20X, todas las estructuras halladas son trasladadas a una placa de 35 mm la cual contiene medio de mantenimiento para posteriormente acabada la búsqueda realizar la clasificación según la clasificación de la Asociación I nternacional de Transferencia de Embriones IETS (Tabla 1 ).
Tabla 1. Clasificación de los embriones, según estado de desarrollo y calidad embrionaria (IETS, 2010).
Estado de desarrollo Código
Ovocito no fertilizado- 1
UFO
Mórula compacta 4
Blastocisto temprano 5
Blastocisto 6
Blastocisto expandido 7
Blastocisto eclocionado 8
Calidad embrionaria Código
Excelente 1
Bueno 2
Regular 3
Degenerado 4
Bipartición de los embriones
Del grupo de embriones, se selecciona embriones en estadios de mórula y blastocisto, ambas de condición excelente (la clasificación fue realizada acorde a la clasificación propuesta por la Sociedad Internacional de Transferencia de Embriones). Los embriones fueron trasferidos una placa de 60mm donde contiene gotas de 20 ul con medio de fijación para manipulación embrionaria compuesta por TCM-Hepes (Medio de cultivo celular con hepes) suplementado con piruvato de sodio, L- glutamina, SFB (suero fetal bovino), albúmina sérica bovina (BSA) libre de ácidos grasos, donde ambos fueron bipartidos con ayuda de una cuchillas de seccionamiento ultra agudo (15°), los compuestos son utilizados con la finalidad de dar energía al embrión para soportar la manipulación (piruvato y glutamina) y también de sedimentar al embrión en la placa y dejarla inmóvil para que el corte sea rápido y eficiente (SFB y BSA), además a ello el medio de fijación ésta preparado en una solución de TCM-Hepes (Medio de cultivo celular con hepes) para que pueda ser manipulado en condiciones ambientales porque el Hepes regula el pH (pH7.4) de la solución la cual es muy importante. La bipartición fue realizada considerando la partición en dos partes del macizo celular de la mórula y el embrioblasto para el caso del blastocisto. Las mitades fueron trasferidos a placas Petri con medio de restauración celular compuesto de SOF base (Fluido sintético del oviducto), suplementado con piruvato de sodio, L- glutamina, aminoácidos esenciales y no esenciales, EGF (Factor de crecimiento epidermal), SFB (suero fetal bovino), ácido cítrico, myo-lnositol y
albúmina sérica bovina (BSA) libre de ácidos grasos. Estos compuestos son utilizados para darle energía al embrión después de ser manipulados (Piruvato, glutamina), además a ello los embriones necesitan de nutrientes para continuar con su desarrollo (Aminoácidos esenciales y no esenciales, EGF, ácido cítrico y myo-lnositol) y para evitar que la estructura celular se pierda se disminuye la concentración de suero.
Posteriormente, las mitades de la mórula fueron transferidos a una pajuela (lo mismo fue realizado con las mitades del blastocisto) con el medio de transferencia compuesto de SOF base (Fluido sintético del oviducto), suplementado con piruvato de sodio, L- glutamina, aminoácidos esenciales y no esenciales, EGF (Factor de crecimiento epidermal), SFB (suero fetal bovino) , ácido cítrico, myo-lnositol y albúmina sérica bovina (BSA) libre de ácidos grasos. Esta solución es utilizada para el desarrollo embrionario y su formulación está compuesta por todos los requerimientos nutricionales que el embrión necesita. En este medio los embriones son transferidos a receptoras evaluadas y seleccionadas , previamente sincronizadas. La confirmación de la preñez se realizó a los 35 días con un equipo de ultrasonido.
Transferencia de embriones
Para la transferencia de los embriones se ubica el cuerpo lúteo por palpación, lo que indicaba ser apta como receptora de embrión. Teniendo los embriones ya identificados según registro y calidad se realizó las transferencias utilizado una pistola de transferencia de embriones, donde la pistola es dirigida al cuerno lipso lateral del cuerpo lúteo (CL) funcional, para que el embrión sea depositado en el tercio craneal del cuerno uterino.
Glosario de Términos
TCM: medio de cultivo celular
Hepes: ácido 4-(2-hidroxietil)-1 -piperazina-etano-sulfónico.
