CN111685108A

CN111685108A - 一种人类外周血免疫细胞冻存高效稳定剂及应用和冻存方法

Info

Publication number: CN111685108A
Application number: CN202010745488.6A
Authority: CN
Inventors: 孔伟圣; 崔国祯; 蓝欣; 孙智勇
Original assignee: Zhuhai Basso Cell Science And Technology Co ltd
Current assignee: Zhuhai Basso Cell Science And Technology Co ltd
Priority date: 2020-07-29
Filing date: 2020-07-29
Publication date: 2020-09-22

Abstract

本发明涉及一种人类外周血免疫细胞冻存高效稳定剂及应用和冻存方法。所述冻存高效稳定剂主要成分为脯氨酸、蔗糖、聚乙烯吡咯烷酮、乙二醇、依克多因、聚乙烯醇及不含酚红的基础细胞培养液。所述冻存剂中，所述脯氨酸浓度为1‑2％(W/V)、所述蔗糖的浓度为5‑6％(W/V)、所述聚乙烯吡咯烷酮的浓度为3‑6％(W/V)、所述乙二醇的比例为5‑8％(V/V)、所述依克多因的浓度为2‑5％(W/V)，所述聚乙烯醇的浓度为1‑3％(W/V)，所述不含酚红的基础细胞培养液比例为92‑95％(V/V)。本发明冻存高效稳定剂不含二甲基亚砜(DMSO)，没有引入外源性的动物源蛋白，降低了动物源污染的可能性，也避免了复苏后细胞回输给患者时出现不良反应和毒副作用，确保临床应用安全，可直接用于临床细胞免疫治疗，安全有效。

Description

一种人类外周血免疫细胞冻存高效稳定剂及应用和冻存方法

技术领域

本发明属于细胞保存技术领域，涉及一种人类外周血免疫细胞冻存高效稳定剂及应用和冻存方法。

技术背景

细胞免疫治疗技术是近年来临床肿瘤治疗新兴技术，也被视为最有前景的技术之一，人类外周血免疫细胞包括淋巴细胞、NK细胞、单核细胞、树突状细胞等在基础医学研究和临床治疗应用日益受到广泛的重视。尤其外周血单个核细胞(PBMC)也是体外制备细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)、LAK细胞、自然杀伤细胞(NK)、NKT细胞、CTL及γδT细胞等的种子细胞。这些细胞保存特别是冷冻保存无论是基础研究还是临床应用都十分重要，尤其是体外诱导的杀伤细胞(CIK)细胞、LAK细胞、自然杀伤细胞(NK)、NKT细胞、CTL及γδT细胞等是过继性细胞免疫治疗技术研究的重点和热点。在临床研究及治疗应用过程中，有的患者很难保证具有足够数量的免疫细胞和细胞因子诱导的免疫细胞，在一定的情况下需要将免疫细胞尤其是外周血单个核细胞(PBMC)进行冷冻保存，一段时间以后再诱导扩大培养，根据临床治疗的需要将已诱导培养的细胞分别在不同时间段进行回输治疗，每次输注相隔一定的时间，也需要将已培养后的细胞冷冻保存。细胞冻存和复苏效果容易受到技术员人员操作、环境以及冻存液性能的影响，使冻存细胞数量及活性具有显著差异。

目前国内大多数实验室细胞冻存多采用传统方法将胎牛血清和RPMI1640培养液以及二甲基亚砜(DMSO)按照一定的比例混合进行细胞冻存，其优点是能够长期保存细胞，操作简单方便，成本低廉，细胞复苏后的存活率通常在70％─90％之间。缺点是由于二甲基亚砜(DMSO)具有一定的毒副作用，细胞复苏后必须进行细胞洗涤，否则不利于细胞培养生长。传统的细胞冻存方法加入胎牛血清，引入了外源性成分，大大增加病原污染的风险。据报道，添加DMSO及动物血清保存细胞，在细胞回输人体后有可能会引起过敏反应，会对人体过继细胞免疫治疗产生一定的影响。也有部分学者在传统技术上进行改良采取β─葡聚糖、羟乙基淀粉、人血清白蛋白或自体血浆和普通细胞培养液混合用于冻存自体外周血免疫细胞，这种方法减少了外源性的风险，但其细胞冻存时间周期不一，冻存后细胞存活率还存不稳定性，无法满足临床治疗的需要。国外已经研发并推出商品化的无血清细胞冻存液，如CELLBANK、BAMBANKER、LABOBANK等品牌，这类产品几乎都不含胎牛血清，没有动物来源成分，细胞冻存复苏后存活率高达80-90％，但是有些商品化冻存液中仍然含有DMSO成分，通常商品化细胞冻存液市售价格较为昂贵。

