KR20130060212A

KR20130060212A - 자가이식 피부 아섬유의 용량 단위 제형

Info

Publication number: KR20130060212A
Application number: KR1020127030921A
Authority: KR
Inventors: 존 매슬로스키
Original assignee: 파이브로셀 테크놀로지스, 인코퍼레이티드
Priority date: 2010-05-07
Filing date: 2011-05-05
Publication date: 2013-06-07
Also published as: US20130295061A1; US20110274665A1; CA2800333C; CN102905711A; US20230270793A1; CN107812014A; AU2011248067B2; US11554142B2; WO2011140323A1; CN107812014B; CA2800333A1; EP2566489A1; EP2566489B1; JP6309268B2; US8529883B2; JP2013524856A; KR102001254B1; AU2011248067A1

Abstract

용량 단위는 치료될 각 개인을 위해 성장된 아섬유들로 이루어지는 자가이식 세포 치료 생성물로 구성된다. CGMP(Current Good Manufacturing Practices) 및 표준 조직 배양 절차를 사용하여 각 개인 자신의 피부의 생검으로부터 성장된 자가이식 아섬유의 현탁액이 극저온보존 아섬유 또는 그의 전구체들을 담고 있는 바이알 내에 공급되고, 이러한 아섬유 또는 그의 전구체는 1 mL당 1.0~2.0ⅹ10⁷개 세포들의 농도로 1 내지 6 mL, 바람직하게는 2 mL로 투여하기 위해, 적어도 98%의 순도 및 적어도 85%의 세포 생존율을 가진다. 코옆 주름살(입의 양단까지 연장되는 코의 양 사이드에서 끝남)로 주사시, 자가이식 아섬유는 콜라겐을 포함하여 세포외 기질 성분들의 합성을 증가시켜 이들 주름의 심각도를 감소시키는 것으로 생각된다. 임상적으로 중요한 투여 용량 및 시점은 임상적으로 중요한 결과를 얻는 데 대단히 중요한 것으로 나타났다.

Description

자가이식 피부 아섬유의 용량 단위 제형{DOSAGE UNIT FORMULATIONS OF AUTOLOGOUS DERMAL FIBROBLASTS}

본 발명은 인간 개체에서 피부 및 연조직 결함의 치료 및 장기간 증강을 위한 부위로의 주사를 위해 분리되어 제조된 자가이식 피부 아섬유의 용량 단위 제형에 관한 것이다.

미국특허 제5,591,444호, 제5,660,850호, 제5,665,372호, 및 제5,858,390호에 기재된 바와 같이, 개체의 피부에서 화장품 및 미적 결함은 자가이식 피부 아섬유를 결함에 하부인접한 피부 및 피하 조직으로 현탁액을 주입함으로써 치료될 수 있다. 이 방법으로 치료될 수 있는 통상적인 결함은 원치않는 주름, 임신선, 움푹 들어간 흉터, 비외상성 기원의 피부 함몰, 여드름 낭창으로부터의 불안감, 및 입술 발육부전을 포함한다. 세포는 개체와 생체적합성이 있고, 바람직하게는 개체로부터 추출된 생검 시료의 배양에 의해 유래되고, 세포 배양시스템에서 옮겨서(passage) 증식되었다.

미용 결과를 얻기 위해 신체, 특히 얼굴로 재료(주사제)를 주사하는 것은 19세기 말로 추정된다. 예를 들어, 얼굴 윤곽 결함을 보정하기 위한 파라핀 주사는 1차 세계대전 이전 수년간 짧은 허용기간 동안 즐겼다. 주사가능한 실리콘의 유용성은 1960년대 초에 시작된 이들 사건의 실질적인 반복을 불러 일으켰다. 특별히 제조된 “의료 등급”의 실리콘 용액, 예컨데, 다우 코닝 MDX 4.4011은 미국의 수많은 승인된 시험 센터에서 실험 기반으로 사용되었다.

실리콘에 대한 국소 및 전신 반응, 주사액의 이동, 및 국소적 조직파괴와 같은 합병증은 실리콘 주사의 사용을 제한하였다. 비생물학적 물질들의 주사에 의해 얻어진 열악한 결과들은 주사액으로서 외부 단백질, 특히 소 콜라겐을 사용하는 시도를 촉진시켰다. 가공되지 않은 소 콜라겐이 인간에게 주사하기에는 너무 면역성이 있지만, 환자를 검진하여 면역반응성이 있는 환자를 배제하면, 소 콜라겐의 C- 및 N-말단 펩티드의 효소 열화에 의한 제거로 제한된 양으로 사용될 수 있는 물질(“수용성 콜라겐(atelocollagen)”)이 생성된다.

광범위하게 사용되고 있지만, 이 물질은 약 90%의 개체들에서 항 소항체의 발생 및 약 1~3%의 개체들에서 공공연한 면역 합병증과 관련이 있었다.

DeLustro, F., 등, 1987, Plastic and Reconstructive Surgery 79:581. 용액 내에서 수용성 콜라겐은 주 물질에 의한 치환없이 주사 부위로부터 개체에 의해 비교적 짧은 시간 내에 흡수되었기 때문에, 이 물질은 완전히 만족스럽지는 않은 것으로 판명되었다. 신체 내 잔류는 미세 메쉬를 통한 통과로 글루타르알데히드 교차결합 후 여과 및 쉬어링(shearing)에 의해 증가되었다. 그러나, 증가되고 불규칙적인 점성은 이 물질을 사용하기에 너무 어렵게 만들었다. 온전히 개체 자신의 조직 시료로부터 유래된 주사용 인간 콜라겐은 유용하지만, 인간 콜라겐 주사가 소 콜라겐 주사보다 더 지속성이 있다는 증거는 없다.

이들 문제는 자가이식 아섬유 조제 물질의 개발을 통하여 극복되었다. 그러나, 문제에 대한 해결책을 갖는 것은 시행착오에 의해 입증되었고 임상시험으로 확인되었고, 미국 식품의약청의 요구에 따라 제조 및 패키지화된 규정 용량으로 저장하기에 안정한 제품을 갖는 것과는 다르다.

따라서, 본 발명의 목적은 피부 결함의 치료 및 장기 증강을 위한 환자에게 주사용 자가이식 피부 아섬유의 규정된 용량 단위 제형을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 피부 결함의 치료 및 장기 증강을 위해 사용될 수 있는 줄기 세포, 전구체 세포 또는 부분적으로 분화된 세포를 포함하는 용량 단위 제형을 제공하는 데 있다.

용량 단위는 치료될 각 개인을 위해 성장된 아섬유들로 이루어지는 자가이식 세포 치료 생성물로 구성된다. CGMP(current good manufacturing practices) 및 표준 조직 배양 절차를 사용하여 각 개체 자신의 피부의 생검으로부터 성장된 자가이식 아섬유의 현탁액은 저온보존된 아섬유 또는 그의 전구체를 포함하는 바이알 내에 공급되고, 이러한 아섬유 또는 그의 전구체는 1 내지 6 mL, 바람직하게는 2 mL를 약 5주에 3회 투여하고, 1.0~2.0ⅹ10⁷ 세포/mL의 농도로 선형 1cm 당 0.05 mL 내지 0.5 mL로 주사되는 세포들의 적어도 98% 아섬유 순도 및 적어도 85%의 생존율을 가진다.

단백질이 없는 배지에서 소정 시간 동안 증식된 아섬유를 배양함으로써 배양된 피부 아섬유는 배양 배지에 존재하는 면역 단백질이 실질적으로 없게 된다. 비순의 주름살(입의 양단까지 연장되는 코의 양 사이드에서 끝남)로 주사시, 자가이식 아섬유는 콜라겐을 포함하여 세포외 소지 성분들의 합성을 증가시켜 이들 주름의 심각도를 감소시키는 것으로 생각된다. 임상적으로 중요한 투여 용량 및 시점은 임상적으로 중요한 결과를 얻는 데 대단히 중요한 것으로 나타났다.

Restylane® Juvederm™ 및 Radiesse®와 같이, 입가 팔자주름의 치료를 위해 미국에서 승인된 몇몇 치료법이 있지만, 아섬유 세포 현탁액은 이들 제품들과 동일한 약리학 부류의 일부는 아니다. 이들 제품들은 일시적으로 안면 조직에 볼륨을 부가함으로써 주름을 완화하기 위해 안면 조직으로 주사되는 구조적 필러(filler)이다. 아섬유 용량 제형은 매우 다르게 제안된 작용 기전으로 운용된다.

본원에 기재된 용량 제형 단위들은 원치않는 주름, 코옆 및 입가 주름, 입술 주위 주름, 눈가 횡주름, 안와골막 주름, 미간 주름의 치료에 유용하다.

아섬유 용량 제형은 또한 조직 치료 및 재생을 위한 만능 세포를 제공하는 데 유용하다.

도 1은 표준화된 제조공정 흐름도이다.
도 2는 피부 유래 아섬유가 후생적 재프로그래밍을 사용하여 다분화능 줄기세포로 탈분화되는 방법을 보여주는 Byrne 2008 Hum. Mol. Gen. 17:R37-R41로부터 얻은 모식도로서, 다분화능 줄기 세포는 이후 뉴론, 심장 근세포, 베타 섬세포, 및 조혈세포로 분화될 수 있다.
도 3은 아섬유가 다분화능 세포로 탈분화되는 방법의 모식도이다. 세포 융합(Cowan 등, 2005), 직접 재프로그래밍(Takahashi 등, 2007), 및 체세포 핵 치환(Byrne 등, 2007).
도 4는 직접 및 접선 조명 하에서 상대적인 흉터 자국의 비교 평가를 채용한 "평가자 라이브 여드름 흉터 평가 척도(Evaluator Live Acne Scar Assessment Scale)"에서 여드름 흉터 심각도를 의사가 객관적으로 평가한 라이브 등급 매기기에서 사용을 위한 모식도이다.

자가이식 아섬유 제품이 개발되었다. 세포 치료 제품은 표준 조직 배양 절차를 사용하여 각 개인 자신의 피부의 생검으로부터 성장된 자가이식 아섬유의 현탁액으로 구성된다. 환자의 귀 뒤쪽 부위의 피부 조직(진피 및 상피층)을 조직 검사하여 다음날 2~8℃로 유지하여 제조 기관에 전달하였다. 효소 소화를 통해 조직으로부터 분리된 아섬유를 환자의 표적 치료 부위로 주사하기에 충분한 양으로 증식하였다. 세포 치료 제품은 증식된 아섬유들로 구성되는데, 이를 표적 세포 치료 제품 세포 농도로 제형화하였고 벌크 원액(Bulk Drug Substance)-Cryovial이라 부르는 크리오바이알에 극저온 보존하였다. 최종 세포 치료 제품은 냉동된 벌크 세포 치료 제품-크리오바이알 세포들로 구성되는데, 이 세포들은 환자 주사를 위해 냉동, 세척 및 조제되었다.

초기 마켓팅 승인은 심각한 코옆 주름의 완화 치료를 위한 것이었다. 현재의 임상적 개발은 피부 윤곽 기형, 성대 흉터, 치은후퇴, 제한적 화상 흉터, 및 여드름 흉터에 집중된다. 용량 및 투여 요법은 아래에 논의되듯이 치료될 조건에 따라 다르다. 정확한 메커니즘이 알려지지 않았지만, 환자 피부에 주사시, 아섬유 용량 제형의 활성 성분을 포함하는 자가이식 아섬유는 콜라겐과 같은 세포외 기질 성분의 합성을 증가시켜서 피부 무결성을 높이고, 결국 미세한 주름의 감소로 이어지는 것으로 생각된다.