SFB: suero fetal bovino
BSA: albúmina sérica bovina
SOF: fluido sintético de oviducto
EGF: Factor de crecimiento epidermal o epidérmico
CL: cuerpo lúteo
MODALIDAD PREFERENTE DE LA INVENCIÓN
Evaluación y selección de receptoras Se evaluó visualmente y con entrevista al ganadero las condiciones sanitarias óptimas, edad (2-10 años), número de partos (0-8 partos) y condición corporal (2.5-4), y luego contrastar con ecografía para descartar preñez y anormalidades; al mismo tiempo, se clasificaron según los cruces. Sincronización de celo de receptoras
Las receptoras fueron sometidas a un protocolo de sincronización del estro, donde el día cero se aplica progesterona 1.38 gr (CIDR®, Pfizer) más benzoato de estradiol 2 mg (Estovet®, Montana); día cinco se aplica prostaglandina F2a como luteolítico 25 mg (Lutalyse®, Pfizer) más 400 Ul de EcG (Folligon®, Intervet); día ocho se retira la progesterona, el día nueve se aplica 1 mg de benzoato de estradiol con la finalidad de sincronizar la ovulación, día diez las receptoras presentan estro, día 17 se realiza la transferencia de embriones.
Colecta de embriones
La colecta se realizó a los siete días de la primera inseminación artificial, utilizando la técnica que a continuación se detalla. Primero se dilata la cérvix para luego fijar el catéter foley en el cuerno derecho y posterior en el izquierdo se realiza el lavado de cada cuerno utilizando medio de colecta comercial (BioLife™, Agtech), el medio evacuado va al filtro (Zona™ Filter, Agtech) donde son retenidas las estructuras; acabado el proceso de colecta el filtro es llevado al laboratorio donde es depositado en placas Petri de 100mm, para posterior realizar la búsqueda.
Búsqueda y clasificación de embriones Se realizó mediante un estereoscopio (Nikon MZ 745 - Alemán), a un aumento de 20X, todas las estructuras halladas son trasladadas a una placa de 35 mm la cual contiene medio de mantenimiento de embriones (SYNGRO®, Bioniche, Canadá) , el cual comprende ácido hialurónico, un polisacárido lineal de ácido D-glucorónico alternativo y N-acetil-D-glucosamina, para posteriormente acabada la búsqueda realizar la clasificación según la Asociación Internacional de Transferencia de Embriones IETS (según laTabla 1 ).
Bipartición de los embriones
Del grupo de embriones, se selecciona embriones en estadios de mórula y blastocisto, ambas de condición excelente (la clasificación fue realizada acorde a la clasificación propuesta por la Sociedad Internacional de Transferencia de Embriones). Los embriones fueron trasferidos una placa de 60mm donde contiene gotas de 20 ul con medio de fijación para manipulación embrionaria compuesta por TCM-Hepes (Medio de cultivo celular con hepes) suplementario con 0,4 mM piruvato de sodio, 0,2 mM de L- glutamina, 30% de SFB (suero fetal bovino), 0,3% de albúmina sérica bovina (BSA) libre de ácidos grasos, donde ambos fueron bipartidos con ayuda de una cuchillas de seccionamiento ultra agudo (BIONICHE, USA), los compuestos son utilizados con la finalidad de dar energía al embrión para soportar la manipulación (piruvato y glutamina) y también de sedimentar al embrión en la placa y dejarla inmóvil para que el corte sea rápido y eficiente (SFB y BSA), además a ello el medio de fijación ésta preparado en una solución de TCM-Hepes para que pueda ser manipulado en condiciones ambientales porque el Hepes regula el pH (pH7.4) de la solución la cual es muy importante. La bipartición fue realizada considerando en dos partes del macizo celular de la mórula y el embrioblasto para el caso del blastocisto. Las mitades fueron trasferidos a placas de 35 mm con medio de restauración celular compuesto de SOF base (Fluido sintético del oviducto), suplementado con 0,4 mM piruvato de sodio, 0,2 mM de L- glutamina, 1 % de aminoácidos esenciales y no esenciales, 10 ng/mL de EGF (Factor de crecimiento epidermal), 10% de SFB (suero fetal bovino), 0,1 mg/mL de ácido cítrico, 0,5 mg/mL de myo-lnositol y 0,3% de albúmina sérica bovina (BSA) libre de ácidos grasos. Estos compuestos son utilizados para darle energía al embrión después de ser manipulados (Piruvato, glutamina), además a ello los embriones necesitan de nutrientes para continuar con su desarrollo (Aminoácidos esenciales y no esenciales, EGF, ácido cítrico y myo-lnositol) y para evitar que la estructura celular se pierda se disminuye la concentración de suero.