因此，既能满足人类外周血单个核细胞(PBMC)以及体外细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)、LAK细胞、自然杀伤细胞(NK)、NKT细胞、CTL及γδT细胞的冻存的需要，又成本低廉，使用方便，安全高效优势，且冻存液中不含有动物血清及DMSO成分，确保临床应用安全的细胞冻存液具有较大的临床需求，和有构建必要性。

发明内容

本发明的目的在于构建一种安全有效的人类外周血免疫细胞冻存高效稳定剂及应用和冻存方法。

本发明的目的通过如下技术方案实现：

一种人类外周血免疫冻存高效稳定剂，主要成分为脯氨酸、蔗糖、聚乙烯吡咯烷酮、乙二醇、依克多因、聚乙烯醇及不含酚红的基础细胞培养液。

作为进一步的方案，所述冻存剂中，所述脯氨酸浓度为1-2％(W/V)、所述蔗糖的浓度为5-6％(W/V)、所述聚乙烯吡咯烷酮的浓度为3-6％(W/V)、所述乙二醇的比例为5-8％(V/V)、所述依克多因的浓度为2-5％(W/V)，所述聚乙烯醇的浓度为1-3％(W/V)，所述基础细胞培养液比例为92-95％(V/V)。

作为一种可能方案，所述基础细胞培养液为不含酚红的Alys-Basal基础细胞培养液。

作为进一步的方案，所述人类外周血免疫细胞为人类外周血单个核细胞以及体外细胞因子诱导的免疫细胞。

具体的，所述体外细胞因子诱导的免疫细胞为细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)、LAK细胞、自然杀伤细胞(NK)、NKT细胞、CTL及γδT细胞。

前述冻存高效稳定剂在冻存人类外周血免疫细胞中的应用。

作为进一步的方案，所述体外细胞因子诱导的免疫细胞为细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)、LAK细胞、自然杀伤细胞(NK)、NKT细胞、CTL及γδT细胞。

一种利用前述冻存高效稳定剂进行细胞冻存方法，包括以下步骤：

(1)获取需要冻存的细胞并悬浮于所述冻存高效稳定剂中形成细胞悬液，分装于冻存管；

(2)冻存管放置程序降温盒中，先放置-80℃过夜冷冻，然后转入液氮中长期冻存。

作为进一步的方案，所述细胞悬液细胞密度是1-2×10⁷个/ml。

作为进一步的方案，先放置-80℃过夜冷冻的时间为18-26小时。

本发明具有如下有益效果：

(1)本发明冻存剂不含动物血清、二甲基亚砜(DMSO)及动物源成分的无血清细胞冻存液，没有引入外源性的动物源蛋白，降低了动物源污染的可能性，也避免了复苏后细胞回输给患者时出现不良反应和毒副作用，不会对人体细胞免疫治疗产生危害，确保临床应用安全，可直接用于临床细胞免疫治疗，安全有效。

(2)本发明对人类外周血免疫细胞冻存6个月后，细胞存活率保持在90％以上；冻存6个月后，人类外周血免疫细胞非冻存与冻存6个月后的增殖细胞数量及细胞免疫学表型(CD3-CD56+)基本一致。

【附图说明】

图1为实施例四非冻存细胞体外NK培养第14天细胞形态图。

图2为实施例四冻存细胞体外NK培养第14天细胞形态图。

图3为实施例四非冻存与冻存细胞体外NK培养增殖数量曲线图。

图4为实施例四非冻存细胞体外NK培养14天CD3^-CD56⁺表型检测流式图。

图5为实施例四冻存细胞体外NK培养14天CD3^-CD56⁺表型检测流式图。

图6为实施例五非冻存细胞体外CIK培养第14天细胞形态图。

图7为实施例五冻存细胞体外CIK培养第14天细胞形态图。

图8为实施例五非冻存与冻存细胞体外CIK培养增殖数量曲线图。

图9为实施例五非冻存细胞体外CIK培养14天CD3⁺CD56⁺表型检测流式图。

图10为实施例五冻存细胞体外CIK培养14天CD3⁺CD56⁺表型检测流式图。

【具体实施方式】

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本作进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所用的实验材料，如无特殊说明，均为自常规化试剂厂商购买得到的。

