CN105602895A - 一种乳牙牙髓间充质干细胞的制备方法 - Google Patents

一种乳牙牙髓间充质干细胞的制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种乳牙牙髓间充质干细胞的制备方法，采用牙髓组织块切碎后直接用间充质干细胞无血清培养基培养的方法，简单、快捷、经济，能够更好地保持细胞活力，减少污染的机会，且培养过程中几乎不引入杂质，对细胞的机械损伤和化学损伤少；本发明采用的均是无血清培养体系，获得的间充质干细胞可以直接用于临床或科研使用；获得的干细胞生物活性高及干性强，阳性指标表达率达98％以上，阴性指标表达率低于2％。

Description

一种乳牙牙髓间充质干细胞的制备方法
技术领域
本发明涉及干细胞的制备方法，具体为一种乳牙牙髓间充质干细胞的制备方法。
背景技术
干细胞是一类具有自我复制能力的细胞，在一定条件下可以分化为多种功能细胞。根据干细胞所处的发育阶段可以分为胚胎干细胞和成体干细胞；胚胎干细胞具有发育的全能性，能分化成成体动物的所有组织和器官，包括生殖细胞；成体干细胞是指存在于一种已经分化组织中的未分化细胞，这种细胞能够自我更新并且能够特化形成组成该类型组织的细胞。间充质干细胞是一种具有自我复制能力和多向分化潜能的成体干细胞，它们可以不断地自我更新，并在特定条件下转变成为一种或多种构成人体组织或器官的细胞。干细胞是机体的起源细胞，是形成人体各种组织器官的始祖细胞，能分化成多种间充质系列细胞，如成骨、成软骨和成脂肪细胞等。间充质干细胞存在于多种组织中，如骨髓、脐带血、脐带组织、胎盘组织等。但是骨髓来源的间充质干细胞存在着细胞采集困难、对人体伤害大、有年龄限制等问题。脐血、脐带、胎盘组织中分离出的间充质干细胞，不仅保持了间充质干细胞的生物学特性，而且具有更强的增殖、分化能力，采集时对身体无伤害，但是其组织材料的收集只能一次完成，局限于生产时的一瞬间，错过时机将无法挽回。
2000年Gronthos首先提出牙髓干细胞(dentalpulpstemcells，DPSCs)的概念，把一群从牙腔内提取出来，在体外具有克隆形成能力及高增殖率的一群干细胞命名为DPSCs。2003年，Miura从脱落乳牙的冠和根的牙髓中分离出具有多分化能力的干细胞，将其命名为乳牙牙髓间充质干细胞(stemcellsfromhumanexfoliateddeciduousteeth，SHED)。SHED体外培养时具有很高的增殖能力和克隆形成能力，并可以分化成包括神经细胞、脂肪细胞和成牙本质细胞在内的各种细胞，把体外培养的细胞移植回小鼠体内后可形成骨和牙本质。乳牙牙髓来源的间充质干细胞具有间充质干细胞的生物学特性，因其来自乳牙采集方便，有20次采集机会且无痛无创。SHED在胚胎发育方面与颌骨部组织具有相同的来源，应用SHED来修复颌面部股损失也更为合适，SHED在取材过程中没有痛苦，更为人们接受，并且脐带血库的成功建立为我们提供了一个很好地榜样或许我们可以同样建立SHEDE库以备不时之需(在日本，香港，新加坡等国家和地区已有乳牙牙髓干细胞库的成立)。
现有技术中乳牙牙髓间充质干细胞的制备方法一般采用酶消化法，步骤繁琐，而且培养体系成分不确定，给后序使用带来干扰。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服现有的乳牙牙髓间充质干细胞采用酶消化法所带来的步骤繁琐，培养体系成分不确定，给后序使用带来干扰的缺陷，提供另一种乳牙牙髓间充质干细胞的制备方法。
为了解决上述技术问题，本发明提供了如下的技术方案：
一种乳牙牙髓间充质干细胞的制备方法，包括以下几个步骤：
