CN105638642B - 一种免疫细胞冻存液及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种免疫细胞冻存液及其应用，所述免疫细胞冻存液包括重组人白介素‑2、聚乙二醇、1,2‑丙二醇，以及基础培养基或注射用氯化钠；具体的，所述免疫细胞冻存液包括：重组人白介素‑250‑200U/mL；聚乙二醇0.1‑0.4g/mL；1,2‑丙二醇0.2‑0.4g/mL；基础培养基或注射用氯化钠90‑99体积％。通过将本发明所述的免疫细胞冻存液用于免疫细胞冻存，可使复苏细胞存活率达到93％以上，细胞生物学特性不发生变化，保证了免疫细胞的生物学活性；另外，由于免疫细胞冻存液中不含动物血清，因此不会引入外源蛋白，降低了动物病原污染的可能性，而且有效解决了免疫细胞无法存储、长时间运输的问题。
Description
技术领域
本发明涉及细胞冻存领域，特别是免疫细胞冻存领域，尤其涉及一种免疫细胞冻存液及其应用。
背景技术
细胞冷冻技术作为一种保存细胞的有效方法在生物学领域已有深入广泛的应用。对供体的免疫细胞深低温保存可保持其活力和功能，无论对临床还是基础研究均具有重要意义，尤其是免疫细胞用于回顾性研究时更为重要。冷冻保存免疫细胞不仅可以解决现有免疫细胞诱导时间较长，需要多次诱导和患者多次采血的问题，还可以把人健康状态最好或战斗力最强时期的免疫细胞保存下来，用于肿瘤治疗以及抗衰老保健治疗。
正常情况下，液体冻结时会造成细胞损伤，其中，一种情况是由于不适当的降温和复温导致细胞内形成冰晶和重结晶；另一种情况是由于冷冻使得电解质和溶质浓度升高所导致的溶质损伤。通常，免疫细胞在-70℃～-80℃冻存，细胞活性会随着冷冻时间的延长迅速下降，在-196℃时细胞生物学过程几乎停止，因此要长期保存免疫细胞，液氮温度是最佳的储存温度。选择合适的冷冻保护剂可以避免细胞在冷冻时细胞内冰晶的形成，保护细胞膜和细胞器免受损伤。
细胞冻存经常采用渗透性保护剂，例如甘油和二甲基亚砜(DMSO)两种，而甘油作为冷冻保护剂冻存的免疫细胞存活率较低，但DMSO却可以迅速透入细胞，提高细胞膜对水的通透性，使水分在细胞冻结前透出细胞外形成冰晶，成为免疫细胞冻存最理想的冷冻保护剂。
目前国内冻存方法多采用的是DMSO、动物血清和细胞培养液按不同比例搭配成的冻存液，例如CN102301992A公开的用于冻存单个核细胞的冻存液，其包含血浆和二甲基亚砜，但不仅限于此，还可以包含动物血清和培养基等成分。采用该冻存液的优点是细胞保存时间长，然而该冻存液中含有的动物血清引入了外源蛋白，同时增加了动物病原污染的可能性，会对人体过继免疫治疗产生一定影响。目前也有一些采用冻存液中不含动物血清的文献，例如，CN104026118A公开的免疫细胞冻存液，其包含二甲基亚砜、人供体血浆和免疫细胞基础培养基。采用该冷冻液的优点在于不会引入外源蛋白，降低了动物病原污染的可能性，然而该冷冻液冻存细胞的存活率以及细胞活性仍较低。
因此，寻找一种如何保持细胞高活性并可实现长期存储、即时复苏的免疫细胞冻存液及冻存方法是目前亟待解决的问题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种免疫细胞冻存液及其应用，特别提供了一种用于免疫细胞长期保存，并能够在复苏后保持其细胞特性的冻存液及其应用。
为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：
在第一方面，本发明提供了一种免疫细胞冻存液，其包括以下组分：重组人白介素-2、聚乙二醇、1,2-丙二醇，以及基础培养基或注射用氯化钠。