다음 정의들이 본원에서 사용된다:

ATM: .분석 시험 방법

AZFICEL-T USAN: 자가이식 배양된 아섬유를 위한 명명법

BULK HARVEST: 극저온 보존 배지에서 제형화 전 최종 채취 후 물질

CGMP: 현재의 좋은 제조관행

CS: 세포 스텍

DFEM: 독수리 배지의 둘베코 변이

DMSO: 디메틸 설폭사이드

DRUG PRODUCT-INJECTION: 세척 및 재제형화된 물질

DMEM: 바이알에 넣어서 임상 기관으로 보낼 준비가 된

DRUG SUBSTANCE-CRYOVIAL: 극저온 보존 배지에서 제형화 및 크리오바이알로 분취된 물질

EDTA 에틸렌디아민테트라 아세트산

FACS: 형광 이용 세포 분류

FBS: 소 태아 혈청

GA: 젠타미신 및 암포테리신 B

IMDM: 이스코브의 변이된 둘베코 배지

IND: 의약품 임상시험계획 승인제도

PBS: 인산염 완충 식염수

PCA: 개인용 세포 분석

QC: 품질관리

USP: 미국약전

I. 용량 단위 제형

A. 세포원

1. 자가이식 피부 아섬유

제형 내 세포들은 배양된 단층 성장시 통상적인 아섬유 형태를 나타낸다. 구체적으로, 세포들은 신장된 방추상 또는 가는 연장부를 갖는 스핀들 모습을 표시할 수 있고, 혹은 세포들은 극저온 혈장 리딩 에지를 가질 수 있는 더 크고, 편평한 별세포로 보일 수 있다. 이들 형태들이 혼합된 형태도 관찰될 수 있다. 이 세포들은 당단백질 및 세포외 기질 단백질을 포함하는 정상 아섬유의 단백질 특성을 나타낸다. 아섬유 용량 제형은 자가이식 아섬유의 현탁액으로 구성되는 자가이식 세포 치료 제품으로서, 표준 조직 배양 절차를 사용하여 각 개인 자신의 피부의 생검으로부터 성장된다.

환자의 귀 뒤쪽 부위의 피부 조직(진피 및 상피층)을 생검한다.

2. 전구체 세포

아섬유는 조직 치료 또는 재생을 위해 다른 세포 유형을 생성하기 위해 사용될 수도 있다. 체세포 핵치환(SCNT)에 의해 환자와 유전적으로 동일한 배아 줄기(ES) 세포의 유도는 주 면역 시스템에 의한 거부에 관한 관심을 우회하면서 많은 퇴행성 질환의 징후를 치료하거나 완화시키기 위한 잠재력을 가진다. Byrne 등은 Nature 2007 Nov 22;450(7169):497-502에서 성인의 피부 아섬유로부터 마카크 원숭이 배반포를 생산하기 위해 변형된 SCNT 접근을 사용하였고, 이들 배아들로부터 두 개의 ES 세포주들을 성공적으로 분리하였다. DNA 분석으로 핵 DNA가 공여자(donor) 체세포와 동일하고 미토콘드리아 DNA가 난모세포로부터 기원하였다는 것을 확인하였다. 양 세포주들은 정상적인 ES 세포 형태를 나타내었고, 주요한 줄기 세포 표지를 나타내었고, 대조 ES 세포들과 표기적으로 유사하였으며, 시험관 및 생체 내에서 다수의 세포 유형으로 분화되었다. (Sparman, 등, Stem Cells 2009;27(6): 1255-64 참조). 도 2는 피부 유래 아섬유가 후생적 재프로그래밍을 사용하여 다분화능 줄기세포로 탈분화되는 방법을 보여주는 Byrne 2008 Hum. Mol. Gen. 17:R37-R41로부터 얻은 모식도로서, 다분화능 줄기 세포는 이후 뉴론, 심장 근세포, 베타 섬세포, 및 조혈세포로 분화될 수 있다. (Hochedlinger, 등, Development. 2009 Feb;136(4):509-23 및 Kanawaty, 등, Bioessays. 2009 Feb;31(2): 134-8 참조).

도 3은 아섬유가 다분화능 세포로 탈분화되는 방법의 모식도이다. 세포 융합(Cowan 등, 2005 Aug 26;309(5739): 1369-73), 직접 재프로그래밍(Takahashi 등, 2007 30;131(5):861-72), 및 체세포 핵 치환(Byrne 등, 2007).

Takahashi 등은 동일한 4 가지 인자(Oct3/4, Sox2, Klf4, 및 c-Myc)로 성인 인간 피부 아섬유로부터 iPS 세포들의 생성을 보였다. 형태, 증식, 표면 항원, 유전자 발현, 다분화능 세포의 후생적 상태-특이 유전자, 및 말단소체복원효소에서 인간 iPS 세포들은 인간 배아줄기(ES) 세포들과 유사하였다.

또한, 이들 세포들은 시험관 및 기형종에서 세 가지 세균층들의 세포 유형들로 분화될 수 있었다. 이러한 발견은 iPS 세포들이 성인 인간 아섬유로부터 생성될 수 있다는 것을 보였다.

B. 세포 준비

원액에서 자가이식 아섬유는 수검자 자신의 피부의 생검 후 표준 세포 배양 기술을 이용한 배양액에서의 증식으로부터 성장된 부분에 의해 유래된다. 환자의 귀 뒤쪽 부위의 피부 조직(진피 및 상피층)을 생검한다. 시작 물질은 표준 무균 진료를 사용하여 수집된 세 개의 3 mm 펀치 피부 생검으로 구성된다. 생검은 치료 의사가 수집하여 살균된 인산염 완충 식염수(PBS)를 담고 있는 바이알에 둔다. 생검 검체들은 2~8℃로 냉장보관된 보관장치에 담아 선적되어 제조기관에 보낸다.

제조기관에 도착 후, 생검 검체는 조사되고, 허가가 떨어지면 제조 장소로 직접 이송된다. 공정의 시작시, 생검 검체 조직은 이후 효소 소화 전에 세척된다. 세척 후, 리베라제 소화성 효소액을 갈지 않고 첨가하여 생검 검체 조직을 37.0 ± 2℃에서 1시간 동안 배양한다. 생검 검체 소화 시간은 배양에서 세포의 생육 및 성장에 영향을 미칠 수 있는 중요한 공정 변수이다. 리베라제는 Lonza Walkersville사(Walkersville, MD)가 제형화 하고 Roche Diagnostics사(Indianapolis, IN)가 제형화 하지 않고서 얻은 콜라게나제/중성 프로테아제 효소 혼합제이다. 대안적으로, Serva Collagenase NB6와 같이 기타 상업적으로 이용가능한 콜라게나제들이 사용될 수 있다.

(Helidelburg, Germany). 소화 후, 시작 성장 매지(IMDM, GA, 10% 소 태아 혈청(FBS))을 첨가하여 효소를 중화시키고, 원심분리로 세포들을 펠릿화하고, 5.0 mL 시작 성장 배지에서 재현탁한다. 대안적으로, 시작 성장 배지만을 첨가함으로써 효소의 비활성화가 발생하면서, 원심분리를 수행하지 않는다. 세포 성장 및 증식의 시작을 위해 T-175 세포 배양 플라스크로 세포 현탁액을 뿌리기 전에 시작 성장 배지를 첨가한다. T-75 플라스크 대신, T-75, T-150, T-185 또는 T-225를 사용할 수 있다.

37 ± 2.0℃에서 5.0 ± 1.0% C0₂로 세포들을 배양하였고, 3~5일 마다 신선한 완전 성장 배지를 공급하였다. 이 과정에서 완전 성장 배지의 반을 제거하고 동일한 용량을 신선한 배지로 교체함으로써 모든 공급을 수행하였다. 대안적으로, 전체 공급을 수행할 수 있다. 계대에 앞서 30일 초과일에 T-175 플라스크에는 세포가 남아 있지 말아야 한다. 분할 배양 동안 적절한 살포 밀도를 보장하기 위해 이 공정에 걸쳐서 융합을 모니터링하였다. T-175 플라스크에서 세포 융합이 40% 이상이면, 사용된 배지를 제거하고, 세포들을 세척하여, 트립신-EDTA로 치료하여 플라스크에 부착 세포들을 용액으로 배출함으로써 세포를 배양하였다. 이 후, 세포들을 트립신 처리하고 계속되는 세포 증식을 위해 T-500 플라스크에 살포하였다. 대안적으로, T-500 플라스크 대신, 한 개 또는 두 개의 T-300 플라스크, 1층 셀 스텍(1 CS), 1층 셀 팩토리(1 CF) 또는 2층 셀 스텍(2 CS)가 사용될 수 있다.

각 계대에서 형태를 평가하여 채취 전에 이 과정에 걸쳐서 배양 순도를 모니터링하였다. 세포 배양물들의 형태 검사를 위해 시각 표준으로 관찰된 시료를 비교하여 형태를 평가하였다. 배양된 단층에서 성장 시 세포들은 전형적인 아섬유 형태를 나타낸다. 세포들은 신장된 방추상 또는 가는 연장부를 갖는 스핀들 형상 또는 세포들은 극저온 혈장 리딩 에지를 가질 수 있는 더 크고, 편평한 별세포 중 어느 하나로 나타날 수 있다. 이들 형태들이 혼합된 형태도 관찰될 수 있다. 융합이 덜한 영역에서 아섬유는 유사한 형상을 가질 수 있지만, 불규칙한 방향으로 배열된다. 세포 배양액에서 케라티노사이트의 존재도 평가하였다. 케라티노사이트는 둥글고 불규칙한 형상을 띠었고, 더 높은 융합에서, 이들은 자갈 형태로 조직화 되었다. 더 낮은 융합에서, 케라티노사이트는 더 작은 콜로니들에서 관찰될 수 있었다.

37 ± 2.0℃에서 5.0 ± 1.0% C0₂로 세포들을 배양하였고, 3~5일 마다 T-500 플라스크에 그리고 5~7일 마다 10층 셀 스텍(10 CS)에 공급하였다. 계대에 앞서 10일 초과일에 T-500 플라스크에는 세포가 남아 있지 말아야 한다. 벌크 원액의 안정성을 위한 품질 관리(QC) 방출 시험은 멸균 및 내독소 시험을 포함한다. T-500 플라스크 내 세포 융합이 95%를 초과하면, 세포들은 10 CS 배양 용기로 옮겨진다. 대안적으로, 10 CS대신 두 개의 5층 셀 스텍(5 CS) 또는 10층 셀 팩토리(10 CF)를 사용할 수 있다. IOCS.

10 CS로의 이동은 사용된 배지를 제거하고, 세포들을 세척하고, 트립신-EDTA로 처리하여 플라스크에 달라 붙은 세포들을 용액으로 방출함으로써 수행된다. 이후 세포들을 10 CS로 옮긴다. 트립신을 중화시키기 위해 추가 완전 성장 배지를 첨가하고 T-500 플라스크에 있는 세포들을 신선한 완전 성장 배지를 담고 있는 2L 병으로 피펫으로 옮겼다.

2L 병의 양을 10 CS로 옮기고 모든 층에 살포하였다. 이후 37 ± 2.0℃에서 2.0 ± 1.0% C0₂로 세포들을 배양하였고, 5~7일 마다 신선한 완전 성장 배지를 공급하였다. 옮기기 전 20일을 초과하는 일자 동안 T-500 플라스크에는 세포가 남아 있지 말아야 한다.

단백질이 없는 배지에서 소정 시간 동안 증식된 아섬유를 배양함으로써 배양된 피부 아섬유는 배양 배지에 존재하는 면역 단백질이 실질적으로 없게 된다.

1차 채취: 10 CS 내 세포 융합이 95% 이상일 때, 세포를 채취하였다. 사용된 배지를 제거하고, 세포들을 세척하고, 트립신-EDTA로 처리하여 플라스크에 달라 붙은 세포들을 용액으로 방출하고, 추가적인 완전 성장 배지를 첨가하여 트립신을 중화시킴으로써 채취가 수행된다. 원심분리로 세포들을 수집하여, 재현탁하고, 과정 중 QC 검사를 수행하여 독자 생존가능한 총 세포 수 및 세포의 생존율을 판단하였다.

코옆 주름의 치료를 위해, 총 세포수는 3.4x10⁸개이어야 하고, 생존율은 85% 이상이어야 한다.

대안적으로, 다른 요법을 위한 총 세포 산출량은 3.4x10⁸ 내지 1x10⁹개 범위일 수 있다. 채취 시 세포 수 및 생존율은 원액의 형성을 위해 적합한 독자 생존가능 세포들의 양을 보장하는 중요한 변수들이다. 총 독자생존 세포수가 의도한 치료용으로 충분하면, 세포들의 부분표본 및 소비된 배지를 마이코플라스마 오염을 위해 검사한다. 마이코플라스마 검사를 수행한다. 채취된 세포들을 제형화하여 극저온 보존한다.

