JP2024015137A - 腫瘍抗原特異的t細胞について濃縮されたtil製品を生成するためのプロセス - Google Patents
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Abstract
【課題】腫瘍抗原特異的T細胞について濃縮されたTIL製品を生成するためのプロセスの提供。【解決手段】本発明は、増加した治療有効性を有する治療用TIL集団を調製するためにTILを再プログラミングするための改善及び/又は短縮されたプロセス及び方法を提供する。そのような再プログラミングされたTILは、治療用処置レジメンでの使用を見出す。【選択図】なし
Description
関連出願の相互参照
[0001] 本出願は、2018年1月8日に提出された米国仮特許出願第62/614,887号、2018年4月27日に提出された米国仮特許出願第62/664,034号、2018年5月9日に提出された米国仮特許出願第62/669,319号、2018年7月13日に提出された米国仮特許出願第62/697,921号、2018年9月21日に提出された米国仮特許出願第62/734,868号及び2018年11月30日に提出された米国仮特許出願第62/773,715号に対する優先権を主張し、これらは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
[0001] 本出願は、2018年1月8日に提出された米国仮特許出願第62/614,887号、2018年4月27日に提出された米国仮特許出願第62/664,034号、2018年5月9日に提出された米国仮特許出願第62/669,319号、2018年7月13日に提出された米国仮特許出願第62/697,921号、2018年9月21日に提出された米国仮特許出願第62/734,868号及び2018年11月30日に提出された米国仮特許出願第62/773,715号に対する優先権を主張し、これらは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
配列表
[0002] 本出願は、ASCII形式で電子的に提出された配列表を含み、その全体は、参照により本明細書に組み込まれる。前記ASCIIの写しは、2019年1月7日に作成され、116983-5034-WO_ST25.txtという名称であり、122キロバイトのサイズである
。
[0002] 本出願は、ASCII形式で電子的に提出された配列表を含み、その全体は、参照により本明細書に組み込まれる。前記ASCIIの写しは、2019年1月7日に作成され、116983-5034-WO_ST25.txtという名称であり、122キロバイトのサイズである
。
発明の背景
[0003] 腫瘍浸潤リンパ球(TIL)の養子移植を用いたかさ高い抵抗性の癌の処置は、予後不良の患者に対する治療への強力なアプローチとなる。Gattinoni, et al., Nat. Rev. Immunol. 2006, 6, 383-393。免疫療法の成功には多量のTILが必要であり、商業化に向けてロバストで信頼性のある方法が求められている。これは、細胞拡大培養に伴う技術上、物流上及び規制上の問題に起因して実現が課題となっている。IL-2ベースのTIL拡大培養、それに続く「急速拡大培養法」(REP)は、その速さ及び効率から、TIL拡大培養に好ましい方法となりつつある。Dudley, et al., Science 2002, 298, 850-54;Dudley, et al., J. Clin. Oncol. 2005, 23, 2346-57;Dudley, et al., J. Clin. Oncol. 2008, 26, 5233-39;Riddell, et al., Science 1992, 257, 238-41;Dudley,
et al., J. Immunother. 2003, 26, 332-42。REPは、14日の期間でTILの1,000倍の拡大をもたらすことができるが、それには、フィーダー細胞として、多くの場合に複数のドナーからの大過剰の(例えば、200倍の)照射した同種異系末梢血単核球(PBMC、単核球(MNC)としても知られる)並びに抗CD3抗体(OKT3)及び高用量のIL-2が必要である。Dudley, et al., J. Immunother. 2003, 26, 332-42。R
EP手順を経たTILは、黒色腫患者において宿主免疫抑制後に養子細胞療法の成功をもたらしている。現行の注入適合パラメータは、TILの組成(例えば、CD28、CD8又はCD4陽性)の読み取り並びにREP産物の拡大倍数及び生存率に依存するものである。
[0003] 腫瘍浸潤リンパ球(TIL)の養子移植を用いたかさ高い抵抗性の癌の処置は、予後不良の患者に対する治療への強力なアプローチとなる。Gattinoni, et al., Nat. Rev. Immunol. 2006, 6, 383-393。免疫療法の成功には多量のTILが必要であり、商業化に向けてロバストで信頼性のある方法が求められている。これは、細胞拡大培養に伴う技術上、物流上及び規制上の問題に起因して実現が課題となっている。IL-2ベースのTIL拡大培養、それに続く「急速拡大培養法」(REP)は、その速さ及び効率から、TIL拡大培養に好ましい方法となりつつある。Dudley, et al., Science 2002, 298, 850-54;Dudley, et al., J. Clin. Oncol. 2005, 23, 2346-57;Dudley, et al., J. Clin. Oncol. 2008, 26, 5233-39;Riddell, et al., Science 1992, 257, 238-41;Dudley,
et al., J. Immunother. 2003, 26, 332-42。REPは、14日の期間でTILの1,000倍の拡大をもたらすことができるが、それには、フィーダー細胞として、多くの場合に複数のドナーからの大過剰の(例えば、200倍の)照射した同種異系末梢血単核球(PBMC、単核球(MNC)としても知られる)並びに抗CD3抗体(OKT3)及び高用量のIL-2が必要である。Dudley, et al., J. Immunother. 2003, 26, 332-42。R
EP手順を経たTILは、黒色腫患者において宿主免疫抑制後に養子細胞療法の成功をもたらしている。現行の注入適合パラメータは、TILの組成(例えば、CD28、CD8又はCD4陽性)の読み取り並びにREP産物の拡大倍数及び生存率に依存するものである。
[0004] 商業規模の製造及び複数の臨床センターのヒト患者に使用するための規制当局の承認に適している、より強力又は効果的なTIL製造プロセス及びかかるプロセスに基づく治療法を提供する緊急の必要性が存在する。本発明は、増加した治療有効性を有する治療用TIL集団を調製するためにTILを再プログラミングするための一過性の遺伝子改変プロセスを提供することにより、この必要性を満たす。
発明の概要
[0005] 本発明は、TILを拡大培養し、且つ治療用TIL集団を生じさせるための改善及び/又は短縮された方法を提供する。
[0005] 本発明は、TILを拡大培養し、且つ治療用TIL集団を生じさせるための改善及び/又は短縮された方法を提供する。
[0006] 本発明は、腫瘍浸潤リンパ球(TIL)を治療用TIL集団に拡大培養する方法も提供し、この方法は、(i)患者から切除された腫瘍から第1のTIL集団を得ること;(ii)IL-2及び任意選択によりOKT-3を含む細胞培養培地中で第1のTIL集団を培養することにより、第1の拡大培養を実施して第2のTIL集団を生じさせること;(iii)第2のTIL集団の細胞培養培地に追加のIL-2、OKT-3及び抗原提示細胞(APC)を補充することにより、第2の拡大培養を実施して第3のTIL集団を生じさせること
、第3のTIL集団は、第2のTIL集団よりも数において少なくとも100倍多く、第2の拡大培養は、第3のTIL集団を得るために少なくとも14日間にわたって実施され、第3のTIL集団は、治療用TIL集団である、生じさせること;及び(iv)第2及び/又は第3のTIL集団を、転写因子(TF)及び/又はタンパク質発現を一過性に変化させることができる他の分子に曝露することであって、TF及び/又はタンパク質発現を一過性に変化させることができる他の分子は、腫瘍抗原の変化した発現及び/又は治療用TIL集団における腫瘍抗原特異的T細胞の数の変化を提供する、曝露することを含む。
、第3のTIL集団は、第2のTIL集団よりも数において少なくとも100倍多く、第2の拡大培養は、第3のTIL集団を得るために少なくとも14日間にわたって実施され、第3のTIL集団は、治療用TIL集団である、生じさせること;及び(iv)第2及び/又は第3のTIL集団を、転写因子(TF)及び/又はタンパク質発現を一過性に変化させることができる他の分子に曝露することであって、TF及び/又はタンパク質発現を一過性に変化させることができる他の分子は、腫瘍抗原の変化した発現及び/又は治療用TIL集団における腫瘍抗原特異的T細胞の数の変化を提供する、曝露することを含む。
[0007] 一部の実施形態において、方法は、第2及び/又は第3のTIL集団を、転写因子(TF)及び/又はタンパク質発現を一過性に変化させることができる他の分子に曝露することを更に含み、ここで、TF及び/又はタンパク質発現を一過性に変化させることができる他の分子は、腫瘍抗原の変化した発現及び/又は治療用TIL集団における腫瘍抗原特異的T細胞の数の変化を提供する。
[0008] 本発明は、腫瘍浸潤リンパ球(TIL)を治療用TIL集団に拡大培養する方法であって、
(a)患者から得られた腫瘍サンプルを複数の腫瘍断片に処理することにより、患者から切除された腫瘍から第1のTIL集団を得ること;
(b)腫瘍断片を閉鎖系に添加すること;
(c)IL-2を含む細胞培養培地中で第1のTIL集団を培養することにより、第1の拡大培養を実施して第2のTIL集団を生じさせることであって、第1の拡大培養は、第1のガス透過性表面積を提供する閉鎖型容器内で実施され、第1の拡大培養は、第2のTIL集団を得るために約3~14日間にわたって実施され、第2のTIL集団は、第1のTIL集団よりも数において少なくとも50倍多く、ステップ(b)からステップ(c)への移行は、系を開放することなく行われる、生じさせること;
(d)第2のTIL集団の細胞培養培地に追加のIL-2、OKT-3及び抗原提示細胞(APC)を補充することにより、第2の拡大培養を実施して第3のTIL集団を生じさせることであって、第2の拡大培養は、第3のTIL集団を得るために約7~14日間にわたって実施され、第3のTIL集団は、治療用TIL集団であり、第2の拡大培養は、第2のガス透過性表面積を提供する閉鎖型容器内で実施され、ステップ(c)からステップ(d)への移行は、系を開放することなく行われる、生じさせること;
(e)第2及び/又は第3のTIL集団を、転写因子(TF)及び/又はタンパク質発現を一過性に変化させることができる他の分子に曝露することであって、TF及び/又はタンパク質発現を一過性に変化させることができる他の分子は、腫瘍抗原の変化した発現及び/又は治療用TIL集団における腫瘍抗原特異的T細胞の数の変化を提供する、曝露すること;
(f)ステップ(d)から得られた治療用TIL集団を回収することであって、ステップ(d)からステップ(e)への移行は、系を開放することなく行われる、回収すること;
及び
(g)ステップ(e)からの回収されたTIL集団を輸注バッグに移すことであって、ステップ(e)から(f)への移行は、系を開放することなく行われる、移すこと
を含む方法も提供する。
(a)患者から得られた腫瘍サンプルを複数の腫瘍断片に処理することにより、患者から切除された腫瘍から第1のTIL集団を得ること;
(b)腫瘍断片を閉鎖系に添加すること;
(c)IL-2を含む細胞培養培地中で第1のTIL集団を培養することにより、第1の拡大培養を実施して第2のTIL集団を生じさせることであって、第1の拡大培養は、第1のガス透過性表面積を提供する閉鎖型容器内で実施され、第1の拡大培養は、第2のTIL集団を得るために約3~14日間にわたって実施され、第2のTIL集団は、第1のTIL集団よりも数において少なくとも50倍多く、ステップ(b)からステップ(c)への移行は、系を開放することなく行われる、生じさせること;
(d)第2のTIL集団の細胞培養培地に追加のIL-2、OKT-3及び抗原提示細胞(APC)を補充することにより、第2の拡大培養を実施して第3のTIL集団を生じさせることであって、第2の拡大培養は、第3のTIL集団を得るために約7~14日間にわたって実施され、第3のTIL集団は、治療用TIL集団であり、第2の拡大培養は、第2のガス透過性表面積を提供する閉鎖型容器内で実施され、ステップ(c)からステップ(d)への移行は、系を開放することなく行われる、生じさせること;
(e)第2及び/又は第3のTIL集団を、転写因子(TF)及び/又はタンパク質発現を一過性に変化させることができる他の分子に曝露することであって、TF及び/又はタンパク質発現を一過性に変化させることができる他の分子は、腫瘍抗原の変化した発現及び/又は治療用TIL集団における腫瘍抗原特異的T細胞の数の変化を提供する、曝露すること;
(f)ステップ(d)から得られた治療用TIL集団を回収することであって、ステップ(d)からステップ(e)への移行は、系を開放することなく行われる、回収すること;
及び
(g)ステップ(e)からの回収されたTIL集団を輸注バッグに移すことであって、ステップ(e)から(f)への移行は、系を開放することなく行われる、移すこと
を含む方法も提供する。
[0009] 一部の実施形態において、方法は、第3のTIL集団の細胞培養培地に追加のIL-2、追加のOKT-3及び追加のAPCを補充することにより、追加の第2の拡大培養をステップ(iv)前又は後に実施することを更に含み、ここで、追加の第2の拡大培養は、ステップ(iii)で得られたよりも大きい治療用TIL集団を得るために少なくとも14日間にわたって実施され、より大きい治療用TIL集団は、腫瘍抗原特異的T細胞の数の変化を示す。
[0010] 一部の実施形態において、本方法は、凍結保存プロセスを使用して、ステップ(f)における回収されたTIL集団を含む輸注バッグを凍結保存するステップを更に含む。
[0011] 一部の実施形態において、凍結保存プロセスは、回収されたTIL集団と凍結保存培地との1:1の比率を使用して実施される。
[0012] 一部の実施形態において、抗原提示細胞は、末梢血単核球(PBMC)である。一部の実施形態において、PBMCは、照射され、且つ同種異系である。一部の実施形態において、PBMCは、ステップ(d)において9~14日目のいずれかに細胞培養物に加えられる。一部の実施形態において、抗原提示細胞は、人工抗原提示細胞である。
[0013] 一部の実施形態において、ステップ(e)における回収は、膜ベースの細胞処理系を使用して実施される。
[0014] 一部の実施形態において、ステップ(e)における回収は、LOVO細胞処理系を使用して実施される。
[0015] 一部の実施形態において、複数の断片は、約4~約50個の断片を含み、各断片は、約27mm3の容積を有する。
[0016] 一部の実施形態において、複数の断片は、約1300mm3~約1500mm3の総容積を有する約30~約60個の断片を含む。
[0017] 一部の実施形態において、複数の断片は、約1350mm3の総容積を有する約50個の断片を含む。
[0018] 一部の実施形態において、複数の断片は、約1グラム~約1.5グラムの総質量を有する約50個の断片を含む。
[0019] 一部の実施形態において、細胞培養培地は、Gコンテナ及びXuri細胞培養バッグからなる群から選択される容器内に提供される。
[0020] 一部の実施形態において、ステップ(d)における細胞培養培地は、IL-15及び/又はIL-21を更に含む。
[0021] 一部の実施形態において、IL-2濃度は、約10,000IU/mL~約5,000IU/mLである。
[0022] 一部の実施形態において、IL-15濃度は、約500IU/mL~約100IU/mLである。
[0023] 一部の実施形態において、IL-21濃度は、約20IU/mL~約0.5IU/mLである。
[0024] 一部の実施形態において、ステップ(f)における輸注バッグは、HypoThermosol含有輸注バッグである。
[0025] 一部の実施形態において、凍結保存培地は、ジメチルスルホキシド(DMSO)を含む。一部の実施形態において、凍結保存培地は、7%~10%のジメチルスルホキシド(DMSO)を含む。
[0026] 一部の実施形態において、ステップ(c)における第1の期間及びステップ(e)における第2の期間は、10日、11日又は12日の期間内にそれぞれ個別に実施される。
[0027] 一部の実施形態において、ステップ(c)における第1の期間及びステップ(e)における第2の期間は、11日の期間内にそれぞれ個別に実施される。
[0028] 一部の実施形態において、ステップ(a)~(f)は、約10日~約22日の期間内に実施される。
[0029] 一部の実施形態において、ステップ(a)~(f)は、約20日~約22日の期間内に実施される。
[0030] 一部の実施形態において、ステップ(a)~(f)は、約15日~約20日の期間内に実施される。
[0031] 一部の実施形態において、ステップ(a)~(f)は、約10日~約20日の期間内に実施される。
[0032] 一部の実施形態において、ステップ(a)~(f)は、約10日~約15日の期間内に実施される。
[0033] 一部の実施形態において、ステップ(a)~(f)は、22日以下で実施される。
[0034] 一部の実施形態において、ステップ(a)~(f)は、20日以下で実施される。
[0035] 一部の実施形態において、ステップ(a)~(f)は、15日以下で実施される。
[0036] 一部の実施形態において、ステップ(a)~(f)は、10日以下で実施される。
[0037] 一部の実施形態において、ステップ(a)~(f)及び凍結保存は、22日以下で実施される。
[0038] 一部の実施形態において、ステップ(e)で回収された治療用TIL集団は、治療有効投与量のTILのために十分なTILを含む。
[0039] 一部の実施形態において、治療有効投与量のために十分なTILの数は、約2.3×1010~約13.7×1010個である。
[0040] 一部の実施形態において、ステップ(b)~(e)は、単一の容器内で実施され、ステップ(b)~(e)を単一の容器で実施することは、ステップ(b)~(e)を複数の容器内で実施することと比較して、切除された腫瘍毎のTIL収率の増加をもたらす。
[0041] 一部の実施形態において、抗原提示細胞は、系を開放することなく、ステップ(d)における第2の期間中にTILに添加される。
[0042] 一部の実施形態において、ステップ(d)における第3のTIL集団は、対象に投与されたときに少なくとも5倍以上のインターフェロンγ産生を提供する。
[0043] 一部の実施形態において、微生物汚染のリスクは、開放系と比較して低減される。
[0044] 一部の実施形態において、ステップ(f)又は(g)からのTILは、患者に注入される。
[0045] 一部の実施形態において、複数の断片は、約4個の断片を含む。
[0046] 本発明は、癌を有する対象を処置する方法であって、
(a)患者から得られた腫瘍サンプルを複数の腫瘍断片に処理することにより、対象から切除された腫瘍から第1のTIL集団を得ること;
(b)腫瘍断片を閉鎖系に添加すること;
(c)IL-2を含む細胞培養培地中で第1のTIL集団を培養することにより、第1の拡大培養を実施して第2のTIL集団を生じさせることであって、第1の拡大培養は、第1のガス透過性表面積を提供する閉鎖型容器内で実施され、第1の拡大培養は、第2のTIL集団を得るために約3~14日間にわたって実施され、第2のTIL集団は、第1のTIL集団よりも数において少なくとも50倍多く、ステップ(b)からステップ(c)への移行は、系を開放することなく行われる、生じさせること;
(d)第2のTIL集団の細胞培養培地に追加のIL-2、OKT-3及び抗原提示細胞(APC)を補充することにより、第2の拡大培養を実施して第3のTIL集団を生じさせることであって、第2の拡大培養は、第3のTIL集団を得るために約7~14日間にわたって実施され、第3のTIL集団は、治療用TIL集団であり、第2の拡大培養は、第2のガス透過性表面積を提供する閉鎖型容器内で実施され、ステップ(c)からステップ(d)への移行は、系を開放することなく行われる、生じさせること;
(e)第2及び/又は第3のTIL集団を、転写因子(TF)及び/又はタンパク質発現を一過性に変化させることができる他の分子に曝露することであって、TF及び/又はタンパク質発現を一過性に変化させることができる他の分子は、腫瘍抗原の増加した発現及び/又は治療用TIL集団における腫瘍抗原特異的T細胞の数の増加を提供する、曝露すること;
(f)ステップ(d)から得られた治療用TIL集団を回収することであって、ステップ(d)からステップ(e)への移行は、系を開放することなく行われる、回収すること;及び
(g)ステップ(e)からの回収されたTIL集団を輸注バッグに移すことであって、ステップ(e)から(f)への移行は、系を開放することなく行われる、移すこと;
(h)任意選択により、凍結保存プロセスを使用して、ステップ(f)からの回収されたTIL集団を含む輸注バッグを凍結保存すること;及び
(i)ステップ(g)における輸注バッグから治療有効投与量の第3のTIL集団を患者に投与すること
を含む、拡大培養された腫瘍浸潤リンパ球(TIL)を投与することを含む方法も提供する。
(a)患者から得られた腫瘍サンプルを複数の腫瘍断片に処理することにより、対象から切除された腫瘍から第1のTIL集団を得ること;
(b)腫瘍断片を閉鎖系に添加すること;
(c)IL-2を含む細胞培養培地中で第1のTIL集団を培養することにより、第1の拡大培養を実施して第2のTIL集団を生じさせることであって、第1の拡大培養は、第1のガス透過性表面積を提供する閉鎖型容器内で実施され、第1の拡大培養は、第2のTIL集団を得るために約3~14日間にわたって実施され、第2のTIL集団は、第1のTIL集団よりも数において少なくとも50倍多く、ステップ(b)からステップ(c)への移行は、系を開放することなく行われる、生じさせること;
(d)第2のTIL集団の細胞培養培地に追加のIL-2、OKT-3及び抗原提示細胞(APC)を補充することにより、第2の拡大培養を実施して第3のTIL集団を生じさせることであって、第2の拡大培養は、第3のTIL集団を得るために約7~14日間にわたって実施され、第3のTIL集団は、治療用TIL集団であり、第2の拡大培養は、第2のガス透過性表面積を提供する閉鎖型容器内で実施され、ステップ(c)からステップ(d)への移行は、系を開放することなく行われる、生じさせること;
(e)第2及び/又は第3のTIL集団を、転写因子(TF)及び/又はタンパク質発現を一過性に変化させることができる他の分子に曝露することであって、TF及び/又はタンパク質発現を一過性に変化させることができる他の分子は、腫瘍抗原の増加した発現及び/又は治療用TIL集団における腫瘍抗原特異的T細胞の数の増加を提供する、曝露すること;
(f)ステップ(d)から得られた治療用TIL集団を回収することであって、ステップ(d)からステップ(e)への移行は、系を開放することなく行われる、回収すること;及び
(g)ステップ(e)からの回収されたTIL集団を輸注バッグに移すことであって、ステップ(e)から(f)への移行は、系を開放することなく行われる、移すこと;
(h)任意選択により、凍結保存プロセスを使用して、ステップ(f)からの回収されたTIL集団を含む輸注バッグを凍結保存すること;及び
(i)ステップ(g)における輸注バッグから治療有効投与量の第3のTIL集団を患者に投与すること
を含む、拡大培養された腫瘍浸潤リンパ球(TIL)を投与することを含む方法も提供する。
[0047] 一部の実施形態において、ステップ(f)で回収された治療用TIL集団は、ステップ(h)の治療有効投与量のTILを投与するのに十分なTILを含む。
[0048] 一部の実施形態において、ステップ(h)における治療有効投与量の投与に十分なTILの数は、約2.3×1010~約13.7×1010個である。
[0049] 一部の実施形態において、抗原提示細胞(APC)は、PBMCである。
[0050] 一部の実施形態において、PBMCは、ステップ(d)において9~14日目のいずれかに細胞培養物に添加される。
[0051] 一部の実施形態において、ステップ(h)で治療有効投与量のTIL細胞を投与する前に非破壊的リンパ球枯渇レジメンが患者に投与されている。
[0052] 一部の実施形態において、骨髄非破壊的リンパ球枯渇レジメンは、60mg/m2/日の用量で2日間のシクロホスファミドの投与ステップと、それに続く25mg/m2/日の用量で5日間のフルダラビンの投与ステップを含む。
[0053] 一部の実施形態において、本方法は、ステップ(h)で患者にTIL細胞を投与した翌日に始まる高用量IL-2レジメンで患者を処置するステップを更に含む。
[0054] 一部の実施形態において、高用量IL-2レジメンは、忍容量まで8時間毎に15分ボーラス静脈内注入として投与される600,000又は720,000IU/kgを含む。
[0055] 一部の実施形態において、癌は、黒色腫、卵巣癌、子宮頸癌、非小細胞肺癌(NSCLC)、肺癌、膀胱癌、乳癌、ヒトパピローマウイルスによって引き起こされる癌、頭頸部癌(頭頸部扁平上皮癌(HNSCC)を含む)、腎癌及び腎細胞癌からなる群から選択される。
[0056] 一部の実施形態において、癌は、黒色腫、HNSCC、子宮頸癌及びNSCLCからなる群から選択される。
[0057] 一部の実施形態において、癌は、黒色腫である。
[0058] 一部の実施形態において、癌は、HNSCCである。
[0059] 一部の実施形態において、癌は、子宮頸癌である。
[0060] 一部の実施形態において、癌は、NSCLCである。
[0061] 本発明は、腫瘍浸潤リンパ球(TIL)を治療用TIL集団に拡大培養する方法も提供し、この方法は、
(a)第1のTIL集団を得るために、患者から切除された腫瘍から処理された腫瘍断片を閉鎖系に添加すること;
(b)IL-2を含む細胞培養培地中で第1のTIL集団を培養することにより、第1の拡大培養を実施して第2のTIL集団を生じさせることであって、第1の拡大培養は、第1のガス透過性表面積を提供する閉鎖型容器内で実施され、第1の拡大培養は、第2のTIL集団を得るために約3~14日間行われ、第2のTIL集団は、第1のTIL集団よりも数において少なくとも50倍多く、ステップ(a)からステップ(b)への移行は、系を開放することなく行われる、生じさせること;
(c)第2のTIL集団の細胞培養培地に追加のIL-2、OKT-3及び抗原提示細胞(APC)を補充することにより、第2の拡大培養を実施して第3のTIL集団を生じさせることであって、第2の拡大培養は、第3のTIL集団を得るために約7~14日間にわたって実施され、第3のTIL集団は、治療用TIL集団であり、第2の拡大培養は、第2のガス透過性表面積を提供する閉鎖型容器内で実施され、ステップ(b)からステップ(c)への移行は、系を開放することなく行われる、生じさせること;
(d)ステップ(c)から得られた治療用TIL集団を回収することであって、ステップ(c)からステップ(d)への移行は、系を開放することなく行われる、回収すること;及び
(e)ステップ(d)からの回収されたTIL集団を輸注バッグに移すことであって、ステップ(d)から(e)への移行は、系を開放することなく行われる、移すこと
を含む。
(a)第1のTIL集団を得るために、患者から切除された腫瘍から処理された腫瘍断片を閉鎖系に添加すること;
(b)IL-2を含む細胞培養培地中で第1のTIL集団を培養することにより、第1の拡大培養を実施して第2のTIL集団を生じさせることであって、第1の拡大培養は、第1のガス透過性表面積を提供する閉鎖型容器内で実施され、第1の拡大培養は、第2のTIL集団を得るために約3~14日間行われ、第2のTIL集団は、第1のTIL集団よりも数において少なくとも50倍多く、ステップ(a)からステップ(b)への移行は、系を開放することなく行われる、生じさせること;
(c)第2のTIL集団の細胞培養培地に追加のIL-2、OKT-3及び抗原提示細胞(APC)を補充することにより、第2の拡大培養を実施して第3のTIL集団を生じさせることであって、第2の拡大培養は、第3のTIL集団を得るために約7~14日間にわたって実施され、第3のTIL集団は、治療用TIL集団であり、第2の拡大培養は、第2のガス透過性表面積を提供する閉鎖型容器内で実施され、ステップ(b)からステップ(c)への移行は、系を開放することなく行われる、生じさせること;
(d)ステップ(c)から得られた治療用TIL集団を回収することであって、ステップ(c)からステップ(d)への移行は、系を開放することなく行われる、回収すること;及び
(e)ステップ(d)からの回収されたTIL集団を輸注バッグに移すことであって、ステップ(d)から(e)への移行は、系を開放することなく行われる、移すこと
を含む。
[0062] 一部の実施形態において、ステップ(d)で回収された治療用TIL集団は、治療有効投与量のTILのために十分なTILを含む。
[0063] 一部の実施形態において、治療有効投与量のために十分なTILの数は、約2.3×1010~約13.7×1010個である。
[0064] 一部の実施形態において、本方法は、凍結保存プロセスを使用して、回収されたTIL集団を含む輸注バッグを凍結保存するステップを更に含む。
[0065] 一部の実施形態において、凍結保存プロセスは、回収されたTIL集団と凍結保存培地との1:1の比率を使用して実施される。
[0066] 一部の実施形態において、抗原提示細胞は、末梢血単核球(PBMC)である。
[0067] 一部の実施形態において、PBMCは、照射され、且つ同種異系である。
[0068] PBMCは、ステップ(c)において9~14日目のいずれかに細胞培養物に添加される、請求項68に記載の方法。
[0069] 一部の実施形態において、抗原提示細胞は、人工抗原提示細胞である。
[0070] 一部の実施形態において、ステップ(d)における回収は、LOVO細胞処理系を使用して実施される。
[0071] 一部の実施形態において、複数の断片は、約4~約50個の断片を含み、各断片は、約27mm3の容積を有する。
[0072] 一部の実施形態において、複数の断片は、約1300mm3~約1500mm3の総容積を有する約30~約60個の断片を含む。
[0073] 一部の実施形態において、複数の断片は、約1350mm3の総容積を有する約50個の断片を含む。
[0074] 一部の実施形態において、複数の断片は、約1グラム~約1.5グラムの総質量を有する約50個の断片を含む。
[0075] 一部の実施形態において、複数の断片は、約4個の断片を含む。
[0076] 一部の実施形態において、第2の細胞培養培地は、Gコンテナ及びXuri細胞培養バッグからなる群から選択される容器内に提供される。
[0077] 一部の実施形態において、ステップ(e)における輸注バッグは、HypoThermosol含有輸注バッグである。
[0078] 一部の実施形態において、ステップ(b)における第1の期間及びステップ(c)における第2の期間は、10日、11日又は12日の期間内にそれぞれ個別に実施される。
[0079] 一部の実施形態において、ステップ(b)における第1の期間及びステップ(c)における第2の期間は、11日の期間内にそれぞれ個別に実施される。
[0080] 一部の実施形態において、ステップ(a)~(e)は、約10日~約22日の期間内に実施される。
[0081] 一部の実施形態において、ステップ(a)~(e)は、約10日~約20日の期間内に実施される。
[0082] 一部の実施形態において、ステップ(a)~(e)は、約10日~約15日の期間内に実施される。
[0083] 一部の実施形態において、ステップ(a)~(e)は、22日以下で実施される。
[0084] 一部の実施形態において、ステップ(a)~(e)及び凍結保存は、22日以下で実施される。
[0085] 一部の実施形態において、ステップ(b)~(e)は、単一の容器内で実施され、ステップ(b)~(e)を単一の容器で実施することは、ステップ(b)~(e)を複数の容器内で実施することと比較して、切除された腫瘍毎のTIL収率の増加をもたらす。
[0086] 一部の実施形態において、抗原提示細胞は、系を開放することなく、ステップ(c)における第2の期間中にTILに添加される。
[0087] 一部の実施形態において、微生物汚染のリスクは、開放系と比較して低減される。
[0088] 一部の実施形態において、ステップ(e)からのTILは、患者に注入される。
[0089] 一部の実施形態において、閉鎖型容器は、単一のバイオリアクターを含む。
[0090] 一部の実施形態において、閉鎖型容器は、G-REX-10を含む。
[0091] 一部の実施形態において、閉鎖型容器は、G-REX-100を含む。
[0092] 一部の実施形態では、ステップ(d)において、抗原提示細胞(APC)は、25:1~100:1のAPC:TIL比で第2のTIL集団の細胞培養物に添加される。
[0093] 一部の実施形態において、細胞培養物は、2.5×109APC対100×106TILの比を有する。
[0094] 一部の実施形態では、ステップ(c)において、抗原提示細胞(APC)は、25:1~100:1のAPC:TIL比で第2のTIL集団の細胞培養物に添加される。
[0095] 一部の実施形態において、細胞培養物は、2.5×109APC対100×106TILの比を有する。
[0096] 本発明は、癌を有する対象の処置に使用するための拡大培養TIL集団も提供し、拡大培養TIL集団は、
(a)患者から得られた腫瘍サンプルを複数の腫瘍断片に処理することにより、対象から切除された腫瘍から第1のTIL集団を得ること;
(b)腫瘍断片を閉鎖系に添加すること;
(c)IL-2を含む細胞培養培地中で第1のTIL集団を培養することにより、第1の拡大培養を実施して第2のTIL集団を生じさせることであって、第1の拡大培養は、第1のガス透過性表面積を提供する閉鎖型容器内で実施され、第1の拡大培養は、第2のTIL集団を得るために約3~14日間にわたって実施され、第2のTIL集団は、第1のTIL集団よりも数において少なくとも50倍多く、ステップ(b)からステップ(c)への移行は、系を開放することなく行われる、生じさせること;
(d)第2のTIL集団の細胞培養培地に追加のIL-2、OKT-3及び抗原提示細胞(APC)を補充することにより、第2の拡大培養を実施して第3のTIL集団を生じさせることであって、第2の拡大培養は、第3のTIL集団を得るために約7~14日間にわたって実施され、第3のTIL集団は、治療用TIL集団であり、第2の拡大培養は、第2のガス透過性表面積を提供する閉鎖型容器内で実施され、ステップ(c)からステップ(d)への移行は、系を開放することなく行われる、生じさせること;
(e)第2及び/又は第3のTIL集団を、転写因子(TF)及び/又はタンパク質発現を一過性に変化させることができる他の分子に曝露することであって、TF及び/又はタンパク質発現を一過性に変化させることができる他の分子は、腫瘍抗原の増加した発現及び/又は治療用TIL集団における腫瘍抗原特異的T細胞の数の増加を提供する、曝露すること;
(f)ステップ(d)から得られた治療用TIL集団を回収することであって、ステップ(d)からステップ(e)への移行は、系を開放することなく行われる、回収すること;及び
(g)ステップ(e)からの回収されたTIL集団を輸注バッグに移すことであって、ス
テップ(e)から(f)への移行は、系を開放することなく行われる、移すこと;及び
(h)任意選択により、凍結保存プロセスを使用して、ステップ(f)からの回収されたTIL集団を含む輸注バッグを凍結保存すること
を含む方法によって得ることができる第3のTIL集団である。
(a)患者から得られた腫瘍サンプルを複数の腫瘍断片に処理することにより、対象から切除された腫瘍から第1のTIL集団を得ること;
(b)腫瘍断片を閉鎖系に添加すること;
(c)IL-2を含む細胞培養培地中で第1のTIL集団を培養することにより、第1の拡大培養を実施して第2のTIL集団を生じさせることであって、第1の拡大培養は、第1のガス透過性表面積を提供する閉鎖型容器内で実施され、第1の拡大培養は、第2のTIL集団を得るために約3~14日間にわたって実施され、第2のTIL集団は、第1のTIL集団よりも数において少なくとも50倍多く、ステップ(b)からステップ(c)への移行は、系を開放することなく行われる、生じさせること;
(d)第2のTIL集団の細胞培養培地に追加のIL-2、OKT-3及び抗原提示細胞(APC)を補充することにより、第2の拡大培養を実施して第3のTIL集団を生じさせることであって、第2の拡大培養は、第3のTIL集団を得るために約7~14日間にわたって実施され、第3のTIL集団は、治療用TIL集団であり、第2の拡大培養は、第2のガス透過性表面積を提供する閉鎖型容器内で実施され、ステップ(c)からステップ(d)への移行は、系を開放することなく行われる、生じさせること;
(e)第2及び/又は第3のTIL集団を、転写因子(TF)及び/又はタンパク質発現を一過性に変化させることができる他の分子に曝露することであって、TF及び/又はタンパク質発現を一過性に変化させることができる他の分子は、腫瘍抗原の増加した発現及び/又は治療用TIL集団における腫瘍抗原特異的T細胞の数の増加を提供する、曝露すること;
(f)ステップ(d)から得られた治療用TIL集団を回収することであって、ステップ(d)からステップ(e)への移行は、系を開放することなく行われる、回収すること;及び
(g)ステップ(e)からの回収されたTIL集団を輸注バッグに移すことであって、ス
テップ(e)から(f)への移行は、系を開放することなく行われる、移すこと;及び
(h)任意選択により、凍結保存プロセスを使用して、ステップ(f)からの回収されたTIL集団を含む輸注バッグを凍結保存すること
を含む方法によって得ることができる第3のTIL集団である。
[0097] 一部の実施形態において、TILの集団は、上記及び本明細書に記載の方法に従い、癌を有する対象を処置するために使用され、この方法は、上記及び本明細書に列挙される特徴の1つ以上を更に含む。
[0098] 本発明は、TIL生存率を決定するためのアッセイ方法も提供する。本開示は、腫瘍浸潤リンパ球(TIL)をより大きいTIL集団に拡大培養することにより、TILの生存率をアッセイする方法も提供し、この方法は、
(i)予め拡大培養された第1のTIL集団を得ること;
(ii)IL-2を含む細胞培養培地中で第1のTIL集団を培養することにより、第1の拡大培養を実施して第2のTIL集団を生じさせること;及び
(iii)第2のTIL集団の細胞培養培地に追加のIL-2、OKT-3及び抗原提示細胞(APC)を補充することにより、第2の拡大培養を実施して第3のTIL集団を生じさせることであって、第3のTIL集団は、第2のTIL集団よりも数において少なくとも100倍多く、第2の拡大培養は、第3のTIL集団を得るために少なくとも14日間にわたって実施され、第3のTIL集団は、生存率について更にアッセイされる、生じさせること
を含む。
(i)予め拡大培養された第1のTIL集団を得ること;
(ii)IL-2を含む細胞培養培地中で第1のTIL集団を培養することにより、第1の拡大培養を実施して第2のTIL集団を生じさせること;及び
(iii)第2のTIL集団の細胞培養培地に追加のIL-2、OKT-3及び抗原提示細胞(APC)を補充することにより、第2の拡大培養を実施して第3のTIL集団を生じさせることであって、第3のTIL集団は、第2のTIL集団よりも数において少なくとも100倍多く、第2の拡大培養は、第3のTIL集団を得るために少なくとも14日間にわたって実施され、第3のTIL集団は、生存率について更にアッセイされる、生じさせること
を含む。
[0099] 一部の実施形態において、本方法は、
(iv)第3のTIL集団の細胞培養培地に追加のIL-2、追加のOKT-3及び追加のAPCを補充することにより、追加の第2の拡大培養を実施することであって、追加の第2の拡大培養は、ステップ(iii)で得られたよりも大きいTIL集団を得るために少なくとも14日間にわたって実施され、第3の集団は、生存率について更にアッセイされる、実施すること
を更に含む。
(iv)第3のTIL集団の細胞培養培地に追加のIL-2、追加のOKT-3及び追加のAPCを補充することにより、追加の第2の拡大培養を実施することであって、追加の第2の拡大培養は、ステップ(iii)で得られたよりも大きいTIL集団を得るために少なくとも14日間にわたって実施され、第3の集団は、生存率について更にアッセイされる、実施すること
を更に含む。
[00100] 一部の実施形態において、ステップ(i)前に、細胞は、凍結保存される。
[00101] 一部の実施形態において、細胞は、ステップ(i)の実施前に解凍される。
[00102] 一部の実施形態において、分析に十分なTILを得るため、ステップ(iv
)は、1~4回繰り返される。
)は、1~4回繰り返される。
[00103] 一部の実施形態において、ステップ(i)~(iii)又は(iv)は、約
40日~約50日の期間内に実施される。
40日~約50日の期間内に実施される。
[00104] 一部の実施形態において、ステップ(i)~(iii)又は(iv)は、約
42日~約48日の期間内に実施される。
42日~約48日の期間内に実施される。
[00105] 一部の実施形態において、ステップ(i)~(iii)又は(iv)は、約
42日~約45日の期間内に実施される。
42日~約45日の期間内に実施される。
[00106] 一部の実施形態において、ステップ(i)~(iii)又は(iv)は、約
44日以下で実施される。
44日以下で実施される。
[00107] 一部の実施形態において、ステップ(iii)又は(iv)からの細胞は、
CD4、CD8及びTCRαβを、新鮮に回収された細胞と同程度に発現する。
CD4、CD8及びTCRαβを、新鮮に回収された細胞と同程度に発現する。
[00108] 一部の実施形態において、抗原提示細胞は、末梢血単核球(PBMC)であ
る。
る。
[00109] 一部の実施形態において、PBMCは、ステップ(iii)において9~1
7日目のいずれかに細胞培養物に添加される。
7日目のいずれかに細胞培養物に添加される。
[00110] 一部の実施形態において、APCは、人工APC(aAPC)である。
[00111] 一部の実施形態において、本方法は、高親和性T細胞受容体をコードする核
酸を含む発現ベクターで第1のTIL集団を形質導入するステップを更に含む。
酸を含む発現ベクターで第1のTIL集団を形質導入するステップを更に含む。
[00112] 一部の実施形態において、形質導入ステップは、ステップ(i)前に行われ
る。
る。
[00113] 一部の実施形態において、本方法は、T細胞シグナル伝達分子の少なくとも
1つのエンドドメインに融合した単鎖可変断片抗体を含むキメラ抗原受容体(CAR)をコードする核酸を含む発現ベクターで第1のTIL集団を形質導入するステップを更に含む。
1つのエンドドメインに融合した単鎖可変断片抗体を含むキメラ抗原受容体(CAR)をコードする核酸を含む発現ベクターで第1のTIL集団を形質導入するステップを更に含む。
[00114] 一部の実施形態において、形質導入ステップは、ステップ(i)前に行われ
る。
る。
[00115] 一部の実施形態において、TILは、生存率に関してアッセイされる。
[00116] 一部の実施形態において、TILは、凍結保存後に生存率に関してアッセイ
される。
される。
[00117] 一部の実施形態において、TILは、凍結保存後及びステップ(iv)後に
生存率に関してアッセイされる。
生存率に関してアッセイされる。
[00118] 本発明は、腫瘍浸潤リンパ球(TIL)を治療用TIL集団に拡大培養する
方法であって、治療用TIL集団を生成するために、転写因子(TF)及び/又はタンパク質発現を一過性に変化させることができる他の分子にTILを曝露することを含む方法も提供し、ここで、TF及び/又はタンパク質発現を一過性に変化させることができる他の分子は、腫瘍抗原の増加した発現及び/又は治療用TIL集団における腫瘍抗原特異的T細胞の数の増加を提供する。
方法であって、治療用TIL集団を生成するために、転写因子(TF)及び/又はタンパク質発現を一過性に変化させることができる他の分子にTILを曝露することを含む方法も提供し、ここで、TF及び/又はタンパク質発現を一過性に変化させることができる他の分子は、腫瘍抗原の増加した発現及び/又は治療用TIL集団における腫瘍抗原特異的T細胞の数の増加を提供する。
[00119] 一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、タンパク質発
現の誘導をもたらす。
現の誘導をもたらす。
[00120] 一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、タンパク質発
現の低減をもたらす。
現の低減をもたらす。
[00121] 一部の実施形態では、1つ以上のsd-RNAは、一過性のタンパク質発現
を低減するために利用される。
を低減するために利用される。
[00122] 本発明は、転写因子(TF)及び/又はタンパク質発現を一過性に変化させ
ることができる他の分子を評価する方法も提供し、方法は、治療用TIL集団を生成するために、転写因子(TF)及び/又はタンパク質発現を一過性に変化させることができる他の分子にTILを曝露して、腫瘍浸潤リンパ球(TIL)を治療用TIL集団に拡大培養することを含み、TF及び/又はタンパク質発現を一過性に変化させることができる他の分子は、腫瘍抗原の変化した発現及び/又は治療用TIL集団における腫瘍抗原特異的T細胞の数の変化を提供する。
ることができる他の分子を評価する方法も提供し、方法は、治療用TIL集団を生成するために、転写因子(TF)及び/又はタンパク質発現を一過性に変化させることができる他の分子にTILを曝露して、腫瘍浸潤リンパ球(TIL)を治療用TIL集団に拡大培養することを含み、TF及び/又はタンパク質発現を一過性に変化させることができる他の分子は、腫瘍抗原の変化した発現及び/又は治療用TIL集団における腫瘍抗原特異的T細胞の数の変化を提供する。
[00123] 一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、PD-1、T
GFBR2、CBLB(CBL-B)、CISH、CCR(キメラ共刺激受容体)、IL-2、IL-12、IL-15、IL-21、NOTCH 1/2 ICD、TIM3、LAG3、TIGIT、TGFβ、CCR2、CCR4、CCR5、CXCR1、CXCR2、CSCR3、CCL2(MCP-1)、CCL3(MIP-1α)、CCL4(MIP1-β)、CCL5(RANTES)、CXCL1/CXCL8、CCL22、CCL17、CXCL1/CXCL8、VHL、CD44、PIK3CD、SOCS1及びcAMPプロテインキナーゼA(PKA)からなる群から選択される遺伝子を標的とする。
GFBR2、CBLB(CBL-B)、CISH、CCR(キメラ共刺激受容体)、IL-2、IL-12、IL-15、IL-21、NOTCH 1/2 ICD、TIM3、LAG3、TIGIT、TGFβ、CCR2、CCR4、CCR5、CXCR1、CXCR2、CSCR3、CCL2(MCP-1)、CCL3(MIP-1α)、CCL4(MIP1-β)、CCL5(RANTES)、CXCL1/CXCL8、CCL22、CCL17、CXCL1/CXCL8、VHL、CD44、PIK3CD、SOCS1及びcAMPプロテインキナーゼA(PKA)からなる群から選択される遺伝子を標的とする。
[00124] 一部の実施形態において、本発明は、腫瘍浸潤リンパ球(TIL)を治療用
TIL集団に拡大培養する方法も提供し、この方法は、
(a)患者から得られた腫瘍サンプルを複数の腫瘍断片に処理することにより、患者から切除された腫瘍から第1のTIL集団を得ること;
(b)腫瘍断片を閉鎖系に添加すること;
(c)IL-2を含み、且つ任意選択により4-1BBアゴニスト抗体を含む細胞培養培地中で約2~5日間にわたって第1のTIL集団を培養することにより、第1の拡大培養を実施すること;
(d)第1のTIL集団を少なくとも1つのsd-RNAと接触させることであって、sd-RNAは、0.1μM sd-RNA/10,000TIL/100μL培地、0.5μM sd-RNA/10,000TIL/100μL培地、0.75μM sd-RNA/10,000TIL/100μL培地、1μM sd-RNA/10,000TIL/100μL培地、1.25μM sd-RNA/10,000TIL/100μL培地、1.5μM sd-RNA/10,000TIL/100μL培地、2μM sd-RNA/10,000TIL/100μL培地、5μM sd-RNA/10,000TIL/100μL培地又は10μM sd-RNA/10,000TIL/100μL培地の濃度で添加され、sd-RNAは、PD-1、LAG-3、TIM-3、CISH及びCBLB並びにそれらの組み合わせからなる群から選択される分子の発現を阻害するためのものである、接触させること;
(e)任意選択により、第1のTIL集団に対して無菌エレクトロポレーションステップを実施することであって、無菌エレクトロポレーションステップは、少なくとも1つのsd-RNAの移動を媒介する、実施すること;
(f)OKT-3を添加して第2のTIL集団を生じさせることであって、第1の拡大培養は、第1のガス透過性表面積を提供する閉鎖型容器内で実施され、第1の拡大培養は、第2のTIL集団を得るために約1~3日間にわたって実施され、第2のTIL集団は、第1のTIL集団よりも数において少なくとも50倍多く、ステップ(c)からステップ(f)への移行は、系を開放することなく行われる、生じさせること;
(g)第2のTIL集団を約1日間にわたって静置すること;
(h)第2のTIL集団の細胞培養培地に追加のIL-2、任意選択によりOKT-3抗体、任意選択によりOX40抗体及び抗原提示細胞(APC)を補充することにより、第2の拡大培養を実施して第3のTIL集団を生じさせることであって、第2の拡大培養は、第3のTIL集団を得るために約7~11日間にわたって実施され、第2の拡大培養は、第2のガス透過性表面積を提供する閉鎖型容器内で実施され、ステップ(c)からステップ(h)への移行は、系を開放することなく行われる、生じさせること;
(i)ステップ(h)から得られた治療用TIL集団を回収して、回収されたTIL集団を提供することであって、ステップ(h)からステップ(i)への移行は、系を開放することなく行われ、回収されたTIL集団は、治療用TIL集団である、提供すること;
(j)ステップ(i)からの回収されたTIL集団を輸注バッグに移すことであって、ステップ(i)から(j)への移行は、系を開放することなく行われる、移すこと;及び
(k)ジメチルスルホキシドベースの凍結保存培地を使用して、回収されたTIL集団を凍結保存すること
を含む。
TIL集団に拡大培養する方法も提供し、この方法は、
(a)患者から得られた腫瘍サンプルを複数の腫瘍断片に処理することにより、患者から切除された腫瘍から第1のTIL集団を得ること;
(b)腫瘍断片を閉鎖系に添加すること;
(c)IL-2を含み、且つ任意選択により4-1BBアゴニスト抗体を含む細胞培養培地中で約2~5日間にわたって第1のTIL集団を培養することにより、第1の拡大培養を実施すること;
(d)第1のTIL集団を少なくとも1つのsd-RNAと接触させることであって、sd-RNAは、0.1μM sd-RNA/10,000TIL/100μL培地、0.5μM sd-RNA/10,000TIL/100μL培地、0.75μM sd-RNA/10,000TIL/100μL培地、1μM sd-RNA/10,000TIL/100μL培地、1.25μM sd-RNA/10,000TIL/100μL培地、1.5μM sd-RNA/10,000TIL/100μL培地、2μM sd-RNA/10,000TIL/100μL培地、5μM sd-RNA/10,000TIL/100μL培地又は10μM sd-RNA/10,000TIL/100μL培地の濃度で添加され、sd-RNAは、PD-1、LAG-3、TIM-3、CISH及びCBLB並びにそれらの組み合わせからなる群から選択される分子の発現を阻害するためのものである、接触させること;
(e)任意選択により、第1のTIL集団に対して無菌エレクトロポレーションステップを実施することであって、無菌エレクトロポレーションステップは、少なくとも1つのsd-RNAの移動を媒介する、実施すること;
(f)OKT-3を添加して第2のTIL集団を生じさせることであって、第1の拡大培養は、第1のガス透過性表面積を提供する閉鎖型容器内で実施され、第1の拡大培養は、第2のTIL集団を得るために約1~3日間にわたって実施され、第2のTIL集団は、第1のTIL集団よりも数において少なくとも50倍多く、ステップ(c)からステップ(f)への移行は、系を開放することなく行われる、生じさせること;
(g)第2のTIL集団を約1日間にわたって静置すること;
(h)第2のTIL集団の細胞培養培地に追加のIL-2、任意選択によりOKT-3抗体、任意選択によりOX40抗体及び抗原提示細胞(APC)を補充することにより、第2の拡大培養を実施して第3のTIL集団を生じさせることであって、第2の拡大培養は、第3のTIL集団を得るために約7~11日間にわたって実施され、第2の拡大培養は、第2のガス透過性表面積を提供する閉鎖型容器内で実施され、ステップ(c)からステップ(h)への移行は、系を開放することなく行われる、生じさせること;
(i)ステップ(h)から得られた治療用TIL集団を回収して、回収されたTIL集団を提供することであって、ステップ(h)からステップ(i)への移行は、系を開放することなく行われ、回収されたTIL集団は、治療用TIL集団である、提供すること;
(j)ステップ(i)からの回収されたTIL集団を輸注バッグに移すことであって、ステップ(i)から(j)への移行は、系を開放することなく行われる、移すこと;及び
(k)ジメチルスルホキシドベースの凍結保存培地を使用して、回収されたTIL集団を凍結保存すること
を含む。
[00125] 一部の実施形態において、本発明は、腫瘍浸潤リンパ球(TIL)を治療用
TIL集団に拡大培養する方法も提供し、この方法は、
(a)患者から得られた腫瘍サンプルを複数の腫瘍断片に処理することにより、患者から切除された腫瘍から第1のTIL集団を得ること;
(b)腫瘍断片を閉鎖系に添加すること;
(c)IL-2を含み、且つ任意選択により4-1BBアゴニスト抗体を含む細胞培養培地中で約2~5日間にわたって第1のTIL集団を培養することにより、第1の拡大培養を実施すること;
(d)第1のTIL集団を少なくとも1つのsd-RNAと接触させることであって、sd-RNAは、0.1μM sd-RNA/10,000TIL、0.5μM sd-RNA/10,000TIL、0.75μM sd-RNA/10,000TIL、1μM
sd-RNA/10,000TIL、1.25μM sd-RNA/10,000TIL、1.5μM sd-RNA/10,000TIL、2μM sd-RNA/10,000TIL、5μM sd-RNA/10,000TIL又は10μM sd-RNA/10,000TILの濃度で添加され、sd-RNAは、PD-1、LAG-3、TIM-3、CISH及びCBLB並びにそれらの組み合わせからなる群から選択される分子の発現を阻害するためのものである、接触させること;
(e)任意選択により、第1のTIL集団に対して無菌エレクトロポレーションステップを実施することであって、無菌エレクトロポレーションステップは、少なくとも1つのsd-RNAの移動を媒介する、実施すること;
(f)OKT-3を添加して第2のTIL集団を生じさせることであって、第1の拡大培養は、第1のガス透過性表面積を提供する閉鎖型容器内で実施され、第1の拡大培養は、第2のTIL集団を得るために約1~3日間にわたって実施され、第2のTIL集団は、第1のTIL集団よりも数において少なくとも50倍多く、ステップ(c)からステップ(f)への移行は、系を開放することなく行われる、生じさせること;
(g)第2のTIL集団を約1日間にわたって静置すること;
(h)第2のTIL集団の細胞培養培地に追加のIL-2、任意選択によりOKT-3抗体、任意選択によりOX40抗体及び抗原提示細胞(APC)を補充することにより、第2の拡大培養を実施して第3のTIL集団を生じさせることであって、第2の拡大培養は、第3のTIL集団を得るために約7~11日間にわたって実施され、第2の拡大培養は、第2のガス透過性表面積を提供する閉鎖型容器内で実施され、ステップ(g)からステップ(h)への移行は、系を開放することなく行われる、生じさせること;
(i)ステップ(h)から得られた治療用TIL集団を回収して、回収されたTIL集団を提供することであって、ステップ(h)からステップ(i)への移行は、系を開放することなく行われ、回収されたTIL集団は、治療用TIL集団である、提供すること;
(j)ステップ(i)からの回収されたTIL集団を輸注バッグに移すことであって、ステップ(i)から(j)への移行は、系を開放することなく行われる、移すこと;及び
(k)ジメチルスルホキシドベースの凍結保存培地を使用して、回収されたTIL集団を凍結保存すること
を含む。
TIL集団に拡大培養する方法も提供し、この方法は、
(a)患者から得られた腫瘍サンプルを複数の腫瘍断片に処理することにより、患者から切除された腫瘍から第1のTIL集団を得ること;
(b)腫瘍断片を閉鎖系に添加すること;
(c)IL-2を含み、且つ任意選択により4-1BBアゴニスト抗体を含む細胞培養培地中で約2~5日間にわたって第1のTIL集団を培養することにより、第1の拡大培養を実施すること;
(d)第1のTIL集団を少なくとも1つのsd-RNAと接触させることであって、sd-RNAは、0.1μM sd-RNA/10,000TIL、0.5μM sd-RNA/10,000TIL、0.75μM sd-RNA/10,000TIL、1μM
sd-RNA/10,000TIL、1.25μM sd-RNA/10,000TIL、1.5μM sd-RNA/10,000TIL、2μM sd-RNA/10,000TIL、5μM sd-RNA/10,000TIL又は10μM sd-RNA/10,000TILの濃度で添加され、sd-RNAは、PD-1、LAG-3、TIM-3、CISH及びCBLB並びにそれらの組み合わせからなる群から選択される分子の発現を阻害するためのものである、接触させること;
(e)任意選択により、第1のTIL集団に対して無菌エレクトロポレーションステップを実施することであって、無菌エレクトロポレーションステップは、少なくとも1つのsd-RNAの移動を媒介する、実施すること;
(f)OKT-3を添加して第2のTIL集団を生じさせることであって、第1の拡大培養は、第1のガス透過性表面積を提供する閉鎖型容器内で実施され、第1の拡大培養は、第2のTIL集団を得るために約1~3日間にわたって実施され、第2のTIL集団は、第1のTIL集団よりも数において少なくとも50倍多く、ステップ(c)からステップ(f)への移行は、系を開放することなく行われる、生じさせること;
(g)第2のTIL集団を約1日間にわたって静置すること;
(h)第2のTIL集団の細胞培養培地に追加のIL-2、任意選択によりOKT-3抗体、任意選択によりOX40抗体及び抗原提示細胞(APC)を補充することにより、第2の拡大培養を実施して第3のTIL集団を生じさせることであって、第2の拡大培養は、第3のTIL集団を得るために約7~11日間にわたって実施され、第2の拡大培養は、第2のガス透過性表面積を提供する閉鎖型容器内で実施され、ステップ(g)からステップ(h)への移行は、系を開放することなく行われる、生じさせること;
(i)ステップ(h)から得られた治療用TIL集団を回収して、回収されたTIL集団を提供することであって、ステップ(h)からステップ(i)への移行は、系を開放することなく行われ、回収されたTIL集団は、治療用TIL集団である、提供すること;
(j)ステップ(i)からの回収されたTIL集団を輸注バッグに移すことであって、ステップ(i)から(j)への移行は、系を開放することなく行われる、移すこと;及び
(k)ジメチルスルホキシドベースの凍結保存培地を使用して、回収されたTIL集団を凍結保存すること
を含む。
[00126] 一部の実施形態において、本発明は、腫瘍浸潤リンパ球(TIL)を治療用
TIL集団に拡大培養する方法も提供し、この方法は、
(a)患者から得られた腫瘍サンプルを複数の腫瘍断片に処理することにより、患者から切除された腫瘍から第1のTIL集団を得ること;
(b)腫瘍断片を閉鎖系に添加すること;
(c)IL-2を含み、且つ任意選択により4-1BBアゴニスト抗体を含む細胞培養培地中で約2~5日間にわたって第1のTIL集団を培養することにより、第1の拡大培養を実施すること;
(d)OKT-3を添加して第2のTIL集団を生じさせることであって、第1の拡大培養は、第1のガス透過性表面積を提供する閉鎖型容器内で実施され、第1の拡大培養は、第2のTIL集団を得るために約1~3日間にわたって実施され、第2のTIL集団は、第1のTIL集団よりも数において少なくとも50倍多く、ステップ(c)からステップ(d)への移行は、系を開放することなく行われる、生じさせること;
(e)第2のTIL集団を約1日間にわたって静置すること;
(f)第2のTIL集団の細胞培養培地に追加のIL-2、任意選択によりOKT-3抗体、任意選択によりOX40抗体及び抗原提示細胞(APC)を補充することにより、第2の拡大培養を実施して第3のTIL集団を生じさせることであって、第2の拡大培養は、第3のTIL集団を得るために約7~11日間にわたって実施され、第2の拡大培養は、第2のガス透過性表面積を提供する閉鎖型容器内で実施され、ステップ(c)からステップ(f)への移行は、系を開放することなく行われる、生じさせること;
(g)ステップ(d)、(e)及び/又は(f)のいずれかの間に第2のTIL集団を少なくとも1つのsd-RNAと接触させることであって、sd-RNAは、0.1μM sd-RNA/10,000TIL/100μL培地、0.5μM sd-RNA/10,000TIL/100μL培地、0.75μM sd-RNA/10,000TIL/100μL培地、1μM sd-RNA/10,000TIL/100μL培地、1.25μM sd-RNA/10,000TIL/100μL培地、1.5μM sd-RNA/10,000TIL/100μL培地、2μM sd-RNA/10,000TIL/100μL培地、5μM sd-RNA/10,000TIL/100μL培地又は10μM sd-RNA/10,000TIL/100μL培地の濃度で添加され、sd-RNAは、PD-1、LAG-3、TIM-3、CISH及びCBLB並びにそれらの組み合わせからなる群から選択される分子の発現を阻害するためのものである、接触させること;
(h)任意選択により、第2のTIL集団に対して無菌エレクトロポレーションステップを実施することであって、無菌エレクトロポレーションステップは、少なくとも1つのsd-RNAの移動を媒介する、実施すること;
(i)ステップ(g)又は(h)から得られた治療用TIL集団を回収して、回収されたTIL集団を提供することであって、ステップ(g)からステップ(i)への移行は、系を開放することなく行われ、回収されたTIL集団は、治療用TIL集団である、提供すること;
(j)ステップ(i)からの回収されたTIL集団を輸注バッグに移すことであって、ステップ(i)から(j)への移行は、系を開放することなく行われる、移すこと;及び
(k)ジメチルスルホキシドベースの凍結保存培地を使用して、回収されたTIL集団を凍結保存すること
を含む。
TIL集団に拡大培養する方法も提供し、この方法は、
(a)患者から得られた腫瘍サンプルを複数の腫瘍断片に処理することにより、患者から切除された腫瘍から第1のTIL集団を得ること;
(b)腫瘍断片を閉鎖系に添加すること;
(c)IL-2を含み、且つ任意選択により4-1BBアゴニスト抗体を含む細胞培養培地中で約2~5日間にわたって第1のTIL集団を培養することにより、第1の拡大培養を実施すること;
(d)OKT-3を添加して第2のTIL集団を生じさせることであって、第1の拡大培養は、第1のガス透過性表面積を提供する閉鎖型容器内で実施され、第1の拡大培養は、第2のTIL集団を得るために約1~3日間にわたって実施され、第2のTIL集団は、第1のTIL集団よりも数において少なくとも50倍多く、ステップ(c)からステップ(d)への移行は、系を開放することなく行われる、生じさせること;
(e)第2のTIL集団を約1日間にわたって静置すること;
(f)第2のTIL集団の細胞培養培地に追加のIL-2、任意選択によりOKT-3抗体、任意選択によりOX40抗体及び抗原提示細胞(APC)を補充することにより、第2の拡大培養を実施して第3のTIL集団を生じさせることであって、第2の拡大培養は、第3のTIL集団を得るために約7~11日間にわたって実施され、第2の拡大培養は、第2のガス透過性表面積を提供する閉鎖型容器内で実施され、ステップ(c)からステップ(f)への移行は、系を開放することなく行われる、生じさせること;
(g)ステップ(d)、(e)及び/又は(f)のいずれかの間に第2のTIL集団を少なくとも1つのsd-RNAと接触させることであって、sd-RNAは、0.1μM sd-RNA/10,000TIL/100μL培地、0.5μM sd-RNA/10,000TIL/100μL培地、0.75μM sd-RNA/10,000TIL/100μL培地、1μM sd-RNA/10,000TIL/100μL培地、1.25μM sd-RNA/10,000TIL/100μL培地、1.5μM sd-RNA/10,000TIL/100μL培地、2μM sd-RNA/10,000TIL/100μL培地、5μM sd-RNA/10,000TIL/100μL培地又は10μM sd-RNA/10,000TIL/100μL培地の濃度で添加され、sd-RNAは、PD-1、LAG-3、TIM-3、CISH及びCBLB並びにそれらの組み合わせからなる群から選択される分子の発現を阻害するためのものである、接触させること;
(h)任意選択により、第2のTIL集団に対して無菌エレクトロポレーションステップを実施することであって、無菌エレクトロポレーションステップは、少なくとも1つのsd-RNAの移動を媒介する、実施すること;
(i)ステップ(g)又は(h)から得られた治療用TIL集団を回収して、回収されたTIL集団を提供することであって、ステップ(g)からステップ(i)への移行は、系を開放することなく行われ、回収されたTIL集団は、治療用TIL集団である、提供すること;
(j)ステップ(i)からの回収されたTIL集団を輸注バッグに移すことであって、ステップ(i)から(j)への移行は、系を開放することなく行われる、移すこと;及び
(k)ジメチルスルホキシドベースの凍結保存培地を使用して、回収されたTIL集団を凍結保存すること
を含む。
[00127] 一部の実施形態において、本発明は、腫瘍浸潤リンパ球(TIL)を治療用
TIL集団に拡大培養する方法も提供し、この方法は、
(a)患者から得られた腫瘍サンプルを複数の腫瘍断片に処理することにより、患者から切除された腫瘍から第1のTIL集団を得ること;
(b)腫瘍断片を閉鎖系に添加すること;
(c)IL-2を含み、且つ任意選択により4-1BBアゴニスト抗体を含む細胞培養培地中で約2~5日間にわたって第1のTIL集団を培養することにより、第1の拡大培養を実施すること;
(d)OKT-3を添加して第2のTIL集団を生じさせることであって、第1の拡大培養は、第1のガス透過性表面積を提供する閉鎖型容器内で実施され、第1の拡大培養は、第2のTIL集団を得るために約1~3日間にわたって実施され、第2のTIL集団は、第1のTIL集団よりも数において少なくとも50倍多く、ステップ(c)からステップ(d)への移行は、系を開放することなく行われる、生じさせること;
(e)第2のTIL集団を約1日間にわたって静置すること;
(f)第2のTIL集団の細胞培養培地に追加のIL-2、任意選択によりOKT-3抗体、任意選択によりOX40抗体及び抗原提示細胞(APC)を補充することにより、第2の拡大培養を実施して第3のTIL集団を生じさせることであって、第2の拡大培養は、第3のTIL集団を得るために約7~11日間にわたって実施され、第2の拡大培養は、第2のガス透過性表面積を提供する閉鎖型容器内で実施され、ステップ(e)からステップ(f)への移行は、系を開放することなく行われる、生じさせること;
(g)ステップ(d)、(e)及び/又は(f)のいずれかの間に第2のTIL集団を少なくとも1つのsd-RNAと接触させることであって、sd-RNAは、0.1μM sd-RNA/10,000TIL、0.5μM sd-RNA/10,000TIL、0.75μM sd-RNA/10,000TIL、1μM sd-RNA/10,000TIL、1.25μM sd-RNA/10,000TIL、1.5μM sd-RNA/10,000TIL、2μM sd-RNA/10,000TIL、5μM sd-RNA/10,000TIL又は10μM sd-RNA/10,000TILの濃度で添加され、sd-RNAは、PD-1、LAG-3、TIM-3、CISH及びCBLB並びにそれらの組み合わせからなる群から選択される分子の発現を阻害するためのものである、接触させること;
(h)任意選択により、第2のTIL集団に対して無菌エレクトロポレーションステップを実施することであって、無菌エレクトロポレーションステップは、少なくとも1つのsd-RNAの移動を媒介する、実施すること;
(i)ステップ(g)又は(h)から得られた治療用TIL集団を回収して、回収されたTIL集団を提供することであって、ステップ(e)からステップ(h)への移行は、系を開放することなく行われ、回収されたTIL集団は、治療用TIL集団である、提供すること;
(j)ステップ(i)からの回収されたTIL集団を輸注バッグに移すことであって、ステップ(h)から(i)への移行は、系を開放することなく行われる、移すこと;及び
(k)ジメチルスルホキシドベースの凍結保存培地を使用して、回収されたTIL集団を凍結保存すること
を含む。
TIL集団に拡大培養する方法も提供し、この方法は、
(a)患者から得られた腫瘍サンプルを複数の腫瘍断片に処理することにより、患者から切除された腫瘍から第1のTIL集団を得ること;
(b)腫瘍断片を閉鎖系に添加すること;
(c)IL-2を含み、且つ任意選択により4-1BBアゴニスト抗体を含む細胞培養培地中で約2~5日間にわたって第1のTIL集団を培養することにより、第1の拡大培養を実施すること;
(d)OKT-3を添加して第2のTIL集団を生じさせることであって、第1の拡大培養は、第1のガス透過性表面積を提供する閉鎖型容器内で実施され、第1の拡大培養は、第2のTIL集団を得るために約1~3日間にわたって実施され、第2のTIL集団は、第1のTIL集団よりも数において少なくとも50倍多く、ステップ(c)からステップ(d)への移行は、系を開放することなく行われる、生じさせること;
(e)第2のTIL集団を約1日間にわたって静置すること;
(f)第2のTIL集団の細胞培養培地に追加のIL-2、任意選択によりOKT-3抗体、任意選択によりOX40抗体及び抗原提示細胞(APC)を補充することにより、第2の拡大培養を実施して第3のTIL集団を生じさせることであって、第2の拡大培養は、第3のTIL集団を得るために約7~11日間にわたって実施され、第2の拡大培養は、第2のガス透過性表面積を提供する閉鎖型容器内で実施され、ステップ(e)からステップ(f)への移行は、系を開放することなく行われる、生じさせること;