通常，外周血的T细胞、B细胞和NK细胞膜表面均存在白介素-2(IL-2)受体，IL-2与其受体结合后可以调节该细胞的增生，调节免疫球蛋白的生成；促进T细胞、B细胞和NK细胞的增殖、分化并能提高NK细胞的杀伤活性。然而，目前主要是将IL-2作为体外刺激培养物用于免疫细胞的扩增培养，而本发明采用将重组人白介素-2(IL-2)添加到免疫细胞冻存液中，可大幅度提高所述免疫细胞的活性稳定性，使其保持原有细胞高活性，从而使免疫细胞很好地保持了细胞复苏后的生理功能和生物学特性，可有效解决细胞复苏后直接应用和进一步扩展的关键问题。
本发明在免疫细胞冻存液中添加聚乙二醇和1,2-丙二醇，可以替代现用的二甲基亚砜(DMSO)为基础的冻存液，有效降低其对细胞毒性，维持细胞稳定性，提高复苏后直接应用的安全性，适合用于细胞冻存复苏后直接应用。
本发明的免疫细胞冻存液并不排除其它成分的存在，比如生理盐水等，然而，本发明的免疫细胞冻存液不含有DMSO等应用过程存在安全风险的物质。
本发明中，所述免疫细胞冻存液包括：重组人白介素-250-200U/mL；聚乙二醇0.1-0.4g/mL；1,2-丙二醇0.2-0.4g/mL；基础培养基或注射用氯化钠90-99体积％，总量为100％。
本发明所述免疫细胞冻存液中的重组人白介素-2的含量为50-200U/mL，例如可以是50U/mL、60U/mL、80U/mL、100U/mL、120U/mL、150U/mL、1600U/mL、180U/mL、200U/mL。
本发明所述免疫细胞冻存液中的聚乙二醇含量为0.1-0.4g/mL，例如可以是0.1g/mL、0.12g/mL、0.15g/mL、0.2g/mL、0.22g/mL、0.25g/mL、0.3g/mL、0.32g/mL、0.35g/mL、0.38g/mL、0.4g/mL。
本发明所述免疫细胞冻存液中的1,2-丙二醇含量为0.2-0.4g/mL，例如可以是0.2g/mL、0.22g/mL、0.25g/mL、0.3g/mL、0.32g/mL、0.35g/mL、0.38g/mL、0.4g/mL。
本发明所述免疫细胞冻存液中的基础培养基或注射用氯化钠的体积百分含量为90％、90.5％、91％、91.5％、92％、92.5％、93％、93.5％、94％、94.5％、95％、95.5％、96％、96.5％、97％、97.5％、98％、98.5％、99％。如果在免疫细胞冻存液中还含有除重组人白介素-2、聚乙二醇、1,2-丙二醇组分以外的其它组分时，所述基础培养基或注射用氯化钠的含量会进行适当的下调，比如降低为80％-95％，例如所述基础培养的含量还可以是80％、80.5％、81％、81.5％、82％、82.5％、83％、83.5％、84％、84.5％、85％、85.5％、86％、86.5％、87％、87.5％、88％、88.5％、89％、89.5％，以满足所述免疫细胞冻存液中各组分含量之和为100％。
本发明所述免疫细胞冻存液中的重组人白介素-2、聚乙二醇、1,2-丙二醇，以及基础培养基或注射用氯化钠可以采用上述各组分所选择的含量进行任意配合，各组分的体积百分含量之和为100％。
优选地，所述免疫细胞冻存液包括：重组人白介素-280-180U/mL；聚乙二醇0.2-0.4g/mL；1,2-丙二醇0.25-0.4g/mL；基础培养基或注射用氯化钠95-99体积％。
本发明所述免疫细胞冻存液中，所述基础培养基为RPMI-1640培养基(THERMO-HyClone)或淋巴细胞培养基[GT551/GT561(TAKARA)、TBD-DCNK1640(天津灏阳)、X-VIVOTM15(LONZA)]。