최초 10 CS 채취로부터 세포 계수 결과를 받은 후 추가 세포들이 필요하면, 다수의 세포 스텍(4개의 10 CS까지)으로 추가적인 옮기기가 수행된다(도 1의 단계 5a). 추가적 옮기기를 위해, 1차 채취된 세포들을 신선한 완전 성장 배지를 담고 있는 2L의 배지 병에 첨가한다. 재현탁된 세포들을 다수의 셀 스텍에 첨가하고 37 ± 2.0℃에서 5.0 ± 1.0% C0₂로 배양한다. 상술한 바처럼, 세포 채취 전 세포 융합이 80% 이상이어야만 하는 것을 제외하고, 셀 스텍들을 공급하여 채취한다. 채취 과정은 상기한 1차 채취에 대해 설명된 것과 동일하다. 세포들 및 사용된 배지들로부터 마이코플라스마 시료를 수집하여 상술한 1차 채취에 대해 설명된 바와 같이 세포 수 및 생존율을 카운트하였다.

이 방법은 동물이 원천인 시약으로부터 이들의 도입을 피함으로써 면역 단백질을 감소 또는 제거한다. 공정 잔류물들을 감소시키기 위해, 세포들을 단백질이 없는 냉동 배지에서 극저온 보관하고, 이후 나머지 잔류물을 더 감소시키기 위해 최종 주사를 준비하기 전에 해동 및 세척한다.

채취 후 원액이 추가로 필요하고 추가 옮기기로부터 세포들의 극저온 보관이 완료되면(도 1의 단계 5a), 냉동된 원액(Cryovial)의 부분표본들은 해동되어 5 CS 또는 10 CS 배양 용기에 살포하기 위해 사용된다)도 1의 단계 7a). 대안적으로, 4층 셀 팩토리(4 CF), 두 개의 4 CF 또는 두 개의 5 CS가 하나의 5CS 또는 10 CS 대신 사용될 수 있다. 상술한 바와 같이, 세포들의 냉동된 크리오바이알(들)은 해동되고, 세척되어 신선한 완전 성장 배지를 담고 있는 2L 배지 병에 첨가되어 배양, 채취 및 극저온 보관된다. 세포 현탁액이 첨가되면, 세포 채취 전 세포 융합은 80% 이상이어야 한다.

C. 세포 현탁액의 준비

배양 증식의 완료 시점에, 세포들을 채취하여 세척하였고, 이후 2.2ⅹ10⁷ 세포/m의 표적으로 1.0~2.7ⅹ10⁷ 세포/mL를 포함하도록 제형화하였다. 대안적으로, 표적은 다른 표시 용량을 수용하는 제형 범위 내로 조절될 수 있다. 원액은, Iscove의 변형된 Dulbecco의배지(IMDM) 및 Profreeze-CDM™ (Lonza, Walkerville, MD) + 7.5% 디메틸 설폭사이드(DMSO)로 구성되는 극저온 배지에서 현탁된 수많은 독자생존 가능하고, 자가 이식의 인간 아섬유 세포들로 구성된다.

대안적으로, 7.5% 또는 CryoStor™ CS5 대신, 더 낮은 DMSO 농도가 사용될 수 있고, 또는 IMDM/Profreeze/DMSO 대신 CryoStor™ CS10(BioLife Solutions, Bothell, WA)이 사용될 수 있다. 냉동 과정은 다음 램프 프로그램에 대한 제어율 냉동 단계로 구성된다:

단계 1: 4.0℃에서 대기

단계 2: 1.0℃/minC/m ~ -4.0℃ (시료 탐침)

단계 3: 25.0℃/minC/m ~ -40℃ (챔버 탐침)

단계 4: 10.0℃/minC/m ~ -12.0℃ (챔버 탐침)

단계 5: 1.0℃/minC/m ~ -40℃ (챔버 탐침)

단계 6: 10.0℃/minC/m ~ -90℃ (챔버 탐침)

단계 7: 끝

조절율 냉동 단계의 완료 후, 벌크 원액 바이알을 기체 상태로 저장하기 위한 극저온 냉동기로 옮긴다. 극저온 냉동 후, 원액을 품질관리 검사를 위해 제출한다. 원액 명세서는 극저온보관에 앞서 수행되고 또한 원액(Cryovial)을 위하여 다시 수행된 세포 카운트 및 세포 생존도 검사를 포함한다. 세포 생존율은 제품 방출을 위해 85% 이상이어야 한다. 세포 카운트 및 생존율은 살아 있고 죽은 세포들의 검출 및 구분을 위해 침투가능 및 침투 불가능한 형광성의 DNA-삽입 염료의 조합을 이용한 자동화된 세포 카운팅 시스템(Guava Technologies)을 사용하여 수행된다.

대안적으로, 트리판 블루 배제 방법을 채용한 수동 세포 카운팅 평가가 상술한 자동화 세포 방법 대신 사용될 수 있다. 대안적으로, 다른 자동화 세포 카운팅 시스템들이 세포 카운팅 및 생존율 측정을 위해 사용될 수 있고, 이러한 시스템으로는 Cedex (Roche Innovatis AG, Bielefield, Germany), ViaCell™ (Beckman Coulter, Brea, CA), NuceloCounter™ (New Brunswick Scientific, Edison, NJ), Countless®(Invitrogen, division of Life Technologies, Carlsbad, CA), 또는 Cellometer®(Nexcelom Biosciences, Lawrence, MA)이 있다.

원액(Cryovial) 시료는 방출 전 1.0~2.7ⅹ10⁷ 세포/mL의 세포 카운트 명세서를 충족시켜야 한다. 멸균 및 내독성 시험도 방출 시험 동안 실시된다.

세포 카운트 및 생존율 측정 외에도, 원액의 순도/식별이 수행되고 현탁액이 98% 이상의 아섬유를 함유하는 지 확인해야만 한다. 통상의 세포 오염물은 케라티노사이트를 포함한다. 순도/식별 분석은 아섬유 세포 집단의 순도 백분율을 정량화하기 위해 CD90 및 CD104(각각, 아섬유 및 케라티오사이트 세포에 대한 세포 표면 표지들)에 대해 형광성 태그가 붙은 항체들을 채용한다. CD90(Thy-1)은 35 kDA 세포-표면 당단백질이다. CD90에 대항하는 항체들은 인간 아섬유 세포들에 대해 높은 특이성을 보이는 것으로 나타났다 CD104, 인테그린 β4쇄는 α6/β4 복합체를 형성하는 인테그린 α6 쇄(CD49f)와 관련된 205 kDa 경막 당단백질이다. 이 복합체는 케라티노사이트 세포를 위한 분자 표지로서 작용하는 것으로 나타났다(Adams 및 Watt 1991).

CD104 단백질에 대한 항체들은 100%의 인간 케로티노사이트 세포들에 결합된다. 세포 카운트 및 생존율은 시료들을 비아카운트 염료 시약으로 인큐베이팅하고 Guava PCA 시스템으로 이들 시료를 분석함으로써 결정된다. 시약은 두 가지 염료, 즉 모든 유핵 세포들을 염색하는 막 투과성염료, 및 손상 또는 죽은 세포들만을 염색하는 막-불투과성 세포로 구성된다. 이러한 염료 조합의 사용은 Guava PCA 시스템으로 하여금 시료에 존재하는 세포들의 총 수를 추정하여 어느 세포들이 생존 가능성이 있는지, 자살세포인지, 혹은 죽은 세포인지를 판단하도록 할 수 있다. 이 방법은 특히 자가이식 배양된 아섬유의 순도/신원을 판단하는 데 사용하기 위해 주문으로 개발되었다. 특이적 작업과정은 다음과 같다:

작업과정

PBS 에서 25%(W/V) 소듐 아지드의 준비:

FACS ( Fluorescent Activated Cell Sorting ) 완충액의 준비: 1000 mL의 Nalgene 병에, 966 mL의 PBS, 30 mL의 FBS, 및 4 mL의 25% 의 소듐아지드를 넣어 PBS 완충액을 만들었다.

PBS에서 1%(W/V) HuS의 준비

검사 시료마다 1mL의 1% HuS 함유 PBS를 제조하라. 1.5 mL 튜브 내로 표지된 1% HuS 부분표본 990 PBS 10 μl의 인간 혈청을 1% HuS 라벨이 붙은 튜브에 첨가하라.

시료 수령 및 준비:

옮긴 결과를 갖고서 그 날 동안 매일 구아바 체크가 수행되었음을 입증하라. 검사 바이알들에 대해 구아바 PCA를 사용하여 세포 카운트와 생존율 검사를 수행하라. 얻은 평균 세포 카운트 값을 기록하라.

각 시료 세트의 경우, 검사 바이알마다, 4개의 1.5 mL 미소원심분리 튜브들에 다음과 같이 라벨을 붙여라. "CD90," "CD104," "마우스"(마우스 IgGl 동종 대조에 해당), 및 "쥐" (쥐 IgG2b 동종 대조에 해당).

평균 세포 카운트 결과를 사용하여, 각 튜브가 1ⅹ10⁵ 생존가능한 세포들을 수용하도록 부분표본에 대한 세포들의 적절한 용적을 계산하라.

실시예:

문서화된 평균 생존가능한 세포 카운트 결과가 1.5ⅹ10⁷ 세포/mL이면, 적절한 용적을 위해 1ⅹ10⁵을 1.5ⅹ10⁷ 세포/mL로 나누어라. 이 용적(mL)에 1000을 곱하여 단위로 μl로 변환하라.

lⅹ10⁵/1.5ⅹ10⁷ cells/mL = 0.0066 mL ⅹ 1000 = 7 μl의 세포 용액 부분표본.

총 용적이 1 mL가 되도록 각 튜브에 충분한 FACS 완충액을 첨가하라.

실시예:

첨가된 세포 용액이 7μl이면, 1 mL 또는 1,000 μl에서 7 μl를 빼라. 1000 μl -7 μl = 993 μl FACS 첨가 완충액.

소용돌이 설정 8로 3초 동안 연속적으로 소용돌이를 만들어서 검사 바이알을 혼합하라.

적절한 양의 세포 용액을 FACS 완충액에 첨가하라. 소용돌이 설정 8로 3초 동안 연속적으로 소용돌이를 만들어서 혼합하라.

3,000 rpm으로 3분 동안 원심분리하여 각 시료에 있는 세포들을 펠릿화하라.

펠릿 형성에 어려움이 생기면, 3,000 rpm에서 3분간 튜브를 다시 원심분리하라. 2차 원심분리 후 펠릿 형성이 적절하면, 상청액 흡입을 진행하라. 피펫을 사용하여, 탈이온수에 20% 표백제를 함유하는 폐용기 내에 상청액을 흡입하라. 부주의로 흡입하는 세포들을 최소화 하도록 각 튜브에 약 50 ml의 상청액을 남겨라.

PBS에 200 ml의 1% HuS를 첨가하라. 소용돌이 설정 8로 3초 동안 연속적으로 소용돌이를 만들어서 혼합하라.

2~8℃에서 25분±5분 동안 튜브를 인큐베이트하라.

5.0 ml의 항체 또는 아이소타이프 대조를 각각의 튜브에 첨가하라. 소용돌이 설정 8로 3초 동안 연속적으로 소용돌이를 만들어서 혼합하라.

2~8℃에서 25분±5분 동안 튜브를 인큐베이트하라. 빛으로부터 보호하라.

각 튜브에 800 ml의 FACS 완충액을 첨가하라. 소용돌이 설정 8로 3초 동안 연속적으로 소용돌이를 만들어서 혼합하라.

피펫을 사용하여, 상청액을 흡입하고 부주의로 흡입하는 세포들을 최소화하도록 각 튜브에 약 50 ml의 상청액을 남겨라. 400 ml의 FACS 완충액을 첨가하라. 소용돌이 설정 8로 3초 동안 연속적으로 소용돌이를 만들어서 혼합하라.

Guava PCA 를 사용한 시료 획득

CytoSoft 2.1.5를 열어서 메인 메뉴의 Guava Express를 클릭하라. New Data Set를 클릭하고 스크린 명령에 따라 새 파일을 생성하라 2000이 Guava Express Acquisition 스크린의 Events To Acquire 부분에 확실하게 입력되도록 하라. 마우스 IgG1 이소타이프 대조를 위한 설정을 조정하라. 시료 정보 조정 패널 내에서 시료 Part, Lot 및 아이소타이프 대조 또는 항체(예를 들어, "DR01 200502001_마우스")를 입력하여 각 시료를 Sample ID 필드로 확인하라.

소용돌이 설정 8로 3초 동안 마우스 IgG1 아이소타이프 대조 튜브를 연속적으로 소용돌이를 일으켜라. 메시지 창이 뜨면, Adjust Setings를 선택하라. 다른 메시지 창이 떠서 대조 시료를 로딩할 것을 촉구할 것이다. OK를 선택하라.