(g)ステップ(d)、(e)及び/又は(f)のいずれかの間に第2のTIL集団を少なくとも1つのsd-RNAと接触させることであって、sd-RNAは、0.1μM sd-RNA/10,000TIL、0.5μM sd-RNA/10,000TIL、0.75μM sd-RNA/10,000TIL、1μM sd-RNA/10,000TIL、1.25μM sd-RNA/10,000TIL、1.5μM sd-RNA/10,000TIL、2μM sd-RNA/10,000TIL、5μM sd-RNA/10,000TIL又は10μM sd-RNA/10,000TILの濃度で添加され、sd-RNAは、PD-1、LAG-3、TIM-3、CISH及びCBLB並びにそれらの組み合わせからなる群から選択される分子の発現を阻害するためのものである、接触させること;
(h)任意選択により、第2のTIL集団に対して無菌エレクトロポレーションステップを実施することであって、無菌エレクトロポレーションステップは、少なくとも1つのsd-RNAの移動を媒介する、実施すること;
(i)ステップ(g)又は(h)から得られた治療用TIL集団を回収して、回収されたTIL集団を提供することであって、ステップ(e)からステップ(h)への移行は、系を開放することなく行われ、回収されたTIL集団は、治療用TIL集団である、提供すること;
(j)ステップ(i)からの回収されたTIL集団を輸注バッグに移すことであって、ステップ(h)から(i)への移行は、系を開放することなく行われる、移すこと;及び
(k)ジメチルスルホキシドベースの凍結保存培地を使用して、回収されたTIL集団を凍結保存すること
を含む。
[00128] 一部の実施形態において、sd-RNAは、第1の拡大培養期間中、1日2
回、1日1回、2日毎、3日毎、4日毎、5日毎、6日毎又は7日毎に第1の細胞集団に添加される。
回、1日1回、2日毎、3日毎、4日毎、5日毎、6日毎又は7日毎に第1の細胞集団に添加される。
[00129] 一部の実施形態において、sd-RNAは、第1の拡大培養期間中、1日2
回、1日1回、2日毎、3日毎、4日毎、5日毎、6日毎又は7日毎に第2の細胞集団に添加される。
回、1日1回、2日毎、3日毎、4日毎、5日毎、6日毎又は7日毎に第2の細胞集団に添加される。
[00130] 一部の実施形態において、2つのsd-RNAは、PD-1、LAG-3、
TIM-3、CISH及びCBLBからなる群から選択される2つの分子の発現を阻害するために添加される。
TIM-3、CISH及びCBLBからなる群から選択される2つの分子の発現を阻害するために添加される。
[00131] 一部の実施形態において、2つのsd-RNAは、2つの分子の発現を阻害
するために添加され、2つの分子は、
i.PD-1及びLAG-3、
ii.PD-1及びTIM-3、
iii.PD-1及びCISH、
iv.PD-1及びCBLB、
v.LAG-3及びTIM-3、
vi.LAG-3及びCISH、
vii.LAG-3及びCBLB、
viii.TIM-3及びCISH、
ix.TIM-3及びCBLB、及び
x.CISH及びCBLB
からなる群から選択される。
するために添加され、2つの分子は、
i.PD-1及びLAG-3、
ii.PD-1及びTIM-3、
iii.PD-1及びCISH、
iv.PD-1及びCBLB、
v.LAG-3及びTIM-3、
vi.LAG-3及びCISH、
vii.LAG-3及びCBLB、
viii.TIM-3及びCISH、
ix.TIM-3及びCBLB、及び
x.CISH及びCBLB
からなる群から選択される。
[00132] 一部の実施形態において、3つ以上のsd-RNAは、PD-1、LAG-
3、TIM-3、CISH及びCBLBからなる群から選択される3つ以上の分子の発現を阻害するために添加される。
3、TIM-3、CISH及びCBLBからなる群から選択される3つ以上の分子の発現を阻害するために添加される。
[00133] 一部の実施形態において、PD-1、LAG-3、TIM-3、CISH及
びCBLBからなる群から選択される少なくとも1つの分子の発現は、少なくとも1つのsd-RNAと接触されたTILにおいて少なくとも80%、85%、90%又は95%だけ低減される。
びCBLBからなる群から選択される少なくとも1つの分子の発現は、少なくとも1つのsd-RNAと接触されたTILにおいて少なくとも80%、85%、90%又は95%だけ低減される。
[00134] 一部の実施形態において、PD-1、LAG-3、TIM-3、CISH及
びCBLBからなる群から選択される少なくとも1つの分子の発現は、少なくとも1つのsd-RNAと接触されたTILにおいて少なくとも12時間、少なくとも24時間又は少なくとも48時間にわたって少なくとも80%、85%、90%又は95%だけ低減される。
びCBLBからなる群から選択される少なくとも1つの分子の発現は、少なくとも1つのsd-RNAと接触されたTILにおいて少なくとも12時間、少なくとも24時間又は少なくとも48時間にわたって少なくとも80%、85%、90%又は95%だけ低減される。
図面の簡単な説明
[00135]プロセス2A、TIL製造の22日間プロセスの実施形態の概略図を示す。
[00136]TIL製造のための1Cプロセス及び2Aプロセスの実施形態の比較を示す。
[00137]1Cプロセスのタイムラインを示す。
[00138]より高い細胞数のために、投与及び共療法ステップを含む、TIL製造のためのプロセス2Aを使用したTIL療法の実施形態のプロセスを示す。
[00139]より低い細胞数のために、投与及び共療法ステップを含む、TIL製造のためのプロセス2Aを使用したTIL療法の実施形態のプロセスを示す。
[00140]2Aプロセスの実施形態の詳細な概略図を示す。
[00141]凍結保存ステップを含む2Aプロセスの実施形態の主要なステップを示す。
[00141]凍結保存ステップを含む2Aプロセスの実施形態の主要なステップを示す。
[00141]凍結保存ステップを含む2Aプロセスの実施形態の主要なステップを示す。
[00142]ステップA~Fの概要を提供する例示的なプロセス2Aのチャートである。
[00143]プロセス2Aデータ収集計画のプロセスフローチャートである。
[00144]急速拡大培養プロトコル(REP)の例示的な実施形態のスキームである。到着すると、腫瘍は、断片化され、11日間、TIL拡大培養(プレREP拡大培養)を行うため、IL-2を含むG-Rexフラスコに入れられる。トリプルカクテル研究では、プレREPの開始時にIL-2/IL-15/IL-21が追加される。急速拡大培養プロトコル(REP)の場合、TILは、11日間のREP拡大培養のためにフィーダー及びOKT3で更に培養される。
[00145]凍結保存TILの代表的な製造プロセス(約22日間)である。
[00146]プロセス2A、TIL製造の22日間プロセスの実施形態の概略図を示す。
[00147]プロセス1C及びプロセス2Aの例示的な実施形態からのステップA~Fの比較表である。
[00148]プロセス1Cの実施形態とプロセス2Aの実施形態との詳細な比較である。
[00149]凍結保存TIL製造プロセスの実施形態の説明(22日間)である。
[00150]Gen 1からGen 2へのプロセス改善の表である。
[00151]Gen 2凍結保存LNー144製造プロセスのスキームである。
[00152]プロセス2A、TIL製造の22日間プロセスの実施形態の概略図を示す。
[00153]重力血液フィルターの下部(単一ライン)へのTIL懸濁液移送パックの無菌溶接(実施例16のプロセスノート5.11を参照されたい)の概略図を示す。
[00154]GRex100MCSから「上清」移送パックへの赤い培地の取り出しラインの無菌溶接(実施例16のプロセスノート5.11を参照されたい)の概略図を示す。
[00155]セルコネクト装置の単一スパイク(B)を(G)で4S-4M60マニホールドの4スパイク端に置き換える、4S-4M60のCC2セルコネクトへの溶接(実施例16のプロセスノート5.11を参照されたい)の概略図を示す。
[00156]4S-4M60のオスのルアーエンドの1つへのリピーター流体移送セットの溶接(実施例16のプロセスノート5.11を参照されたい)の概略図を示す。
[00157]LOVO原料(source)バッグへの重力血液フィルターの長い終端の無菌溶接(実施例16のプロセスノート5.11を参照されたい)の概略図を示す。
[00158]フィルターの2つの供給源ラインの1つの、「プールされたTIL懸濁液」収集バッグへの無菌溶接(実施例16のプロセスノート5.11を参照されたい)の概略図を示す。
[00159]セルコネクト装置の単一スパイク(B)を(G)で4S-4M60マニホールドの4スパイク端に置き換える、4S-4M60のCC2セルコネクトへの滅菌溶接(実施例16のプロセスノート5.11を参照されたい)の概略図を示す。
[00160]4つのオスルアーエンド(E)の1つを各バッグに交換する、ステップ8.14.8で準備したハーネスへのCS750クライオバッグの滅菌溶接(実施例16のプロセスノート5.11を参照されたい)の概略図を示す。
[00161]4S-4M60のスパイクへのCS-10バッグの溶接(実施例16のプロセスノート5.11を参照されたい)の概略図を示す。
[00162]ステップ8.14.10で準備した装置における残りのスパイク(A)への「製剤化されたTIL」バッグの溶接(実施例16のプロセスノート5.11を参照されたい)の概略図を示す。
[00163]空の未透過液バッグ及びCS-10バッグを取り外す、Fでのヒートシール(実施例16のプロセスノート5.12を参照されたい)の図を示す。
[00164]一過性の遺伝子編集のためのTILプロセスの実施形態の概略図を示す。
[00165]一過性の遺伝子編集のためのTILプロセスの実施形態の概略図を示す。
[00166]一過性の遺伝子再プログラミングの目的で、RNA移動ステップのTILプロセスへの組み込みに関する概略図を示す。
[00167]TILの遺伝子発現を一過性に変化させるために提案された遺伝子工学アプローチの概要を示す。
[00168]腫瘍部位へのTIL輸送を改善するために一過性の遺伝子発現変化を利用できる、ケモカイン及びケモカイン受容体の概要を示す。
[00169]腫瘍部位へのTIL輸送を改善するために一過性の遺伝子発現変化を利用できる、ケモカイン及びケモカイン受容体の第2の概要を示す。
[00170]例示的な自己送達性リボ核酸(sd-RNA)の実施形態の概略的な構造図を示す。Ligtenberg, et al., Mol. Therapy, 2018を参照されたい。
[00171]例示的なsd-RNAの実施形態の概略的な構造図を示す。米国特許出願公開第2016/0304873号を参照されたい。
[00172]特別に設計されたプライマーを使用したPCRによって得られるDNAテンプレートを使用した、mRNA合成の例示的なスキームを示す。フォワードプライマーは、インビトロ転写に適したバクテリオファージプロモーターを含有し、リバースプライマーは、ポリTストレッチを含有する。PCR産物は、インビトロ転写に適した発現カセットである。新生mRNAの3’末端にあるポリアデニル酸は、異常なRNAランオフ合成及び二本鎖RNA産物の生成を防止できる。転写の完了後、ポリAテールは、ポリ(A)ポリメラーゼで更に伸長できる。(米国特許第8,859,229号を参照されたい。)
[00173]PDCD1、TIM3、CBLB、LAG3及びCISHのSd-rxRNA媒介サイレンシングを示すグラフである。
[00174]TILにおけるSd-rxRNA媒介遺伝子サイレンシング;例示的なプロトコルである。例示的な腫瘍は、黒色腫(新鮮又は凍結;n=6)、乳房腫瘍(新鮮又は凍結;n=5)、肺腫瘍(n=1)、肉腫(n=1)及び/又は卵巣(n=1)を含む。
[00175]タンパク質発現の低減は、5つの標的の4つで検出された。PD1:n=9、TIM3:n=8、LAG3/CISH:n=2、Cbl-b n=2。プレREP黒色腫及び新鮮乳癌TILからの調製物、2uM sd-rxRNA。%KDは、(100-(100×(目的の遺伝子/NTC)))として計算される。
[00176]Sd-rxRNA誘発性KDは、時間及び刺激と共に下降した。n=3、プレREP黒色腫TILからの調製物、2uM sd-rxRNA。
[00177]TILの生存率は、PDCD1 sd-rxRNAによってわずかに影響を受けた。PD1、TIM3 n>6、プレREP黒色腫/新鮮乳癌TILからの調製物。LAG3、CISH n=2、プレREP黒色腫及び乳癌TIL、2uM sd-rxRNA。
[00178]PD1及びTIM3のSd-rxRNA媒介KDは、TILの活性化を示す表現型の変化と関連していた。n=3、プレREP黒色腫TILからの調製物、2uM sd-rxRNA。
[00179]sd-rxRNAによるPD1及びTIM3ノックダウンは、他の阻害/枯渇マーカーの発現に影響しない。A)n=3、TIM3:n=2、プレREP黒色腫TILからの調製物、2uM sd-rxRNA。
[00179]sd-rxRNAによるPD1及びTIM3ノックダウンは、他の阻害/枯渇マーカーの発現に影響しない。B)n=3、TIM3:n=2、プレREP黒色腫TILからの調製物、2uM sd-rxRNA。
[00180]PD1及びTIM3 KDは、IFNγの分泌を有意に改善しなかった。n=3、プレREP黒色腫TILからの調製物、2uM sd-rxRNA。
[00181]CD107a動員は、sd-rxRNAのいずれにも影響されなかった。A)n=6、プレREP黒色腫TILからの調製物、2uM sd-rxRNA。
[00181]CD107a動員は、sd-rxRNAのいずれにも影響されなかった。B)n=2、プレREP黒色腫及び乳癌TILからの調製物、2uM sd-rxRNA。
[00181]CD107a動員は、sd-rxRNAのいずれにも影響されなかった。C)n=3、凍結黒色腫及び新鮮乳癌TIL。
[00181]CD107a動員は、sd-rxRNAのいずれにも影響されなかった。D)n=3、凍結黒色腫並びに新鮮乳癌及び肺癌TIL。
[00181]CD107a動員は、sd-rxRNAのいずれにも影響されなかった。E)n=3、乳癌腫瘍からの新鮮調製物。
[00181]CD107a動員は、sd-rxRNAのいずれにも影響されなかった。F)n=3、乳癌腫瘍からの新鮮調製物。
[00182]xCELLigenceリアルタイム細胞分析(RTCA)。
[00183]PD1 KD TILは、より優れた死滅効率を引き出した。A)死滅効率の代表図。
[00183]PD1 KD TILは、より優れた死滅効率を引き出した。B)n=3、黒色腫TIL、2uM sd-rxRNAの代表図。
[00184]sd-rxRNA用量反応実験である。A)n=3、乳癌腫瘍からの新鮮調製物。B)n=3、プレREP黒色腫TILからの調製物。
[00185]CBLBのSd-rxRNA媒介ノックダウンは、検出できなかった。A)グラフ。
[00185]CBLBのSd-rxRNA媒介ノックダウンは、検出できなかった。B)フローサイトメトリーアッセイプロット。n=2、プレREP黒色腫及び新鮮乳癌TILからの調製物。NTCと比較してCBLBのmRNAレベルに変化はなかった。フローサイトメトリーアッセイを使用したCbl-bのタンパク質レベルに変化はなかった。
[00186]IovanceのTIL製造プロセスにおける、TIL表現型を評価するsd-rxRNA媒介遺伝子サイレンシングの試験を示す。PD-1のsd-rxRNA媒介ノックダウンは、TILの活性化を示す表現型の変化と関連していた。PD-1、n>6、プレREP黒色腫/新鮮乳癌TILからの調製物、2uM sd-rxRNA。A)CD25、CCR7、CD27、CD28、CD56、CD95、4-1BB及びOX40。
[00186]IovanceのTIL製造プロセスにおける、TIL表現型を評価するsd-rxRNA媒介遺伝子サイレンシングの試験を示す。PD-1のsd-rxRNA媒介ノックダウンは、TILの活性化を示す表現型の変化と関連していた。PD-1、n>6、プレREP黒色腫/新鮮乳癌TILからの調製物、2uM sd-rxRNA。B)CD25、CD56、CCR7、4-1BB及びOX40。N=12、新鮮及び凍結TIL;乳房、黒色腫、卵巣及び肺。
[00187]PD1 sd-rxRNAの添加により、TILの細胞増殖が有意に低減したが、生存率は、低減しなかった。A)拡大倍率。B)細胞生存率。n=7、乳房、肉腫及び肺のTIL。
[00188]PD1 KDは、非特異的刺激に反応してCD107a動員及びIFNγ分泌を改善しなかった。A)刺激前後のCD107aを発現するCD8細胞のパーセンテージ。B)刺激前後のIFNγ分泌。n=6、黒色腫TIL。
配列表の簡単な説明
[00189] 配列番号1は、ムロモナブの重鎖のアミノ酸配列である。
[00190] 配列番号2は、ムロモナブの軽鎖のアミノ酸配列である。
[00191] 配列番号3は、組換えヒトIL-2タンパク質のアミノ酸配列である。
[00192] 配列番号4は、アルデスロイキンのアミノ酸配列である。
[00193] 配列番号5は、組換えヒトIL-4タンパク質のアミノ酸配列である。
[00194] 配列番号6は、組換えヒトIL-7タンパク質のアミノ酸配列である。
[00195] 配列番号7は、組換えヒトIL-15タンパク質のアミノ酸配列である。
[00196] 配列番号8は、組換えヒトIL-21タンパク質のアミノ酸配列である。
[00197] 配列番号9は、ヒト4-1BBのアミノ酸配列である。
[00198] 配列番号10は、マウス4-1BBのアミノ酸配列である。
[00199] 配列番号11は、4-1BBアゴニストモノクローナル抗体ウトミルマブ(
PF-05082566)の重鎖である。
[00200] 配列番号12は、4-1BBアゴニストモノクローナル抗体ウトミルマブ(
PF-05082566)の軽鎖である。
[00201] 配列番号13は、4-1BBアゴニストモノクローナル抗体ウトミルマブ(
PF-05082566)の重鎖可変領域(VH)である。
[00202] 配列番号14は、4-1BBアゴニストモノクローナル抗体ウトミルマブ(
PF-05082566)の軽鎖可変領域(VL)である。
[00203] 配列番号15は、4-1BBアゴニストモノクローナル抗体ウトミルマブ(
PF-05082566)の重鎖CDR1である。
[00204] 配列番号16は、4-1BBアゴニストモノクローナル抗体ウトミルマブ(
PF-05082566)の重鎖CDR2である。
[00205] 配列番号17は、4-1BBアゴニストモノクローナル抗体ウトミルマブ(
PF-05082566)の重鎖CDR3である。
[00206] 配列番号18は、4-1BBアゴニストモノクローナル抗体ウトミルマブ(
PF-05082566)の軽鎖CDR1である。
[00207] 配列番号19は、4-1BBアゴニストモノクローナル抗体ウトミルマブ(
PF-05082566)の軽鎖CDR2である。
[00208] 配列番号20は、4-1BBアゴニストモノクローナル抗体ウトミルマブ(
PF-05082566)の軽鎖CDR3である。
[00209] 配列番号21は、4-1BBアゴニストモノクローナル抗体ウレルマブ(B
MS-663513)の重鎖である。
[00210] 配列番号22は、4-1BBアゴニストモノクローナル抗体ウレルマブ(B
MS-663513)の軽鎖である。
[00211] 配列番号23は、4-1BBアゴニストモノクローナル抗体ウレルマブ(B
MS-663513)の重鎖可変領域(VH)である。
[00212] 配列番号24は、4-1BBアゴニストモノクローナル抗体ウレルマブ(B
MS-663513)の軽鎖可変領域(VL)である。
[00213] 配列番号25は、4-1BBアゴニストモノクローナル抗体ウレルマブ(B
MS-663513)の重鎖CDR1である。
[00214] 配列番号26は、4-1BBアゴニストモノクローナル抗体ウレルマブ(B
MS-663513)の重鎖CDR2である。
[00215] 配列番号27は、4-1BBアゴニストモノクローナル抗体ウレルマブ(B
MS-663513)の重鎖CDR3である。
[00216] 配列番号28は、4-1BBアゴニストモノクローナル抗体ウレルマブ(B
MS-663513)の軽鎖CDR1である。
[00217] 配列番号29は、4-1BBアゴニストモノクローナル抗体ウレルマブ(B
MS-663513)の軽鎖CDR2である。
[00218] 配列番号30は、4-1BBアゴニストモノクローナル抗体ウレルマブ(B
MS-663513)の軽鎖CDR3である。
[00219] 配列番号31は、TNFRSFアゴニスト融合タンパク質のFcドメインで
ある。
[00220] 配列番号32は、TNFRSFアゴニスト融合タンパク質のリンカーである
。
[00221] 配列番号33は、TNFRSFアゴニスト融合タンパク質のリンカーである
。
[00222] 配列番号34は、TNFRSFアゴニスト融合タンパク質のリンカーである
。
[00223] 配列番号35は、TNFRSFアゴニスト融合タンパク質のリンカーである
。
[00224] 配列番号36は、TNFRSFアゴニスト融合タンパク質のリンカーである
。
[00225] 配列番号37は、TNFRSFアゴニスト融合タンパク質のリンカーである
。
[00226] 配列番号38は、TNFRSFアゴニスト融合タンパク質のリンカーである
。
[00227] 配列番号39は、TNFRSFアゴニスト融合タンパク質のリンカーである
。
[00228] 配列番号40は、TNFRSFアゴニスト融合タンパク質のリンカーである
。
[00229] 配列番号41は、TNFRSFアゴニスト融合タンパク質のリンカーである
。
[00230] 配列番号42は、TNFRSFアゴニスト融合タンパク質のFcドメインで
ある。
[00231] 配列番号43は、TNFRSFアゴニスト融合タンパク質のリンカーである
。
[00232] 配列番号44は、TNFRSFアゴニスト融合タンパク質のリンカーである
。
[00233] 配列番号45は、TNFRSFアゴニスト融合タンパク質のリンカーである
。
[00234] 配列番号46は、4-1BBリガンド(4-1BBL)アミノ酸配列である
。
[00235] 配列番号47は、4-1BBLポリペプチドの可溶性部分である。
[00236] 配列番号48は、4-1BBアゴニスト抗体4B4-1-1バージョン1の
重鎖可変領域(VH)である。
[00237] 配列番号49は、4-1BBアゴニスト抗体4B4-1-1バージョン1の
軽鎖可変領域(VL)である。
[00238] 配列番号50は、4-1BBアゴニスト抗体4B4-1-1バージョン2の
重鎖可変領域(VH)である。
[00239] 配列番号51は、4-1BBアゴニスト抗体4B4-1-1バージョン2の
軽鎖可変領域(VL)である。
[00240] 配列番号52は、4-1BBアゴニスト抗体H39E3-2の重鎖可変領域
(VH)である。
[00241] 配列番号53は、4-1BBアゴニスト抗体H39E3-2の軽鎖可変領域
(VL)である。
[00242] 配列番号54は、ヒトOX40のアミノ酸配列である。
[00243] 配列番号55は、マウスOX40のアミノ酸配列である。
[00244] 配列番号56は、OX40アゴニストモノクローナル抗体タボリキシズマブ
(MEDI-0562)の重鎖である。
[00245] 配列番号57は、OX40アゴニストモノクローナル抗体タボリキシズマブ
(MEDI-0562)の軽鎖である。
[00246] 配列番号58は、OX40アゴニストモノクローナル抗体タボリキシズマブ
(MEDI-0562)の重鎖可変領域(VH)である。
[00247] 配列番号59は、OX40アゴニストモノクローナル抗体タボリキシズマブ
(MEDI-0562)の軽鎖可変領域(VL)である。
[00248] 配列番号60は、OX40アゴニストモノクローナル抗体タボリキシズマブ
(MEDI-0562)の重鎖CDR1である。
[00249] 配列番号61は、OX40アゴニストモノクローナル抗体タボリキシズマブ
(MEDI-0562)の重鎖CDR2である。
[00250] 配列番号62は、OX40アゴニストモノクローナル抗体タボリキシズマブ
(MEDI-0562)の重鎖CDR3である。
[00251] 配列番号63は、OX40アゴニストモノクローナル抗体タボリキシズマブ
(MEDI-0562)の軽鎖CDR1である。
[00252] 配列番号64は、OX40アゴニストモノクローナル抗体タボリキシズマブ
(MEDI-0562)の軽鎖CDR2である。
[00253] 配列番号65は、OX40アゴニストモノクローナル抗体タボリキシズマブ
(MEDI-0562)の軽鎖CDR3である。
[00254] 配列番号66は、OX40アゴニストモノクローナル抗体11D4の重鎖で
ある。
[00255] 配列番号67は、OX40アゴニストモノクローナル抗体11D4の軽鎖で
ある。
[00256] 配列番号68は、OX40アゴニストモノクローナル抗体11D4の重鎖可
変領域(VH)である。
[00257] 配列番号69は、OX40アゴニストモノクローナル抗体11D4の軽鎖可
変領域(VL)である。
[00258] 配列番号70は、OX40アゴニストモノクローナル抗体11D4の重鎖C
DR1である。
[00259] 配列番号71は、OX40アゴニストモノクローナル抗体11D4の重鎖C
DR2である。
[00260] 配列番号72は、OX40アゴニストモノクローナル抗体11D4の重鎖C
DR3である。
[00261] 配列番号73は、OX40アゴニストモノクローナル抗体11D4の軽鎖C
DR1である。
[00262] 配列番号74は、OX40アゴニストモノクローナル抗体11D4の軽鎖C
DR2である。
[00263] 配列番号75は、OX40アゴニストモノクローナル抗体11D4の軽鎖C
DR3である。
[00264] 配列番号76は、OX40アゴニストモノクローナル抗体18D8の重鎖で
ある。
[00265] 配列番号77は、OX40アゴニストモノクローナル抗体18D8の軽鎖で
ある。
[00266] 配列番号78は、OX40アゴニストモノクローナル抗体18D8の重鎖可
変領域(VH)である。
[00267] 配列番号79は、OX40アゴニストモノクローナル抗体18D8の軽鎖可
変領域(VL)である。
[00268] 配列番号80は、OX40アゴニストモノクローナル抗体18D8の重鎖C
DR1である。
[00269] 配列番号81は、OX40アゴニストモノクローナル抗体18D8の重鎖C
DR2である。
[00270] 配列番号82は、OX40アゴニストモノクローナル抗体18D8の重鎖C
DR3である。
[00271] 配列番号83は、OX40アゴニストモノクローナル抗体18D8の軽鎖C
DR1である。
[00272] 配列番号84は、OX40アゴニストモノクローナル抗体18D8の軽鎖C
DR2である。
[00273] 配列番号85は、OX40アゴニストモノクローナル抗体18D8の軽鎖C
DR3である。
[00274] 配列番号86は、OX40アゴニストモノクローナル抗体Hu119-12
2の重鎖可変領域(VH)である。
[00275] 配列番号87は、OX40アゴニストモノクローナル抗体Hu119-12
2の軽鎖可変領域(VL)である。
[00276] 配列番号88は、OX40アゴニストモノクローナル抗体Hu119-12
2の重鎖CDR1である。
[00277] 配列番号89は、OX40アゴニストモノクローナル抗体Hu119-12
2の重鎖CDR2である。
[00278] 配列番号90は、OX40アゴニストモノクローナル抗体Hu119-12
2の重鎖CDR3である。
[00279] 配列番号91は、OX40アゴニストモノクローナル抗体Hu119-12
2の軽鎖CDR1である。
[00280] 配列番号92は、OX40アゴニストモノクローナル抗体Hu119-12
2の軽鎖CDR2である。
[00281] 配列番号93は、OX40アゴニストモノクローナル抗体Hu119-12
2の軽鎖CDR3である。
[00282] 配列番号94は、OX40アゴニストモノクローナル抗体Hu106-22
2の重鎖可変領域(VH)である。
[00283] 配列番号95は、OX40アゴニストモノクローナル抗体Hu106-22
2の軽鎖可変領域(VL)である。
[00284] 配列番号96は、OX40アゴニストモノクローナル抗体Hu106-22
2の重鎖CDR1である。
[00285] 配列番号97は、OX40アゴニストモノクローナル抗体Hu106-22
2の重鎖CDR2である。
[00286] 配列番号98は、OX40アゴニストモノクローナル抗体Hu106-22
2の重鎖CDR3である。
[00287] 配列番号99は、OX40アゴニストモノクローナル抗体Hu106-22
2の軽鎖CDR1である。
[00288] 配列番号100は、OX40アゴニストモノクローナル抗体Hu106-2
22の軽鎖CDR2である。
[00289] 配列番号101は、OX40アゴニストモノクローナル抗体Hu106-2
22の軽鎖CDR3である。
[00290] 配列番号102は、OX40リガンド(OX40L)アミノ酸配列である。
[00291] 配列番号103は、OX40Lポリペプチドの可溶性部分である。
[00292] 配列番号104は、OX40Lポリペプチドの代替的可溶性部分である。
[00293] 配列番号105は、OX40アゴニストモノクローナル抗体008の重鎖可
変領域(VH)である。
[00294] 配列番号106は、OX40アゴニストモノクローナル抗体008の軽鎖可
変領域(VL)である。
[00295] 配列番号107は、OX40アゴニストモノクローナル抗体011の重鎖可
変領域(VH)である。
[00296] 配列番号108は、OX40アゴニストモノクローナル抗体011の軽鎖可
変領域(VL)である。
[00297] 配列番号109は、OX40アゴニストモノクローナル抗体021の重鎖可
変領域(VH)である。
[00298] 配列番号110は、OX40アゴニストモノクローナル抗体021の軽鎖可
変領域(VL)である。
[00299] 配列番号111は、OX40アゴニストモノクローナル抗体023の重鎖可
変領域(VH)である。
[00300] 配列番号112は、OX40アゴニストモノクローナル抗体023の軽鎖可
変領域(VL)である。
[00301] 配列番号113は、OX40アゴニストモノクローナル抗体の重鎖可変領域
(VH)である。
[00302] 配列番号114は、OX40アゴニストモノクローナル抗体の軽鎖可変領域
(VL)である。
[00303] 配列番号115は、OX40アゴニストモノクローナル抗体の重鎖可変領域
(VH)である。
[00304] 配列番号116は、OX40アゴニストモノクローナル抗体の軽鎖可変領域
(VL)である。
[00305] 配列番号117は、ヒト化OX40アゴニストモノクローナル抗体の重鎖可
変領域(VH)である。
[00306] 配列番号118は、ヒト化OX40アゴニストモノクローナル抗体の重鎖可
変領域(VH)である。
[00307] 配列番号119は、ヒト化OX40アゴニストモノクローナル抗体の軽鎖可
変領域(VL)である。
[00308] 配列番号120は、ヒト化OX40アゴニストモノクローナル抗体の軽鎖可
変領域(VL)である。
[00309] 配列番号121は、ヒト化OX40アゴニストモノクローナル抗体の重鎖可
変領域(VH)である。
[00310] 配列番号122は、ヒト化OX40アゴニストモノクローナル抗体の重鎖可
変領域(VH)である。
[00311] 配列番号123は、ヒト化OX40アゴニストモノクローナル抗体の軽鎖可
変領域(VL)である。
[00312] 配列番号124は、ヒト化OX40アゴニストモノクローナル抗体の軽鎖可
変領域(VL)である。
[00313] 配列番号125は、OX40アゴニストモノクローナル抗体の重鎖可変領域
(VH)である。
[00314] 配列番号126は、OX40アゴニストモノクローナル抗体の軽鎖可変領域
(VL)である。
[00189] 配列番号1は、ムロモナブの重鎖のアミノ酸配列である。
[00190] 配列番号2は、ムロモナブの軽鎖のアミノ酸配列である。
[00191] 配列番号3は、組換えヒトIL-2タンパク質のアミノ酸配列である。
[00192] 配列番号4は、アルデスロイキンのアミノ酸配列である。
[00193] 配列番号5は、組換えヒトIL-4タンパク質のアミノ酸配列である。
[00194] 配列番号6は、組換えヒトIL-7タンパク質のアミノ酸配列である。
[00195] 配列番号7は、組換えヒトIL-15タンパク質のアミノ酸配列である。
[00196] 配列番号8は、組換えヒトIL-21タンパク質のアミノ酸配列である。
[00197] 配列番号9は、ヒト4-1BBのアミノ酸配列である。
[00198] 配列番号10は、マウス4-1BBのアミノ酸配列である。
[00199] 配列番号11は、4-1BBアゴニストモノクローナル抗体ウトミルマブ(
PF-05082566)の重鎖である。
[00200] 配列番号12は、4-1BBアゴニストモノクローナル抗体ウトミルマブ(
PF-05082566)の軽鎖である。
[00201] 配列番号13は、4-1BBアゴニストモノクローナル抗体ウトミルマブ(
PF-05082566)の重鎖可変領域(VH)である。
[00202] 配列番号14は、4-1BBアゴニストモノクローナル抗体ウトミルマブ(
PF-05082566)の軽鎖可変領域(VL)である。
[00203] 配列番号15は、4-1BBアゴニストモノクローナル抗体ウトミルマブ(
PF-05082566)の重鎖CDR1である。
[00204] 配列番号16は、4-1BBアゴニストモノクローナル抗体ウトミルマブ(
PF-05082566)の重鎖CDR2である。
[00205] 配列番号17は、4-1BBアゴニストモノクローナル抗体ウトミルマブ(
PF-05082566)の重鎖CDR3である。
[00206] 配列番号18は、4-1BBアゴニストモノクローナル抗体ウトミルマブ(
PF-05082566)の軽鎖CDR1である。
[00207] 配列番号19は、4-1BBアゴニストモノクローナル抗体ウトミルマブ(
PF-05082566)の軽鎖CDR2である。
[00208] 配列番号20は、4-1BBアゴニストモノクローナル抗体ウトミルマブ(
PF-05082566)の軽鎖CDR3である。
[00209] 配列番号21は、4-1BBアゴニストモノクローナル抗体ウレルマブ(B
MS-663513)の重鎖である。
[00210] 配列番号22は、4-1BBアゴニストモノクローナル抗体ウレルマブ(B
MS-663513)の軽鎖である。
[00211] 配列番号23は、4-1BBアゴニストモノクローナル抗体ウレルマブ(B
MS-663513)の重鎖可変領域(VH)である。
[00212] 配列番号24は、4-1BBアゴニストモノクローナル抗体ウレルマブ(B
MS-663513)の軽鎖可変領域(VL)である。
[00213] 配列番号25は、4-1BBアゴニストモノクローナル抗体ウレルマブ(B
MS-663513)の重鎖CDR1である。
[00214] 配列番号26は、4-1BBアゴニストモノクローナル抗体ウレルマブ(B
MS-663513)の重鎖CDR2である。
[00215] 配列番号27は、4-1BBアゴニストモノクローナル抗体ウレルマブ(B
MS-663513)の重鎖CDR3である。
[00216] 配列番号28は、4-1BBアゴニストモノクローナル抗体ウレルマブ(B
MS-663513)の軽鎖CDR1である。
[00217] 配列番号29は、4-1BBアゴニストモノクローナル抗体ウレルマブ(B
MS-663513)の軽鎖CDR2である。
[00218] 配列番号30は、4-1BBアゴニストモノクローナル抗体ウレルマブ(B
MS-663513)の軽鎖CDR3である。
[00219] 配列番号31は、TNFRSFアゴニスト融合タンパク質のFcドメインで
ある。
[00220] 配列番号32は、TNFRSFアゴニスト融合タンパク質のリンカーである
。
[00221] 配列番号33は、TNFRSFアゴニスト融合タンパク質のリンカーである
。
[00222] 配列番号34は、TNFRSFアゴニスト融合タンパク質のリンカーである
。
[00223] 配列番号35は、TNFRSFアゴニスト融合タンパク質のリンカーである
。
[00224] 配列番号36は、TNFRSFアゴニスト融合タンパク質のリンカーである
。
[00225] 配列番号37は、TNFRSFアゴニスト融合タンパク質のリンカーである
。
[00226] 配列番号38は、TNFRSFアゴニスト融合タンパク質のリンカーである
。
[00227] 配列番号39は、TNFRSFアゴニスト融合タンパク質のリンカーである
。
[00228] 配列番号40は、TNFRSFアゴニスト融合タンパク質のリンカーである
。
[00229] 配列番号41は、TNFRSFアゴニスト融合タンパク質のリンカーである
。
[00230] 配列番号42は、TNFRSFアゴニスト融合タンパク質のFcドメインで
ある。
[00231] 配列番号43は、TNFRSFアゴニスト融合タンパク質のリンカーである
。
[00232] 配列番号44は、TNFRSFアゴニスト融合タンパク質のリンカーである
。
[00233] 配列番号45は、TNFRSFアゴニスト融合タンパク質のリンカーである
。
[00234] 配列番号46は、4-1BBリガンド(4-1BBL)アミノ酸配列である
。
[00235] 配列番号47は、4-1BBLポリペプチドの可溶性部分である。
[00236] 配列番号48は、4-1BBアゴニスト抗体4B4-1-1バージョン1の
重鎖可変領域(VH)である。
[00237] 配列番号49は、4-1BBアゴニスト抗体4B4-1-1バージョン1の
軽鎖可変領域(VL)である。
[00238] 配列番号50は、4-1BBアゴニスト抗体4B4-1-1バージョン2の
重鎖可変領域(VH)である。
[00239] 配列番号51は、4-1BBアゴニスト抗体4B4-1-1バージョン2の
軽鎖可変領域(VL)である。
[00240] 配列番号52は、4-1BBアゴニスト抗体H39E3-2の重鎖可変領域
(VH)である。
[00241] 配列番号53は、4-1BBアゴニスト抗体H39E3-2の軽鎖可変領域
(VL)である。
[00242] 配列番号54は、ヒトOX40のアミノ酸配列である。
[00243] 配列番号55は、マウスOX40のアミノ酸配列である。
[00244] 配列番号56は、OX40アゴニストモノクローナル抗体タボリキシズマブ
(MEDI-0562)の重鎖である。
[00245] 配列番号57は、OX40アゴニストモノクローナル抗体タボリキシズマブ
(MEDI-0562)の軽鎖である。
[00246] 配列番号58は、OX40アゴニストモノクローナル抗体タボリキシズマブ
(MEDI-0562)の重鎖可変領域(VH)である。
[00247] 配列番号59は、OX40アゴニストモノクローナル抗体タボリキシズマブ
(MEDI-0562)の軽鎖可変領域(VL)である。
[00248] 配列番号60は、OX40アゴニストモノクローナル抗体タボリキシズマブ
(MEDI-0562)の重鎖CDR1である。
[00249] 配列番号61は、OX40アゴニストモノクローナル抗体タボリキシズマブ
(MEDI-0562)の重鎖CDR2である。
[00250] 配列番号62は、OX40アゴニストモノクローナル抗体タボリキシズマブ
(MEDI-0562)の重鎖CDR3である。
[00251] 配列番号63は、OX40アゴニストモノクローナル抗体タボリキシズマブ
(MEDI-0562)の軽鎖CDR1である。
[00252] 配列番号64は、OX40アゴニストモノクローナル抗体タボリキシズマブ
(MEDI-0562)の軽鎖CDR2である。
[00253] 配列番号65は、OX40アゴニストモノクローナル抗体タボリキシズマブ
(MEDI-0562)の軽鎖CDR3である。
[00254] 配列番号66は、OX40アゴニストモノクローナル抗体11D4の重鎖で
ある。
[00255] 配列番号67は、OX40アゴニストモノクローナル抗体11D4の軽鎖で
ある。
[00256] 配列番号68は、OX40アゴニストモノクローナル抗体11D4の重鎖可
変領域(VH)である。
[00257] 配列番号69は、OX40アゴニストモノクローナル抗体11D4の軽鎖可
変領域(VL)である。
[00258] 配列番号70は、OX40アゴニストモノクローナル抗体11D4の重鎖C
DR1である。
[00259] 配列番号71は、OX40アゴニストモノクローナル抗体11D4の重鎖C
DR2である。
[00260] 配列番号72は、OX40アゴニストモノクローナル抗体11D4の重鎖C
DR3である。
[00261] 配列番号73は、OX40アゴニストモノクローナル抗体11D4の軽鎖C
DR1である。
[00262] 配列番号74は、OX40アゴニストモノクローナル抗体11D4の軽鎖C
DR2である。
[00263] 配列番号75は、OX40アゴニストモノクローナル抗体11D4の軽鎖C
DR3である。
[00264] 配列番号76は、OX40アゴニストモノクローナル抗体18D8の重鎖で
ある。
[00265] 配列番号77は、OX40アゴニストモノクローナル抗体18D8の軽鎖で
ある。
[00266] 配列番号78は、OX40アゴニストモノクローナル抗体18D8の重鎖可
変領域(VH)である。
[00267] 配列番号79は、OX40アゴニストモノクローナル抗体18D8の軽鎖可
変領域(VL)である。
[00268] 配列番号80は、OX40アゴニストモノクローナル抗体18D8の重鎖C
DR1である。
[00269] 配列番号81は、OX40アゴニストモノクローナル抗体18D8の重鎖C
DR2である。
[00270] 配列番号82は、OX40アゴニストモノクローナル抗体18D8の重鎖C
DR3である。
[00271] 配列番号83は、OX40アゴニストモノクローナル抗体18D8の軽鎖C
DR1である。
[00272] 配列番号84は、OX40アゴニストモノクローナル抗体18D8の軽鎖C
DR2である。
[00273] 配列番号85は、OX40アゴニストモノクローナル抗体18D8の軽鎖C
DR3である。
[00274] 配列番号86は、OX40アゴニストモノクローナル抗体Hu119-12
2の重鎖可変領域(VH)である。
[00275] 配列番号87は、OX40アゴニストモノクローナル抗体Hu119-12
2の軽鎖可変領域(VL)である。
[00276] 配列番号88は、OX40アゴニストモノクローナル抗体Hu119-12
2の重鎖CDR1である。
[00277] 配列番号89は、OX40アゴニストモノクローナル抗体Hu119-12
2の重鎖CDR2である。
[00278] 配列番号90は、OX40アゴニストモノクローナル抗体Hu119-12
2の重鎖CDR3である。
[00279] 配列番号91は、OX40アゴニストモノクローナル抗体Hu119-12
2の軽鎖CDR1である。
[00280] 配列番号92は、OX40アゴニストモノクローナル抗体Hu119-12
2の軽鎖CDR2である。
[00281] 配列番号93は、OX40アゴニストモノクローナル抗体Hu119-12
2の軽鎖CDR3である。
[00282] 配列番号94は、OX40アゴニストモノクローナル抗体Hu106-22
2の重鎖可変領域(VH)である。
[00283] 配列番号95は、OX40アゴニストモノクローナル抗体Hu106-22
2の軽鎖可変領域(VL)である。
[00284] 配列番号96は、OX40アゴニストモノクローナル抗体Hu106-22
2の重鎖CDR1である。
[00285] 配列番号97は、OX40アゴニストモノクローナル抗体Hu106-22
2の重鎖CDR2である。
[00286] 配列番号98は、OX40アゴニストモノクローナル抗体Hu106-22
2の重鎖CDR3である。
[00287] 配列番号99は、OX40アゴニストモノクローナル抗体Hu106-22
2の軽鎖CDR1である。
[00288] 配列番号100は、OX40アゴニストモノクローナル抗体Hu106-2
22の軽鎖CDR2である。
[00289] 配列番号101は、OX40アゴニストモノクローナル抗体Hu106-2
22の軽鎖CDR3である。
[00290] 配列番号102は、OX40リガンド(OX40L)アミノ酸配列である。
[00291] 配列番号103は、OX40Lポリペプチドの可溶性部分である。
[00292] 配列番号104は、OX40Lポリペプチドの代替的可溶性部分である。
[00293] 配列番号105は、OX40アゴニストモノクローナル抗体008の重鎖可
変領域(VH)である。
[00294] 配列番号106は、OX40アゴニストモノクローナル抗体008の軽鎖可
変領域(VL)である。
[00295] 配列番号107は、OX40アゴニストモノクローナル抗体011の重鎖可
変領域(VH)である。
[00296] 配列番号108は、OX40アゴニストモノクローナル抗体011の軽鎖可
変領域(VL)である。
[00297] 配列番号109は、OX40アゴニストモノクローナル抗体021の重鎖可
変領域(VH)である。
[00298] 配列番号110は、OX40アゴニストモノクローナル抗体021の軽鎖可
変領域(VL)である。
[00299] 配列番号111は、OX40アゴニストモノクローナル抗体023の重鎖可
変領域(VH)である。
[00300] 配列番号112は、OX40アゴニストモノクローナル抗体023の軽鎖可
変領域(VL)である。
[00301] 配列番号113は、OX40アゴニストモノクローナル抗体の重鎖可変領域
(VH)である。
[00302] 配列番号114は、OX40アゴニストモノクローナル抗体の軽鎖可変領域
(VL)である。
[00303] 配列番号115は、OX40アゴニストモノクローナル抗体の重鎖可変領域
(VH)である。
[00304] 配列番号116は、OX40アゴニストモノクローナル抗体の軽鎖可変領域
(VL)である。
[00305] 配列番号117は、ヒト化OX40アゴニストモノクローナル抗体の重鎖可
変領域(VH)である。
[00306] 配列番号118は、ヒト化OX40アゴニストモノクローナル抗体の重鎖可
変領域(VH)である。
[00307] 配列番号119は、ヒト化OX40アゴニストモノクローナル抗体の軽鎖可
変領域(VL)である。
[00308] 配列番号120は、ヒト化OX40アゴニストモノクローナル抗体の軽鎖可
変領域(VL)である。
[00309] 配列番号121は、ヒト化OX40アゴニストモノクローナル抗体の重鎖可
変領域(VH)である。
[00310] 配列番号122は、ヒト化OX40アゴニストモノクローナル抗体の重鎖可
変領域(VH)である。
[00311] 配列番号123は、ヒト化OX40アゴニストモノクローナル抗体の軽鎖可
変領域(VL)である。
[00312] 配列番号124は、ヒト化OX40アゴニストモノクローナル抗体の軽鎖可
変領域(VL)である。
[00313] 配列番号125は、OX40アゴニストモノクローナル抗体の重鎖可変領域
(VH)である。
[00314] 配列番号126は、OX40アゴニストモノクローナル抗体の軽鎖可変領域
(VL)である。
発明の詳細な説明
I.序論
[00315] 急速拡大培養プロトコル(REP)によってエキソビボで培養したTILを
利用する養子細胞療法は、黒色腫患者において宿主免疫抑制後に養子細胞療法の成功をもたらしている。現行の注入適合パラメータは、TILの組成(例えば、CD28、CD8又はCD4陽性)の読み取り並びにREP産物の拡大倍数及び生存率の数値に依存している。
I.序論
[00315] 急速拡大培養プロトコル(REP)によってエキソビボで培養したTILを
利用する養子細胞療法は、黒色腫患者において宿主免疫抑制後に養子細胞療法の成功をもたらしている。現行の注入適合パラメータは、TILの組成(例えば、CD28、CD8又はCD4陽性)の読み取り並びにREP産物の拡大倍数及び生存率の数値に依存している。
[00316] 現行のREPプロトコルは、患者に注入されることになるTILの健康に関
して見識をほとんど与えない。T細胞は、ナイーブT細胞からエフェクターT細胞へのその成熟の過程で顕著な代謝シフトを起こす(Chang, et al., Nat. Immunol. 2016, 17, 364(本明細書によって全体として明示的に組み込まれる)及び特に嫌気的及び好気的代謝の考察及びマーカーについて参照されたい)。例えば、ナイーブT細胞はATPの産生をミトコンドリア呼吸に依存する一方、TILなどの成熟した健康なエフェクターT細胞は、高度に解糖性であり、それは、増殖、遊走、活性化及び抗腫瘍有効性に必要とするバイ
オエナジェティクス基質の供給を好気的解糖に依存する。
して見識をほとんど与えない。T細胞は、ナイーブT細胞からエフェクターT細胞へのその成熟の過程で顕著な代謝シフトを起こす(Chang, et al., Nat. Immunol. 2016, 17, 364(本明細書によって全体として明示的に組み込まれる)及び特に嫌気的及び好気的代謝の考察及びマーカーについて参照されたい)。例えば、ナイーブT細胞はATPの産生をミトコンドリア呼吸に依存する一方、TILなどの成熟した健康なエフェクターT細胞は、高度に解糖性であり、それは、増殖、遊走、活性化及び抗腫瘍有効性に必要とするバイ
オエナジェティクス基質の供給を好気的解糖に依存する。
[00317] 現在のTIL製造プロセスは、長さ、経費、無菌性の懸念及び本明細書中に
記載される他の要因によって制限されるため、かかるプロセスを商業化する可能性は、大幅に制限されており、これら及び他の理由により、現時点で利用できる商業プロセスはない。本発明は、一過性のタンパク質発現変化の方法論並びに商業規模の製造及び複数の臨床センターでヒト患者に使用するための規制当局の承認に適している、かかるプロセスに基づく治療法を利用したTIL製造プロセスを提供する。本発明は、治療有効性が増大した治療用TIL集団を調製するためにTILを再プログラミングするための一過性の遺伝子改変プロセスを提供する。
記載される他の要因によって制限されるため、かかるプロセスを商業化する可能性は、大幅に制限されており、これら及び他の理由により、現時点で利用できる商業プロセスはない。本発明は、一過性のタンパク質発現変化の方法論並びに商業規模の製造及び複数の臨床センターでヒト患者に使用するための規制当局の承認に適している、かかるプロセスに基づく治療法を利用したTIL製造プロセスを提供する。本発明は、治療有効性が増大した治療用TIL集団を調製するためにTILを再プログラミングするための一過性の遺伝子改変プロセスを提供する。
II.定義
[00319] 他に定義されない限り、本明細書中で使用される全ての技術及び科学用語は
、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書で言及される全ての特許及び刊行物は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
[00319] 他に定義されない限り、本明細書中で使用される全ての技術及び科学用語は
、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書で言及される全ての特許及び刊行物は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
[00320] 用語「インビボ」は、対象の体内で起こる事象を指す。
[00321] 用語「インビトロ」は、対象の体外で起こる事象を指す。インビトロアッセ
イは、生細胞又は死細胞を利用した細胞ベースのアッセイを包含し、また、インタクトな細胞を利用しない無細胞アッセイも包含し得る。
イは、生細胞又は死細胞を利用した細胞ベースのアッセイを包含し、また、インタクトな細胞を利用しない無細胞アッセイも包含し得る。
[00322] 用語「エキソビボ」は、対象の身体から摘出された細胞、組織及び/又は臓
器の処置又は処置の実施を含む事象を指す。適切には、細胞、組織及び/又は臓器は、手術又は処置の方法で対象の身体に戻される。
器の処置又は処置の実施を含む事象を指す。適切には、細胞、組織及び/又は臓器は、手術又は処置の方法で対象の身体に戻される。
[00323] 用語「急速拡大培養」は、1週間の期間にわたって少なくとも約3倍(又は
4倍、5倍、6倍、7倍、8倍又は9倍)、より好ましくは、1週間の期間にわたって少なくとも約10倍(又は20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍又は90倍)又は最も好ましくは、1週間の期間にわたって少なくとも約100倍の抗原特異的TILの数の増加を意味する。複数の急速拡大培養プロトコルを以下に概説する。
4倍、5倍、6倍、7倍、8倍又は9倍)、より好ましくは、1週間の期間にわたって少なくとも約10倍(又は20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍又は90倍)又は最も好ましくは、1週間の期間にわたって少なくとも約100倍の抗原特異的TILの数の増加を意味する。複数の急速拡大培養プロトコルを以下に概説する。
[00324] 本明細書において「腫瘍浸潤リンパ球」又は「TIL」とは、対象の血流を
離れて腫瘍中に遊走した、当初白血球細胞として得られた細胞の集団を意味する。TILとしては、限定はされないが、CD8+細胞傷害性T細胞(リンパ球)、Th1及びTh17 CD4+ T細胞、ナチュラルキラー細胞、樹状細胞及びM1マクロファージが挙げられる。TILは、初代及び二次TILの両方を含む。「初代TIL」は、本明細書に概説される通り患者組織サンプルから得られるものであり(「新鮮に回収された」と称されることもある)、及び「二次TIL」は、限定はされないが、バルクTIL及び拡大培養TIL(「REP TIL」又は「ポストREP TIL」)を含め、本明細書で考察する通り拡大培養された又は成長した任意のTIL細胞集団である。TIL細胞集団は、遺伝子修飾TILを含み得る。
離れて腫瘍中に遊走した、当初白血球細胞として得られた細胞の集団を意味する。TILとしては、限定はされないが、CD8+細胞傷害性T細胞(リンパ球)、Th1及びTh17 CD4+ T細胞、ナチュラルキラー細胞、樹状細胞及びM1マクロファージが挙げられる。TILは、初代及び二次TILの両方を含む。「初代TIL」は、本明細書に概説される通り患者組織サンプルから得られるものであり(「新鮮に回収された」と称されることもある)、及び「二次TIL」は、限定はされないが、バルクTIL及び拡大培養TIL(「REP TIL」又は「ポストREP TIL」)を含め、本明細書で考察する通り拡大培養された又は成長した任意のTIL細胞集団である。TIL細胞集団は、遺伝子修飾TILを含み得る。
[00325] 本明細書において「細胞集団」(TILを含む)は、共通の形質を共有する
多数の細胞を意味する。一般に、集団は、概して数が1×106~1×1010個の範囲であり、異なるTIL集団は異なる数を含む。例えば、IL-2の存在下での初代TILの初期成長は、およそ1×108個の細胞のバルクTIL集団をもたらす。REP拡大培養は、概して1.5×109~1.5×1010個の注入のための細胞集団が提供されるように行われる。
多数の細胞を意味する。一般に、集団は、概して数が1×106~1×1010個の範囲であり、異なるTIL集団は異なる数を含む。例えば、IL-2の存在下での初代TILの初期成長は、およそ1×108個の細胞のバルクTIL集団をもたらす。REP拡大培養は、概して1.5×109~1.5×1010個の注入のための細胞集団が提供されるように行われる。
[00326] 本明細書において「凍結保存TIL」とは、初代、バルク又は拡大培養(R
EP TIL)のいずれかのTILが約-150℃~-60℃の範囲で処理及び保存されることを意味する。一般的な凍結保存方法は、実施例を含め、本明細書の他の部分にも記載される。明確にするために言えば、「凍結保存TIL」は、初代TILの供給源として用いられ得る凍結組織サンプルと区別可能なものである。
EP TIL)のいずれかのTILが約-150℃~-60℃の範囲で処理及び保存されることを意味する。一般的な凍結保存方法は、実施例を含め、本明細書の他の部分にも記載される。明確にするために言えば、「凍結保存TIL」は、初代TILの供給源として用いられ得る凍結組織サンプルと区別可能なものである。
[00327] 本明細書において「解凍した凍結保存TIL」とは、かつて凍結保存されて
いたが、次に処理により、限定はされないが細胞培養温度又はTILを患者に投与し得る温度を含め、室温以上に戻されたTIL集団を意味する。
いたが、次に処理により、限定はされないが細胞培養温度又はTILを患者に投与し得る温度を含め、室温以上に戻されたTIL集団を意味する。
[00328] TILは、一般的に、細胞表面マーカーを使用して生化学的に、又は腫瘍に
浸潤し処置に影響を及ぼすそれらの能力によって機能的に定義することができる。TILは、一般に、以下のバイオマーカーの1つ以上を発現することによって分類することができる:CD4、CD8、TCR αβ、CD27、CD28、CD56、CCR7、CD45Ra、CD95、PD-1及びCD25。加えて及び代わりに、TILは、患者への再導入時に固形腫瘍に浸潤するその能力によって機能的に定義することができる。
浸潤し処置に影響を及ぼすそれらの能力によって機能的に定義することができる。TILは、一般に、以下のバイオマーカーの1つ以上を発現することによって分類することができる:CD4、CD8、TCR αβ、CD27、CD28、CD56、CCR7、CD45Ra、CD95、PD-1及びCD25。加えて及び代わりに、TILは、患者への再導入時に固形腫瘍に浸潤するその能力によって機能的に定義することができる。
[00329] 用語「凍結保存培地(cryopreservation media)」又は「凍結保存培地(cryopreservation medium)」は、細胞の凍結保存に使用できる任意の培地を指す。かかる培地には、7%~10%のDMSOを含む培地が含まれ得る。例示的培地には、CryoStor CS10、Hyperthermasol及びそれらの組み合わせが含まれる。用語「CS10」は、Stemcell Technologies又はBiolife Solutionsから入手した凍結保存培地を指す。CS10倍地
は、商品名「CryoStor(登録商標)CS10」と称される場合がある。CS10培地は、DMSOを含む無血清、無動物成分培地である。
は、商品名「CryoStor(登録商標)CS10」と称される場合がある。CS10培地は、DMSOを含む無血清、無動物成分培地である。
[00330] 用語「セントラルメモリーT細胞」は、ヒトではCD45R0+であり、且
つCCR7(CCR7hi)及びCD62L(CD62hi)を構成的に発現するT細胞のサブセットを指す。セントラルメモリーT細胞の表面表現型には、TCR、CD3、CD127(IL-7R)及びIL-15Rも含まれる。セントラルメモリーT細胞の転写因子には、BCL-6、BCL-6B、MBD2及びBMI1が含まれる。セントラルメモリーT細胞はTCR惹起後にエフェクター分子としてIL-2及びCD40Lを主に分泌する。セントラルメモリーT細胞は、血中のCD4区画において優勢であり、ヒトではリンパ節及び扁桃腺において比例的に濃縮されている。
つCCR7(CCR7hi)及びCD62L(CD62hi)を構成的に発現するT細胞のサブセットを指す。セントラルメモリーT細胞の表面表現型には、TCR、CD3、CD127(IL-7R)及びIL-15Rも含まれる。セントラルメモリーT細胞の転写因子には、BCL-6、BCL-6B、MBD2及びBMI1が含まれる。セントラルメモリーT細胞はTCR惹起後にエフェクター分子としてIL-2及びCD40Lを主に分泌する。セントラルメモリーT細胞は、血中のCD4区画において優勢であり、ヒトではリンパ節及び扁桃腺において比例的に濃縮されている。
[00331] 用語「エフェクターメモリーT細胞」は、セントラルメモリーT細胞と同様
にCD45R0+であるが、CCR7の構成的発現が欠損しており(CCR7lo)、且つCD62L発現が不均一であるか又は低い(CD62Llo)、ヒト又は哺乳類T細胞のサブセットを指す。セントラルメモリーT細胞の表面表現型には、TCR、CD3、CD127(IL-7R)及びIL-15Rも含まれる。セントラルメモリーT細胞の転写因子には、BLIMP1が含まれる。エフェクターメモリーT細胞は、抗原刺激後、インターフェロン-γ、IL-4及びIL-5を含む、高レベルの炎症性サイトカインを急速に分泌する。エフェクターメモリーT細胞は、血中のCD8区画において優勢であり、ヒトでは肺、肝臓及び腸において比例的に濃縮されている。CD8+エフェクターメモリーT細胞は多量のパーフォリンを有する。用語「閉鎖系」は、外部環境に対して閉鎖されている系を指す。本発明の方法では、細胞培養方法に適切な任意の閉鎖系を用いることができる。閉鎖系としては、例えば、限定はされないが、閉鎖型Gコンテナが挙げられる。閉鎖系に腫瘍セグメントが加えられた後は、TILの患者への投与直前までこの系は外部環境に対して開放されない。
にCD45R0+であるが、CCR7の構成的発現が欠損しており(CCR7lo)、且つCD62L発現が不均一であるか又は低い(CD62Llo)、ヒト又は哺乳類T細胞のサブセットを指す。セントラルメモリーT細胞の表面表現型には、TCR、CD3、CD127(IL-7R)及びIL-15Rも含まれる。セントラルメモリーT細胞の転写因子には、BLIMP1が含まれる。エフェクターメモリーT細胞は、抗原刺激後、インターフェロン-γ、IL-4及びIL-5を含む、高レベルの炎症性サイトカインを急速に分泌する。エフェクターメモリーT細胞は、血中のCD8区画において優勢であり、ヒトでは肺、肝臓及び腸において比例的に濃縮されている。CD8+エフェクターメモリーT細胞は多量のパーフォリンを有する。用語「閉鎖系」は、外部環境に対して閉鎖されている系を指す。本発明の方法では、細胞培養方法に適切な任意の閉鎖系を用いることができる。閉鎖系としては、例えば、限定はされないが、閉鎖型Gコンテナが挙げられる。閉鎖系に腫瘍セグメントが加えられた後は、TILの患者への投与直前までこの系は外部環境に対して開放されない。
[00332] 腫瘍を破砕するプロセスを説明するために本明細書で使用される「断片化」
、「断片」及び「断片化された」という用語には、腫瘍組織の破砕、スライス、分割及び細切並びに腫瘍組織の物理的構造を破砕する任意の他の方法などの機械的断片化方法が含まれる。
、「断片」及び「断片化された」という用語には、腫瘍組織の破砕、スライス、分割及び細切並びに腫瘍組織の物理的構造を破砕する任意の他の方法などの機械的断片化方法が含まれる。
[00333] 用語「末梢血単核球」及び「PBMC」は、リンパ球(T細胞、B細胞、N
K細胞)及び単球を含めた、円形の核を有する末梢血細胞を指す。抗原提示細胞(PBMCは、抗原提示細胞の一種である)として使用される場合、末梢血単核球は、照射された同種異系末梢血単核球である。
K細胞)及び単球を含めた、円形の核を有する末梢血細胞を指す。抗原提示細胞(PBMCは、抗原提示細胞の一種である)として使用される場合、末梢血単核球は、照射された同種異系末梢血単核球である。
[00334] 用語「末梢血単核球」及び「PBMC」は、リンパ球(T細胞、B細胞、N
K細胞)及び単球を含めた、円形の核を有する末梢血細胞を指す。好ましくは、末梢血単核球は、照射された同種異系末梢血単核球である。PBMCは、抗原提示細胞の一種である。
K細胞)及び単球を含めた、円形の核を有する末梢血細胞を指す。好ましくは、末梢血単核球は、照射された同種異系末梢血単核球である。PBMCは、抗原提示細胞の一種である。
[00335] 用語「抗CD3抗体」は、抗体又はその変異体、例えばモノクローナル抗体
であって、成熟T細胞のT細胞抗原受容体におけるCD3受容体に対するヒト、ヒト化、キメラ又はマウス抗体を含むものを指す。抗CD3抗体には、ムロモナブとしても知られるOKT-3が含まれる。抗CD3抗体には、T3及びCD3εとしても知られるUHCT1クローンも含まれる。他の抗CD3抗体には、例えば、オテリキシズマブ、テプリズマブ及びビジリズマブが含まれる。
であって、成熟T細胞のT細胞抗原受容体におけるCD3受容体に対するヒト、ヒト化、キメラ又はマウス抗体を含むものを指す。抗CD3抗体には、ムロモナブとしても知られるOKT-3が含まれる。抗CD3抗体には、T3及びCD3εとしても知られるUHCT1クローンも含まれる。他の抗CD3抗体には、例えば、オテリキシズマブ、テプリズマブ及びビジリズマブが含まれる。
[00336] 用語「OKT-3」(本明細書では「OKT3」とも称される)は、成熟T
細胞のT細胞抗原受容体中のCD3受容体に対して指向されたヒト、ヒト化、キメラ又はマウス抗体を含む、モノクローナル抗体若しくはバイオシミラー又はその変異体を指し、OKT-3(30ng/mL、MACS GMP CD3 pure、Miltenyi Biotech, Inc., San Diego, CA, USA)及びムロモナブ又はそれらの変異体、保存的アミノ酸置換、グリコフォーム
若しくはバイオシミラーなどの市販の形態を含む。ムロモナブの重鎖及び軽鎖のアミノ酸配列を表1に示す(配列番号1及び配列番号2)。OKT-3を産生することができるハイブリドーマは、American Type Culture Collectionに寄託されており、ATCC受託番号CRL 8001が割り当てられている。OKT-3を産生することができるハイブリドーマもEuropean Collection of Authenticated Cell Cultures(ECACC)に寄託されており、カタログ番号86022706が割り当てられている。
細胞のT細胞抗原受容体中のCD3受容体に対して指向されたヒト、ヒト化、キメラ又はマウス抗体を含む、モノクローナル抗体若しくはバイオシミラー又はその変異体を指し、OKT-3(30ng/mL、MACS GMP CD3 pure、Miltenyi Biotech, Inc., San Diego, CA, USA)及びムロモナブ又はそれらの変異体、保存的アミノ酸置換、グリコフォーム
若しくはバイオシミラーなどの市販の形態を含む。ムロモナブの重鎖及び軽鎖のアミノ酸配列を表1に示す(配列番号1及び配列番号2)。OKT-3を産生することができるハイブリドーマは、American Type Culture Collectionに寄託されており、ATCC受託番号CRL 8001が割り当てられている。OKT-3を産生することができるハイブリドーマもEuropean Collection of Authenticated Cell Cultures(ECACC)に寄託されており、カタログ番号86022706が割り当てられている。
[00337] 用語「IL-2」(本明細書では「IL2」とも称される)は、インターロ
イキン-2として知られるT細胞成長因子を指し、ヒト及び哺乳動物の形態、保存的アミノ酸置換、グリコフォーム、バイオシミラー及びそれらの変異体を含む全ての形態のIL-2を含む。IL-2は、例えば、Nelson, J. Immunol. 2004, 172, 3983-88及びMalek,
Annu. Rev. Immunol. 2008, 26, 453-79に記載され、その開示は、参照により本明細書
に組み込まれる。本発明における使用に適した組換えヒトIL-2のアミノ酸配列を表2に示す(配列番号3)。例えば、IL-2という用語は、アルデスロイキン(PROLEUKIN
、1単回使用バイアルあたり2200万IUで複数の供給元から市販されている)並びにCellGenix, Inc., Portsmouth, NH, USA(CELLGRO GMP)又はProSpec-Tany TechnoGene Ltd., East Brunswick, NJ, USA(カタログ番号CYT-209-b)から市販で供給される組換えIL-2の形態及び他の販売業者からの他の市販の同等物などのIL-2のヒト組換え型を包含する。アルデスロイキン(デス-アラニル-1、セリン-125ヒトIL-2)は、分子量およそ15kDaの非グリコシル化ヒト組換え型IL-2である。本発明における使用に適したアルデスロイキンのアミノ酸配列を表2に示す(配列番号4)。IL-2という用語は、本明細書に記載されているように、Nektar Therapeutics, South
San Francisco, CA, USAから入手可能なペグ化IL2プロドラッグNKTR-214も
含む、ペグ化形態のIL-2も包含する。本発明での使用に好適なNKTR-214及びペグ化IL-2が米国特許出願公開第2014/0328791 A1号及び国際公開第2012/065086 A1号(これらの開示は、参照により本明細書に組み込まれる)に記載されている。本発明での使用に適したコンジュゲートIL-2の代替形態は、米国特許第4,766,106号、同第5,206,344号、同第5,089,261号及び同第4902,502号に記載され、その開示は、参照により本明細書に組み込まれる。本発明における使用に適したIL-2の製剤は、米国特許第6,706,289号に記載されており、その開示は、参照により本明細書に組み込まれる。
イキン-2として知られるT細胞成長因子を指し、ヒト及び哺乳動物の形態、保存的アミノ酸置換、グリコフォーム、バイオシミラー及びそれらの変異体を含む全ての形態のIL-2を含む。IL-2は、例えば、Nelson, J. Immunol. 2004, 172, 3983-88及びMalek,
Annu. Rev. Immunol. 2008, 26, 453-79に記載され、その開示は、参照により本明細書
に組み込まれる。本発明における使用に適した組換えヒトIL-2のアミノ酸配列を表2に示す(配列番号3)。例えば、IL-2という用語は、アルデスロイキン(PROLEUKIN
、1単回使用バイアルあたり2200万IUで複数の供給元から市販されている)並びにCellGenix, Inc., Portsmouth, NH, USA(CELLGRO GMP)又はProSpec-Tany TechnoGene Ltd., East Brunswick, NJ, USA(カタログ番号CYT-209-b)から市販で供給される組換えIL-2の形態及び他の販売業者からの他の市販の同等物などのIL-2のヒト組換え型を包含する。アルデスロイキン(デス-アラニル-1、セリン-125ヒトIL-2)は、分子量およそ15kDaの非グリコシル化ヒト組換え型IL-2である。本発明における使用に適したアルデスロイキンのアミノ酸配列を表2に示す(配列番号4)。IL-2という用語は、本明細書に記載されているように、Nektar Therapeutics, South
San Francisco, CA, USAから入手可能なペグ化IL2プロドラッグNKTR-214も
含む、ペグ化形態のIL-2も包含する。本発明での使用に好適なNKTR-214及びペグ化IL-2が米国特許出願公開第2014/0328791 A1号及び国際公開第2012/065086 A1号(これらの開示は、参照により本明細書に組み込まれる)に記載されている。本発明での使用に適したコンジュゲートIL-2の代替形態は、米国特許第4,766,106号、同第5,206,344号、同第5,089,261号及び同第4902,502号に記載され、その開示は、参照により本明細書に組み込まれる。本発明における使用に適したIL-2の製剤は、米国特許第6,706,289号に記載されており、その開示は、参照により本明細書に組み込まれる。
[00338] 用語「IL-4」(本明細書では「IL4」とも称される)は、インターロ
イキン4として知られるサイトカインを指し、これは、Th2 T細胞により、且つ好酸球、好塩基球及び肥満細胞により産生される。IL-4は、ナイーブヘルパーT細胞(Th0細胞)からTh2 T細胞への分化を調節する。Steinke and Borish, Respir. Res.
