CN117187168A - 一种高安全性的牛卵母细胞体外成熟培养液及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种高安全性的牛卵母细胞体外成熟培养液及其制备方法和应用。本发明还提供包括牛卵母细胞体外成熟培养液的体外胚胎生产试剂组合。本发明中的体外胚胎生产试剂用牛血清蛋白替代血清，解决了在胚胎生产过程中使用的制剂不安全、为母体生产带来难产风险的问题；同时解决了经过体外成熟的卵母细胞获得的胚胎冷冻效能低、冷冻再解冻后胚胎存活率低、孵化率低的缺陷。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，尤其涉及一组用于提高胚胎生产安全试剂，特别涉及一种高安全性的牛卵母细胞体外成熟培养液。
背景技术
本部分的陈述仅仅是提供了与本发明相关的背景技术信息，不必然构成在先技术。
目前，在世界范围内，牛体外胚已经成为牛胚胎的主要来源。胚胎移植技术相比于目前牧场广泛使用的人工授精技术，能充分发挥公母牛双方的优良遗传和繁殖潜力，使后代由含有50％的优良遗传基因，升级为含有100％的优良遗传基因。因此，牛胚胎移植技术是快速改良品种、提升养殖竞争力的重要手段，能极大地提高育种效率、促进育种进程。
胚胎生产成为制约牛生产繁殖的制约因素。胚胎生产过程中涉及到卵母细胞体外成熟、体外受精、胚胎培养、胚胎冷冻及移植等多个环节。各个环节中需要的试剂中均含有血清。
血清是动物细胞培养过程中常用的一种试剂。血清作为一种天然培养基，富含蛋白质、多肽、生长因子、氨基酸、脂肪、碳水化合物、多胺、尿素、激素和维生素等细胞生长所必需的营养成分，在胚胎发育过程中具有极为重要的功能，能提高胚胎发育率。但是，血清价格较高，成本较高，且各批次之间差异较大；血清成分复杂，除含有能促进胚胎发育的物质外，还含有细胞生长抑制因子和毒性因子，存在潜在毒性；血清的使用有引入血源性病原生物污染的可能。
体外胚胎移植技术，胚胎质量至关重要，同时受体牛的生产安全也需要持续关注。申请人发现，体外受精的胚胎，经过培养、冷冻后，胚胎生产效率不高，且时常出现受体牛难产的现象。
发明内容
为克服上述现有技术的不足，本发明提供了一种高安全性的牛卵母细胞体外成熟培养液及其制备方法和应用。本发明主要解决在胚胎生产过程中使用的制剂不安全、为母体生产带来极大风险的问题；同时解决经过体外成熟的卵母细胞获得的胚胎冷冻效能低的缺陷。
为实现上述目的，本发明的一个或多个实施例提供了如下技术方案：
本发明的第一方面，提供一种高安全性牛卵母细胞体外成熟培养液，其包括0-0.05IU/mL促卵泡素、0-0.05IU/mL促黄体素、1-3μg/mL雌激素、0.05-0.2g/L牛血清白蛋白；所述促卵泡素、促黄体素的最低浓度均不为0。
在具体的实施方式中，还包括TCM199培养液。
在具体的实施方式中，促卵泡素为0.01IU/mL、促黄体素为.01IU/mL、雌激素为1μg/mL、牛血清白蛋白为0.1g/L。
本发明的第二方面，提供第一方面所述的体外成熟培养液的应用；
具体的，1)在促进卵母细胞体外成熟或抑制卵母细胞减数分裂中的应用；
2)用于制备促进卵母细胞体外成熟或抑制卵母细胞减数分裂药物中的应用；
3)在提升卵母细胞、胚胎冷冻能力的应用或在制备提升卵母细胞、胚胎冷冻能力的药物中的应用；