"Adjust Settings" 스크린이 나타나고 시스템은 배경 형광을 배제하는 역치를 자동으로 설정할 것이다. 규정된 세포 클러스터의 중앙을 FSC vs. Viability (PM1) 플롯(예를 들어, "x2")의 X-축 상에서 우측 하단 사분면의 10e3 위에 위치시키도록 FSC Gain 세기를 선택하라. 잔해를 배제하도록 FSC 대 Viability (PM1) 플롯 위에 FSC 역치 바를 위치시켜라.

PM2를 300V로 조절하라. FSC vs PM1 및 PM1 대 PM2 도트 플롯 둘 다에서 부대조군이 10e0 및 10e1 사이에 위치되도록 1PM1을 300~400V로 조절하라.

마우스 IgG1 아이소타이프 대조를 획득하라:

소용돌이 설정 8로 3초 동안 마우스 IgG1 아이소타이프 대조 튜브에 연속적으로 소용돌이를 일으키고, 구아바 PCA에 로딩한 다음 Acquire Next Sample을 클릭하라. 모든 디폴트 게이팅 옵션을 언게이티드(ungated)로 확실하게 설정하라. PMI 대 카운트 히스토그램 상에서, 표지들은 디폴트 위치로 설정된다. PMI Gated 시료에 대한 Histogram Events의 %가 약 1.0%이 되도록 설정하기 위해 표지를 클릭하라.

CD90 시료를 획득하라:

시료 정보 조정 패널 내에서 시료 Part, Lot 및 아이소타이프 대조 또는 항체(예를 들어, "DR01 200502001_CD90")를 입력하여 각 시료를 Sample ID 필드로 확인하라. PMI 형광 표지들이 마우스 IgG1 아이소타이프 대조 시료와 동일한 설정으로 정해진다.

쥐 IgG2b 아이소타입 대조를 위한 설정을 조절하라:

소용돌이 설정 8로 3초 동안 쥐 IgG1 아이소타이프 대조 튜브를 연속적으로 소용돌이를 일으켜라. "Adjust Settings"스크린이 나타나고 시스템은 배경 형광을 배제하는 역치를 자동으로 설정할 것이다. 규정된 세포 클러스터의 중앙을 FSC 대 Viability (PM1) 플롯(예를 들어, "x2")의 X-축 상에서 우측 하단 사분면의 10³ 위에 위치시키도록 FSC Gain 세기를 선택하라. 잔해를 배제하도록 FSC 대 Viability (PM1) 플롯 위에 FSC 역치 바를 위치시켜라. PM2를 300V로 조절하라. FSC 대 PM1 및 PM1 대 PM2 도트 플롯 둘 다에서 부대조군이 10e0 및 10e1 사이에 위치되도록 1PM1을 300~400 V로 조절하라.

쥐 IgG1 아이소타이프 대조 시료를 획득하라:

소용돌이 설정 8로 3초 동안 쥐 IgG1 아이소타이프 대조 튜브에 연속적으로 소용돌이를 일으키고, Guava PCA에 로딩한 다음 Acquire Next Sample을 클릭하라. 게이트 옵션 모두를 언게이티드로 설정하라. PMI 대 Count 히스토그램 상에서, 표지들은 디폴트 위치로 설정된다. PMI Gated 시료에 대한 Histogram Events의 %가 약 1.0%이 되도록 설정하기 위해 표지를 클릭하라. 표지의 위치가 "Marker Position" 박스에 수치로 표시된다.

CD104 시료를 획득하라:

소용돌이 설정 8로 3초 동안 CD104 튜브에 연속적으로 소용돌이를 일으키고, Guava PCA에 로딩한 다음 Acquire Next Sample을 클릭하라. PM1 형광 표지들이 쥐 IgG1 아이소타이프 대조 시료와 동일한 설정으로 정해진다.

Guava PCA 를 사용한 시료 분석:

Acquisition 스크린에서 Go to Analysis를 클릭하라. Print를 클릭하고 OK하라. 인쇄된 보고서들 각각의 이니셜 및 일자.

순도 계산:

PM1 사건 카운트 [CD90 (CD90) 라벨이 붙은 총 사건] - PM1 사건 카운트 [항-CD90 (마우스 IgGl) 라벨이 붙은 총 사건] = (배경/비특이적 형광을 위해 정상화된) CD90 라벨이 붙은 총 사건 (예를 들어, 1918 사건 - 20 사건 = 1898 사건).

PM1 사건 카운트 [항-CD104 (쥐 IgG2b) 라벨이 붙은 총 사건] - PM1 사건 카운트 [항-CD104 (쥐 IgG2b) 라벨이 붙은 총 사건] = (배경/비특이적 형광을 위해 정상화된) CD104 라벨이 붙은 총 사건 (예를 들어, 31 사건 - 23 사건 = 8 사건).

(배경/비특이적 형광을 위해 정상화된) CD90 라벨이 붙은 총 사건 + (배경/비특이적 형광을 위해 정상화된) CD104 라벨이 붙은 총 사건 = 라벨이 붙은 총 정상화된 사건(예를 들어, 1898 사건 + 8 사건 = 1906 사건)

다음과 같이 순도 %를 계산하라. 1898 총 CD90 사건 / 1906 총 정상화된 라벨이 붙은 사건 x 100 = 99.58, 또는 100%.

시스템 적합성 및 명세서

성공적 비드 체크는 평가 전에 수행되어야만 한다.

총 입자 카운트는 2000을 획득해야 한다.

모든 시료들에 대한 순도 %는 98%를 초과해야 한다.

교번적 제조 방법

대안적으로, T-175 플라스크(또는 대안) 또는 T-500 플라스크(또는 대안)으로부터 세포 성장 표면으로 마이크로카머(microcamer)들을 담고 있는 스피너 플라스크로 옮겨질 수 있다. 마이크로카머들은 현탁배양에서 정박지 의존형세포들을 위한 성장 표면으로 사용되는 작은 비드 유사 구조들이다. 이들은 작은 용적을 큰 세포 효율을 생산하도록 설계된다.

이 장치에서, 50 mL~300 mL 범위의 완전 성장 배지의 소정 용적이 500 mL, 1L, 또는 2L 멸균 1회용 스피너 플라스크에 첨가된다. 멸균 마이크로캐리어들이 스피너 플라스크에 첨가된다. 배양은 계속 정적 상태이도록 하거나 5.0±1.0% CO₂ 인큐베이터로 37±2.0℃에서 짧은 시간 주기(1~24시간) 동안 낮은 RPM(15~30 RPM)으로 교반 플레이트 위에 놓여져서 캐리어에 대한 세포들의 부착을 허용한다. 부착 기간 후, 스핀 플레이트의 속도는 증가된다(30~120 RPM). 세포들은 1일 내지 5일 마다 혹은 색 변화에 의해 소비된 배지가 보이면 신선한 완전 성장 배지를 공급받는다.

마이크로캐리어를 샘플링함으로서 세포들을 일정 간격으로 수집하고 수집된 세포들을 분리하여 세포 카운트와 생존율 분석을 수행한다. 캐리어 당 세포 농도는 배양을 일정한 율로 증가시킬 시점을 판단하기 위해 사용된다. 충분한 세포들이 생산되면, PBS로 세포들을 세척하고 트립신-EDTA를 사용하여 마이크로캐리어로부터 채취하여 더 많은 양의 마이크로캐리어 및 더 높은 용적의 완전 성장 배지(300mL~2L)가 들어 있는 스피너 플라스크에 도로 살포된다. 대안적으로, 추가적인 마이크로캐리어 및 완전 성장 배지는 존재하는 마이크로캐리어 배양액을 함유하고 있는 스피너 플라스크에 직접 첨가되어, 트립신처리 및 재살포 없이 세포들의 직접 비드에서 비드로 이송을 고려한다. 대안적으로, 초기 T-175 또는 T-500 플라스크로부터 충분한 세포들이 생산되면, 이 세포들은 증식된 양의 마이크로캐리어들에게 직접 살포될 수 있다.

부착 기간 후, 스핀 플레이트의 속도는 증가된다(30~120 RPM). 세포들은 1일 내지 5일 마다 혹은 색 변화에 의해 소비된 배지가 보이면 신선한 완전 성장 배지를 공급받는다. 농도가 의도한 표시를 위한 원하는 세포 카운트에 도달하면, 세포들을 PBS로 세척하고 트립신-EDTA를 사용하여 채취한다. 섹션 C 및 D에 기재된 과정 다음에 약물 제품(주사액)의 방출 검사, 극저온보존 및 준비가 이루어질 것이다.

일회용 스피너 플라스크 내에 사용된 마이크로캐리어는 BioNOC II®(Cesco Bioengineering, distributed by Bellco Biotechnology, Vineland, NJ) 및 FibraCel®(New Brunswick Scientific, Edison, NJ)와 같은 폴리 블렌드, Cultispher-G (Percell Biolytica, Astrop, Sweden)와 같은 젤라틴, Cytopore™ (GE Healthcare, Piscataway, NJ)와 같은 셀룰로오스, 또는 2D MicroHex™ (Nunc, Weisbaden, Germany), Cytodex®(GE Healthcare, Piscataway, NJ) 또는 Hy-Q Sphere™ (Thermo Scientific Hyclone, Logan, UT)와 같은 코팅/코팅되지 않은 폴리스티렌으로 제조될 수 있다.

대안적으로, 세포들을 폴리 블렌드 2D 마이크로캐리어, 예를 들어, BioNOC II® 및 FibraCel® 상에서 스피너 플라스크 장치 대신 자동 벨로우 시스템, 예를 들어, FibraStage™ (New Brunswick Scientific, Edison, NJ) 또는 BelloCell®(Cesco Bioengineering, distributed by Bellco Biotechnology, Vineland, NJ)를 사용하여 처리할 수 있다. T-175(또는 대안) 또는 T-500 플라스크(또는 대안)의 세포들을 적절한 양의 완전 성장 배지와 함께 마이크로캐리어를 담고 있는 벨로우 병으로 옮겨서 상기 시스템에 두었다. 시스템은 마이크로캐리어 위에 배지를 펌핑하여 세포들을 공급하고, 반복적ㅇ니 고정 사이클로 산화를 고려하여 배지를 떼어 놓는다. 상술한 바와 같은 동일한 순서로 세포들을 관찰하고, 공급하고, 세척하고, 채취한다.

대안적으로, 자동화 시스템을 사용하여 세포들을 처리할 수 있다. 생검 조직의 소화 후 또는 제1 옮기기가 완료(T-175 플라스크 또는 대체재)된 후, 세포들을 자동화 장치 내로 살포할 수 있다. 한 가지 방법은 자동화 세포 증식 시스템(Automated Cellular Expansion(ACE) system)으로서, 이 시스템은 함께 연결된 일련의 상업적으로 이용가능하거나 주문 제작된 부품들로 이루어져 인간의 개입 없이 세포들이 증식할 수 있는 세포 성장 플랫폼을 형성한다. 정박지 의존형 세포 부착을 지원할 수 있는 적층 디스크들로 구성되는 세포 타워에서 세포들을 증식한다. 이 시스템은 배지들을 자동으로 순환시키고 세포 증식 단계의 완료시 채취를 위한 트립신처리를 수행한다.

대안적으로, ACE 시스템은 축소될 수 있는데, 단일 롯트 단위 버전은 세포 성장 표면, 전달관, 배지 및 시약, 그리고 기계적인 부분 및 가열/냉각, 배지 이송 및 자동화된 프로그램 사이클의 실행을 위한 컴퓨터 처리능을 수용하는 영구 베이스로 구성되는 일회용 부품으로 구성된다. 접수 시, 각각의 멸균 조사 ACE 일회용 단위의 포장을 풀어서 미리 채워진 백(bag)들에 걸고 이들 백들을 무균 연결기를 통해 존재하는 관에 연결함으로써 배지 및 시약과 함께 로딩한다. 과정은 다음과 같이 계속된다:

생물학적으로 안전한 캐비넷(BSC) 내에, 효소 소화된 생검으로부터 얻은 세포들의 현탁액을 항체들을 포함하는 시작 성장 배지로 이미 채워져 있는 "성장전 챔버(pre-growth chamber)"(셀 타워의 상단 위의 작은 단위) 내에 도입한다. BSC로부터, 일회용 단위는 이미 놓여 있는 영구 ACE 단위로 이송될 것이다.