2001, 2, 66-70。IL-4によって活性化されると、Th2 T細胞は続いてポジティ
ブフィードバックループにおいて、更なるIL-4を産生する。IL-4はまた、B細胞拡大培養及びクラスII MHC発現を刺激し、B細胞からのIgE及びIgG1発現へのクラス切り替えを誘導する。本発明における使用に適した組換えヒトIL-4は、ProSpec-Tany TechnoGene Ltd., East Brunswick, NJ, USA(カタログ番号CYT-211)
及びThermoFisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA(ヒトIL-15組換えタンパ
ク質、カタログ番号Gibco CTP0043)を含む複数の供給元から市販されている。本発明における使用に適した組換えヒトIL-4のアミノ酸配列を表2に示す(配列番号5)。
イキン4として知られるサイトカインを指し、これは、Th2 T細胞により、且つ好酸球、好塩基球及び肥満細胞により産生される。IL-4は、ナイーブヘルパーT細胞(Th0細胞)からTh2 T細胞への分化を調節する。Steinke and Borish, Respir. Res.
2001, 2, 66-70。IL-4によって活性化されると、Th2 T細胞は続いてポジティ
ブフィードバックループにおいて、更なるIL-4を産生する。IL-4はまた、B細胞拡大培養及びクラスII MHC発現を刺激し、B細胞からのIgE及びIgG1発現へのクラス切り替えを誘導する。本発明における使用に適した組換えヒトIL-4は、ProSpec-Tany TechnoGene Ltd., East Brunswick, NJ, USA(カタログ番号CYT-211)
及びThermoFisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA(ヒトIL-15組換えタンパ
ク質、カタログ番号Gibco CTP0043)を含む複数の供給元から市販されている。本発明における使用に適した組換えヒトIL-4のアミノ酸配列を表2に示す(配列番号5)。
[00339] 用語「IL-7」(本明細書では「IL7」とも称される)は、インターロ
イキン7として知られるグリコシル化組織由来サイトカインを指し、これは間質及び上皮細胞並びに樹状細胞から入手し得る。Fry and Mackall, Blood 2002, 99, 3892-904。I
L-7は、T細胞の発生を刺激することができる。IL-7は、胸腺内のT細胞発生及び末梢内での生存に重要な一連のシグナルにおいて、IL-7受容体α及び一般的なγ鎖受容体からなるヘテロ二量体であるIL-7受容体に結合する。本発明における使用に適した組換えヒトIL-7は、ProSpec-Tany TechnoGene Ltd., East Brunswick, NJ, USA(
カタログ番号CYT-254)及びThermoFisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA (ヒトIL-15組換えタンパク質、カタログ番号Gibco PHC0071)を含む複数の供給元から市販されている。本発明における使用に適した組換えヒトIL-7のアミノ酸配列を表2に示す(配列番号6)。
イキン7として知られるグリコシル化組織由来サイトカインを指し、これは間質及び上皮細胞並びに樹状細胞から入手し得る。Fry and Mackall, Blood 2002, 99, 3892-904。I
L-7は、T細胞の発生を刺激することができる。IL-7は、胸腺内のT細胞発生及び末梢内での生存に重要な一連のシグナルにおいて、IL-7受容体α及び一般的なγ鎖受容体からなるヘテロ二量体であるIL-7受容体に結合する。本発明における使用に適した組換えヒトIL-7は、ProSpec-Tany TechnoGene Ltd., East Brunswick, NJ, USA(
カタログ番号CYT-254)及びThermoFisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA (ヒトIL-15組換えタンパク質、カタログ番号Gibco PHC0071)を含む複数の供給元から市販されている。本発明における使用に適した組換えヒトIL-7のアミノ酸配列を表2に示す(配列番号6)。
[00340] 用語「IL-15」(本明細書では「IL15」とも称される)は、インタ
ーロイキン-15として知られるT細胞成長因子を指し、ヒト及び哺乳動物の形態、保存的アミノ酸置換、グリコフォーム、バイオシミラー及びそれらの変異体を含む全ての形態のIL-2を含む。IL-15は、例えば、Fehniger and Caligiuri, Blood 2001, 97, 14-32に記載され、その開示は、参照により本明細書に組み込まれる。IL-15は、β
及びγシグナル伝達受容体サブユニットをIL-2と共有する。組換えヒトIL-15は、分子量12.8kDaの114個のアミノ酸(及びN末端メチオニン)を含有する単一の非グリコシル化ポリペプチド鎖である。組換えヒトIL-15は、ProSpec-Tany TechnoGene Ltd., East Brunswick, NJ, USA(カタログ番号CYT-230-b)及びThermoFisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA (ヒトIL-15組換えタンパク質、カタ
ログ番号34-8159-82)を含む複数の供給元から市販されている。本発明における使用に適した組換えヒトIL-15のアミノ酸配列を表2に示す(配列番号7)。
ーロイキン-15として知られるT細胞成長因子を指し、ヒト及び哺乳動物の形態、保存的アミノ酸置換、グリコフォーム、バイオシミラー及びそれらの変異体を含む全ての形態のIL-2を含む。IL-15は、例えば、Fehniger and Caligiuri, Blood 2001, 97, 14-32に記載され、その開示は、参照により本明細書に組み込まれる。IL-15は、β
及びγシグナル伝達受容体サブユニットをIL-2と共有する。組換えヒトIL-15は、分子量12.8kDaの114個のアミノ酸(及びN末端メチオニン)を含有する単一の非グリコシル化ポリペプチド鎖である。組換えヒトIL-15は、ProSpec-Tany TechnoGene Ltd., East Brunswick, NJ, USA(カタログ番号CYT-230-b)及びThermoFisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA (ヒトIL-15組換えタンパク質、カタ
ログ番号34-8159-82)を含む複数の供給元から市販されている。本発明における使用に適した組換えヒトIL-15のアミノ酸配列を表2に示す(配列番号7)。
[00341] 用語「IL-21」(本明細書では「IL21」とも称される)は、インタ
ーロイキン-21として知られる多面発現性サイトカインタンパク質を指し、ヒト及び哺乳動物の形態、保存的アミノ酸置換、グリコフォーム、バイオシミラー及びそれらの変異体を含む全ての形態のIL-21を含む。IL-21は、例えば、Spolski and Leonard,
Nat. Rev. Drug. Disc. 2014, 13, 379-95に記載され、その開示は、参照により本明細
書に組み込まれる。IL-21は、主にナチュラルキラーT細胞及び活性化ヒトCD4+
T細胞によって産生される。組換えヒトIL-21は、分子量15.4kDaの132個のアミノ酸を含有する単一の非グリコシル化ポリペプチド鎖である。組換えヒトIL-21は、ProSpec-Tany TechnoGene Ltd., East Brunswick, NJ, USA(カタログ番号CY
T-408-b)及びThermoFisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA (ヒトIL-21組換えタンパク質、カタログ番号14-8219-80)を含む複数の供給元から市販されている。本発明における使用に適した組換えヒトIL-21のアミノ酸配列を表2に示す(配列番号8)。
ーロイキン-21として知られる多面発現性サイトカインタンパク質を指し、ヒト及び哺乳動物の形態、保存的アミノ酸置換、グリコフォーム、バイオシミラー及びそれらの変異体を含む全ての形態のIL-21を含む。IL-21は、例えば、Spolski and Leonard,
Nat. Rev. Drug. Disc. 2014, 13, 379-95に記載され、その開示は、参照により本明細
書に組み込まれる。IL-21は、主にナチュラルキラーT細胞及び活性化ヒトCD4+
T細胞によって産生される。組換えヒトIL-21は、分子量15.4kDaの132個のアミノ酸を含有する単一の非グリコシル化ポリペプチド鎖である。組換えヒトIL-21は、ProSpec-Tany TechnoGene Ltd., East Brunswick, NJ, USA(カタログ番号CY
T-408-b)及びThermoFisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA (ヒトIL-21組換えタンパク質、カタログ番号14-8219-80)を含む複数の供給元から市販されている。本発明における使用に適した組換えヒトIL-21のアミノ酸配列を表2に示す(配列番号8)。
[00342] 「抗腫瘍有効量」、「腫瘍阻害有効量」又は「治療量」が指示されるとき、
本発明の組成物の正確な投与量は、医師が年齢、体重、腫瘍サイズ、感染又は転移の程度
及び患者(対象)の状態の個体差を考慮して決定することができる。概して、本明細書に記載される腫瘍浸潤リンパ球(例えば、二次TIL又は遺伝子修飾された細胞傷害性リンパ球)を含む医薬組成物は、104~1011細胞/kg体重(例えば、105~106、105~1010、105~1011、106~1010、106~1011、107~1011、107~1010、108~1011、108~1010、109~1011又は109~1010細胞/kg体重)(これらの範囲内にある全ての整数値を含む)の投薬量で投与され得ると言うことができる。腫瘍浸潤リンパ球(場合により遺伝子修飾された細胞傷害性リンパ球を含む)組成物はまた、これらの投薬量で複数回投与され得る。腫瘍浸潤リンパ球(ある場合には遺伝子的なものを含む)は、免疫療法で一般に公知の注入技法を用いることにより投与され得る(例えば、Rosenberg et al., New Eng. J. of
Med. 319: 1676, 1988を参照されたい)。特定の患者に対する最適な投与量及び処置レ
ジメンは、疾患の徴候について患者をモニターし、それに応じて処置を調整することにより、医学の当業者によって容易に決定され得る。
本発明の組成物の正確な投与量は、医師が年齢、体重、腫瘍サイズ、感染又は転移の程度
及び患者(対象)の状態の個体差を考慮して決定することができる。概して、本明細書に記載される腫瘍浸潤リンパ球(例えば、二次TIL又は遺伝子修飾された細胞傷害性リンパ球)を含む医薬組成物は、104~1011細胞/kg体重(例えば、105~106、105~1010、105~1011、106~1010、106~1011、107~1011、107~1010、108~1011、108~1010、109~1011又は109~1010細胞/kg体重)(これらの範囲内にある全ての整数値を含む)の投薬量で投与され得ると言うことができる。腫瘍浸潤リンパ球(場合により遺伝子修飾された細胞傷害性リンパ球を含む)組成物はまた、これらの投薬量で複数回投与され得る。腫瘍浸潤リンパ球(ある場合には遺伝子的なものを含む)は、免疫療法で一般に公知の注入技法を用いることにより投与され得る(例えば、Rosenberg et al., New Eng. J. of
Med. 319: 1676, 1988を参照されたい)。特定の患者に対する最適な投与量及び処置レ
ジメンは、疾患の徴候について患者をモニターし、それに応じて処置を調整することにより、医学の当業者によって容易に決定され得る。
[00343] 「血液悪性腫瘍」という用語は、血液、骨髄、リンパ節及びリンパ系の組織
を含むが、これらに限定されない、哺乳動物の癌及び造血系及びリンパ系組織の腫瘍を指す。血液悪性腫瘍は、「液性腫瘍」とも称される。血液悪性腫瘍には、急性リンパ芽球性白血病(ALL)、慢性リンパ性リンパ腫(CLL)、小リンパ性リンパ腫(SLL)、急性骨髄性白血病(AML)、慢性骨髄性白血病(CML)、急性単球性白血病(AMoL)、ホジキンリンパ腫及び非ホジキンリンパ腫が含まれるが、これらに限定されるものではない。「B細胞血液悪性腫瘍」という用語は、B細胞に影響を及ぼす血液悪性腫瘍を指す。
を含むが、これらに限定されない、哺乳動物の癌及び造血系及びリンパ系組織の腫瘍を指す。血液悪性腫瘍は、「液性腫瘍」とも称される。血液悪性腫瘍には、急性リンパ芽球性白血病(ALL)、慢性リンパ性リンパ腫(CLL)、小リンパ性リンパ腫(SLL)、急性骨髄性白血病(AML)、慢性骨髄性白血病(CML)、急性単球性白血病(AMoL)、ホジキンリンパ腫及び非ホジキンリンパ腫が含まれるが、これらに限定されるものではない。「B細胞血液悪性腫瘍」という用語は、B細胞に影響を及ぼす血液悪性腫瘍を指す。
[00344] 用語「固形腫瘍」は、嚢胞又は液体領域を通常含まない異常な組織塊を指す
。固形腫瘍は、良性又は悪性であり得る。用語「固形腫瘍癌」は、悪性、新生物性又は癌性の固形腫瘍を指す。固形腫瘍癌としては、肺癌、乳癌、前立腺癌、結腸癌、直腸癌及び膀胱癌などの肉腫、癌腫及びリンパ腫が挙げられるが、これらに限定されるものではない。固形腫瘍の組織構造は、柔組織(癌細胞)を含む相互依存的組織コンパートメント及び癌細胞が分散し支持微小環境を提供し得る支持間質細胞を含む。
。固形腫瘍は、良性又は悪性であり得る。用語「固形腫瘍癌」は、悪性、新生物性又は癌性の固形腫瘍を指す。固形腫瘍癌としては、肺癌、乳癌、前立腺癌、結腸癌、直腸癌及び膀胱癌などの肉腫、癌腫及びリンパ腫が挙げられるが、これらに限定されるものではない。固形腫瘍の組織構造は、柔組織(癌細胞)を含む相互依存的組織コンパートメント及び癌細胞が分散し支持微小環境を提供し得る支持間質細胞を含む。
[00345] 「液性腫瘍」という用語は、本来流動性である異常な細胞塊を指す。液性腫
瘍癌としては、白血病、骨髄腫及びリンパ腫並びに他の血液悪性腫瘍が挙げられるが、これらに限定されるものではない。液性腫瘍から得られたTILは、本明細書では骨髄浸潤リンパ球(MIL)とも称される。
瘍癌としては、白血病、骨髄腫及びリンパ腫並びに他の血液悪性腫瘍が挙げられるが、これらに限定されるものではない。液性腫瘍から得られたTILは、本明細書では骨髄浸潤リンパ球(MIL)とも称される。
[00346] 本明細書で使用される「微小環境」という用語は、全体としての固形若しく
は血液腫瘍微小環境又は微小環境内の細胞の個々のサブセットを指し得る。本明細書で使用される腫瘍微小環境は、Swartz, et al., Cancer Res., 2012, 72, 2473に記載されて
いるように、「新生物性形質転換を促進し、腫瘍の成長及び浸潤をサポートし、腫瘍を宿主の免疫から保護し、治療抵抗性を培い、優勢な転移を成功させるニッチを提供する、細胞、可溶性因子、シグナル伝達分子、細胞外マトリックス及び機械的手がかり」の複合的な混合物を指す。腫瘍はT細胞によって認識されるべき抗原を発現するが、免疫系による腫瘍の排除は、微小環境による免疫抑制のため、希少である。
は血液腫瘍微小環境又は微小環境内の細胞の個々のサブセットを指し得る。本明細書で使用される腫瘍微小環境は、Swartz, et al., Cancer Res., 2012, 72, 2473に記載されて
いるように、「新生物性形質転換を促進し、腫瘍の成長及び浸潤をサポートし、腫瘍を宿主の免疫から保護し、治療抵抗性を培い、優勢な転移を成功させるニッチを提供する、細胞、可溶性因子、シグナル伝達分子、細胞外マトリックス及び機械的手がかり」の複合的な混合物を指す。腫瘍はT細胞によって認識されるべき抗原を発現するが、免疫系による腫瘍の排除は、微小環境による免疫抑制のため、希少である。
[00347] 一実施形態において、本発明は、TIL集団で癌を治療する方法を含み、こ
こで、患者は、本発明に係るTILの注入前に骨髄非破壊的化学療法で前処置される。一部の実施形態において、TIL集団が提供され得、ここで、患者は、本発明に係るTILの注入前に骨髄非破壊的化学療法で前処置される。一実施形態において、骨髄非破壊的化学療法は、2日間(TIL注入の27日前及び26日前)のシクロホスファミド60mg/kg/日及び5日間(TIL注入の27~23日前)のフルダラビン25mg/m2/
日である。一実施形態において、骨髄非破壊的化学療法及び本発明に係るTIL注入(0日目)後、患者は、生理学的忍容量まで8時間毎に静脈内に720,000IU/kgのIL-2の静脈内注入を受ける。
こで、患者は、本発明に係るTILの注入前に骨髄非破壊的化学療法で前処置される。一部の実施形態において、TIL集団が提供され得、ここで、患者は、本発明に係るTILの注入前に骨髄非破壊的化学療法で前処置される。一実施形態において、骨髄非破壊的化学療法は、2日間(TIL注入の27日前及び26日前)のシクロホスファミド60mg/kg/日及び5日間(TIL注入の27~23日前)のフルダラビン25mg/m2/
日である。一実施形態において、骨髄非破壊的化学療法及び本発明に係るTIL注入(0日目)後、患者は、生理学的忍容量まで8時間毎に静脈内に720,000IU/kgのIL-2の静脈内注入を受ける。
[00348] 実験的知見は、腫瘍特異的Tリンパ球の養子移入前のリンパ球枯渇が、調節
性T細胞及び免疫系の競合要素(「サイトカインシンク」)を排除することによって処置効果を高めるのに重要な役割を果たすことを示す。従って、本発明の一部の実施形態は、本発明のrTILを導入する前に患者に対してリンパ球枯渇ステップ(「免疫抑制コンディショニング」とも称される)を利用する。
性T細胞及び免疫系の競合要素(「サイトカインシンク」)を排除することによって処置効果を高めるのに重要な役割を果たすことを示す。従って、本発明の一部の実施形態は、本発明のrTILを導入する前に患者に対してリンパ球枯渇ステップ(「免疫抑制コンディショニング」とも称される)を利用する。
[00349] 本明細書で使用される「共投与」、「共投与すること」、「~と組み合わせ
て投与される」、「~と組み合わせて投与すること」、「同時(simultaneous)」及び「同時(concurrent)」という用語は、両方の活性医薬成分及び/又はそれらの代謝産物が同時に対象内に存在するための、2つ以上の活性医薬成分(本発明の好ましい実施形態において、例えば複数のTILと組み合わせた少なくとも1つのカリウムチャネルアゴニスト)の対象への投与を包含する。共投与には、別々の組成物中での同時投与、別々の組成物中での異なる時点における投与又は2つ以上の活性医薬成分が存在する組成物での投与が含まれる。別々の組成物での同時投与及び両方の薬剤が存在する組成物での投与が好ましい。
て投与される」、「~と組み合わせて投与すること」、「同時(simultaneous)」及び「同時(concurrent)」という用語は、両方の活性医薬成分及び/又はそれらの代謝産物が同時に対象内に存在するための、2つ以上の活性医薬成分(本発明の好ましい実施形態において、例えば複数のTILと組み合わせた少なくとも1つのカリウムチャネルアゴニスト)の対象への投与を包含する。共投与には、別々の組成物中での同時投与、別々の組成物中での異なる時点における投与又は2つ以上の活性医薬成分が存在する組成物での投与が含まれる。別々の組成物での同時投与及び両方の薬剤が存在する組成物での投与が好ましい。
[00350] 用語「有効量」又は「治療有効量」は、疾患処置を含むが、これに限定され
ない、意図された用途を達成するのに十分な、本明細書に記載の化合物又は化合物の組み合わせの量を指す。治療有効量は、意図される用途(インビトロ又はインビボ)又は処置されている対象及び疾患状態(例えば、対象の体重、年齢及び性別)、疾患状態の重症度又は投与方法によって変動し得る。この用語は、標的細胞において特定の応答(例えば、血小板接着及び/又は細胞遊走の減少)を誘発する用量にも適用される。特定の用量は、選択された特定の化合物、従うべき投与レジメン、化合物が他の化合物と組み合わせて投与されるかどうか、投与のタイミング、それが投与される組織及び化合物が運ばれる物理的送達システムによって変動する。
ない、意図された用途を達成するのに十分な、本明細書に記載の化合物又は化合物の組み合わせの量を指す。治療有効量は、意図される用途(インビトロ又はインビボ)又は処置されている対象及び疾患状態(例えば、対象の体重、年齢及び性別)、疾患状態の重症度又は投与方法によって変動し得る。この用語は、標的細胞において特定の応答(例えば、血小板接着及び/又は細胞遊走の減少)を誘発する用量にも適用される。特定の用量は、選択された特定の化合物、従うべき投与レジメン、化合物が他の化合物と組み合わせて投与されるかどうか、投与のタイミング、それが投与される組織及び化合物が運ばれる物理的送達システムによって変動する。
[00351] 用語「処置」、「処置している」、「処置する」などは、所望の薬理学的及
び/又は生理学的効果を達成することを指す。効果は、疾患又はその症状を完全に又は部分的に防ぐという意味で予防的であり得、及び/又は疾患及び/又は疾患に起因する有害作用を部分的に又は完全に治癒するという意味で治療的であり得る。「処置」は、本明細書で使用されるとき、哺乳類、特にヒトにおける疾患の任意の治療を包含し、(a)疾患の素因があり得るが、依然としてそれを有するとは診断されてない対象において疾患の発生を防ぐこと;(b)疾患を阻害すること、即ちその発症又は進行を止めること;及び(c)疾患を軽減すること、即ち疾患の退縮を生じさせること及び/又は1つ以上の疾患症状を軽減することが含まれる。「処置」は、疾患又は病態がない場合でも、薬理学的効果を提供するための薬剤の送達を包含することも意図される。例えば、「処置」は、例えば、ワクチンの場合、疾患状態がない中で免疫応答を誘発し又は免疫を付与することができる組成物の送達を包含する。
び/又は生理学的効果を達成することを指す。効果は、疾患又はその症状を完全に又は部分的に防ぐという意味で予防的であり得、及び/又は疾患及び/又は疾患に起因する有害作用を部分的に又は完全に治癒するという意味で治療的であり得る。「処置」は、本明細書で使用されるとき、哺乳類、特にヒトにおける疾患の任意の治療を包含し、(a)疾患の素因があり得るが、依然としてそれを有するとは診断されてない対象において疾患の発生を防ぐこと;(b)疾患を阻害すること、即ちその発症又は進行を止めること;及び(c)疾患を軽減すること、即ち疾患の退縮を生じさせること及び/又は1つ以上の疾患症状を軽減することが含まれる。「処置」は、疾患又は病態がない場合でも、薬理学的効果を提供するための薬剤の送達を包含することも意図される。例えば、「処置」は、例えば、ワクチンの場合、疾患状態がない中で免疫応答を誘発し又は免疫を付与することができる組成物の送達を包含する。
[00352] 核酸又はタンパク質の部分に関して使用される場合の「異種」という用語は
、その核酸又はタンパク質が、天然には互いに同じ関係では見出されない2つ以上の部分配列を含むことを示す。例えば、核酸は、典型的には組換え的に産生され、新しい機能性核酸を作成するように配置された無関係の遺伝子由来の2つ以上の配列、例えば1つの供給源からのプロモーター及び別の供給源からのコーディング領域又は異なる供給源からのコーディング領域を有する。同様に、異種タンパク質は、そのタンパク質が、天然には互いに同じ関係では見出されない2つ以上の部分配列を含むことを示す(例えば、融合タン
パク質)。
、その核酸又はタンパク質が、天然には互いに同じ関係では見出されない2つ以上の部分配列を含むことを示す。例えば、核酸は、典型的には組換え的に産生され、新しい機能性核酸を作成するように配置された無関係の遺伝子由来の2つ以上の配列、例えば1つの供給源からのプロモーター及び別の供給源からのコーディング領域又は異なる供給源からのコーディング領域を有する。同様に、異種タンパク質は、そのタンパク質が、天然には互いに同じ関係では見出されない2つ以上の部分配列を含むことを示す(例えば、融合タン
パク質)。
[00353] 2つ以上の核酸又はポリペプチドの文脈における「配列同一性」、「パーセ
ント同一性」及び「配列パーセント同一性」(又はそれらの同義語、例えば「99%同一」)という用語は、配列同一性の一部として保存的アミノ酸置換を考慮せずに、最大限の対応について比較し、整合させた場合に(必要であればギャップを導入する)、同じであるか、同じヌクレオチド又はアミノ酸残基の特定のパーセンテージを有する、2つ以上の配列又は部分配列を指す。同一性パーセントは、配列比較ソフトウェア若しくはアルゴリズムを使用するか、又は目視検査によって測定することができる。アミノ酸又はヌクレオチド配列のアラインメントを入手するために使用することができる様々なアルゴリズム及びソフトウェアが当技術分野において公知である。パーセント配列同一性を決定するための適切なプログラムには、例えば、米国政府の国立バイオテクノロジー情報センター(National Center for Biotechnology Information)のBLASTウェブサイトから入手可
能なBLASTプログラム一式が含まれる。2つの配列間の比較は、BLASTN又はBLASTPアルゴリズムのいずれかを使用して実施することができる。BLASTNは核酸配列を比較するために使用される一方、BLASTPはアミノ酸配列を比較するために使用される。ALIGN、ALIGN-2(Genentech, South San Francisco, California)又はDNASTARから入手可能なMegAlignは、配列を整合するために使用することができる、公に入手
可能な更なるソフトウェアプログラムである。当業者は、特定のアラインメントソフトウェアによって最大アラインメントのための適切なパラメータを決定することができる。特定の実施形態において、アラインメントソフトウェアのデフォルトパラメータが使用される。
ント同一性」及び「配列パーセント同一性」(又はそれらの同義語、例えば「99%同一」)という用語は、配列同一性の一部として保存的アミノ酸置換を考慮せずに、最大限の対応について比較し、整合させた場合に(必要であればギャップを導入する)、同じであるか、同じヌクレオチド又はアミノ酸残基の特定のパーセンテージを有する、2つ以上の配列又は部分配列を指す。同一性パーセントは、配列比較ソフトウェア若しくはアルゴリズムを使用するか、又は目視検査によって測定することができる。アミノ酸又はヌクレオチド配列のアラインメントを入手するために使用することができる様々なアルゴリズム及びソフトウェアが当技術分野において公知である。パーセント配列同一性を決定するための適切なプログラムには、例えば、米国政府の国立バイオテクノロジー情報センター(National Center for Biotechnology Information)のBLASTウェブサイトから入手可
能なBLASTプログラム一式が含まれる。2つの配列間の比較は、BLASTN又はBLASTPアルゴリズムのいずれかを使用して実施することができる。BLASTNは核酸配列を比較するために使用される一方、BLASTPはアミノ酸配列を比較するために使用される。ALIGN、ALIGN-2(Genentech, South San Francisco, California)又はDNASTARから入手可能なMegAlignは、配列を整合するために使用することができる、公に入手
可能な更なるソフトウェアプログラムである。当業者は、特定のアラインメントソフトウェアによって最大アラインメントのための適切なパラメータを決定することができる。特定の実施形態において、アラインメントソフトウェアのデフォルトパラメータが使用される。
[00354] 本明細書で使用される「変異体」という用語は、参照抗体のアミノ酸配列内
又はそれに隣接する特定の位置での1つ以上の置換、欠失及び/又は付加により、参照抗体のアミノ酸配列と異なる、アミノ酸配列を含む抗体又は融合タンパク質を包含するが、これに限定されるものではない。変異体は、参照抗体のアミノ酸配列と比較して、そのアミノ酸配列中に1つ以上の保存的置換を含み得る。保存的置換は、例えば、同様に荷電又は非荷電であるアミノ酸の置換を含み得る。変異体は、参照抗体の抗原に特異的に結合する能力を保持している。変異体という用語は、ペグ化抗体又はタンパク質も含む。
又はそれに隣接する特定の位置での1つ以上の置換、欠失及び/又は付加により、参照抗体のアミノ酸配列と異なる、アミノ酸配列を含む抗体又は融合タンパク質を包含するが、これに限定されるものではない。変異体は、参照抗体のアミノ酸配列と比較して、そのアミノ酸配列中に1つ以上の保存的置換を含み得る。保存的置換は、例えば、同様に荷電又は非荷電であるアミノ酸の置換を含み得る。変異体は、参照抗体の抗原に特異的に結合する能力を保持している。変異体という用語は、ペグ化抗体又はタンパク質も含む。
[00355] 本明細書において「腫瘍浸潤リンパ球」又は「TIL」とは、対象の血流を
離れて腫瘍中に遊走した、当初白血球細胞として得られた細胞の集団を意味する。TILとしては、限定はされないが、CD8+細胞傷害性T細胞(リンパ球)、Th1及びTh17 CD4+ T細胞、ナチュラルキラー細胞、樹状細胞及びM1マクロファージが挙げられる。TILは、初代及び二次TILの両方を含む。「初代TIL」は、本明細書に概説される通り患者組織サンプルから得られるものであり(「新鮮に回収された」と称されることもある)、及び「二次TIL」は、限定はされないが、バルクTIL、拡大培養TIL(「REP TIL」)並びに本明細書で考察する通りの「reREP TIL」を含め、本明細書で考察する通り拡大培養された又は成長した任意のTIL細胞集団である。reREP TILは、例えば、第2の拡大培養TIL又は第2の追加拡大培養TIL(例えば、reREP TILと称されるTILを含む、図8のステップDに記載されたものなど)を含み得る。
離れて腫瘍中に遊走した、当初白血球細胞として得られた細胞の集団を意味する。TILとしては、限定はされないが、CD8+細胞傷害性T細胞(リンパ球)、Th1及びTh17 CD4+ T細胞、ナチュラルキラー細胞、樹状細胞及びM1マクロファージが挙げられる。TILは、初代及び二次TILの両方を含む。「初代TIL」は、本明細書に概説される通り患者組織サンプルから得られるものであり(「新鮮に回収された」と称されることもある)、及び「二次TIL」は、限定はされないが、バルクTIL、拡大培養TIL(「REP TIL」)並びに本明細書で考察する通りの「reREP TIL」を含め、本明細書で考察する通り拡大培養された又は成長した任意のTIL細胞集団である。reREP TILは、例えば、第2の拡大培養TIL又は第2の追加拡大培養TIL(例えば、reREP TILと称されるTILを含む、図8のステップDに記載されたものなど)を含み得る。
[00356] TILは、一般的に、細胞表面マーカーを使用して生化学的に、又は腫瘍に
浸潤し処置に影響を及ぼすそれらの能力によって機能的に定義することができる。TILは、一般的に、次のバイオマーカー:CD4、CD8、TCR αβ、CD27、CD28、CD56、CCR7、CD45Ra、CD95、PD-1及びCD25の1つ以上を発現することによって分類することができる。加えて及び代わりに、TILは、患者への再導入時に固形腫瘍に浸潤するその能力によって機能的に定義することができる。TIL
は、更に効力によって特徴付けられ得 - 例えば、TILは、例えば、インターフェロン(IFN)遊離が約50pg/mLより高い、約100pg/mLより高い、約150pg/mLより高い又は約200pg/mLより高い場合に効力があると見なすことができる。
浸潤し処置に影響を及ぼすそれらの能力によって機能的に定義することができる。TILは、一般的に、次のバイオマーカー:CD4、CD8、TCR αβ、CD27、CD28、CD56、CCR7、CD45Ra、CD95、PD-1及びCD25の1つ以上を発現することによって分類することができる。加えて及び代わりに、TILは、患者への再導入時に固形腫瘍に浸潤するその能力によって機能的に定義することができる。TIL
は、更に効力によって特徴付けられ得 - 例えば、TILは、例えば、インターフェロン(IFN)遊離が約50pg/mLより高い、約100pg/mLより高い、約150pg/mLより高い又は約200pg/mLより高い場合に効力があると見なすことができる。
[00357] 「デオキシリボヌクレオチド」という用語は、天然及び合成の非修飾及び修
飾デオキシリボヌクレオチドを包含する。修飾には、オリゴヌクレオチドの糖部分、塩基部分及び/又はデオキシリボヌクレオチド間の結合への変化が含まれる。
飾デオキシリボヌクレオチドを包含する。修飾には、オリゴヌクレオチドの糖部分、塩基部分及び/又はデオキシリボヌクレオチド間の結合への変化が含まれる。
[00358] 「RNA」という用語は、少なくとも1つのリボヌクレオチド残基を含む分
子を定義する。「リボヌクレオチド」という用語は、b-D-リボフラノース部分の2’位にヒドロキシル基を有するヌクレオチドを定義する。RNAという用語には、二本鎖RNA、一本鎖RNA、部分的に精製されたRNAなどの単離されたRNA、本質的に純粋なRNA、合成RNA、組み換えにより産生されたRNA並びに1つ以上のヌクレオチドの付加、欠失、置換及び/又は改変によって天然に存在するRNAとは異なる改変されたRNAが含まれる。本明細書に記載されるRNA分子のヌクレオチドは、非天然ヌクレオチド又は化学的に合成されたヌクレオチド若しくはデオキシヌクレオチドなどの非標準ヌクレオチドも含み得る。これらの改変されたRNAは、類似体又は天然に存在するRNAの類似体と称され得る。
子を定義する。「リボヌクレオチド」という用語は、b-D-リボフラノース部分の2’位にヒドロキシル基を有するヌクレオチドを定義する。RNAという用語には、二本鎖RNA、一本鎖RNA、部分的に精製されたRNAなどの単離されたRNA、本質的に純粋なRNA、合成RNA、組み換えにより産生されたRNA並びに1つ以上のヌクレオチドの付加、欠失、置換及び/又は改変によって天然に存在するRNAとは異なる改変されたRNAが含まれる。本明細書に記載されるRNA分子のヌクレオチドは、非天然ヌクレオチド又は化学的に合成されたヌクレオチド若しくはデオキシヌクレオチドなどの非標準ヌクレオチドも含み得る。これらの改変されたRNAは、類似体又は天然に存在するRNAの類似体と称され得る。
[00359] 「修飾ヌクレオチド」という用語は、ヌクレオシド、核酸塩基、ペントース
環又はリン酸基に対して1つ以上の修飾を有するヌクレオチドを指す。例えば、修飾ヌクレオチドは、アデノシン一リン酸、グアノシン一リン酸、ウリジン一リン酸及びシチジン一リン酸を含むリボヌクレオチド並びにデオキシアデノシン一リン酸、デオキシグアノシン一リン酸、デオキシチミジン一リン酸及びデオキシシチジン一リン酸を含有するデオキシリボヌクレオチドを除外する。修飾には、メチルトランスフェラーゼなどのヌクレオチドを修飾する酵素による修飾の結果として天然に存在するものが含まれる。
環又はリン酸基に対して1つ以上の修飾を有するヌクレオチドを指す。例えば、修飾ヌクレオチドは、アデノシン一リン酸、グアノシン一リン酸、ウリジン一リン酸及びシチジン一リン酸を含むリボヌクレオチド並びにデオキシアデノシン一リン酸、デオキシグアノシン一リン酸、デオキシチミジン一リン酸及びデオキシシチジン一リン酸を含有するデオキシリボヌクレオチドを除外する。修飾には、メチルトランスフェラーゼなどのヌクレオチドを修飾する酵素による修飾の結果として天然に存在するものが含まれる。
[00360] 修飾ヌクレオチドには、合成又は非天然ヌクレオチドも含まれる。ヌクレオ
チドの合成又は非天然の修飾には、2’修飾を有する修飾、例えば2’-O-メチル、2’-メトキシエトキシ、2’-フルオロ、2’-アリル、2’-O-[2-(メチルアミノ)-2-オキソエチル]、4’-チオ、4’-CH2-O-2’-ブリッジ、4’-(CH2)2-O-2’-ブリッジ、2’-LNA及び2’-O-(N-メチルカルバメート)又は塩基類似体を含むものが含まれる。本開示について記載されるような2’修飾ヌクレオチドに関して、「アミノ」とは、2’-NH2又は2’-O-NH2を意味し、これらは、修飾されていても修飾されていなくてもよい。そのような修飾されたグループは、例えば、米国特許第5,672,695号及び同第6,248,878号に記載され、参照により本明細書に組み込まれる。
チドの合成又は非天然の修飾には、2’修飾を有する修飾、例えば2’-O-メチル、2’-メトキシエトキシ、2’-フルオロ、2’-アリル、2’-O-[2-(メチルアミノ)-2-オキソエチル]、4’-チオ、4’-CH2-O-2’-ブリッジ、4’-(CH2)2-O-2’-ブリッジ、2’-LNA及び2’-O-(N-メチルカルバメート)又は塩基類似体を含むものが含まれる。本開示について記載されるような2’修飾ヌクレオチドに関して、「アミノ」とは、2’-NH2又は2’-O-NH2を意味し、これらは、修飾されていても修飾されていなくてもよい。そのような修飾されたグループは、例えば、米国特許第5,672,695号及び同第6,248,878号に記載され、参照により本明細書に組み込まれる。
[00361] 「マイクロRNA」又は「miRNA」という用語は、一本鎖RNAを形成
する核酸を指し、その一本鎖RNAは、遺伝子又は標的遺伝子と同じ細胞でmiRNAが発現される場合、遺伝子又は標的遺伝子の発現を変化させる(発現を低減又は阻害する;発現を調節する;直接的又は間接的に発現を増強する)能力を有する。一実施形態において、miRNAは、標的遺伝子に対して実質的又は完全な同一性を有し、一本鎖miRNAを形成する核酸を指す。一部の実施形態において、miRNAは、プレmiRNAの形態であり得、ここで、プレmiRNAは、二本鎖RNAである。miRNAの配列は、完全長の標的遺伝子又はその部分配列に対応し得る。通常、miRNAは、少なくとも約15~50ヌクレオチド長である(例えば、一本鎖miRNAの各配列は、15~50ヌクレオチド長であり、二本鎖プレmiRNAは、約15~50塩基対の長さである)。一部の実施形態において、miRNAは、20~30塩基のヌクレオチドである。一部の実施
形態において、miRNAは、20~25ヌクレオチド長である。一部の実施形態において、miRNAは、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29又は30ヌクレオチド長である。
する核酸を指し、その一本鎖RNAは、遺伝子又は標的遺伝子と同じ細胞でmiRNAが発現される場合、遺伝子又は標的遺伝子の発現を変化させる(発現を低減又は阻害する;発現を調節する;直接的又は間接的に発現を増強する)能力を有する。一実施形態において、miRNAは、標的遺伝子に対して実質的又は完全な同一性を有し、一本鎖miRNAを形成する核酸を指す。一部の実施形態において、miRNAは、プレmiRNAの形態であり得、ここで、プレmiRNAは、二本鎖RNAである。miRNAの配列は、完全長の標的遺伝子又はその部分配列に対応し得る。通常、miRNAは、少なくとも約15~50ヌクレオチド長である(例えば、一本鎖miRNAの各配列は、15~50ヌクレオチド長であり、二本鎖プレmiRNAは、約15~50塩基対の長さである)。一部の実施形態において、miRNAは、20~30塩基のヌクレオチドである。一部の実施
形態において、miRNAは、20~25ヌクレオチド長である。一部の実施形態において、miRNAは、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29又は30ヌクレオチド長である。
[00362] 「標的遺伝子」という用語は、免疫耐性機構に関与する遺伝子の発現を調節
することが知られているか又は同定されている遺伝子を含み、サプレッサー受容体、例えばCTLA4及びPD1;免疫細胞を不活性化するサイトカイン受容体、例えばTGF-β受容体、LAG3及び/又はTIM3並びにそれらの組み合わせなどの遺伝子のいくつかのグループの1つであり得る。一部の実施形態において、標的遺伝子は、PD-1、TGFBR2、CBLB(CBL-B)、CISH、CCR(キメラ共刺激受容体)、IL-2、IL-4、IL-7、IL-10、IL-12、IL-15、IL-21、NOTCH 1/2細胞内ドメイン(ICD)、NOTCHリガンドmDLL1、TIM3、LAG3、TIGIT、TGFβ、CCR2、CCR4、CCR5、CXCR1、CXCR2、CSCR3、CCL2(MCP-1)、CCL3(MIP-1α)、CCL4(MIP1-β)、CCL5(RANTES)、CXCL1/CXCL8、CCL22、CCL17、CXCL1/CXCL8、VHL、CD44、PIK3CD、SOCS1及び/又はcAMPプロテインキナーゼA(PKA)の1つ以上を含む。
することが知られているか又は同定されている遺伝子を含み、サプレッサー受容体、例えばCTLA4及びPD1;免疫細胞を不活性化するサイトカイン受容体、例えばTGF-β受容体、LAG3及び/又はTIM3並びにそれらの組み合わせなどの遺伝子のいくつかのグループの1つであり得る。一部の実施形態において、標的遺伝子は、PD-1、TGFBR2、CBLB(CBL-B)、CISH、CCR(キメラ共刺激受容体)、IL-2、IL-4、IL-7、IL-10、IL-12、IL-15、IL-21、NOTCH 1/2細胞内ドメイン(ICD)、NOTCHリガンドmDLL1、TIM3、LAG3、TIGIT、TGFβ、CCR2、CCR4、CCR5、CXCR1、CXCR2、CSCR3、CCL2(MCP-1)、CCL3(MIP-1α)、CCL4(MIP1-β)、CCL5(RANTES)、CXCL1/CXCL8、CCL22、CCL17、CXCL1/CXCL8、VHL、CD44、PIK3CD、SOCS1及び/又はcAMPプロテインキナーゼA(PKA)の1つ以上を含む。
[00363] 「低分子干渉RNA」、又は「siRNA」、又は「短鎖干渉RNA」、又
は「サイレンシングRNA」という語句は、それぞれ一般的に約1022ヌクレオチド長のセンス及びアンチセンスRNA鎖を含み、任意選択により1~3ヌクレオチドの3’オーバーハングを含む二本鎖RNA分子のグループを定義する。siRNAは、RNA干渉(RNAi)経路で活性であり、相補的なヌクレオチド配列を有する特定の標的遺伝子の発現に干渉する。
は「サイレンシングRNA」という語句は、それぞれ一般的に約1022ヌクレオチド長のセンス及びアンチセンスRNA鎖を含み、任意選択により1~3ヌクレオチドの3’オーバーハングを含む二本鎖RNA分子のグループを定義する。siRNAは、RNA干渉(RNAi)経路で活性であり、相補的なヌクレオチド配列を有する特定の標的遺伝子の発現に干渉する。
[00364] sd-RNAという用語は、非対称の二本鎖RNA-アンチセンスオリゴヌ
クレオチドハイブリッドとして形成される「自己送達可能な」RNAi剤を指す。二本鎖RNAは、約19~25ヌクレオチドのガイド(センス)鎖及び約10~19ヌクレオチドのパッセンジャー(アンチセンス)鎖を含み、約5~9ヌクレオチドの一本鎖ホスホロチオール化テールを結果として生じる二重鎖形成を伴う。一部の実施形態において、RNA配列は、ステロール、例えばコレステロール、ビタミンD、ナフチル、イソブチル、ベンジル、インドール、トリプトファン及びフェニルなどの安定化及び疎水性修飾で修飾され得、トランスフェクション試薬又は製剤の不存在下で安定性及び効率的な細胞取り込みをもたらす。一部の実施形態において、IFN誘発性タンパク質について試験する免疫応答アッセイは、sd-RNAが他のRNAi剤と比較して低減した免疫刺激プロファイルを生成することを示す。例えば、参照により組み込まれるByrne et al., December 2013,
J. Ocular Pharmacology and Therapeutics, 29(10): 855-864を参照されたい。一部の
実施形態において、本明細書に記載されているsd-RNAは、Advirna LLC, Worcester, MA, USAから市販されている。
クレオチドハイブリッドとして形成される「自己送達可能な」RNAi剤を指す。二本鎖RNAは、約19~25ヌクレオチドのガイド(センス)鎖及び約10~19ヌクレオチドのパッセンジャー(アンチセンス)鎖を含み、約5~9ヌクレオチドの一本鎖ホスホロチオール化テールを結果として生じる二重鎖形成を伴う。一部の実施形態において、RNA配列は、ステロール、例えばコレステロール、ビタミンD、ナフチル、イソブチル、ベンジル、インドール、トリプトファン及びフェニルなどの安定化及び疎水性修飾で修飾され得、トランスフェクション試薬又は製剤の不存在下で安定性及び効率的な細胞取り込みをもたらす。一部の実施形態において、IFN誘発性タンパク質について試験する免疫応答アッセイは、sd-RNAが他のRNAi剤と比較して低減した免疫刺激プロファイルを生成することを示す。例えば、参照により組み込まれるByrne et al., December 2013,
J. Ocular Pharmacology and Therapeutics, 29(10): 855-864を参照されたい。一部の
実施形態において、本明細書に記載されているsd-RNAは、Advirna LLC, Worcester, MA, USAから市販されている。
[00365] 用語「薬学的に許容される担体」又は「薬学的に許容される賦形剤」は、あ
らゆる溶媒、分散剤、コーティング、抗菌剤及び抗真菌剤、等張剤及び吸収遅延剤並びに不活性成分を含むものとする。活性医薬成分のためのかかる薬学的に許容される担体又は薬学的に許容される賦形剤の使用は、当技術分野において周知である。任意の従来の薬学的に許容される担体又は薬学的に許容される賦形剤が活性医薬成分と適合しない場合を除いて、本発明の治療用組成物におけるその使用が企図される。他の薬物などの追加の活性医薬成分も記載の組成物及び方法に組み込むことができる。
らゆる溶媒、分散剤、コーティング、抗菌剤及び抗真菌剤、等張剤及び吸収遅延剤並びに不活性成分を含むものとする。活性医薬成分のためのかかる薬学的に許容される担体又は薬学的に許容される賦形剤の使用は、当技術分野において周知である。任意の従来の薬学的に許容される担体又は薬学的に許容される賦形剤が活性医薬成分と適合しない場合を除いて、本発明の治療用組成物におけるその使用が企図される。他の薬物などの追加の活性医薬成分も記載の組成物及び方法に組み込むことができる。
[00366] 用語「約」及び「およそ」は、統計的に意味のある値の範囲内を指す。かか
る範囲は、所定の値又は範囲の一桁以内、好ましくは50%以内、より好ましくは20%
以内、更により好ましくは10%以内、更により好ましくは5%以内であり得る。用語「約」又は「およそ」に含まれる許容変動は、研究中の特定の系に依存し、当業者に容易に理解できる。更に、本明細書で使用される場合、用語「約」及び「およそ」は、寸法、サイズ、配合、パラメータ、形状及び他の量及び特性が正確ではなく、且つ正確である必要がないことを意味するが、近似及び/又はより大きい又はより小さい場合があり、必要に応じて、公差、変換係数、四捨五入、測定誤差など、及び当業者に公知の他の因子を反映する。一般に、寸法、サイズ、製剤、パラメータ、形状又は他の量若しくは特性は、明示的にそうであると明記されているか否かにかかわらず、「約」又は「およそ」である。大きく異なるサイズ、形状及び寸法の実施形態が、記載された用語を引用する場合があることに留意されたい。
る範囲は、所定の値又は範囲の一桁以内、好ましくは50%以内、より好ましくは20%
以内、更により好ましくは10%以内、更により好ましくは5%以内であり得る。用語「約」又は「およそ」に含まれる許容変動は、研究中の特定の系に依存し、当業者に容易に理解できる。更に、本明細書で使用される場合、用語「約」及び「およそ」は、寸法、サイズ、配合、パラメータ、形状及び他の量及び特性が正確ではなく、且つ正確である必要がないことを意味するが、近似及び/又はより大きい又はより小さい場合があり、必要に応じて、公差、変換係数、四捨五入、測定誤差など、及び当業者に公知の他の因子を反映する。一般に、寸法、サイズ、製剤、パラメータ、形状又は他の量若しくは特性は、明示的にそうであると明記されているか否かにかかわらず、「約」又は「およそ」である。大きく異なるサイズ、形状及び寸法の実施形態が、記載された用語を引用する場合があることに留意されたい。
[00367] 添付の特許請求の範囲で使用される場合、「を含む」、「から本質的になる
」及び「からなる」という移行用語は、記載されていない追加の請求要素又はステップがある場合、それらが特許請求の範囲から除外されることに関して、元の形式及び修正された形式で、特許請求の範囲を定義する。用語「を含む」は、包括的又は無制限であることを意図しており、追加の、引用されていない要素、方法、ステップ又は材料を除外するものではない。用語「からなる」は、特許請求の範囲で指定されたもの以外の任意の要素、ステップ又は材料を除外し、後者の場合、指定された材料に関連する通常の不純物を除外する。用語「から本質的になる」は、特許請求の範囲を特定の要素、ステップ又は材料及び請求された発明の基本的及び新規の特性に実質的に影響しないものに限定する。本発明を具体化する本明細書に記載の全ての組成物、方法及びキットは、代替実施形態において、「を含む」、「から本質的になる」及び「からなる」という移行用語のいずれかによってより具体的に定義され得る。
」及び「からなる」という移行用語は、記載されていない追加の請求要素又はステップがある場合、それらが特許請求の範囲から除外されることに関して、元の形式及び修正された形式で、特許請求の範囲を定義する。用語「を含む」は、包括的又は無制限であることを意図しており、追加の、引用されていない要素、方法、ステップ又は材料を除外するものではない。用語「からなる」は、特許請求の範囲で指定されたもの以外の任意の要素、ステップ又は材料を除外し、後者の場合、指定された材料に関連する通常の不純物を除外する。用語「から本質的になる」は、特許請求の範囲を特定の要素、ステップ又は材料及び請求された発明の基本的及び新規の特性に実質的に影響しないものに限定する。本発明を具体化する本明細書に記載の全ての組成物、方法及びキットは、代替実施形態において、「を含む」、「から本質的になる」及び「からなる」という移行用語のいずれかによってより具体的に定義され得る。
III.TILにおける一過性に変化したタンパク質発現の方法
[00368] 一部の実施形態において、本発明の拡大培養されたTILは、タンパク質発
現を変化させるために、それぞれ本明細書で提供されるように、閉鎖無菌製造プロセス中を含む、拡大培養ステップ前、その間又はその後に更に操作される。一部の実施形態において、一過性に変化したタンパク質発現は、一過性の遺伝子編集によるものである。一部の実施形態において、本発明の拡大培養されたTILは、転写因子(TF)及び/又はTILにおけるタンパク質発現を一過性に変化させることができる他の分子で処置される。一部の実施形態において、TF及び/又はタンパク質発現を一過性に変化させることができる他の分子は、腫瘍抗原の変化した発現及び/又はTIL集団における腫瘍抗原特異的T細胞の数の変化を提供する。
[00368] 一部の実施形態において、本発明の拡大培養されたTILは、タンパク質発
現を変化させるために、それぞれ本明細書で提供されるように、閉鎖無菌製造プロセス中を含む、拡大培養ステップ前、その間又はその後に更に操作される。一部の実施形態において、一過性に変化したタンパク質発現は、一過性の遺伝子編集によるものである。一部の実施形態において、本発明の拡大培養されたTILは、転写因子(TF)及び/又はTILにおけるタンパク質発現を一過性に変化させることができる他の分子で処置される。一部の実施形態において、TF及び/又はタンパク質発現を一過性に変化させることができる他の分子は、腫瘍抗原の変化した発現及び/又はTIL集団における腫瘍抗原特異的T細胞の数の変化を提供する。
[00369] 一部の実施形態において、本発明は、1つ以上のタンパク質の発現の促進又
は1つ以上のタンパク質の発現の阻害及びタンパク質の組の促進と、別のセットのタンパク質の阻害との両方の同時の組み合わせのための、TIL集団へのメッセンジャーRNA(mRNA)又は小分子(短鎖)干渉RNA(siRNA)の挿入を含む、リボ核酸(RNA)挿入などのヌクレオチド挿入による遺伝子編集を含む。
は1つ以上のタンパク質の発現の阻害及びタンパク質の組の促進と、別のセットのタンパク質の阻害との両方の同時の組み合わせのための、TIL集団へのメッセンジャーRNA(mRNA)又は小分子(短鎖)干渉RNA(siRNA)の挿入を含む、リボ核酸(RNA)挿入などのヌクレオチド挿入による遺伝子編集を含む。
[00370] 一部の実施形態において、本発明の拡大培養されたTILは、タンパク質発
現の一過性の変化を受ける。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、第1の拡大培養前に、例えば、例えば図8に示されるステップAから得られる、TIL集団におけるものを含むバルクTIL集団で発生する。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、例えば、例えば図8に示されるステップBにおいて、拡大培養されるTIL集団におけるものを含む第1の拡大培養中に発生する。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、例えば、第1及び第2の拡大培養間の移行中のTIL集団、図8に示される、例えばステップBから取得され、ステップCに含まれるTIL集団におけるものを含む第1の拡大培養後に発生する。一部の実施形態において、
タンパク質発現の一過性の変化は、例えば、例えばステップCから得られる、TIL集団におけるものを含む第2の拡大培養前及び図8に示されるステップDにおけるその拡大培養前にバルクTIL集団で発生する。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、例えば、例えば図8に示されるステップDにおいて、拡大培養されるTIL集団におけるものを含む第2の拡大培養中に発生する。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、例えば、例えば図8に示されるステップDにおける、拡大培養から得られるTIL集団におけるものを含む第2の拡大培養後に発生する。
現の一過性の変化を受ける。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、第1の拡大培養前に、例えば、例えば図8に示されるステップAから得られる、TIL集団におけるものを含むバルクTIL集団で発生する。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、例えば、例えば図8に示されるステップBにおいて、拡大培養されるTIL集団におけるものを含む第1の拡大培養中に発生する。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、例えば、第1及び第2の拡大培養間の移行中のTIL集団、図8に示される、例えばステップBから取得され、ステップCに含まれるTIL集団におけるものを含む第1の拡大培養後に発生する。一部の実施形態において、
タンパク質発現の一過性の変化は、例えば、例えばステップCから得られる、TIL集団におけるものを含む第2の拡大培養前及び図8に示されるステップDにおけるその拡大培養前にバルクTIL集団で発生する。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、例えば、例えば図8に示されるステップDにおいて、拡大培養されるTIL集団におけるものを含む第2の拡大培養中に発生する。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、例えば、例えば図8に示されるステップDにおける、拡大培養から得られるTIL集団におけるものを含む第2の拡大培養後に発生する。
[00371] 一実施形態において、TIL集団におけるタンパク質発現を一過性に変化さ
せる方法は、エレクトロポレーションのステップを含む。一実施形態において、TIL集団におけるタンパク質発現を一過性に変化させる方法は、図30及び図31に示される方法に従って実施される。エレクトロポレーション法は、当技術分野で公知であり、例えばTsong, Biophys. J. 1991, 60, 297-306及び米国特許出願公開第2014/0227237 A1号に記載され、そのそれぞれの開示は、参照により本明細書に組み込まれる。一実施形態において、TIL集団におけるタンパク質発現を一過性に変化させる方法は、リン酸カルシウムトランスフェクションのステップを含む。リン酸カルシウムトランスフェクション法(リン酸カルシウムDNA沈殿、細胞表面コーティング及びエンドサイトーシス)は、当技術分野で公知であり、例えばGraham and van der Eb, Virology 1973, 52, 456-467;Wigler, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 1979, 76, 1373-1376;及びChen and Okayarea, Mol. Cell. Biol. 1987, 7, 2745-2752;並びに米国特許第5,593,8
75号に記載され、そのそれぞれの開示は、参照により本明細書に組み込まれる。一実施形態において、TIL集団におけるタンパク質発現を一過性に変化させる方法は、リポソームトランスフェクションのステップを含む。ろ過水中のカチオン性脂質N-[1-(2,3-ジオレイルオキシ)プロピル]-n,n,n-トリメチルアンモニウムクロライド(DOTMA)及びジオレオイルホスフォチジルエタノールアミン(DOPE)の1:1(w/w)リポソーム製剤を使用する方法などのリポソームトランスフェクション法は、当技術分野で公知であり、例えばRose, et al., Biotechniques 1991, 10, 520-525及びFelgner, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1987, 84, 7413-7417並びに米国特許第
5,279,833号;同第5,908,635号;同第6,056,938号;同第6,110,490号;同第6,534,484号;及び同第7,687,070号に記載され、そのそれぞれの開示は、参照により本明細書に組み込まれる。一実施形態において、TIL集団におけるタンパク質発現を一過性に変化させる方法は、米国特許第5,766,902号;同第6,025,337号;同第6,410,517号;同第6,475,994号;及び同第7,189,705号(そのそれぞれの開示は、参照により本明細書に組み込まれる)に記載される方法を使用したトランスフェクションのステップを含む。
せる方法は、エレクトロポレーションのステップを含む。一実施形態において、TIL集団におけるタンパク質発現を一過性に変化させる方法は、図30及び図31に示される方法に従って実施される。エレクトロポレーション法は、当技術分野で公知であり、例えばTsong, Biophys. J. 1991, 60, 297-306及び米国特許出願公開第2014/0227237 A1号に記載され、そのそれぞれの開示は、参照により本明細書に組み込まれる。一実施形態において、TIL集団におけるタンパク質発現を一過性に変化させる方法は、リン酸カルシウムトランスフェクションのステップを含む。リン酸カルシウムトランスフェクション法(リン酸カルシウムDNA沈殿、細胞表面コーティング及びエンドサイトーシス)は、当技術分野で公知であり、例えばGraham and van der Eb, Virology 1973, 52, 456-467;Wigler, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 1979, 76, 1373-1376;及びChen and Okayarea, Mol. Cell. Biol. 1987, 7, 2745-2752;並びに米国特許第5,593,8
75号に記載され、そのそれぞれの開示は、参照により本明細書に組み込まれる。一実施形態において、TIL集団におけるタンパク質発現を一過性に変化させる方法は、リポソームトランスフェクションのステップを含む。ろ過水中のカチオン性脂質N-[1-(2,3-ジオレイルオキシ)プロピル]-n,n,n-トリメチルアンモニウムクロライド(DOTMA)及びジオレオイルホスフォチジルエタノールアミン(DOPE)の1:1(w/w)リポソーム製剤を使用する方法などのリポソームトランスフェクション法は、当技術分野で公知であり、例えばRose, et al., Biotechniques 1991, 10, 520-525及びFelgner, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1987, 84, 7413-7417並びに米国特許第
5,279,833号;同第5,908,635号;同第6,056,938号;同第6,110,490号;同第6,534,484号;及び同第7,687,070号に記載され、そのそれぞれの開示は、参照により本明細書に組み込まれる。一実施形態において、TIL集団におけるタンパク質発現を一過性に変化させる方法は、米国特許第5,766,902号;同第6,025,337号;同第6,410,517号;同第6,475,994号;及び同第7,189,705号(そのそれぞれの開示は、参照により本明細書に組み込まれる)に記載される方法を使用したトランスフェクションのステップを含む。
[00372] 一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、ステムメモリ
ーT細胞(TSCM)の増加をもたらす。TSCMは、抗原経験のあるセントラルメモリーT細胞の初期の前駆細胞である。TSCMは、一般に、幹細胞を定義する長期生存、自己再生及び多能性能力を示し、効果的なTIL産物の生成に一般的に望ましい。TSCMは、養子細胞移入のマウスモデルで他のT細胞サブセットと比較して強化された抗腫瘍活性を示している(Gattinoni et al. Nat Med 2009, 2011;Gattinoni, Nature Rev. Cancer, 2012;Cieri et al. Blood 2013)。一部の実施形態において、タンパク質発現の一
過性の変化は、高い割合のTSCMを含む組成物を伴うTIL集団をもたらす。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、少なくとも5%、少なくとも10%、少なくとも10%、少なくとも20%、少なくとも25%、少なくとも30%、少なくとも35%、少なくとも40%、少なくとも45%、少なくとも50%、少なくとも55%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%又は少なくとも95%のTSCMパ
ーセンテージの増加をもたらす。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、TIL集団における、少なくとも1倍、2倍、3倍、4倍、5倍又は10倍のTSCMの増加をもたらす。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、少なくとも5%、少なくとも10%、少なくとも10%、少なくとも20%、少なくとも25%、少なくとも30%、少なくとも35%、少なくとも40%、少なくとも45%、少なくとも50%、少なくとも55%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%又は少なくとも95%のTSCMを伴うTIL集団をもたらす。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、少なくとも5%、少なくとも10%、少なくとも10%、少なくとも20%、少なくとも25%、少なくとも30%、少なくとも35%、少なくとも40%、少なくとも45%、少なくとも50%、少なくとも55%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%又は少なくとも95%のTSCMを伴う治療用TIL集団をもたらす。
ーT細胞(TSCM)の増加をもたらす。TSCMは、抗原経験のあるセントラルメモリーT細胞の初期の前駆細胞である。TSCMは、一般に、幹細胞を定義する長期生存、自己再生及び多能性能力を示し、効果的なTIL産物の生成に一般的に望ましい。TSCMは、養子細胞移入のマウスモデルで他のT細胞サブセットと比較して強化された抗腫瘍活性を示している(Gattinoni et al. Nat Med 2009, 2011;Gattinoni, Nature Rev. Cancer, 2012;Cieri et al. Blood 2013)。一部の実施形態において、タンパク質発現の一
過性の変化は、高い割合のTSCMを含む組成物を伴うTIL集団をもたらす。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、少なくとも5%、少なくとも10%、少なくとも10%、少なくとも20%、少なくとも25%、少なくとも30%、少なくとも35%、少なくとも40%、少なくとも45%、少なくとも50%、少なくとも55%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%又は少なくとも95%のTSCMパ
ーセンテージの増加をもたらす。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、TIL集団における、少なくとも1倍、2倍、3倍、4倍、5倍又は10倍のTSCMの増加をもたらす。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、少なくとも5%、少なくとも10%、少なくとも10%、少なくとも20%、少なくとも25%、少なくとも30%、少なくとも35%、少なくとも40%、少なくとも45%、少なくとも50%、少なくとも55%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%又は少なくとも95%のTSCMを伴うTIL集団をもたらす。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、少なくとも5%、少なくとも10%、少なくとも10%、少なくとも20%、少なくとも25%、少なくとも30%、少なくとも35%、少なくとも40%、少なくとも45%、少なくとも50%、少なくとも55%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%又は少なくとも95%のTSCMを伴う治療用TIL集団をもたらす。
[00373] 一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、抗原経験のあ
るT細胞の若返りをもたらす。一部の実施形態において、若返りには、例えば、増殖の増加、T細胞活性化の増加及び/又は抗原認識の増加が含まれる。
るT細胞の若返りをもたらす。一部の実施形態において、若返りには、例えば、増殖の増加、T細胞活性化の増加及び/又は抗原認識の増加が含まれる。
[00374] 一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、腫瘍由来のT
CRレパートリーを保存するために、T細胞の大部分における発現を変化させる。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、腫瘍由来のTCRレパートリーを変化させない。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、腫瘍由来のTCRレパートリーを維持する。
CRレパートリーを保存するために、T細胞の大部分における発現を変化させる。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、腫瘍由来のTCRレパートリーを変化させない。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、腫瘍由来のTCRレパートリーを維持する。
[00375] 一部の実施形態において、タンパク質の一過性の変化は、特定の遺伝子の変
化した発現をもたらす。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、PD-1(PDCD1又はCD279とも称される)、TGFBR2、CCR4/5、CBLB(CBL-B)、CISH、CCR(キメラ共刺激受容体)、IL-2、IL-7、IL-10、IL-12、IL-15、IL-21、NOTCH 1/2 ICD、TIM3、LAG3、TIGIT、TGFβ、CCR2、CCR4、CCR5、CXCR1、CXCR2、CSCR3、CCL2(MCP-1)、CCL3(MIP-1α)、CCL4(MIP1-β)、CCL5(RANTES)、CXCL1/CXCL8、CCL22、CCL17、CXCL1/CXCL8、VHL、CD44、PIK3CD、SOCS1及び/又はcAMPプロテインキナーゼA(PKA)を含むが、これらに限定されない遺伝子を標的とする。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、PD-1、TGFBR2、CCR4/5、CBLB(CBL-B)、CISH、CCR(キメラ共刺激受容体)、IL-2、IL-7、IL-10、IL-12、IL-15、IL-21、NOTCH 1/2 ICD、TIM3、LAG3、TIGIT、TGFβ、CCR2、CCR4、CCR5、CXCR1、CXCR2、CSCR3、CCL2(MCP-1)、CCL3(MIP-1α)、CCL4(MIP1-β)、CCL5(RANTES)、CXCL1/CXCL8、CCL22、CCL17、CXCL1/CXCL8、VHL、CD44、PIK3CD、SOCS1及び/又はcAMPプロテインキナーゼA(PKA)からなる群から選択される遺伝子を標的とする。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、PD-1を標的とする。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、TGFBR2を標的とする。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、CCR4/5を標的とする。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、CBLBを標的とする。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、CISHを標的とする。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、CCR(キメラ共刺激受容体)を標的とする。一部の実施形態に
