JP2009148236A - 線維芽細胞の細胞識別方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】繊維芽細胞の細胞識別法は、レクチンプレート、検出方法、解析方法を有する。レクチンプレートは少なくとも1種類以上のレクチンを基板表面に固相化している。検出法はプレートに結合した細胞の量に対応して変化するシグナルを測定することにより、レクチンと細胞との反応を数値化する。細胞種の解析方法は上記の方法で検出した数値データをクラスタ解析法で統計処理し、得られたデンドログラムによる区分による。
【選択図】図13
Description
これらの用途のために線維芽細胞は一定度に純化され、高度に工程管理されることが求められているが、他種の細胞との混在の恐れは常に存在している。線維芽細胞を他の正常細胞や、間葉系幹細胞(再生医療で使われる分化能力を持った潜在価値の高い細胞)と明確に区分し、分離して使用することは必須である。
線維芽細胞と間葉系幹細胞は形態的に特に非常によく似ており、また、表面発現抗原も極めて類似していることが知られており、特異的な細胞表面マーカーは見つかっていない。さらにDNAチップを用いた解析でも両者を明確に判別できる状況にはないことから、現状両者の区別は困難を極めており、両者を識別する有効な方法が求められている。
特許文献4においては、糖タンパク質のレクチンによる分別法とともに、間葉系幹細胞とそれから派生した細胞との識別に触れているが、極めて限定的な組み合わせにおいての分別法についての記載である。多くの線維芽細胞、特に全く由来の異なる線維芽細胞を他細胞と分別する方法については言及がなく、また他の多数の種類の細胞の分別が実施できる内容のものとなっていない。
本発明は、このような課題の状況に鑑みてなされたものであり、種々の線維芽細胞と間葉系幹細胞などの識別を簡便に短時間に行うことのできる細胞識別方法およびそれに使用する、識別用試薬組成物を提供することを目的とする。
(1)以下のレクチンプレート、検出方法、解析方法を有する線維芽細胞の識別法。
(イ)少なくとも1種類以上のレクチンを固相化した基板プレート。
(ロ)基板上のレクチンに結合した細胞の量に対応して変化するシグナルを測定することにより、レクチンと細胞との反応を数値化する検出法。
(ハ)上記の方法で検出した数値データを統計的にデータ処理し、得られたデータを多変量解析により区分化することを特徴とした線維芽細胞の識別方法。
(2)レクチンが天然レクチンであることを特徴とする(1)の線維芽細胞の識別方法。
(3)レクチンが人工レクチンであることを特徴とする(1)の線維芽細胞の識別方法。
(5)多変量解析がデンドログラムによることを特徴とする(1)−(4)の線維芽細胞の識別方法。
(6)クラスタ解析が数値変換した値を用いる、階層的クラスタ解析である(1)−(5)の線維芽細胞の識別方法。
本発明の細胞識別法によれば、組織由来の異なる種々の線維芽細胞と例えば間葉系幹細胞などの細胞を、染色や標識することなく生きたままの状態で、極めて短時間に、複数のレクチンとの反応パターンの違いとして区別することができる。また、反応パターンの基となる吸光度データを階層的クラスタ解析することで、線維芽細胞と例えば間葉系幹細胞をデンドログラム上で明確に区別することができる。
クラスター解析のためのソフトウエアはウエブ上でも入手することができ、TIGRmeV、NIA Array Analysis、Stalib−MULTI,MULTIV,NetLib,ALN,MIXMOD,Cluster 3.0,MeV V4.0などがあり、適宜選択して使用することができる。
細胞識別法に用いるレクチンプレートは少なくとも1種類以上のレクチンを表面上に固相化したマイクロタイタープレートを用いる。表面上に種々のレクチンを固相化したマイクロタイタープレートを用いることで、一度に多種類のレクチンと細胞との反応を行なうことができる。このレクチンプレートに、細胞懸濁液を添加してレクチンと細胞を反応させ、反応しなかった細胞を洗い流す。レクチンと細胞との反応性の程度を数値化するためには、プレートに結合して残った細胞を染色し、その色素の細胞吸着量を吸光度計により測定する。
得られたレクチンと細胞との反応に由来する複数の吸光度測定値を対数変換(log10変換)しクラスタ解析を行う。クラスタ解析の結果をデンドログラムとして表すと、線維芽細胞と間葉系幹細胞はデンドログラム上の異なったクラスタに分類され、線維芽細胞と間葉系幹細胞を識別することができる。
(細胞の調製)