약 3일 후, 성장전 챔버 내의 세포들을 트립신화하여 완전 성장 배지들로 미리 채워져 있는 셀 타워 자체 내로 도입한다. 본원에서, CO₂ 주입으로 야기되는 "버블링 작용(bubbling action)"은 세포들이 하방 소용돌이를 일으켜서 편평하게 분포되는 방식으로 디스크들의 표면 위에 쌓이는 속도로 순환하는 배지에 작용한다.

약 7일 동안, 세포들이 증식되도록 한다. 이 때, 배양조직이 성장하는 것을 입증하기 위해 융합을 (본 발명의 작성 시점에 알려지지 않은 방법으로) 체커할 것이다. 또한, 이 때, 완전 성장 배지를 신선한 완전 성장 배지로 교체할 것이다. CGM을 3주 내지 4주 동안 7일 마다 교체할 것이다. 배양 기간의 마지막에, 의도한 치료를 위해 원하는 양의 세포들을 생산함직한 충분한 성장이 있다는 것을 입증하기 위해, 융합을 체크한다.

배양 조직이 충분히 융합되면, 채취한다. 소모된 배지(상청액)을 용기에 내보낸다. 이 후, PBS를 용기로 펌핑(배지를 세척하기 위함, 세포들로부터 FBS)하고 거의 즉시 배출한다. 트립신-EDTA를 용기로 펌핑하여 성장 표면으로부터 세포들을 떼어낸다. 트립신/세포 혼합물을 용기로부터 배출하고 스핀 분리기를 입력하라. 극저온 방부제를 용기로 펌핑하여 디스크의 표면으로부터 잔류 세포들을 세정하고, 또한 세포 분리기로 보낸다. 스핀 분리기는 세포들을 수집하여 출하/주사 배지에 세포들을 균일하게 재현탁한다. 스핀 분리기로부터, 인라인 자동화 세포 카운팅 장치 또는 실험실 분석을 통해 세포 카운트 및 생존율 검사를 위해 수집된 시료를 통해 세포들을 보낼 것이다. 특정 수의 세포들이 카운트되었고 적당한 세포 농도에 도달되었으면, 극저온 냉동을 위해 시료들을 부분표본화하기 위해 제거될 수 있는 수집 바이알로 채취된 세포들을 옮긴다.

대안적으로, 이 과정의 전체 및 일부 동안 세포 공급, 옮기기, 및 채취를 수행하기 위해 자동화된 로봇 시스템이 사용될 수도 있다. 세포들은 소화 및 T-175 플라스크(또는 대체재)로 살포 후 직접 로봇 장치로 도입될 수 있다. 이 장치는 세포들을 인큐베이트하고, 세포 카운트 및 생존율 분석을 수행하고, 더 큰 배양 용기로 공급 및 이동을 수행할 수 있다. 이 시스템은 또한 개별적인 롯트들을 추적하기 위해 전산화된 카테고리 기능을 가질 수도 있다. 존재하는 기술 또는 주문형 시스템이 로봇 옵션을 위해 사용될 수 있다.

D. 용량 단위

최종 용량 단위를 제조하기 위해 사용된 원액(Cryovial)는 최종 배양 용기로부터 채취되고, 원하는 세포 농도로 제형화되고, 크리오바이알에서 극저온 보관된 아섬유들로 구성된다. 원액(Crovial)는 2.2 x 10⁷ 세포/mL의 목표값까지 IMDM 및 Profreeze^TM+7.5% DMSO로 구성된 극저온보존 배지에 저장된다. 속도 조절된 냉각 사이클에 노출 후, 크리오바이알에 담긴 원액은 액체 질소 냉동기에 기체 상태에 냉동되어 보관된다.

채취된 세포들은 모아져서 Profreeze, DMSO 및 IMDM 배지를 포함하는 극저온보관 배지에 제형화되고, 크리오바이알들로 부분표본화되고, 속도 조절된 냉각을 통해 원액(Crovial) 물질로서 액체 질소로 냉동되어 보관된다.

캡과 바이알은 방사선 멸균되고 제조업자에 의해 멸균처리된다. 치료를 위해 필요한 요구되는 용적의 벌크 물질은 냉동 저장, 해동 및 모으기로 제거된다. 세포들을 4배 벌크 용적의 PBS로 세척하고 10분 동안 150xg로 원심분리한다(5±3℃). 이후, 세포들을 4배 벌크 용적의 DMEM으로 세척하고 10분 동안 150xg로 원심분리한다(5±3℃). 세척된 세포들을 페놀 레드 없이 DMEM에서 1.0~2.0 x 10⁷ 세포/mL의 목표값까지 재현탁한다. 대안적으로, 제2 4회 세척 및 최종 재현탁은 Hypothermosol®-FRS로 수행될 수 있다(BioLife Solutions, Bothell, WA). 이후, 최종 멸균 크리오바이알 용기들을 용기 당 1.2 mL의 용적까지 생물학적 안전 캐비닛에 수동으로 채운다. 약 제품- 투여 부위까지 2~8℃로 냉장되는 운송장치(shipper)에 선적될 때까지 주입액은 2~8℃에서 저장된다.

대안적으로, 원액 바이알들을 극저온저장고에서 꺼내어 희석 및 투여를 위해 투여 부위에 직접 투여할 수 있다. 직접 주사 개념에서, 세포들은 현재 목표인 2.2 x 10⁷ 세포/mL 더 높은 세포 농도(3.0~4.0 x 10⁷ cell/mL)로 극저온보관을 위해 채취되어 제조된다. 주사 중일 때, 냉동된 바이알은 드라이 아이스 또는 액체 질소 듀어병으로 연구부위까지 적하될 것이다. 투여 부위는 손이나 히트 블록으로 바이알을 해동하고, 세균 발육 억제수, 멸균수, 염화나트륨, 또는 인산염 완충 식염수와 같은 통상적인 주사 희석제를 사용하여 연구 부위에서 냉동된 세포들의 1 비율의 희석을 수행한다.

대안적으로, DMEM은 희석제로 사용될 수 있다. 이 개념은 연구 부위까지 밤새 출하를 위해 주사액의 신선한 현탁액을 세척하고 제조할 필요를 없앤다.

대안적으로, 플라스크로부터 신선하게 채취된 세포들 또는 세포 스텍들은 DMEM에서 1.0~2.0 x 10⁷ 세포/mL의 목표 농도로 조절될 수 있고, 위에서 설명된 모든 벌크 채취 및 원액-Cryovial 검사를 받아서 최종 주사 제품으로 2~8℃ 냉장되는 보관장치에 투여부위까지 밤새 신선하게 선적될 수 있다. 이러한 시나리오에서, 멸균 및 마이코플라즈마 검사는 선적에 앞서 결과들에대한 시간을 허용하는 채취로부터 거슬러 올라가서 수행될 수 있다.

II . 투여방법

A. 용량 단위의 제조

Azficel-T Azficel-T 약물 제품-주사제는 페놀 레드 없이 둘베코의 변형된 독수리의 배지(DMEM)로 제형화된 각 환자 자신의 살아있는 자가이식 아섬유의 현탁액으로 구성된다.

Azficel-T 아섬유 용량 제형은 2개의 2 mL 바이알로서 공급되고, 각 바이알은 1.2 mL의 약물 제품을 1mL 당 1.0~2.0x10⁷개 세포들을 함유하고 있다. 멸균 세포 현탁액은 피내 주사를 위한 것이다. 초기에, Azficel-아섬유 용량 제형을 위한 세포 용량은 FDA에 의한 Azficel-T 아섬유 용량 제형의 조절 전 임상의가 투여한 세포들의 수에 기반하였다. 1mL 당 1.5~7.0x10⁷개 세포 범위의 복용량 주사가 성공적으로 사용되었다. 점성은 이 범위보다 고농도에서 아섬유 용량 제형 주사를 위한 관심이 되었다. 이 복용량 범위는 1mL 당 1.1~5.8ⅹ10⁷개 세포들로 변환되었다.

IND하 1차 임상시험에서, 1 mL당 0.5~3.0ⅹ10⁷ 세포들이 제형화되었다. 2차 임상시험에서, 1 mL 당 1.0~3.0ⅹ10⁷ 세포들이 제형화되었다. 후속의 모든 임상시험을 위한 표준 방출 명세는 1mL 당 1.0~2.0ⅹ10⁷ 세포들이었다.

나중의 임상 시험, IT-R-005 및 IT-R-006에서, 1 mL당 1.0~2.0ⅹ10⁷ 세포들까지 제형화된 2개의 2.0 mL 크리오바이알 각각에 1.2 mL의 아섬유 용액이 제공되었다. 제공된 2.4 mL 중, 2.0 mL는 안면의 양측에서 총 20 cm의 최대 예상 코옆 주름 길이에 대해 1선형 cm 당 0.1 mL의 용량으로 주사를 위한 것이었다. 0.2 mL의 초과량은 1을 보장하기 위한 것이었다. 1.0 mL는 코옆 주름의 10 선형 센티미터까지 치료하기 위해 바이알로부터 얻어질 수 있다.

B. 용량 단위의 투여

바이알들을 상온까지 데워서 부드럽게 하여 침전된 세포들을 재현탁하였다. 부착가능한 바늘 또는 고정된 바늘을 갖게 맞추어진 소단위 주사기를 사용하여 용기로부터 세포 현탁액을 회수하였다. 더 나은 주사 조절 및 감염의 위험을 줄이기 위해, 짧고, 날카로운 바늘 및 소단위 주사기(예를 들어, 0.5 mL 인슐린 주사기)의 사용이 추천된다. 제품의 피내 주사를 위해 29-게이지 또는 30-게이지 바늘이 요구된다. 그러나, 더 큰 구멍, 즉 21-게이지의 탈착가능한 바늘을 가진 주사기가 용기로부터 제품을 회수하는 것을 돕기 위해 사용될 수 있다. 일단 회수되면, 21-게이지의 바늘은 30-게이지 바늘 및 투여될 제품으로 전환될 수 있다.

배치(batch)는 세 가지 주사액 치료들로 구성된다. 코옆 주름의 치료를 위해, 한 번의 주사 치료(배치)는 바이알당 1.2 mL의 azificelAzificel-T 아섬유 용량 제형을 함유하는 두 개의 2 mL 바이알을 요구한다.

C. 치료 조건

피부의 노화과정은 내인성 및 외인성 인자들 모두의 결과로서 일어난다. 내인성 또는 자연적 노화에 기여하는 인자들은 구조적 및 기능적이다. 구조적으로, 상피는 얇아지고, 각질세포(corneocyte)는 덜 부착되고, 표피-상피 접합은 평평해진다. 기능적으로, 아섬유들의 수 및 생합성 용량이 감소하고 표피는 위축되고 상대적으로 무세포 및 무혈관이 된다. 자외선 복사에 대한 노출은 외인성 또는 광노화의 주요 원인이다. 외인성 노화 특성은 탄력 상실, 거칠기 및 건조도 증가, 불규칙한 색소침착, 깊은 주름, 가죽 같은 외모, 물집 형성 및 상처 치료 기능 저하이다. 노화, 특히 안면 주름의 가시적 외형은 환자들이 감소시키고자 하는 공통적 효과이다. 안면 선, 주름의 치료를 위한 옵션들은 외과적 수술, 신경독, 필러, 레이저, 비침습성 치료, 미세연마 및 화학적 필(peel)을 포함한다. 이들 치료들 중 많은 것은 노화 신호의 치료에서 안정성, 효능, 및 효과의 지속성이 변화된다. 본원에 기재된 제형은 피부에서 콜라겐 생성 세포의 수를 증가시켜 피부의 개선을 위한 다원적 효과를 가질 수 있는 것으로 믿기어진다.

윤곽 기형의 치료를 위한 자가이식 인간 아섬유의 사용은 Hackensack 대학 의료센터의 성형수술과의 부의장인 William K. Boss 의학박사가 개척하였다. 피부 치료의 분야에서 그의 일은 1992년에 시작되었다. 그는 환자의 손목으로부터 작은 피부 조각을 제거하여, 생검으로부터 자가이식 아섬유를 배양하고, 이 자가이식 세포들을 환자 손목의 피부의 주름으로 주입하여, 시간에 따라 주름이 사라지는 것을 관찰하였다. 그는 수년 동안 순차적으로 그 부위를 관찰하였고 검사 부위 주름이 보정되었음에 주목하였다. 이 단일 치료에 대한 역반응은 없었다.