一、乳牙牙髓间充质干细胞的分离及扩增培养
(1)将在医院检验合格且进行过初步清洗消毒的自然脱落或是人工拔除的乳牙转运至实验室；优选的，乳牙转运至实验室时，保持乳牙在2～8℃的温度下转运，且转运时间不超过48～96h，最好控制在48～72h，更优选的为48h；
(2)在超净工作台中，对乳牙进行二次清洗消毒灭菌，用液压钳压碎乳牙，取出牙髓组织，将牙髓组织切碎后用间充质干细胞无血清培养基培养，获得牙髓组织混合液；优选的，所述间充质干细胞无血清培养基为FasGrow培养基，每500mL的无血清培养基中添加有25mL的添加因子，间充质干细胞无血清培养基的主要成分是转铁蛋白、重组人血小板源生长因子、重组人表皮生长因子；
(3)将获得的牙髓组织混合液在温度为37℃，CO2体积分数为5％的培养箱中培养；
(4)在培养的第7～10天，更换培养基，以后每2～3天对培养基进行三分之一换液，培养至12～17天时，细胞汇合率达到70～80％时，进行传代培养。
优选的，传代培养时，先以质量分数为0.05％的胰蛋白酶消化1～3min,离心收集细胞，然后用间充质干细胞无血清培养基在温度为37℃、CO2体积分数为5％的培养箱中培养获得扩增后的乳牙牙髓间充质干细胞。进一步的，传代乳牙牙髓间充质干细胞的接种密度为3～6×103/cm2；优选的，质量分数为0.05％的胰蛋白酶是由DPBS将浓度质量分数为0.25％的胰蛋白酶成品稀释五倍得到。
二、乳牙牙髓间充质干细胞的冷冻保存
(5)当传代细胞的汇合率达到70％～80％时，将传代细胞吸出培养基，加入质量分数为0.05％的胰蛋白酶消化1～3min，离心收集细胞，用间充质干细胞无血清培养基重悬细胞沉淀得到细胞悬液；
(6)将细胞悬液与DMSO冻存液按体积比为4:1混合，得到冻存细胞液，调整冻存细胞的浓度为2～5×106/ml；优选的，冻存液是Cryo-DEX40,主要成分为二甲基亚砜和右旋糖酐40；
(7)将冻存细胞液放入程序性降温盒中在-80℃冰箱降温，隔夜后转入液氮罐中长期储存。
进一步的，乳牙为6～12岁体检合格儿童的乳牙，采集的乳牙完整带牙根，健康无龋齿、无牙髓炎症、无牙髓坏死。
本发明的乳牙牙髓间充质干细胞的制备方法具有以下的优点：
一、本发明采用的牙髓组织块切碎后直接在间充质干细胞无血清培养基培养，与酶消化法相比，简单、快捷、经济，能够更好地保持细胞活力，减少污染的机会，且培养过程中几乎不引入杂质；而酶消化法技术要求高、操作复杂、耗时又长、价格昂贵，同时还存在对细胞的机械损伤和化学损伤；
二、本发明的乳牙牙髓间充质干细胞的培养过程采用的均是无血清培养体系，获得的间充质干细胞可以直接用于临床或科研使用；
三、本发明的乳牙牙髓间充质干细胞获得的细胞生物活性高及干性强，阳性指标表达率达98％以上，阴性指标表达率低于2％。
附图说明
附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：
图1为本发明的乳牙牙髓间充质干细胞的原代培养图，既乳牙牙髓组织块培养图；
图2为本发明的P1代乳牙牙髓间充质干细胞的第一天培养图；
图3为本发明的P1代乳牙牙髓间充质干细胞的第三天培养图；
图4为本发明的P1代乳牙牙髓间充质干细胞的第四天培养图；
图5为乳牙牙髓间充质干细胞成骨分化茜素红染色结果图；
图6为乳牙牙髓间充质干细胞成脂分化油红O染色结果图。
具体实施方式
以下结合附图对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例
如图1所示，
一、乳牙牙髓间充质干细胞的分离及扩增培养
(1)通过自然脱落或手术拔除的方式，采集无锡儿童医院某6岁儿童的左上中切牙；所采集的乳牙需是完整带牙根，健康无龋齿、无牙髓炎症、无牙髓坏死等症状；