优选地，所述淋巴细胞培养基为X-VIVOTM15(LONZA)，其均可购自日本LONZA公司。
本发明所述免疫细胞冻存液中不含有DMSO，因此不会引入外源蛋白，降低了动物病原污染的可能性，也不会对人体过继免疫治疗产生影响。
本发明中所述免疫细胞冻存液还含有血清替代物，其适用于采用淋巴细胞培养基作为基础培养基的情况。例如，所述免疫细胞冻存液还含有Ultroser G(购自PALL)、自体血浆或胎牛血清中的任意一种。
优选地，所述Ultroser G的含量为0.2-1.8g/mL，例如可以是0.2g/mL、0.5g/mL、0.6g/mL、0.8g/mL、1g/mL、1.2g/mL、1.3g/mL、1.5g/mL、1.6g/mL、1.8g/mL。
优选地，所述自体血浆的含量为10-90体积％。
优选地，所述胎牛血清的含量为10-90体积％。
本发明中，当所述重组人白介素-2、聚乙二醇、1,2-丙三醇和基础培养基等的体积百分含量之和小于100％时，所述免疫细胞冻存液进一步包含剩余体积的人血白蛋白或丙三醇。
优选地，所述人血白蛋白的的含量为0.05-10.1g/mL，例如可以是0.05g/mL、1g/mL、1.5g/mL、2g/mL、2.5g/mL、3g/mL、3.5g/mL、5g/mL、7g/mL、8g/mL、8g/mL、10.1g/mL。
本发明采用在免疫细胞冻存液中添加人血白蛋白为细胞冻存稳定剂使用，采用药用人血白蛋白使用量低，可进一步提高采用本方法冻存细胞存储稳定性，避免由于细胞存储供者血质问题导致过程储存活性不稳定或细胞复苏率下降。
优选地，所述丙三醇的含量为10-20体积％。
第二方面，本发明还提供了如本发明第一方面所述的免疫细胞冻存液在免疫细胞冻存复苏中的应用。
优选地，所述免疫细胞为T细胞、自然杀伤细胞或NTK细胞中的任意一种。
本发明还提供了一种组合物在免疫细胞冻存液中的应用，所述组合物包括以下组分：重组人白介素-2、聚乙二醇、1,2-丙二醇和基础培养基。
本发明采用将重组人白介素-2(IL-2)添加到免疫细胞冻存液中，可大幅度提高所述免疫细胞的活性，使其具有高活性，从而使免疫细胞很好地保持了细胞复苏后的生理功能和生物学特性。
本发明在所述组合物中还可以添加人血白蛋白，其有利于在冷冻复苏过程中调节渗透压，对细胞保护作用好，并且冻存液成本低，提高细胞冻存稳定性。
本发明中所述组合物中含有的重组人白介素-2和人血白蛋白具有显著的协同作用，可以显著提高免疫细胞的活性和复苏后的存活率。
本发明中，所述免疫细胞冻存液包括：重组人白介素-250-200U/mL；聚乙二醇0.1-0.4g/mL；1,2-丙二醇0.2-0.4g/mL；基础培养基或注射用氯化钠90-99体积％，总量为100％。
本发明所述免疫细胞冻存液中的重组人白介素-2的含量为50-200U/mL，例如可以是50U/mL、60U/mL、80U/mL、100U/mL、120U/mL、150U/mL、1600U/mL、180U/mL、200U/mL。
本发明所述免疫细胞冻存液中的聚乙二醇含量为0.1-0.4g/mL，例如可以是0.1g/mL、0.12g/mL、0.15g/mL、0.2g/mL、0.22g/mL、0.25g/mL、0.3g/mL、0.32g/mL、0.35g/mL、0.38g/mL、0.4g/mL。
本发明所述免疫细胞冻存液中的1,2-丙二醇含量为0.2-0.4g/mL，例如可以是0.2g/mL、0.22g/mL、0.25g/mL、0.3g/mL、0.32g/mL、0.35g/mL、0.38g/mL、0.4g/mL。