おいて、タンパク質発現の一過性の変化は、IL-2を標的とする。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、IL-7を標的とする。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、IL-10を標的とする。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、IL-12を標的とする。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、IL-15を標的とする。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、IL-21を標的とする。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、NOTCH 1/2 ICDを標的とする。
化した発現をもたらす。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、PD-1(PDCD1又はCD279とも称される)、TGFBR2、CCR4/5、CBLB(CBL-B)、CISH、CCR(キメラ共刺激受容体)、IL-2、IL-7、IL-10、IL-12、IL-15、IL-21、NOTCH 1/2 ICD、TIM3、LAG3、TIGIT、TGFβ、CCR2、CCR4、CCR5、CXCR1、CXCR2、CSCR3、CCL2(MCP-1)、CCL3(MIP-1α)、CCL4(MIP1-β)、CCL5(RANTES)、CXCL1/CXCL8、CCL22、CCL17、CXCL1/CXCL8、VHL、CD44、PIK3CD、SOCS1及び/又はcAMPプロテインキナーゼA(PKA)を含むが、これらに限定されない遺伝子を標的とする。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、PD-1、TGFBR2、CCR4/5、CBLB(CBL-B)、CISH、CCR(キメラ共刺激受容体)、IL-2、IL-7、IL-10、IL-12、IL-15、IL-21、NOTCH 1/2 ICD、TIM3、LAG3、TIGIT、TGFβ、CCR2、CCR4、CCR5、CXCR1、CXCR2、CSCR3、CCL2(MCP-1)、CCL3(MIP-1α)、CCL4(MIP1-β)、CCL5(RANTES)、CXCL1/CXCL8、CCL22、CCL17、CXCL1/CXCL8、VHL、CD44、PIK3CD、SOCS1及び/又はcAMPプロテインキナーゼA(PKA)からなる群から選択される遺伝子を標的とする。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、PD-1を標的とする。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、TGFBR2を標的とする。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、CCR4/5を標的とする。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、CBLBを標的とする。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、CISHを標的とする。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、CCR(キメラ共刺激受容体)を標的とする。一部の実施形態に
おいて、タンパク質発現の一過性の変化は、IL-2を標的とする。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、IL-7を標的とする。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、IL-10を標的とする。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、IL-12を標的とする。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、IL-15を標的とする。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、IL-21を標的とする。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、NOTCH 1/2 ICDを標的とする。
[00376] 一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、NOTCH
1/2 ICDを介するもの及び/又はmDLL1などの他のNOTCHリガンドを介するものなど、NOTCHシグナル伝達経路を標的とする(例えば、全体として参照により本明細書に組み込まれるKondo, T. et al., NOTCH-mediated conversion of activated T
cells into stem cell memory-like T cells for adoptive immunotherapy, Nature Communications, Vol. 8, Article number: 15338 (2017)を参照されたい)。
1/2 ICDを介するもの及び/又はmDLL1などの他のNOTCHリガンドを介するものなど、NOTCHシグナル伝達経路を標的とする(例えば、全体として参照により本明細書に組み込まれるKondo, T. et al., NOTCH-mediated conversion of activated T
cells into stem cell memory-like T cells for adoptive immunotherapy, Nature Communications, Vol. 8, Article number: 15338 (2017)を参照されたい)。
[00377] 一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、TIM3を標
的とする。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、LAG3を標的とする。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、TIGITを標的とする。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、TGFβを標的とする。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、CCR1を標的とする。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、CCR2を標的とする。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、CCR4を標的とする。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、CCR5を標的とする。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、CXCR1を標的とする。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、CXCR2を標的とする。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、CSCR3を標的とする。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、CCL2(MCP-1)を標的とする。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、CCL3(MIP-1α)を標的とする。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、CCL4(MIP-1β)を標的とする。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、CCL5(RANTES)を標的とする。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、CXCL1を標的とする。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、CXCL8を標的とする。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、CCL22を標的とする。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、CCL17を標的とする。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、VHLを標的とする。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、CD44を標的とする。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、PIK3CDを標的とする。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、SOCS1を標的とする。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、cAMPプロテインキナーゼA(PKA)を標的とする。
的とする。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、LAG3を標的とする。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、TIGITを標的とする。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、TGFβを標的とする。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、CCR1を標的とする。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、CCR2を標的とする。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、CCR4を標的とする。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、CCR5を標的とする。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、CXCR1を標的とする。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、CXCR2を標的とする。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、CSCR3を標的とする。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、CCL2(MCP-1)を標的とする。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、CCL3(MIP-1α)を標的とする。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、CCL4(MIP-1β)を標的とする。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、CCL5(RANTES)を標的とする。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、CXCL1を標的とする。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、CXCL8を標的とする。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、CCL22を標的とする。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、CCL17を標的とする。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、VHLを標的とする。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、CD44を標的とする。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、PIK3CDを標的とする。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、SOCS1を標的とする。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、cAMPプロテインキナーゼA(PKA)を標的とする。
[00378] 一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、ケモカイン受
容体の増加及び/又は過剰発現をもたらす。一部の実施形態において、一過性のタンパク質発現によって過剰発現されるケモカイン受容体は、CCL2(MCP-1)、CCL3(MIP-1α)、CCL4(MIP1-β)、CCL5(RANTES)、CXCL1、CXCL8、CCL22及び/又はCCL17を含むが、これらに限定されないリガンドを有する受容体を含む。一部の実施形態において、一過性のタンパク質発現によって過剰発現されるケモカイン受容体は、IL-2、IL-7、IL-10、IL-15及びIL-21並びにNOTCH 1/2細胞内ドメイン(ICD)を含むが、これらに限定されないリガンドを有する受容体を含む。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過
性の変化は、NOTCH 1/2 ICDを介するもの及び/又はmDLL1などの他のNOTCHリガンドを介するものなど、NOTCHシグナル伝達経路を標的とする(例えば、全体として参照により本明細書に組み込まれるKondo, T. et al., NOTCH-mediated conversion of activated T cells into stem cell memory-like T cells for adoptive immunotherapy, Nature Communications, Vol. 8, Article number: 15338 (2017)を参照
されたい)。
容体の増加及び/又は過剰発現をもたらす。一部の実施形態において、一過性のタンパク質発現によって過剰発現されるケモカイン受容体は、CCL2(MCP-1)、CCL3(MIP-1α)、CCL4(MIP1-β)、CCL5(RANTES)、CXCL1、CXCL8、CCL22及び/又はCCL17を含むが、これらに限定されないリガンドを有する受容体を含む。一部の実施形態において、一過性のタンパク質発現によって過剰発現されるケモカイン受容体は、IL-2、IL-7、IL-10、IL-15及びIL-21並びにNOTCH 1/2細胞内ドメイン(ICD)を含むが、これらに限定されないリガンドを有する受容体を含む。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過
性の変化は、NOTCH 1/2 ICDを介するもの及び/又はmDLL1などの他のNOTCHリガンドを介するものなど、NOTCHシグナル伝達経路を標的とする(例えば、全体として参照により本明細書に組み込まれるKondo, T. et al., NOTCH-mediated conversion of activated T cells into stem cell memory-like T cells for adoptive immunotherapy, Nature Communications, Vol. 8, Article number: 15338 (2017)を参照
されたい)。
[00379] 一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、PD-1、C
TLA-4、TIM-3、LAG-3、TIGIT、TGFβR2及び/又はTGFβの減少及び/又は発現の低減をもたらす(例えば、TGFβ経路の遮断をもたらすことを含む)。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、CBLB(CBL-B)の減少及び/又は発現の低減をもたらす。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、CISHの減少及び/又は発現の低減をもたらす。
TLA-4、TIM-3、LAG-3、TIGIT、TGFβR2及び/又はTGFβの減少及び/又は発現の低減をもたらす(例えば、TGFβ経路の遮断をもたらすことを含む)。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、CBLB(CBL-B)の減少及び/又は発現の低減をもたらす。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、CISHの減少及び/又は発現の低減をもたらす。
[00380] 一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、例えば、腫瘍
部位へのTIL輸送又は移動を改善するために、ケモカイン受容体の増加及び/又は過剰発現をもたらす。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、CCR(キメラ共刺激受容体)の増加及び/又は過剰発現をもたらす。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、CCR1、CCR2、CCR4、CCR5、CXCR1、CXCR2及び/又はCSCR3からなる群から選択されるケモカイン受容体の増加及び/又は過剰発現をもたらす。
部位へのTIL輸送又は移動を改善するために、ケモカイン受容体の増加及び/又は過剰発現をもたらす。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、CCR(キメラ共刺激受容体)の増加及び/又は過剰発現をもたらす。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、CCR1、CCR2、CCR4、CCR5、CXCR1、CXCR2及び/又はCSCR3からなる群から選択されるケモカイン受容体の増加及び/又は過剰発現をもたらす。
[00381] 一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、インターロイ
キンの増加及び/又は過剰発現をもたらす。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、IL-2、IL-12、IL-15及び/又はIL-21からなる群から選択されるインターロイキンの増加及び/又は過剰発現をもたらす。
キンの増加及び/又は過剰発現をもたらす。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、IL-2、IL-12、IL-15及び/又はIL-21からなる群から選択されるインターロイキンの増加及び/又は過剰発現をもたらす。
[00382] 一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、NOTCH
1/2 ICDを介するもの及び/又はmDLL1などの他のNOTCHリガンドを介するものなど、NOTCHシグナル伝達経路を標的とする(例えば、全体として参照により本明細書に組み込まれるKondo, T. et al., NOTCH-mediated conversion of activated T
cells into stem cell memory-like T cells for adoptive immunotherapy, Nature Communications, Vol. 8, Article number: 15338 (2017)を参照されたい)。一部の実施形
態において、タンパク質発現の一過性の変化は、NOTCH 1/2 ICDの増加及び/又は過剰発現をもたらす。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、mDLL1などのNOTCHリガンドの増加及び/又は過剰発現をもたらす。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、VHLの増加及び/又は過剰発現をもたらす。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、CD44の増加及び/又は過剰発現をもたらす。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、PIK3CDの増加及び/又は過剰発現をもたらす。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、SOCS1の増加及び/又は過剰発現をもたらす。
1/2 ICDを介するもの及び/又はmDLL1などの他のNOTCHリガンドを介するものなど、NOTCHシグナル伝達経路を標的とする(例えば、全体として参照により本明細書に組み込まれるKondo, T. et al., NOTCH-mediated conversion of activated T
cells into stem cell memory-like T cells for adoptive immunotherapy, Nature Communications, Vol. 8, Article number: 15338 (2017)を参照されたい)。一部の実施形
態において、タンパク質発現の一過性の変化は、NOTCH 1/2 ICDの増加及び/又は過剰発現をもたらす。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、mDLL1などのNOTCHリガンドの増加及び/又は過剰発現をもたらす。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、VHLの増加及び/又は過剰発現をもたらす。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、CD44の増加及び/又は過剰発現をもたらす。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、PIK3CDの増加及び/又は過剰発現をもたらす。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、SOCS1の増加及び/又は過剰発現をもたらす。
[00383] 一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、cAMPプロ
テインキナーゼ(PKA)の減少及び/又は発現の低減をもたらす。
テインキナーゼ(PKA)の減少及び/又は発現の低減をもたらす。
[00384] 一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、PD-1、L
AG3、TIM3、CTLA-4、TIGIT、CISH、TGFβR2、PKA、CBLB、BAFF(BR3)及びそれらの組み合わせからなる群から選択される1つの分子の減少及び/又は発現の低減をもたらす。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、PD-1、LAG3、TIM3、CTLA-4、TIGIT、CISH、
TGFβR2、PKA、CBLB、BAFF(BR3)及びそれらの組み合わせからなる群から選択される2つの分子の減少及び/又は発現の低減をもたらす。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、PD-1と、LAG3、TIM3、CTLA-4、TIGIT、CISH、TGFβR2、PKA、CBLB、BAFF(BR3)及びそれらの組み合わせからなる群から選択される1つの分子との減少及び/又は発現の低減をもたらす。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、PD-1、LAG-3、CISH、CBLB、TIM3及びそれらの組み合わせの減少及び/又は発現の低減をもたらす。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、PD-1と、LAG-3、CISH、CBLB、TIM3及びそれらの組み合わせの1つとの減少及び/又は発現の低減をもたらす。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、PD-1及びLAG3の減少及び/又は発現の低減をもたらす。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、PD-1及びCISHの減少及び/又は発現の低減をもたらす。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、PD-1及びCBLBの減少及び/又は発現の低減をもたらす。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、LAG3及びCISHの減少及び/又は発現の低減をもたらす。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、LAG3及びCBLBの減少及び/又は発現の低減をもたらす。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、CISH及びCBLBの減少及び/又は発現の低減をもたらす。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、TIM3及びPD-1の減少及び/又は発現の低減をもたらす。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、TIM3及びLAG3の減少及び/又は発現の低減をもたらす。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、TIM3及びCISHの減少及び/又は発現の低減をもたらす。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、TIM3及びCBLBの減少及び/又は発現の低減をもたらす。
AG3、TIM3、CTLA-4、TIGIT、CISH、TGFβR2、PKA、CBLB、BAFF(BR3)及びそれらの組み合わせからなる群から選択される1つの分子の減少及び/又は発現の低減をもたらす。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、PD-1、LAG3、TIM3、CTLA-4、TIGIT、CISH、
TGFβR2、PKA、CBLB、BAFF(BR3)及びそれらの組み合わせからなる群から選択される2つの分子の減少及び/又は発現の低減をもたらす。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、PD-1と、LAG3、TIM3、CTLA-4、TIGIT、CISH、TGFβR2、PKA、CBLB、BAFF(BR3)及びそれらの組み合わせからなる群から選択される1つの分子との減少及び/又は発現の低減をもたらす。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、PD-1、LAG-3、CISH、CBLB、TIM3及びそれらの組み合わせの減少及び/又は発現の低減をもたらす。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、PD-1と、LAG-3、CISH、CBLB、TIM3及びそれらの組み合わせの1つとの減少及び/又は発現の低減をもたらす。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、PD-1及びLAG3の減少及び/又は発現の低減をもたらす。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、PD-1及びCISHの減少及び/又は発現の低減をもたらす。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、PD-1及びCBLBの減少及び/又は発現の低減をもたらす。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、LAG3及びCISHの減少及び/又は発現の低減をもたらす。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、LAG3及びCBLBの減少及び/又は発現の低減をもたらす。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、CISH及びCBLBの減少及び/又は発現の低減をもたらす。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、TIM3及びPD-1の減少及び/又は発現の低減をもたらす。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、TIM3及びLAG3の減少及び/又は発現の低減をもたらす。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、TIM3及びCISHの減少及び/又は発現の低減をもたらす。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、TIM3及びCBLBの減少及び/又は発現の低減をもたらす。
[00385] 一部の実施形態において、CCR2、CCR4、CCR5、CXCR2、C
XCR3、CX3CR1及びそれらの組み合わせからなる群から選択される接着分子は、ガンマレトロウイルス又はレンチウイルス方法により、第1のTIL集団、第2のTIL集団又は回収されたTIL集団に挿入される(例えば、接着分子の発現が増加する)。
XCR3、CX3CR1及びそれらの組み合わせからなる群から選択される接着分子は、ガンマレトロウイルス又はレンチウイルス方法により、第1のTIL集団、第2のTIL集団又は回収されたTIL集団に挿入される(例えば、接着分子の発現が増加する)。
[00386] 一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、PD-1、L
AG3、TIM3、CTLA-4、TIGIT、CISH、TGFβR2、PKA、CBLB、BAFF(BR3)及びそれらの組み合わせからなる群から選択される1つの分子の減少及び/又は発現の低減並びにCCR2、CCR4、CCR5、CXCR2、CXCR3、CX3CR1及びそれらの組み合わせの増加及び/又は発現の増強をもたらす。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、PD-1、LAG3、TIM3、CISH、CBLB及びそれらの組み合わせからなる群から選択される1つの分子の減少及び/又は発現の低減並びにCCR2、CCR4、CCR5、CXCR2、CXCR3、CX3CR1及びそれらの組み合わせの増加及び/又は発現の増強をもたらす。
AG3、TIM3、CTLA-4、TIGIT、CISH、TGFβR2、PKA、CBLB、BAFF(BR3)及びそれらの組み合わせからなる群から選択される1つの分子の減少及び/又は発現の低減並びにCCR2、CCR4、CCR5、CXCR2、CXCR3、CX3CR1及びそれらの組み合わせの増加及び/又は発現の増強をもたらす。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、PD-1、LAG3、TIM3、CISH、CBLB及びそれらの組み合わせからなる群から選択される1つの分子の減少及び/又は発現の低減並びにCCR2、CCR4、CCR5、CXCR2、CXCR3、CX3CR1及びそれらの組み合わせの増加及び/又は発現の増強をもたらす。
[00387] 一部の実施形態において、約5%、約10%、約10%、約20%、約25
%、約30%、約35%、約40%、約45%、約50%、約55%、約60%、約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%又は約95%の発現の低減が存在する。一部の実施形態において、少なくとも約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%又は約95%の発現の低減が存在する。一部の実施形態において、少なくとも約75%、約80%、約85%、約90%又は約95%の発現の低減が存在する。一部の実施形態において、少なくとも約80%、約85%、約90%又は約95%の発現の低減が存在する。一部の実施形態において、少なくとも約85%、約90%又は約95%の発現の低減が存在する。一部の実施形態において、少なくとも約80%の発現の低減が存在する。一部の実施形態において、少なくとも約85%の発現の低減が存在する
。一部の実施形態において、少なくとも約90%の発現の低減が存在する。一部の実施形態において、少なくとも約95%の発現の低減が存在する。一部の実施形態において、少なくとも約99%の発現の低減が存在する。
%、約30%、約35%、約40%、約45%、約50%、約55%、約60%、約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%又は約95%の発現の低減が存在する。一部の実施形態において、少なくとも約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%又は約95%の発現の低減が存在する。一部の実施形態において、少なくとも約75%、約80%、約85%、約90%又は約95%の発現の低減が存在する。一部の実施形態において、少なくとも約80%、約85%、約90%又は約95%の発現の低減が存在する。一部の実施形態において、少なくとも約85%、約90%又は約95%の発現の低減が存在する。一部の実施形態において、少なくとも約80%の発現の低減が存在する。一部の実施形態において、少なくとも約85%の発現の低減が存在する
。一部の実施形態において、少なくとも約90%の発現の低減が存在する。一部の実施形態において、少なくとも約95%の発現の低減が存在する。一部の実施形態において、少なくとも約99%の発現の低減が存在する。
[00388] 一部の実施形態において、約5%、約10%、約10%、約20%、約25
%、約30%、約35%、約40%、約45%、約50%、約55%、約60%、約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%又は約95%の発現の増加が存在する。一部の実施形態において、少なくとも約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%又は約95%の発現の増加が存在する。一部の実施形態において、少なくとも約75%、約80%、約85%、約90%又は約95%の発現の増加が存在する。一部の実施形態において、少なくとも約80%、約85%、約90%又は約95%の発現の増加が存在する。一部の実施形態において、少なくとも約85%、約90%又は約95%の発現の増加が存在する。一部の実施形態において、少なくとも約80%の発現の増加が存在する。一部の実施形態において、少なくとも約85%の発現の増加が存在する。一部の実施形態において、少なくとも約90%の発現の増加が存在する。一部の実施形態において、少なくとも約95%の発現の増加が存在する。一部の実施形態において、少なくとも約99%の発現の増加が存在する。
%、約30%、約35%、約40%、約45%、約50%、約55%、約60%、約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%又は約95%の発現の増加が存在する。一部の実施形態において、少なくとも約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%又は約95%の発現の増加が存在する。一部の実施形態において、少なくとも約75%、約80%、約85%、約90%又は約95%の発現の増加が存在する。一部の実施形態において、少なくとも約80%、約85%、約90%又は約95%の発現の増加が存在する。一部の実施形態において、少なくとも約85%、約90%又は約95%の発現の増加が存在する。一部の実施形態において、少なくとも約80%の発現の増加が存在する。一部の実施形態において、少なくとも約85%の発現の増加が存在する。一部の実施形態において、少なくとも約90%の発現の増加が存在する。一部の実施形態において、少なくとも約95%の発現の増加が存在する。一部の実施形態において、少なくとも約99%の発現の増加が存在する。
[00389] 一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、転写因子(T
F)及び/又はTILにおけるタンパク質発現を一過性に変化させることができる他の分子でのTILの処置によって誘導される。一部の実施形態において、SQZベクターを含まないマイクロ流体プラットフォームは、転写因子(TF)及び/又はタンパク質発現を一過性に変化させることができる他の分子の細胞内送達のために使用される。転写因子を含むタンパク質を、T細胞を含む様々な初代ヒト細胞に送達する能力を実証するそのような方法(Sharei et al. PNAS 2013並びにSharei et al., PLOS ONE 2015及びGreisbeck et al., J. Immunology vol. 195, 2015)が説明されており、これは、TF又は他の分子
が細胞に侵入するようにマイクロ流体狭窄を使用して細胞を変形させる迅速な方法を含む。例えば、国際公開第2013/059343A1号、国際公開第2017/008063A1号若しくは国際公開第2017/123663A1号又は米国特許出願公開第2014/0287509A1号、同第2018/0201889A1号若しくは同第2018/0245089A1号(これらは、全てその全体が参照により本明細書に組み込まれる)を参照されたい。国際公開第2013/059343A1号、国際公開第2017/008063A1号若しくは国際公開第2017/123663A1号又は米国特許出願公開第2014/0287509A1号、同第2018/0201889A1号若しくは同第2018/0245089A1号に記載されるそのような方法は、転写因子(TF)及び/又は一過性のタンパク質発現を誘導することができる他の分子にTIL集団を曝露するために本発明と共に使用することができ、ここで、TF及び/又は一過性のタンパク質発現を誘導することができる他の分子は、腫瘍抗原の増加した発現及び/又はTIL集団における腫瘍抗原特異的T細胞の数の増加を提供し、したがってTIL集団の再プログラミング及び再プログラミングされたTIL集団の治療効果の再プログラミングされていないTIL集団と比較した増加をもたらす。一部の実施形態において、再プログラミングは、本明細書に記載されるように、TILの開始集団又は前の(即ち再プログラミング前の)集団と比較して、エフェクターT細胞及び/又はセントラルメモリーT細胞の増加したサブ集団をもたらす。
F)及び/又はTILにおけるタンパク質発現を一過性に変化させることができる他の分子でのTILの処置によって誘導される。一部の実施形態において、SQZベクターを含まないマイクロ流体プラットフォームは、転写因子(TF)及び/又はタンパク質発現を一過性に変化させることができる他の分子の細胞内送達のために使用される。転写因子を含むタンパク質を、T細胞を含む様々な初代ヒト細胞に送達する能力を実証するそのような方法(Sharei et al. PNAS 2013並びにSharei et al., PLOS ONE 2015及びGreisbeck et al., J. Immunology vol. 195, 2015)が説明されており、これは、TF又は他の分子
が細胞に侵入するようにマイクロ流体狭窄を使用して細胞を変形させる迅速な方法を含む。例えば、国際公開第2013/059343A1号、国際公開第2017/008063A1号若しくは国際公開第2017/123663A1号又は米国特許出願公開第2014/0287509A1号、同第2018/0201889A1号若しくは同第2018/0245089A1号(これらは、全てその全体が参照により本明細書に組み込まれる)を参照されたい。国際公開第2013/059343A1号、国際公開第2017/008063A1号若しくは国際公開第2017/123663A1号又は米国特許出願公開第2014/0287509A1号、同第2018/0201889A1号若しくは同第2018/0245089A1号に記載されるそのような方法は、転写因子(TF)及び/又は一過性のタンパク質発現を誘導することができる他の分子にTIL集団を曝露するために本発明と共に使用することができ、ここで、TF及び/又は一過性のタンパク質発現を誘導することができる他の分子は、腫瘍抗原の増加した発現及び/又はTIL集団における腫瘍抗原特異的T細胞の数の増加を提供し、したがってTIL集団の再プログラミング及び再プログラミングされたTIL集団の治療効果の再プログラミングされていないTIL集団と比較した増加をもたらす。一部の実施形態において、再プログラミングは、本明細書に記載されるように、TILの開始集団又は前の(即ち再プログラミング前の)集団と比較して、エフェクターT細胞及び/又はセントラルメモリーT細胞の増加したサブ集団をもたらす。
[00390] 一部の実施形態において、転写因子(TF)は、TCF-1、NOTCH
1/2 ICD及び/又はMYBを含むが、これらに限定されない。一部の実施形態において、転写因子(TF)は、TCF-1である。一部の実施形態において、転写因子(TF)は、NOTCH 1/2 ICDである。一部の実施形態において、転写因子(TF)は、MYBである。一部の実施形態において、転写因子(TF)は、市販のKNOCKOUT血
清代替物(Gibco/ThermoFisher)などの人工多能性幹細胞培養物(iPSC)と共に投与されて、追加のTIL再プログラミングを誘導する。一部の実施形態において、転写因子(TF)は、追加のTIL再プログラミングを誘導するために、iPSCカクテルと共に投与される。一部の実施形態において、転写因子(TF)は、iPSCカクテルなしで投与される。一部の実施形態において、再プログラミングは、TSCMのパーセンテージの増加をもたらす。一部の実施形態において、再プログラミングは、TSCMのパーセンテージの約5%、約10%、約10%、約20%、約25%、約30%、約35%、約40%、約45%、約50%、約55%、約60%、約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%又は約95%TSCMの増加をもたらす。
1/2 ICD及び/又はMYBを含むが、これらに限定されない。一部の実施形態において、転写因子(TF)は、TCF-1である。一部の実施形態において、転写因子(TF)は、NOTCH 1/2 ICDである。一部の実施形態において、転写因子(TF)は、MYBである。一部の実施形態において、転写因子(TF)は、市販のKNOCKOUT血
清代替物(Gibco/ThermoFisher)などの人工多能性幹細胞培養物(iPSC)と共に投与されて、追加のTIL再プログラミングを誘導する。一部の実施形態において、転写因子(TF)は、追加のTIL再プログラミングを誘導するために、iPSCカクテルと共に投与される。一部の実施形態において、転写因子(TF)は、iPSCカクテルなしで投与される。一部の実施形態において、再プログラミングは、TSCMのパーセンテージの増加をもたらす。一部の実施形態において、再プログラミングは、TSCMのパーセンテージの約5%、約10%、約10%、約20%、約25%、約30%、約35%、約40%、約45%、約50%、約55%、約60%、約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%又は約95%TSCMの増加をもたらす。
[00391] 一部の実施形態において、腫瘍浸潤リンパ球(TIL)を治療用TIL集団
に拡大培養する方法は、
(i)患者から切除された腫瘍から第1のTIL集団を得るステップ;
(ii)IL-2及び任意選択によりOKT-3を含む細胞培養培地中で第1のTIL集団を培養することにより、第1の拡大培養を実施して第2のTIL集団を生じさせること;
(iii)第2のTIL集団の細胞培養培地に追加のIL-2、OKT-3及び抗原提示細胞(APC)を補充することにより、第2の拡大培養を実施して第3のTIL集団を生じさせることであって、第3のTIL集団は、第2のTIL集団よりも数において少なくとも100倍多く、第2の拡大培養は、第3のTIL集団を得るために少なくとも14日間にわたって実施され、第3のTIL集団は、治療用TIL集団である、生じさせること;及び
(iv)第2及び/又は第3のTIL集団を、転写因子(TF)及び/又はタンパク質発現を一過性に変化させることができる他の分子に曝露することであって、TF及び/又はタンパク質発現を一過性に変化させることができる他の分子は、腫瘍抗原の変化した発現及び/又は治療用TIL集団における腫瘍抗原特異的T細胞の数の変化を提供する、曝露すること
を含む。
に拡大培養する方法は、
(i)患者から切除された腫瘍から第1のTIL集団を得るステップ;
(ii)IL-2及び任意選択によりOKT-3を含む細胞培養培地中で第1のTIL集団を培養することにより、第1の拡大培養を実施して第2のTIL集団を生じさせること;
(iii)第2のTIL集団の細胞培養培地に追加のIL-2、OKT-3及び抗原提示細胞(APC)を補充することにより、第2の拡大培養を実施して第3のTIL集団を生じさせることであって、第3のTIL集団は、第2のTIL集団よりも数において少なくとも100倍多く、第2の拡大培養は、第3のTIL集団を得るために少なくとも14日間にわたって実施され、第3のTIL集団は、治療用TIL集団である、生じさせること;及び
(iv)第2及び/又は第3のTIL集団を、転写因子(TF)及び/又はタンパク質発現を一過性に変化させることができる他の分子に曝露することであって、TF及び/又はタンパク質発現を一過性に変化させることができる他の分子は、腫瘍抗原の変化した発現及び/又は治療用TIL集団における腫瘍抗原特異的T細胞の数の変化を提供する、曝露すること
を含む。
[00392] 一部の実施形態において、腫瘍浸潤リンパ球(TIL)を治療用TIL集団
に拡大培養する方法は、
(a)患者から得られた腫瘍サンプルを複数の腫瘍断片に処理することにより、患者から切除された腫瘍から第1のTIL集団を得ること;
(b)腫瘍断片を閉鎖系に添加すること;
(c)IL-2を含み、且つ任意選択により4-1BBアゴニスト抗体を含む細胞培養培地中で約2~5日間にわたって第1のTIL集団を培養することにより、第1の拡大培養を実施すること;
(d)OKT-3を添加して第2のTIL集団を生じさせることであって、第1の拡大培養は、第1のガス透過性表面積を提供する閉鎖型容器内で実施され、第1の拡大培養は、第2のTIL集団を得るために約1~3日間にわたって実施され、第2のTIL集団は、第1のTIL集団よりも数において少なくとも50倍多く、ステップ(c)からステップ(d)への移行は、系を開放することなく行われる、生じさせること;
(e)第2のTIL集団に対して無菌エレクトロポレーションステップを実施することであって、無菌エレクトロポレーションステップは、少なくとも1つの短鎖干渉RNA又は1つのメッセンジャーRNAの移動を媒介する、実施すること;
(f)第2のTIL集団を約1日間にわたって静置すること;
(g)第2のTIL集団の細胞培養培地に追加のIL-2、任意選択によりOKT-3抗体、任意選択によりOX40抗体及び抗原提示細胞(APC)を補充することにより、第2の拡大培養を実施して第3のTIL集団を生じさせることであって、第2の拡大培養は、第3のTIL集団を得るために約7~11日間にわたって実施され、第2の拡大培養は
、第2のガス透過性表面積を提供する閉鎖型容器内で実施され、ステップ(f)からステップ(g)への移行は、系を開放することなく行われる、生じさせること;
(h)ステップ(g)から得られた治療用TIL集団を回収して、回収されたTIL集団を提供することであって、ステップ(g)からステップ(g)への移行は、系を開放することなく行われ、回収されたTIL集団は、治療用TIL集団である、提供すること;
(i)ステップ(e)からの回収されたTIL集団を輸注バッグに移すことであって、ステップ(e)から(f)への移行は、系を開放することなく行われる、移すこと;及び
(j)ジメチルスルホキシドベースの凍結保存培地を使用して、回収されたTIL集団を凍結保存すること
を含み、滅菌エレクトロポレーションステップは、PD-1、LAG-3、TIM-3、CTLA-4、TIGIT、CISH、TGFβR2、PKA、CBLB、BAFF(BR3)及びそれらの組み合わせからなる群から選択される分子の発現を阻害するための短鎖干渉RNAの送達を含む。
に拡大培養する方法は、
(a)患者から得られた腫瘍サンプルを複数の腫瘍断片に処理することにより、患者から切除された腫瘍から第1のTIL集団を得ること;
(b)腫瘍断片を閉鎖系に添加すること;
(c)IL-2を含み、且つ任意選択により4-1BBアゴニスト抗体を含む細胞培養培地中で約2~5日間にわたって第1のTIL集団を培養することにより、第1の拡大培養を実施すること;
(d)OKT-3を添加して第2のTIL集団を生じさせることであって、第1の拡大培養は、第1のガス透過性表面積を提供する閉鎖型容器内で実施され、第1の拡大培養は、第2のTIL集団を得るために約1~3日間にわたって実施され、第2のTIL集団は、第1のTIL集団よりも数において少なくとも50倍多く、ステップ(c)からステップ(d)への移行は、系を開放することなく行われる、生じさせること;
(e)第2のTIL集団に対して無菌エレクトロポレーションステップを実施することであって、無菌エレクトロポレーションステップは、少なくとも1つの短鎖干渉RNA又は1つのメッセンジャーRNAの移動を媒介する、実施すること;
(f)第2のTIL集団を約1日間にわたって静置すること;
(g)第2のTIL集団の細胞培養培地に追加のIL-2、任意選択によりOKT-3抗体、任意選択によりOX40抗体及び抗原提示細胞(APC)を補充することにより、第2の拡大培養を実施して第3のTIL集団を生じさせることであって、第2の拡大培養は、第3のTIL集団を得るために約7~11日間にわたって実施され、第2の拡大培養は
、第2のガス透過性表面積を提供する閉鎖型容器内で実施され、ステップ(f)からステップ(g)への移行は、系を開放することなく行われる、生じさせること;
(h)ステップ(g)から得られた治療用TIL集団を回収して、回収されたTIL集団を提供することであって、ステップ(g)からステップ(g)への移行は、系を開放することなく行われ、回収されたTIL集団は、治療用TIL集団である、提供すること;
(i)ステップ(e)からの回収されたTIL集団を輸注バッグに移すことであって、ステップ(e)から(f)への移行は、系を開放することなく行われる、移すこと;及び
(j)ジメチルスルホキシドベースの凍結保存培地を使用して、回収されたTIL集団を凍結保存すること
を含み、滅菌エレクトロポレーションステップは、PD-1、LAG-3、TIM-3、CTLA-4、TIGIT、CISH、TGFβR2、PKA、CBLB、BAFF(BR3)及びそれらの組み合わせからなる群から選択される分子の発現を阻害するための短鎖干渉RNAの送達を含む。
[00393] 一実施形態によれば、腫瘍浸潤リンパ球(TIL)を治療用TIL集団に拡
大培養する方法は、
(a)患者から得られた腫瘍サンプルを複数の腫瘍断片に処理することにより、患者から切除された腫瘍から第1のTIL集団を得ること;
(b)腫瘍断片を閉鎖系に添加すること;
(c)IL-2を含み、且つ任意選択により4-1BBアゴニスト抗体を含む細胞培養培地中で約2~5日間にわたって第1のTIL集団を培養することにより、第1の拡大培養を実施すること;
(d)OKT-3を添加して第2のTIL集団を生じさせることであって、第1の拡大培養は、第1のガス透過性表面積を提供する閉鎖型容器内で実施され、第1の拡大培養は、第2のTIL集団を得るために約1~3日間にわたって実施され、第2のTIL集団は、第1のTIL集団よりも数において少なくとも50倍多く、ステップ(c)からステップ(d)への移行は、系を開放することなく行われる、生じさせること;
(e)第2のTIL集団に対してSQZマイクロ流体膜破壊ステップを実施することであって、SQZマイクロ流体膜破壊ステップは、少なくとも1つの短鎖干渉RNA又は1つのメッセンジャーRNAの移動を媒介する、実施すること;
(f)第2のTIL集団を約1日間にわたって静置すること;
(g)第2のTIL集団の細胞培養培地に追加のIL-2、任意選択によりOKT-3抗体、任意選択によりOX40抗体及び抗原提示細胞(APC)を補充することにより、第2の拡大培養を実施して第3のTIL集団を生じさせることであって、第2の拡大培養は、第3のTIL集団を得るために約7~11日間にわたって実施され、第2の拡大培養は、第2のガス透過性表面積を提供する閉鎖型容器内で実施され、ステップ(f)からステップ(g)への移行は、系を開放することなく行われる、生じさせること;
(h)ステップ(g)から得られた治療用TIL集団を回収して、回収されたTIL集団を提供することであって、ステップ(g)からステップ(g)への移行は、系を開放することなく行われ、回収されたTIL集団は、治療用TIL集団である、提供すること;
(i)ステップ(e)からの回収されたTIL集団を輸注バッグに移すことであって、ステップ(e)から(f)への移行は、系を開放することなく行われる、移すこと;及び
(j)ジメチルスルホキシドベースの凍結保存培地を使用して、回収されたTIL集団を凍結保存すること
を含み、SQZマイクロ流体膜破壊ステップは、PD-1、LAG-3、TIM-3、CTLA-4、TIGIT、CISH、TGFβR2、PKA、CBLB、BAFF(BR3)及びそれらの組み合わせからなる群から選択される分子の発現を阻害するための短鎖干渉RNAの送達を含む。
大培養する方法は、
(a)患者から得られた腫瘍サンプルを複数の腫瘍断片に処理することにより、患者から切除された腫瘍から第1のTIL集団を得ること;
(b)腫瘍断片を閉鎖系に添加すること;
(c)IL-2を含み、且つ任意選択により4-1BBアゴニスト抗体を含む細胞培養培地中で約2~5日間にわたって第1のTIL集団を培養することにより、第1の拡大培養を実施すること;
(d)OKT-3を添加して第2のTIL集団を生じさせることであって、第1の拡大培養は、第1のガス透過性表面積を提供する閉鎖型容器内で実施され、第1の拡大培養は、第2のTIL集団を得るために約1~3日間にわたって実施され、第2のTIL集団は、第1のTIL集団よりも数において少なくとも50倍多く、ステップ(c)からステップ(d)への移行は、系を開放することなく行われる、生じさせること;
(e)第2のTIL集団に対してSQZマイクロ流体膜破壊ステップを実施することであって、SQZマイクロ流体膜破壊ステップは、少なくとも1つの短鎖干渉RNA又は1つのメッセンジャーRNAの移動を媒介する、実施すること;
(f)第2のTIL集団を約1日間にわたって静置すること;
(g)第2のTIL集団の細胞培養培地に追加のIL-2、任意選択によりOKT-3抗体、任意選択によりOX40抗体及び抗原提示細胞(APC)を補充することにより、第2の拡大培養を実施して第3のTIL集団を生じさせることであって、第2の拡大培養は、第3のTIL集団を得るために約7~11日間にわたって実施され、第2の拡大培養は、第2のガス透過性表面積を提供する閉鎖型容器内で実施され、ステップ(f)からステップ(g)への移行は、系を開放することなく行われる、生じさせること;
(h)ステップ(g)から得られた治療用TIL集団を回収して、回収されたTIL集団を提供することであって、ステップ(g)からステップ(g)への移行は、系を開放することなく行われ、回収されたTIL集団は、治療用TIL集団である、提供すること;
(i)ステップ(e)からの回収されたTIL集団を輸注バッグに移すことであって、ステップ(e)から(f)への移行は、系を開放することなく行われる、移すこと;及び
(j)ジメチルスルホキシドベースの凍結保存培地を使用して、回収されたTIL集団を凍結保存すること
を含み、SQZマイクロ流体膜破壊ステップは、PD-1、LAG-3、TIM-3、CTLA-4、TIGIT、CISH、TGFβR2、PKA、CBLB、BAFF(BR3)及びそれらの組み合わせからなる群から選択される分子の発現を阻害するための短鎖干渉RNAの送達を含む。
[00394] 一部の実施形態において、上記のように一過性に変化するタンパク質発現の
方法は、TIL集団を遺伝子改変する方法と組み合わされ得、1つ以上のタンパク質の産生のための遺伝子の安定した組み込みのステップを含む。一実施形態において、TILの集団を遺伝子改変する方法は、レトロウイルス形質導入のステップを含む。一実施形態において、TILの集団を遺伝子改変する方法は、レンチウイルス形質導入のステップを含む。レンチウイルス形質導入システムは、当技術分野で公知であり、例えばLevine, et al., Proc. Nat’l Acad. Sci. 2006, 103, 17372-77;Zufferey, et al., Nat. Biotechnol. 1997, 15, 871-75;Dull, et al., J. Virology 1998, 72, 8463-71及び米国特許第
6,627,442号に記載され、そのそれぞれの開示は、参照により本明細書に組み込まれる。一実施形態において、TILの集団を遺伝子改変する方法は、ガンマレトロウイルス形質導入のステップを含む。ガンマレトロウイルス形質導入システムは、当技術分野で公知であり、例えばCepko and Pear, Cur. Prot. Mol. Biol. 1996, 9.9.1-9.9.16に記載され、その開示は、参照により本明細書に組み込まれる。一実施形態において、TILの集団を遺伝子改変する方法は、トランスポゾン媒介遺伝子導入のステップを含む。トランスポゾン媒介遺伝子導入システムは、当技術分野で公知であり、トランスポサーゼの長期発現がトランスジェニック細胞では発生しないように、トランスポサーゼがDNA発現ベクターとして又は発現可能なRNA若しくはタンパク質として提供されるシステム、例えばmRNA(例えば、キャップ及びポリAテールを含むmRNA)として提供されるトランスポサーゼを含む。SB10、SB11、SB100xなどのサケ科のTel様トランスポサーゼ(SB又はSleeping Beautyトランスポサーゼ)を含む適切なトランスポゾ
ン媒介遺伝子導入システム及び酵素活性が向上した人工酵素は、例えば、Hackett, et al., Mol. Therapy 2010, 18, 674-83及び米国特許第6,489,458号に記載され、そのそれぞれの開示は、参照により本明細書に組み込まれる。
方法は、TIL集団を遺伝子改変する方法と組み合わされ得、1つ以上のタンパク質の産生のための遺伝子の安定した組み込みのステップを含む。一実施形態において、TILの集団を遺伝子改変する方法は、レトロウイルス形質導入のステップを含む。一実施形態において、TILの集団を遺伝子改変する方法は、レンチウイルス形質導入のステップを含む。レンチウイルス形質導入システムは、当技術分野で公知であり、例えばLevine, et al., Proc. Nat’l Acad. Sci. 2006, 103, 17372-77;Zufferey, et al., Nat. Biotechnol. 1997, 15, 871-75;Dull, et al., J. Virology 1998, 72, 8463-71及び米国特許第
6,627,442号に記載され、そのそれぞれの開示は、参照により本明細書に組み込まれる。一実施形態において、TILの集団を遺伝子改変する方法は、ガンマレトロウイルス形質導入のステップを含む。ガンマレトロウイルス形質導入システムは、当技術分野で公知であり、例えばCepko and Pear, Cur. Prot. Mol. Biol. 1996, 9.9.1-9.9.16に記載され、その開示は、参照により本明細書に組み込まれる。一実施形態において、TILの集団を遺伝子改変する方法は、トランスポゾン媒介遺伝子導入のステップを含む。トランスポゾン媒介遺伝子導入システムは、当技術分野で公知であり、トランスポサーゼの長期発現がトランスジェニック細胞では発生しないように、トランスポサーゼがDNA発現ベクターとして又は発現可能なRNA若しくはタンパク質として提供されるシステム、例えばmRNA(例えば、キャップ及びポリAテールを含むmRNA)として提供されるトランスポサーゼを含む。SB10、SB11、SB100xなどのサケ科のTel様トランスポサーゼ(SB又はSleeping Beautyトランスポサーゼ)を含む適切なトランスポゾ
ン媒介遺伝子導入システム及び酵素活性が向上した人工酵素は、例えば、Hackett, et al., Mol. Therapy 2010, 18, 674-83及び米国特許第6,489,458号に記載され、そのそれぞれの開示は、参照により本明細書に組み込まれる。
[00395] 一部の実施形態において、腫瘍浸潤リンパ球(TIL)を治療用TIL集団
に拡大培養する方法は、
(a)患者から得られた腫瘍サンプルを複数の腫瘍断片に処理することにより、患者から切除された腫瘍から第1のTIL集団を得ること;
(b)腫瘍断片を閉鎖系に添加すること;
(c)IL-2を含み、且つ任意選択により4-1BBアゴニスト抗体を含む細胞培養培地中で約2~5日間にわたって第1のTIL集団を培養することにより、第1の拡大培養を実施すること;
(d)OKT-3を添加して第2のTIL集団を生じさせることであって、第1の拡大培養は、第1のガス透過性表面積を提供する閉鎖型容器内で実施され、第1の拡大培養は、第2のTIL集団を得るために約1~3日間にわたって実施され、第2のTIL集団は、第1のTIL集団よりも数において少なくとも50倍多く、ステップ(c)からステップ(d)への移行は、系を開放することなく行われる、生じさせること;
(e)第2のTIL集団に対して無菌エレクトロポレーションステップ又はSQZマイクロ流体膜破壊ステップを実施することであって、無菌エレクトロポレーションステップ又はSQZマイクロ流体膜破壊ステップは、少なくとも1つの短鎖干渉RNA又は1つのメッセンジャーRNAの移動を媒介する、実施すること;
(f)第2のTIL集団を約1日間にわたって静置すること;
(g)第2のTIL集団の細胞培養培地に追加のIL-2、任意選択によりOKT-3抗体、任意選択によりOX40抗体及び抗原提示細胞(APC)を補充することにより、第2の拡大培養を実施して第3のTIL集団を生じさせることであって、第2の拡大培養は、第3のTIL集団を得るために約7~11日間にわたって実施され、第2の拡大培養は、第2のガス透過性表面積を提供する閉鎖型容器内で実施され、ステップ(f)からステップ(g)への移行は、系を開放することなく行われる、生じさせること;
(h)ステップ(g)から得られた治療用TIL集団を回収して、回収されたTIL集団を提供することであって、ステップ(g)からステップ(g)への移行は、系を開放することなく行われ、回収されたTIL集団は、治療用TIL集団である、提供すること;
(i)ステップ(e)からの回収されたTIL集団を輸注バッグに移すことであって、ステップ(e)から(f)への移行は、系を開放することなく行われる、移すこと;及び
(j)ジメチルスルホキシドベースの凍結保存培地を使用して、回収されたTIL集団を凍結保存すること
を含み、エレクトロポレーションステップは、PD-1、LAG-3、TIM-3、CTLA-4、TIGIT、CISH、TGFβR2、PKA、CBLB、BAFF(BR3)及びそれらの組み合わせからなる群から選択される分子の発現を一過性に阻害するための短鎖干渉RNAの送達を含み、更に、CCR2、CCR4、CCR5、CXCR2、CXCR3、CX3CR1及びそれらの組み合わせからなる群から選択される接着分子は、ガンマレトロウイルス又はレンチウイルス方法により、第1のTIL集団、第2のTIL集団又は回収されたTIL集団に挿入される。
に拡大培養する方法は、
(a)患者から得られた腫瘍サンプルを複数の腫瘍断片に処理することにより、患者から切除された腫瘍から第1のTIL集団を得ること;
(b)腫瘍断片を閉鎖系に添加すること;
(c)IL-2を含み、且つ任意選択により4-1BBアゴニスト抗体を含む細胞培養培地中で約2~5日間にわたって第1のTIL集団を培養することにより、第1の拡大培養を実施すること;
(d)OKT-3を添加して第2のTIL集団を生じさせることであって、第1の拡大培養は、第1のガス透過性表面積を提供する閉鎖型容器内で実施され、第1の拡大培養は、第2のTIL集団を得るために約1~3日間にわたって実施され、第2のTIL集団は、第1のTIL集団よりも数において少なくとも50倍多く、ステップ(c)からステップ(d)への移行は、系を開放することなく行われる、生じさせること;
(e)第2のTIL集団に対して無菌エレクトロポレーションステップ又はSQZマイクロ流体膜破壊ステップを実施することであって、無菌エレクトロポレーションステップ又はSQZマイクロ流体膜破壊ステップは、少なくとも1つの短鎖干渉RNA又は1つのメッセンジャーRNAの移動を媒介する、実施すること;
(f)第2のTIL集団を約1日間にわたって静置すること;
(g)第2のTIL集団の細胞培養培地に追加のIL-2、任意選択によりOKT-3抗体、任意選択によりOX40抗体及び抗原提示細胞(APC)を補充することにより、第2の拡大培養を実施して第3のTIL集団を生じさせることであって、第2の拡大培養は、第3のTIL集団を得るために約7~11日間にわたって実施され、第2の拡大培養は、第2のガス透過性表面積を提供する閉鎖型容器内で実施され、ステップ(f)からステップ(g)への移行は、系を開放することなく行われる、生じさせること;
(h)ステップ(g)から得られた治療用TIL集団を回収して、回収されたTIL集団を提供することであって、ステップ(g)からステップ(g)への移行は、系を開放することなく行われ、回収されたTIL集団は、治療用TIL集団である、提供すること;
(i)ステップ(e)からの回収されたTIL集団を輸注バッグに移すことであって、ステップ(e)から(f)への移行は、系を開放することなく行われる、移すこと;及び
(j)ジメチルスルホキシドベースの凍結保存培地を使用して、回収されたTIL集団を凍結保存すること
を含み、エレクトロポレーションステップは、PD-1、LAG-3、TIM-3、CTLA-4、TIGIT、CISH、TGFβR2、PKA、CBLB、BAFF(BR3)及びそれらの組み合わせからなる群から選択される分子の発現を一過性に阻害するための短鎖干渉RNAの送達を含み、更に、CCR2、CCR4、CCR5、CXCR2、CXCR3、CX3CR1及びそれらの組み合わせからなる群から選択される接着分子は、ガンマレトロウイルス又はレンチウイルス方法により、第1のTIL集団、第2のTIL集団又は回収されたTIL集団に挿入される。
[00396] 一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、自己送達RN