(2)将采集的乳牙在清洗液中清洗5～10min，清洗液由注射用青霉素钠(80万单位/瓶)、硫酸阿卡米星注射液(20万单位/瓶)、甲硝唑氯化钠注射液(250ml，甲硝唑0.5g)配制而成，清洗后转移至乳牙保存液(DMEM/F12)中在2～8℃条件下运输至实验室，且从收集乳牙到处理牙髓的时间不应超过48～96h；
(3)在超净工作台中，进行二次清洗消毒灭菌，用液压钳压碎乳牙，取出牙髓组织切碎，切碎后的牙髓组织的大小为1～2mm2，用间充质干细胞无血清培养基培养即可获得牙髓组织混合液；
(4)获得的牙髓组织混合液在温度为37℃，CO2体积分数为5％的培养箱中培养；
(5)培养7～10天左右会看到乳牙牙髓间充质干细胞的萌发，更换培养基，以后每2～3天三分之一换液，继续培养5～7天至细胞汇合率达到70～80％即可进行传代操作进行传代培养；
(6)传代操作以浓度质量分数为0.05％的胰蛋白酶消化1～3min,离心收集细胞，继续用间充质干细胞无血清培养基在温度为37℃，CO2体积分数为5％的培养箱中培养获得扩增后的乳牙牙髓间充质干细胞。
二、乳牙牙髓间充质干细胞的冷冻保存
(5)当传代细胞的汇合率达到70％～80％时，将传代细胞吸出培养基，加入质量分数为0.05％的胰蛋白酶消化1～3min，离心收集细胞，用间充质干细胞无血清培养基重悬细胞沉淀得到细胞悬液；
(6)将细胞悬液与DMSO冻存液按体积比为4:1混合，得到冻存细胞液，调整冻存细胞的浓度为2～5×106/ml；优选的，冻存液是Cryo-DEX40,主要成分为二甲基亚砜和右旋糖酐40；
(7)将冻存细胞液放入程序性降温盒中在-80℃冰箱降温，隔夜后转入液氮罐中长期储存。
乳牙牙髓间充质干细胞的检验
将本实施例获得的乳牙牙髓间充质干细胞进行细胞活性检测、无菌性检测、细胞表面标记分子检测及分化潜能的检测；
(1)细胞活性的检测包括在显微镜下观察细胞的生长状况，在乳牙牙髓间充质干冻存前及复苏后均用台盼蓝计数计算细胞活性；
(2)细胞无菌性检测是收集乳牙牙髓间充质干细胞培养过的培养基，在37℃生化培养箱中培养24～48h后在显微镜下观察有无细菌、真菌的污染；
(3)细胞表面标记分子的检测主要包括用流式法测间充质干细胞特异性表面标记分子如CD73、CD90、CD105、CD29等，以及一些其他特异性表面标记分子如CD34、CD45、HLA-DR等；
(4)细胞分化潜能的检测包括将乳牙牙髓间充质干细胞接种在24孔板中，用间充质干细胞无血清培养基培养，当细胞汇合率达到70～80％以后更换为成骨分化培养基继续培养，连续培养28天后用茜素红染色，观察染色结果，判断乳牙牙髓间充质干细胞的成骨分化潜能；
(5)细胞分化潜能的检测包括将乳牙牙髓间充质干细胞接种在24孔板中，用间充质干细胞无血清培养基培养，当细胞汇合率达到70～80％以后更换为成脂分化培养基继续培养，连续培养22天后用油红O染色，观察染色结果，判断乳牙牙髓间充质干细胞的成脂分化潜能。
乳牙牙髓间充质干细胞的各项检测结果如下：
(1)附图2为P1代乳牙牙髓间充质干细胞的第一天培养图，附图3为P1代乳牙牙髓间充质干细胞的第三天培养图，附图4为P1代乳牙牙髓间充质干细胞的第四天培养图。在附图2、3、4中可以看出细胞的生长形态很好。用台盼蓝对冻存前的细胞计数，显示细胞的存活率高达99％；复苏后的细胞用台盼蓝染色计数，细胞存活率仍高达95％。
(2)在37℃生化培养箱中培养24～48h后观察无浑浊出现，在显微镜下观察无细菌、真菌，说明无细菌、真菌污染。
(3)乳牙牙髓间充质干细胞表面标记分子的检测结果如表1所示：
表1乳牙牙髓间充质干细胞表面标记分子检测结果
CD分子 CD73 CD90 CD105 CD29 CD34 CD45 HLA-DR