本发明所述免疫细胞冻存液中的基础培养基或注射用氯化钠的体积百分含量为90％、90.5％、91％、91.5％、92％、92.5％、93％、93.5％、94％、94.5％、95％、95.5％、96％、96.5％、97％、97.5％、98％、98.5％、99％。如果在免疫细胞冻存液中还含有除重组人白介素-2、聚乙二醇、1,2-丙二醇组分以外的其它组分时，所述基础培养基的含量会进行适当的下调，比如降低为80％-95％，例如所述基础培养的含量还可以是80％、80.5％、81％、81.5％、82％、82.5％、83％、83.5％、84％、84.5％、85％、85.5％、86％、86.5％、87％、87.5％、88％、88.5％、89％、89.5％，以满足所述免疫细胞冻存液中各组分含量之和为100％。
本发明所述免疫细胞冻存液中的重组人白介素-2、聚乙二醇、1,2-丙二醇，以及基础培养基或注射用氯化钠可以采用上述各组分所选择的含量进行任意配合，各组分的体积百分含量之和为100％。
优选地，所述免疫细胞冻存液包括：重组人白介素-280-180U/mL；聚乙二醇0.2-0.4g/mL；1,2-丙二醇0.25-0.4g/mL；基础培养基95-99体积％。
本发明所述免疫细胞冻存液中，所述基础培养基为RPMI-1640培养基或淋巴细胞培养基。
优选地，所述淋巴细胞培养基为GT-T551培养基或GT-T561培养基。
本发明所述免疫细胞冻存液中不含有动物血清，因此不会引入外源蛋白，降低了动物病原污染的可能性，也不会对人体过继免疫治疗产生影响。
本发明中所述免疫细胞冻存液还含有血清替代物，其适用于采用淋巴细胞培养基作为基础培养基的情况。例如，所述免疫细胞冻存液还含有Ultroser G、自体血浆或胎牛血清中的任意一种。
优选地，所述Ultroser G的含量为0.2-1.8g/mL，例如可以是0.2g/mL、0.5g/mL、0.6g/mL、0.8g/mL、1g/mL、1.2g/mL、1.3g/mL、1.5g/mL、1.6g/mL、1.8g/mL。
优选地，所述自体血浆的含量为10-90体积％。
优选地，所述胎牛血清的含量为10-90体积％。
本发明中，当所述重组人白介素-2、聚乙二醇、1,2-丙三醇和基础培养基等的体积百分含量之和小于100％时，所述免疫细胞冻存液进一步包含剩余体积的人血白蛋白。
优选地，所述人血白蛋白的的含量为0.05-1.0g/mL，例如可以是0.05g/mL、0.1g/mL、0.15g/mL、0.2g/mL、0.25g/mL、0.3g/mL、0.35g/mL、0.5g/mL、0.7g/mL、0.8g/mL、1.0g/mL。
在第三方面，本发明还提供了一种免疫细胞的冻存方法，其包括：
(1)将免疫细胞与本发明第一方面所述的免疫细胞冻存液混合；和
(2)进行程序降温至-80℃，然后转移至液氮中冷冻保存。
本发明中所述免疫细胞优选的冻存方法包括以下步骤：
(1)冻存液的制备：制备本发明第一方面所述的免疫细胞冻存液；
(2)细胞悬液的制备：将供体资源离心后，分离去除上层血浆，并将下层浓血离心，分离获得免疫细胞，将所述免疫细胞与所述免疫细胞冻存液混合得到细胞悬液，置于无菌的冻存管中；
(3)冷冻：将所述冻存管进行程序降温至-80℃，然后转移至液氮中冷冻保存；
(4)细胞复苏：取出冻存管快速置于37-40℃水浴1-3分钟，振荡直至细胞悬液完全融化，经离心，以淋巴细胞无血清培养基洗涤2-3次，即可。
本发明所述的冻存方法中，步骤(2)所述供体资源为外周血或脐带血。
本发明所述的冻存方法中，通过采用步骤(2)，可以有效提高免疫细胞的纯度，从而有利于后续的复苏以及细胞存活率的提高。