本发明需要提示说明的实验环境、实验材料和仪器设备如下：

1、实验环境：GMP环境下实验室内的超净工作台中操作。

2、试剂：恒温自动加热仪、台盼蓝染色液、磷酸盐缓冲液PBS(珠海贝索生物技术有限公司)、ALyS505N-0、ALyS505NK-AC、ALyS505NK-EX无血清培养液(株式会社细胞科学研究所CSTI)，IgG1-PE、IgG1-FITC、CD56-PE、CD3-FITC(美国贝克曼公司)，二甲亚砜、胎牛血清、人淋巴细胞分离液、肝素钠溶液。

3、仪器与设备：离心机(Thermo，美国)、T75悬浮培养瓶、T175悬浮培养瓶、NIPRO细胞培养袋(日本NIPRO株式会社)、CO₂培养箱(三洋，中国)、超净工作台(智净、中国)、50ml离心管、96孔板、酶联免疫检测仪、移液管、血细胞计数盘(株式会社细胞科学研究所CSTI)、液氮罐。

实施例一

本实施例用于介绍本发明一种人类外周血免疫细胞冻存高效稳定剂及应用和冻存方法。本发明冻存剂不含动物血清、二甲基亚砜(DMSO)及动物源成分的无血清细胞冻存液，没有引入外源性的动物源蛋白，降低了动物源污染的可能性，也避免了复苏后细胞回输给患者时出现不良反应和毒副作用，不会对人体细胞免疫治疗产生危害，安全有效。

一种人类外周血免疫细胞冻存高效稳定剂，主要成分为脯氨酸、蔗糖、聚乙烯吡咯烷酮、乙二醇、依克多因、聚乙烯醇及不含酚红的基础细胞培养液；所述脯氨酸浓度为1-2％(W/V)、所述蔗糖的浓度为5-6％(W/V)、所述聚乙烯吡咯烷酮的浓度为3-6％(W/V)、所述乙二醇的比例为5-8％(V/V)、所述依克多因的浓度为2-5％(W/V)，所述聚乙烯醇的浓度为1-3％(W/V)所述基础细胞培养液比例为92-95％(V/V)。具体地，本实施例中，所述细胞为人类外周血单个核细胞以及体外细胞因子诱导的免疫细胞，其中，所述体外细胞因子诱导的免疫细胞为细胞因子诱导的杀伤细胞、LAK细胞、自然杀伤细胞、NKT细胞、CTL及γδT细胞。即，所述冻存高效稳定剂可以应用于人类外周血免疫细胞，尤其是人类外周血单个核细胞以及体外细胞因子诱导的免疫细胞。

在上述冻存高效稳定剂中，所述脯氨酸作为细胞营养增补剂添加，为细胞提供营养成分，用以补充细胞代谢时消耗的部分能量，确保细胞冻存的活性，也是业界常用的而且安全的营养剂。所述脯氨酸浓度优选范围为1-2％(W/V)，在此范围内营养效果稳定。具体地，本实施例中，所述脯氨酸浓度为1％。

为了避免细胞冻存过程中损伤，防止细胞内形成水晶体，减少细胞内的晶体形成，其中冷冻保护剂的作用十分重要，常用冷冻保护剂一类是渗透性保护剂和非渗透性试剂。本发明的冻存高效稳定剂采用渗透性和非渗透性优化组合保护剂由蔗糖、乙二醇和聚乙烯吡咯烷酮(PVP)组成。所述蔗糖是非渗透性组合保护剂，能避免细胞冻存过程中损伤，保护细胞膜的完整性，是一种高分子葡萄糖聚合物，已认定是一种安全的物质，是目前血浆替代品之一，广泛用于医药、食品、化妆品等行业，在所述冻存高效稳定剂中，所述蔗糖浓度优选范围为5-6％(W/V)，本实施例中，所述蔗糖的浓度为5％(W/V)。所述乙二醇和聚乙烯吡咯烷酮(PVP)为渗透性保护剂，比例为5-8％(V/V)的所述乙二醇和浓度为3-6％(W/V)聚乙烯吡咯烷酮均可防止细胞内结晶形成，避免细胞受损死亡。具体地，本实施例所述乙二醇比例为5％(V/V)。所述聚乙烯吡咯烷酮浓度为3.5％(W/V)。