1995년 3월에 작은 임상시험이 수행되었다. 초기에, 약 12명의 개체들에게 자가이식 배양된 아섬유를 선택된 원치않는 주름 및 흉터에 2회 내지 3회 주입하였다. 12개월의 후속조치 후, 각 개체에서 점진적인 개선이 나타났다. Boss 박사 및 Marko 박사는 2년 반의 관찰 기간 동안 알러지 또는 역반응의 징후가 없는 100명 이상의 환자들을 치료하였다고 보고하였다. 1995년 12월에, 자가이식 아섬유는 미국에서 상업적으로 이용가능하게 되었다. 미국의 상업적인 경험은 안면 주름, 흉터, 발육부전 입술, 화상 및 기타 문제들을 가진 환자들을 치료한 피부과학, 안면 성형, 및 복원 성형의 분야에서 약 100명의 의사들을 포함하였다. 거의 1,000명의 환자들의 보고된 환자 경험이 있는데, 그 중 354명은 사실에 관한 소급적 보고서의 효능군으로 포함되었다.

눈에 띄는 안면 주름 및 움푹 들어간 안면 흉터의 치료를 위한 아섬유 세포 현탁액의 피부내 주사를 사용한 파일럿 연구는 UCLA 대학에서 10명의 건강한 성인들에 대해 수행되었다. 3주 간격으로 수행된 2회의 주사 기간 뒤, 10명의 환자 중 9명이 이 치료로 60~100%의 개선을 나타내었다; 유사한 관찰은 의사에 의해 이루어졌다. 광학 측정(레이저)에 의해 치료된 모든 기형의 크기가 10~85% 감소된 것으로 나타났다. 미시적으로, 상피츠의 두께 및 밀도가 증가하였다는 증거가 있었다.

연구들은 피부의 윤곽 기형으로 아섬유 세포 현탁액의 주사가 손상된 상피 및 피하 조직의 보정에 이를 수 있다는 것을 보여주었다. 피부의 진피는 피부에 대한 역학적 강도 및 일체도를 제공하는 콜라겐 및 엘라스틴과 같은 세포외 기질 성분들의 분비에 주로 책임이 있는 아섬유를 포함한다. 정확한 메커니즘은 알려져 있지 않지만, 아섬유 세포 현탁액은 환자 피부로 주입시 세포외 기질 성분들의 합성을 증가시켜서 피부 일체도를 증가시키고, 궁극적으로는 미세 선 및 주름의 감소로 이어질 수 있는 자가이식 아섬유를 함유한다. 치료의 효과는 즉각적이지 않지만, 대신 시간에 따라 선 및 주름의 외형에서 점진적인 개선을 제공한다.

아섬유 세포 현탁액은 처음에 1995년에 William Boss 박사가 수행한 임상시험에서 평가되었고, 이후 1995년 12월부터 1999년 2월까지 안면 윤곽 기형을 위한 미용 치료로서 미국에서 상업화되었다. 1999년 2월 이후, FDA는 PHS 법률 하에서 모든 체세포 치료를 규제하도록 요구받았다.

아섬유 현탁액이 새로운 새로 및 조직 규제 하에 해당한다는 FDA 통지시, 상업적 배포는 중단되었고 임상시험허가신청(Investigational New Drug Application (IND)) #8641하에서 임상 발전이 시작되었다. 두 가지 제 2상 임상 시험(시험 IT-R-001과 IT-R-007) 및 5가지 제 3상 임상시험(시험 IT-R-002, IT-R-003A, IT-R-003B, IT-R-005, 및 IT-R-006)에서 안면 주름의 치료를 위한 시험들이 수행되었다. 시험 IT-R-003A, IT-R-003B, IT-R-005 및 IT-R-006은 아섬유 세포 현탁액의 안전성 및 효능 프로파일을 나타내는 강력하고 잘 조절된 데이터를 제공한다. 아섬유 세포 현탁액은 여드름 흉터의 치료에서 시험되었다(시험 IT-A-008: IND #13455).

99 개체들은 시험 IT-A-008 동안 아섬유 세포 현탁액으로 치료를 받았다. 아섬유 세포 현탁액은 또한 제한적인 화상 흉터(ND #13308), 성대 흉터(IND #9892) 및 치은 치료(IND #10805)를 포함하는 징후에서의 사용을 위해 개발되었다.

초기의 001 및 002 시험은 003 A/B의 설계를 안내하는 지원적, 예비적 데이터를 제공하였고, 005/006 시험 연구 IT-R-001은 원치않는 주름의 치료(코옆 및 입가 주름, 입주위선, 미간선, 여드름 흉터, 및 이마가 치료되었음)를 위해 아섬유 세포 현탁액의 제 2상 맹검, 무작위, 및 플라시보-조절 연구였다. 급성 시험에서, 각 개체는 세 가지의 아섬유 세포 현탁액(1mL당 0.5ⅹ10⁷ 세포, 1.0ⅹ10⁷ 세포, 2.0ⅹ10⁷ 세포) 또는 플라시보의 치료를 받았고, 약 2주 간격으로 투여받았다. 개체들(40)은 급성 시험에서 아섬유 현탁액(N=30) 또는 플라시보(N=10)로 치료받았다.

시험 IT-R-002는 안면 윤곽 기형 및 흉터의 치료를 위한 아섬유 세포 현탁액의 제2상 맹검, 무작위 및 플라시보-조절 시험이었다. 이 시험의 급성 상에서, 각 개체는 14±7일 마다 투여된, 1mL당 2.0ⅹ10⁷ 세포들 또는 플라시보를 함유한 아섬유 세포 현탁액의 세 가지 치료를 받았다. 개체들(151)은 시험의 급성 상에서 아섬유 현탁액(N=112) 또는 플라시보(N=39)로 치료받았다. 양 시험에 걸쳐서, 개체들(213)은 시험의 급성 상에서 아섬유 현탁액(N=100) 또는 플라시보(N=113)로 치료받았다.

시험 IT-R-003B가 코-프라이머리(co-primary) 종점 둘 다를 위해 효능을 보였지만, (시험자 평가를 위해) 통계적 중요성을 위한 기준을 충족시키는 시험 IT-R-003 A에서 공동-1차 종점들 중 하나의 실패는 아섬유 세포 현탁액(시험 IT-R-005 및 IT-R-006)에 대한 중심이 되는 제3상 시험으로서 두 가지 새로운 프로토콜로 이어졌다.

003 A에서 놓친 종점에 대한 이유들은 차선의 복용량을 포함했던 것으로 생각된다. 세포들의 농도는 동일하게 유지되었지만, 전달된 용적은 증가되었다. 훈련 기술 및 연속 주사들 간 시간을 포함하는 다른 이유들도 확인되었다. .

시험 IT-R-005 및 IT-R-006은 코옆 주름의 치료에서 아섬유 세포 현탁액의효능 및 안전성의 제3상 다기관, 이중맹검, 무작위, 플라시보-조절 시험이었다. 이들 시험들은 FDA SPA 계약을 받은 동일한 프로토콜 하에서 수행되었다. 이 시험의 급성기에서, 각 개체는 5주±1주 마다 투여된, 1mL당 1.0~2.0ⅹ10⁷ 세포들 또는 플라시보를 함유한 아섬유 세포 현탁액의 세 가지 치료를 받았다. 시험 IT-R-005에서, 83 개체들은 아섬유 세포 현탁액 치료를, 92 개체들은 플라시보를 치료받았다. 시험 IT-R-006에서, 98 개체들은 아섬유 세포 현탁액 치료를, 99 개체들은 플라시보를 치료받았다.

시험 IT-R-007은 코옆 주름 이외의 사용을 위해 아섬유 세포 현탁액의 사용을 위한 안전성 및 효능 데이터를 얻도록 설계된, 안면 주름의 치료에서 아섬유 세포 현탁액의 안전성 및 효능의 제 2상 다기관, 공개 시험이었다. 이 시험의 급성기에서, 각 개체는 5주±10일 마다 투여된, 1mL당 1.0~2.0ⅹ10⁷ 세포들을 함유하는 6 mL까지의 아섬유 세포 현탁액의 두 가지 치료를 받았다. 이 시험의 급성기 동안, 45 개체들은 아섬유 세포 현탁액으로 치료 받았다. 이 시험은 개체들을 005/006 시험에서 사용된 것보다 3배 더 높은 아섬유 세포 현탁액의 총 복용량에 노출시켰다.

이 개체군들은 아섬유 세포들의 제 3상 중심 효능 시험으로 기재되었다. 시험 IT-R-005 및 IT-R-006 (005/006)은 50세와 60세 사이의 백인 여성이 주였다. 개체들의 나이는 23~82세로서 평균 나이는 56.1세였다. 시험으로 등재시 개체들의 코옆 주름의 심각도는 평가자 주름 심각도 평가시 3~5 등급 범위였고, 우측 주름의 경우 평균 3.7, 좌측 주름의 경우 평균 3.6의 등급이었다.

제 3상 IT-R-003A 및 IT-R-003B (003A/B) 시험에 등록된 군들은 005/006이 군들과 유사하였다. 003A/B 시험에서 군의 94%는 여성으로 구성되었고, 95%는 백인이었다. 두 시험에서 개체들의 평균 연령은 54.1세였다. 003A/B 프로토콜은 그 설계가 005/006 프로토콜과 매우 유사하지만, 003A/003B는 더 넓은 범위의 주름 심각도를 가진 개체들의 등록을 허용하였는데, 등록시 주요한 코옆 주름 기형은 평가자 스케일에서 2~5 등급 범위였고, 평균 심각도 스코어는 3.9로 유사하였다.

모든 중심적 효능 시험들은 개체 자신 평가 도구 및 임상 시험자에 의한 평가로 구성되는 공동-1차 종점을 사용하였다.

005/006 시험에서, 공동-1차 효능 종점들은 다음과 같았다:

개체 주름 평가: 베이스라인과 비교시 반응이 2점으로 정의되거나 스케일의 더 나은 개선이 있는 경우, 5-점 주름 평가 스케일을 사용하여 비지트 6에서 안면의 하부의 주름들의 개체의 유효한 전반적인 평가.

평가자 주름 심각도 평가: 베이스라인과 비교시 반응이 2점으로 정의되거나 스케일의 더 나은 개선이 있는 경우, 포토가이드가 있는 6-점 목 주름 심각도 스케일을 사용하여 비지트 6에서 움직이지 않는 양측 코옆 주름에 대한 맹검 평가자의 유효한 평가. 이들 종점들은 공정한 평가(맹검 의사에 의한 등급화) 및 임상 타당성(그들 자신의 외모에 대한 개체의 의견) 양자를 제공하도록 선택되었다. 평가자 주름 심각도 평가를 위해 사용된 스케일은 Lemperle 등에 의해, Plast Reconstr Surg. 2001 108(6): 1735-50)에서 개발되고 입증된 코옆 주름(NLF)의 평가를 위한 6-점 목 주름 심각도 스케일이었다. Lemperle 스케일은 코옆 주름의 심각도의 1점 개선을 검출하기 위해 인증되었다.

그러나, 외모 평가는 주관적일고 가변적이기 쉽기 때문에, 이 종점을 위한 성공은 각 NLF에 대해, 즉, 제공된 환자에 대해 2점 개선으로 정의되었고, 좌측 및 우측 NLF는 응답자로 여겨지도록 평가자의 평가에서 2점 만큼 개선되어야만 하였다. Lemperle 스케일은 피부학의 분야에서 허용된 측정 표준이고, 유사 징후들에서 FDEA-승인 제품들에 대한 중심이 되는 임상 시험들에서 성공적으로 채용되었다.

개체 주름 평가를 위해 사용된 스케일은 Cohen 및 Holmes가 Plast Reconstr Surg. 2004 15; 114(4): 964-76에서 사용한 공개된 스케일에 기반을 두고 있다.평가자 평가를 갖는 것으로서, 2점 개선은 치료에 대한 성공적 반응을 위한 기준으로 확립되었다.

003 A/B 시험은 유사한 공동-1차 종점들을 갖고서 설겨되었지만, 005/006 시험과는 다른 개체 평가 도구를 사용하였다. 003 A/B 프로토콜에서 언급된 바와 같이. 공동-1차 효능 종점은 시험자의 6-점 목주름 스케일 및 개체의 VAS 평가를사용하여 6개월 비지트에서 1차 코옆 주름에서의 아섬유 복용량 제형 주사의 효능이다.