4)在提高受体牛生产安全性的应用。
本发明的第三方面，提供一种促进卵母细胞体外成熟的培养方法，采集活体动物的卵母细胞或者收集屠宰后动物的卵母细胞，置于第一方面所述的体外成熟培养液中进行成熟培养。
在具体的实施方式中，所述卵母细胞为含有三层以上颗粒细胞、胞质均匀的卵母细胞。
本发明的第四方面，提供一组高安全性牛体外胚胎生产试剂，所述生产试剂包括第一方面所述的卵母细胞体外成熟培养液。
在具体的实施方式中，所述生产试剂各培养液中均不含有血清。
在具体的实施方式中，所述生产试剂还包括卵子及胚胎洗涤液、精子处理液、受精液、胚胎培养液、胚胎程序化冷冻液、胚胎保存液、胚胎玻璃化冷冻液、胚胎玻璃化解冻液。
在具体的实施方式中，所述卵子及胚胎洗涤液包括TCM199培养液和牛血清白蛋白；所述牛血清白蛋白的终浓度为0.1g/L；
所述受精液包括100-120mM氯化钠、3-5mM氯化钾、2-3mM二水氯化钙、0.5-1.5mM一水磷酸二氢钠、0.2-1mM六水氯化镁、30-45mM碳酸氢钠、1-2mM丙酮酸钠、5-15μg/mL肝素钠、2-5mg/mL牛血清白蛋白；
所述胚胎程序化冷冻液包括5-10g/L氯化钠、0.1-0.4g/L氯化钾、0.05-0.2g/L氯化镁、3-4g/L磷酸氢二钠、0.1-0.4g/L磷酸二氢钾、0.5-2g/L葡萄糖、0.001-0.1g/L丙酮酸钠、0.05-0.2g/L氯化钙、2-6g/L牛血清白蛋白、0.05-0.2M蔗糖、1-3M乙二醇；
所述胚胎玻璃化冷冻液包括TCM199培养液、0.05-0.2g/L牛血清白蛋白、体积百分比20％的二甲基亚砜、0.2-1M蔗糖；
所述胚胎玻璃化解冻液包括TCM199培养液、0.05-0.2g/L牛血清白蛋白、0.2-1M蔗糖。
以上一个或多个技术方案存在以下有益效果：
本发明首次发现牛血清白蛋白代替牛血清制备牛体外胚胎生产试剂，不仅能够发挥原有血清具有的促进细胞生长的功能，还能避免引入过敏原及污染源，提高了牛体外胚胎生产的安全性，同时能够避免由于使用血清导致的胚胎培养过程中表观遗传学改变引起的大胎综合症，降低了胎儿初生重，从而降低了受体牛难产概率，降低了生产成本。
同时经过本发明所提供的的牛卵母细胞体外成熟培养液培养的卵母细胞，具有更强的抗冷冻能力，解冻后胚胎的存活力更高，冷冻解冻后胚胎的移植受胎率更高。
本发明附加方面的优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
下面结合具体的实施例，对本发明做进一步的详细说明，应该指出，所述具体实施例是对本发明的解释而不是限定。
说明：本发明所用试剂纯度均为细胞培养级别以上，例如Sigma-aldrich公司的产品。
TCM199购自Gibco，货号：12340030；牛血清白蛋白购自Sigma货号：A6003。
实施例一
本实施例公开了牛体外胚胎生产试剂的配制。
(1)卵子及胚胎洗涤液:以市售商业化TCM199为基础液，添加0.1g/L牛血清白蛋白。
(2)卵母细胞体外成熟培养液:以市售商业化TCM199为基础液，包含0.01IU/mL促卵泡素、0.01IU/mL促黄体素、1μg/mL雌激素、0.1g/L牛血清白蛋白。
(3)精子处理液:包含112mM氯化钠、4.02mM氯化钾、2.25mM二水氯化钙、0.83mM一水磷酸二氢钠、0.52mM六水氯化镁、37mM碳酸氢钠、1.25mM丙酮酸钠、10μg/mL肝素钠、10mM咖啡因、4mg/mL牛血清白蛋白的水溶液。