Posteriormente, las mitades de la mórula fueron transferidos a una pajuela de 0,25 ce (lo mismo fue realizado con las mitades del blastocisto) con el medio de transferencia compuesto de SOF base (Fluido sintético del oviducto), suplementado con 0,4 mM piruvato de sodio, 0,2 mM de L- glutamina, 1 % de aminoácidos esenciales y no esenciales, 10 ng/mL de EGF (Factor de crecimiento epidermal), 2% de SFB (s(suero fetal bovino), 0,1 mg/mL de ácido cítrico, 0,5 mg/mL de myo-lnositol y 0,3% de albúmina sérica bovina (BSA) libre de ácidos grasos. Esta solución es utilizada para el desarrollo embrionario y su formulación está compuesta por todos los requerimientos nutricionales que el embrión necesita.
En este medio los embriones bipartidos son transferidos a receptoras evaluadas y seleccionadas, previamente sincronizadas. La confirmación de la preñez se realizó a los 35 días con un equipo de ultrasonido (Esaote, Italia). Transferencia de embriones
Para la transferencia de los embriones se ubica cuerpo lúteo por palpación (CL > 16mm), lo que indicaba ser apta como receptora de embrión; Teniendo los embriones ya identificados según registro y calidad se realizó las transferencias utilizado una pistola de transferencia de embriones (21 ") con fundas de punta de acero (Agtech, USA) cubierta con camiseta sanitaria, donde la pistola es dirigida al cuerno lipso lateral del cuerpo lúteo (CL) funcional, para que el embrión sea depositado en el tercio craneal del cuerno uterino.
Debido a que en nuestro invento los embriones fueron bisectados manualmente con el uso de microcuchillas y medio de fijación, restauración y transferencia, los cuales se describieron anteriormente, ello produce el efecto de su aplicabilidad con equipamiento mínimo bajo condiciones de campo, sin el uso de micromanipuladores que necesariamente se debe realizar en un laboratorio, en tanto que el presente procedimiento puede ser aplicado directamente en el campo sin necesidad de condiciones especiales y equipos sofisticados, haciendo que los embriones estén en óptimas condiciones capaz de genera r una preñez.
La aplicabilidad de la presente invención sugiere también la posibilidad de usarla como herramienta para lograr múltiples beneficios tales como la obtención de material biológico para séxado e identificación de genes de interés o defectuosos, incremento del porcentaje de preñez, el progreso genético, modelos experimentales, entre otros. En conclusión, la producción artificial de gemelos homocigóticos puede realizarse con equipamiento mínimo y el uso de éstos medios en campo a partir de embriones en estadio de mórula y poder ser aplicado en centros de mejora genética, universidades, institutos, tecnológicos y sobre todo en ganaderos del país.
Claims
1. Un procedimiento de generación de gemelos homocigóticos por bipartición embrionaria caracterizado porque comprende las siguientes etapas.