本发明为使细胞渗透压保持平衡，以及避免细胞过于沉降叠加从而影响细胞冻存效果。使用渗透性的聚乙烯醇(PVA)和依克多因两种作为细胞冻存的稳定剂，所述依克多因、聚乙烯醇浓度分别为2-5％(W/V)和1-3％(W/V)，沉降稳定效果最好，可以避免组织细胞内结晶生成，避免细胞受损死亡。具体地，本实施例，所述依克多因、聚乙烯醇浓度分别为2％(W/V)和1％(W/V)。

在上述冻存高效稳定剂中，使用细胞基础培养液为冻存剂的溶剂，本实施例中使用不含酚红的Alys-Basal基础细胞培养液作为溶剂，Alys-Basal基础细胞培养液是一种无血清合成培养液，不仅是作为使用方便的溶剂，同时还含有一定的氨基酸、重组蛋白为细胞提供营养成分，可以补充细胞代谢消耗的部分能量，为细胞冻存的活性提供条件支持，培养液中含有重组人类蛋白质作为血清或血浆的替代品，因此不会引入动物外源性蛋白，降低了生物危害，无需额外添加溶剂，临床应用更为安全，所述Alys-Basal基础细胞培养液的比例为92-95％(V/V)。具体地，本实施例Alys-Basal基础细胞培养液的比例为95％(V/V)，所述保存条件为2-8℃。

一种人类外周血免疫细胞冻存高效稳定剂的制备方法。

1.配制

1)在称量间将领取的原料隔离并送至配制车间。根据配制数量按照称量的顺序逐一准确称取所需要的量，分装于密封袋中，在密封袋上写上原料名称、原料批号及原料重量，送至配制车间。

2)检查超纯水系统水质并作记录：TOC≤20ppb，电阻率≥15MΩ·cm。

3)用无菌配制桶(或在配制桶内套上一次性无菌塑料袋)采集计划配置量80％的超纯水，要求误差不超过采集量的10％。

4)安装搅拌器，让搅拌叶下探至水位1/3处，调整搅拌速度为：200rpm/min。

5)按原料投放顺序逐一投料，原料完全投进去后，用无菌烧杯装取超纯水倒进密封袋中冲洗，冲洗液体倒进配制桶中。

6)投完原料后将超纯水加至规定的配制量，误差应小于1％。

7)搅拌20min后，用一次性移液管取两次5ml培养液分别装于两支无菌试管中送至品质部进行半成品检测(检测项目：pH值、渗透压、内毒素)。

8)将搅拌器转速调至100rpm/min，搅拌30分钟以上。

2.分装、质控、入库。在无菌环境下进行分装，并由质检人员按要求对产品包装、外观、数量检查，并随机抽样做PH、渗透压、内毒素、无菌检测；质检合格后通知成品仓库验收入库。

冻存高效稳定剂的质量检测

1.内毒素检测

本发明中冻存高效稳定剂内毒素检测凝胶法鲎试剂及相关消耗品购自厦门市鲎试剂实验厂有限公司，鲎试剂规格为0.1ml/支，λ＝0.06，内毒素标准品规格为15EU/支。

内毒素检测操作步骤

取细菌内毒素工作标准品一支配制2λ内毒素标准溶液，阴性对照液，

浓度为2λ的内毒素标准溶液做为阳性对照液。取出鲎试剂，分别用除热源吸头加入0.1ml检查用水，轻摇使鲎试剂完全溶解；在溶解的鲎试剂安瓿瓶内分别加入0.1ml的阴性对照液、阳性对照液和供试品液，用封口膜封闭管口轻轻摇匀，垂直放入37℃恒温器中孵育60min±2min，期间避免振动。