A干渉(sd-RNA)によって誘導される発現の低減であり、これは、テトラエチレングリコール(TEG)リンカーを使用してその3’末端でコレステロールにコンジュゲートした20ヌクレオチドのアンチセンス(ガイド)鎖及び13~15塩基のセンス(パッセンジャー)鎖を含む、2’-OH置換(典型的にはフッ素又は-OCH3)の高いパーセンテージを有する化学合成された非対称siRNA二重鎖である。sd-RNAの使用方法は、Khvorova and Watts, Nat. Biotechnol. 2017, 35, 238-248;Byrne, et al., J. Ocul. Pharmacol. Ther. 2013, 29, 855-864;及びLigtenberg, et al., Mol. Therapy, 2018(近刊)に記載され、その開示は、参照により本明細書に組み込まれる。一実施形態において、TIL集団へのsd-RNAの送達は、エレクトロポレーション、SQZ又は他の方法を使用せずに達成され、代わりにTIL集団が培地中1μM/10,000TILの濃度でsd-RNAに曝露される1~3日の期間を使用する。一実施形態において、TIL集団へのsd-RNAの送達は、TIL集団が培地中10μM/10,000TILの濃度でsd-RNAに曝露される1~3日の期間を使用して達成される。一実施形態において、TIL集団へのsd-RNAの送達は、TIL集団が培地中50μM/10,000TILの濃度でsd-RNAに曝露される1~3日の期間を使用して達成される。一実施形態において、TIL集団へのsd-RNAの送達は、TIL集団が培地中において0.1μM/10,000TIL~50μM/10,000TILの濃度でsd-RNAに曝露される1~3日の期間を使用して達成される。一実施形態において、TIL集団へのsd-RNAの送達は、TIL集団が培地中において0.1μM/10,000TIL~50μM/10,000TILの濃度でsd-RNAに曝露される1~3日の期間を使用して達成され、ここで、sd-RNAへの曝露は、培地に新鮮なsd-RNAを添加することにより、2、3、4又は5回行われる。他の適切なプロセスは、例えば、米国特許出願公開第2011/0039914 A1号、同第2013/0131141 A1号及び同第2013/0131142 A1号並びに米国特許第9,080,171号に記載され、その開示は、参照により本明細書に組み込まれる。
A干渉(sd-RNA)によって誘導される発現の低減であり、これは、テトラエチレングリコール(TEG)リンカーを使用してその3’末端でコレステロールにコンジュゲートした20ヌクレオチドのアンチセンス(ガイド)鎖及び13~15塩基のセンス(パッセンジャー)鎖を含む、2’-OH置換(典型的にはフッ素又は-OCH3)の高いパーセンテージを有する化学合成された非対称siRNA二重鎖である。sd-RNAの使用方法は、Khvorova and Watts, Nat. Biotechnol. 2017, 35, 238-248;Byrne, et al., J. Ocul. Pharmacol. Ther. 2013, 29, 855-864;及びLigtenberg, et al., Mol. Therapy, 2018(近刊)に記載され、その開示は、参照により本明細書に組み込まれる。一実施形態において、TIL集団へのsd-RNAの送達は、エレクトロポレーション、SQZ又は他の方法を使用せずに達成され、代わりにTIL集団が培地中1μM/10,000TILの濃度でsd-RNAに曝露される1~3日の期間を使用する。一実施形態において、TIL集団へのsd-RNAの送達は、TIL集団が培地中10μM/10,000TILの濃度でsd-RNAに曝露される1~3日の期間を使用して達成される。一実施形態において、TIL集団へのsd-RNAの送達は、TIL集団が培地中50μM/10,000TILの濃度でsd-RNAに曝露される1~3日の期間を使用して達成される。一実施形態において、TIL集団へのsd-RNAの送達は、TIL集団が培地中において0.1μM/10,000TIL~50μM/10,000TILの濃度でsd-RNAに曝露される1~3日の期間を使用して達成される。一実施形態において、TIL集団へのsd-RNAの送達は、TIL集団が培地中において0.1μM/10,000TIL~50μM/10,000TILの濃度でsd-RNAに曝露される1~3日の期間を使用して達成され、ここで、sd-RNAへの曝露は、培地に新鮮なsd-RNAを添加することにより、2、3、4又は5回行われる。他の適切なプロセスは、例えば、米国特許出願公開第2011/0039914 A1号、同第2013/0131141 A1号及び同第2013/0131142 A1号並びに米国特許第9,080,171号に記載され、その開示は、参照により本明細書に組み込まれる。
[00397] 一部の実施形態において、sd-RNAは、図32によるプロセスを使用し
て、製造中にTILの集団に挿入される。一部の実施形態において、sd-RNAは、NOTCH 1/2 ICD、NOTCHリガンドmDLL1、PD-1、CTLA-4 TIM-3、LAG-3、TIGIT、TGFβ、TGFBR2、cAMPプロテインキナーゼA(PKA)、BAFF BR3、CISH及び/又はCBLBに干渉するRNAをコードする。一部の実施形態において、発現の低減は、例えば、フローサイトメトリー及び/又はqPCRによって評価されるような遺伝子サイレンシングのパーセンテージに基づいて決定される。一部の実施形態において、約5%、約10%、約10%、約20%、約25%、約30%、約35%、約40%、約45%、約50%、約55%、約60%、約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%又は約95%の発現の低減が存在する。一部の実施形態において、少なくとも約65%、約70%、約75%、
約80%、約85%、約90%又は約95%の発現の低減が存在する。一部の実施形態において、少なくとも約75%、約80%、約85%、約90%又は約95%の発現の低減が存在する。一部の実施形態において、少なくとも約80%、約85%、約90%又は約95%の発現の低減が存在する。一部の実施形態において、少なくとも約85%、約90%又は約95%の発現の低減が存在する。一部の実施形態において、少なくとも約80%の発現の低減が存在する。一部の実施形態において、少なくとも約85%の発現の低減が存在する。一部の実施形態において、少なくとも約90%の発現の低減が存在する。一部の実施形態において、少なくとも約95%の発現の低減が存在する。一部の実施形態において、少なくとも約99%の発現の低減が存在する。
て、製造中にTILの集団に挿入される。一部の実施形態において、sd-RNAは、NOTCH 1/2 ICD、NOTCHリガンドmDLL1、PD-1、CTLA-4 TIM-3、LAG-3、TIGIT、TGFβ、TGFBR2、cAMPプロテインキナーゼA(PKA)、BAFF BR3、CISH及び/又はCBLBに干渉するRNAをコードする。一部の実施形態において、発現の低減は、例えば、フローサイトメトリー及び/又はqPCRによって評価されるような遺伝子サイレンシングのパーセンテージに基づいて決定される。一部の実施形態において、約5%、約10%、約10%、約20%、約25%、約30%、約35%、約40%、約45%、約50%、約55%、約60%、約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%又は約95%の発現の低減が存在する。一部の実施形態において、少なくとも約65%、約70%、約75%、
約80%、約85%、約90%又は約95%の発現の低減が存在する。一部の実施形態において、少なくとも約75%、約80%、約85%、約90%又は約95%の発現の低減が存在する。一部の実施形態において、少なくとも約80%、約85%、約90%又は約95%の発現の低減が存在する。一部の実施形態において、少なくとも約85%、約90%又は約95%の発現の低減が存在する。一部の実施形態において、少なくとも約80%の発現の低減が存在する。一部の実施形態において、少なくとも約85%の発現の低減が存在する。一部の実施形態において、少なくとも約90%の発現の低減が存在する。一部の実施形態において、少なくとも約95%の発現の低減が存在する。一部の実施形態において、少なくとも約99%の発現の低減が存在する。
[00398] 一部の実施形態において、腫瘍浸潤リンパ球(TIL)を治療用TIL集団
に拡大培養する方法は、
(a)患者から得られた腫瘍サンプルを複数の腫瘍断片に処理することにより、患者から切除された腫瘍から第1のTIL集団を得ること;
(b)腫瘍断片を閉鎖系に添加すること;
(c)IL-2を含み、且つ任意選択により4-1BBアゴニスト抗体を含む細胞培養培地中で約2~5日間にわたって第1のTIL集団を培養することにより、第1の拡大培養を実施すること;
(d)OKT-3を添加して第2のTIL集団を生じさせることであって、第1の拡大培養は、第1のガス透過性表面積を提供する閉鎖型容器内で実施され、第1の拡大培養は、第2のTIL集団を得るために約1~3日間にわたって実施され、第2のTIL集団は、第1のTIL集団よりも数において少なくとも50倍多く、ステップ(c)からステップ(d)への移行は、系を開放することなく行われる、生じさせること;
(e)第2のTIL集団の細胞培養培地に追加のIL-2、1つ以上の自己送達RNA(sd-RNA)、任意選択によりOKT-3抗体、任意選択によりOX40抗体及び抗原提示細胞(APC)を補充することにより、第2の拡大培養を実施して第3のTIL集団を生じさせることであって、第2の拡大培養は、第3のTIL集団を得るために約7~11日間にわたって実施され、第2の拡大培養は、第2のガス透過性表面積を提供する閉鎖型容器内で実施され、ステップ(f)からステップ(g)への移行は、系を開放することなく行われる、生じさせること;
(h)ステップ(g)から得られた治療用TIL集団を回収して、回収されたTIL集団を提供することであって、ステップ(g)からステップ(g)への移行は、系を開放することなく行われ、回収されたTIL集団は、治療用TIL集団である、提供すること;
(i)ステップ(e)からの回収されたTIL集団を輸注バッグに移すことであって、ステップ(e)から(f)への移行は、系を開放することなく行われる、移すこと;及び
(j)ジメチルスルホキシドベースの凍結保存培地を使用して、回収されたTIL集団を凍結保存すること
を含み、1つ以上のsd-RNAは、PD-1、LAG-3、TIM-3、CTLA-4、TIGIT、CISH、TGFβR2、PKA、CBLB、BAFF(BR3)及びそれらの組み合わせからなる群から選択される分子の発現を一過性に阻害する。
に拡大培養する方法は、
(a)患者から得られた腫瘍サンプルを複数の腫瘍断片に処理することにより、患者から切除された腫瘍から第1のTIL集団を得ること;
(b)腫瘍断片を閉鎖系に添加すること;
(c)IL-2を含み、且つ任意選択により4-1BBアゴニスト抗体を含む細胞培養培地中で約2~5日間にわたって第1のTIL集団を培養することにより、第1の拡大培養を実施すること;
(d)OKT-3を添加して第2のTIL集団を生じさせることであって、第1の拡大培養は、第1のガス透過性表面積を提供する閉鎖型容器内で実施され、第1の拡大培養は、第2のTIL集団を得るために約1~3日間にわたって実施され、第2のTIL集団は、第1のTIL集団よりも数において少なくとも50倍多く、ステップ(c)からステップ(d)への移行は、系を開放することなく行われる、生じさせること;
(e)第2のTIL集団の細胞培養培地に追加のIL-2、1つ以上の自己送達RNA(sd-RNA)、任意選択によりOKT-3抗体、任意選択によりOX40抗体及び抗原提示細胞(APC)を補充することにより、第2の拡大培養を実施して第3のTIL集団を生じさせることであって、第2の拡大培養は、第3のTIL集団を得るために約7~11日間にわたって実施され、第2の拡大培養は、第2のガス透過性表面積を提供する閉鎖型容器内で実施され、ステップ(f)からステップ(g)への移行は、系を開放することなく行われる、生じさせること;
(h)ステップ(g)から得られた治療用TIL集団を回収して、回収されたTIL集団を提供することであって、ステップ(g)からステップ(g)への移行は、系を開放することなく行われ、回収されたTIL集団は、治療用TIL集団である、提供すること;
(i)ステップ(e)からの回収されたTIL集団を輸注バッグに移すことであって、ステップ(e)から(f)への移行は、系を開放することなく行われる、移すこと;及び
(j)ジメチルスルホキシドベースの凍結保存培地を使用して、回収されたTIL集団を凍結保存すること
を含み、1つ以上のsd-RNAは、PD-1、LAG-3、TIM-3、CTLA-4、TIGIT、CISH、TGFβR2、PKA、CBLB、BAFF(BR3)及びそれらの組み合わせからなる群から選択される分子の発現を一過性に阻害する。
[00399] 一部の実施形態において、腫瘍浸潤リンパ球(TIL)を治療用TIL集団
に拡大培養する方法は、
(a)患者から得られた腫瘍サンプルを複数の腫瘍断片に処理することにより、患者から切除された腫瘍から第1のTIL集団を得ること;
(b)腫瘍断片を閉鎖系に添加すること;
(c)IL-2を含み、且つ任意選択により4-1BBアゴニスト抗体を含む細胞培養培地中で約2~5日間にわたって第1のTIL集団を培養することにより、第1の拡大培養を実施すること;
(d)OKT-3を添加して第2のTIL集団を生じさせることであって、第1の拡大培
養は、第1のガス透過性表面積を提供する閉鎖型容器内で実施され、第1の拡大培養は、第2のTIL集団を得るために約1~3日間にわたって実施され、第2のTIL集団は、第1のTIL集団よりも数において少なくとも50倍多く、ステップ(c)からステップ(d)への移行は、系を開放することなく行われる、生じさせること;
(e)第2のTIL集団の細胞培養培地に追加のIL-2、1つ以上の自己送達RNA(sd-RNA)、任意選択によりOKT-3抗体、任意選択によりOX40抗体及び抗原提示細胞(APC)を補充することにより、第2の拡大培養を実施して第3のTIL集団を生じさせることであって、第2の拡大培養は、第3のTIL集団を得るために約7~11日間にわたって実施され、第2の拡大培養は、第2のガス透過性表面積を提供する閉鎖型容器内で実施され、ステップ(f)からステップ(g)への移行は、系を開放することなく行われる、生じさせること;
(h)ステップ(g)から得られた治療用TIL集団を回収して、回収されたTIL集団を提供することであって、ステップ(g)からステップ(g)への移行は、系を開放することなく行われ、回収されたTIL集団は、治療用TIL集団である、提供すること;
(i)ステップ(e)からの回収されたTIL集団を輸注バッグに移すことであって、ステップ(e)から(f)への移行は、系を開放することなく行われる、移すこと;及び
(j)ジメチルスルホキシドベースの凍結保存培地を使用して、回収されたTIL集団を凍結保存すること
を含み、1つ以上のsd-RNAは、PD-1、LAG-3、TIM-3、CTLA-4、TIGIT、CISH、TGFβR2、PKA、CBLB、BAFF(BR3)及びそれらの組み合わせからなる群から選択される分子の発現を一過性に阻害し、更に、CCR2、CCR4、CCR5、CXCR2、CXCR3、CX3CR1及びそれらの組み合わせからなる群から選択される接着分子は、ガンマレトロウイルス又はレンチウイルス方法により、第1のTIL集団、第2のTIL集団又は回収されたTIL集団に挿入される。
に拡大培養する方法は、
(a)患者から得られた腫瘍サンプルを複数の腫瘍断片に処理することにより、患者から切除された腫瘍から第1のTIL集団を得ること;
(b)腫瘍断片を閉鎖系に添加すること;
(c)IL-2を含み、且つ任意選択により4-1BBアゴニスト抗体を含む細胞培養培地中で約2~5日間にわたって第1のTIL集団を培養することにより、第1の拡大培養を実施すること;
(d)OKT-3を添加して第2のTIL集団を生じさせることであって、第1の拡大培
養は、第1のガス透過性表面積を提供する閉鎖型容器内で実施され、第1の拡大培養は、第2のTIL集団を得るために約1~3日間にわたって実施され、第2のTIL集団は、第1のTIL集団よりも数において少なくとも50倍多く、ステップ(c)からステップ(d)への移行は、系を開放することなく行われる、生じさせること;
(e)第2のTIL集団の細胞培養培地に追加のIL-2、1つ以上の自己送達RNA(sd-RNA)、任意選択によりOKT-3抗体、任意選択によりOX40抗体及び抗原提示細胞(APC)を補充することにより、第2の拡大培養を実施して第3のTIL集団を生じさせることであって、第2の拡大培養は、第3のTIL集団を得るために約7~11日間にわたって実施され、第2の拡大培養は、第2のガス透過性表面積を提供する閉鎖型容器内で実施され、ステップ(f)からステップ(g)への移行は、系を開放することなく行われる、生じさせること;
(h)ステップ(g)から得られた治療用TIL集団を回収して、回収されたTIL集団を提供することであって、ステップ(g)からステップ(g)への移行は、系を開放することなく行われ、回収されたTIL集団は、治療用TIL集団である、提供すること;
(i)ステップ(e)からの回収されたTIL集団を輸注バッグに移すことであって、ステップ(e)から(f)への移行は、系を開放することなく行われる、移すこと;及び
(j)ジメチルスルホキシドベースの凍結保存培地を使用して、回収されたTIL集団を凍結保存すること
を含み、1つ以上のsd-RNAは、PD-1、LAG-3、TIM-3、CTLA-4、TIGIT、CISH、TGFβR2、PKA、CBLB、BAFF(BR3)及びそれらの組み合わせからなる群から選択される分子の発現を一過性に阻害し、更に、CCR2、CCR4、CCR5、CXCR2、CXCR3、CX3CR1及びそれらの組み合わせからなる群から選択される接着分子は、ガンマレトロウイルス又はレンチウイルス方法により、第1のTIL集団、第2のTIL集団又は回収されたTIL集団に挿入される。
A.sd-RNA法
[00400] 本明細書に記載されるように、siRNAの化学修飾に基づく自己送達可能
なRNAi技術を本発明の方法と共に使用して、sd-RNAを問題なくTILに送達することができる。骨格修飾と非対称siRNA構造及び疎水性リガンドとの組み合わせ(例えば、Ligtenberg, et al., Mol. Therapy, 2018及び米国特許出願公開第20160304873
号並びに本明細書の図36及び図37を参照されたい)は、sd-RNAのヌクレアーゼ安定性を利用して、培養培地に単純に添加することにより、追加の製剤及び及び方法なしで、sd-RNAを培養した哺乳動物細胞に浸透させることを可能にする。この安定性は、単に培地中のsd-RNAの活性濃度を維持することで、RNAiを介した標的遺伝子活性の一定レベルの低減のサポートを可能にする。理論に拘束されるものではないが、sd-RNAの骨格安定化は、非分裂細胞において数ヶ月間続き得る、遺伝子発現効果の長期低減を提供する。
[00400] 本明細書に記載されるように、siRNAの化学修飾に基づく自己送達可能
なRNAi技術を本発明の方法と共に使用して、sd-RNAを問題なくTILに送達することができる。骨格修飾と非対称siRNA構造及び疎水性リガンドとの組み合わせ(例えば、Ligtenberg, et al., Mol. Therapy, 2018及び米国特許出願公開第20160304873
号並びに本明細書の図36及び図37を参照されたい)は、sd-RNAのヌクレアーゼ安定性を利用して、培養培地に単純に添加することにより、追加の製剤及び及び方法なしで、sd-RNAを培養した哺乳動物細胞に浸透させることを可能にする。この安定性は、単に培地中のsd-RNAの活性濃度を維持することで、RNAiを介した標的遺伝子活性の一定レベルの低減のサポートを可能にする。理論に拘束されるものではないが、sd-RNAの骨格安定化は、非分裂細胞において数ヶ月間続き得る、遺伝子発現効果の長期低減を提供する。
[00401] 一実施形態において、本明細書で開示される遺伝子を標的とするために本明
細書で使用されるsd-RNAは、図36又は図37に示される構造を有する。
細書で使用されるsd-RNAは、図36又は図37に示される構造を有する。
[00402] 一部の実施形態において、95%を超えるTILのトランスフェクション効
率及び様々な特定のsd-RNAによる標的の発現の低減が生じる。一部の実施形態において、いくつかの未修飾リボース残基を含有するsd-RNAを、完全に修飾された配列で置換して、RNAi効果の効力及び/又は寿命を増加させた。一部の実施形態において、発現効果の低減は、12時間、24時間、36時間、48時間、5日間、6日間、7日間又は8日間以上維持される。一部の実施形態において、発現効果の低減は、TILのsd-RNA処置後、10日以上で減少する。一部の実施形態において、標的発現の発現において70%を超える低減が維持される。一部の実施形態において、標的発現の発現において70%を超える低減は、維持されたTILである。一部の実施形態において、PD-
1/PD-L1経路における発現の減少により、TILがより強力なインビボ効果を示すことが可能となり、これは、一部の実施形態において、PD-1/PD-L1経路の抑制効果の回避による。一部の実施形態において、sd-RNAによるPD-1の発現の低減は、TIL増殖の増加をもたらす。
率及び様々な特定のsd-RNAによる標的の発現の低減が生じる。一部の実施形態において、いくつかの未修飾リボース残基を含有するsd-RNAを、完全に修飾された配列で置換して、RNAi効果の効力及び/又は寿命を増加させた。一部の実施形態において、発現効果の低減は、12時間、24時間、36時間、48時間、5日間、6日間、7日間又は8日間以上維持される。一部の実施形態において、発現効果の低減は、TILのsd-RNA処置後、10日以上で減少する。一部の実施形態において、標的発現の発現において70%を超える低減が維持される。一部の実施形態において、標的発現の発現において70%を超える低減は、維持されたTILである。一部の実施形態において、PD-
1/PD-L1経路における発現の減少により、TILがより強力なインビボ効果を示すことが可能となり、これは、一部の実施形態において、PD-1/PD-L1経路の抑制効果の回避による。一部の実施形態において、sd-RNAによるPD-1の発現の低減は、TIL増殖の増加をもたらす。
1.sd-RNAの選択及び特徴
a.sd-RNAオリゴヌクレオチドの構造
[00403] 低分子干渉RNA(siRNA)は、短鎖干渉RNA又はサイレンシングR
NAとして知られる場合もあり、一般に長さが19~25塩基対の二本鎖RNA分子である。siRNAは、相補的なヌクレオチド配列を有する特定の遺伝子の発現に干渉するRNA干渉(RNAi)で使用される。
a.sd-RNAオリゴヌクレオチドの構造
[00403] 低分子干渉RNA(siRNA)は、短鎖干渉RNA又はサイレンシングR
NAとして知られる場合もあり、一般に長さが19~25塩基対の二本鎖RNA分子である。siRNAは、相補的なヌクレオチド配列を有する特定の遺伝子の発現に干渉するRNA干渉(RNAi)で使用される。
[00404] 二本鎖DNA(dsRNA)は、一般にセンス(パッセンジャー)及びアン
チセンス(ガイド)鎖であり、一本鎖オーバーハング領域を含み得る、RNAの相補鎖の対を含む任意の分子を定義するために一般的に使用できる。siRNAと対比されるdsRNAという用語は、ダイサーを含む切断酵素システムの作用により、より大きいdsRNA分子から放出されるsiRNA分子の配列を含む前駆体分子を一般的に指す。
チセンス(ガイド)鎖であり、一本鎖オーバーハング領域を含み得る、RNAの相補鎖の対を含む任意の分子を定義するために一般的に使用できる。siRNAと対比されるdsRNAという用語は、ダイサーを含む切断酵素システムの作用により、より大きいdsRNA分子から放出されるsiRNA分子の配列を含む前駆体分子を一般的に指す。
[00405] sd-RNA(自己送達可能なRNA)は、細胞に侵入するのに送達ビヒク
ルを必要とせず、従来のsiRNAと比較して向上した薬理を有する、共有結合修飾されたRNAi化合物の新しいクラスである。「自己送達可能なRNA」又は「sd-RNA」は、疎水性修飾されたRNA干渉アンチセンスハイブリッドであり、初代細胞ではインビトロで、局所投与ではインビボで非常に効果的であることが実証されている。毒性のない強力な取り込み及び/又はサイレンシングが実証されている。sd-RNAは、一般に、最小の二本鎖領域を有する、化学的に修飾された非対称の核酸分子である。sd-RNA分子は、典型的には、一本鎖領域及び二本鎖領域を含み、分子の一本鎖領域及び二本鎖領域の両方に様々な化学修飾を含み得る。更に、sd-RNA分子は、本明細書に記載されるように、従来の及び先端的なステロール型分子などの疎水性コンジュゲートに結合させることができる。sd-RNA(及び/又はsd-RNAと同様の方法で利用することができるRNA)及びそのようなsd-RNAを作製するための関連する方法は、例えば、米国特許出願公開第2016/0304873号、国際公開第2010/033246号、国際公開第2017/070151号、国際公開第2009/102427号、国際公開第201/1119887号、国際公開第2010/033247号、国際公開第2009045457号、国際公開第2011/119852号、国際公開第2011/119871号、米国特許出願公開第2011/0263680号、国際公開第2010/033248号、国際公開第2010/078536号、国際公開第2010/090762号、米国特許出願公開第20110039914号、国際公開第2011/109698号、国際公開第2010/090762号、米国特許第8,815,818号、国際公開第2016/094845号、国際公開第2017/193053号、米国特許出願公開第2006/0276635号、国際公開第2001/009312号、米国特許出願公開第2017/0043024号、米国特許出願公開第2017/0312367号、米国特許出願公開第2016/0319278号、米国特許出願公開第2017/0369882号、米国特許第8,501,706号、米国特許出願公開第2004/0224405号、米国特許第8,252,755号、米国特許出願公開第2007/0031844号、米国特許出願公開第2007/0039072号、米国特許出願公開第2007/0207974号、米国特許出願公開第2007/0213520号、米国特許出願公開第2007/0213521号、米国特許出願公開第2007/0219362号、米国特許出願公開第2007/0238868号、米国特許出願公開第2014/0148362号、米国特許出願公開第2016/0193242号、米国特許出願公開第2016/01946461号、米国特許出願公開第2016/0201058号、米国特許
出願公開第2016/0201065号、米国特許出願公開第2017/0349904号、米国特許出願公開第2018/0119144号、米国特許第7,834,170号、米国特許第8,090,542号及び米国特許出願公開第2012/0052487号にも広範に記載され、これらの全ては、全ての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。sd-RNAは、Advirna LLC, Worcester, MA, USAからも市販され
ている。sd-RNAの構造、化学、標的位置、配列の優先傾向などを最適化するために独自のアルゴリズムが開発され、sd-RNAの効力予測に利用されている(例えば、米国特許出願公開第20160304873号を参照されたい)。これらの分析に基づいて、機能的sd-RNA配列は、一般に、40%を超える確率において、1μMの濃度で70%を超える発現の低減を有すると定義されている。
ルを必要とせず、従来のsiRNAと比較して向上した薬理を有する、共有結合修飾されたRNAi化合物の新しいクラスである。「自己送達可能なRNA」又は「sd-RNA」は、疎水性修飾されたRNA干渉アンチセンスハイブリッドであり、初代細胞ではインビトロで、局所投与ではインビボで非常に効果的であることが実証されている。毒性のない強力な取り込み及び/又はサイレンシングが実証されている。sd-RNAは、一般に、最小の二本鎖領域を有する、化学的に修飾された非対称の核酸分子である。sd-RNA分子は、典型的には、一本鎖領域及び二本鎖領域を含み、分子の一本鎖領域及び二本鎖領域の両方に様々な化学修飾を含み得る。更に、sd-RNA分子は、本明細書に記載されるように、従来の及び先端的なステロール型分子などの疎水性コンジュゲートに結合させることができる。sd-RNA(及び/又はsd-RNAと同様の方法で利用することができるRNA)及びそのようなsd-RNAを作製するための関連する方法は、例えば、米国特許出願公開第2016/0304873号、国際公開第2010/033246号、国際公開第2017/070151号、国際公開第2009/102427号、国際公開第201/1119887号、国際公開第2010/033247号、国際公開第2009045457号、国際公開第2011/119852号、国際公開第2011/119871号、米国特許出願公開第2011/0263680号、国際公開第2010/033248号、国際公開第2010/078536号、国際公開第2010/090762号、米国特許出願公開第20110039914号、国際公開第2011/109698号、国際公開第2010/090762号、米国特許第8,815,818号、国際公開第2016/094845号、国際公開第2017/193053号、米国特許出願公開第2006/0276635号、国際公開第2001/009312号、米国特許出願公開第2017/0043024号、米国特許出願公開第2017/0312367号、米国特許出願公開第2016/0319278号、米国特許出願公開第2017/0369882号、米国特許第8,501,706号、米国特許出願公開第2004/0224405号、米国特許第8,252,755号、米国特許出願公開第2007/0031844号、米国特許出願公開第2007/0039072号、米国特許出願公開第2007/0207974号、米国特許出願公開第2007/0213520号、米国特許出願公開第2007/0213521号、米国特許出願公開第2007/0219362号、米国特許出願公開第2007/0238868号、米国特許出願公開第2014/0148362号、米国特許出願公開第2016/0193242号、米国特許出願公開第2016/01946461号、米国特許出願公開第2016/0201058号、米国特許
出願公開第2016/0201065号、米国特許出願公開第2017/0349904号、米国特許出願公開第2018/0119144号、米国特許第7,834,170号、米国特許第8,090,542号及び米国特許出願公開第2012/0052487号にも広範に記載され、これらの全ては、全ての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。sd-RNAは、Advirna LLC, Worcester, MA, USAからも市販され
ている。sd-RNAの構造、化学、標的位置、配列の優先傾向などを最適化するために独自のアルゴリズムが開発され、sd-RNAの効力予測に利用されている(例えば、米国特許出願公開第20160304873号を参照されたい)。これらの分析に基づいて、機能的sd-RNA配列は、一般に、40%を超える確率において、1μMの濃度で70%を超える発現の低減を有すると定義されている。
b.sd-RNAオリゴヌクレオチドの構造
[00406] 一部の実施形態において、本発明で使用するための1つ以上のsd-RNA
は、線状二本鎖DNAテンプレートから生成することができる。一部の実施形態において、1つ以上のsd-RNAを生成するための線状二本鎖DNAテンプレートは、米国特許第8,859,229号及び以下で説明されているものである。
[00406] 一部の実施形態において、本発明で使用するための1つ以上のsd-RNA
は、線状二本鎖DNAテンプレートから生成することができる。一部の実施形態において、1つ以上のsd-RNAを生成するための線状二本鎖DNAテンプレートは、米国特許第8,859,229号及び以下で説明されているものである。
[00407] 一部の実施形態において、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によって得られ
、且つmRNAのインビトロ転写に適した線状二本鎖DNAテンプレートは、二本鎖DNAのコード鎖上のRNAポリメラーゼプロモーター、3,000ヌクレオチド長未満であり、且つ真核細胞へのトランスフェクション後にmRNAを検出可能なポリペプチドに翻訳するのに有効なの5’非翻訳領域、ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームであって、ポリペプチドは、トランスフェクトされる細胞に対して異種であり、ポリペプチドは、免疫細胞のリガンド又は受容体、免疫系の機能を刺激又は阻害するポリペプチド及び発癌性ポリペプチドの機能を阻害するポリペプチドからなる群から選択される、オープンリーディングフレーム、真核細胞へのトランスフェクション後にmRNAを検出可能なポリペプチドに翻訳するのに有効な3’非翻訳領域及び二本鎖DNAのコード鎖上の50~5,000ヌクレオチドのポリ(A)ストレッチを5’から3’に含み、ここで、プロモーターは、オープンリーディングフレームに対して異種であり、DNAテンプレートは、DNAベクター内に含有されず、且つポリ(A)ストレッチの3’末端で終了する。一部の実施形態において、RNAポリメラーゼプロモーターは、T7、T3又はSP6 RNAポリメラーゼからなる群から選択されるRNAポリメラーゼのためのコンセンサス結合配列を含む。一部の実施形態において、オープンリーディングフレームは、融合ポリペプチドをコードする。一部の実施形態において、オープンリーディングフレームは、PD-1、TGFBR2、CBLB(CBL-B)、CISH、CCR(キメラ共刺激受容体)、IL-2、IL-12、IL-15、IL-21、NOTCH 1/2 ICD、TIM3、LAG3、TIGIT、TGFβ、CCR2、CCR4、CCR5、CXCR1、CXCR2、CSCR3、CCL2(MCP-1)、CCL3(MIP-1α)、CCL4(MIP1-β)、CCL5(RANTES)、CXCL1/CXCL8、CCL22、CCL17、CXCL1/CXCL8、VHL、CD44、PIK3CD、SOCS1、cAMPプロテインキナーゼA(PKA)及びそれらの組み合わせからなる群から選択されるポリペプチドをコードする。一部の実施形態において、オープンリーディングフレームは、PD-1、LAG-3、TIM-3、CTLA-4、TIGIT、CISH、TGFβR2、PKA、CBLB、BAFF(BR3)からなる群から選択されるポリペプチド及びそれらの組み合わせをコードする。一部の実施形態において、線状二本鎖は、内部リボソーム侵入部位を更に含む。一部の実施形態において、ポリ(A)ストレッチは、300~400ヌクレオチド長である。
、且つmRNAのインビトロ転写に適した線状二本鎖DNAテンプレートは、二本鎖DNAのコード鎖上のRNAポリメラーゼプロモーター、3,000ヌクレオチド長未満であり、且つ真核細胞へのトランスフェクション後にmRNAを検出可能なポリペプチドに翻訳するのに有効なの5’非翻訳領域、ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームであって、ポリペプチドは、トランスフェクトされる細胞に対して異種であり、ポリペプチドは、免疫細胞のリガンド又は受容体、免疫系の機能を刺激又は阻害するポリペプチド及び発癌性ポリペプチドの機能を阻害するポリペプチドからなる群から選択される、オープンリーディングフレーム、真核細胞へのトランスフェクション後にmRNAを検出可能なポリペプチドに翻訳するのに有効な3’非翻訳領域及び二本鎖DNAのコード鎖上の50~5,000ヌクレオチドのポリ(A)ストレッチを5’から3’に含み、ここで、プロモーターは、オープンリーディングフレームに対して異種であり、DNAテンプレートは、DNAベクター内に含有されず、且つポリ(A)ストレッチの3’末端で終了する。一部の実施形態において、RNAポリメラーゼプロモーターは、T7、T3又はSP6 RNAポリメラーゼからなる群から選択されるRNAポリメラーゼのためのコンセンサス結合配列を含む。一部の実施形態において、オープンリーディングフレームは、融合ポリペプチドをコードする。一部の実施形態において、オープンリーディングフレームは、PD-1、TGFBR2、CBLB(CBL-B)、CISH、CCR(キメラ共刺激受容体)、IL-2、IL-12、IL-15、IL-21、NOTCH 1/2 ICD、TIM3、LAG3、TIGIT、TGFβ、CCR2、CCR4、CCR5、CXCR1、CXCR2、CSCR3、CCL2(MCP-1)、CCL3(MIP-1α)、CCL4(MIP1-β)、CCL5(RANTES)、CXCL1/CXCL8、CCL22、CCL17、CXCL1/CXCL8、VHL、CD44、PIK3CD、SOCS1、cAMPプロテインキナーゼA(PKA)及びそれらの組み合わせからなる群から選択されるポリペプチドをコードする。一部の実施形態において、オープンリーディングフレームは、PD-1、LAG-3、TIM-3、CTLA-4、TIGIT、CISH、TGFβR2、PKA、CBLB、BAFF(BR3)からなる群から選択されるポリペプチド及びそれらの組み合わせをコードする。一部の実施形態において、線状二本鎖は、内部リボソーム侵入部位を更に含む。一部の実施形態において、ポリ(A)ストレッチは、300~400ヌクレオチド長である。
[00408] 一部の実施形態において、請求項1の線状二本鎖DNAテンプレートは、5
’から3’に、二本鎖DNAのコード鎖上のRNAポリメラーゼプロモーター、3,00
0ヌクレオチド長未満であり、且つ真核細胞へのトランスフェクション後にmRNAを検出可能なポリペプチドに翻訳するのに有効な5’非翻訳領域、ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームであって、ポリペプチドは、トランスフェクトされる細胞に対して異種であり、ポリペプチドは、免疫細胞のリガンド又は受容体、免疫系の機能を刺激又は阻害するポリペプチド及び発癌性ポリペプチドの機能を阻害するポリペプチドからなる群から選択される、オープンリーディングフレーム、真核細胞へのトランスフェクション後にmRNAを検出可能なポリペプチドに翻訳するのに有効な3’非翻訳領域及び二本鎖DNAのコード鎖上の50~5,000ヌクレオチドのポリ(A)ストレッチからなり、ここで、プロモーターは、オープンリーディングフレームに対して異種であり、DNAテンプレートは、DNAベクター内に含有されず、且つポリ(A)ストレッチの3’末端で終了する。一部の実施形態において、3’非翻訳領域は、少なくとも100ヌクレオチド長である。
’から3’に、二本鎖DNAのコード鎖上のRNAポリメラーゼプロモーター、3,00
0ヌクレオチド長未満であり、且つ真核細胞へのトランスフェクション後にmRNAを検出可能なポリペプチドに翻訳するのに有効な5’非翻訳領域、ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームであって、ポリペプチドは、トランスフェクトされる細胞に対して異種であり、ポリペプチドは、免疫細胞のリガンド又は受容体、免疫系の機能を刺激又は阻害するポリペプチド及び発癌性ポリペプチドの機能を阻害するポリペプチドからなる群から選択される、オープンリーディングフレーム、真核細胞へのトランスフェクション後にmRNAを検出可能なポリペプチドに翻訳するのに有効な3’非翻訳領域及び二本鎖DNAのコード鎖上の50~5,000ヌクレオチドのポリ(A)ストレッチからなり、ここで、プロモーターは、オープンリーディングフレームに対して異種であり、DNAテンプレートは、DNAベクター内に含有されず、且つポリ(A)ストレッチの3’末端で終了する。一部の実施形態において、3’非翻訳領域は、少なくとも100ヌクレオチド長である。
[00409] 一部の実施形態において、本発明は、上記の線状二本鎖DNAテンプレート
を生成する方法を提供し、ここで、方法は、フォワード及びリバースプライマーを生成することを含み、フォワードプライマーは、目的の標的二本鎖DNAの非コード鎖に実質的に相補的な複数のヌクレオチド及びRNAポリメラーゼの結合部位として機能する複数のヌクレオチドを含み、リバースプライマーは、目的の標的二本鎖DNAのコード鎖に実質的に相補的な複数のヌクレオチド及び複数のデオキシチミジンヌクレオチドを含み、線状二本鎖DNAテンプレートを形成するために、フォワードプライマー及びリバースプライマーを使用して、標的DNAのポリメラーゼ連鎖反応増幅を実施する。一部の実施形態において、本発明は、上記の線状二本鎖DNAテンプレートを生成する方法を提供し、ここで、方法は、フォワード及びリバースプライマーを生成することを含み、フォワードプライマーは、目的の標的二本鎖DNAの直接上流のヌクレオチドの領域に実質的に相補的な複数のヌクレオチドを含み、リバースプライマーは、目的の標的二本鎖DNAの直接下流のヌクレオチドの領域に実質的に相補的な複数のヌクレオチドを含み、線状二本鎖DNAテンプレートを形成するために、フォワードプライマー及びリバースプライマーを使用して、標的DNAのポリメラーゼ連鎖反応増幅を実施する。一部の実施形態において、プライマーは、目的の二本鎖DNAの5’及び3’非翻訳領域のヌクレオチドのストレッチに実質的に相補的なヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態において、プライマーは、目的の二本鎖DNAのオープンリーディングフレーム内のヌクレオチドのストレッチに実質的に相補的であるヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態において、プライマーは、目的の二本鎖DNAのオープンリーディングフレーム内のヌクレオチドのストレッチに実質的に相補的であるヌクレオチド配列を含み、ここで、プライマーは、5’及び3’非翻訳領域を含むヌクレオチドのストレッチを更に含み、5’非翻訳領域を含むフォワードプライマーにおけるヌクレオチドのストレッチは、RNAポリメラーゼプロモーターを含むヌクレオチドと、目的の標的二本鎖DNAの非コード鎖に実質的に相補的であるヌクレオチドとの間にあり、3’非翻訳領域を含むリバースプライマーにおけるヌクレオチドのストレッチは、複数のデオキシチミジンヌクレオチドと、目的の標的二本鎖DNAのコード鎖に実質的に相補的なヌクレオチドとの間にある。一部の実施形態において、フォワードプライマー及びオープンリーディングフレームは、コンセンサスコザック配列を含む。
を生成する方法を提供し、ここで、方法は、フォワード及びリバースプライマーを生成することを含み、フォワードプライマーは、目的の標的二本鎖DNAの非コード鎖に実質的に相補的な複数のヌクレオチド及びRNAポリメラーゼの結合部位として機能する複数のヌクレオチドを含み、リバースプライマーは、目的の標的二本鎖DNAのコード鎖に実質的に相補的な複数のヌクレオチド及び複数のデオキシチミジンヌクレオチドを含み、線状二本鎖DNAテンプレートを形成するために、フォワードプライマー及びリバースプライマーを使用して、標的DNAのポリメラーゼ連鎖反応増幅を実施する。一部の実施形態において、本発明は、上記の線状二本鎖DNAテンプレートを生成する方法を提供し、ここで、方法は、フォワード及びリバースプライマーを生成することを含み、フォワードプライマーは、目的の標的二本鎖DNAの直接上流のヌクレオチドの領域に実質的に相補的な複数のヌクレオチドを含み、リバースプライマーは、目的の標的二本鎖DNAの直接下流のヌクレオチドの領域に実質的に相補的な複数のヌクレオチドを含み、線状二本鎖DNAテンプレートを形成するために、フォワードプライマー及びリバースプライマーを使用して、標的DNAのポリメラーゼ連鎖反応増幅を実施する。一部の実施形態において、プライマーは、目的の二本鎖DNAの5’及び3’非翻訳領域のヌクレオチドのストレッチに実質的に相補的なヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態において、プライマーは、目的の二本鎖DNAのオープンリーディングフレーム内のヌクレオチドのストレッチに実質的に相補的であるヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態において、プライマーは、目的の二本鎖DNAのオープンリーディングフレーム内のヌクレオチドのストレッチに実質的に相補的であるヌクレオチド配列を含み、ここで、プライマーは、5’及び3’非翻訳領域を含むヌクレオチドのストレッチを更に含み、5’非翻訳領域を含むフォワードプライマーにおけるヌクレオチドのストレッチは、RNAポリメラーゼプロモーターを含むヌクレオチドと、目的の標的二本鎖DNAの非コード鎖に実質的に相補的であるヌクレオチドとの間にあり、3’非翻訳領域を含むリバースプライマーにおけるヌクレオチドのストレッチは、複数のデオキシチミジンヌクレオチドと、目的の標的二本鎖DNAのコード鎖に実質的に相補的なヌクレオチドとの間にある。一部の実施形態において、フォワードプライマー及びオープンリーディングフレームは、コンセンサスコザック配列を含む。
[00410] 一部の実施形態において、本発明は、線状二本鎖DNAテンプレートからの
インビトロ転写を実施することを含む、細胞のトランスフェクションのための1つ以上のRNAを生成する方法を提供する。一部の実施形態において、方法は、ポリ(A)ポリメラーゼを使用して、1つ以上のアデニンヌクレオチド又はその類似体でRNAのポリ(A)テールを伸長することを更に含む。一部の実施形態において、方法は、転写されたRNAの5’キャップとして機能するヌクレオチドを転写中に付加することを更に含む。一部の実施形態において、RNAは、PD-1、TGFBR2、CBLB(CBL-B)、CISH、CCR(キメラ共刺激受容体)、IL-2、IL-12、IL-15、IL-2
1、NOTCH 1/2 ICD、TIM3、LAG3、TIGIT、TGFβ、CCR2、CCR4、CCR5、CXCR1、CXCR2、CSCR3、CCL2(MCP-1)、CCL3(MIP-1α)、CCL4(MIP1-β)、CCL5(RANTES)、CXCL1/CXCL8、CCL22、CCL17、CXCL1/CXCL8、VHL、CD44、PIK3CD、SOCS1、cAMPプロテインキナーゼA(PKA)及びそれらの組み合わせからなる群から選択されるポリペプチドを標的とする。一部の実施形態において、RNAは、PD-1、LAG-3、TIM-3、CTLA-4、TIGIT、CISH、TGFβR2、PKA、CBLB、BAFF(BR3)及びそれらの組み合わせからなる群から選択されるポリペプチドを標的とする。
インビトロ転写を実施することを含む、細胞のトランスフェクションのための1つ以上のRNAを生成する方法を提供する。一部の実施形態において、方法は、ポリ(A)ポリメラーゼを使用して、1つ以上のアデニンヌクレオチド又はその類似体でRNAのポリ(A)テールを伸長することを更に含む。一部の実施形態において、方法は、転写されたRNAの5’キャップとして機能するヌクレオチドを転写中に付加することを更に含む。一部の実施形態において、RNAは、PD-1、TGFBR2、CBLB(CBL-B)、CISH、CCR(キメラ共刺激受容体)、IL-2、IL-12、IL-15、IL-2
1、NOTCH 1/2 ICD、TIM3、LAG3、TIGIT、TGFβ、CCR2、CCR4、CCR5、CXCR1、CXCR2、CSCR3、CCL2(MCP-1)、CCL3(MIP-1α)、CCL4(MIP1-β)、CCL5(RANTES)、CXCL1/CXCL8、CCL22、CCL17、CXCL1/CXCL8、VHL、CD44、PIK3CD、SOCS1、cAMPプロテインキナーゼA(PKA)及びそれらの組み合わせからなる群から選択されるポリペプチドを標的とする。一部の実施形態において、RNAは、PD-1、LAG-3、TIM-3、CTLA-4、TIGIT、CISH、TGFβR2、PKA、CBLB、BAFF(BR3)及びそれらの組み合わせからなる群から選択されるポリペプチドを標的とする。
[00411] 一部の実施形態において、本発明は、線状二本鎖DNAテンプレートから産
生される、1つ以上のオープンリーディングフレームを含む1つ以上の単離されたRNAの使用を利用する。一部の実施形態において、本発明は、細胞を線状二本鎖DNAテンプレートから産生された1つ以上のRNAと接触させることを含む、細胞において1つ以上のRNAを発現する方法を提供する。一部の実施形態において、RNAは、細胞内でのRNAの別個の発現レベルを提供するために等しくないモル量で存在する。一部の実施形態において、1つ以上のRNAは、PD-1、TGFBR2、CBLB(CBL-B)、CISH、CCR(キメラ共刺激受容体)、IL-2、IL-12、IL-15、IL-21、NOTCH 1/2 ICD、TIM3、LAG3、TIGIT、TGFβ、CCR2、CCR4、CCR5、CXCR1、CXCR2、CSCR3、CCL2(MCP-1)、CCL3(MIP-1α)、CCL4(MIP1-β)、CCL5(RANTES)、CXCL1/CXCL8、CCL22、CCL17、CXCL1/CXCL8、VHL、CD44、PIK3CD、SOCS1、cAMPプロテインキナーゼA(PKA)及びそれらの組み合わせからなる群から選択されるポリペプチドを標的とする。一部の実施形態において、1つ以上のRNAは、PD-1、LAG-3、TIM-3、CTLA-4、TIGIT、CISH、TGFβR2、PKA、CBLB、BAFF(BR3)及びそれらの組み合わせからなる群から選択されるポリペプチドを標的とする。
生される、1つ以上のオープンリーディングフレームを含む1つ以上の単離されたRNAの使用を利用する。一部の実施形態において、本発明は、細胞を線状二本鎖DNAテンプレートから産生された1つ以上のRNAと接触させることを含む、細胞において1つ以上のRNAを発現する方法を提供する。一部の実施形態において、RNAは、細胞内でのRNAの別個の発現レベルを提供するために等しくないモル量で存在する。一部の実施形態において、1つ以上のRNAは、PD-1、TGFBR2、CBLB(CBL-B)、CISH、CCR(キメラ共刺激受容体)、IL-2、IL-12、IL-15、IL-21、NOTCH 1/2 ICD、TIM3、LAG3、TIGIT、TGFβ、CCR2、CCR4、CCR5、CXCR1、CXCR2、CSCR3、CCL2(MCP-1)、CCL3(MIP-1α)、CCL4(MIP1-β)、CCL5(RANTES)、CXCL1/CXCL8、CCL22、CCL17、CXCL1/CXCL8、VHL、CD44、PIK3CD、SOCS1、cAMPプロテインキナーゼA(PKA)及びそれらの組み合わせからなる群から選択されるポリペプチドを標的とする。一部の実施形態において、1つ以上のRNAは、PD-1、LAG-3、TIM-3、CTLA-4、TIGIT、CISH、TGFβR2、PKA、CBLB、BAFF(BR3)及びそれらの組み合わせからなる群から選択されるポリペプチドを標的とする。
(i)非翻訳領域
[00412] 安定性及び/又は翻訳効率を促進する能力を備えた化学構造も使用され得る
。RNAは、好ましくは、5’及び3’UTRを有する。以下の例は、44塩基対の5’UTRをPCRテンプレートに含めることで、6塩基対の5’UTRのみを含むPCRテンプレートと比較して、転写されたCFP RNAの翻訳効率が向上したことを示す。例は、113塩基対の3’UTRを付加することで、11塩基対の3’UTRのみを含むPCRテンプレートと比較して、転写されたGFP RNAの翻訳効率が向上することも示す。一般に、3’UTRの長さは、100ヌクレオチドを超えるため、100ヌクレオチドより長い3’UTRが好ましい。一実施形態において、3’UTR配列は、100~5000ヌクレオチドである。5’UTRの長さは、3’UTRの長さほど重要ではなく、より短いことができる。一実施形態において、5’UTRは、0~3000ヌクレオチド長である。コード領域に付加される5’及び3’UTR配列の長さは、UTRの異なる領域にアニーリングするPCRのためのプライマーの設計を含むが、これに限定されない異なる方法で変更することができる。このアプローチを使用して、当業者は、転写されたRNAのトランスフェクション後に最適な翻訳効率を達成するために必要な5’及び3’UTRの長さを変更することができる。
[00412] 安定性及び/又は翻訳効率を促進する能力を備えた化学構造も使用され得る
。RNAは、好ましくは、5’及び3’UTRを有する。以下の例は、44塩基対の5’UTRをPCRテンプレートに含めることで、6塩基対の5’UTRのみを含むPCRテンプレートと比較して、転写されたCFP RNAの翻訳効率が向上したことを示す。例は、113塩基対の3’UTRを付加することで、11塩基対の3’UTRのみを含むPCRテンプレートと比較して、転写されたGFP RNAの翻訳効率が向上することも示す。一般に、3’UTRの長さは、100ヌクレオチドを超えるため、100ヌクレオチドより長い3’UTRが好ましい。一実施形態において、3’UTR配列は、100~5000ヌクレオチドである。5’UTRの長さは、3’UTRの長さほど重要ではなく、より短いことができる。一実施形態において、5’UTRは、0~3000ヌクレオチド長である。コード領域に付加される5’及び3’UTR配列の長さは、UTRの異なる領域にアニーリングするPCRのためのプライマーの設計を含むが、これに限定されない異なる方法で変更することができる。このアプローチを使用して、当業者は、転写されたRNAのトランスフェクション後に最適な翻訳効率を達成するために必要な5’及び3’UTRの長さを変更することができる。
[00413] 5’及び3’UTRは、天然に存在する、目的の遺伝子に対して内因性の5
’及び3’UTRであり得る。代わりに、目的の遺伝子に対して内因性でないUTR配列は、UTR配列をフォワード及びリバースプライマーに組み込むことにより又はテンプレートの他の変更により付加することができる。目的の遺伝子に対して内因性でないUTR配列の使用は、RNAの安定性及び/又は翻訳効率を変更するのに有用であり得る。例え
ば、3’UTR配列におけるAUが豊富な要素は、mRNAの安定性を低下させ得ることが知られている。したがって、当技術分野で周知のUTRの特性に基づいて、転写されたRNAの安定性を高めるように3’UTRを選択又は設計することができる。
’及び3’UTRであり得る。代わりに、目的の遺伝子に対して内因性でないUTR配列は、UTR配列をフォワード及びリバースプライマーに組み込むことにより又はテンプレートの他の変更により付加することができる。目的の遺伝子に対して内因性でないUTR配列の使用は、RNAの安定性及び/又は翻訳効率を変更するのに有用であり得る。例え
ば、3’UTR配列におけるAUが豊富な要素は、mRNAの安定性を低下させ得ることが知られている。したがって、当技術分野で周知のUTRの特性に基づいて、転写されたRNAの安定性を高めるように3’UTRを選択又は設計することができる。
[00414] 一実施形態において、5’UTRは、内因性遺伝子のコザック配列を含有し
得る。代わりに、目的の遺伝子に対して内因性でない5’UTRが上記のようにPCRによって付加される場合、5’UTR配列を付加することでコンセンサスコザック配列を再設計できる。コザック配列は、一部のRNA転写産物の翻訳効率を高めることができるが、効率的な翻訳を可能にするために全てのRNAに必要であるとは限らないようである。多くのmRNAに対するコザック配列の要件は、当技術分野で公知である。他の実施形態において、5’UTRは、そのRNAゲノムが細胞内で安定しているRNAウイルスに由来し得る。他の実施形態において、mRNAのエキソヌクレアーゼ分解を妨げるために、3’又は5’UTRで様々なヌクレオチド類似体を使用することができる。
得る。代わりに、目的の遺伝子に対して内因性でない5’UTRが上記のようにPCRによって付加される場合、5’UTR配列を付加することでコンセンサスコザック配列を再設計できる。コザック配列は、一部のRNA転写産物の翻訳効率を高めることができるが、効率的な翻訳を可能にするために全てのRNAに必要であるとは限らないようである。多くのmRNAに対するコザック配列の要件は、当技術分野で公知である。他の実施形態において、5’UTRは、そのRNAゲノムが細胞内で安定しているRNAウイルスに由来し得る。他の実施形態において、mRNAのエキソヌクレアーゼ分解を妨げるために、3’又は5’UTRで様々なヌクレオチド類似体を使用することができる。
(ii)RNAポリメラーゼプロモーター
[00415] 遺伝子クローニングを必要とせずにDNAテンプレートからRNAを合成で
きるようにするには、転写される配列の上流のDNAテンプレートに転写のプロモーターが付加されるべきである。バクテリオファージRNAポリメラーゼプロモーター配列は、DNAライゲーションなどの異なる遺伝子工学的方法によってSt UTRに付加され得るか、又は標的DNAに実質的に相補的な配列のフォワードプライマー(5’)に付加され得る。RNAポリメラーゼのプロモーターとして機能する配列がフォワードプライマーの5’末端に付加されると、RNAポリメラーゼプロモーターは、転写されるオープンリーディングフレームの上流のPCR産物に組み込まれる。好ましい一実施形態において、プロモーターは、上記のように、T7ポリメラーゼプロモーターである。他の有用なプロモーターには、T3及びSP6 RNAポリメラーゼプロモーターが含まれるが、これらに限定されない。T7、T3及びSP6プロモーターのコンセンサスヌクレオチド配列は、当技術分野で公知である。
[00415] 遺伝子クローニングを必要とせずにDNAテンプレートからRNAを合成で
きるようにするには、転写される配列の上流のDNAテンプレートに転写のプロモーターが付加されるべきである。バクテリオファージRNAポリメラーゼプロモーター配列は、DNAライゲーションなどの異なる遺伝子工学的方法によってSt UTRに付加され得るか、又は標的DNAに実質的に相補的な配列のフォワードプライマー(5’)に付加され得る。RNAポリメラーゼのプロモーターとして機能する配列がフォワードプライマーの5’末端に付加されると、RNAポリメラーゼプロモーターは、転写されるオープンリーディングフレームの上流のPCR産物に組み込まれる。好ましい一実施形態において、プロモーターは、上記のように、T7ポリメラーゼプロモーターである。他の有用なプロモーターには、T3及びSP6 RNAポリメラーゼプロモーターが含まれるが、これらに限定されない。T7、T3及びSP6プロモーターのコンセンサスヌクレオチド配列は、当技術分野で公知である。
(iii)ポリ(A)テール及び5’キャップ
[00416] 好ましい実施形態において、mRNAは、5’末端のキャップと、細胞内の
リボソーム結合、翻訳開始及び安定性mRNAを決定する3’ポリ(A)テールとの両方を有する。環状DNAテンプレート、例えばプラスミドDNAでは、RNAポリメラーゼは、真核細胞での発現に適さない長いコンカテマー産物を産生する。3’UTRの末端で線状化されたプラスミドDNAの転写は、転写後にポリアデニル化されたとしても真核生物のトランスフェクションに効果的でない通常サイズのmRNAをもたらす。
[00416] 好ましい実施形態において、mRNAは、5’末端のキャップと、細胞内の
リボソーム結合、翻訳開始及び安定性mRNAを決定する3’ポリ(A)テールとの両方を有する。環状DNAテンプレート、例えばプラスミドDNAでは、RNAポリメラーゼは、真核細胞での発現に適さない長いコンカテマー産物を産生する。3’UTRの末端で線状化されたプラスミドDNAの転写は、転写後にポリアデニル化されたとしても真核生物のトランスフェクションに効果的でない通常サイズのmRNAをもたらす。
[00417] 直鎖状DNAテンプレートでは、ファージT7 RNAポリメラーゼは、テ
ンプレートの最後の塩基を超えて転写産物の3’末端を伸長できる(Schenborn及びMierendorf, Nuc. Acids Res., 13:6223-36 (1985);Nacheva及びBerzal-Herranz, Eur. J. Biochem., 270:1485-65 (2003)。これは、ランオフ転写産物が曲がり、続いて第2のDNA鎖とテンプレートが交換されるか、又はRNA自体が転写され(Triana-Alonso et al., J. Biol. Chem., 270:6298-307 (1995);Dunn及びStudier, J. Mol. Biol., 166:477-535
(1983);Arnaud-Barbe et al., Nuc. Acids Res., 26:3550-54 (1998);Macdonald et al., 1993)、次いで逆方向の異常な転写及び二本鎖RNAの蓄積につながり得、これは、遺伝子発現を阻害し得る。DNA線形化自体は、正しい転写に十分でない(Triana-Alonso et al., J. Biol. Chem., 270:6298-307 (1995);Dunn及びStudier, J. Mol. Biol., 166:477-535 (1983);Arnaud-Barbe et al., 1998 Nuc. Acids Res., 26:3550-54 (1998)
;Macdonald et al., J. Mol. Biol., 232:1030-47 (1993);Nakano et al., Biotechnol. Bioeng., 64:194-99 (1999), plasmid DNA linearized downstream of a poly (A/T) stretch of 64-100 nucleotides results in good templates (Saeboe-Larssen et al., J
. Immunol. Meth., 259:191-203 (2002);Boczkowski et al., Cancer Res., 60:1028-34
(2000);Elango et al., Biochem Riophys Res Commun., 330:958-966 2005)。T7
RNAポリメラーゼの内因性終結シグナルは、ステムループ構造に折り畳まれ、続いてウリジン残基の追跡が行われ得る、RNAをコードする(Dunn及びStudier, J. Mol. Biol., 166:477-535 (1983);Arnaud-Barbe et al., 1998 Nuc. Acids Res., 26:3550-54 (1998))。ヘアピンなしでも、合成されたウリジンの追跡は、転写を減弱し得る(Kiyama及びOishi, Nuc. Acids Res., 24:4577-4583 (1996)。ポリ(A/T)ストレッチの下流のプ
ラスミドDNAの線状化は、おそらく潜在的な異常な転写を防ぐ一種の「ダイナミック」ターミネーターを形成すると仮定された:ポリ(A/T)ストレッチ上のRNA転写物の3’伸長及び逆方向の転写は、成長の終結のようなシグナル(伸長されたポリ(U)ストレッチ及びポリ(A/U)ヘアピン)を生成する。その結果、GFP遺伝子の3’アンカー配列及び5’100塩基ストレッチのポリ(T)を使用してリバースPCRプライマーが設計された(図38)。
ンプレートの最後の塩基を超えて転写産物の3’末端を伸長できる(Schenborn及びMierendorf, Nuc. Acids Res., 13:6223-36 (1985);Nacheva及びBerzal-Herranz, Eur. J. Biochem., 270:1485-65 (2003)。これは、ランオフ転写産物が曲がり、続いて第2のDNA鎖とテンプレートが交換されるか、又はRNA自体が転写され(Triana-Alonso et al., J. Biol. Chem., 270:6298-307 (1995);Dunn及びStudier, J. Mol. Biol., 166:477-535
(1983);Arnaud-Barbe et al., Nuc. Acids Res., 26:3550-54 (1998);Macdonald et al., 1993)、次いで逆方向の異常な転写及び二本鎖RNAの蓄積につながり得、これは、遺伝子発現を阻害し得る。DNA線形化自体は、正しい転写に十分でない(Triana-Alonso et al., J. Biol. Chem., 270:6298-307 (1995);Dunn及びStudier, J. Mol. Biol., 166:477-535 (1983);Arnaud-Barbe et al., 1998 Nuc. Acids Res., 26:3550-54 (1998)
;Macdonald et al., J. Mol. Biol., 232:1030-47 (1993);Nakano et al., Biotechnol. Bioeng., 64:194-99 (1999), plasmid DNA linearized downstream of a poly (A/T) stretch of 64-100 nucleotides results in good templates (Saeboe-Larssen et al., J
. Immunol. Meth., 259:191-203 (2002);Boczkowski et al., Cancer Res., 60:1028-34
(2000);Elango et al., Biochem Riophys Res Commun., 330:958-966 2005)。T7
RNAポリメラーゼの内因性終結シグナルは、ステムループ構造に折り畳まれ、続いてウリジン残基の追跡が行われ得る、RNAをコードする(Dunn及びStudier, J. Mol. Biol., 166:477-535 (1983);Arnaud-Barbe et al., 1998 Nuc. Acids Res., 26:3550-54 (1998))。ヘアピンなしでも、合成されたウリジンの追跡は、転写を減弱し得る(Kiyama及びOishi, Nuc. Acids Res., 24:4577-4583 (1996)。ポリ(A/T)ストレッチの下流のプ
ラスミドDNAの線状化は、おそらく潜在的な異常な転写を防ぐ一種の「ダイナミック」ターミネーターを形成すると仮定された:ポリ(A/T)ストレッチ上のRNA転写物の3’伸長及び逆方向の転写は、成長の終結のようなシグナル(伸長されたポリ(U)ストレッチ及びポリ(A/U)ヘアピン)を生成する。その結果、GFP遺伝子の3’アンカー配列及び5’100塩基ストレッチのポリ(T)を使用してリバースPCRプライマーが設計された(図38)。
[00418] DNAテンプレートにポリA/Tストレッチを組み込む従来法は、分子クロ
ーニングである。しかしながら、プラスミドDNAに組み込まれたポリA/T配列は、プラスミドの不安定性を引き起こし得、そのため、細菌細胞から得られたプラスミドDNAテンプレートは、多くの場合、欠失及び他の異常で重度に汚染されている。このため、クローニング手順は面倒で時間がかかるだけでなく、多くの場合、信頼できるものではない。そのため、クローニングせずにポリA/T 3’ストレッチでDNAテンプレートを構築できる方法が非常に望ましい。
ーニングである。しかしながら、プラスミドDNAに組み込まれたポリA/T配列は、プラスミドの不安定性を引き起こし得、そのため、細菌細胞から得られたプラスミドDNAテンプレートは、多くの場合、欠失及び他の異常で重度に汚染されている。このため、クローニング手順は面倒で時間がかかるだけでなく、多くの場合、信頼できるものではない。そのため、クローニングせずにポリA/T 3’ストレッチでDNAテンプレートを構築できる方法が非常に望ましい。
[00419] 転写DNAテンプレートのポリA/Tセグメントは、PCR中、100Tテ
ールなどのpolyTテール(サイズは、50~5000Tであり得る)を含有するリバースプライマーを使用して、又はPCR後、DNAライゲーション若しくはインビトロ組換えを含むが、これらに限定されない他の任意の方法によって産生することができる。ポリ(A)テールは、RNAに安定性も提供し、その分解を減少させる。一般に、ポリ(A)テールの長さは、転写されたRNAの安定性と正の相関がある。一実施形態において、ポリ(A)テールは、100~5000アデノシンである。以下の例は、100塩基対のポリ(A)のストレッチが、RNA転写物の効率的な翻訳を可能にするのに十分であることを示す。
ールなどのpolyTテール(サイズは、50~5000Tであり得る)を含有するリバースプライマーを使用して、又はPCR後、DNAライゲーション若しくはインビトロ組換えを含むが、これらに限定されない他の任意の方法によって産生することができる。ポリ(A)テールは、RNAに安定性も提供し、その分解を減少させる。一般に、ポリ(A)テールの長さは、転写されたRNAの安定性と正の相関がある。一実施形態において、ポリ(A)テールは、100~5000アデノシンである。以下の例は、100塩基対のポリ(A)のストレッチが、RNA転写物の効率的な翻訳を可能にするのに十分であることを示す。
[00420] RNAのポリ(A)テールは、大腸菌(E. coli)ポリAポリメラーゼ(E-PAP)などのポリ(A)ポリメラーゼの使用により、インビトロ転写後に更に伸長できる。以下の例は、poly(A)テールの長さを100ヌクレオチドから300ヌクレオチドから400ヌクレオチドに増加させると、RNAの翻訳効率が約2倍になることを示す。更に、3’末端への異なる化学基の結合により、mRNAの安定性が向上させることができる。そのような結合は、修飾/人工ヌクレオチド、アプタマー及び他の化合物を含み得る。例えば、ATP類似体は、ポリ(A)ポリメラーゼを使用してポリ(A)テールに組み込むことができる。ATP類似体は、RNAの安定性を更に高めることができる。適切なATP類似体には、コルジオシピン及び8-アザアデノシンが含まれるが、これらに限定されない。
[00421] 5’キャップは、RNA分子に安定性を提供することもできる。好ましい実
施形態において、本明細書に開示される方法によって産生されるRNAは、5’キャップを含む。5’キャップは、例えば、m7G(5’)ppp(5’)G、m7G(5’)ppp(5’)A、G(5’)ppp(5’)G又はG(5’)ppp(5’)Aキャップ類似体であり得、これらは、全て市販されている。5’キャップは、アンチリバースキャップ類似体(ARCA)(Stepinski, et al., RNA, 7:1468-95 (2001)を参照されたい)又は任意の他の適切な類似体でもあり得る。5’キャップは、当技術分野で公知であり、
本明細書に記載される技術を使用して提供される(Cougot, et al., Trends in Biochem.