正常ヒト間葉系幹細胞(MSC、Cambrex社:以下C社と略。PT−2501、ロット番号6F3400、5F0972、6F3502)はMSCGM(C社PT−3001)を用いて37℃、5%CO2存在下で培養し、約3週間、2回の継代を行って拡大した。拡大培養した細胞はトリプシン・EDTA液(C社CC−3232)ではく離し、トリプシン中和液(C社CC−5002)で酵素反応を止めた後、10%DMSOを加えた増殖培地中に懸濁し、液体窒素中に凍結保存した。
線維芽細胞として、正常ヒト皮膚線維芽細胞(NHDF、C社CC−2511)、正常歯根膜由来線維芽細胞(HPdLF、C社CC−7049)、正常ヒト心線維芽細胞(HCF、CAI社306−05f)はそれぞれFGM−2(C社CC−3132)、SCGM(C社CC−3205)、Lung/Cardiac Fibroblast Growth Medium(CAI社516−500)で培養し、同様に10%DMSOを含む増殖培地中で凍結保存した。
その他の細胞として、正常ヒトアストロサイト(NHA、C社CC−2565)、正常ヒト骨芽細胞(NHOst、C社CC−2538)、正常ヒト膝関節軟骨細胞(NHAc−Kn、C社CC−2550)、正常ヒト頭髪毛乳頭細胞(HFDPC、CAI社602−05a)、正常ヒト皮膚角化細胞(NHEK、C社CC−2501)はそれぞれAGM(C社CC−3186)、OGM(C社CC−3207)、CGM(C社CC−3216)、PCGM(東洋紡績社TMTPGM−250)、KGM(C社CC−3111)で培養し、同様に10%DMSOを含む増殖培地中で凍結保存した。
マイクロタイタープレート(スミロンELISAプレートH:MS−8896F:住友ベークライト社製)に0.05M炭酸緩衝液(pH9.6)で希釈した表1−3に示す76種類のレクチン(20μg/ml)を50μl/wellずつ添加し、4℃で一晩反応させた。未反応のレクチンを除くために、1mMカルシウムおよび1mMマグネシウムを含む50mMトリス緩衝生理食塩水(pH7.6)(CM−TBS)で2回洗浄した。洗浄操作はCM−TBSをゆっくりとウエルに添加した後、プレートを逆さにしてウエル内の液を捨て、ペーパータオル上で軽く叩いて液を完全に除くことで行った。さらにプレートをブロッキングするため、3%BSA/CM−TBS(170μl/well)を添加し、室温で3時間反応させた。その後、CM−TBSで2回プレートを洗浄し、レクチンプレートとして以下の細胞との反応に供した。
液体窒素中に凍結保存した細胞を取り出し、37℃水浴にて急速に細胞を解凍した。細胞懸濁液を50ml遠心チューブに移し、αMEM(ナカライテスク社21444−05)(4℃)で1回、50mMトリス緩衝生理食塩水(TBS)(pH7.6、4℃)で3回を洗浄した。なお、細胞の洗浄操作は細胞懸濁液に培地(4℃)あるいはTBS(4℃)をゆっくりと攪拌しながら添加した後、遠心分離装置(1000rpm,5分、4℃)で細胞を回収することで行った。また、培地で洗浄した後にトリパンブルー法で細胞懸濁液中の総細胞数と生細胞率を測定し、細胞の状態を確認した。
このようにして洗浄した細胞に1% BSA/CM−TBS(4℃)を添加して、1×106個/mLとなるように懸濁し、レクチンプレートとの反応に供した。
洗浄したレクチンプレートに1×106個/mlとなるように調製した線維芽細胞3種と間葉系幹細胞3種のそれぞれの細胞懸濁液を100μl/wellずつ添加した。このレクチンプレートをプレートシールで蓋をして、冷蔵庫内に置き4℃下、2時間静置して細胞とレクチンを反応させた。なお、プレート間の測定誤差を補正するために各プレートには標準反応用ウエルを設定した。標準反応は固相化したDSAにCHO−Lec2細胞を反応させた。反応終了後、プレートを逆さにしてウエル内の液を捨てた後、ペーパータオル上で軽く叩いて液を完全に除いた。さらにレクチンと反応しない細胞を除くため、ウエルの洗浄を行った。洗浄操作はCM−TBS(4℃)をゆっくりとウエルに添加した後、プレートを逆さにしてウエル内の液を捨て、ペーパータオル上で軽く叩いて液を完全に除くことで行い、この操作を3回繰り返した。
レクチンと反応した細胞は、プレート上に結合したままプレート表面に残るので0.25%(v/v)グルタルアルデヒドPBS溶液を用いてレクチンとの反応を停止させるとともに、プレートと結合したままの細胞を固定した(室温、30分)。反応後、ウエル中のグルタルアルデヒド溶液PBSは、プレートを逆さにして捨て、各ウエルをTBSで2回洗浄した。
レクチンとの反応によりプレートに結合した細胞を検出するために、0.1%クリスタルバイオレット/25%MeOH(50μl/well)を添加し、プレート上に結合した細胞を染色した(室温、30分)。その後、余分な染色液を流水下で十分に洗い流し、ペーパータオル上でプレートを軽く叩いて液を完全に除いた。続いて10%MeOH/40%EtOH(50μl/well)をウエルに添加して、細胞内の色素を溶媒中に抽出した(室温、60分)。