内毒素检测结果判定

孵育结束，将安瓿瓶从恒温器中轻轻取出，缓缓倒转180°。若管内的内容物呈坚实凝胶，不变形，不从管壁滑脱为阳性，记录为(+)；不成凝胶或者虽呈凝胶但不能保持完整并从管壁滑脱为阴性，记为(-)；只有当阴性对照管为阴性，阳性对照管为阳性，实验方为有效，否则无效。

内毒素检测结果见表1

2.支原体检测

取100ul冻存高效稳定剂到支原体液体培养液内，微需氧环境，35-37℃培养3～7天，观察液体培养液是否变浑浊。

若液体培养液变浑浊再转种支原体固体培养液，微需氧环境，35-37℃继续培养3-7天，观察生长菌落，进行支原体确认。

支原体检测结果见表1。

3.真菌及细菌检测

将冻存高效稳定剂检测样品试剂接种于硫乙醇酸盐流体培养液及胰酪大豆胨液体培养液中，置于35～37℃条件下，培养3～7天观察结果；

结果判定：若样品检测管7天均澄清无菌生长，判供试品符合规定；若样品检测管中任何一管显浑浊并确证有菌生长，判供若样品检测不符合规定。

检测结果：真菌及细菌检测见表1

实施案例一结果:

作为另外一种实现，一种人类外周血免疫细胞冻存高效稳定剂，所述冻存高效稳定剂中，所述脯氨酸的浓度为1.5％(W/V)、所述蔗糖的浓度为5.5％(W/V)、所述聚乙烯吡咯烷酮的浓度为3％(W/V)、所述乙二醇的比例为6％(V/V)、所述依克多因浓度为5％(W/V)，所述聚乙烯醇浓度为2％(W/V)，所述基础细胞培养液的比例为94％(V/V)。制备方法同前。

作为另外一种实现，一种人类外周血免疫细胞冻存高效稳定剂，所述冻存剂中，所述脯氨酸的浓度为2％(W/V)、所述蔗糖的浓度为6％(W/V)、所述聚乙烯吡咯烷酮的浓度为6％(W/V)、所述乙二醇的比例为8％(V/V)、所述依克多因浓度为3％(W/V)，所述聚乙烯醇浓度为3％(W/V)，所述基础细胞培养液的比例为92％(V/V)。制备方法同前。

本发明实施例还提供一种人类外周血免疫细胞的冻存方法，包括以下步骤：

(1)抽取肝素抗凝外周血转移至含有人淋巴细胞分离液的50ml离心管中，室温800g离心15min，吸取白膜层细胞，PBS洗涤2次。对于体外细胞因子诱导的免疫细胞的冻存，收集体外培养液中的免疫细胞，将细胞转移至50ml离心管中离心洗涤，用PBS清洗2次；该步骤即为获取需要冻存的细胞。

(2)洗涤后的免疫细胞悬浮于前述冻存高效稳定剂中，获得细胞悬液并计数细胞数量；调整细胞密度至1-2×10⁷个/ml，分装于细胞冻存管中，每管1ml；

(3))冻存管放置程序降温盒中，先放置-80℃过夜冷冻18-26小时，然后转入液氮中长期冻存。

步骤(1)分离人类外周血免疫细胞的免疫细胞，为去除细胞以外其他成分干扰达到更好的效果，可以采用生理盐水、RPMI1640、Alys-Basal基础细胞培养液、PBS中的一种洗涤，本实施例以PBS洗涤2次后冻存。本实施例中，人外周血免疫细胞，包括外周血淋巴细胞、外周血PBMC以及体外经过细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)、LAK细胞、自然杀伤细胞(NK)、NKT细胞、CTL及γδT细胞，均可应用本发明的冻存高效稳定剂及冻存方法；尤其是外周血淋巴细胞和PBMC。

步骤(2)得到的免疫细胞细胞悬液中密度为1-2×10⁷个/ml，以达到足够量的细胞，悬浮混合于本发明冻存剂中形成细胞悬液，分装于细胞冻存管中冻存，每管1ml；更优选细胞密度为1.5×10⁷个/支。