表达比例 98.6％ 98.5％ 98.9％ 95.4％ 0.32％ 0.56％ 0.68％
由表1可知，乳牙牙髓间充质干细胞表面标记分子CD73、CD90、CD105、CD29的检测结果为阳性，CD34、CD45、HLA-DR的检测结果为阴性，符合人间充质干细胞的表面分子的特性。
(4)附图5为乳牙牙髓间充质干细胞成骨分化茜素红染色结果图，附图6为乳牙牙髓间充质干细胞成脂分化油红O染色结果图，通过分化后的乳牙牙髓间充质干细胞染色结果图能够看出分化后的细胞具有明显的骨和脂肪细胞特性，说明乳牙牙髓间充质干细胞具有较好的成骨和成脂分化能力。
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种乳牙牙髓间充质干细胞的制备方法，其特征在于，包括以下几个步骤：
一、乳牙牙髓间充质干细胞的分离及扩增培养
(1)将在医院检验合格且进行过初步清洗消毒的自然脱落或是人工拔除的乳牙转运至实验室；
(2)在超净工作台中，对乳牙进行二次清洗消毒灭菌，用液压钳压碎乳牙，取出牙髓组织，将牙髓组织切碎后用间充质干细胞无血清培养基培养，获得牙髓组织混合液；
(3)将获得的牙髓组织混合液在温度为37℃，CO2体积分数为5％的培养箱中培养；
(4)在培养的第7～10天，更换培养基，以后每2～3天对培养基进行三分之一换液，培养至12～17天时，细胞汇合率达到70～80％时，进行传代培养；
二、乳牙牙髓间充质干细胞的冷冻保存
(5)当传代细胞的汇合率达到70％～80％时，将传代细胞吸出培养基，加入质量分数为0.05％的胰蛋白酶消化1～3min，离心收集细胞，用间充质干细胞无血清培养基重悬细胞沉淀得到细胞悬液；
(6)将细胞悬液与DMSO冻存液按体积比为4：1混合，得到冻存细胞液，调整冻存细胞的浓度为2～5×106/ml；
(7)将冻存细胞液放入程序性降温盒中在-80℃冰箱降温，隔夜后转入液氮罐中长期储存。
2.如权利要求1所述的乳牙牙髓间充质干细胞的制备方法，其特征在于，所述的步骤(4)中传代培养时，先以质量分数为0.05％的胰蛋白酶消化1～3min，离心收集细胞，然后用间充质干细胞无血清培养基在温度为37℃、CO2体积分数为5％的培养箱中培养获得扩增后的乳牙牙髓间充质干细胞。
3.如权利要求2所述的乳牙牙髓间充质干细胞的制备方法，其特征在于，所述步骤(4)中传代乳牙牙髓间充质干细胞的接种密度为3～6×103/cm2。
4.如权利要求1所述的乳牙牙髓间充质干细胞的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中乳牙转运至实验室时，保持乳牙在2～8℃的温度下转运，且转运时间不超过48～96h。
5.如权利要求1所述的乳牙牙髓间充质干细胞的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中间充质干细胞无血清培养基为FasGrow培养基，每500mL的无血清培养基中添加有25mL的添加因子，所述的添加因子为重组人血小板源生长因子、重组人表皮生长因子的混合物。
6.如权利要求1所述的乳牙牙髓间充质干细胞的制备方法，其特征在于，所述步骤(6)中DMSO冻存液为二甲基亚砜和右旋糖酐40的水溶液。
7.如权利要求1所述的乳牙牙髓间充质干细胞的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中乳牙为6～12岁体检合格儿童的乳牙，采集的乳牙完整带牙根，健康无龋齿、无牙髓炎症、无牙髓坏死。
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