溶媒中に溶出させたクリスタルバイオレットをELISA測定用プレートリーダー(大日本製薬、マルチスキャンJX)にて570nmの吸光度を測定した。
得られた吸光度値から各プレートに設定した標準反応との相対%値を算出し、レクチンの反応パターンをレーダーチャート図として示した(図1−6)。これによると個々のレクチンの反応性の強弱は間葉系幹細胞の3ロットで似たものとなり、線維芽細胞群とは異なっていた。
線維芽細胞と間葉系幹細胞について、実施例2で得られた各レクチンの吸光度値をlog10変換し、その数値と用いてTIGRmeV、NIA Array Analysis、ソフトウエアを用いて階層的クラスタ解析を行った。その結果得られたデンドログラムを図12に示した。これによると線維芽細胞と間葉系幹細胞はクラスタ番号11で区別された。また、間葉系幹細胞だけに注目すると各ロットの違いで間葉系幹細胞は異なったクラスタに分かれた(クラスタ番号10、7)。なお図中□内に囲まれた番号はクラスタ番号を示す。囲みのない数字番号は、区分に使用するレクチンの種類の数を示す。
実施例3では線維芽細胞と間葉系幹細胞の識別を行ったが、解析に用いるレクチンの種類を絞り込んだ場合の線維芽細胞と間葉系幹細胞の識別法について、他の細胞種も含めた場合の解析を行った。
実施例2と同様に種々のヒト正常細胞のレクチンの反応パターンを本発明の細胞識別法で取得した。図7−11に示したように様々な種類のヒト正常細胞の反応パターンは線維芽細胞のパターンとは異なったものとなった。
レクチンの中から線維芽細胞と他の細胞との間で反応性の有意差が高いレクチンをNIA Array Analysisソフトウエアにて2群検定法(ANOVA)で抽出し選ばれたレクチン(rPNA)を使ってクラスタ解析を行った。クラスタ解析は吸光度値を対数変換(log10変換)し、実施例3と同様に行った。その結果、図13に示すようにクラスタ番号21において、線維芽細胞は間葉系幹細胞および種々の細胞と異なったクラスタに分類された。なお図中□内に囲まれた番号はクラスタ番号を示す。囲みのない数字番号は、区分に使用するレクチンの種類の数を示す。なおクラスタ番号21に相当するレクチンは、組換え型ピーナッツレクチン(組換え型PNA、rPNA)であった。
Claims (14)
- 以下のレクチンプレート、検出方法、解析方法を有する線維芽細胞の識別法。
(イ)少なくとも1種類以上のレクチンを固相化した基板プレート。
(ロ)基板上のレクチンに結合した細胞の量に対応して変化するシグナルを測定することにより、レクチンと細胞との反応を数値化する検出法。
(ハ)上記の方法で検出した数値データを統計的にデータ処理し、得られたデータを多変量解析により区分化することを特徴とした細胞の識別方法。 - レクチンが天然レクチンであることを特徴とする請求項1の線維芽細胞の識別方法。
- レクチンが人工レクチンであることを特徴とする請求項1の線維芽細胞の識別方法。
- 統計的データ処理が、クラスタ解析であることを特徴とする請求項1−3の線維芽細胞の識別方法。
- 多変量解析がデンドログラムによることを特徴とする請求項1−4の線維芽細胞の識別方法。
- クラスタ解析が数値変換した値を用いる、階層的クラスタ解析である請求項1−5の線維芽細胞の識別方法。
- 識別できる線維芽細胞が少なくとも1種類以上の組織由来の異なる線維芽細胞である請求項1−6の線維芽細胞の識別方法。
- 識別する細胞が標識されていない生きた細胞であることを特徴とする請求項1−7の線維芽細胞の識別方法。
- レクチンを固定化する基板が、プラスチック基板であることを特徴とする請求項1−8の線維芽細胞の識別方法。
- 基板がマイクロプレートの形状であることを特徴とする、請求項1−9の線維芽細胞の識別方法。
- レクチンと細胞との反応性を検出する方法が、色素による細胞染色法であることを特徴とする請求項1−10の線維芽細胞の識別方法。
- 色素によるシグナルを、吸光度、蛍光強度として検出することを特徴とする請求項11の線維芽細胞の識別方法。
- 請求項1−12による線維芽細胞の識別方法に使用するために調製された、レクチン固定化基板および試薬。
- 線維芽細胞を他細胞と分別するためのレクチンとして、組換え型ピーナッツレクチン(組換え型PNA)を用いることを特徴とする請求項1−12の線維芽細胞の識別方法ならびに請求項13の試薬。
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