步骤(3)中将程序冻存盒于-80℃过夜冷冻的时间为18-26小时，优选时间为22-24小时。

实施例二

(1)人类外周血免疫细胞分离

采集1名健康志愿者肝素钠溶液抗凝的人类外周血40ml，缓慢注到2支含有15ml淋巴细胞分离液离心管中，室温条件下离心，离心力800xg离心15分钟。离心后血液被分为4层，用无菌吸管采集上层的血浆，倒入灭菌过的离心管中，56℃加热血浆30分钟，保存在冰箱中备用，吸取白膜层细胞，PBS洗涤2次。

(2)对照组冻存液制备

传统技术血清组：用10％胎牛血清+10％DMSO+80％RPMI1640培养液。

市售商品化DMSO组：细胞冻存液LABOBANKER2(NO:BLB-2，不含血清)。

(3)人类外周血免疫细胞冻存

采用传统细胞冻存技术、商品化细胞冻存液和本发明冻存高效稳定剂，按照清洗后的免疫细胞悬浮于细胞冻存液中，获得细胞悬液并计数细胞数量；调整细胞密度至1.5×10⁷个/ml，分装于细胞冻存管中，每管1ml；在相同条件下同时进行放置程序降温盒中，放置于-80℃过夜冷冻24小时，然后转入液氮中长期冻存6个月。

(4)冻存免疫细胞存活率检测

从液氮罐中取出三组不同冻存方法，1、3、6个月人类外周血免疫细胞，在37℃恒温自动加热仪中解冻，使冷冻免疫细胞完全融化，取少量细胞用台盼蓝染色法检测细胞存活率，细胞存活率＝(细胞总数-着色细胞数)/细胞总数×100％，结果见表1：

组别	冻存1个月存活率	冻存3个月存活率	冻存6个月存活率
				传统技术血清组	95％	92％	90％
商品化DMSO组	94％	90％	92％
				本发明技术组	94％	90％	90％

实施例三

(1)体外人淋巴细胞细胞培养(HPBL)

采集1名健康志愿者肝素钠溶液抗凝的人类外周血40ml，将外周血小心地注入到分离液上层，缓升缓降离心细胞，将外周血进行离心，吸取上层血浆，装入无菌离心管置于56℃恒温加热仪内进行30min灭活，冷却至室温后离心取上清保存于4℃备用。吸取单个核细胞层并用PBS离心洗涤三次，最后一次洗涤需要进行计数。接种到175cm2培养瓶中，加入含IL-2700IU/ml的ALyS505N-0无血清培养液，同时加入10％的灭活血浆。接种密度1～2×10⁶个/ml，放入37℃，5％CO₂恒温箱里开始培养(day 0)。培养第三天(day3)，确认培养液颜色变成黄色时，添加含IL-2175IU/ml的ALyS505N-0无血清培养液，继续培养。第五天(day5)，确认培养液颜色再次变成黄色时，再添加含IL-2175IU/ml的ALyS505N-0无血清培养液，继续培养。

(2)HPBL细胞冻存

培养第六天(day6)对数增殖期细胞(活细胞率90％以上，密度100～200×10⁴/ml为基准)，把细胞悬液回收到离心管，以300g×5min做离心收集细胞，按照实施例二中的(3)人类外周血免疫细胞冻存方法冻存HPBL细胞。

(3)HPBL细胞冻存存活率检测

从液氮罐中取出三组不同方法冻存的1、3、6个月人类HPBL细胞在37℃恒温自动加热仪中解冻，使免疫细胞完全融化，取少量细胞用台盼蓝染色法检测细胞存活率，细胞存活率＝(细胞总数-着色细胞数)/细胞总数×100％，结果见表2：

组别	冻存1个月存活率	冻存3个月存活率	冻存6个月存活率
				传统技术组	96％	90％	87％
商品化组	94％	90％	83％
				本发明	95％	88％	86％

实施例四

(1)人外周血PBMC细胞分离

采集100ml外周血小心地将注入到分离液上层，缓升缓降离心细胞，将外周血进行离心，吸取上层血浆，装入无菌离心管置于56℃水浴锅内进行30min灭活，冷却至室温后离心取上清保存于4℃备用。吸取单个核细胞层并用PBS离心洗涤二次，最后一次洗涤需要进行计数，一部分用于直接体外细胞因子诱导NK细胞培养，另一部分细胞用于本发明技术冻存保存6个月进行细胞因子诱导NK细胞培养，冻存方法参考实施中二中的(3)人类外周血免疫细胞冻存方法冻存。