Sci., 29:436-444 (2001);Stepinski, et al., RNA, 7:1468-95 (2001);Elango, et al., Biochim. Biophys. Res. Commun., 330:958-966 (2005))。
施形態において、本明細書に開示される方法によって産生されるRNAは、5’キャップを含む。5’キャップは、例えば、m7G(5’)ppp(5’)G、m7G(5’)ppp(5’)A、G(5’)ppp(5’)G又はG(5’)ppp(5’)Aキャップ類似体であり得、これらは、全て市販されている。5’キャップは、アンチリバースキャップ類似体(ARCA)(Stepinski, et al., RNA, 7:1468-95 (2001)を参照されたい)又は任意の他の適切な類似体でもあり得る。5’キャップは、当技術分野で公知であり、
本明細書に記載される技術を使用して提供される(Cougot, et al., Trends in Biochem.
Sci., 29:436-444 (2001);Stepinski, et al., RNA, 7:1468-95 (2001);Elango, et al., Biochim. Biophys. Res. Commun., 330:958-966 (2005))。
[00422] 本明細書に開示される方法によって産生されるRNAは、内部リボソーム侵
入部位(IRES)配列も含み得る。IRES配列は、キャップに依存しないリボソームのmRNAへの結合を開始し、翻訳の開始を促進するウイルス、染色体又は人工的に設計された任意の配列である。糖、ペプチド、脂質、タンパク質、抗酸化剤及び界面活性剤などの細胞透過性及び生存率を促進する因子を含み得る、細胞エレクトロポレーションに適した任意の溶質が含まれ得る。
入部位(IRES)配列も含み得る。IRES配列は、キャップに依存しないリボソームのmRNAへの結合を開始し、翻訳の開始を促進するウイルス、染色体又は人工的に設計された任意の配列である。糖、ペプチド、脂質、タンパク質、抗酸化剤及び界面活性剤などの細胞透過性及び生存率を促進する因子を含み得る、細胞エレクトロポレーションに適した任意の溶質が含まれ得る。
[00423] 一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、標的遺
伝子の発現において、70%の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、標的遺伝子の発現において、75%の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、標的遺伝子の発現において、80%の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、標的遺伝子の発現において、85%の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、標的遺伝子の発現において、90%の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、標的遺伝子の発現において、95%の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、標的遺伝子の発現において、99%の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約0.25μM~約10μMの濃度、一部の実施形態では約0.25μM~約4μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約0.25μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約0.5μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約0.75μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約1.0μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約1.25μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約1.5μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約1.75μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約2.0μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約2.25μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約2.5μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約2.75μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約3.0μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約3.25μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約3.5μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約3.75μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約4.0μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約5.0μMの濃度で送達された場合
、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約6.0μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約7.0μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約8.0μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約9.0μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約10.0μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約0.25μM~約10μM/10,000TIL又は約0.25μM~約4μM/10,000TILの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約0.25μM/10,000TILの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約0.5μM/10,000TILの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約0.75μM/10,000TILの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約1.0μM/10,000TILの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約1.25μM/10,000TILの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約1.5μM/10,000TILの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約1.75μM/10,000TILの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約2.0μM/10,000TILの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約2.25μM/10,000TILの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約2.5μM/10,000TILの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約2.75μM/10,000TILの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約3.0μM/10,000TILの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約3.25μM/10,000TILの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約3.5μM/10,000TILの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約3.75μM/10,000TILの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約4.0μM/10,000TILの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約5.0μM/10,000TILの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約6.0μM/10,000TILの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約7.0μM/10,000TILの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約8.0μM/10,000TILの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約9.0μM/10,000TILの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減
を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約10.0μM/10,000TILの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約0.25μM/10,000TIL/100μL培地の濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約0.5μM/10,000TIL/100μL培地の濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約0.75μM/10,000TIL/100μL培地の濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約1.0μM/10,000TIL/100μL媒体の濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約1.25μM/10,000TIL/100μL培地の濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約1.5μM/10,000TIL/100μL培地の濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約1.75μM/10,000TIL/100μL培地の濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約2.0μM/10,000TIL/100μL培地の濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約2.25μM/10,000TIL/100μL培地の濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約2.5μM/10,000TIL/100μL培地の濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約2.75μM/10,000TIL/100μL培地の濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約3.0μM/10,000TIL/100μL培地の濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約3.25μM/10,000TIL/100μL培地の濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約3.5μM/10,000TIL/100μL培地の濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約3.75μM/10,000TIL/100μL培地の濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約4.0μM/10,000TIL/100μL培地の濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約5.0μM/10,000TIL/100μL培地の濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約6.0μM/10,000TIL/100μL培地の濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示
す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約7.0μM/10,000TIL/100μL培地の濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約8.0μM/10,000TIL/100μL培地の濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約9.0μM/10,000TIL/100μL培地の濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約10.0μM/10,000TIL/100μL培地の濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。
伝子の発現において、70%の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、標的遺伝子の発現において、75%の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、標的遺伝子の発現において、80%の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、標的遺伝子の発現において、85%の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、標的遺伝子の発現において、90%の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、標的遺伝子の発現において、95%の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、標的遺伝子の発現において、99%の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約0.25μM~約10μMの濃度、一部の実施形態では約0.25μM~約4μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約0.25μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約0.5μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約0.75μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約1.0μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約1.25μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約1.5μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約1.75μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約2.0μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約2.25μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約2.5μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約2.75μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約3.0μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約3.25μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約3.5μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約3.75μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約4.0μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約5.0μMの濃度で送達された場合
、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約6.0μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約7.0μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約8.0μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約9.0μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約10.0μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約0.25μM~約10μM/10,000TIL又は約0.25μM~約4μM/10,000TILの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約0.25μM/10,000TILの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約0.5μM/10,000TILの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約0.75μM/10,000TILの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約1.0μM/10,000TILの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約1.25μM/10,000TILの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約1.5μM/10,000TILの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約1.75μM/10,000TILの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約2.0μM/10,000TILの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約2.25μM/10,000TILの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約2.5μM/10,000TILの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約2.75μM/10,000TILの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約3.0μM/10,000TILの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約3.25μM/10,000TILの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約3.5μM/10,000TILの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約3.75μM/10,000TILの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約4.0μM/10,000TILの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約5.0μM/10,000TILの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約6.0μM/10,000TILの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約7.0μM/10,000TILの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約8.0μM/10,000TILの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約9.0μM/10,000TILの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減
を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約10.0μM/10,000TILの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約0.25μM/10,000TIL/100μL培地の濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約0.5μM/10,000TIL/100μL培地の濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約0.75μM/10,000TIL/100μL培地の濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約1.0μM/10,000TIL/100μL媒体の濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約1.25μM/10,000TIL/100μL培地の濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約1.5μM/10,000TIL/100μL培地の濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約1.75μM/10,000TIL/100μL培地の濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約2.0μM/10,000TIL/100μL培地の濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約2.25μM/10,000TIL/100μL培地の濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約2.5μM/10,000TIL/100μL培地の濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約2.75μM/10,000TIL/100μL培地の濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約3.0μM/10,000TIL/100μL培地の濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約3.25μM/10,000TIL/100μL培地の濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約3.5μM/10,000TIL/100μL培地の濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約3.75μM/10,000TIL/100μL培地の濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約4.0μM/10,000TIL/100μL培地の濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約5.0μM/10,000TIL/100μL培地の濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約6.0μM/10,000TIL/100μL培地の濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示
す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約7.0μM/10,000TIL/100μL培地の濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約8.0μM/10,000TIL/100μL培地の濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約9.0μM/10,000TIL/100μL培地の濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約10.0μM/10,000TIL/100μL培地の濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。
c.sd-RNA修飾
[00424] 一部の実施形態において、オリゴヌクレオチド剤は、治療剤の安定性及び/
又は有効性を増加させ、処置される細胞又は組織へのオリゴヌクレオチドの効率的な送達をもたらすための1つ以上の修飾を含む。そのような修飾は、2’-O-メチル修飾、2’-O-フルオロ修飾、ジホスホロチオエート修飾、2’F修飾ヌクレオチド、2’-O-メチル修飾及び/又は2’デオキシヌクレオチドを含み得る。一部の実施形態において、オリゴヌクレオチドは、例えば、ステロール、コレステロール、ビタミンD、ナフチル、イソブチル、ベンジル、インドール、トリプトファン及び/又はフェニルを含む1つ以上の疎水性修飾を含むように修飾される。更なる特定の実施形態において、化学修飾されたヌクレオチドは、ホスホロチオエート、2’-O-メチル、2’デオキシ、疎水性修飾及びホスホロチオエートの組み合わせである。一部の実施形態において、糖は、修飾され得、修飾された糖は、D-リボース、2’-O-アルキル(2’-O-メチル及び2’-O-エチルを含む)、即ち2’-アルコキシ、2’-アミノ、2’-S-アルキル、2’-ハロ(2’-フルオロを含む)、T-メトキシエトキシ、2’-アリルオキシ(-OCH2CH=CH2)、2’-プロパルギル、2’-プロピル、エチニル、エテニル、プロペニル及びシアノなどを含み得るが、これらに限定されない。一実施形態において、糖部分は、ヘキソースであり得、記載されるようにオリゴヌクレオチドに組み込まれる(Augustyns, K., et al., Nucl. Acids. Res., 18:4711 (1992))。
[00424] 一部の実施形態において、オリゴヌクレオチド剤は、治療剤の安定性及び/
又は有効性を増加させ、処置される細胞又は組織へのオリゴヌクレオチドの効率的な送達をもたらすための1つ以上の修飾を含む。そのような修飾は、2’-O-メチル修飾、2’-O-フルオロ修飾、ジホスホロチオエート修飾、2’F修飾ヌクレオチド、2’-O-メチル修飾及び/又は2’デオキシヌクレオチドを含み得る。一部の実施形態において、オリゴヌクレオチドは、例えば、ステロール、コレステロール、ビタミンD、ナフチル、イソブチル、ベンジル、インドール、トリプトファン及び/又はフェニルを含む1つ以上の疎水性修飾を含むように修飾される。更なる特定の実施形態において、化学修飾されたヌクレオチドは、ホスホロチオエート、2’-O-メチル、2’デオキシ、疎水性修飾及びホスホロチオエートの組み合わせである。一部の実施形態において、糖は、修飾され得、修飾された糖は、D-リボース、2’-O-アルキル(2’-O-メチル及び2’-O-エチルを含む)、即ち2’-アルコキシ、2’-アミノ、2’-S-アルキル、2’-ハロ(2’-フルオロを含む)、T-メトキシエトキシ、2’-アリルオキシ(-OCH2CH=CH2)、2’-プロパルギル、2’-プロピル、エチニル、エテニル、プロペニル及びシアノなどを含み得るが、これらに限定されない。一実施形態において、糖部分は、ヘキソースであり得、記載されるようにオリゴヌクレオチドに組み込まれる(Augustyns, K., et al., Nucl. Acids. Res., 18:4711 (1992))。
[00425] 一部の実施液体において、本発明の二本鎖オリゴヌクレオチドは、その全長
にわたって二本鎖である、即ち分子のいずれかの末端にオーバーハングする一本鎖配列を有しない、即ち平滑末端である。一部の実施形態において、個々の核酸分子は、異なる長さであり得る。換言すれば、本発明の二本鎖オリゴヌクレオチドは、その全長にわたって二本鎖ではない。例えば、2つの別個の核酸分子が使用される場合、分子の1つ、例えばアンチセンス配列を含む第1の分子は、それにハイブリダイズする第2の分子より長いものであり得る(分子の一部が一本鎖のまま残る)。一部の実施形態において、単一の核酸分子が使用される場合、いずれかの末端の分子の一部は、一本鎖のままであり得る。
にわたって二本鎖である、即ち分子のいずれかの末端にオーバーハングする一本鎖配列を有しない、即ち平滑末端である。一部の実施形態において、個々の核酸分子は、異なる長さであり得る。換言すれば、本発明の二本鎖オリゴヌクレオチドは、その全長にわたって二本鎖ではない。例えば、2つの別個の核酸分子が使用される場合、分子の1つ、例えばアンチセンス配列を含む第1の分子は、それにハイブリダイズする第2の分子より長いものであり得る(分子の一部が一本鎖のまま残る)。一部の実施形態において、単一の核酸分子が使用される場合、いずれかの末端の分子の一部は、一本鎖のままであり得る。
[00426] 一部の実施形態において、本発明の二本鎖オリゴヌクレオチドは、ミスマッ
チ及び/又はループ又はバルジを含有するが、オリゴヌクレオチドの長さの少なくとも約70%にわたって二本鎖である。一部の実施形態において、本発明の二本鎖オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの長さの少なくとも約80%にわたって二本鎖である。別の実施形態において、本発明の二本鎖オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの長さの少なくとも約90~95%にわたって二本鎖である。一部の実施形態において、本発明の二本鎖オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの長さの少なくとも約96~98%にわたって二本鎖である。一部の実施形態において、本発明の二本鎖オリゴヌクレオチドは、少なくとも又は最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14又は15のミスマッチを含有する。
チ及び/又はループ又はバルジを含有するが、オリゴヌクレオチドの長さの少なくとも約70%にわたって二本鎖である。一部の実施形態において、本発明の二本鎖オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの長さの少なくとも約80%にわたって二本鎖である。別の実施形態において、本発明の二本鎖オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの長さの少なくとも約90~95%にわたって二本鎖である。一部の実施形態において、本発明の二本鎖オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの長さの少なくとも約96~98%にわたって二本鎖である。一部の実施形態において、本発明の二本鎖オリゴヌクレオチドは、少なくとも又は最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14又は15のミスマッチを含有する。
[00427] 一部の実施形態において、オリゴヌクレオチドは、例えば、3’又は5’結
合を修飾することにより、ヌクレアーゼから実質的に保護され得る(例えば、米国特許第5,849,902号及び国際公開第98/13526号)。例えば、オリゴヌクレオチドは、「ブロッキング基」を含めることによって耐性とすることができる。本明細書で使用される「ブロッキング基」という用語は、合成のための保護基又はカップリング基のいずれかとして、オリゴヌクレオチド又はヌクレオモノマーに結合することができる置換基(例えば、OH基以外)を指す(例えば、FITC、プロピル(CH2-CH2-CH3)、グリコール(-O-CH2-CH2-O-)リン酸(PO3 2+)、ホスホン酸水素又はホスホルアミダイト)。「ブロッキング基」は、修飾ヌクレオチド及び非ヌクレオチドエキソヌクレアーゼ耐性構造を含む、オリゴヌクレオチドの5’及び3’末端を保護する「末端ブロッキング基」又は「エキソヌクレアーゼブロッキング基」も含み得る。
合を修飾することにより、ヌクレアーゼから実質的に保護され得る(例えば、米国特許第5,849,902号及び国際公開第98/13526号)。例えば、オリゴヌクレオチドは、「ブロッキング基」を含めることによって耐性とすることができる。本明細書で使用される「ブロッキング基」という用語は、合成のための保護基又はカップリング基のいずれかとして、オリゴヌクレオチド又はヌクレオモノマーに結合することができる置換基(例えば、OH基以外)を指す(例えば、FITC、プロピル(CH2-CH2-CH3)、グリコール(-O-CH2-CH2-O-)リン酸(PO3 2+)、ホスホン酸水素又はホスホルアミダイト)。「ブロッキング基」は、修飾ヌクレオチド及び非ヌクレオチドエキソヌクレアーゼ耐性構造を含む、オリゴヌクレオチドの5’及び3’末端を保護する「末端ブロッキング基」又は「エキソヌクレアーゼブロッキング基」も含み得る。
[00428] 一部の実施形態において、sd-RNA内の隣接するポリヌクレオチドの少
なくとも一部は、置換結合、例えばホスホロチオエート結合によって結合される。
なくとも一部は、置換結合、例えばホスホロチオエート結合によって結合される。
[00429] 一部の実施形態において、化学修飾は、少なくとも1.5、2、3、4、5
、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150、155、160、165、170、175、180、185、190、195、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500の細胞取り込みの強化を導く。一部の実施形態において、C又はU残基の少なくとも1つは、疎水性修飾を含む。一部の実施形態において、複数のC及びUが疎水性修飾を含む。一部の実施形態において、C及びUの少なくとも10%、15%、20%、30%、40%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%又は少なくとも95%が疎水性修飾を含み得る。一部の実施形態において、C及びUの全てが疎水性修飾を含む。
、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150、155、160、165、170、175、180、185、190、195、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500の細胞取り込みの強化を導く。一部の実施形態において、C又はU残基の少なくとも1つは、疎水性修飾を含む。一部の実施形態において、複数のC及びUが疎水性修飾を含む。一部の実施形態において、C及びUの少なくとも10%、15%、20%、30%、40%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%又は少なくとも95%が疎水性修飾を含み得る。一部の実施形態において、C及びUの全てが疎水性修飾を含む。
[00430] 一部の実施形態において、sd-RNA又はsd-rxRNAは、プロトン
化可能なアミンの組み込みにより、sd-rxRNA分子のエンドソーム放出の増強を示す。一部の実施形態において、プロトン化可能なアミンは、センス鎖に組み込まれる(RISC充填後に廃棄される分子の部分において)。一部の実施形態において、本発明のsd-RNA化合物は、二重鎖領域(長さが10~15塩基の効率的なRISCエントリーに必要)及び4~12ヌクレオチド長の一本鎖領域と、13ヌクレオチドの二重鎖とを含む非対称化合物を含む。一部の実施形態において、6ヌクレオチドの一本鎖領域が使用される。一部の実施形態において、sd-RNAの一本鎖領域は、2~12個のホスホロチオエートヌクレオチド間結合(ホスホロチオエート修飾と称される)を含む。一部の実施形態において、6~8個のホスホロチオエートヌクレオチド間結合が使用される。一部の実施形態において、本発明のsd-RNA化合物は、ユニークな化学修飾パターンも含み、これは、安定性を提供し、RISCエントリーと適合性である。
化可能なアミンの組み込みにより、sd-rxRNA分子のエンドソーム放出の増強を示す。一部の実施形態において、プロトン化可能なアミンは、センス鎖に組み込まれる(RISC充填後に廃棄される分子の部分において)。一部の実施形態において、本発明のsd-RNA化合物は、二重鎖領域(長さが10~15塩基の効率的なRISCエントリーに必要)及び4~12ヌクレオチド長の一本鎖領域と、13ヌクレオチドの二重鎖とを含む非対称化合物を含む。一部の実施形態において、6ヌクレオチドの一本鎖領域が使用される。一部の実施形態において、sd-RNAの一本鎖領域は、2~12個のホスホロチオエートヌクレオチド間結合(ホスホロチオエート修飾と称される)を含む。一部の実施形態において、6~8個のホスホロチオエートヌクレオチド間結合が使用される。一部の実施形態において、本発明のsd-RNA化合物は、ユニークな化学修飾パターンも含み、これは、安定性を提供し、RISCエントリーと適合性である。
[00431] 例えば、ガイド鎖は、RISCエントリーに干渉することなく安定性を確認
する任意の化学修飾によっても修飾され得る。一部の実施形態において、ガイド鎖における化学修飾パターンは、2’F修飾されているC及びUヌクレオチドの大部分と、リン酸化されている5’末端とを含む。
する任意の化学修飾によっても修飾され得る。一部の実施形態において、ガイド鎖における化学修飾パターンは、2’F修飾されているC及びUヌクレオチドの大部分と、リン酸化されている5’末端とを含む。
[00432] 一部の実施形態において、sd-RNA又はsd-rxRNAのヌクレオチ
ドの少なくとも30%が修飾されている。一部の実施形態において、sd-RNA又はsd-rxRNAのヌクレオチドの少なくとも30%、31%、32%、33%、34%、35%、36%、37%、38%、39%、40%、41%、42%、43%、44%、45%、46%、47%、48%、49%、50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%又は99%が修飾されている。一部の実施形態において、sd-RNA又はsd-rxRNAのヌクレオチドの100%が修飾されている。
ドの少なくとも30%が修飾されている。一部の実施形態において、sd-RNA又はsd-rxRNAのヌクレオチドの少なくとも30%、31%、32%、33%、34%、35%、36%、37%、38%、39%、40%、41%、42%、43%、44%、45%、46%、47%、48%、49%、50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%又は99%が修飾されている。一部の実施形態において、sd-RNA又はsd-rxRNAのヌクレオチドの100%が修飾されている。
[00433] 一部の実施形態において、sd-RNA分子は、最小の二本鎖領域を有する
。一部の実施形態において、二本鎖である分子の領域は、8~15ヌクレオチド長の範囲である。一部の実施形態において、二本鎖である分子の領域は、8、9、10、11、1
2、13、14又は15ヌクレオチド長である。一部の実施形態において、二本鎖領域は、13ヌクレオチド長である。ガイド鎖とパッセンジャー鎖との間に100%の相補性があり得、ガイド鎖とパッセンジャー鎖との間に1つ以上のミスマッチがあり得る。一部の実施形態において、二本鎖分子の1つの末端において、分子は、平滑末端であるか、又は1ヌクレオチドのオーバーハングを有する。分子の一本鎖領域は、一部の実施形態において、4~12ヌクレオチド長である。一部の実施形態において、一本鎖領域は、4、5、6、7、8、9、10、11又は12ヌクレオチド長であり得る。一部の実施形態において、一本鎖領域は、4ヌクレオチド長未満又は12ヌクレオチド長超でもあり得る。特定の実施形態において、一本鎖領域は、6又は7ヌクレオチド長である。
。一部の実施形態において、二本鎖である分子の領域は、8~15ヌクレオチド長の範囲である。一部の実施形態において、二本鎖である分子の領域は、8、9、10、11、1
2、13、14又は15ヌクレオチド長である。一部の実施形態において、二本鎖領域は、13ヌクレオチド長である。ガイド鎖とパッセンジャー鎖との間に100%の相補性があり得、ガイド鎖とパッセンジャー鎖との間に1つ以上のミスマッチがあり得る。一部の実施形態において、二本鎖分子の1つの末端において、分子は、平滑末端であるか、又は1ヌクレオチドのオーバーハングを有する。分子の一本鎖領域は、一部の実施形態において、4~12ヌクレオチド長である。一部の実施形態において、一本鎖領域は、4、5、6、7、8、9、10、11又は12ヌクレオチド長であり得る。一部の実施形態において、一本鎖領域は、4ヌクレオチド長未満又は12ヌクレオチド長超でもあり得る。特定の実施形態において、一本鎖領域は、6又は7ヌクレオチド長である。
[00434] 一部の実施形態において、sd-RNA分子は、増加した安定性を有する。
一部の場合、化学修飾されたsd-RNA又はsd-rxRNA分子は、任意の中間値を含む、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24時間又は24時間を超える培地中での半減期を有する。一部の実施形態において、sd-rxRNAは、12時間より長い培地中での半減期を有する。
一部の場合、化学修飾されたsd-RNA又はsd-rxRNA分子は、任意の中間値を含む、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24時間又は24時間を超える培地中での半減期を有する。一部の実施形態において、sd-rxRNAは、12時間より長い培地中での半減期を有する。
[00435] 一部の実施形態において、sd-RNAは、効力の増加及び/又は毒性の低
下のために最適化される。一部の実施形態において、ガイド及び/又はパッセンジャー鎖のヌクレオチド長及び/又はガイド及び/又はパッセンジャー鎖におけるホスホロチオエート修飾の数は、一部の態様において、RNA分子の効力に影響を与えることができる一方、2’-フルオロ(2’F)修飾の2’-O-メチル(2’OMe)修飾による置換は、一部の態様において、分子の毒性に影響を与えることができる。一部の実施形態において、分子の2’F含有量の低減は、分子の毒性を低減すると予測される。一部の実施形態において、RNA分子におけるホスホロチオエート修飾の数は、細胞への分子の取り込み、例えば細胞への分子の受動的取り込みの効率に影響を及ぼし得る。一部の実施形態において、sd-RNAは2’F修飾を有しないが、細胞取り込み及び組織浸透において同等の効力を特徴とする。
下のために最適化される。一部の実施形態において、ガイド及び/又はパッセンジャー鎖のヌクレオチド長及び/又はガイド及び/又はパッセンジャー鎖におけるホスホロチオエート修飾の数は、一部の態様において、RNA分子の効力に影響を与えることができる一方、2’-フルオロ(2’F)修飾の2’-O-メチル(2’OMe)修飾による置換は、一部の態様において、分子の毒性に影響を与えることができる。一部の実施形態において、分子の2’F含有量の低減は、分子の毒性を低減すると予測される。一部の実施形態において、RNA分子におけるホスホロチオエート修飾の数は、細胞への分子の取り込み、例えば細胞への分子の受動的取り込みの効率に影響を及ぼし得る。一部の実施形態において、sd-RNAは2’F修飾を有しないが、細胞取り込み及び組織浸透において同等の効力を特徴とする。
[00436] 一部の実施形態において、ガイド鎖は、長さがおよそ18~19ヌクレオチ
ドであり、およそ2~14個のリン酸修飾を有する。例えば、ガイド鎖は、リン酸修飾された2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14又は14を超えるヌクレオチドを含み得る。ガイド鎖は、RISCエントリーに干渉することなく安定性の向上を付与する1つ以上の修飾を含み得る。ホスホロチオエート修飾ヌクレオチドなどのリン酸修飾ヌクレオチドは、3’末端、5’末端にあるか、又はガイド鎖全体に広がっている。一部の実施形態において、ガイド鎖の3’末端の10ヌクレオチドは、1、2、3、4、5、6、7、8、9又は10個のホスホロチオエート修飾ヌクレオチドを含む。ガイド鎖は、2’F及び/又は2’OMe修飾も含むことができ、これは、分子全体に位置し得る。一部の実施形態において、ガイド鎖の1位のヌクレオチド(ガイド鎖の最も5’位のヌクレオチド)は、2’OMe修飾及び/又はリン酸化されている。ガイド鎖内のC及びUヌクレオチドは、2’F修飾され得る。例えば、19ntガイド鎖の2~10位(又は異なる長さのガイド鎖の対応する位置)のC及びUヌクレオチドは、2’F修飾され得る。ガイド鎖内のC及びUヌクレオチドも2’OMe修飾することができる。例えば、19ntガイド鎖の11~18位(又は異なる長さのガイド鎖の対応する位置)のC及びUヌクレオチドは、2’OMe修飾され得る。一部の実施形態において、ガイド鎖の最も3’末端のヌクレオチドは、修飾されていない。特定の実施形態において、ガイド鎖内のC及びUの大部分は、2’F修飾されており、ガイド鎖の5’末端は、リン酸化されている。他の実施形態において、1位及び11~18位のC又はUは、2’OMe修飾されており、ガイド鎖の5’末端は、リン酸化されている。他の実施形態において、1位及び11~18位のC又はUは、2’OMe修飾されており、ガイド鎖の5’末端は、リン酸化
されており、2~10位のC又はU、は2’F修飾されている。
ドであり、およそ2~14個のリン酸修飾を有する。例えば、ガイド鎖は、リン酸修飾された2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14又は14を超えるヌクレオチドを含み得る。ガイド鎖は、RISCエントリーに干渉することなく安定性の向上を付与する1つ以上の修飾を含み得る。ホスホロチオエート修飾ヌクレオチドなどのリン酸修飾ヌクレオチドは、3’末端、5’末端にあるか、又はガイド鎖全体に広がっている。一部の実施形態において、ガイド鎖の3’末端の10ヌクレオチドは、1、2、3、4、5、6、7、8、9又は10個のホスホロチオエート修飾ヌクレオチドを含む。ガイド鎖は、2’F及び/又は2’OMe修飾も含むことができ、これは、分子全体に位置し得る。一部の実施形態において、ガイド鎖の1位のヌクレオチド(ガイド鎖の最も5’位のヌクレオチド)は、2’OMe修飾及び/又はリン酸化されている。ガイド鎖内のC及びUヌクレオチドは、2’F修飾され得る。例えば、19ntガイド鎖の2~10位(又は異なる長さのガイド鎖の対応する位置)のC及びUヌクレオチドは、2’F修飾され得る。ガイド鎖内のC及びUヌクレオチドも2’OMe修飾することができる。例えば、19ntガイド鎖の11~18位(又は異なる長さのガイド鎖の対応する位置)のC及びUヌクレオチドは、2’OMe修飾され得る。一部の実施形態において、ガイド鎖の最も3’末端のヌクレオチドは、修飾されていない。特定の実施形態において、ガイド鎖内のC及びUの大部分は、2’F修飾されており、ガイド鎖の5’末端は、リン酸化されている。他の実施形態において、1位及び11~18位のC又はUは、2’OMe修飾されており、ガイド鎖の5’末端は、リン酸化されている。他の実施形態において、1位及び11~18位のC又はUは、2’OMe修飾されており、ガイド鎖の5’末端は、リン酸化
されており、2~10位のC又はU、は2’F修飾されている。
d.sd-RNAの送達
[00437] 自己送達可能なRNAi技術は、追加の製剤又は技術を必要とすることなく
、RNAi剤で細胞を直接トランスフェクションする方法を提供する。トランスフェクションが困難な細胞株をトランスフェクトする能力、高いインビボ活性及び使用の単純さは、従来のsiRNAベースの手法に比べて有意な機能的利点を提供する組成物及び方法の特徴であり、したがって、sd-RNA法は、本発明のTILにおける標的遺伝子の発現を低減する方法に関するいくつかの実施形態において使用される。sd-RNAi法により、化学合成された化合物をエクスビボ及びインビボの両方で広範な初代細胞及び組織に直接送達することが可能となる。本明細書の本発明の一部の実施形態に記載されているsd-RNAは、Advirna LLC, Worcester, MA, USAから市販されている。
[00437] 自己送達可能なRNAi技術は、追加の製剤又は技術を必要とすることなく
、RNAi剤で細胞を直接トランスフェクションする方法を提供する。トランスフェクションが困難な細胞株をトランスフェクトする能力、高いインビボ活性及び使用の単純さは、従来のsiRNAベースの手法に比べて有意な機能的利点を提供する組成物及び方法の特徴であり、したがって、sd-RNA法は、本発明のTILにおける標的遺伝子の発現を低減する方法に関するいくつかの実施形態において使用される。sd-RNAi法により、化学合成された化合物をエクスビボ及びインビボの両方で広範な初代細胞及び組織に直接送達することが可能となる。本明細書の本発明の一部の実施形態に記載されているsd-RNAは、Advirna LLC, Worcester, MA, USAから市販されている。
[00438] sd-RNAの一般的な構造は、図36に示される。sd-RNAは、疎水
的に修飾されたsiRNA-アンチセンスオリゴヌクレオチドハイブリッド構造として形成され、例えば全体として参照により本明細書に組み込まれるByrne et al., December 2013, J. Ocular Pharmacology and Therapeutics, 29(10):855-864に開示される。
的に修飾されたsiRNA-アンチセンスオリゴヌクレオチドハイブリッド構造として形成され、例えば全体として参照により本明細書に組み込まれるByrne et al., December 2013, J. Ocular Pharmacology and Therapeutics, 29(10):855-864に開示される。
[00439] 一部の実施形態において、sd-RNAオリゴヌクレオチドは、無菌エレク
トロポレーションを使用して、本明細書に記載されるTILに送達することができる。
トロポレーションを使用して、本明細書に記載されるTILに送達することができる。
[00440] 一部の実施形態において、オリゴヌクレオチドは、膜貫通送達システムと組
み合わせて細胞に送達することができる。一部の実施形態において、この膜貫通送達システムは、脂質、ウイルスベクターなどを含む。一部の実施形態において、オリゴヌクレオチド剤は、いかなる送達剤も必要としない自己送達RNAi剤である。
み合わせて細胞に送達することができる。一部の実施形態において、この膜貫通送達システムは、脂質、ウイルスベクターなどを含む。一部の実施形態において、オリゴヌクレオチド剤は、いかなる送達剤も必要としない自己送達RNAi剤である。
[00441] 実施形態において、本明細書に記載されるRNA又はsd-RNAなどのオ
リゴヌクレオチドは、異なる方法、例えばエレクトロポレーション(Amaxa Nucleofector-II (Amaxa Biosystems、Cologne、ドイツ)、(ECM 830(BTX)(Harvard Instruments、Boston、MA)、Neon(商標)トランスフェクションシステム(ThermoFisher Scientific、Waltham、MAから市販)及び/又はGene Pulser II(BioRad、Denver、CO)、Multiporator(Eppendort、Hamburg、ドイツ)、リポフェクション、ポリマーカプセル化、ペプチド媒介トランスフェクションを使用したカチオン性リポソーム媒介トランスフェクション又は「遺伝子銃」などの微粒子銃粒子送達システム(例えば、全体として参照により本明細書に組み込まれるNishikawa, et al. Hum Gene Ther., 12(8):861-70 (2001)を参照さ
れたい)を含むが、これらに限定されない市販の方法を使用して標的細胞に導入することができる。米国特許第8,859,229号、米国特許出願公開第2016/0230188号及びAmaxa Nucleofector(登録商標)IIマニュアル(ウェブサイトhttp://icob.sinica.edu.tw/pubweb/bio-chem/Core%20Facilities/Data/R401-core/Nucleofector_Manual_II_Apr06.pdfで入手可能)も参照されたい。
リゴヌクレオチドは、異なる方法、例えばエレクトロポレーション(Amaxa Nucleofector-II (Amaxa Biosystems、Cologne、ドイツ)、(ECM 830(BTX)(Harvard Instruments、Boston、MA)、Neon(商標)トランスフェクションシステム(ThermoFisher Scientific、Waltham、MAから市販)及び/又はGene Pulser II(BioRad、Denver、CO)、Multiporator(Eppendort、Hamburg、ドイツ)、リポフェクション、ポリマーカプセル化、ペプチド媒介トランスフェクションを使用したカチオン性リポソーム媒介トランスフェクション又は「遺伝子銃」などの微粒子銃粒子送達システム(例えば、全体として参照により本明細書に組み込まれるNishikawa, et al. Hum Gene Ther., 12(8):861-70 (2001)を参照さ
れたい)を含むが、これらに限定されない市販の方法を使用して標的細胞に導入することができる。米国特許第8,859,229号、米国特許出願公開第2016/0230188号及びAmaxa Nucleofector(登録商標)IIマニュアル(ウェブサイトhttp://icob.sinica.edu.tw/pubweb/bio-chem/Core%20Facilities/Data/R401-core/Nucleofector_Manual_II_Apr06.pdfで入手可能)も参照されたい。
[00442] 一部の実施形態において、エレクトロポレーションは、製造業者の推奨に従
い、Amaxa NUCLEOFECTOR(商標)-IIを使用して実施することができる。一部の実施形態において、TILは、NUCLEOFECTOR(商標)-II溶液V及びエレクトロポレーションのための推奨される形態のセットを使用してトランスフェクトすることができる。一部の実施形態において、TILは、溶液V、T及びR並びにエレクトロポレーションの異なる形態を使用してトランスフェクトすることができる。一部の実施形態において、TILは、T細胞NUCLEOFECTOR(商標)-II溶液及びエレクトロポレーションの異なる形態を使用してトランスフェクトすることができる。核酸送達の代替方法も、本明細書に記載の使用されるオリゴヌクレオチドをトランスフェクトするために利用することができる:カチ
オン性リポソーム媒介トランスフェクションは、LIPOFECTIN又はLIPOFECTAMIN(Invitrogen)を使用して実施された。エレクトロポレーションは、ECM 830(BTX)(Harvard Instruments、Boston、MA)、Gene Pulser II(BioRad、Denver、CO)、Multiporator(Eppendorf、Hamburg、ドイツ)及び/又はNeon(商標)トランスフェクションシステム(ThermoFisher Scientific、Waltham、MAから市販)でも実施される。一部の実施形態において
、pmaxGFPプラスミドDNA(Amaxa Biosystems)をDNA対照として利用することがで
きる。いくつかの実施形態では、トランスフェクション効率(ET)は、蛍光活性化細胞選別(FACS)によるトランスフェクションの約3、6、9、12、15及び/又は18時間後に決定することができる。一部の実験では、GFPコントロールでGFPがもはや検出できなくなるまでトランスフェクタントを12時間~24時間毎に更に分析できる。一部の実施形態では、細胞生存率は、トリパンブルー染色排除により決定することができる。
い、Amaxa NUCLEOFECTOR(商標)-IIを使用して実施することができる。一部の実施形態において、TILは、NUCLEOFECTOR(商標)-II溶液V及びエレクトロポレーションのための推奨される形態のセットを使用してトランスフェクトすることができる。一部の実施形態において、TILは、溶液V、T及びR並びにエレクトロポレーションの異なる形態を使用してトランスフェクトすることができる。一部の実施形態において、TILは、T細胞NUCLEOFECTOR(商標)-II溶液及びエレクトロポレーションの異なる形態を使用してトランスフェクトすることができる。核酸送達の代替方法も、本明細書に記載の使用されるオリゴヌクレオチドをトランスフェクトするために利用することができる:カチ
オン性リポソーム媒介トランスフェクションは、LIPOFECTIN又はLIPOFECTAMIN(Invitrogen)を使用して実施された。エレクトロポレーションは、ECM 830(BTX)(Harvard Instruments、Boston、MA)、Gene Pulser II(BioRad、Denver、CO)、Multiporator(Eppendorf、Hamburg、ドイツ)及び/又はNeon(商標)トランスフェクションシステム(ThermoFisher Scientific、Waltham、MAから市販)でも実施される。一部の実施形態において
、pmaxGFPプラスミドDNA(Amaxa Biosystems)をDNA対照として利用することがで
きる。いくつかの実施形態では、トランスフェクション効率(ET)は、蛍光活性化細胞選別(FACS)によるトランスフェクションの約3、6、9、12、15及び/又は18時間後に決定することができる。一部の実験では、GFPコントロールでGFPがもはや検出できなくなるまでトランスフェクタントを12時間~24時間毎に更に分析できる。一部の実施形態では、細胞生存率は、トリパンブルー染色排除により決定することができる。
[00443] オリゴヌクレオチド及びオリゴヌクレオチド組成物は、本明細書に記載のT
ILと接触し(例えば、接触させ、本明細書では投与又は送達とも称される)、TILにより取り込まれる(TILによる受動的取り込みを含む)。sd-RNAは、第1の拡大培養中、例えばステップB、第1の拡大培養後、例えばステップC中、第2の拡大培養前又はその間、例えばステップD前又はその間、ステップD後且つステップEにおける回収前、ステップFの回収中又はその後、ステップFの最終的な製剤化及び/又は輸注バッグへの移動前又はその間及びステップFのいずれかの任意選択による凍結保存ステップ前に、本明細書に記載されるようにTILに添加することができる。更に、sd-RNAは、ステップFの任意の凍結保存ステップから解凍した後に添加することができる。一実施形態において、PD-1、LAG-3、TIM-3、CISH及びCBLBを含む、本明細書に記載の遺伝子を標的とする1つ以上のsd-RNAは、100nM~20mM、200nM~10mM、500nm~1mM、1μM~100μM、1μM~100μMからなる群から選択される濃度において、TIL及び他の薬剤を含む細胞培養培地に添加され得る。一実施形態において、PD-1、LAG-3、TIM-3、CISH及びCBLBを含む、本明細書に記載の遺伝子を標的とする1つ以上のsd-RNAは、0.1μM sd-RNA/10,000TIL/100μL培地、0.5μM sd-RNA/10,000TIL/100μL培地、0.75μM sd-RNA/10,000TIL/100μL培地、1μM sd-RNA/10,000TIL/100μL培地、1.25μM sd-RNA/10,000TIL/100μL培地、1.5μM sd-RNA/10,000TIL/100μL培地、2μM sd-RNA/10,000TIL/100μL培地、5μM sd-RNA/10,000TIL/100μL培地又は10μM sd-RNA/10,000TIL/100μL培地からなる群から選択される量において、TIL及び他の薬剤を含む細胞培養培地に添加され得る。一実施形態において、PD-1、LAG-3、TIM-3、CISH及びCBLBを含む、本明細書に記載の遺伝子を標的とする1つ以上のsd-RNAは、プレREP又はREP段階中、1日2回、1日1回、2日毎、3日毎、4日毎、5日毎、6日毎又は7日毎にTIL培養物に添加され得る。一実施形態において、PD-1、LAG-3、TIM-3、CISH及びCBLBを含む、本明細書に記載の遺伝子を標的とする1つ以上のsd-RNAは、0.1μM sd-RNA/10,000TIL、0.5μM sd-RNA/10,000TIL、0.75μM sd-RNA/10,000TIL、1μM sd-RNA/10,000TIL、1.25μM sd-RNA/10,000TIL、1.5μM sd-RNA/10,000TIL、2μM sd-RNA/10,000TIL、5μM sd-RNA/10,000TIL又は10μM sd-RNA/10,000TILからなる群から選択される量において、TIL及び他の薬剤を含む細胞培養培地に添加され得る。一実施形態において、PD-1、LAG-3、TIM-3、CISH及びCBLBを含む、本明細書に記載の遺伝子を標的とする1つ以上のsd-RNAは、第1、第2及び/又は追加の拡大培養段階中、1日2回、1日1回、2日毎、3日毎、4日毎、5日毎
、6日毎又は7日毎にTIL培養物に添加され得る。
ILと接触し(例えば、接触させ、本明細書では投与又は送達とも称される)、TILにより取り込まれる(TILによる受動的取り込みを含む)。sd-RNAは、第1の拡大培養中、例えばステップB、第1の拡大培養後、例えばステップC中、第2の拡大培養前又はその間、例えばステップD前又はその間、ステップD後且つステップEにおける回収前、ステップFの回収中又はその後、ステップFの最終的な製剤化及び/又は輸注バッグへの移動前又はその間及びステップFのいずれかの任意選択による凍結保存ステップ前に、本明細書に記載されるようにTILに添加することができる。更に、sd-RNAは、ステップFの任意の凍結保存ステップから解凍した後に添加することができる。一実施形態において、PD-1、LAG-3、TIM-3、CISH及びCBLBを含む、本明細書に記載の遺伝子を標的とする1つ以上のsd-RNAは、100nM~20mM、200nM~10mM、500nm~1mM、1μM~100μM、1μM~100μMからなる群から選択される濃度において、TIL及び他の薬剤を含む細胞培養培地に添加され得る。一実施形態において、PD-1、LAG-3、TIM-3、CISH及びCBLBを含む、本明細書に記載の遺伝子を標的とする1つ以上のsd-RNAは、0.1μM sd-RNA/10,000TIL/100μL培地、0.5μM sd-RNA/10,000TIL/100μL培地、0.75μM sd-RNA/10,000TIL/100μL培地、1μM sd-RNA/10,000TIL/100μL培地、1.25μM sd-RNA/10,000TIL/100μL培地、1.5μM sd-RNA/10,000TIL/100μL培地、2μM sd-RNA/10,000TIL/100μL培地、5μM sd-RNA/10,000TIL/100μL培地又は10μM sd-RNA/10,000TIL/100μL培地からなる群から選択される量において、TIL及び他の薬剤を含む細胞培養培地に添加され得る。一実施形態において、PD-1、LAG-3、TIM-3、CISH及びCBLBを含む、本明細書に記載の遺伝子を標的とする1つ以上のsd-RNAは、プレREP又はREP段階中、1日2回、1日1回、2日毎、3日毎、4日毎、5日毎、6日毎又は7日毎にTIL培養物に添加され得る。一実施形態において、PD-1、LAG-3、TIM-3、CISH及びCBLBを含む、本明細書に記載の遺伝子を標的とする1つ以上のsd-RNAは、0.1μM sd-RNA/10,000TIL、0.5μM sd-RNA/10,000TIL、0.75μM sd-RNA/10,000TIL、1μM sd-RNA/10,000TIL、1.25μM sd-RNA/10,000TIL、1.5μM sd-RNA/10,000TIL、2μM sd-RNA/10,000TIL、5μM sd-RNA/10,000TIL又は10μM sd-RNA/10,000TILからなる群から選択される量において、TIL及び他の薬剤を含む細胞培養培地に添加され得る。一実施形態において、PD-1、LAG-3、TIM-3、CISH及びCBLBを含む、本明細書に記載の遺伝子を標的とする1つ以上のsd-RNAは、第1、第2及び/又は追加の拡大培養段階中、1日2回、1日1回、2日毎、3日毎、4日毎、5日毎
、6日毎又は7日毎にTIL培養物に添加され得る。
[00444] sd-RNAを含む本発明のオリゴヌクレオチド組成物は、例えば、細胞培
養培地中に高濃度でsd-RNAを溶解し、受動的取り込みが発生するのに十分な時間を与えることにより、拡大培養プロセス中に本明細書に記載されるようにTILと接触させることができる。一部の実施形態において、高濃度は、0.1μM sd-RNA/10,000TIL、0.5μM sd-RNA/10,000TIL、0.75μM sd-RNA/10,000TIL、1μM sd-RNA/10,000TIL、1.25μM sd-RNA/10,000TIL、1.5μM sd-RNA/10,000TIL、2μM sd-RNA/10,000TIL、5μM sd-RNA/10,000TIL又は10μM sd-RNA/10,000TILを含む。一部の実施形態において、高濃度は、2μM sd-RNA/10,000TIL、5μM sd-RNA/10,000TIL又は10μM sd-RNA/10,000TILを含む。一部の実施形態において、高濃度は、5μM sd-RNA/10,000TIL又は最大10μM sd-RNA/10,000TILを含む。
養培地中に高濃度でsd-RNAを溶解し、受動的取り込みが発生するのに十分な時間を与えることにより、拡大培養プロセス中に本明細書に記載されるようにTILと接触させることができる。一部の実施形態において、高濃度は、0.1μM sd-RNA/10,000TIL、0.5μM sd-RNA/10,000TIL、0.75μM sd-RNA/10,000TIL、1μM sd-RNA/10,000TIL、1.25μM sd-RNA/10,000TIL、1.5μM sd-RNA/10,000TIL、2μM sd-RNA/10,000TIL、5μM sd-RNA/10,000TIL又は10μM sd-RNA/10,000TILを含む。一部の実施形態において、高濃度は、2μM sd-RNA/10,000TIL、5μM sd-RNA/10,000TIL又は10μM sd-RNA/10,000TILを含む。一部の実施形態において、高濃度は、5μM sd-RNA/10,000TIL又は最大10μM sd-RNA/10,000TILを含む。
[00445] 一部の実施形態において、細胞へのオリゴヌクレオチドの送達は、リン酸カ
ルシウム、DMSO、グリセロール若しくはデキストラン、エレクトロポレーションを含む、当技術分野で認められた適切な方法により、又は例えばカチオン性、アニオン性若しくは中性脂質組成物若しくはリポソームを使用するトランスフェクションにより、当技術分野で公知の方法を使用して増強され得る(例えば、国際公開第90/14074号;国際公開第91/16024号;国際公開第91/17424号;米国特許第4,897,355号;Bergan et a 1993. Nucleic Acids Research. 21:3567)。
ルシウム、DMSO、グリセロール若しくはデキストラン、エレクトロポレーションを含む、当技術分野で認められた適切な方法により、又は例えばカチオン性、アニオン性若しくは中性脂質組成物若しくはリポソームを使用するトランスフェクションにより、当技術分野で公知の方法を使用して増強され得る(例えば、国際公開第90/14074号;国際公開第91/16024号;国際公開第91/17424号;米国特許第4,897,355号;Bergan et a 1993. Nucleic Acids Research. 21:3567)。
e.sd-RNAの組み合わせ
[00446] 一部の実施形態において、標的遺伝子の発現を低減するために2つ以上のs
d-RNAが使用される。一部の実施形態において、PD-1、TIM-3、CBLB、LAG3及び/又はCISHを標的とするsd-RNAの1つ以上が一緒に使用される。一部の実施形態において、PD-1 sd-RNAは、2つ以上の遺伝子標的の発現を低減するためにTIM-3、CBLB、LAG3及び/又はCISHの1つ以上と共に使用される。一部の実施形態において、LAG3 sd-RNAは、CISH標的とするsd-RNAと組み合わせて使用されて、両方の標的の遺伝子発現を低減する。一部の実施形態において、本明細書のPD-1、TIM-3、CBLB、LAG3及び/又はCISHの1つ以上を標的とするsd-RNAは、Advirna LLC, Worcester, MA, USAから市販さ
れている。一部の実施形態において、PD-1、TIM-3、CBLB、LAG3及び/又はCISHの1つ以上を標的とするsd-RNAは、図36又は図37に示される構造を有する。
[00446] 一部の実施形態において、標的遺伝子の発現を低減するために2つ以上のs
d-RNAが使用される。一部の実施形態において、PD-1、TIM-3、CBLB、LAG3及び/又はCISHを標的とするsd-RNAの1つ以上が一緒に使用される。一部の実施形態において、PD-1 sd-RNAは、2つ以上の遺伝子標的の発現を低減するためにTIM-3、CBLB、LAG3及び/又はCISHの1つ以上と共に使用される。一部の実施形態において、LAG3 sd-RNAは、CISH標的とするsd-RNAと組み合わせて使用されて、両方の標的の遺伝子発現を低減する。一部の実施形態において、本明細書のPD-1、TIM-3、CBLB、LAG3及び/又はCISHの1つ以上を標的とするsd-RNAは、Advirna LLC, Worcester, MA, USAから市販さ
れている。一部の実施形態において、PD-1、TIM-3、CBLB、LAG3及び/又はCISHの1つ以上を標的とするsd-RNAは、図36又は図37に示される構造を有する。
[00447] 一部の実施形態において、sd-RNAは、PD-1、LAG3、TIM3
、CTLA-4、TIGIT、CISH、TGFβR2、PKA、CBLB、BAFF(BR3)及びそれらの組み合わせからなる群から選択される遺伝子を標的とする。一部の実施形態において、sd-RNAは、PD-1、LAG3、TIM3、CTLA-4、TIGIT、CISH、TGFβR2、PKA、CBLB、BAFF(BR3)及びそれらの組み合わせからなる群から選択される遺伝子を標的とする。一部の実施形態において、1つのsd-RNAは、PD-1を標的とし、別のsd-RNAは、LAG3、TIM3、CTLA-4、TIGIT、CISH、TGFβR2、PKA、CBLB、BAFF(BR3)及びそれらの組み合わせからなる群から選択される遺伝子を標的とする。一部の実施形態において、sd-RNAは、PD-1、LAG-3、CISH、CBLB、TIM3及びそれらの組み合わせから選択される遺伝子を標的とする。一部の実施形態において、sd-RNAは、PD-1と、LAG-3、CISH、CBLB、TIM3及びそれ
らの組み合わせから選択される遺伝子のいずれか1つとを標的とする。一部の実施形態において、1つのsd-RNAは、PD-1を標的とし、1つのsd-RNAは、LAG3を標的とする。一部の実施形態において、1つのsd-RNAは、PD-1を標的とし、1つのsd-RNAは、CISHを標的とする。一部の実施形態において、1つのsd-RNAは、PD-1を標的とし、1つのsd-RNAは、CBLBを標的とする。一部の実施形態において、1つのsd-RNAは、LAG3を標的とし、1つのsd-RNAは、CISHを標的とする。一部の実施形態において、1つのsd-RNAは、LAG3を標的とし、1つのsd-RNAは、CBLBを標的とする。一部の実施形態において、1つのsd-RNAは、CISHを標的とし、1つのsd-RNAは、CBLBを標的とする。一部の実施形態において、1つのsd-RNAは、TIM3を標的とし、1つのsd-RNAは、PD-1を標的とする。一部の実施形態において、1つのsd-RNAは、TIM3を標的とし、1つのsd-RNAは、LAG3を標的とする。一部の実施形態において、1つのsd-RNAは、TIM3を標的とし、1つのsd-RNAは、CISHを標的とする。一部の実施形態において、1つのsd-RNAは、TIM3を標的とし、1つのsd-RNAは、CBLBを標的とする。
、CTLA-4、TIGIT、CISH、TGFβR2、PKA、CBLB、BAFF(BR3)及びそれらの組み合わせからなる群から選択される遺伝子を標的とする。一部の実施形態において、sd-RNAは、PD-1、LAG3、TIM3、CTLA-4、TIGIT、CISH、TGFβR2、PKA、CBLB、BAFF(BR3)及びそれらの組み合わせからなる群から選択される遺伝子を標的とする。一部の実施形態において、1つのsd-RNAは、PD-1を標的とし、別のsd-RNAは、LAG3、TIM3、CTLA-4、TIGIT、CISH、TGFβR2、PKA、CBLB、BAFF(BR3)及びそれらの組み合わせからなる群から選択される遺伝子を標的とする。一部の実施形態において、sd-RNAは、PD-1、LAG-3、CISH、CBLB、TIM3及びそれらの組み合わせから選択される遺伝子を標的とする。一部の実施形態において、sd-RNAは、PD-1と、LAG-3、CISH、CBLB、TIM3及びそれ
らの組み合わせから選択される遺伝子のいずれか1つとを標的とする。一部の実施形態において、1つのsd-RNAは、PD-1を標的とし、1つのsd-RNAは、LAG3を標的とする。一部の実施形態において、1つのsd-RNAは、PD-1を標的とし、1つのsd-RNAは、CISHを標的とする。一部の実施形態において、1つのsd-RNAは、PD-1を標的とし、1つのsd-RNAは、CBLBを標的とする。一部の実施形態において、1つのsd-RNAは、LAG3を標的とし、1つのsd-RNAは、CISHを標的とする。一部の実施形態において、1つのsd-RNAは、LAG3を標的とし、1つのsd-RNAは、CBLBを標的とする。一部の実施形態において、1つのsd-RNAは、CISHを標的とし、1つのsd-RNAは、CBLBを標的とする。一部の実施形態において、1つのsd-RNAは、TIM3を標的とし、1つのsd-RNAは、PD-1を標的とする。一部の実施形態において、1つのsd-RNAは、TIM3を標的とし、1つのsd-RNAは、LAG3を標的とする。一部の実施形態において、1つのsd-RNAは、TIM3を標的とし、1つのsd-RNAは、CISHを標的とする。一部の実施形態において、1つのsd-RNAは、TIM3を標的とし、1つのsd-RNAは、CBLBを標的とする。
f.共刺激受容体又は接着分子の過剰発現
[00448] 追加の実施形態によると、TIL拡大培養方法中のTILのタンパク質発現
の変化は、1つ以上の免疫チェックポイント遺伝子の発現を治療用TIL集団の少なくとも一部において増強することも可能にすることができる。例えば、タンパク質発現を変化させると、刺激受容体の発現が増強され得、これは、遺伝子改変されていない刺激受容体の発現と比較して、それが過剰発現されることを意味する。本発明のTILにおけるタンパク質発現を一過性に変化させることにより発現の増強を示し得る免疫チェックポイント遺伝子の非限定的な例には、CCR2、CCR4、CCR5、CXCR2、CXCR3、CX3CR1、IL-2、IL-4、IL-7、IL-10、IL-15、IL-21、NOTCH 1/2細胞内ドメイン(ICD)及び/又はNOTCHリガンドmDLL1などの特定のケモカイン受容体及びインターロイキンが含まれる。
[00448] 追加の実施形態によると、TIL拡大培養方法中のTILのタンパク質発現