外周血和脐带血中均富含各种矿物质离子和蛋白因子，可提供细胞代谢所述物质并维持细胞所述的渗透压，是天然的营养体系和缓冲体系。采用来自外周血和脐带血的免疫细胞，并经特殊的提取过程，可以增加免疫细胞的纯度，并避免了动物源病原微生物的交叉感染风险，使免疫细胞的冻存更加安全有效，便于冻存细胞后续的临床应用。
优选地，所述离心的转速为2000-3000转/分钟，例如可以是2000转/分钟、2100转/分钟、2200转/分钟、2300转/分钟、2400转/分钟、2500转/分钟、2600转/分钟、2700转/分钟、2800转/分钟、2900转/分钟、3000转/分钟；所述离心的时间为10-20分钟，例如可以是10分钟、11分钟、12分钟、13分钟、14分钟、15分钟、16分钟、17分钟、18分钟、19分钟、20分钟。
优选地，所述细胞悬液的浓度为5-10×106个细胞/mL，例如可以是5×106个细胞/mL、6×106个细胞/mL、7×106个细胞/mL、8×106个细胞/mL、9×106个细胞/mL、10×106个细胞/mL，优选为7×106个细胞/mL。
本发明中所述免疫细胞为外周血单个核细胞，优选为T细胞、自然杀伤细胞或NTK细胞中的任意一种。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
(1)本发明的免疫细胞冻存液和冻存方法，使得复苏细胞存活率达到93％以上，细胞生物学特性不发生变化，保证了免疫细胞的生物学活性；
(2)本发明的免疫细胞冻存液中不含动物血清，因此不会引入外源蛋白，降低了动物病原污染的可能性，不会对人体过继免疫治疗产生影响；
(3)本发明的免疫细胞冻存液和冻存方法有效解决了免疫细胞无法存储、长时间运输的问题，实现了免疫细胞的本地采集、异地制备以及即时复苏的应用。
附图说明
图1是本发明的免疫细胞冻存液冻存1个月复苏后的再次扩增NK细胞生长曲线图。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述。本领域技术人员将会理解，以下实施例仅为本发明的优选实施例，以便于更好地理解本发明，因而不应视为限定本发明的范围。对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换或改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所用的实验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂厂商购买得到的。
实验材料及其来源：
1、实验环境：GMP实验室里的生物安全柜中操作。
2、试剂：RPMI-1640培养基(THERMO，美国)、GT-T551/561培养基(TAKARA)、人淋巴细胞分离液(天津灏洋生物制品科技有限责任公司)、胎牛血清(GIBCO，美国)、二甲基亚砜DMSO(WAK，德国)、生理盐水(杭州民生药业)、重组人白介素-2、人血白蛋白(上海莱士)、Ultroser G(PALL)。
3、器材：离心机(THERMO，美国)、T175培养瓶(NUNC，丹麦)、GT-A610培养袋(TAKARA，日本)、程控降温仪(THERMO，美国)、生物安全柜(力康生物医疗科技控股有限公司，香港)、1mL和5mL冻存管、50mL离心管(BD，美国)。
实施例1：制备免疫细胞冻存液(重组人白介素-2+聚乙二醇+1,2-丙二醇+RPMI-1640培养基+人血白蛋白)
按体积含量，将1.0g/ml人血白蛋白、100U/mL的重组人白介素-2、0.1g/mL的聚乙二醇、0.2g/mL的1,2-丙二醇和99％的RPMI-1640培养基混匀，制得免疫细胞冻存液，于4℃保存备用。