(4)受精液:包含112mM氯化钠、4.02mM氯化钾、2.25mM二水氯化钙、0.83mM一水磷酸二氢钠、0.52mM六水氯化镁、37mM碳酸氢钠、1.25mM丙酮酸钠、10μg/mL肝素钠、4mg/mL牛血清白蛋白的水溶液。
(5)胚胎培养液:包含109.5mM氯化钠、3.1mM氯化钾、26.2mM碳酸氢钠、0.8mM六水氯化镁、1.19mM磷酸二氢钾、0.4mM丙酮酸钠、1.5mM葡萄糖、5mM半乳糖酸钙、6mg/mL牛血清白蛋白、20μL/mL必需氨基酸、10μL/mL非必需氨基酸、0.15mg/mL谷氨酰胺的水溶液。
(6)胚胎程序化冷冻液:包含8g/L氯化钠、0.2g/L氯化钾、0.1g/L氯化镁、2.9g/L磷酸氢二钠、0.2g/L磷酸二氢钾、1g/L葡萄糖、0.036g/L丙酮酸钠、0.1g/L氯化钙、4g/L牛血清白蛋白、0.1M蔗糖、1.5M乙二醇的水溶液。
(7)胚胎保存液:包含8g/L氯化钠、0.2g/L氯化钾、0.1g/L氯化镁、2.9g/L磷酸氢二钠、0.2g/L磷酸二氢钾、1g/L葡萄糖、0.036g/L丙酮酸钠、0.1g/L氯化钙、4g/L牛血清白蛋白的水溶液。
(8)胚胎玻璃化冷冻平衡液：以市售商业化TCM199为基础液，添加0.2g/L牛血清白蛋白、体积百分比10％的二甲基亚砜、0.2M蔗糖。
(9)胚胎玻璃化冷冻液：以市售商业化TCM199为基础液，添加0.1g/L牛血清白蛋白、体积百分比20％的二甲基亚砜、0.5M蔗糖。
(10)胚胎玻璃化解冻液：以市售商业化TCM199为基础液，添加0.1g/L牛血清白蛋白、0.5M蔗糖。
实施例二
本实施例公开牛体外胚胎生产方法。
1、卵母细胞获得
活体采卵：
仪器准备：准备活体采卵仪、负压泵以及金属浴，连接采卵针、采卵管与负压泵。
供体牛准备：利用保定架对供体牛进行保定，清除直肠内的粪便，并检查供体牛卵巢上卵泡及黄体状态。确认牛只可用于采卵后，用盐酸利多卡因于尾椎处对其进行硬膜外腔麻醉。
活体采卵：利用活体采卵仪、负压泵，采用B超引导法从母牛卵巢上回收卵母细胞，回收采卵液。
2、卵母细胞的体外成熟
将卵母细胞用卵子及胚胎洗涤液洗涤后，从中选择其中含有三层以上颗粒细胞、胞质均匀的卵母细胞置于实施例一中的卵母细胞体外成熟培养液中进行成熟培养。培养环境为38.5度、5-7％二氧化碳的饱和湿度环境，培养时间为20-24小时。
3、体外受精
①成熟后卵母细胞从卵母细胞体外成熟培养液转移到受精液中。②将精子处理液加入解冻后的精液中，每支精液加入3ml精子处理液，400g离心5分钟，离心后去上清。③调节精子密度，取适量处理后的精液加入到受精液中的卵母细胞里，使最终精子密度为1-5×106个/ml。④精子与卵母细胞在38.5度、5-7％二氧化碳的饱和湿度环境中培养16-20小时。
4、体外胚胎培养
用内径为130-160μm的巴斯德吸管将受精结束后受精卵外层的颗粒细胞脱除干净，用卵子及胚胎洗涤液洗干净后，放入胚胎培养液中进行培养。培养环境为38.5度、5-7％二氧化碳、5-7％的氮气、饱和湿度。
统计培养过程的胚胎发育情况，具体结果见表1。
5、胚胎冷冻及移植
(1)程序化冷冻、解冻