(2)冻存人外周血PBMC细胞复苏

取多管冻存6个月的人外周血免疫细胞复苏，在37℃恒温自动加热仪中完全溶解，细胞活率>90％，用ALyS505N-0无血清培养液洗涤一次并计数，数量大于2×10⁷/ml，使用于冻存细胞体外细胞因子诱导NK细胞培养与未冻存细胞体外细胞因子诱导NK细胞培养的数量相同。

(3)冻存与未冻存人类外周血PBMC体外诱导NK细胞培养

吸取4ml PBS稀释1ml Lymactin-NK抗体，加入T75cm2悬浮细胞培养瓶中轻轻摇晃培养瓶，让溶液在培养培养瓶表面扩散。在室温下，至少孵育2个小时，接种细胞前弃掉包被液并用10ml PBS洗涤培养瓶。

取2ml灭活血浆加入回温后的18ml含IL-2(1000IU/ml)、IL-15(20IU/ml)的Alys505NK-AC培养液混合，分别接种冻存和非冻存免疫细胞到包被的培养瓶中，使单个核细胞密度大于1.0×10⁶个/ml，置于37℃、5％CO₂培养箱中静置培养，计当天为Day0。按照Day3补加含IL-2(1000IU/ml)、IL-15(20IU/ml)的Alys505NK-AC培养液40ml，Day5将细胞转移到T175cm2培养瓶中，并补加含IL-2(1000IU/ml)、IL-15(20IU/ml)的Alys505NK-AC培养液140ml，静置培养。

培养到Day7将全部细胞平均转至2个NIPRO细胞培养袋中扩大培养，每袋分别补加含有IL-2(700IU/ml)的Alys505NK-EX无血清培养液400ml，Day9、Day11分别补加含有IL-2(700IU/ml)的Alys505NK-EX无血清培养液700ml、900ml，静置培养，Day14收获细胞(细胞形态图如图1、2所示)。

(4)结果测定

收获由本实施例所述未冻存组及冻存组培养Day14细胞，用用血球计数板计算细胞总数。从附表三和附图3可看出实施例所述未冻存组及冻存组没有明显差异，冻存6个月的免疫细胞仍具有较好的增殖性，未冻存组及冻存组的免疫细胞增殖数量基本一致。

收获培养Day14细胞NK细胞表型(CD3-CD56+)检测，洗涤后的细胞重悬至密度为1×10⁷个/ml，各取两个管分别加入100μl的细胞悬液，每组内一管加10μl IgG1-PE及10μlIgG1-FITC作为同型对照，另一管加10μl CD56-PE及10μl CD3-FITC作为样品检测；共同冰浴30min后检测。从附图4、5可看出未冻存组及冻存组没有明显差异，两组CD3^-CD56⁺比例均达57％，本发明冻存6个月人类外周血免疫细胞体外细胞因子诱导NK细胞培养表现出较高的高纯度，未冻存组及冻存组的免疫细胞细胞免疫学表型基本一致。结果见表3：

组别	增殖细胞数量	CD3<sup>-</sup>CD56<sup>+</sup>
			非冻存组	4.6×10<sup>9</sup>	60.98％
冻存组	4.5×10<sup>9</sup>	60.88％

实施例五

(1)人外周血PBMC细胞分离

(2)冻存人外周血PDMC细胞复苏

取多管冻存6个月的人外周血PBMC细胞复苏，在37℃恒温自动加热仪中完全溶解，细胞活率>90％，用ALyS505N-0无血清培养液洗涤一次并计数，数量大于7.5×10⁷/ml，使用于冻存细胞体外细胞因子诱导CIK细胞培养与未冻存细胞体外细胞因子诱导CIK细胞培养的数量相同。

(3)冻存与未冻存人类外周血免疫细胞体外细胞因子诱导CIK细胞培养

在T-75cm²的细胞培养瓶中加入50ml含10％灭活自体血浆细胞培养液，重悬细胞调整细胞密度≥1.5x10⁶cells/ml，并添加IFN-γ(1000IU/ml)，置于5％CO₂、37℃培养箱中培养；24h后，培养瓶中加入Lymactin-T(50μg)、IL-2(1000IU/ml)、IL-1α(100IU/ml)，继续培养；Day3加入ALyS505N-0培养基50ml含IL-2(1000IU/ml)、Day5转入细胞培养袋中扩大培养，补加含10％自体灭活血浆及IL-2(1000IU/ml)的ALyS505N-0的培养基。