实施例2：制备免疫细胞冻存液(重组人白介素-2+聚乙二醇+1,2-丙二醇+RPMI-1640培养基+人血白蛋白)
按体积含量，将1.0g/ml人血白蛋白、50U/mL的重组人白介素-2、0.15g/mL的聚乙二醇、0.25g/mL的1,2-丙二醇和98％的RPMI-1640培养基混匀，制得免疫细胞冻存液，于4℃保存备用。
实施例3：制备免疫细胞冻存液(重组人白介素-2+聚乙二醇+1,2-丙二醇+RPMI-1640培养基+人血白蛋白)
按体积含量，将1.0g/ml人血白蛋白、200U/mL的重组人白介素-2、0.2g/mL的聚乙二醇、0.3g/mL的1,2-丙二醇和95％的RPMI-1640培养基混匀，制得免疫细胞冻存液，于4℃保存备用。
实施例4：制备免疫细胞冻存液(重组人白介素-2+聚乙二醇+1,2-丙二醇+淋巴细胞培养基GT-T561+Ultroser G)
按体积含量，将100U/mL的重组人白介素-2、0.2g/mL的聚乙二醇、0.3g/mL的1,2-丙二醇和95％的淋巴细胞培养基GT-T561以及0.2g/mL的Ultroser G混匀，制得免疫细胞冻存液，于4℃保存备用。
实施例5：制备免疫细胞冻存液(重组人白介素-2+聚乙二醇+1,2-丙二醇+淋巴细胞培养基GT-T561+Ultroser G+人血白蛋白)
按体积含量，将50U/mL的重组人白介素-2、0.1g/mL的聚乙二醇、0.2g/mL的1,2-丙二醇和86％的淋巴细胞培养基GT-T561以及0.5g/mL的Ultroser G和0.2g/mL的人血白蛋白混匀，制得免疫细胞冻存液，于4℃保存备用。
实施例6：制备免疫细胞冻存液(重组人白介素-2+聚乙二醇+1,2-丙二醇+注射用氯化钠+Ultroser G+人血白蛋白)
按体积含量，将50U/mL的重组人白介素-2、0.1g/mL的聚乙二醇、0.2g/mL的1,2-丙二醇和86％的注射用氯化钠以及0.5g/mL的Ultroser G和0.2g/mL的人血白蛋白混匀，制得免疫细胞冻存液，于4℃保存备用。
实施例7：制备免疫细胞冻存液(重组人白介素-2+聚乙二醇+1,2-丙二醇+注射用氯化钠+Ultroser G)
按体积含量，将100U/mL的重组人白介素-2、0.2g/mL的聚乙二醇、0.3g/mL的1,2-丙二醇和95％的注射用氯化钠以及0.2g/mL的Ultroser G混匀，制得免疫细胞冻存液，于4℃保存备用。
对比例1：制备免疫细胞冻存液(肽牛血清+DMSO+RPMI-1640)
按体积百分比，将10％的胎牛血清与10％的DMSO和80％的RPMI-1640培养基混匀，制得免疫细胞冻存液，于4℃保存备用。
对比例2：制备免疫细胞冻存液(供体血浆+DMSO+RPMI-1640)
按体积百分比，将10％的供体血浆与10％的DMSO和80％的RPMI-1640培养基混匀，制得免疫细胞冻存液，于4℃保存备用。
对比例3：制备免疫细胞冻存液(供体血浆+DMSO+淋巴细胞培养基GT-T561)
按体积百分比，将10％的供体血浆与10％的DMSO和80％的淋巴细胞培养液GT-T561培养基混匀，制得免疫细胞冻存液，于4℃保存备用。
对比例4：制备免疫细胞冻存液(供体血浆+DMSO+SFM培养基)
按体积百分比，将10％的供体血浆与10％的DMSO和80％的SFM培养基(OpTmizerTMCTSTM T-Cell Expansion)混匀，制得免疫细胞冻存液，于4℃保存备用。
实施例8：采用实施例1-7和对比例1-4的免疫细胞冻存液进行免疫细胞的冻存