a) Colocar al menos un embrión de un mamífero no humano en estadio mórula en un medio de fijación/manipulación que comprende TCM-HEPES (medio de cultivo celular con ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazina-etano-sulfónico) suplementado con 0,4 mM de piruvato de sodio, 0,2 mM de L- glutamina, 30% de SFB (suero fetal bovino) y 0,3% de albúmina sérica bovina (BSA) libre de ácidos grasos;
b) Realizar la bipartición del embrión del paso a) con una microcuchilla teniendo en cuenta la separación en dos partes el macizo celular de la mórula;
c) Transferir las mitades del embrión obtenido en el paso b) a un medio de restauración celular que comprende SOF base (Fluido sintético del oviducto), suplementado con 0,4 mM de piruvato de sodio, 0,2 mM de L- glutamina, 1 % de aminoácidos esenciales y no esenciales, 10 ng/mL de EGF(Factor de crecimiento epidermal), 10% de SFB (suero fetal bovino), 0,1 mg/mL de ácido cítrico, 0,5 mg/mL de myo-lnositol y 0,3% de albúmina sérica bovina (BSA) libre de ácidos grasos; y d) Colocar las mitades de la mórula obtenido en el paso c) a un medio de transferencia que comprende SOF base (Fluido sintético del oviducto), suplementado con 0,4 mM piruvato de sodio, 0,2 mM de L- glutamina, 1 % de aminoácidos esenciales y no esenciales, 10 ng/mL de EGF (Factor de crecimiento epidermal), 2% de SFB (suero fetal bovino), 0, 1 mg/mL de ácido cítrico, 0,5 mg/mL de myo-lnositol y 0,3% de albúmina sérica bovina (BSA) libre de ácidos grasos con la finalidad de seguir el desarrollo embrionario; y
e) Realizar la transferencia de embriones obtenidas en el paso d) a la porción tercio craneal del cuerno uterino lipso lateral del cuerpo lúteo funcional del mamífero y controlar la preñez.
2. Un procedimiento de generación de gemelos homocigóticos por bipartición embrionaria según la reivindicación 1 caracterizado porque la microcuchilla es una cuchilla de seccionamiento de 15°.
3. Un procedimiento de generación de gemelos homocigóticos por bipartición embrionaria según la reivindicación 1 caracterizado porque la transferencia de embrión se realiza con una pistola de transferencia de embriones de 53 cm (21 pulgadas) con fundas de punta de acero.
4. Un procedimiento de generación de gemelos homocigóticos por bipartición embrionaria según la reivindicación 1 caracterizado porque el mamífero es un ganado bovino.
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Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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Patent Citations (1)
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|---|---|---|---|---|
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Non-Patent Citations (8)
| Title |
|---|
| BREDBACKA, P. ET AL.: "Factors affecting cell viability during bisection of bovine embryos", THERIOGENOLOGY, vol. 44, no. 2, 1995, pages 159 - 66, XP055477245 * |
| CORTEZ, J. ET AL.: "Generation de gemelos homocigoticos por biparticion embrionaria en bovinos de came", SPERMOVA. AGOSTO DE 2015, vol. 5, no. 1, pages 159 - 162, XP055477224 * |
| GRAY, K. R. ET AL.: "The commercial application of embryo splitting in beef cattle", THERIOGENOLOGY, vol. 35, no. 1, 1991, pages 37 - 44, XP055477248 * |
| ILLMENSEE, K ET AL.: "Embryo splitting", EMBRYO SPLITTING. MIDDLE EAST FERTILITY SOCIETY JOURNAL, vol. 15, no. 2, 2010, pages 57 - 63, XP027246292 * |
| TAGAWA, M. ET AL.: "Production of monozygotic twin calves using the blastomere separation technique and Well of the Well culture system", THERIOGENOLOGY, vol. 69, no. 5, 2008, pages 574 - 82, XP022507211 * |
| TANG, H. H. ET AL.: "Embryo splitting can increase the quantity but not the quality of blastocysts", TAIWAN J OBSTET GYNECOL., vol. 51, no. 2, 2012, pages 236 - 9, XP028426532 * |
| TOMINAGA, K. ET AL.: "Influence of ''Solcoseryl'' during culture on the sex-dependent repair of bovine demi-embryos", MOL REPROD DEV., vol. 43, no. 3, 1996, pages 331 - 5, XP008093107 * |
| VELASQUEZ, A. E. ET AL.: "Splitting of IVP bovine blastocyst affects morphology and gene expression of resulting demi-embryos during in vitro culture and in vivo elongation", ZYGOTE, vol. 24, no. 1, 2016, pages 18 - 30, XP055477234 * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN109042515A (zh) * | 2018-08-16 | 2018-12-21 | 阜阳师范学院 | 提高山羊体内早期胚胎附植数量和窝产仔数的方法 |
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