の変化は、1つ以上の免疫チェックポイント遺伝子の発現を治療用TIL集団の少なくとも一部において増強することも可能にすることができる。例えば、タンパク質発現を変化させると、刺激受容体の発現が増強され得、これは、遺伝子改変されていない刺激受容体の発現と比較して、それが過剰発現されることを意味する。本発明のTILにおけるタンパク質発現を一過性に変化させることにより発現の増強を示し得る免疫チェックポイント遺伝子の非限定的な例には、CCR2、CCR4、CCR5、CXCR2、CXCR3、CX3CR1、IL-2、IL-4、IL-7、IL-10、IL-15、IL-21、NOTCH 1/2細胞内ドメイン(ICD)及び/又はNOTCHリガンドmDLL1などの特定のケモカイン受容体及びインターロイキンが含まれる。
(i)CCR及びCCL
[00449] 養子T細胞免疫療法を有効にするには、T細胞をケモカインによって腫瘍に
適切に輸送する必要がある。腫瘍細胞によって分泌されるケモカイン、末梢に存在するケモカイン及びT細胞によって発現されるケモカイン受容体間の一致は、T細胞の腫瘍床への輸送の成功に重要である。
[00449] 養子T細胞免疫療法を有効にするには、T細胞をケモカインによって腫瘍に
適切に輸送する必要がある。腫瘍細胞によって分泌されるケモカイン、末梢に存在するケモカイン及びT細胞によって発現されるケモカイン受容体間の一致は、T細胞の腫瘍床への輸送の成功に重要である。
[00450] 特定の実施形態によれば、本発明のタンパク質発現方法の変更は、CCR2
、CCR4、CCR5、CXCR2、CXCR3及び/又はCX3CR1の1つ以上などのTILにおける特定のケモカイン受容体の発現を増加させるために使用され得る。CCRの過剰発現は、養子移入後のエフェクター機能及びTILの増殖を促進するのに役立つ。一部の実施形態において、本発明のタンパク質発現方法の変更は、TIL中のCCL2(MCP-1)、CCL3(MIP-1α)、CCL4(MIP1-β)、CCL5(RANTES)、CXCL1、CXCL8、CCL22及び/又はCCL17の発現の増加に使用され得る。
、CCR4、CCR5、CXCR2、CXCR3及び/又はCX3CR1の1つ以上などのTILにおける特定のケモカイン受容体の発現を増加させるために使用され得る。CCRの過剰発現は、養子移入後のエフェクター機能及びTILの増殖を促進するのに役立つ。一部の実施形態において、本発明のタンパク質発現方法の変更は、TIL中のCCL2(MCP-1)、CCL3(MIP-1α)、CCL4(MIP1-β)、CCL5(RANTES)、CXCL1、CXCL8、CCL22及び/又はCCL17の発現の増加に使用され得る。
[00451] 特定の実施形態によれば、TILにおけるCCR2、CCR4、CCR5、
CXCR2、CXCR3及び/又はCX3CR1の1つ以上の発現は、本発明の組成物及び方法に従って増強される。例えば、腫瘍浸潤リンパ球(TIL)を治療用TIL集団に拡大培養するための方法は、本明細書に記載される方法の任意の実施形態(例えば、プロセス2A又は図20及び21に示される方法)に従って実施され得、ここで、方法は、CCR2、CCR4、CCR5、CXCR2、CXCR3及び/又はCX3CR1の1つ以上の発現を増強させることによってTILの少なくとも一部を遺伝子編集することを含む
。以下でより詳細に説明されるように、遺伝子編集プロセスは、ケモカイン受容体遺伝子における二本鎖又は一本鎖切断の生成を媒介するプログラム可能なヌクレアーゼの使用を含み得る。例えば、CRISPR法、TALE法又はジンクフィンガー法は、TILにおける特定のケモカイン受容体の発現を増強するために使用され得る。
CXCR2、CXCR3及び/又はCX3CR1の1つ以上の発現は、本発明の組成物及び方法に従って増強される。例えば、腫瘍浸潤リンパ球(TIL)を治療用TIL集団に拡大培養するための方法は、本明細書に記載される方法の任意の実施形態(例えば、プロセス2A又は図20及び21に示される方法)に従って実施され得、ここで、方法は、CCR2、CCR4、CCR5、CXCR2、CXCR3及び/又はCX3CR1の1つ以上の発現を増強させることによってTILの少なくとも一部を遺伝子編集することを含む
。以下でより詳細に説明されるように、遺伝子編集プロセスは、ケモカイン受容体遺伝子における二本鎖又は一本鎖切断の生成を媒介するプログラム可能なヌクレアーゼの使用を含み得る。例えば、CRISPR法、TALE法又はジンクフィンガー法は、TILにおける特定のケモカイン受容体の発現を増強するために使用され得る。
[00452] 一実施形態において、CCR4及び/又はCCR5接着分子は、本明細書に
記載のガンマレトロウイルス又はレンチウイルス方法を使用してTIL集団に挿入される。一実施形態において、CXCR2接着分子は、Forget, et al., Frontiers Immunology
2017, 8, 908又はPeng, et al., Clin. Cancer Res. 2010, 16, 5458に記載のガンマレ
トロウイルス又はレンチウイルス方法を使用してTIL集団に挿入され、その開示は、参照により本明細書に組み込まれる。
記載のガンマレトロウイルス又はレンチウイルス方法を使用してTIL集団に挿入される。一実施形態において、CXCR2接着分子は、Forget, et al., Frontiers Immunology
2017, 8, 908又はPeng, et al., Clin. Cancer Res. 2010, 16, 5458に記載のガンマレ
トロウイルス又はレンチウイルス方法を使用してTIL集団に挿入され、その開示は、参照により本明細書に組み込まれる。
[00453] 一部の実施形態において、本発明は、腫瘍浸潤リンパ球(TIL)を治療用
TIL集団に拡大培養する方法も提供し、この方法は、
(i)患者から切除された腫瘍から第1のTIL集団を得るステップ;
(ii)IL-2及び任意選択によりOKT-3を含む細胞培養培地中で第1のTIL集団を培養することにより、第1の拡大培養を実施して第2のTIL集団を生じさせること;
(iii)第2のTIL集団の細胞培養培地に追加のIL-2、OKT-3及び抗原提示細胞(APC)を補充することにより、第2の拡大培養を実施して第3のTIL集団を生じさせることであって、第3のTIL集団は、第2のTIL集団よりも数において少なくとも100倍多く、第2の拡大培養は、第3のTIL集団を得るために少なくとも14日間にわたって実施され、第3のTIL集団は、治療用TIL集団である、生じさせること;及び
(iv)第2及び/又は第3のTIL集団を、転写因子(TF)及び/又はタンパク質発現を一過性に変化させることができる他の分子に曝露することであって、TF及び/又はタンパク質発現を一過性に変化させることができる他の分子は、腫瘍抗原の変化した発現及び/又は治療用TIL集団における腫瘍抗原特異的T細胞の数の変化を提供し、発現の変化は、CCR2、CCR4、CCR5、CXCR2、CXCR3、CX3CR1、CCL2(MCP-1)、CCL3(MIP-1α)、CCL4(MIP1-β)、CCL5(RANTES)、CXCL1、CXCL8及び/又はCCL22の1つ以上の発現の増加である、曝露すること
を含む。
TIL集団に拡大培養する方法も提供し、この方法は、
(i)患者から切除された腫瘍から第1のTIL集団を得るステップ;
(ii)IL-2及び任意選択によりOKT-3を含む細胞培養培地中で第1のTIL集団を培養することにより、第1の拡大培養を実施して第2のTIL集団を生じさせること;
(iii)第2のTIL集団の細胞培養培地に追加のIL-2、OKT-3及び抗原提示細胞(APC)を補充することにより、第2の拡大培養を実施して第3のTIL集団を生じさせることであって、第3のTIL集団は、第2のTIL集団よりも数において少なくとも100倍多く、第2の拡大培養は、第3のTIL集団を得るために少なくとも14日間にわたって実施され、第3のTIL集団は、治療用TIL集団である、生じさせること;及び
(iv)第2及び/又は第3のTIL集団を、転写因子(TF)及び/又はタンパク質発現を一過性に変化させることができる他の分子に曝露することであって、TF及び/又はタンパク質発現を一過性に変化させることができる他の分子は、腫瘍抗原の変化した発現及び/又は治療用TIL集団における腫瘍抗原特異的T細胞の数の変化を提供し、発現の変化は、CCR2、CCR4、CCR5、CXCR2、CXCR3、CX3CR1、CCL2(MCP-1)、CCL3(MIP-1α)、CCL4(MIP1-β)、CCL5(RANTES)、CXCL1、CXCL8及び/又はCCL22の1つ以上の発現の増加である、曝露すること
を含む。
(ii)インターロイキン及びその他
[00454] 追加の実施形態によれば、本発明の遺伝子編集方法は、IL-2、IL-4
、IL-7、IL-10、IL-15及びIL-21の1つ以上などの特定のインターロイキン並びにNOTCH 1/2細胞内ドメイン(ICD)の発現を増加させるために使用され得る。特定のインターロイキンは、T細胞のエフェクター機能を増強し、腫瘍制御を媒介することが示されている。
[00454] 追加の実施形態によれば、本発明の遺伝子編集方法は、IL-2、IL-4
、IL-7、IL-10、IL-15及びIL-21の1つ以上などの特定のインターロイキン並びにNOTCH 1/2細胞内ドメイン(ICD)の発現を増加させるために使用され得る。特定のインターロイキンは、T細胞のエフェクター機能を増強し、腫瘍制御を媒介することが示されている。
[00455] 特定の実施形態によれば、TILにおけるIL-2、IL-4、IL-7、
IL-10、IL-15及びIL-21の1つ以上などの特定のインターロイキン並びにNOTCH 1/2細胞内ドメイン(ICD)の発現は、本発明の組成物及び方法に従って増強される。一部の実施形態において、本発明は、腫瘍浸潤リンパ球(TIL)を治療用TIL集団に拡大培養する方法も提供し、この方法は、
(i)患者から切除された腫瘍から第1のTIL集団を得るステップ;
(ii)IL-2及び任意選択によりOKT-3を含む細胞培養培地中で第1のTIL集団を培養することにより、第1の拡大培養を実施して第2のTIL集団を生じさせること;
(iii)第2のTIL集団の細胞培養培地に追加のIL-2、OKT-3及び抗原提示細胞(APC)を補充することにより、第2の拡大培養を実施して第3のTIL集団を生じさせることであって、第3のTIL集団は、第2のTIL集団よりも数において少なくとも100倍多く、第2の拡大培養は、第3のTIL集団を得るために少なくとも14日間にわたって実施され、第3のTIL集団は、治療用TIL集団である、生じさせること;及び
(iv)第2及び/又は第3のTIL集団を、転写因子(TF)及び/又はタンパク質発現を一過性に変化させることができる他の分子に曝露することであって、TF及び/又はタンパク質発現を一過性に変化させることができる他の分子は、腫瘍抗原の変化した発現及び/又は治療用TIL集団における腫瘍抗原特異的T細胞の数の変化を提供し、発現の変化は、IL-2、IL-4、IL-7、IL-10、IL-15及びIL-21並びにNOTCH 1/2細胞内ドメイン(ICD)の1つ以上の発現の増加である、曝露すること
を含む。
IL-10、IL-15及びIL-21の1つ以上などの特定のインターロイキン並びにNOTCH 1/2細胞内ドメイン(ICD)の発現は、本発明の組成物及び方法に従って増強される。一部の実施形態において、本発明は、腫瘍浸潤リンパ球(TIL)を治療用TIL集団に拡大培養する方法も提供し、この方法は、
(i)患者から切除された腫瘍から第1のTIL集団を得るステップ;
(ii)IL-2及び任意選択によりOKT-3を含む細胞培養培地中で第1のTIL集団を培養することにより、第1の拡大培養を実施して第2のTIL集団を生じさせること;
(iii)第2のTIL集団の細胞培養培地に追加のIL-2、OKT-3及び抗原提示細胞(APC)を補充することにより、第2の拡大培養を実施して第3のTIL集団を生じさせることであって、第3のTIL集団は、第2のTIL集団よりも数において少なくとも100倍多く、第2の拡大培養は、第3のTIL集団を得るために少なくとも14日間にわたって実施され、第3のTIL集団は、治療用TIL集団である、生じさせること;及び
(iv)第2及び/又は第3のTIL集団を、転写因子(TF)及び/又はタンパク質発現を一過性に変化させることができる他の分子に曝露することであって、TF及び/又はタンパク質発現を一過性に変化させることができる他の分子は、腫瘍抗原の変化した発現及び/又は治療用TIL集団における腫瘍抗原特異的T細胞の数の変化を提供し、発現の変化は、IL-2、IL-4、IL-7、IL-10、IL-15及びIL-21並びにNOTCH 1/2細胞内ドメイン(ICD)の1つ以上の発現の増加である、曝露すること
を含む。
IV.TILの製造方法
[00456] これらの特徴のいくつかを含むプロセス2Aとして知られるTILプロセス
の例を図1に示し、プロセス1Cに対する本発明の本実施形態の利点のいくつかを図13及び14と同様に図2に示す。プロセス1Cを図3に比較のために示す。プロセス2Aに基づくTIL治療の2つの代替タイムラインを図4(細胞数が多い)及び図5(細胞数が少ない)に示す。プロセス2Aの実施形態を図6並びに図8に示す。図13及び図14は、例示的なプロセス1Cと比較した例示的なプロセス2Aを更に提供する。
[00456] これらの特徴のいくつかを含むプロセス2Aとして知られるTILプロセス
の例を図1に示し、プロセス1Cに対する本発明の本実施形態の利点のいくつかを図13及び14と同様に図2に示す。プロセス1Cを図3に比較のために示す。プロセス2Aに基づくTIL治療の2つの代替タイムラインを図4(細胞数が多い)及び図5(細胞数が少ない)に示す。プロセス2Aの実施形態を図6並びに図8に示す。図13及び図14は、例示的なプロセス1Cと比較した例示的なプロセス2Aを更に提供する。
[00457] 本明細書において考察される通り、本発明は、患者への移植前に凍結保存T
ILを再刺激することによりその代謝活性、従って相対的健康を増加させること及び代謝的健康の試験方法に関するステップを含み得る。一般的に本明細書に概説される通り、TILは、一般的に、患者サンプルから採取し、操作することにより、患者への移植前にその数が拡大される。一部の実施形態において、TILは、任意選択により、以下に考察する通り、遺伝的に操作され得る。
ILを再刺激することによりその代謝活性、従って相対的健康を増加させること及び代謝的健康の試験方法に関するステップを含み得る。一般的に本明細書に概説される通り、TILは、一般的に、患者サンプルから採取し、操作することにより、患者への移植前にその数が拡大される。一部の実施形態において、TILは、任意選択により、以下に考察する通り、遺伝的に操作され得る。
[00458] 一部の実施形態において、TILは凍結保存され得る。解凍後、TILは、
患者への注入前に、その代謝を高めるために再刺激され得る。
患者への注入前に、その代謝を高めるために再刺激され得る。
[00459] 一部の実施形態において、以下並びに実施例及び図で詳細に考察する通り、
第1の拡大培養(プレREPと称されるプロセス及び図8にステップAとして示されるプロセスを含む)は、3~14日に短縮され、第2の拡大培養(REPと称されるプロセス及び図8にステップBとして示されるプロセスを含む)は、7~14日間に短縮される。一部の実施形態において、例で考察され、図4、5、6及び7に示す通り、第1の拡大培養(例えば、図8のステップBとして記載される拡拡大培養)は、11日間に短縮され、第2の拡大培養(例えば、図8のステップDに記載される拡大培養)は、11日間に短縮される。一部の実施形態において、以下並びに実施例及び図で詳細に考察するように、第1の拡大培養及び第2の拡大培養(例えば、図8のステップB及びステップDとして記載される拡大培養)の組み合わせは、22日間に短縮される。
第1の拡大培養(プレREPと称されるプロセス及び図8にステップAとして示されるプロセスを含む)は、3~14日に短縮され、第2の拡大培養(REPと称されるプロセス及び図8にステップBとして示されるプロセスを含む)は、7~14日間に短縮される。一部の実施形態において、例で考察され、図4、5、6及び7に示す通り、第1の拡大培養(例えば、図8のステップBとして記載される拡拡大培養)は、11日間に短縮され、第2の拡大培養(例えば、図8のステップDに記載される拡大培養)は、11日間に短縮される。一部の実施形態において、以下並びに実施例及び図で詳細に考察するように、第1の拡大培養及び第2の拡大培養(例えば、図8のステップB及びステップDとして記載される拡大培養)の組み合わせは、22日間に短縮される。
[00460] 以下の「ステップ」の名称A、B、C等は、図8を参照し、本明細書に記載
の特定の実施形態を参照している。以下及び図8におけるステップの順序は、例示であり、ステップの任意の組み合わせ又は順序並びに追加のステップ、ステップの繰り返し及び/又はステップの省略は、本出願及び本明細書に開示される方法によって企図される。
の特定の実施形態を参照している。以下及び図8におけるステップの順序は、例示であり、ステップの任意の組み合わせ又は順序並びに追加のステップ、ステップの繰り返し及び/又はステップの省略は、本出願及び本明細書に開示される方法によって企図される。
A.ステップA:患者の腫瘍サンプルを入手
[00461] 一般に、TILは、最初に患者腫瘍サンプルから得られ(「初代TIL」)
、次に本明細書に記載される通りの更なる操作のためにより大きい集団に拡大培養され、任意選択により凍結保存され、本明細書に概説される通り再刺激され、且つ任意選択によりTILの健康の指標として表現型及び代謝パラメータが判定される。
[00461] 一般に、TILは、最初に患者腫瘍サンプルから得られ(「初代TIL」)
、次に本明細書に記載される通りの更なる操作のためにより大きい集団に拡大培養され、任意選択により凍結保存され、本明細書に概説される通り再刺激され、且つ任意選択によりTILの健康の指標として表現型及び代謝パラメータが判定される。
[00462] 患者腫瘍サンプルは、当技術分野において公知の方法を用いて、概して外科
的切除又は針生検など、腫瘍とTIL細胞との混合物を含むサンプルを得るための手段によって入手され得る。一般に、腫瘍サンプルは、原発腫瘍、浸潤性腫瘍又は転移性腫瘍を含めた任意の固形腫瘍からのものであり得る。腫瘍サンプルは、血液悪性腫瘍から得られた腫瘍など、液性腫瘍でもあり得る。固形腫瘍は、限定はされないが、乳癌、膵癌、前立腺癌、結腸直腸癌、肺癌、脳癌、腎癌、胃癌及び皮膚癌(限定はされないが、扁平上皮癌、基底細胞癌及び黒色腫を含む)を含めた任意の癌型のものであり得る。一部の実施形態において、有用なTILは、特に高レベルのTILを有すると報告されていることに伴って悪性黒色腫腫瘍から得られる。
的切除又は針生検など、腫瘍とTIL細胞との混合物を含むサンプルを得るための手段によって入手され得る。一般に、腫瘍サンプルは、原発腫瘍、浸潤性腫瘍又は転移性腫瘍を含めた任意の固形腫瘍からのものであり得る。腫瘍サンプルは、血液悪性腫瘍から得られた腫瘍など、液性腫瘍でもあり得る。固形腫瘍は、限定はされないが、乳癌、膵癌、前立腺癌、結腸直腸癌、肺癌、脳癌、腎癌、胃癌及び皮膚癌(限定はされないが、扁平上皮癌、基底細胞癌及び黒色腫を含む)を含めた任意の癌型のものであり得る。一部の実施形態において、有用なTILは、特に高レベルのTILを有すると報告されていることに伴って悪性黒色腫腫瘍から得られる。
[00463] 「固形腫瘍」という用語は、嚢胞又は液体領域を通常含まない異常な組織塊
を指す。固形腫瘍は、良性又は悪性であり得る。「固形腫瘍癌」という用語は、悪性、新生物性又は癌性の固形腫瘍を指す。固形腫瘍癌としては、限定はされないが、肺癌、乳癌、トリプルネガティブ乳癌、前立腺癌、結腸癌、直腸癌及び膀胱癌など、肉腫、癌腫及びリンパ腫が挙げられる。一部の実施形態において、癌は、子宮頸癌、頭頸部癌(例えば、頭頚部扁平上皮癌(HNSCC)を含む)、膠芽腫、卵巣癌、肉腫、膵癌、膀胱癌、乳癌、トリプルネガティブ乳癌及び非小細胞肺癌から選択される。固形腫瘍の組織構造は、柔組織(癌細胞)を含む相互依存的組織コンパートメント及び癌細胞が分散し支持微小環境を提供し得る支持間質細胞を含む。
を指す。固形腫瘍は、良性又は悪性であり得る。「固形腫瘍癌」という用語は、悪性、新生物性又は癌性の固形腫瘍を指す。固形腫瘍癌としては、限定はされないが、肺癌、乳癌、トリプルネガティブ乳癌、前立腺癌、結腸癌、直腸癌及び膀胱癌など、肉腫、癌腫及びリンパ腫が挙げられる。一部の実施形態において、癌は、子宮頸癌、頭頸部癌(例えば、頭頚部扁平上皮癌(HNSCC)を含む)、膠芽腫、卵巣癌、肉腫、膵癌、膀胱癌、乳癌、トリプルネガティブ乳癌及び非小細胞肺癌から選択される。固形腫瘍の組織構造は、柔組織(癌細胞)を含む相互依存的組織コンパートメント及び癌細胞が分散し支持微小環境を提供し得る支持間質細胞を含む。
[00464] 「血液悪性腫瘍」という用語は、血液、骨髄、リンパ節及びリンパ系の組織
を含むが、これらに限定されない哺乳動物の癌及び造血系及びリンパ系組織の腫瘍を指す。血液悪性腫瘍は、「液性腫瘍」とも称される。血液悪性腫瘍には、急性リンパ芽球性白血病(ALL)、慢性リンパ性リンパ腫(CLL)、小リンパ性リンパ腫(SLL)、急性骨髄性白血病(AML)、慢性骨髄性白血病(CML)、急性単球性白血病(AMoL)、ホジキンリンパ腫及び非ホジキンリンパ腫が含まれるが、これらに限定されるものではない。「B細胞血液悪性腫瘍」という用語は、B細胞に影響を及ぼす血液悪性腫瘍を指す。
を含むが、これらに限定されない哺乳動物の癌及び造血系及びリンパ系組織の腫瘍を指す。血液悪性腫瘍は、「液性腫瘍」とも称される。血液悪性腫瘍には、急性リンパ芽球性白血病(ALL)、慢性リンパ性リンパ腫(CLL)、小リンパ性リンパ腫(SLL)、急性骨髄性白血病(AML)、慢性骨髄性白血病(CML)、急性単球性白血病(AMoL)、ホジキンリンパ腫及び非ホジキンリンパ腫が含まれるが、これらに限定されるものではない。「B細胞血液悪性腫瘍」という用語は、B細胞に影響を及ぼす血液悪性腫瘍を指す。
[00465] 入手後、腫瘍サンプルは、一般的に鋭的な切離を用いて1~約8mm3の小
片に断片化され、約2~3mm3が特に有用である。TILは、酵素的腫瘍消化物を使用してこれらの断片から培養される。そのような腫瘍消化物は、酵素培地(例えば、Roswell Park Memorial Institute(RPMI)1640緩衝液、2mMグルタメート、10mcg
/mLゲンタマイシン、30単位/mLのDNase及び1.0mg/mLのコラゲナーゼ)中でのインキュベーション、続いて機械的分離(例えば、組織分離剤を使用)によって産生され得る。腫瘍消化物は、腫瘍を酵素培地中に置き、腫瘍を約1分間機械的に分離した後、続いて5%CO2下37℃で30分間インキュベートし、続いてごく小さい組織片のみが存在するまで前述の条件下で機械的分離及びインキュベーションのサイクルを繰り返すことにより作製され得る。このプロセスの終わりに細胞懸濁液が多数の赤血球又は死細胞を含有する場合、これらの細胞を除去するためにFICOLL分岐親水性多糖を用いた密度勾配分離を行うことができる。米国特許出願公開第2012/0244133A1号に記載されているものなど、当技術分野で公知の代替的方法を使用し得、その開示は、参照により本明細書に組み込まれる。前述の任意の方法は、TILを拡大培養する方法又は癌を処置する方法のために、本明細書に記載の任意の実施形態において使用され得る。
片に断片化され、約2~3mm3が特に有用である。TILは、酵素的腫瘍消化物を使用してこれらの断片から培養される。そのような腫瘍消化物は、酵素培地(例えば、Roswell Park Memorial Institute(RPMI)1640緩衝液、2mMグルタメート、10mcg
/mLゲンタマイシン、30単位/mLのDNase及び1.0mg/mLのコラゲナーゼ)中でのインキュベーション、続いて機械的分離(例えば、組織分離剤を使用)によって産生され得る。腫瘍消化物は、腫瘍を酵素培地中に置き、腫瘍を約1分間機械的に分離した後、続いて5%CO2下37℃で30分間インキュベートし、続いてごく小さい組織片のみが存在するまで前述の条件下で機械的分離及びインキュベーションのサイクルを繰り返すことにより作製され得る。このプロセスの終わりに細胞懸濁液が多数の赤血球又は死細胞を含有する場合、これらの細胞を除去するためにFICOLL分岐親水性多糖を用いた密度勾配分離を行うことができる。米国特許出願公開第2012/0244133A1号に記載されているものなど、当技術分野で公知の代替的方法を使用し得、その開示は、参照により本明細書に組み込まれる。前述の任意の方法は、TILを拡大培養する方法又は癌を処置する方法のために、本明細書に記載の任意の実施形態において使用され得る。
[00466] 一般に、回収された細胞懸濁液は、「初代細胞集団」又は「新鮮に回収され
た」細胞集団と呼ばれる。
た」細胞集団と呼ばれる。
[00467] 一部の実施形態において、断片化は、例えば、切離及び消化を含めた物理的
断片化を含む。一部の実施形態において、断片化は、物理的断片化である。一部の実施形態において、断片化は、切離である。一部の実施形態において、断片化は、消化による。一部の実施形態において、TILは、初めに、患者から得られた酵素的腫瘍消化物及び腫瘍断片から培養することができる。一実施形態において、TILは、初めに、患者から得られた酵素的腫瘍消化物及び腫瘍断片から培養することができる。
断片化を含む。一部の実施形態において、断片化は、物理的断片化である。一部の実施形態において、断片化は、切離である。一部の実施形態において、断片化は、消化による。一部の実施形態において、TILは、初めに、患者から得られた酵素的腫瘍消化物及び腫瘍断片から培養することができる。一実施形態において、TILは、初めに、患者から得られた酵素的腫瘍消化物及び腫瘍断片から培養することができる。
[00468] 一部の実施形態において、腫瘍が固形腫瘍である場合、例えばステップA(
図8に提供される)における腫瘍サンプルの入手後、腫瘍は、物理的断片化を受ける。一部の実施形態において、断片化は、凍結保存前に行われる。一部の実施形態において、断片化は、凍結保存後に行われる。一部の実施形態において、断片化は、腫瘍の入手後、いかなる凍結保存もなしに行われる。一部の実施形態において、腫瘍は、断片化され、第1の拡大培養のための各容器に10、20、30、40個又はそれを超える数の断片又は小片が置かれる。一部の実施形態において、腫瘍は、断片化され、第1の拡大培養のための各容器に30又は40個の断片又は小片が置かれる。一部の実施形態において、腫瘍は、断片化され、第1の拡大培養のための各容器に40個の断片又は小片が置かれる。一部の実施形態において、複数の断片は、約4~約50個の断片を含み、各断片は、約27mm3の容積を有する。一部の実施形態において、複数の断片は、約1300mm3~約1500mm3の総容積を有する約30~約60個の断片を含む。一部の実施形態において、複数の断片は、約1350mm3の総容積を有する約50個の断片を含む。一部の実施形態において、複数の断片は、約1グラム~約1.5グラムの総質量を有する約50個の断片を含む。一部の実施形態において、複数の断片は、約4個の断片を含む。
図8に提供される)における腫瘍サンプルの入手後、腫瘍は、物理的断片化を受ける。一部の実施形態において、断片化は、凍結保存前に行われる。一部の実施形態において、断片化は、凍結保存後に行われる。一部の実施形態において、断片化は、腫瘍の入手後、いかなる凍結保存もなしに行われる。一部の実施形態において、腫瘍は、断片化され、第1の拡大培養のための各容器に10、20、30、40個又はそれを超える数の断片又は小片が置かれる。一部の実施形態において、腫瘍は、断片化され、第1の拡大培養のための各容器に30又は40個の断片又は小片が置かれる。一部の実施形態において、腫瘍は、断片化され、第1の拡大培養のための各容器に40個の断片又は小片が置かれる。一部の実施形態において、複数の断片は、約4~約50個の断片を含み、各断片は、約27mm3の容積を有する。一部の実施形態において、複数の断片は、約1300mm3~約1500mm3の総容積を有する約30~約60個の断片を含む。一部の実施形態において、複数の断片は、約1350mm3の総容積を有する約50個の断片を含む。一部の実施形態において、複数の断片は、約1グラム~約1.5グラムの総質量を有する約50個の断片を含む。一部の実施形態において、複数の断片は、約4個の断片を含む。
[00469] 一部の実施形態において、TILは、腫瘍断片から得られる。一部の実施形
態において、腫瘍断片は、鋭的な切離によって得られる。一部の実施形態において、腫瘍断片は、約1mm3~10mm3である。一部の実施形態において、腫瘍断片は、約1mm3~8mm3である。一部の実施形態において、腫瘍断片は、約1mm3である。一部の実施形態において、腫瘍断片は、約2mm3である。一部の実施形態において、腫瘍断片は、約3mm3である。一部の実施形態において、腫瘍断片は、約4mm3である。一部の実施形態において、腫瘍断片は、約5mm3である。一部の実施形態において、腫瘍断片は、約6mm3である。一部の実施形態において、腫瘍断片は、約7mm3である。一部の実施形態において、腫瘍断片は、約8mm3である。一部の実施形態において、腫瘍断片は、約9mm3である。一部の実施形態において、腫瘍断片は、約10mm3である。一部の実施形態において、腫瘍は、1~4mm×1~4mm×1~4mmである。一部の実施形態において、腫瘍は、1mm×1mm×1mmである。一部の実施形態において、腫瘍は、2mm×2mm×2mmである。一部の実施形態において、腫瘍は、3mm×3mm×3mmである。一部の実施形態において、腫瘍は、4mm×4mm×4mmである。
態において、腫瘍断片は、鋭的な切離によって得られる。一部の実施形態において、腫瘍断片は、約1mm3~10mm3である。一部の実施形態において、腫瘍断片は、約1mm3~8mm3である。一部の実施形態において、腫瘍断片は、約1mm3である。一部の実施形態において、腫瘍断片は、約2mm3である。一部の実施形態において、腫瘍断片は、約3mm3である。一部の実施形態において、腫瘍断片は、約4mm3である。一部の実施形態において、腫瘍断片は、約5mm3である。一部の実施形態において、腫瘍断片は、約6mm3である。一部の実施形態において、腫瘍断片は、約7mm3である。一部の実施形態において、腫瘍断片は、約8mm3である。一部の実施形態において、腫瘍断片は、約9mm3である。一部の実施形態において、腫瘍断片は、約10mm3である。一部の実施形態において、腫瘍は、1~4mm×1~4mm×1~4mmである。一部の実施形態において、腫瘍は、1mm×1mm×1mmである。一部の実施形態において、腫瘍は、2mm×2mm×2mmである。一部の実施形態において、腫瘍は、3mm×3mm×3mmである。一部の実施形態において、腫瘍は、4mm×4mm×4mmである。
[00470] 一部の実施形態において、各断片上の出血、壊死及び/又は脂肪組織の量を
最小限にするために腫瘍が切除される。一部の実施形態において、各断片上の出血組織の量を最小限にするために腫瘍が切除される。一部の実施形態において、各断片上の壊死組織の量を最小限にするために腫瘍が切除される。一部の実施形態において、各断片上の脂肪組織の量を最小限にするために腫瘍が切除される。
最小限にするために腫瘍が切除される。一部の実施形態において、各断片上の出血組織の量を最小限にするために腫瘍が切除される。一部の実施形態において、各断片上の壊死組織の量を最小限にするために腫瘍が切除される。一部の実施形態において、各断片上の脂肪組織の量を最小限にするために腫瘍が切除される。
[00471] 一部の実施形態において、腫瘍の内部構造を維持するために腫瘍の断片化が
実施される。一部の実施形態において、腫瘍の断片化は、メスでの鋸引き運動を実施する
ことなく実施される。一部の実施形態において、TILは、腫瘍消化物から得られる。一部の実施形態において、腫瘍消化物は、酵素培地中、例えば、限定はされないが、RPMI1640、2mM GlutaMAX、10mg/mLゲンタマイシン、30U/mL DNアーゼ及び1.0mg/mLコラゲナーゼ中におけるインキュベーションと、それに続く機械的解離(GentleMACS、Miltenyi Biotec、Auburn, CA)によって作成した。腫瘍を酵素
培地に置いた後、腫瘍を約1分間機械的に分離し得る。次に溶液を5%CO2下37℃で30分間インキュベートし、次にそれを再び約1分間機械的に破壊し得る。再び5%CO2下37℃で30分間インキュベートした後、腫瘍を3度目に約1分間機械的に破壊し得る。一部の実施形態において、3度目の機械的破壊後に大型の組織片が存在した場合、5%CO2下37℃での更に30分間のインキュベーションを伴う又は伴わない1回又は2回の更なる機械的分離をサンプルに適用した。一部の実施形態において、最終回のインキュベーションの終了時に細胞懸濁液が多数の赤血球又は死細胞を含有した場合、フィコールを使用した密度勾配分離を実施して、そうした細胞を除去し得る。
実施される。一部の実施形態において、腫瘍の断片化は、メスでの鋸引き運動を実施する
ことなく実施される。一部の実施形態において、TILは、腫瘍消化物から得られる。一部の実施形態において、腫瘍消化物は、酵素培地中、例えば、限定はされないが、RPMI1640、2mM GlutaMAX、10mg/mLゲンタマイシン、30U/mL DNアーゼ及び1.0mg/mLコラゲナーゼ中におけるインキュベーションと、それに続く機械的解離(GentleMACS、Miltenyi Biotec、Auburn, CA)によって作成した。腫瘍を酵素
培地に置いた後、腫瘍を約1分間機械的に分離し得る。次に溶液を5%CO2下37℃で30分間インキュベートし、次にそれを再び約1分間機械的に破壊し得る。再び5%CO2下37℃で30分間インキュベートした後、腫瘍を3度目に約1分間機械的に破壊し得る。一部の実施形態において、3度目の機械的破壊後に大型の組織片が存在した場合、5%CO2下37℃での更に30分間のインキュベーションを伴う又は伴わない1回又は2回の更なる機械的分離をサンプルに適用した。一部の実施形態において、最終回のインキュベーションの終了時に細胞懸濁液が多数の赤血球又は死細胞を含有した場合、フィコールを使用した密度勾配分離を実施して、そうした細胞を除去し得る。
[00472] 一部の実施形態において、第1の拡大培養ステップ前の回収された細胞懸濁
液は、「初代細胞集団」又は「新鮮に回収された」細胞集団と呼ばれる。
液は、「初代細胞集団」又は「新鮮に回収された」細胞集団と呼ばれる。
[00473] 一部の実施形態において、細胞は、以下に更に詳細に記載し、図8に例示す
る、ステップBに記載の拡大培養に進む前に、任意選択によりサンプル回収後に凍結され、凍結貯蔵され得る。
る、ステップBに記載の拡大培養に進む前に、任意選択によりサンプル回収後に凍結され、凍結貯蔵され得る。
B.ステップB:第1の拡大培養
[00474] 一部の実施形態において、本方法は、対象/患者への投与時に複製サイクル
を増加させることができる幼若TILを得ることを提供し、従って成熟TIL(即ち被験者/患者への投与前に更に多くの回数の複製を受けたTIL)を超える追加の治療上の利点を提供し得る。幼若TILの特徴が、文献に記載されている。例えば、Donia, at al.,
Scandinavian Journal of Immunology, 75:157-167 (2012);Dudley et al., Clin Cancer Res, 16:6122-6131 (2010)、Huang et al., J Immunother, 28(3):258-267 (2005)
、Besser et al., Clin Cancer Res, 19(17):OF1-OF9 (2013)、Besser et al., J Immunother 32:415-423 (2009)、Robbins, et al., J Immunol 2004;173:7125-7130、Shen et al., J Immunother, 30:123-129 (2007)、Zhou, et al., J Immunother, 28:53-62 (2005)及びTran, et al., J Immunother, 31:742-751 (2008)であり、これらは、全て全体として参照により本明細書に組み込まれる。
[00474] 一部の実施形態において、本方法は、対象/患者への投与時に複製サイクル
を増加させることができる幼若TILを得ることを提供し、従って成熟TIL(即ち被験者/患者への投与前に更に多くの回数の複製を受けたTIL)を超える追加の治療上の利点を提供し得る。幼若TILの特徴が、文献に記載されている。例えば、Donia, at al.,
Scandinavian Journal of Immunology, 75:157-167 (2012);Dudley et al., Clin Cancer Res, 16:6122-6131 (2010)、Huang et al., J Immunother, 28(3):258-267 (2005)
、Besser et al., Clin Cancer Res, 19(17):OF1-OF9 (2013)、Besser et al., J Immunother 32:415-423 (2009)、Robbins, et al., J Immunol 2004;173:7125-7130、Shen et al., J Immunother, 30:123-129 (2007)、Zhou, et al., J Immunother, 28:53-62 (2005)及びTran, et al., J Immunother, 31:742-751 (2008)であり、これらは、全て全体として参照により本明細書に組み込まれる。
[00475] T及びBリンパ球の多様な抗原受容体は、限られているが多数の遺伝子セグ
メントの体細胞組換えによって産生される。V(可変)、D(多様性)、J(結合)及びC(定数)の遺伝子セグメントは、免疫グロブリン及びT細胞受容体(TCR)の結合特異性及び下流側での適用を決定する。本発明は、T細胞レパートリーの多様性を示し、増加させるTILを生成する方法を提供する。一部の実施形態において、本方法により得られたTILは、T細胞レパートリー多様性の増加を示す。一部の実施形態において、本方法によって得られたTILは、新たに回収されたTIL及び/又は例えば図8に具体化された方法以外の方法を含む、本明細書で提供する以外の方法を使用して調製されたTILと比較して、T細胞レパートリー多様性の増加を示す。一部の実施形態において、図13に例示されているように、本方法によって得られたTILは、新たに回収されたTIL及び/又はプロセス1Cと称される方法を使用して調製されたTILと比較して、T細胞レパートリー多様性の増加を示す。一部の実施形態において、第1の拡大培養で得られたTILは、T細胞レパートリー多様性の増加を示す。一部の実施形態において、多様性の増加は、免疫グロブリンの多様性及び/又はT細胞受容体の多様性の増加である。一部の実施形態において、免疫グロブリンの多様性は、免疫グロブリン重鎖にある。一部の実施形態において、免疫グロブリンの多様性は、免疫グロブリン軽鎖にある。一部の実施形態に
おいて、多様性は、T細胞受容体にある。一部の実施形態において、多様性は、α、β、γ及びδ受容体からなる群から選択されるT細胞受容体の1つにある。一部の実施形態において、T細胞受容体(TCR)α及び/又はβの発現が増加する。一部の実施形態において、T細胞受容体(TCR)αの発現が増加する。一部の実施形態において、T細胞受容体(TCR)βの発現が増加する。一部の実施形態において、TCRab(即ちTCRα/β)の発現が増加する。
メントの体細胞組換えによって産生される。V(可変)、D(多様性)、J(結合)及びC(定数)の遺伝子セグメントは、免疫グロブリン及びT細胞受容体(TCR)の結合特異性及び下流側での適用を決定する。本発明は、T細胞レパートリーの多様性を示し、増加させるTILを生成する方法を提供する。一部の実施形態において、本方法により得られたTILは、T細胞レパートリー多様性の増加を示す。一部の実施形態において、本方法によって得られたTILは、新たに回収されたTIL及び/又は例えば図8に具体化された方法以外の方法を含む、本明細書で提供する以外の方法を使用して調製されたTILと比較して、T細胞レパートリー多様性の増加を示す。一部の実施形態において、図13に例示されているように、本方法によって得られたTILは、新たに回収されたTIL及び/又はプロセス1Cと称される方法を使用して調製されたTILと比較して、T細胞レパートリー多様性の増加を示す。一部の実施形態において、第1の拡大培養で得られたTILは、T細胞レパートリー多様性の増加を示す。一部の実施形態において、多様性の増加は、免疫グロブリンの多様性及び/又はT細胞受容体の多様性の増加である。一部の実施形態において、免疫グロブリンの多様性は、免疫グロブリン重鎖にある。一部の実施形態において、免疫グロブリンの多様性は、免疫グロブリン軽鎖にある。一部の実施形態に
おいて、多様性は、T細胞受容体にある。一部の実施形態において、多様性は、α、β、γ及びδ受容体からなる群から選択されるT細胞受容体の1つにある。一部の実施形態において、T細胞受容体(TCR)α及び/又はβの発現が増加する。一部の実施形態において、T細胞受容体(TCR)αの発現が増加する。一部の実施形態において、T細胞受容体(TCR)βの発現が増加する。一部の実施形態において、TCRab(即ちTCRα/β)の発現が増加する。
[00476] 腫瘍断片の解剖又は消化(例えば、図8のステップAに記載されるように)
後、得られた細胞は、腫瘍及び他の細胞よりもTILの成長に有利な条件下で血清含有IL-2において培養される。一部の実施形態において、腫瘍消化物は、2mLウェルにおいて、不活性化ヒトAB血清を6000IU/mLのIL-2と共に含む培地中でインキュベートされる。この初代細胞集団は、数日、概して3~14日の期間にわたって培養され、それによりバルクTIL集団、概して約1×108個のバルクTIL細胞が得られる。一部の実施形態において、この初代細胞集団は、7~14日の期間にわたって培養され、それによりバルクTIL集団、概して約1×108個のバルクTIL細胞が得られる。一部の実施形態において、この初代細胞集団は、10~14日の期間にわたって培養され、それによりバルクTIL集団、概して約1×108個のバルクTIL細胞が得られる。一部の実施形態において、この初代細胞集団は、約11日の期間にわたって培養され、それによりバルクTIL集団、概して約1×108個のバルクTIL細胞が得られる。
後、得られた細胞は、腫瘍及び他の細胞よりもTILの成長に有利な条件下で血清含有IL-2において培養される。一部の実施形態において、腫瘍消化物は、2mLウェルにおいて、不活性化ヒトAB血清を6000IU/mLのIL-2と共に含む培地中でインキュベートされる。この初代細胞集団は、数日、概して3~14日の期間にわたって培養され、それによりバルクTIL集団、概して約1×108個のバルクTIL細胞が得られる。一部の実施形態において、この初代細胞集団は、7~14日の期間にわたって培養され、それによりバルクTIL集団、概して約1×108個のバルクTIL細胞が得られる。一部の実施形態において、この初代細胞集団は、10~14日の期間にわたって培養され、それによりバルクTIL集団、概して約1×108個のバルクTIL細胞が得られる。一部の実施形態において、この初代細胞集団は、約11日の期間にわたって培養され、それによりバルクTIL集団、概して約1×108個のバルクTIL細胞が得られる。
[00477] 好ましい実施形態において、以下及び本明細書で説明するように、初期バル
クTIL拡大培養ステップ(例えば、プレREPと称されるプロセスを含み得る図8のステップBで説明したものなど)、その後の、以下ステップDの下及び本明細書に記載されているように、第2の拡大培養(ステップD、急速拡大培養プロトコル(REP)ステップと称されるプロセスを含む)、その後の、任意選択による凍結保存及びその後の第2ステップD(再刺激REPステップと称されるプロセスを含む)を使用してTILの拡大培養を実施することができる。このプロセスによって得られたTILは、任意選択により、本明細書に記載される通り表現型特徴及び代謝パラメータが特徴付けられ得る。
クTIL拡大培養ステップ(例えば、プレREPと称されるプロセスを含み得る図8のステップBで説明したものなど)、その後の、以下ステップDの下及び本明細書に記載されているように、第2の拡大培養(ステップD、急速拡大培養プロトコル(REP)ステップと称されるプロセスを含む)、その後の、任意選択による凍結保存及びその後の第2ステップD(再刺激REPステップと称されるプロセスを含む)を使用してTILの拡大培養を実施することができる。このプロセスによって得られたTILは、任意選択により、本明細書に記載される通り表現型特徴及び代謝パラメータが特徴付けられ得る。
[00478] 実施形態において、TIL培養が24ウェルプレートで例えばCostar24ウ
ェル細胞培養クラスター、平底(Corning Incorporated、Corning, NYを使用して開始さ
れる場合、各ウェルには、IL-2(6000IU/mL;Chiron Corp.、Emeryville, CA)を含む2mLの完全培地(CM)中、1×106個の腫瘍消化物細胞又は1個の腫瘍断片を播種することができる。一部の実施形態において、腫瘍断片は、約1mm3~10mm3である。
ェル細胞培養クラスター、平底(Corning Incorporated、Corning, NYを使用して開始さ
れる場合、各ウェルには、IL-2(6000IU/mL;Chiron Corp.、Emeryville, CA)を含む2mLの完全培地(CM)中、1×106個の腫瘍消化物細胞又は1個の腫瘍断片を播種することができる。一部の実施形態において、腫瘍断片は、約1mm3~10mm3である。
[00479] 一部の実施形態において、第1の拡大培養培地は、培養培地の略称である「
CM」と称される。一部の実施形態において、ステップBのCMは、10%ヒトAB血清、25mMヘペス及び10mg/mLゲンタマイシンを添加したGlutaMAX含有RPMI1640からなる。培養が40mL容量及び10cm2ガス透過性シリコン底のガス透過性フラスコ(例えば、G-Rex10;Wilson Wolf Manufacturing、New Brighton, MN)内で開始される実施形態において(図1)、各フラスコに10~40mLのIL-2含有CM中の10~40×106個の腫瘍消化物生細胞又は5~30個の腫瘍断片をロードした。G-Rex10及び24ウェルプレートのいずれも、加湿インキュベーターにおいて5%CO2下3
7℃でインキュベートし、培養開始から5日後に培地の半分を取り出して、新鮮なCM及びIL-2を補充し、5日目以降には2~3日毎に培地の半分を交換した。
CM」と称される。一部の実施形態において、ステップBのCMは、10%ヒトAB血清、25mMヘペス及び10mg/mLゲンタマイシンを添加したGlutaMAX含有RPMI1640からなる。培養が40mL容量及び10cm2ガス透過性シリコン底のガス透過性フラスコ(例えば、G-Rex10;Wilson Wolf Manufacturing、New Brighton, MN)内で開始される実施形態において(図1)、各フラスコに10~40mLのIL-2含有CM中の10~40×106個の腫瘍消化物生細胞又は5~30個の腫瘍断片をロードした。G-Rex10及び24ウェルプレートのいずれも、加湿インキュベーターにおいて5%CO2下3
7℃でインキュベートし、培養開始から5日後に培地の半分を取り出して、新鮮なCM及びIL-2を補充し、5日目以降には2~3日毎に培地の半分を交換した。
[00480] 腫瘍断片の調製後、得られた細胞(即ち断片)は、腫瘍及び他の細胞よりも
TILの成長に有利な条件下で血清含有IL-2において培養される。一部の実施形態において、腫瘍消化物は、2mLウェルにおいて、不活性化ヒトAB血清を6000IU/
mLのIL-2と共に含む培地中で(又はある場合には本明細書に概説される通りaAPC細胞集団の存在下で)インキュベートされる。この初代細胞集団は、数日、概して10~14日の期間にわたって培養され、それによりバルクTIL集団、概して約1×108個のバルクTIL細胞が得られる。一部の実施形態において、第1の拡大培養中の成長培地は、IL-2又はその変異体を含む。一部の実施形態において、ILは、組換えヒトIL-2(rhIL-2)である。一部の実施形態において、IL-2ストック溶液は、1mgバイアルについて20~30×106IU/mgの比活性を有する。一部の実施形態において、IL-2ストック溶液は、1mgバイアルについて20×106IU/mgの比活性を有する。一部の実施形態において、IL-2ストック溶液は、1mgバイアルについて25×106IU/mgの比活性を有する。一部の実施形態において、IL-2ストック溶液は、1mgバイアルについて30×106IU/mgの比活性を有する。一部の実施形態において、IL-2ストック溶液は、4~8×106IU/mgのIL-2の最終濃度を有する。一部の実施形態において、IL-2ストック溶液は、5~7×106IU/mgのIL-2の最終濃度を有する。一部の実施形態において、IL-2ストック溶液は、6×106IU/mgのIL-2の最終濃度を有する。一部の実施形態において、IL-2ストック溶液は、実施例4に記載される通り調製される。一部の実施形態において、第1の拡大培養培地は、約10,000IU/mLのIL-2、約9,000IU/mLのIL-2、約8,000IU/mLのIL-2、約7,000IU/mLのIL-2、約6000IU/mLのIL-2又は約5,000IU/mLのIL-2を含む。一部の実施形態において、第1の拡大培養培地は、約9,000IU/mLのIL-2~約5,000IU/mLのIL-2を含む。一部の実施形態において、第1の拡大培養培地は、約8,000IU/mLのIL-2~約6,000IU/mLのIL-2を含む。一部の実施形態において、第1の拡大培養培地は、約7,000IU/mLのIL-2~約6,000IU/mLのIL-2を含む。一部の実施形態において、第1の拡大培養培地は、約6,000IU/mLのIL-2を含む。一実施形態において、細胞培養培地は、IL-2を更に含む。一部の実施形態において、細胞培養培地は、約3000IU/mLのIL-2を含む。一実施形態において、細胞培養培地は、IL-2を更に含む。好ましい一実施形態において、細胞培養培地は、約3000IU/mLのIL-2を含む。一実施形態において、細胞培養培地は、約1000IU/mL、約1500IU/mL、約2000IU/mL、約2500IU/mL、約3000IU/mL、約3500IU/mL、約4000IU/mL、約4500IU/mL、約5000IU/mL、約5500IU/mL、約6000IU/mL、約6500IU/mL、約7000IU/mL、約7500IU/mL又は約8000IU/mLのIL-2を含む。一実施形態において、細胞培養培地は、1000~2000IU/mL、2000~3000IU/mL、3000~4000IU/mL、4000~5000IU/mL、5000~6000IU/mL、6000~7000IU/mL、7000~8000IU/mL又は約8000IU/mLのIL-2を含む。
TILの成長に有利な条件下で血清含有IL-2において培養される。一部の実施形態において、腫瘍消化物は、2mLウェルにおいて、不活性化ヒトAB血清を6000IU/
mLのIL-2と共に含む培地中で(又はある場合には本明細書に概説される通りaAPC細胞集団の存在下で)インキュベートされる。この初代細胞集団は、数日、概して10~14日の期間にわたって培養され、それによりバルクTIL集団、概して約1×108個のバルクTIL細胞が得られる。一部の実施形態において、第1の拡大培養中の成長培地は、IL-2又はその変異体を含む。一部の実施形態において、ILは、組換えヒトIL-2(rhIL-2)である。一部の実施形態において、IL-2ストック溶液は、1mgバイアルについて20~30×106IU/mgの比活性を有する。一部の実施形態において、IL-2ストック溶液は、1mgバイアルについて20×106IU/mgの比活性を有する。一部の実施形態において、IL-2ストック溶液は、1mgバイアルについて25×106IU/mgの比活性を有する。一部の実施形態において、IL-2ストック溶液は、1mgバイアルについて30×106IU/mgの比活性を有する。一部の実施形態において、IL-2ストック溶液は、4~8×106IU/mgのIL-2の最終濃度を有する。一部の実施形態において、IL-2ストック溶液は、5~7×106IU/mgのIL-2の最終濃度を有する。一部の実施形態において、IL-2ストック溶液は、6×106IU/mgのIL-2の最終濃度を有する。一部の実施形態において、IL-2ストック溶液は、実施例4に記載される通り調製される。一部の実施形態において、第1の拡大培養培地は、約10,000IU/mLのIL-2、約9,000IU/mLのIL-2、約8,000IU/mLのIL-2、約7,000IU/mLのIL-2、約6000IU/mLのIL-2又は約5,000IU/mLのIL-2を含む。一部の実施形態において、第1の拡大培養培地は、約9,000IU/mLのIL-2~約5,000IU/mLのIL-2を含む。一部の実施形態において、第1の拡大培養培地は、約8,000IU/mLのIL-2~約6,000IU/mLのIL-2を含む。一部の実施形態において、第1の拡大培養培地は、約7,000IU/mLのIL-2~約6,000IU/mLのIL-2を含む。一部の実施形態において、第1の拡大培養培地は、約6,000IU/mLのIL-2を含む。一実施形態において、細胞培養培地は、IL-2を更に含む。一部の実施形態において、細胞培養培地は、約3000IU/mLのIL-2を含む。一実施形態において、細胞培養培地は、IL-2を更に含む。好ましい一実施形態において、細胞培養培地は、約3000IU/mLのIL-2を含む。一実施形態において、細胞培養培地は、約1000IU/mL、約1500IU/mL、約2000IU/mL、約2500IU/mL、約3000IU/mL、約3500IU/mL、約4000IU/mL、約4500IU/mL、約5000IU/mL、約5500IU/mL、約6000IU/mL、約6500IU/mL、約7000IU/mL、約7500IU/mL又は約8000IU/mLのIL-2を含む。一実施形態において、細胞培養培地は、1000~2000IU/mL、2000~3000IU/mL、3000~4000IU/mL、4000~5000IU/mL、5000~6000IU/mL、6000~7000IU/mL、7000~8000IU/mL又は約8000IU/mLのIL-2を含む。
[00481] 一部の実施形態において、第1の拡大培養培地は、約500IU/mLのI
L-15、約400IU/mLのIL-15、約300IU/mLのIL-15、約200IU/mLのIL-15、約180IU/mLのIL-15、約160IU/mLのIL-15、約140IU/mLのIL-15、約120IU/mLのIL-15又は約100IU/mLのIL-15を含む。一部の実施形態において、第1の拡大培養培地は、約500IU/mLのIL-15~約100IU/mLのIL-15を含む。一部の実施形態において、第1の拡大培養培地は、約400IU/mLのIL-15~約100IU/mLのIL-15を含む。一部の実施形態において、第1の拡大培養培地は、約300IU/mLのIL-15~約100IU/mLのIL-15を含む。一部の実施形態において、第1の拡大培養培地は、約200IU/mLのIL-15を含む。一部の実施形態において、細胞培養培地は、約180IU/mLのIL-15を含む。一実施形態において、細胞培養培地は、IL-15を更に含む。好ましい一実施形態において、細胞培養培
地は、約180IU/mLのIL-15を含む。
L-15、約400IU/mLのIL-15、約300IU/mLのIL-15、約200IU/mLのIL-15、約180IU/mLのIL-15、約160IU/mLのIL-15、約140IU/mLのIL-15、約120IU/mLのIL-15又は約100IU/mLのIL-15を含む。一部の実施形態において、第1の拡大培養培地は、約500IU/mLのIL-15~約100IU/mLのIL-15を含む。一部の実施形態において、第1の拡大培養培地は、約400IU/mLのIL-15~約100IU/mLのIL-15を含む。一部の実施形態において、第1の拡大培養培地は、約300IU/mLのIL-15~約100IU/mLのIL-15を含む。一部の実施形態において、第1の拡大培養培地は、約200IU/mLのIL-15を含む。一部の実施形態において、細胞培養培地は、約180IU/mLのIL-15を含む。一実施形態において、細胞培養培地は、IL-15を更に含む。好ましい一実施形態において、細胞培養培
地は、約180IU/mLのIL-15を含む。
[00482] 一部の実施形態において、第1の拡大培養培地は、約20IU/mLのIL
-21、約15IU/mLのIL-21、約12IU/mLのIL-21、約10IU/mLのIL-21、約5IU/mLのIL-21、約4IU/mLのIL-21、約3IU/mLのIL-21、約2IU/mLのIL-21、約1IU/mLのIL-21又は約0.5IU/mLのIL-21を含む。一部の実施形態において、第1の拡大培養培地は、約20IU/mLのIL-21~約0.5IU/mLのIL-21を含む。一部の実施形態において、第1の拡大培養培地は、約15IU/mLのIL-21~約0.5IU/mLのIL-21を含む。一部の実施形態において、第1の拡大培養培地は、約12IU/mLのIL-21~約0.5IU/mLのIL-21を含む。一部の実施形態において、第1の拡大培養培地は、約10IU/mLのIL-21~約0.5IU/mLのIL-21を含む。一部の実施形態において、第1の拡大培養培地は、約5IU/mLのIL-21~約1IU/mLのIL-21を含む。一部の実施形態において、第1の拡大培養培地は、約2IU/mLのIL-21を含む。一部の実施形態において、細胞培養培地は、約1IU/mLのIL-21を含む。一部の実施形態において、細胞培養培地は、約0.5IU/mLのIL-21を含む。一実施形態において、細胞培養培地は、IL-21を更に含む。好ましい一実施形態において、細胞培養培地は、約1IU/mLのIL-21を含む。
-21、約15IU/mLのIL-21、約12IU/mLのIL-21、約10IU/mLのIL-21、約5IU/mLのIL-21、約4IU/mLのIL-21、約3IU/mLのIL-21、約2IU/mLのIL-21、約1IU/mLのIL-21又は約0.5IU/mLのIL-21を含む。一部の実施形態において、第1の拡大培養培地は、約20IU/mLのIL-21~約0.5IU/mLのIL-21を含む。一部の実施形態において、第1の拡大培養培地は、約15IU/mLのIL-21~約0.5IU/mLのIL-21を含む。一部の実施形態において、第1の拡大培養培地は、約12IU/mLのIL-21~約0.5IU/mLのIL-21を含む。一部の実施形態において、第1の拡大培養培地は、約10IU/mLのIL-21~約0.5IU/mLのIL-21を含む。一部の実施形態において、第1の拡大培養培地は、約5IU/mLのIL-21~約1IU/mLのIL-21を含む。一部の実施形態において、第1の拡大培養培地は、約2IU/mLのIL-21を含む。一部の実施形態において、細胞培養培地は、約1IU/mLのIL-21を含む。一部の実施形態において、細胞培養培地は、約0.5IU/mLのIL-21を含む。一実施形態において、細胞培養培地は、IL-21を更に含む。好ましい一実施形態において、細胞培養培地は、約1IU/mLのIL-21を含む。
[00483] 一実施形態において、細胞培養培地は、OKT-3抗体を含む。一部の実施
形態において、細胞培養培地は、約30ng/mLのOKT-3抗体を含む。一実施形態において、細胞培養培地は、約0.1ng/mL、約0.5ng/mL、約1ng/mL、約2.5ng/mL、約5ng/mL、約7.5ng/mL、約10ng/mL、約15ng/mL、約20ng/mL、約25ng/mL、約30ng/mL、約35ng/mL、約40ng/mL、約50ng/mL、約60ng/mL、約70ng/mL、約80ng/mL、約90ng/mL、約100ng/mL、約200ng/mL、約500ng/mL及び約1μg/mLのOKT-3抗体を含む。一実施形態において、細胞培養培地は、0.1ng/mL~1ng/mL、1ng/mL~5ng/mL、5ng/mL~10ng/mL、10ng/mL~20ng/mL、20ng/mL~30ng/mL、30ng/mL~40ng/mL、40ng/mL~50ng/mL及び50ng/mL~100ng/mLのOKT-3抗体を含む。一部の実施形態において、細胞培養培地はOKT-3抗体を含まない。
形態において、細胞培養培地は、約30ng/mLのOKT-3抗体を含む。一実施形態において、細胞培養培地は、約0.1ng/mL、約0.5ng/mL、約1ng/mL、約2.5ng/mL、約5ng/mL、約7.5ng/mL、約10ng/mL、約15ng/mL、約20ng/mL、約25ng/mL、約30ng/mL、約35ng/mL、約40ng/mL、約50ng/mL、約60ng/mL、約70ng/mL、約80ng/mL、約90ng/mL、約100ng/mL、約200ng/mL、約500ng/mL及び約1μg/mLのOKT-3抗体を含む。一実施形態において、細胞培養培地は、0.1ng/mL~1ng/mL、1ng/mL~5ng/mL、5ng/mL~10ng/mL、10ng/mL~20ng/mL、20ng/mL~30ng/mL、30ng/mL~40ng/mL、40ng/mL~50ng/mL及び50ng/mL~100ng/mLのOKT-3抗体を含む。一部の実施形態において、細胞培養培地はOKT-3抗体を含まない。
[00484] 一部の実施形態において、細胞培養培地は、細胞培養培地中に1つ以上のT
NFRSFアゴニストを含む。一部の実施形態において、TNFRSFアゴニストは4-1BBアゴニストを含む。一部の実施形態において、TNFRSFアゴニストは4-1BBアゴニストであり、4-1BBアゴニストは、ウレルマブ、ウトミルマブ、EU-101、融合タンパク質並びにそれらの断片、誘導体、変異体、バイオシミラー及び組み合わせからなる群から選択される。一部の実施形態において、TNFRSFアゴニストは、細胞培養培地中、0.1μg/mL~100μg/mLの濃度を達成するのに十分な濃度で添加される。一部の実施形態において、TNFRSFアゴニストは、細胞培養培地中、20μg/mL~40μg/mLの濃度を達成するのに十分な濃度で添加される。
NFRSFアゴニストを含む。一部の実施形態において、TNFRSFアゴニストは4-1BBアゴニストを含む。一部の実施形態において、TNFRSFアゴニストは4-1BBアゴニストであり、4-1BBアゴニストは、ウレルマブ、ウトミルマブ、EU-101、融合タンパク質並びにそれらの断片、誘導体、変異体、バイオシミラー及び組み合わせからなる群から選択される。一部の実施形態において、TNFRSFアゴニストは、細胞培養培地中、0.1μg/mL~100μg/mLの濃度を達成するのに十分な濃度で添加される。一部の実施形態において、TNFRSFアゴニストは、細胞培養培地中、20μg/mL~40μg/mLの濃度を達成するのに十分な濃度で添加される。
[00485] 一部の実施形態において、1つ以上のTNFRSFに加えて、細胞培養培地
は、初期濃度約3000IU/mLのIL-2及び初期濃度約30ng/mLのOKT-3抗体を更に含み、1つ以上のTNFRSFアゴニストは、4-1BBアゴニストを含む。
は、初期濃度約3000IU/mLのIL-2及び初期濃度約30ng/mLのOKT-3抗体を更に含み、1つ以上のTNFRSFアゴニストは、4-1BBアゴニストを含む。
[00486] 一部の実施形態において、第1の拡大培養培地は、培養培地の略称である「
CM」と称される。一部の実施形態において、これはCM1(培養培地1)と称される。一部の実施形態において、CMは、10%ヒトAB血清、25mMヘペス及び10mg/mLゲンタマイシンを添加したGlutaMAX含有RPMI1640からなる。培養が40mL容量及び10cm2ガス透過性シリコン底のガス透過性フラスコ(例えば、G-Rex10;Wilson Wolf Manufacturing、New Brighton, MN)内で開始される実施形態において(図1)、各フラスコに10~40mLのIL-2含有CM中の10~40×106個の腫瘍消化物生細胞又は5~30個の腫瘍断片をロードした。G-Rex10及び24ウェルプレートのい
ずれも、加湿インキュベーターにおいて5%CO2下37℃でインキュベートし、培養開始から5日後に培地の半分を取り出して、新鮮なCM及びIL-2を補充し、5日目以降には2~3日毎に培地の半分を交換した。一部の実施形態において、CMは、実施例に記載されるCM1であり、実施例5を参照されたい。一部の実施形態において、第1の拡大培養は、初期細胞培養培地又は第1の細胞培養培地中で行われる。一部の実施形態において、初期細胞培養培地又は第1の細胞培養培地は、IL-2を含む。
CM」と称される。一部の実施形態において、これはCM1(培養培地1)と称される。一部の実施形態において、CMは、10%ヒトAB血清、25mMヘペス及び10mg/mLゲンタマイシンを添加したGlutaMAX含有RPMI1640からなる。培養が40mL容量及び10cm2ガス透過性シリコン底のガス透過性フラスコ(例えば、G-Rex10;Wilson Wolf Manufacturing、New Brighton, MN)内で開始される実施形態において(図1)、各フラスコに10~40mLのIL-2含有CM中の10~40×106個の腫瘍消化物生細胞又は5~30個の腫瘍断片をロードした。G-Rex10及び24ウェルプレートのい
ずれも、加湿インキュベーターにおいて5%CO2下37℃でインキュベートし、培養開始から5日後に培地の半分を取り出して、新鮮なCM及びIL-2を補充し、5日目以降には2~3日毎に培地の半分を交換した。一部の実施形態において、CMは、実施例に記載されるCM1であり、実施例5を参照されたい。一部の実施形態において、第1の拡大培養は、初期細胞培養培地又は第1の細胞培養培地中で行われる。一部の実施形態において、初期細胞培養培地又は第1の細胞培養培地は、IL-2を含む。
[00487] 一部の実施形態において、実施例及び図で考察されているように、第1の拡
大培養(例えば、プレREPと称されることもあるものを含み得る、図8のステップBに記載されるプロセスなどを含む)プロセスは、3~14日間に短縮される。一部の実施形態において、例えば図4及び5並びに例えば図8のステップBに記載されている実施例を含む実施例で考察されているように、第1の拡大培養(例えば、プレREPと称されることもある図8のステップBに記載されるプロセスなどを含み得る)プロセスは、7~14日間に短縮される。一部の実施形態において、実施例で考察し、図4及び5に示すように、ステップBの第1の拡大培養は、10~14日間に短縮される。一部の実施形態において、実施例で考察し、図4及び5並びに例えば図8のステップBに記載されている拡大培養を含む第1の拡大培養は、11日間に短縮される。
大培養(例えば、プレREPと称されることもあるものを含み得る、図8のステップBに記載されるプロセスなどを含む)プロセスは、3~14日間に短縮される。一部の実施形態において、例えば図4及び5並びに例えば図8のステップBに記載されている実施例を含む実施例で考察されているように、第1の拡大培養(例えば、プレREPと称されることもある図8のステップBに記載されるプロセスなどを含み得る)プロセスは、7~14日間に短縮される。一部の実施形態において、実施例で考察し、図4及び5に示すように、ステップBの第1の拡大培養は、10~14日間に短縮される。一部の実施形態において、実施例で考察し、図4及び5並びに例えば図8のステップBに記載されている拡大培養を含む第1の拡大培養は、11日間に短縮される。
[00488] 一部の実施形態において、第1のTIL拡大培養は、1日、2日、3日、4
日、5日、6日、7日、8日、9日、10日、11日、12日、13日又は14日間続行され得る。一部の実施形態において、第1のTIL拡大培養は、1日~14日間続行され得る。一部の実施形態において、第1のTIL拡大培養は、2日~14日間続行され得る。一部の実施形態において、第1のTIL拡大培養は、3日~14日間続行され得る。一部の実施形態において、第1のTIL拡大培養は、4日~14日間続行され得る。一部の実施形態において、第1のTIL拡大培養は、5日~14日間続行され得る。一部の実施形態において、第1のTIL拡大培養は、6日~14日間続行され得る。一部の実施形態において、第1のTIL拡大培養は、7日~14日間続行され得る。一部の実施形態において、第1のTIL拡大培養は、8日~14日間続行され得る。一部の実施形態において、第1のTIL拡大培養は、9日~14日間続行され得る。一部の実施形態において、第1のTIL拡大培養は、10日~14日間続行され得る。一部の実施形態において、第1のTIL拡大培養は、11日~14日間続行され得る。一部の実施形態において、第1のTIL拡大培養は、12日~14日間続行され得る。一部の実施形態において、第1のTIL拡大培養は、13日~14日間続行され得る。一部の実施形態において、第1のTIL拡大培養は、14日間続行され得る。一部の実施形態において、第1のTIL拡大培養は、1日~11日間続行され得る。一部の実施形態において、第1のTIL拡大培養は、2日~11日間続行され得る。一部の実施形態において、第1のTIL拡大培養は、3日~11日間続行され得る。一部の実施形態において、第1のTIL拡大培養は、4日~11日間続行され得る。一部の実施形態において、第1のTIL拡大培養は、5日~11日間続行され得る。一部の実施形態において、第1のTIL拡大培養は、6日~11日間続行され得る。一部の実施形態において、第1のTIL拡大培養は、7日~11日間続行され得る。一部の実施形態において、第1のTIL拡大培養は、8日~11日間続行され得る。一部の実施形態において、第1のTIL拡大培養は、9日~11日間続行され得る。一部の実施形態において、第1のTIL拡大培養は、10日~11日間続行され得る。一
部の実施形態において、第1のTIL拡大培養は、11日間続行され得る。
日、5日、6日、7日、8日、9日、10日、11日、12日、13日又は14日間続行され得る。一部の実施形態において、第1のTIL拡大培養は、1日~14日間続行され得る。一部の実施形態において、第1のTIL拡大培養は、2日~14日間続行され得る。一部の実施形態において、第1のTIL拡大培養は、3日~14日間続行され得る。一部の実施形態において、第1のTIL拡大培養は、4日~14日間続行され得る。一部の実施形態において、第1のTIL拡大培養は、5日~14日間続行され得る。一部の実施形態において、第1のTIL拡大培養は、6日~14日間続行され得る。一部の実施形態において、第1のTIL拡大培養は、7日~14日間続行され得る。一部の実施形態において、第1のTIL拡大培養は、8日~14日間続行され得る。一部の実施形態において、第1のTIL拡大培養は、9日~14日間続行され得る。一部の実施形態において、第1のTIL拡大培養は、10日~14日間続行され得る。一部の実施形態において、第1のTIL拡大培養は、11日~14日間続行され得る。一部の実施形態において、第1のTIL拡大培養は、12日~14日間続行され得る。一部の実施形態において、第1のTIL拡大培養は、13日~14日間続行され得る。一部の実施形態において、第1のTIL拡大培養は、14日間続行され得る。一部の実施形態において、第1のTIL拡大培養は、1日~11日間続行され得る。一部の実施形態において、第1のTIL拡大培養は、2日~11日間続行され得る。一部の実施形態において、第1のTIL拡大培養は、3日~11日間続行され得る。一部の実施形態において、第1のTIL拡大培養は、4日~11日間続行され得る。一部の実施形態において、第1のTIL拡大培養は、5日~11日間続行され得る。一部の実施形態において、第1のTIL拡大培養は、6日~11日間続行され得る。一部の実施形態において、第1のTIL拡大培養は、7日~11日間続行され得る。一部の実施形態において、第1のTIL拡大培養は、8日~11日間続行され得る。一部の実施形態において、第1のTIL拡大培養は、9日~11日間続行され得る。一部の実施形態において、第1のTIL拡大培養は、10日~11日間続行され得る。一
部の実施形態において、第1のTIL拡大培養は、11日間続行され得る。
[00489] 一部の実施形態において、IL-2、IL-7、IL-15及び/又はIL
-21の組み合わせは、第1の拡大培養中の組み合わせとして用いられる。一部の実施形態において、IL-2、IL-7、IL-15及び/又はIL-21並びにそれらの任意選択の組み合わせは、例えば、図8による並びに本明細書に記載されている通り、ステップBプロセス中を含む第1の拡大培養中に含められ得る。一部の実施形態において、IL-2、IL-15及びIL-21の組み合わせが、第1の拡大培養中の組み合わせとして用いられる。一部の実施形態において、IL-2、IL-15及びIL-21並びにそれらの任意選択の組み合わせは、例えば、図8による及び本明細書に記載されている通りステップBプロセス中に含められ得る。一部の実施形態において、IL-15及び/又はIL-21は、1日目に添加される。一部の実施形態において、コア生検が膵臓腫瘍からのもの(例えば、膵臓起源のもの)である場合、IL-15及び/又はIL-21は、1日目に添加される。一部の実施形態において、IL-15は含まれない。一部の実施形態において、IL-21は含まれない。一部の実施形態において、IL-15もIL-21も含まれない。
-21の組み合わせは、第1の拡大培養中の組み合わせとして用いられる。一部の実施形態において、IL-2、IL-7、IL-15及び/又はIL-21並びにそれらの任意選択の組み合わせは、例えば、図8による並びに本明細書に記載されている通り、ステップBプロセス中を含む第1の拡大培養中に含められ得る。一部の実施形態において、IL-2、IL-15及びIL-21の組み合わせが、第1の拡大培養中の組み合わせとして用いられる。一部の実施形態において、IL-2、IL-15及びIL-21並びにそれらの任意選択の組み合わせは、例えば、図8による及び本明細書に記載されている通りステップBプロセス中に含められ得る。一部の実施形態において、IL-15及び/又はIL-21は、1日目に添加される。一部の実施形態において、コア生検が膵臓腫瘍からのもの(例えば、膵臓起源のもの)である場合、IL-15及び/又はIL-21は、1日目に添加される。一部の実施形態において、IL-15は含まれない。一部の実施形態において、IL-21は含まれない。一部の実施形態において、IL-15もIL-21も含まれない。
[00490] 一部の実施形態において、実施例及び図で考察されているように、第1の拡
大培養(例えば、プレREPと称される図8のステップBに記載されるプロセスなどを含む)プロセスは、3~14日間に短縮される。一部の実施形態において、実施例で考察し、図4及び5に示すように、ステップBの第1の拡大培養は、7~14日間に短縮される。一部の実施形態において、実施例で考察し、図4、5、6及び7に示すように、ステップBの第1の拡大培養は、10~14日間に短縮される。一部の実施形態において、実施例で考察し、図4、5、6及び7に示すように、ステップBの第1の拡大培養は、11日間に短縮される。
大培養(例えば、プレREPと称される図8のステップBに記載されるプロセスなどを含む)プロセスは、3~14日間に短縮される。一部の実施形態において、実施例で考察し、図4及び5に示すように、ステップBの第1の拡大培養は、7~14日間に短縮される。一部の実施形態において、実施例で考察し、図4、5、6及び7に示すように、ステップBの第1の拡大培養は、10~14日間に短縮される。一部の実施形態において、実施例で考察し、図4、5、6及び7に示すように、ステップBの第1の拡大培養は、11日間に短縮される。
[00491] 一部の実施形態において、第1の拡大培養、例えば図8によるステップBは
、閉鎖系バイオリアクターで実施される。一部の実施形態において、本明細書に記載される通り、TIL拡大培養のために閉鎖系が用いられる。一部の実施形態において、単一のバイオリアクターが用いられる。一部の実施形態において、用いられる単一のバイオリアクターは、例えば、G-REX-10又はG-REX-100である。一部の実施形態において、閉鎖系バ
イオリアクターは、単一のバイオリアクターである。
、閉鎖系バイオリアクターで実施される。一部の実施形態において、本明細書に記載される通り、TIL拡大培養のために閉鎖系が用いられる。一部の実施形態において、単一のバイオリアクターが用いられる。一部の実施形態において、用いられる単一のバイオリアクターは、例えば、G-REX-10又はG-REX-100である。一部の実施形態において、閉鎖系バ
イオリアクターは、単一のバイオリアクターである。
[00492] 一部の実施形態において、PD-1、LAG-3、TIM-3、CISH及
びCBLBを含む、本明細書に記載の遺伝子を標的とする1つ以上のsd-RNAは、0.1μM sd-RNA/10,000TIL/100μL培地、0.5μM sd-RNA/10,000TIL/100μL培地、0.75μM sd-RNA/10,000TIL/100μL培地、1μM sd-RNA/10,000TIL/100μL培地、1.25μM sd-RNA/10,000TIL/100μL培地、1.5μM sd-RNA/10,000TIL/100μL培地、2μM sd-RNA/10,000TIL/100μL培地、5μM sd-RNA/10,000TIL/100μL培地又は10μM sd-RNA/10,000TIL/100μL培地からなる群から選択される量において、第1の拡大培養、例えば図8のステップB中、TIL及び他の薬剤を含む細胞培養培地に添加され得る。一部の実施形態において、PD-1、LAG-3、TIM-3、CISH及びCBLBを含む、本明細書に記載の遺伝子を標的とする1つ以上のsd-RNAは、第1の拡大培養、例えば図8のステップB中、1日2回、1日1回、2日毎、3日毎、4日毎、5日毎、6日毎又は7日毎にTIL培養物に添加され得る。一実施形態において、PD-1、LAG-3、TIM-3、CISH及びCBLBを含む、本明細書に記載の遺伝子を標的とする1つ以上のsd-RNAは、0.1μM sd-RNA/10,000TIL、0.5μM sd-RNA/10,000TIL、0.