外周血经2000转/分钟，离心10分钟，分离去除上层血浆于-20℃备用，下层浓血经淋巴细胞分离液密度梯度400g离心20分钟，分离获得单个核细胞，单个核细胞以5×106个细胞/mL与冻存液混合放入1mL、5mL冻存管中。
将冻存管放入程序降温盒或放入-80℃深低温冰箱10小时，再放入液氮罐(-196℃)中存储30分钟，然后转入-20℃环境下放置2小时，再放入-80℃深低温冰箱8小时，再转入液氮罐中存储。
取出冻存管快速置于37℃水浴1分钟，振荡直至细胞悬液完全融化，经离心，以淋巴细胞无血清培养基洗涤2次，即可。
实施例9：采用实施例1-7和对比例1-4的免疫细胞冻存液进行免疫细胞的冻存
脐带血经2500转/分钟，离心15分钟，分离去除上层血浆于-20℃备用，下层浓血经淋巴细胞分离液密度梯度400g离心25分钟，分离获得单个核细胞，单个核细胞以7×106个细胞/mL与冻存液混合放入1mL、5mL冻存管中。
将冻存管放入程序降温盒或放入-80℃深低温冰箱11小时，再放入4℃环境中放置30分钟，然后转入-20℃环境下放置2.5小时，再放入-80℃深低温冰箱9小时，再转入液氮罐中存储。
取出冻存管快速置于38℃水浴1.5分钟，振荡直至细胞悬液完全融化，经离心，以淋巴细胞无血清培养基洗涤3次，即可。
实施例10：采用实施例1-7和对比例1-4的免疫细胞冻存液进行免疫细胞的冻存
外周血经3000转/分钟，离心20分钟，分离去除上层血浆于-20℃备用，下层浓血经淋巴细胞分离液密度梯度400g离心30分钟，分离获得单个核细胞，单个核细胞以8×106个细胞/mL与冻存液混合放入1mL、5mL冻存管中。
将冻存管放入程序降温盒或放入-80℃深低温冰箱12小时，再放入液氮罐(-196℃)中存储30分钟，然后转入-20℃环境下放置3小时，再放入-80℃深低温冰箱10小时，再转入液氮罐中存储。
取出冻存管快速置于40℃水浴3分钟，振荡直至细胞悬液完全融化，经离心，以淋巴细胞无血清培养基洗涤2次，即可。
使用实施例1-7和对比例1-4的免疫细胞冻存液冻存1个月、3个月、6个月和12个月后，其复苏后的NK细胞活性(冻存密度1.0×106个细胞/ml)结果如表1所示。
表1
由表1可以看出：使用实施例1-7的免疫细胞冻存液冻存1个月、3个月、6个月和12个月后复苏的NK细胞活性均在93％以上，其中，实施例4-5冻存的NK细胞复苏后的活性高于实施例1-3和实施例6-7的免疫细胞冻存液，另外，实施例1-7的免疫细胞冻存液冻存1个月、3个月、6个月和12个月后复苏的NK细胞均没有可见异物、细菌、真菌、细菌内毒素、支原体的污染。
通过将实施例1-7与对比例1-4进行比较可以得出，采用实施例1-7的免疫细胞冻存液可以使细胞复苏后取得更好的细胞活性，细胞生物学特性不发生变化，保证了免疫细胞的生物学活性。
通过上述实施例可以说明，采用本发明的免疫细胞冻存液能够使细胞复苏后的存活率达到93％以上，有效解决了免疫细胞无法存储、长时间运输的问题，实现了本地采集、异地制备、本地存储、即时复苏的应用。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细特征以及详细方法，但本发明并不局限于上述详细特征以及详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细特征以及详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明选用组分的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