冷冻：做200微升冷冻平衡液滴；将胚胎放入平衡液滴表面，待胚胎沉入液滴底部，将胚胎移入冷冻液表面；按照冷冻液、气泡、冷冻液、气泡、含有胚胎的冷冻液、气泡、冷冻液、气泡、冷冻液的顺序进行五步法装管；用麦管塞封口后，装入程序控温仪中，启动冷冻程序；冷冻程序完成后，将麦管投入液氮。
解冻：将细管从液氮中取出，空气中暴露10秒，投入30度的温水中，停留30秒即可。
(2)玻璃化冷冻、解冻
冷冻：做200微升冷冻平衡液滴及冷冻液滴；胚胎在冷冻平衡液滴中静置5分钟；胚胎移入冷冻液滴中，静置45秒；在10秒内将胚胎从冷冻液滴中取出，装载到胚胎冷冻载体上，投入液氮。
解冻：将胚胎冷冻载体从液氮中取出，快速没入胚胎解冻液中，并晃动冷冻载体；胚胎从冷冻载体上脱落后，继续在解冻液中停留5分钟；将培养从解冻液中取出，移入胚胎保存液。
(3)胚胎移植
鲜胚移植：培养至第6-8天的囊胚、扩张囊胚按照胚胎保存液、气泡、胚胎保存液、气泡、含有胚胎的胚胎保存液、气泡、胚胎保存液、气泡、胚胎保存液的顺序进行五段式装管，用麦管塞封口后，移植到发情第7天的受体牛体内。胚胎移植后第30天，使用B超对受体牛进行妊娠检查，统计移植受胎率。具体结果见表2。
程序化冷冻胚胎移植：胚胎解冻后在10分钟内移植到发情第7天的受体牛体内。胚胎移植后第30天，使用B超对受体牛进行妊娠检查，统计移植受胎率。具体结果见表3。
玻璃化冷冻胚胎移植：胚胎解冻后用胚胎保存液洗涤3遍，之后进行五段式装管，麦管用麦管塞封口后，移植到发情第7天的受体牛体内。胚胎移植后第30天，使用B超对受体牛进行妊娠检查，统计移植受胎率。具体结果见表4。
(4)胚胎耐冻性检测
程序化冷冻：将培养获得的胚胎经过程序化冷冻、解冻，解冻后胚胎从细管中取出，用100微升卵子及胚胎洗涤液洗涤3遍后，放入胚胎培养液中进行培养。培养环境为38.5度、5-7％二氧化碳、5-7％的氮气、饱和湿度。统计解冻后胚胎24小时存活情况及解冻后48小时孵化情况，具体结果见表5。
玻璃化冷冻：将培养获得的胚胎经过玻璃化冷冻、解冻，解冻后胚胎用100微升卵子及胚胎洗涤液洗涤3遍后，放入胚胎培养液中进行培养。培养环境为38.5度、5-7％二氧化碳、5-7％的氮气、饱和湿度。统计解冻后胚胎24小时存活情况及解冻后48小时孵化情况，具体结果见表6。
实施例三
1、牛体外胚胎生产试剂的配制参照实施例一。
2、卵母细胞的取得：所用卵母细胞来源于屠宰场卵巢，非活体采卵获得。具体方法为：将从屠宰场获得的牛卵巢用0.9％生理盐水冲洗干净后，用30-35度的运输温度运到实验室，从采集第一个卵巢到卵巢运到实验室的时间不超过6小时。卵巢运到实验室后先用30-35度的0.9％生理盐水进行冲洗。冲洗干净后，用带12号针头的无菌注射器抽取卵巢上的卵泡。
3、卵母细胞的体外成熟、体外受精、胚胎体外胚胎、胚胎冷冻及移植同实施例二。
对比例一
与实施例二的区别在于，所用体外胚胎生产试剂中牛血清白蛋白用10％牛血清替代。
对比例二
与实施例三的区别在于，所用体外胚胎生产试剂中的牛血清白蛋白用10％牛血清替代。
表1
表2
表3
表4
表5
注：不同字母上标表示差异显著(P<0.05)表6
注：不同字母上标表示差异显著(P<0.05)