每袋分别补100ml加含有IL-2(700IU/ml)的Alys505NK-0无血清培养液400ml，Day7、Day9、Day11分别补加含有IL-2(700IU/ml)的Alys505NK-0无血清培养液1000ml、1000ml、1400ml，静置培养，Day14收获细胞(细胞形态图如图6、7所示)

(3)细胞培养至Day14，进行细胞计数，离心洗涤收集细胞，加入流式细胞检测荧光抗体，通过流式细胞仪检测CD3^-CD56⁺细胞和CD3⁺CD56⁺细胞所占比例。

收获由本实施例所述未冻存组及冻存组培养Day14细胞，用用血球计数板计算细胞总数。从附表4和附图8可看出实施例所述未冻存组及冻存组没有明显差异，冻存6个月的PBMC细胞仍具有较好的增殖性，未冻存组及冻存组的免疫细胞增殖数量基本一致。

收获培养Day14细胞CIK细胞表型(CD3⁺CD56⁺)检测，洗涤后的细胞重悬至密度为1×10⁷个/ml，各取两个管分别加入100μl的细胞悬液，每组内一管加10μl IgG1-PE及10μlIgG1-FITC作为同型对照，另一管加10μl CD56-PE及10μl CD3-FITC作为样品检测；共同冰浴30min后检测。从附图4可看出未冻存组及冻存组没有明显差异，两组CD3+CD56+比例均达30％，本发明冻存6个月人类外周血免疫细胞体外细胞因子诱导CIK细胞培养表现出较高的高纯度，未冻存组及冻存组的免疫细胞细胞免疫学表型基本一致。结果见表4：

组别	增殖细胞数量	CD3<sup>+</sup>CD56<sup>+</sup>
			非冻存组	9.2×10<sup>9</sup>	31.08％
冻存组	9.1×10<sup>9</sup>	30.19％

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所做的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种人类外周血免疫细胞冻存高效稳定剂，其特征在于，所述冻存高效稳定剂主要成分为脯氨酸、蔗糖、聚乙烯吡咯烷酮、乙二醇、依克多因、聚乙烯醇及不含酚红的基础细胞培养液。

2.根据权利要求1所述的冻存高效稳定剂，其特征在于所述脯氨酸浓度为1-2％，W/V；所述蔗糖的浓度为5-6％，W/V；所述聚乙烯吡咯烷酮的浓度为3-6％，W/V；所述乙二醇的V/V比例为5-8％，所述依克多因的浓度为2-5％，W/V；所述聚乙烯醇的浓度为1-3％，W/V；所述基础细胞培养液比例为92-95％，V/V。

3.根据权利要求1或2所述的冻存高效稳定剂，其特征在于，所述人类外周血免疫细胞为人类外周血单个核细胞以及体外细胞因子诱导的免疫细胞。

4.根据权利要求3所述的冻存高效稳定剂，其特征在于，所述体外细胞因子诱导的免疫细胞为CIK细胞、LAK细胞、自然杀伤细胞、NKT细胞、CTL及γδT细胞等。

5.根据权利要求1所述的冻存高效稳定剂，其特征在于，所述基础细胞培养液为不含酚红的Alys-Basal基础细胞培养液。

6.权利要求1-5任意一项所述冻存高效稳定剂在冻存人类外周血单个核细胞以及体外细胞因子诱导的免疫细胞中的应用。

7.根据权利要求6所述应用，其特征在于，所述体外细胞因子诱导的免疫细胞为杀伤细胞、LAK细胞、自然杀伤细胞、NKT细胞、CTL及γδT细胞。

8.一种利用权利要求1-5任意一项所述冻存高效稳定剂进行细胞冻存方法，包括以下步骤：

9.根据权利要求8所述细胞冻存方法，其特征在于，所述细胞悬液细胞密度是1-2×10⁷个/ml。

10.根据权利要求8所述细胞冻存方法，先放置-80℃过夜冷冻的时间为18-26小时，再转移至液氮长期保存。