005/006 시험이 003A/B 시험에서 사용된 것보다 척도 상 각 점에 대하여 더설명적인 텍스트를 제공하였지만, 프로토콜에 언급된 6-점 서열 척도는 005/006 시험에서 사용된 동일한 Lemperle 척도이다. 시각적 유사 척도가 개체 평가를 위해 사용되었다. 이 척도는 마크를 10 cm 선 상에 둠으로써 개체들에게 각 윤곽 기형을 0(무결함)에서부터 100(매우 심각한 결함)까지 순위를 정하도록 요청하였다. 양 시험들은 이러한 평가 도구를 사용한 개선을 위한 통계적 중요성을 충족시켰지만, VSA 척도는 개체 데이터의 임상 적합성 및 영상해석능력을 개선하기 위해 005/006 시험에서 개체 주름 평가 순서 척도로 대체되었다.

005/006 양 시험의 결과들은 공동-1차 종점들 양자에 의해 측정된 바와 같이, IT-치료 및 플라시보 처리된 개체들 간 반응에서 매우 상당한 차이를 나타내었다.

003 A/B 시험에서, 네 개의 종점들 중 세개의 경우, IT-치료된 개체와 플라시보 치료된 개체 간 반응에서 통계적으로 상당한 차이들이 관찰되었다. IT-R-003A 시험에서, IT-치료된 개체들의 더 많은 비율이 플라시보 처리된 개체들보다 평가자 평가에 의한 응답자로서 기록되었지만, 차이는 통계적 중요성을 충족하지 못했다.

IT-R-005 및 IT-R-006 시험들은 동일한 시험 프로토콜을 사용하여 동시에 운용되었고, 그래서 시험 설계에서의 차이는 없었다. IT-R-003A 및 IT-R-003B 시험은 별도의 프로토콜 하에서 동시에 운용되었다. 그럼에도 불구하고, 각 시험 그룹에서 결과 차이는 없었다. 모든 1차 종점들은 005/006 시험에서 성공적으로 충족되었지만, 005 시험은 개체 및 평가자 평가에서 아섬유 세포 현탁액 치료군의 각각 57%와 33%이 응답자로서 보고하였었고, 006 시험은 동일 척도에서 응답자 비율이 각각 46% 및 19%로 보고하였다. 003A 시험에서, IT-치료된 군에서 개체의 21%가 평가자 평가에서 응답자로서 기록되었고, 반면에 아섬유 용량 제형 군에서 개체들의 48%가 이 척도에 따라 IT-R-003B 시험에서 응답하였다.

005/006 시험에서, 두 시험들 간에 환자 인구통계(성, 종족, 나이 또는 베이스라인 심각도)에서 중요한 차이는 주목하지 않았다. 그러나, 응답율의 가변성은 각 시험에서 부위에 따라 관찰되었다. 그 후, 참여한 모든 시험자들은 동일한 기술을 사용하여 코옆 주름 주입을 수행하도록 훈련되었고, 유두 진피 내로의 주사에 대해 예상한 바와 같이, 이들이 "피부발진(wheal)"을 발생시켰을 것이라는 것을 입증하는 것이 예상되었다. 이는 IT-R-003 시험들에 앞서 이루어지지 않았다. 평가 방법들에서 차이도 관찰되었다. 이들 관찰들과 결합시, 부위 차이는 부위들간 많은 불일치가 주사 기술과 평가 양자에서의 공통적 훈련의 부족에 의해 야기될 수 있었다는 결론으로 이어졌다.

005/006 시험은 003 A/B 시험으로부터 얻은 데이터의 검토 및 분석 후 설계되었다. 이러한 검토 결과, 003 A/B 시험에 비해, 005/006 프로토콜의 설계에서 수 많은 변경들이 이루어졌다. 1차 종점들의 결과에서 관찰된 차이에 기여할 수 있었던 변경들의 요약이 표 6에 제공된다.

1회 투여량 및 투여 방식의 영향

원치않는 안면주름 및 코 옆 주름

코 옆 주름의 치료를 위해 선택된 1회 투여량(선형 1cm 당 0.1 ml로 투여된, 1mL 당 1.0~2.0ⅹ10⁷ 세포 2mL까지)은 IND 8641 하에서 수행된 임상 시험들에서 생긴 데이터뿐만 아니라 미국 및 외국 모두에서 아섬유 용량 제형의 상업적 사용을 통하여 얻어진 정보에 기반한다.

IT-R-001 시험은 선형 1cm 당 0.1 mL로 0.5, 1.0 및 2.0ⅹ10⁷ 세포로 아섬유 세포 현탁액 대 안면 주름의 치료에서 안전성 및 예비 효능에 대한 플라시보를 평가한 플라시보-조절 제 2상 투여량 범위 시험이었다. 가장 높은 투여량 군(1mL 당 2.0ⅹ10⁷ 세포)에서 초기 주사(IT-R-001에 대한 1차 효능 시점) 후 4개월까지 베이스라인은 최상의 결과를 제공하였다. 따라서, 이는 모든 후속 시험들에서 사용된 세포들의 밀도였다.

003 A/B 시험에서, 선형 1 cm당 투여량은 이 요법(선형 1 cm당 0.1 mL)에 대한 다른 azificel-T 아섬유 용량 제형 시험에서 사용된 것과 동일하였다. 그러나, 각 치료에 대한 총 투여량은 총 10cm의 전체 치료 영역에 대해 1 mL로 제한되었다. 이러한 차이는 003 A/B 시험이 턱 쪽을 향한 입의 구석으로부터 아래로 연장된 주름인 때때로 입가주름이라 부르는 것의 치료를 고려하지 않았기 때문이다. 입가 주름은 종종 코옆 주름과 연속적이어서 전체 미적 결과에 기여하는 요소이기 때문에, 총 투여량은 입가 주름의 치료를 허용하도록 005/006에서 2 mL로 증가되었다. 허용된 총 투여량은 003A/B 프로토콜 및 005/006 프로토콜 간 유일한 차이이기는 하지만, 투여된 제품의 용적에서 이러한 증가는 005/006 시험으로부터 얻어진 성공적 결과에서 기여 인자인 것으로 여겨진다.

5주±1주의 추천된 투여량 간격은 003 A/B 시험 및 005/006 시험의 결과로부터 시험자들이 제공한 피드백을 근거로 결정되었다. 003 A/B 시험자들은 그러한 시험들(7~14일)에서 치료들 사이의 시간은 다음 주사의 투여 전 약해진 한 번의 주사에 의해 유도된 염증을 허용하기에 불충분하였다는 아이소라겐(Isolagen)을 충고하였다.

이러한 염증 지속기간은 주사 과정 동안에만 주목하였고 부작용으로 보고되지 않았다. 프로토콜이 허용한 더 긴 간격으로 순차적으로 주사를 투여시, 시험자들은 주사 부위들이 정상 피부에 더 가깝게 보일 것 같았고, 이는 주사의 깊이 및 용량 모두의 더 큰 조절로 이어졌다고 보고하였다. 이는 1주 내지 4주, 이후 5주±1주의 005/006 시험에서 주사들 간 간격을 더 길게 하는 것으로 이어졌다. 이러한 변화는 또한 성공적인 005/006 시험 결과들에서 기여 인자인 것으로 여겨진다.

005/006 시험에서 군을 치료하는 의도의 1차 효능 분석은 공동-1차 효능 종점들에 의한 측정시 아섬유 세포 현탁액 및 플라시보 처리군들 사이의 치료 반응을 평가하였다. 비지트 6(공동-1차 효능 종점)에서 평가자 주름 심각도 평가의 경우, IT-무작위 개체들이 26% 대 플라시보-무작위 개체들의 7%가 양측 코옆 주름에 대해 2-점 개선을 보였다. 아섬유 세포 제형 또는 플라시보로 적어도 한 번의 치료를 실제로 받은 개체들만 분석((MITT) 군을 치료하려는 변형된 의도)에 포함될 때, 평가자 주름 심각도평가에 대한 2-점 반응의 백분율은 플라시보-치료된 개체들의 경우가 8%인데 비하여, IT-치료된 개체들에서 30%를 초과하였다. 평가자 주름 심각도 평가시 MITT 군에서 1-점 반응율은 아섬유 용량 제형으로 치료된 개체들에서 64%였고, 플라시보로 치료된 개체들에서 36%였다.

마지막으로, IT의 사용으로 관찰된 효과의 미묘한 개시의 표시에서, 평가자와 개체들 양자에 의한 효능의 사진 평가는 IT-치료된 개체와 플라시보-치료된 개체들 간 치료 반응에서 통계적으로 매우 상당한 차이를 보였다. 최종 효능 방문에서 찍은 사진들과 나란히 있는 베이스라인에서 찍은 개체의 사진들을 평가자가 비교했을 때, MITT 군에서 IT-치료된 개체들의 57% 및 이 군에서 플라시보-치료된 개체들의 20% 초과 개체들은 개선된 것으로 나타났다. 개체들이 그들 자신의 베이스라인 사진들을 최종효능 방문에서 찍은 사진들과 비교한 경우 환자의 사진 평가(개체 개선 평가)시, IT-치료된 개체들 중 67% 및 플라시보-치료된 개체들의 26%가 개선을 보였다.

실황 평가 결과와 비교시 이러한 평가 도구를 사용한 반응율의 증가는 미묘하고, 점차적인 효과의 개시를 나타내고, 이는 외모가 베이스라인과 비교되기까지 개체들 또는 평가자들에게 분명하지 않을 수 있다.

요약하면, 위에서 논의된 이유들 때문에, 코옆 주름의 치료를 위해 바람직한 용량은 치료 기간마다, 바람직하게는 5주±7~10일 분리된 세 번의 치료 기간동안 용량 제형의 1 내지 2 mL를 선형 1 cm당 0.1 mL의 투여량 분포로 표층의 유두 진피 내로 주사하는 것이다.

다수의 안면 영역들(즉, "전체 안면(full face)")에서 원치않는 주름의 치료를 위한 바람직한 용량은 치료 기간마다, 바람직하게는 5주±7~10일 분리된 한 번 또는 두 번의 치료 기간동안 용량 제형의 5 내지 6 mL를 선형 1 cm당 0.05 mL의 투여량 분포로 도 4의 치료 맵에 따라서 표층의 유두 진피 내로 주사하는 것이다.

여드름 흉터

여드름 흉터의 치료를 위한 적절한 용량은 객관적이고, 의사가 평가한, 여드름 흉터 심각도의 현재 등급화를 위해 입증된 방법 및 척도, 즉 도 2를 참조하여 직접 및 접선 조명 하에서 상대적 흉터 외형의 비교 평가를 채용한 "평가자 라이브 여드름 흉터 평가 척도"를 사용하여 결정될 수 있다

평가자 라이브 여드름 흉터 평가 척도

등급	항목	설명
0	깨끗	치료 부위에서 함몰은 보이지 않음. 반점성 변색이 보임.
1	매우 가벼움	직접 조명으로 하나의 함몰이 쉽게 눈에 띔(깊음). 보이는 함몰들 대부분 또는 전부는 접선 조명으로 쉽게 뚜렷해짐(얕음).
2	가벼움	소수이지만, 모든 함몰들의 반 미만이 직접 조명으로 쉽게 눈에 띔(깊음). 보이는 함몰들 대부분은 접선 조명으로 단지 쉽게 뚜렷해짐(얕음).
3	보통	반을 넘어선 함몰들이 직접 조명으로 뚜렷함(깊음).
4	심함	병변들 전부 또는 거의 전부가 직접 조명으로 볼 수 있음(깊음)

Layton 등이 Leeds General Infirmary에서 수행한 시험에서, 여드름 흉터의 심각도는 위축성 및 비대성/켈로이드 모양의 흉터의 병변 카운트로 평가되었다.

위축성 흉터-형태적으로 얼음 깨는 송곳으로 정의됨, 반점이 있는 위축성 또는 소낭모양의 반점이 있는 위축성-각각 1~5, 6~10, 11~25, 26~50, 51~100 및 100개를 초과하는 흉터 범위의 기록으로 이해됨.