由表中数据可以看出，本发明所提供的卵母细胞体外成熟培养液及其组成的体外胚胎生产试剂组合，在不使用血清的基础上，可以保持与常规体外胚胎生产试剂相近的囊胚率、移植受胎率；同时因为不使用血清，降低了致敏性、提高了安全性，犊牛出生重明显降低，平均出生重降低4-6kg(10-15％)，能大大降低受体牛的难产概率；另外，使用不含有血清的卵母细胞体外成熟培养液培养出胚胎耐冻性提高，经过冷冻解冻后胚胎存活率及孵化率有明显升高，尤其孵化率有显著性提高。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种高安全性牛卵母细胞体外成熟培养液，其特征在于，其包括0-0.05IU/mL促卵泡素、0-0.05IU/mL促黄体素、1-3μg/mL雌激素、0.05-0.2g/L牛血清白蛋白；所述促卵泡素、促黄体素的最低浓度均不为0。
2.如权利要求1所述的牛卵母细胞体外成熟培养液，其特征在于，还包括TCM199培养液。
3.如权利要求2所述的牛卵母细胞体外成熟培养液，其特征在于，促卵泡素为0.01IU/mL、促黄体素为.01IU/mL、雌激素为1μg/mL、牛血清白蛋白为0.1g/L。
4.权利要求1-3任一项所述的体外成熟培养液的应用；
具体的，1)在促进卵母细胞体外成熟或抑制卵母细胞减数分裂中的应用；
2)用于制备促进卵母细胞体外成熟或抑制卵母细胞减数分裂药物中的应用；
3)在提升卵母细胞、胚胎冷冻能力的应用或在制备提升卵母细胞、胚胎冷冻能力的药物中的应用；
4)在提高供体牛及受体牛安全性的应用。
5.一种促进卵母细胞体外成熟的培养方法，其特征在于，采集活体动物的卵母细胞或者收集屠宰后动物的卵母细胞，置于权利要求1-3任一项所述的体外成熟培养液中进行成熟培养。
6.如权利要求5所述的培养方法，其特征在于，所述卵母细胞为含有三层以上颗粒细胞、胞质均匀的卵母细胞。
7.一组高安全性牛体外胚胎生产试剂，其特征在于，所述生产试剂包括权利要去1所述的卵母细胞体外成熟培养液。
8.如权利要求7所述的牛体外胚胎生产试剂，其特征在于，所述生产试剂各培养液中均不含有血清。
9.如权利要求7所述的牛体外胚胎生产试剂，其特征在于，所述生产试剂还包括卵子及胚胎洗涤液、精子处理液、受精液、胚胎培养液、胚胎程序化冷冻液、胚胎保存液、胚胎玻璃化冷冻液、胚胎玻璃化解冻液。
10.如权利要求9所述的牛体外胚胎生产试剂，其特征在于，所述卵子及胚胎洗涤液包括TCM199培养液和牛血清白蛋白；所述牛血清白蛋白的终浓度为0.1g/L；
所述受精液包括100-120mM氯化钠、3-5mM氯化钾、2-3mM二水氯化钙、0.5-1.5mM一水磷酸二氢钠、0.2-1mM六水氯化镁、30-45mM碳酸氢钠、1-2mM丙酮酸钠、5-15μg/mL肝素钠、2-5mg/mL牛血清白蛋白；
所述胚胎程序化冷冻液包括5-10g/L氯化钠、0.1-0.4g/L氯化钾、0.05-0.2g/L氯化镁、3-4g/L磷酸氢二钠、0.1-0.4g/L磷酸二氢钾、0.5-2g/L葡萄糖、0.001-0.1g/L丙酮酸钠、0.05-0.2g/L氯化钙、2-6g/L牛血清白蛋白、0.05-0.2M蔗糖、1-3M乙二醇；
所述胚胎玻璃化冷冻液包括TCM199培养液、0.05-0.2g/L牛血清白蛋白、体积百分比20％的二甲基亚砜、0.2-1M蔗糖；
所述胚胎玻璃化解冻液包括TCM199培养液、0.05-0.2g/L牛血清白蛋白、0.2-1M蔗糖。
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