Claims (21)
1.一种免疫细胞冻存液，其特征在于，所述免疫细胞冻存液包括：重组人白介素-2 50-200U/mL；聚乙二醇0.1-0.4g/mL；1,2-丙二醇0.2-0.4g/mL；基础培养基或注射用氯化钠90-99体积％。
2.如权利要求1所述的免疫细胞冻存液，其特征在于，所述免疫细胞冻存液包括：重组人白介素-2 80-180U/mL；聚乙二醇0.2-0.4g/mL；1,2-丙二醇0.25-0.4g/mL；基础培养基或注射用氯化钠95-99体积％。
3.如权利要求1或2所述的免疫细胞冻存液，其特征在于，所述基础培养基为RPMI-1640培养基或淋巴细胞培养基。
4.如权利要求3所述的免疫细胞冻存液，其特征在于，所述淋巴细胞培养基为GT-T551培养基或GT-T561培养基。
5.如权利要求1所述的免疫细胞冻存液，其特征在于，所述免疫细胞冻存液还含有Ultroser G、自体血浆或胎牛血清中的任意一种。
6.如权利要求5所述的免疫细胞冻存液，其特征在于，所述Ultroser G的含量为0.2-1.8g/mL。
7.如权利要求5所述的免疫细胞冻存液，其特征在于，所述自体血浆的含量为10-90体积％。
8.如权利要求5所述的免疫细胞冻存液，其特征在于，所述胎牛血清的含量为10-90体积％。
9.如权利要求1所述的免疫细胞冻存液，其特征在于，所述免疫细胞冻存液进一步含有人血白蛋白或丙三醇。
10.如权利要求9所述的免疫细胞冻存液，其特征在于，所述人血白蛋白的含量为0.05-10.1g/mL。
11.如权利要求9所述的免疫细胞冻存液，其特征在于，所述丙三醇的含量为10-20体积％。
12.如权利要求1-11任一项所述的免疫细胞冻存液在免疫细胞冻存复苏中的应用。
13.如权利要求12所述的应用，其特征在于，所述免疫细胞为T细胞、自然杀伤细胞或NTK细胞中的任意一种。
14.一种免疫细胞的冻存方法，其特征在于，其包括：
(1)将免疫细胞与权利要求1-11任一项所述的免疫细胞冻存液混合；和
(2)进行程序降温至-80℃，然后转移至液氮中冷冻保存。
15.如权利要求14所述的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
(1)冻存液的制备：制备如权利要求1-11任一项所述的免疫细胞冻存液；
(2)细胞悬液的制备：将供体资源离心后，分离去除上层血浆，并将下层浓血离心，分离获得免疫细胞，将所述免疫细胞与所述免疫细胞冻存液混合得到细胞悬液，置于无菌的冻存管中；
(3)冷冻：将所述冻存管进行程序降温至-80℃，然后转移至液氮中冷冻保存；
(4)细胞复苏：取出冻存管快速置于37-40℃水浴1-3分钟，振荡直至细胞悬液完全融化，经离心，以淋巴细胞无血清培养基洗涤2-3次，即得。
16.如权利要求15所述的方法，其特征在于，步骤(2)所述供体资源为外周血或脐带血。
17.如权利要求15所述的方法，其特征在于，步骤(2)所述离心的转速为2000-3000转/分钟；所述离心的时间为10-20分钟。
18.如权利要求15所述的方法，其特征在于，步骤(2)所述细胞悬液的浓度为5-10×106个细胞/mL。
19.如权利要求18所述的方法，其特征在于，步骤(2)所述细胞悬液的浓度为7×106个细胞/mL。
20.如权利要求14所述的方法，其特征在于，所述免疫细胞为外周血单个核细胞。
21.如权利要求20所述的方法，其特征在于，所述免疫细胞为T细胞、自然杀伤细胞或NKT细胞中的任意一种。
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