얼음 깨는 송곳 형태의 흉터들은 불규칙한 경계, 뾰족한 에지 및 날카로운 마진을 가진 것들로서, 가파른 사이드는 섬유증의 베이스로 이어지는 것들로서 설명되었다. 반점이 있는 위축성 흉터들은 부드러워졌고 팽창될 수 있었는데, 여기서 베이스는 종종 쉽게 주름이 졌다. 소낭모양의 반점이 있는 위축성 흉터들은 작고, 하얀 모낭주위의 구진 또는 반점들이다. 발명자들은 별도로 자신들의 더 심한 미관손상 때문에 켈로이드상 및 비대성 흉터들을 정량화하였다. 2, 4, 및 6의 스코어 할당은 1 내지 3, 4 내지 7, 및 7을 초과하는 이러한 유형의 흉터들을 각각 나타낸다. 켈로이드상 흉터들은 개시한 염증성 여드름 병변의 경계를 지나서 경화되고 연장된 것들로 설명되었고, 반면에 비대성 염증들은 덜 발생되어 1차 여드름 병변의 부위와 일치하는 것들로서 정의된다. 이 후, 위축성 및 비대성 분류들 모두로부터 스코어를 합산함으로써 총 흉터 스코어가 얻어졌다. 이러한 총 스코어는 안면, 가슴, 및 등에 대해 별도로 계산될 수 있어서 흉터 평가를 위한 전반적인 시스템을 제공할 수 있었고, 또한 효과적인 용량 및 치료 계획을 평가하기 위한 수단을 제공할 수 있었다.

바람직한 실시예에서, 여드름 흉터는 치료 기간마다 2 내지 12 mL의 아섬유 용량 제형을 흉터가 난 부위에 0.1 mL/cm²의 용량 분포로 14일±3일 간격으로 한 번 내지 세 번의 치료 기간동안 표층의 유두진피 내로 주사함으로써 치료된다.

화상

잠재적으로 심각한 심부 피부에 대한 장기 화상의 결과는 손상후 흉터이다. 심각한 화상으로 인한 제한적 흉터의 형성은 영향을 받은 부위의 정상적인 운동을 못하게 하고 운동의 범위를 제한(구부리기, 내전운동(adduction), 및/또는 뻗치기)할 수 있다. 사실상, 기능에 영향을 미치는 화상 흉터 및 구축(contracture)은 가장 낙담하게 하는 화상의 후기 합병증을 여전히 남긴다(Iwuagwu, Plast reconst Surg. 1999 Apr;103(4): l 198-204). 이들 흉터들은 통증과 기능 저하를 야기함으로서 삶의 질에 대해 상당히 부정적인 영향을 줄 수 있다. 흉터의 위치에 따라, 제한적인 화상 흉터들은 상지의 상당한 기능 장애 및 손실로 이어질 수 있다. 아섬유 용량 제형은 상지에 대한 제한적인 화상 흉터의 치료에 특히 유용하고, 구체적으로는 개체가 겪은 신체적 정신적 관련 장애의 정도를 감소시킨다.

제한적 화상 흉터의 치료를 위한 바람직한 용량은 치료 기간 마다 1 내지 10mL의 용량 제형을 흉터 부위에 0.1~0.5 mL/cm²의 용량 분포로, 바람직하게는 2 내지 6주 간격으로 한 번 내지 다섯 번의 치료 기간 동안 촉진된 제한 밴드 내로 주사하는 것이다.

이전에 이용가능한 제형이 사용되었던 영국의 사례 보고는 부작용 없이 화상 흉터 및 상처를 치료한 것을 보여주었다.

런던의 Chris Inglefield 박사는 목, 하부 안면, 눈 및 귀 부분에 다수의 화상을 입은 남자의 사례를 보고하였다. 이전에 이 개체는 안면 주름을 위한 아섬유 제형을 시술받았기 때문에 화상 시점에 저장된 세포들을 갖고 있었다. 이는 그의 초기 상처의 6주 이내에 이 환자의 안면 화상이 치료될 수 있도록 하였다. 그는 이 후 상처 후 3개월 동안 세 번의 추가적인 치료를 받았다. 각 치료는 국소마취 하에서 수행되었고 3~4 ml 세포들로 이루어진 30~40회 주사를 맞았다. 이 개체는 이전에 피부 이식 치료를 받았다. 이 환자는 얼굴 및 목의 운동이 개선되었고, 첫 번째 치료 후 3주 내에 감촉 및 유연성이 개선된 것으로 보고되었다.

인디아나 대학교의 W. Gregory Chernoff 박사 또한 10명의 치료되지 않는 레이저 화상에서 아섬유 제형을 사용하였다. 이들 상처는 아섬유로 치료전 3 내지 9개월의 기간 동안 치료되지 않았다는 사실에도 불구하고, 그는 세포들의 마지막 주사 후 6주에 완전한 치료를 언급하였다(Boss 등, 2000 Clinical Plastic Surgery 27:613-626).

미국에서, 치료되지 않았던 화상 상처를 가진 두 명의 화재 피해자는 아섬유 제형의 특별한 사용으로 이익을 받았다. 오클라호마시 폭탄 희생자는 그 폭발로부터 비참하게 흉터를 입었다. 그녀의 생명을 구하고 피부를 개선하기 위한 두 가지 목적으로 수 개월의 수술, 레이저 박피 및 기타 치료들 후, 그녀는 아섬유 치료를 받았고 그녀가 여전히 얼굴 및 목에 갖고 있는 실패한 피부 이식 및 다른 치료되지 않았던 상처들에 대해 도움을 받았다. 치료되지 않았던 상처들은 치료 후 아물었고 치료되었다. 아울러, 그녀는 흉터의 외형이 개선되었음을 언급하였다.

레이저 화상으로 이마 및 광대 부위에 치료되지 않는 12곳의 상처가 있던 또 다른 개체는 특별 사용 근거로 아섬유 제형으로 치료를 받았다. 그녀가 치료받았던 시점에서 그녀의 유일한 대안은 소의 피부를 이식하는 것이었다. 치료 후, 대부분의 상처들은 주사 6주 내에 치료되었다.

다음 사례 보고들은 아섬유 제형들이 아급성 또는 치료중인 화상 상처뿐만 아니라 장기간에 걸친, 잘 치료되었지만 약화시키는 제한적인 화상 흉터들을 개선할 수 있는 것으로 나타난다.

영국 런던의 Chris Inglefield 박사는 프레젠테이션에서 2년 동안 지속되어 좌측 부분에서 그녀의 안면 표현을 제한하였던 큰 흉터로 귀결되었던 다수의 화상을 갖고 있던 여성의 사례를 보고하였다. 이 환자의 상처는 심리적으로 심각한 부정적 결과를 가졌고 그녀는 자신의 정체성을 잃었다고 느꼈었다. 이 환자는 그녀의 안면에 각 3mL로 세 번의 치료를 받았다. 6 내지 8주 내에, 이 환자, 그녀 가족 및 치료한 의사는 두드러진 개선을 언급하였는데, 그녀 어머니는 그녀의 딸이 되돌아 왔다고 느꼈다. 그녀의 얼굴을 움직이는 능력은 피부 감촉 및 외모에서럼 개선되었다. 동일 환자는 이후 흉터 축소 및 치료되지 않았던 손의 상처에 대한 치료를 받았다. 치료 전 이 환자는 보석 제조 과정에서 작은 물체를 다루는데 어려움을 갖고 있었다. 치료 후 4주 내에 상처들은 치료되었고 그녀는 보석 제조 작업을 수행하기 위한 개선된 능력을 갖게 되었다.

영국 리즈의 Mark Palmer 박사는 목, 어께 및 상지에 10년 동안 지속된 만성 상처를 치료받은 또 다른 환자에 대해 보고하였다. 치료 전에, 이 환자는 목과 어께의 운동 범위를 심하게 제한받았고 만성적 통증을 위해 고통을 없게 하는 아편제를 매일 요구하였다. 이 환자는 그녀의 목 부위에 4mL씩 총 2회의 치료를 받았다. 심지어 첫 번째 치료 후, 이 환자는 운동 및 피부 감촉의 범위가 개선되었음을 보고하였다. 두 번째 치료로, 이 환자의 운동 범위는 정상에 가까웠고 흉터 외형 및 감촉에서 극적인 변화가 언급되었다.

그 후, 동일 환자는 상지 흉터에 대한 치료를 받았다. 치료 전 이들 흉터들은 심각하게 불능상태여서, 고통 때문에 팔을 90° 넘게 들어 올릴 수가 없었다. 그녀의 팔에서 두 곳의 수축된 흉터 띠에 대해 각각 1.5 mL의 1회 치료 후 3개월째에, 흉터는 거의 사라졌고 이 환자는 고통없이 180° 범위의 운동을 회복하였다.

Claims

1mL당 1.0ⅹ10⁷개 세포 내지 2.7ⅹ10⁷개 세포들을 포함하는 용량 제형으로서, 상기 세포들 중 적어도 98%는 자가이식 인간 아섬유 세포들이거나 그의 전구체들이고, 적어도 85%는 생존가능하고, 선택적으로 극저온보존 배지인, 용량 제형.

제1항에 있어서,
Iscove의 변형된 둘베코 베지(IMDM) 및 Pro freeze™ + 7.5% 디메틸 설폭사이드(DMSO)로 구성되는 극저온보존 배지를 포함하는, 용량 제형.

제1항에 있어서,
상기 세포들 중 98% 이상은 아섬유인, 용량 제형.

제1항에 있어서,
1, 2, 3 또는 6 mL를 포함하는, 용량 제형.

1mL당 1.0ⅹ10⁷개 세포 내지 2.7ⅹ10⁷개 세포들을 포함하는 용량 제형의 유효량을 4주 또는 5주±7~10일의 간격으로 2회 또는 3회 치료로 주사하는 것을 포함하는 세포 결함 치료 방법으로서, 상기 세포들 중 적어도 98%는 자가이식 인간 아섬유 세포들이거나 그의 전구체들이고, 적어도 85%는 치료될 부위에서 생존가능한, 방법.

제5항에 있어서,
원치않는 주름, 코옆 및 입가 주름, 입술 주위 주름, 눈가 횡주름, 안와골막 주름, 및 미간 주름의 치료용인, 방법.

제5항에 있어서,
상기 용량 제형을 선형 1 cm당 0.05 mL 내지 0.5 mL로 주사하는 것을 포함하는, 방법.

제5항에 있어서,
각 치료에서 2 mL 내지 6 mL로 주사하는 것을 포함하는, 방법.

제5항에 있어서,
5주±7~10일 간격의 세 번의 치료 기간 동안 치료 기간마다 상기 용량 제형 1 내지 2 mL를 선형 1 cm당 0.1 mL의 투여량 분포로 표층의 유두진피 내로 주사로 투여하는 것을 포함하는 코옆 주름의 치료를 위한, 방법.

제5항에 있어서,
5주±7~10일 간격의 한 번 또는 두 번의 치료 기간 동안 치료 기간마다 5 내지 6 mL를 선형 1 cm당 0.5 mL의 투여량 분포로 표층의 유두진피 내로 주사하는 것을 포함하는 다수의 안면 부위들에서 원치 않는 주름의 치료를 위한, 방법.

제5항에 있어서,
14일±3일 간격의 한 번 내지 세 번의 치료 기간 동안 치료 기간마다 2 내지 12 mL를 상처 부위에 1cm²당 0.1 mL의 투여량 분포로 표층의 유두진피 내로 주사하는 것을 포함하는 여드름 흉터의 치료를 위한, 방법.

제5항에 있어서,
2 내지 6주 간격의 한 번 내지 다섯 번의 치료 동안 치료 기간마다 1 내지 10 mL를 1cm²당 0.1~0.5 mL의 투여량 분포로 화상 흉터의 촉진된 제한 띠 내로 주사하는 것을 포함하는 제한적 화상 흉터의 치료를 위한, 방법.

조직 치료 또는 재생을 위한 다기능 세포들을 제공하는 방법으로서,
1mL당 1.0ⅹ10⁷개 세포 내지 2.7ⅹ10⁷개 세포들을 포함하는 용량 제형을 제공하는 단계, 이 단계에서 상기 세포들 중 적어도 98%는 자가이식 인간 아섬유 세포들이거나 그의 전구체들이고, 적어도 85%는 생존가능하고,
상기 세포들을 분화시키기 위한 수단을 제공하는 단계를 포함하는, 방법.

제13항에 있어서,
상기 세포들은 세포 프로그래밍, 세포 융합 또는 체세포 치환에 의해 탈분화되는, 방법.

1mL당 1.0ⅹ10⁷개 세포 내지 2.7ⅹ10⁷개 세포들을 포함하는 용량 제형의 탈분화에 의해 제조된 다분화능 세포 제형으로서, 상기 세포들 중 적어도 98%는 자가이식 인간 아섬유 세포들이거나 그의 전구체들이고, 적어도 85%는 생존가능한, 다분화능 세포 제형.