75μM sd-RNA/10,000TIL、1μM sd-RNA/10,000TIL、1.25μM sd-RNA/10,000TIL、1.5μM sd-RNA/10,000TIL、2μM sd-RNA/10,000TIL、5μM sd-RNA/10,000TIL又は10μM sd-RNA/10,000TILからなる群から選択される量において、第1の拡大培養、例えば図8のステップB中、TIL及び他の薬剤を含む細胞培養培地に添加され得る。一実施形態において、PD-1、LAG-3、TIM-3、CISH及びCBLBを含む、本明細書に記載の遺伝子を標的とする1つ以上のsd-RNAは、第1の拡大培養、例えば図8のステップB中、1日2回、1日1回、2日毎、3日毎、4日毎、5日毎、6日毎又は7日毎にTIL培養物に添加され得る。
びCBLBを含む、本明細書に記載の遺伝子を標的とする1つ以上のsd-RNAは、0.1μM sd-RNA/10,000TIL/100μL培地、0.5μM sd-RNA/10,000TIL/100μL培地、0.75μM sd-RNA/10,000TIL/100μL培地、1μM sd-RNA/10,000TIL/100μL培地、1.25μM sd-RNA/10,000TIL/100μL培地、1.5μM sd-RNA/10,000TIL/100μL培地、2μM sd-RNA/10,000TIL/100μL培地、5μM sd-RNA/10,000TIL/100μL培地又は10μM sd-RNA/10,000TIL/100μL培地からなる群から選択される量において、第1の拡大培養、例えば図8のステップB中、TIL及び他の薬剤を含む細胞培養培地に添加され得る。一部の実施形態において、PD-1、LAG-3、TIM-3、CISH及びCBLBを含む、本明細書に記載の遺伝子を標的とする1つ以上のsd-RNAは、第1の拡大培養、例えば図8のステップB中、1日2回、1日1回、2日毎、3日毎、4日毎、5日毎、6日毎又は7日毎にTIL培養物に添加され得る。一実施形態において、PD-1、LAG-3、TIM-3、CISH及びCBLBを含む、本明細書に記載の遺伝子を標的とする1つ以上のsd-RNAは、0.1μM sd-RNA/10,000TIL、0.5μM sd-RNA/10,000TIL、0.
75μM sd-RNA/10,000TIL、1μM sd-RNA/10,000TIL、1.25μM sd-RNA/10,000TIL、1.5μM sd-RNA/10,000TIL、2μM sd-RNA/10,000TIL、5μM sd-RNA/10,000TIL又は10μM sd-RNA/10,000TILからなる群から選択される量において、第1の拡大培養、例えば図8のステップB中、TIL及び他の薬剤を含む細胞培養培地に添加され得る。一実施形態において、PD-1、LAG-3、TIM-3、CISH及びCBLBを含む、本明細書に記載の遺伝子を標的とする1つ以上のsd-RNAは、第1の拡大培養、例えば図8のステップB中、1日2回、1日1回、2日毎、3日毎、4日毎、5日毎、6日毎又は7日毎にTIL培養物に添加され得る。
C.ステップC:第1の拡大培養から第2の拡大培養への移行
[00493] ある場合には、例えば図8に示されるように、例えばステップBから得られ
るTIL集団を含む、第1の拡大培養から得られるバルクTIL集団は、以下本明細書で考察されるプロトコルを使用して直ちに凍結保存され得る。代わりに、第2のTIL集団と称される第1の拡大培養から得られたTIL集団は、第2の拡大培養(REPと呼ばれることがある拡大培養を含み得る)に供し、その後、以下で考察するように凍結保存することができる。同様に、遺伝子修飾TILが治療に使用される場合、第1のTIL集団(バルクTIL集団と称されることもある)又は第2のTIL集団(一部の実施形態において、REP TIL集団と称される集団を含み得る)は、拡大培養前又は第1の拡大培養後で第2の拡大培養前に適切な処置のために遺伝子修飾に供することができる。
[00493] ある場合には、例えば図8に示されるように、例えばステップBから得られ
るTIL集団を含む、第1の拡大培養から得られるバルクTIL集団は、以下本明細書で考察されるプロトコルを使用して直ちに凍結保存され得る。代わりに、第2のTIL集団と称される第1の拡大培養から得られたTIL集団は、第2の拡大培養(REPと呼ばれることがある拡大培養を含み得る)に供し、その後、以下で考察するように凍結保存することができる。同様に、遺伝子修飾TILが治療に使用される場合、第1のTIL集団(バルクTIL集団と称されることもある)又は第2のTIL集団(一部の実施形態において、REP TIL集団と称される集団を含み得る)は、拡大培養前又は第1の拡大培養後で第2の拡大培養前に適切な処置のために遺伝子修飾に供することができる。
[00494] 一部の実施形態において、第1の拡大培養から(例えば、図8に示される通
りのステップBから)得られたTILは、選択のためのフェノタイピングまで貯蔵される。一部の実施形態において、第1の拡大培養から(例えば、図8に示される通りのステップBから)得られたTILは、貯蔵されず第2の拡大培養に直接進む。一部の実施形態において、第1の拡大培養から得られたTILは、第1の拡大培養後、第2の拡大培養前に凍結保存されない。一部の実施形態において、第1の拡大培養から第2の拡大培養への移行は、断片化が行われたときから約3日、4日、5日、6日、7日、8日、9日、10日、11日、12日、13日又は14日の時点で行われる。一部の実施形態において、第1の拡大培養から第2の拡大培養への移行は、断片化が行われたときから約3日~14日の時点で行われる。一部の実施形態において、第1の拡大培養から第2の拡大培養への移行は、断片化が行われたときから約4日~14日の時点で行われる。一部の実施形態において、第1の拡大培養から第2の拡大培養への移行は、断片化が行われたときから約4日~10日の時点で行われる。一部の実施形態において、第1の拡大培養から第2の拡大培養への移行は、断片化が行われたときから約7日~14日の時点で行われる。一部の実施形態において、第1の拡大培養から第2の拡大培養への移行は、断片化が行われたときから約14日の時点で行われる。
りのステップBから)得られたTILは、選択のためのフェノタイピングまで貯蔵される。一部の実施形態において、第1の拡大培養から(例えば、図8に示される通りのステップBから)得られたTILは、貯蔵されず第2の拡大培養に直接進む。一部の実施形態において、第1の拡大培養から得られたTILは、第1の拡大培養後、第2の拡大培養前に凍結保存されない。一部の実施形態において、第1の拡大培養から第2の拡大培養への移行は、断片化が行われたときから約3日、4日、5日、6日、7日、8日、9日、10日、11日、12日、13日又は14日の時点で行われる。一部の実施形態において、第1の拡大培養から第2の拡大培養への移行は、断片化が行われたときから約3日~14日の時点で行われる。一部の実施形態において、第1の拡大培養から第2の拡大培養への移行は、断片化が行われたときから約4日~14日の時点で行われる。一部の実施形態において、第1の拡大培養から第2の拡大培養への移行は、断片化が行われたときから約4日~10日の時点で行われる。一部の実施形態において、第1の拡大培養から第2の拡大培養への移行は、断片化が行われたときから約7日~14日の時点で行われる。一部の実施形態において、第1の拡大培養から第2の拡大培養への移行は、断片化が行われたときから約14日の時点で行われる。
[00495] 一部の実施形態において、第1の拡大培養から第2の拡大培養への移行は、
断片化が行われたときから1日、2日、3日、4日、5日、6日、7日、8日、9日、10日、11日、12日、13日又は14日の時点で行われる。一部の実施形態において、第1の拡大培養から第2の拡大培養への移行は、断片化が行われたときから1日~14日で行われる。一部の実施形態において、第1のTIL拡大培養は2日~14日間続行され得る。一部の実施形態において、第1の拡大培養から第2の拡大培養への移行は、断片化が行われたときから3日~14日で行われる。一部の実施形態において、第1の拡大培養から第2の拡大培養への移行は、断片化が行われたときから4日~14日で行われる。一部の実施形態において、第1の拡大培養から第2の拡大培養への移行は、断片化が行われたときから5日~14日で行われる。一部の実施形態において、第1の拡大培養から第2の拡大培養への移行は、断片化が行われたときから6日~14日で行われる。一部の実施形態において、第1の拡大培養から第2の拡大培養への移行は、断片化が行われたときか
ら7日~14日で行われる。一部の実施形態において、第1の拡大培養から第2の拡大培養への移行は、断片化が行われたときから8日~14日で行われる。一部の実施形態において、第1の拡大培養から第2の拡大培養への移行は、断片化が行われたときから9日~14日で行われる。一部の実施形態において、第1の拡大培養から第2の拡大培養への移行は、断片化が行われたときから10日~14日で行われる。一部の実施形態において、第1の拡大培養から第2の拡大培養への移行は、断片化が行われたときから11日~14日で行われる。一部の実施形態において、第1の拡大培養から第2の拡大培養への移行は、断片化が行われたときから12日~14日で行われる。一部の実施形態において、第1の拡大培養から第2の拡大培養への移行は、断片化が行われたときから13日~14日で行われる。一部の実施形態において、第1の拡大培養から第2の拡大培養への移行は、断片化が行われたときから14日で行われる。一部の実施形態において、第1の拡大培養から第2の拡大培養への移行は、断片化が行われたときから1日~11日で行われる。一部の実施形態において、第1の拡大培養から第2の拡大培養への移行は、断片化が行われたときから2日~11日で行われる。一部の実施形態において、第1の拡大培養から第2の拡大培養への移行は、断片化が行われたときから3日~11日で行われる。一部の実施形態において、第1の拡大培養から第2の拡大培養への移行は、断片化が行われたときから4日~11日で行われる。一部の実施形態において、第1の拡大培養から第2の拡大培養への移行は、断片化が行われたときから5日~11日で行われる。一部の実施形態において、第1の拡大培養から第2の拡大培養への移行は、断片化が行われたときから6日~11日で行われる。一部の実施形態において、第1の拡大培養から第2の拡大培養への移行は、断片化が行われたときから7日~11日で行われる。一部の実施形態において、第1の拡大培養から第2の拡大培養への移行は、断片化が行われたときから8日~11日で行われる。一部の実施形態において、第1の拡大培養から第2の拡大培養への移行は、断片化が行われたときから9日~11日で行われる。一部の実施形態において、第1の拡大培養から第2の拡大培養への移行は、断片化が行われたときから10日~11日で行われる。一部の実施形態において、第1の拡大培養から第2の拡大培養への移行は、断片化が行われたときから11日で行われる。
断片化が行われたときから1日、2日、3日、4日、5日、6日、7日、8日、9日、10日、11日、12日、13日又は14日の時点で行われる。一部の実施形態において、第1の拡大培養から第2の拡大培養への移行は、断片化が行われたときから1日~14日で行われる。一部の実施形態において、第1のTIL拡大培養は2日~14日間続行され得る。一部の実施形態において、第1の拡大培養から第2の拡大培養への移行は、断片化が行われたときから3日~14日で行われる。一部の実施形態において、第1の拡大培養から第2の拡大培養への移行は、断片化が行われたときから4日~14日で行われる。一部の実施形態において、第1の拡大培養から第2の拡大培養への移行は、断片化が行われたときから5日~14日で行われる。一部の実施形態において、第1の拡大培養から第2の拡大培養への移行は、断片化が行われたときから6日~14日で行われる。一部の実施形態において、第1の拡大培養から第2の拡大培養への移行は、断片化が行われたときか
ら7日~14日で行われる。一部の実施形態において、第1の拡大培養から第2の拡大培養への移行は、断片化が行われたときから8日~14日で行われる。一部の実施形態において、第1の拡大培養から第2の拡大培養への移行は、断片化が行われたときから9日~14日で行われる。一部の実施形態において、第1の拡大培養から第2の拡大培養への移行は、断片化が行われたときから10日~14日で行われる。一部の実施形態において、第1の拡大培養から第2の拡大培養への移行は、断片化が行われたときから11日~14日で行われる。一部の実施形態において、第1の拡大培養から第2の拡大培養への移行は、断片化が行われたときから12日~14日で行われる。一部の実施形態において、第1の拡大培養から第2の拡大培養への移行は、断片化が行われたときから13日~14日で行われる。一部の実施形態において、第1の拡大培養から第2の拡大培養への移行は、断片化が行われたときから14日で行われる。一部の実施形態において、第1の拡大培養から第2の拡大培養への移行は、断片化が行われたときから1日~11日で行われる。一部の実施形態において、第1の拡大培養から第2の拡大培養への移行は、断片化が行われたときから2日~11日で行われる。一部の実施形態において、第1の拡大培養から第2の拡大培養への移行は、断片化が行われたときから3日~11日で行われる。一部の実施形態において、第1の拡大培養から第2の拡大培養への移行は、断片化が行われたときから4日~11日で行われる。一部の実施形態において、第1の拡大培養から第2の拡大培養への移行は、断片化が行われたときから5日~11日で行われる。一部の実施形態において、第1の拡大培養から第2の拡大培養への移行は、断片化が行われたときから6日~11日で行われる。一部の実施形態において、第1の拡大培養から第2の拡大培養への移行は、断片化が行われたときから7日~11日で行われる。一部の実施形態において、第1の拡大培養から第2の拡大培養への移行は、断片化が行われたときから8日~11日で行われる。一部の実施形態において、第1の拡大培養から第2の拡大培養への移行は、断片化が行われたときから9日~11日で行われる。一部の実施形態において、第1の拡大培養から第2の拡大培養への移行は、断片化が行われたときから10日~11日で行われる。一部の実施形態において、第1の拡大培養から第2の拡大培養への移行は、断片化が行われたときから11日で行われる。
[00496] 一部の実施形態において、TILは第1の拡大培養後、第2の拡大培養前に
貯蔵されず、TILは第2の拡大培養に直接進む(例えば、一部の実施形態において、図8に示すように、ステップBからステップDへの移行中に貯蔵は行われない)。一部の実施形態において、本明細書に記載される通り、移行は閉鎖系で行われる。一部の実施形態において、第1の拡大培養からのTILは、第2のTIL集団からのTILであり、移行期間を伴わず第2の拡大培養に直接進む。
貯蔵されず、TILは第2の拡大培養に直接進む(例えば、一部の実施形態において、図8に示すように、ステップBからステップDへの移行中に貯蔵は行われない)。一部の実施形態において、本明細書に記載される通り、移行は閉鎖系で行われる。一部の実施形態において、第1の拡大培養からのTILは、第2のTIL集団からのTILであり、移行期間を伴わず第2の拡大培養に直接進む。
[00497] 一部の実施形態において、第1の拡大培養から第2の拡大培養への移行は、
例えば、図8によるステップCは、閉鎖系バイオリアクターで実施される。一部の実施形態において、本明細書に記載される通り、TIL拡大培養のために閉鎖系が用いられる。一部の実施形態において、単一のバイオリアクターが用いられる。一部の実施形態において、用いられる単一のバイオリアクターは、例えば、G-REX-10又はG-REX-100である。一
部の実施形態において、閉鎖系バイオリアクターは、単一のバイオリアクターである。
例えば、図8によるステップCは、閉鎖系バイオリアクターで実施される。一部の実施形態において、本明細書に記載される通り、TIL拡大培養のために閉鎖系が用いられる。一部の実施形態において、単一のバイオリアクターが用いられる。一部の実施形態において、用いられる単一のバイオリアクターは、例えば、G-REX-10又はG-REX-100である。一
部の実施形態において、閉鎖系バイオリアクターは、単一のバイオリアクターである。
[00498] 一部の実施形態において、PD-1、LAG-3、TIM-3、CISH及
びCBLBを含む、本明細書に記載の遺伝子を標的とする1つ以上のsd-RNAは、0.1μM sd-RNA/10,000TIL/100μL培地、0.5μM sd-RNA/10,000TIL/100μL培地、0.75μM sd-RNA/10,000TIL/100μL培地、1μM sd-RNA/10,000TIL/100μL培地、1.25μM sd-RNA/10,000TIL/100μL培地、1.5μM sd-RNA/10,000TIL/100μL培地、2μM sd-RNA/10,000TIL/100μL培地、5μM sd-RNA/10,000TIL/100μL
培地又は10μM sd-RNA/10,000TIL/100μL培地からなる群から選択される量において、第1の拡大培養から第2の拡大培養への移行、例えば図8のステップC中、TIL及び他の薬剤を含む細胞培養培地に添加され得る。一部の実施形態において、PD-1、LAG-3、TIM-3、CISH及びCBLBを含む、本明細書に記載の遺伝子を標的とする1つ以上のsd-RNAは、第1の拡大培養から第2の拡大培養への移行、例えば図8のステップC中、1日2回、1日1回、2日毎、3日毎、4日毎、5日毎、6日毎又は7日毎にTIL培養物に添加され得る。一実施形態において、PD-1、LAG-3、TIM-3、CISH及びCBLBを含む、本明細書に記載の遺伝子を標的とする1つ以上のsd-RNAは、0.1μM sd-RNA/10,000TIL、0.5μM sd-RNA/10,000TIL、0.75μM sd-RNA/10,000TIL、1μM sd-RNA/10,000TIL、1.25μM sd-RNA/10,000TIL、1.5μM sd-RNA/10,000TIL、2μM sd-RNA/10,000TIL、5μM sd-RNA/10,000TIL又は10μM sd-RNA/10,000TILからなる群から選択される量において、第1の拡大培養から第2の拡大培養への移行、例えば図8のステップC中、TIL及び他の薬剤を含む細胞培養培地に添加され得る。一実施形態において、PD-1、LAG-3、TIM-3、CISH及びCBLBを含む、本明細書に記載の遺伝子を標的とする1つ以上のsd-RNAは、第1の拡大培養から第2の拡大培養への移行、例えば図8のステップC中、1日2回、1日1回、2日毎、3日毎、4日毎、5日毎、6日毎又は7日毎にTIL培養物に添加され得る。
びCBLBを含む、本明細書に記載の遺伝子を標的とする1つ以上のsd-RNAは、0.1μM sd-RNA/10,000TIL/100μL培地、0.5μM sd-RNA/10,000TIL/100μL培地、0.75μM sd-RNA/10,000TIL/100μL培地、1μM sd-RNA/10,000TIL/100μL培地、1.25μM sd-RNA/10,000TIL/100μL培地、1.5μM sd-RNA/10,000TIL/100μL培地、2μM sd-RNA/10,000TIL/100μL培地、5μM sd-RNA/10,000TIL/100μL
培地又は10μM sd-RNA/10,000TIL/100μL培地からなる群から選択される量において、第1の拡大培養から第2の拡大培養への移行、例えば図8のステップC中、TIL及び他の薬剤を含む細胞培養培地に添加され得る。一部の実施形態において、PD-1、LAG-3、TIM-3、CISH及びCBLBを含む、本明細書に記載の遺伝子を標的とする1つ以上のsd-RNAは、第1の拡大培養から第2の拡大培養への移行、例えば図8のステップC中、1日2回、1日1回、2日毎、3日毎、4日毎、5日毎、6日毎又は7日毎にTIL培養物に添加され得る。一実施形態において、PD-1、LAG-3、TIM-3、CISH及びCBLBを含む、本明細書に記載の遺伝子を標的とする1つ以上のsd-RNAは、0.1μM sd-RNA/10,000TIL、0.5μM sd-RNA/10,000TIL、0.75μM sd-RNA/10,000TIL、1μM sd-RNA/10,000TIL、1.25μM sd-RNA/10,000TIL、1.5μM sd-RNA/10,000TIL、2μM sd-RNA/10,000TIL、5μM sd-RNA/10,000TIL又は10μM sd-RNA/10,000TILからなる群から選択される量において、第1の拡大培養から第2の拡大培養への移行、例えば図8のステップC中、TIL及び他の薬剤を含む細胞培養培地に添加され得る。一実施形態において、PD-1、LAG-3、TIM-3、CISH及びCBLBを含む、本明細書に記載の遺伝子を標的とする1つ以上のsd-RNAは、第1の拡大培養から第2の拡大培養への移行、例えば図8のステップC中、1日2回、1日1回、2日毎、3日毎、4日毎、5日毎、6日毎又は7日毎にTIL培養物に添加され得る。
1.サイトカイン
[00499] 本明細書に記載の拡大培養方法は、一般に、当技術分野において公知の通り
、高用量のサイトカイン、特にIL-2を含む培養培地を使用する。
[00499] 本明細書に記載の拡大培養方法は、一般に、当技術分野において公知の通り
、高用量のサイトカイン、特にIL-2を含む培養培地を使用する。
[00500] 代わりに、TILの急速拡大培養及び/又は第2の拡大培養にサイトカイン
の組み合わせを使用することが更に可能であり、IL-2、IL-15及びIL-21の2つ以上の組み合わせについては、概して国際公開第2015/189356号及び国際公開第2015/189357号(参照により全体として明示的に本明細書に組み込まれる)に概説される通りである。従って、可能な組み合わせとしては、IL-2とIL-15、IL-2とIL-21、IL-15とIL-21とIL-2、IL-15とIL-21が挙げられ、後者には多くの実施形態において特定の使用が見出される。これらの明細書に記載される通り、サイトカインの組み合わせを使用することは、特にリンパ球、詳細にはT細胞の生成に有利である。
の組み合わせを使用することが更に可能であり、IL-2、IL-15及びIL-21の2つ以上の組み合わせについては、概して国際公開第2015/189356号及び国際公開第2015/189357号(参照により全体として明示的に本明細書に組み込まれる)に概説される通りである。従って、可能な組み合わせとしては、IL-2とIL-15、IL-2とIL-21、IL-15とIL-21とIL-2、IL-15とIL-21が挙げられ、後者には多くの実施形態において特定の使用が見出される。これらの明細書に記載される通り、サイトカインの組み合わせを使用することは、特にリンパ球、詳細にはT細胞の生成に有利である。
D.ステップD:第2の拡大培養
[00501] 一部の実施形態において、TIL細胞集団は、例えば、図8に記載の通り、
ステップA及びステップB並びにステップCと称される移行後、回収及び初期バルク処理後、数が増加する。この更なる増加は、本明細書では第2の拡大培養と称され、これは、当技術分野で一般に急速拡大培養法と称される拡大培養プロセス(REP並びに図8のステップDに示されるプロセス)を含み得る。第2の拡大培養は、概して、フィーダー細胞、サイトカイン源及び抗CD3抗体を含め、幾つもの成分を含むガス透過性容器内の培養培地を使用して達成することができる。
[00501] 一部の実施形態において、TIL細胞集団は、例えば、図8に記載の通り、
ステップA及びステップB並びにステップCと称される移行後、回収及び初期バルク処理後、数が増加する。この更なる増加は、本明細書では第2の拡大培養と称され、これは、当技術分野で一般に急速拡大培養法と称される拡大培養プロセス(REP並びに図8のステップDに示されるプロセス)を含み得る。第2の拡大培養は、概して、フィーダー細胞、サイトカイン源及び抗CD3抗体を含め、幾つもの成分を含むガス透過性容器内の培養培地を使用して達成することができる。
[00502] 一部の実施形態において、TILの第2の拡大培養又は第2のTIL拡大培
養(これは、REPと称されることもある拡大培養;並びに図8のステップDに示されるプロセスを含み得る)は、当業者に公知の任意のTILフラスコ又は容器を使用して実施することができる。一部の実施形態において、第2のTIL拡大培養は、7日、8日、9日、10日、11日、12日、13日又は14日間続行し得る。一部の実施形態において、第2のTIL拡大培養は、約7日~約14日間続行し得る。一部の実施形態において、
第2のTIL拡大培養は、約8日~約14日間続行し得る。一部の実施形態において、第2のTIL拡大培養は、約9日~約14日間続行し得る。一部の実施形態において、第2のTIL拡大培養は、約10日~約14日間続行し得る。一部の実施形態において、第2のTIL拡大培養は、約11日~約14日間続行し得る。一部の実施形態において、第2のTIL拡大培養は、約12日~約14日間続行し得る。一部の実施形態において、第2のTIL拡大培養は、約13日~約14日間続行し得る。一部の実施形態において、第2のTIL拡大培養は、約14日間続行し得る。
養(これは、REPと称されることもある拡大培養;並びに図8のステップDに示されるプロセスを含み得る)は、当業者に公知の任意のTILフラスコ又は容器を使用して実施することができる。一部の実施形態において、第2のTIL拡大培養は、7日、8日、9日、10日、11日、12日、13日又は14日間続行し得る。一部の実施形態において、第2のTIL拡大培養は、約7日~約14日間続行し得る。一部の実施形態において、
第2のTIL拡大培養は、約8日~約14日間続行し得る。一部の実施形態において、第2のTIL拡大培養は、約9日~約14日間続行し得る。一部の実施形態において、第2のTIL拡大培養は、約10日~約14日間続行し得る。一部の実施形態において、第2のTIL拡大培養は、約11日~約14日間続行し得る。一部の実施形態において、第2のTIL拡大培養は、約12日~約14日間続行し得る。一部の実施形態において、第2のTIL拡大培養は、約13日~約14日間続行し得る。一部の実施形態において、第2のTIL拡大培養は、約14日間続行し得る。
[00503] 一実施形態において、第2の拡大培養は、本開示の方法(例えば、REPと
称される膨張並びに図8のステップDに示されるプロセスを含む)を使用して、ガス透過性容器内で実施することができる。例えば、TILは、インターロイキン-2(IL-2)又はインターロイキン-15(IL-15)の存在下で非特異的T細胞受容体刺激を用いて急速に拡大培養することができる。非特異的T細胞受容体刺激としては、例えば、約30ng/mlのOKT3などの抗CD3抗体、マウスモノクローナル抗CD3抗体(Ortho-McNeil、Raritan, NJ又はMiltenyi Biotech、Auburn, CAから市販されている)又は
UHCT-1(BioLegend、San Diego, CA, USAから市販されている)を挙げることがで
きる。TILは、任意選択により300IU/mL IL-2又はIL-15など、T細胞成長因子の存在下において、ヒト白血球抗原A2(HLA-A2)結合ペプチド、例えば0.3μΜ MART-1:26-35(27L)又はgpl 00:209-217(210M)など、任意選択によりベクターから発現させることができる、1つ又は複数のエピトープなど、その抗原性部分を含めた癌の1つ以上の抗原を、第2の拡大培養中に誘導することにより、インビトロでのTILの更なる刺激を誘発するように拡大培養することができる。他の好適な抗原としては、例えば、NY-ESO-1、TRP-1、TRP-2、チロシナーゼ癌抗原、MAGE-A3、SSX-2及びVEGFR2又はその抗原性部分を挙げることができる。TILは、HLA-A2発現抗原提示細胞にパルスした癌の同じ1つ又は複数の抗原による再刺激によっても急速に拡大培養し得る。代わりに、TILは、例えば、照射自己リンパ球によるか、又は照射HLA-A2+同種異系リンパ球及びIL-2によって更に再刺激することができる。一部の実施形態において、再刺激は、第2の拡大培養の一部として生じる。一部の実施形態において、照射された自己リンパ球の存在下において、又は照射されたHLA-A2+同種異系リンパ球及びIL-2と共に第2の拡大培養が発生する。
称される膨張並びに図8のステップDに示されるプロセスを含む)を使用して、ガス透過性容器内で実施することができる。例えば、TILは、インターロイキン-2(IL-2)又はインターロイキン-15(IL-15)の存在下で非特異的T細胞受容体刺激を用いて急速に拡大培養することができる。非特異的T細胞受容体刺激としては、例えば、約30ng/mlのOKT3などの抗CD3抗体、マウスモノクローナル抗CD3抗体(Ortho-McNeil、Raritan, NJ又はMiltenyi Biotech、Auburn, CAから市販されている)又は
UHCT-1(BioLegend、San Diego, CA, USAから市販されている)を挙げることがで
きる。TILは、任意選択により300IU/mL IL-2又はIL-15など、T細胞成長因子の存在下において、ヒト白血球抗原A2(HLA-A2)結合ペプチド、例えば0.3μΜ MART-1:26-35(27L)又はgpl 00:209-217(210M)など、任意選択によりベクターから発現させることができる、1つ又は複数のエピトープなど、その抗原性部分を含めた癌の1つ以上の抗原を、第2の拡大培養中に誘導することにより、インビトロでのTILの更なる刺激を誘発するように拡大培養することができる。他の好適な抗原としては、例えば、NY-ESO-1、TRP-1、TRP-2、チロシナーゼ癌抗原、MAGE-A3、SSX-2及びVEGFR2又はその抗原性部分を挙げることができる。TILは、HLA-A2発現抗原提示細胞にパルスした癌の同じ1つ又は複数の抗原による再刺激によっても急速に拡大培養し得る。代わりに、TILは、例えば、照射自己リンパ球によるか、又は照射HLA-A2+同種異系リンパ球及びIL-2によって更に再刺激することができる。一部の実施形態において、再刺激は、第2の拡大培養の一部として生じる。一部の実施形態において、照射された自己リンパ球の存在下において、又は照射されたHLA-A2+同種異系リンパ球及びIL-2と共に第2の拡大培養が発生する。
[00504] 一実施形態において、細胞培養培地は、IL-2を更に含む。一部の実施形
態において、細胞培養培地は、約3000IU/mLのIL-2を含む。一実施形態において、細胞培養培地は、約1000IU/mL、約1500IU/mL、約2000IU/mL、約2500IU/mL、約3000IU/mL、約3500IU/mL、約4000IU/mL、約4500IU/mL、約5000IU/mL、約5500IU/mL、約6000IU/mL、約6500IU/mL、約7000IU/mL、約7500IU/mL又は約8000IU/mLのIL-2を含む。一実施形態において、細胞培養培地は、1000~2000IU/mL、2000~3000IU/mL、3000~4000IU/mL、4000~5000IU/mL、5000~6000IU/mL、6000~7000IU/mL、7000~8000IU/mL又は8000IU/mLのIL-2を含む。
態において、細胞培養培地は、約3000IU/mLのIL-2を含む。一実施形態において、細胞培養培地は、約1000IU/mL、約1500IU/mL、約2000IU/mL、約2500IU/mL、約3000IU/mL、約3500IU/mL、約4000IU/mL、約4500IU/mL、約5000IU/mL、約5500IU/mL、約6000IU/mL、約6500IU/mL、約7000IU/mL、約7500IU/mL又は約8000IU/mLのIL-2を含む。一実施形態において、細胞培養培地は、1000~2000IU/mL、2000~3000IU/mL、3000~4000IU/mL、4000~5000IU/mL、5000~6000IU/mL、6000~7000IU/mL、7000~8000IU/mL又は8000IU/mLのIL-2を含む。
[00505] 一実施形態において、細胞培養培地は、OKT-3抗体を含む。一部の実施
形態において、細胞培養培地は、約30ng/mLのOKT-3抗体を含む。一実施形態において、細胞培養培地は、約0.1ng/mL、約0.5ng/mL、約1ng/mL、約2.5ng/mL、約5ng/mL、約7.5ng/mL、約10ng/mL、約15ng/mL、約20ng/mL、約25ng/mL、約30ng/mL、約35ng/mL、約40ng/mL、約50ng/mL、約60ng/mL、約70ng/mL、約
80ng/mL、約90ng/mL、約100ng/mL、約200ng/mL、約500ng/mL及び約1μg/mLのOKT-3抗体を含む。一実施形態において、細胞培養培地は、0.1ng/mL~1ng/mL、1ng/mL~5ng/mL、5ng/mL~10ng/mL、10ng/mL~20ng/mL、20ng/mL~30ng/mL、30ng/mL~40ng/mL、40ng/mL~50ng/mL及び50ng/mL~100ng/mLのOKT-3抗体を含む。一部の実施形態において、細胞培養培地は、OKT-3抗体を含まない。
形態において、細胞培養培地は、約30ng/mLのOKT-3抗体を含む。一実施形態において、細胞培養培地は、約0.1ng/mL、約0.5ng/mL、約1ng/mL、約2.5ng/mL、約5ng/mL、約7.5ng/mL、約10ng/mL、約15ng/mL、約20ng/mL、約25ng/mL、約30ng/mL、約35ng/mL、約40ng/mL、約50ng/mL、約60ng/mL、約70ng/mL、約
80ng/mL、約90ng/mL、約100ng/mL、約200ng/mL、約500ng/mL及び約1μg/mLのOKT-3抗体を含む。一実施形態において、細胞培養培地は、0.1ng/mL~1ng/mL、1ng/mL~5ng/mL、5ng/mL~10ng/mL、10ng/mL~20ng/mL、20ng/mL~30ng/mL、30ng/mL~40ng/mL、40ng/mL~50ng/mL及び50ng/mL~100ng/mLのOKT-3抗体を含む。一部の実施形態において、細胞培養培地は、OKT-3抗体を含まない。
[00506] 一部の実施形態において、細胞培養培地は、細胞培養培地中に1つ以上のT
NFRSFアゴニストを含む。一部の実施形態において、TNFRSFアゴニストは、4-1BBアゴニストを含む。一部の実施形態において、TNFRSFアゴニストは、4-1BBアゴニストであり、4-1BBアゴニストは、ウレルマブ、ウトミルマブ、EU-101、融合タンパク質並びにその断片、誘導体、変異体、バイオシミラー及び組み合わせからなる群から選択される。一部の実施形態において、TNFRSFアゴニストは、細胞培養培地中、0.1μg/mL~100μg/mLの濃度を達成するのに十分な濃度で添加される。一部の実施形態において、TNFRSFアゴニストは、細胞培養培地中、20μg/mL~40μg/mLの濃度を達成するのに十分な濃度で添加される。
NFRSFアゴニストを含む。一部の実施形態において、TNFRSFアゴニストは、4-1BBアゴニストを含む。一部の実施形態において、TNFRSFアゴニストは、4-1BBアゴニストであり、4-1BBアゴニストは、ウレルマブ、ウトミルマブ、EU-101、融合タンパク質並びにその断片、誘導体、変異体、バイオシミラー及び組み合わせからなる群から選択される。一部の実施形態において、TNFRSFアゴニストは、細胞培養培地中、0.1μg/mL~100μg/mLの濃度を達成するのに十分な濃度で添加される。一部の実施形態において、TNFRSFアゴニストは、細胞培養培地中、20μg/mL~40μg/mLの濃度を達成するのに十分な濃度で添加される。
[00507] 一部の実施形態において、1つ以上のTNFRSFに加えて、細胞培養培地
は、初期濃度約3000IU/mLのIL-2及び初期濃度約30ng/mLのOKT-3抗体を更に含み、1つ以上のTNFRSFアゴニストは、4-1BBアゴニストを含む。
は、初期濃度約3000IU/mLのIL-2及び初期濃度約30ng/mLのOKT-3抗体を更に含み、1つ以上のTNFRSFアゴニストは、4-1BBアゴニストを含む。
[00508] 一部の実施形態において、IL-2、IL-7、IL-15及び/又はIL
-21の組み合わせが、第2の拡大培養中の組み合わせとして用いられる。一部の実施形態において、IL-2、IL-7、IL-15及び/又はIL-21並びにそれらの任意の組み合わせは、例えば、図8による並びに本明細書に記載されている通り、ステップDプロセス中を含む第2の拡大培養中に含められ得る。一部の実施形態において、IL-2、IL-15及びIL-21の組み合わせが、第2の拡大培養中の組み合わせとして用いられる。一部の実施形態において、IL-2、IL-15及びIL-21並びにそれらの任意の組み合わせは、例えば、図8による及び本明細書に記載されている通りステップDプロセス中に含められ得る。
-21の組み合わせが、第2の拡大培養中の組み合わせとして用いられる。一部の実施形態において、IL-2、IL-7、IL-15及び/又はIL-21並びにそれらの任意の組み合わせは、例えば、図8による並びに本明細書に記載されている通り、ステップDプロセス中を含む第2の拡大培養中に含められ得る。一部の実施形態において、IL-2、IL-15及びIL-21の組み合わせが、第2の拡大培養中の組み合わせとして用いられる。一部の実施形態において、IL-2、IL-15及びIL-21並びにそれらの任意の組み合わせは、例えば、図8による及び本明細書に記載されている通りステップDプロセス中に含められ得る。
[00509] 一部の実施形態において、第2の拡大培養は、IL-2、OKT-3、抗原
提示フィーダー細胞及び任意選択によりTNFRSFアゴニストを含む補充細胞培養培地で実施され得る。一部の実施形態において、第2の拡大培養は補充細胞培養培地で行われる。一部の実施形態において、補充細胞培養培地は、IL-2、OKT-3及び抗原提示フィーダー細胞を含む。一部の実施形態において、第2の細胞培養培地は、IL-2、OKT-3及び抗原提示細胞(APC;抗原提示フィーダー細胞とも称される)を含む。一部の実施形態において、第2の拡大培養は、IL-2、OKT-3及び抗原提示フィーダー細胞で生じる(即ち抗原提示細胞)。
提示フィーダー細胞及び任意選択によりTNFRSFアゴニストを含む補充細胞培養培地で実施され得る。一部の実施形態において、第2の拡大培養は補充細胞培養培地で行われる。一部の実施形態において、補充細胞培養培地は、IL-2、OKT-3及び抗原提示フィーダー細胞を含む。一部の実施形態において、第2の細胞培養培地は、IL-2、OKT-3及び抗原提示細胞(APC;抗原提示フィーダー細胞とも称される)を含む。一部の実施形態において、第2の拡大培養は、IL-2、OKT-3及び抗原提示フィーダー細胞で生じる(即ち抗原提示細胞)。
[00510] 一部の実施形態において、第2の拡大培養培地は、約500IU/mLのI
L-15、約400IU/mLのIL-15、約300IU/mLのIL-15、約200IU/mLのIL-15、約180IU/mLのIL-15、約160IU/mLのIL-15、約140IU/mLのIL-15、約120IU/mLのIL-15又は約100IU/mLのIL-15を含む。一部の実施形態において、第2の拡大培養培地は、約500IU/mLのIL-15~約100IU/mLのIL-15を含む。一部の実施形態において、第2の拡大培養培地は、約400IU/mLのIL-15~約100IU/mLのIL-15を含む。一部の実施形態において、第2の拡大培養培地は、約300
IU/mLのIL-15~約100IU/mLのIL-15を含む。一部の実施形態において、第2の拡大培養培地は、約200IU/mLのIL-15を含む。一部の実施形態において、細胞培養培地は、約180IU/mLのIL-15を含む。ある実施形態において、細胞培養培地は、IL-15を更に含む。好ましい一実施形態において、細胞培養培地は、約180IU/mLのIL-15を含む。
L-15、約400IU/mLのIL-15、約300IU/mLのIL-15、約200IU/mLのIL-15、約180IU/mLのIL-15、約160IU/mLのIL-15、約140IU/mLのIL-15、約120IU/mLのIL-15又は約100IU/mLのIL-15を含む。一部の実施形態において、第2の拡大培養培地は、約500IU/mLのIL-15~約100IU/mLのIL-15を含む。一部の実施形態において、第2の拡大培養培地は、約400IU/mLのIL-15~約100IU/mLのIL-15を含む。一部の実施形態において、第2の拡大培養培地は、約300
IU/mLのIL-15~約100IU/mLのIL-15を含む。一部の実施形態において、第2の拡大培養培地は、約200IU/mLのIL-15を含む。一部の実施形態において、細胞培養培地は、約180IU/mLのIL-15を含む。ある実施形態において、細胞培養培地は、IL-15を更に含む。好ましい一実施形態において、細胞培養培地は、約180IU/mLのIL-15を含む。
[00511] 一部の実施形態において、第2の拡大培養培地は、約20IU/mLのIL
-21、約15IU/mLのIL-21、約12IU/mLのIL-21、約10IU/mLのIL-21、約5IU/mLのIL-21、約4IU/mLのIL-21、約3IU/mLのIL-21、約2IU/mLのIL-21、約1IU/mLのIL-21又は約0.5IU/mLのIL-21を含む。一部の実施形態において、第2の拡大培養培地は、約20IU/mLのIL-21~約0.5IU/mLのIL-21を含む。一部の実施形態において、第2の拡大培養培地は、約15IU/mLのIL-21~約0.5IU/mLのIL-21を含む。一部の実施形態において、第2の拡大培養培地は、約12IU/mLのIL-21~約0.5IU/mLのIL-21を含む。一部の実施形態において、第2の拡大培養培地は、約10IU/mLのIL-21~約0.5IU/mLのIL-21を含む。一部の実施形態において、第2の拡大培養培地は、約5IU/mLのIL-21~約1IU/mLのIL-21を含む。一部の実施形態において、第2の拡大培養培地は、約2IU/mLのIL-21を含む。一部の実施形態において、細胞培養培地は、約1IU/mLのIL-21を含む。一部の実施形態において、細胞培養培地は、約0.5IU/mLのIL-21を含む。ある実施形態において、細胞培養培地は、IL-21を更に含む。好ましい一実施形態において、細胞培養培地は、約1IU/mLのIL-21を含む。
-21、約15IU/mLのIL-21、約12IU/mLのIL-21、約10IU/mLのIL-21、約5IU/mLのIL-21、約4IU/mLのIL-21、約3IU/mLのIL-21、約2IU/mLのIL-21、約1IU/mLのIL-21又は約0.5IU/mLのIL-21を含む。一部の実施形態において、第2の拡大培養培地は、約20IU/mLのIL-21~約0.5IU/mLのIL-21を含む。一部の実施形態において、第2の拡大培養培地は、約15IU/mLのIL-21~約0.5IU/mLのIL-21を含む。一部の実施形態において、第2の拡大培養培地は、約12IU/mLのIL-21~約0.5IU/mLのIL-21を含む。一部の実施形態において、第2の拡大培養培地は、約10IU/mLのIL-21~約0.5IU/mLのIL-21を含む。一部の実施形態において、第2の拡大培養培地は、約5IU/mLのIL-21~約1IU/mLのIL-21を含む。一部の実施形態において、第2の拡大培養培地は、約2IU/mLのIL-21を含む。一部の実施形態において、細胞培養培地は、約1IU/mLのIL-21を含む。一部の実施形態において、細胞培養培地は、約0.5IU/mLのIL-21を含む。ある実施形態において、細胞培養培地は、IL-21を更に含む。好ましい一実施形態において、細胞培養培地は、約1IU/mLのIL-21を含む。
[00512] 一部の実施形態において、抗原提示フィーダー細胞(APC)は、PBMC
である。一実施形態において、急速拡大培養及び/又は第2の拡大培養におけるTILとPBMC及び/又は抗原提示細胞との比は、約1:25、約1:50、約1:100、約1:125、約1:150、約1:175、約1:200、約1:225、約1:250、約1:275、約1:300、約1:325、約1:350、約1:375、約1:400又は約1:500である。一実施形態において、急速拡大培養及び/又は第2の拡大培養におけるTILとPBMCとの比は、1:50~1:300である。一実施形態において、急速拡大培養及び/又は第2の拡大培養におけるTILとPBMCとの比は、1:100~1:200である。
である。一実施形態において、急速拡大培養及び/又は第2の拡大培養におけるTILとPBMC及び/又は抗原提示細胞との比は、約1:25、約1:50、約1:100、約1:125、約1:150、約1:175、約1:200、約1:225、約1:250、約1:275、約1:300、約1:325、約1:350、約1:375、約1:400又は約1:500である。一実施形態において、急速拡大培養及び/又は第2の拡大培養におけるTILとPBMCとの比は、1:50~1:300である。一実施形態において、急速拡大培養及び/又は第2の拡大培養におけるTILとPBMCとの比は、1:100~1:200である。
[00513] 一実施形態において、REP及び/又は第2の拡大培養は、バルクTILを
150mL培地中の100倍又は200倍過剰の不活性化フィーダー細胞、30mg/mL OKT3抗CD3抗体及び3000IU/mL IL-2と混合してフラスコ内で実施される。細胞を別の成長チャンバーに移すまで培地補充が行われる(一般的に新鮮培地による呼吸を介した3分の2の培地補充)。別の成長チャンバーには、以下に更に十分に考察する通りのG-REXフラスコ及びガス透過性容器が含まれる。
150mL培地中の100倍又は200倍過剰の不活性化フィーダー細胞、30mg/mL OKT3抗CD3抗体及び3000IU/mL IL-2と混合してフラスコ内で実施される。細胞を別の成長チャンバーに移すまで培地補充が行われる(一般的に新鮮培地による呼吸を介した3分の2の培地補充)。別の成長チャンバーには、以下に更に十分に考察する通りのG-REXフラスコ及びガス透過性容器が含まれる。
[00514] 一部の実施形態において、第2の拡大培養(REPプロセスと称されるプロ
セスを含み得る)は、実施例及び図で考察されるように、7~14日間に短縮される。一部の実施形態において、第2の拡大培養は、11日間に短縮される。
セスを含み得る)は、実施例及び図で考察されるように、7~14日間に短縮される。一部の実施形態において、第2の拡大培養は、11日間に短縮される。
[00515] 一実施形態において、REP及び/又は第2の拡大培養は、前述のように(Tran, et al., J. Immunother. 2008, 31, 742-51;Dudley, et al., J. Immunother. 2003, 26, 332-42)T-175フラスコ及び気体透過性バッグ又はガス透過性培養器具(G-Rexフ
ラスコ)を使用して実施され得る。一部の実施形態において、第2の拡大培養(急速拡大培養と称される拡大培養を含む)は、T-175フラスコで実施され、150mLの培地に懸
濁した約1×106個のTILを各T-175フラスコに加え得る。TILは、IL-2の1
mLあたり3000IU及び抗CD3の1mLあたり30ngを補充したCM及びAIM-V
培地の1:1の混合物で培養され得る。T-175フラスコは5%CO2下37℃でインキュ
ベートされ得る。培地の半分は、5日目に、1mLあたり3000IUのIL-2を含む50/50培地を使用して交換され得る。一部の実施形態において、7日目に、2つのT-175フラスコからの細胞を3Lバッグに合わせることができ、その300mLのTIL懸
濁液に、5%ヒトAB血清及び3000IU/mLのIL-2を含む300mLのAIM V
を加えた。毎日又は2日毎に各バッグの細胞数を計数し、新鮮培地を加えて細胞数を0.5~2.0×106細胞/mLに保った。
ラスコ)を使用して実施され得る。一部の実施形態において、第2の拡大培養(急速拡大培養と称される拡大培養を含む)は、T-175フラスコで実施され、150mLの培地に懸
濁した約1×106個のTILを各T-175フラスコに加え得る。TILは、IL-2の1
mLあたり3000IU及び抗CD3の1mLあたり30ngを補充したCM及びAIM-V
培地の1:1の混合物で培養され得る。T-175フラスコは5%CO2下37℃でインキュ
ベートされ得る。培地の半分は、5日目に、1mLあたり3000IUのIL-2を含む50/50培地を使用して交換され得る。一部の実施形態において、7日目に、2つのT-175フラスコからの細胞を3Lバッグに合わせることができ、その300mLのTIL懸
濁液に、5%ヒトAB血清及び3000IU/mLのIL-2を含む300mLのAIM V
を加えた。毎日又は2日毎に各バッグの細胞数を計数し、新鮮培地を加えて細胞数を0.5~2.0×106細胞/mLに保った。
[00516] 一実施形態において、第2の拡大培養(これはREPと称される拡大培養;
並びに図8のステップDに参照されるものを含み得る)は、100cmガス透過性シリコン底の500mL容量ガス透過性フラスコ(G-Rex 100、Wilson Wolf Manufacturing Corporation、New Brighton, MN, USAから市販されている)において実施され得、5%ヒト
AB血清、3000IU/mLのIL-2及び30ng/mLの抗CD3(OKT3)を補充した400mLの50/50培地中で5×106又は10×106個のTILをPBMCと培養し得る。G-Rex 100フラスコは5%CO2下37℃でインキュベートし得る。
5日目、250mLの上清を取り出して遠心ボトルに入れ、1500rpm(491×g)で10分間遠心し得る。5%ヒトAB血清、3000IU/mLのIL-2を含む150mLの新鮮培地にTILペレットを再懸濁し、元のG-Rex 100フラスコに戻し加え得る
。G-Rex 100フラスコ内でTILを連続的に拡大培養するときは、7日目に各G-Rex 100のTILを各フラスコ内に存在する300mLの培地に懸濁し得、且つ細胞懸濁液を3つの100mLアリコートに分割し得、それらを3つのG-Rex 100フラスコの播種に使用し得
る。次に、5%ヒトAB血清及び3000IU/mLのIL-2を含む150mLのAIM-Vを各フラスコに加え得る。G-Rex 100フラスコは5%CO2下37℃でインキュベートし得、4日後、各G-Rex100フラスコに3000IU/mLのIL-2を含む150mLのAIM-Vを加え得る。細胞は培養14日目に回収し得る。
並びに図8のステップDに参照されるものを含み得る)は、100cmガス透過性シリコン底の500mL容量ガス透過性フラスコ(G-Rex 100、Wilson Wolf Manufacturing Corporation、New Brighton, MN, USAから市販されている)において実施され得、5%ヒト
AB血清、3000IU/mLのIL-2及び30ng/mLの抗CD3(OKT3)を補充した400mLの50/50培地中で5×106又は10×106個のTILをPBMCと培養し得る。G-Rex 100フラスコは5%CO2下37℃でインキュベートし得る。
5日目、250mLの上清を取り出して遠心ボトルに入れ、1500rpm(491×g)で10分間遠心し得る。5%ヒトAB血清、3000IU/mLのIL-2を含む150mLの新鮮培地にTILペレットを再懸濁し、元のG-Rex 100フラスコに戻し加え得る
。G-Rex 100フラスコ内でTILを連続的に拡大培養するときは、7日目に各G-Rex 100のTILを各フラスコ内に存在する300mLの培地に懸濁し得、且つ細胞懸濁液を3つの100mLアリコートに分割し得、それらを3つのG-Rex 100フラスコの播種に使用し得
る。次に、5%ヒトAB血清及び3000IU/mLのIL-2を含む150mLのAIM-Vを各フラスコに加え得る。G-Rex 100フラスコは5%CO2下37℃でインキュベートし得、4日後、各G-Rex100フラスコに3000IU/mLのIL-2を含む150mLのAIM-Vを加え得る。細胞は培養14日目に回収し得る。
[00517] 一実施形態において、第2の拡大培養(REPと称される拡大培養を含む)
は、バルクTILを150ml培地中の100倍又は200倍過剰の不活性化フィーダー細胞、30mg/mL OKT3抗CD3抗体及び3000IU/mL IL-2と混合してフラスコ内で実施される。一部の実施形態において、細胞が別の成長チャンバーに移されるまで培地交換が行われる。一部の実施形態において、培地の2/3が新鮮培地による呼吸に置き換えられる。一部の実施形態において、別の成長チャンバーには、以下に更に十分に考察する通りのG-REXフラスコ及びガス透過性容器が含まれる。
は、バルクTILを150ml培地中の100倍又は200倍過剰の不活性化フィーダー細胞、30mg/mL OKT3抗CD3抗体及び3000IU/mL IL-2と混合してフラスコ内で実施される。一部の実施形態において、細胞が別の成長チャンバーに移されるまで培地交換が行われる。一部の実施形態において、培地の2/3が新鮮培地による呼吸に置き換えられる。一部の実施形態において、別の成長チャンバーには、以下に更に十分に考察する通りのG-REXフラスコ及びガス透過性容器が含まれる。
[00518] 一実施形態において、第2の拡大培養(REPと称される拡大培養を含む)
が実施され、これは優れた腫瘍応答性に関してTILを選択するステップを更に含む。当技術分野において公知の任意の選択方法を用いることができる。例えば、その開示が参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第2016/0010058A1号に記載されている方法は、優れた腫瘍反応性に関するTILの選択に使用され得る。
が実施され、これは優れた腫瘍応答性に関してTILを選択するステップを更に含む。当技術分野において公知の任意の選択方法を用いることができる。例えば、その開示が参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第2016/0010058A1号に記載されている方法は、優れた腫瘍反応性に関するTILの選択に使用され得る。
[00519] 任意選択により、第2の拡大培養(REP拡大培養と称される拡大培養を含
む)後、当技術分野において公知の標準アッセイを用いて細胞生存率アッセイを実施することができる。例えば、バルクTILのサンプルに対してトリパンブルー色素排除アッセイを行うことができ、これは、死細胞を選択的に標識して生存率の評価を可能にするものである。一部の実施形態では、Cellometer K2自動セルカウンター(Nexcelom Bioscience、Lawrence, MA)を使用してTILサンプルをカウントし、生存率を決定することができる。一部の実施形態では、生存率は、例えば、実施例15に記載されるCellometer K2 Image Cytometer自動セルカウンタープロトコルに従って決定される。
む)後、当技術分野において公知の標準アッセイを用いて細胞生存率アッセイを実施することができる。例えば、バルクTILのサンプルに対してトリパンブルー色素排除アッセイを行うことができ、これは、死細胞を選択的に標識して生存率の評価を可能にするものである。一部の実施形態では、Cellometer K2自動セルカウンター(Nexcelom Bioscience、Lawrence, MA)を使用してTILサンプルをカウントし、生存率を決定することができる。一部の実施形態では、生存率は、例えば、実施例15に記載されるCellometer K2 Image Cytometer自動セルカウンタープロトコルに従って決定される。
[00520] 一部の実施形態において、TILの第2の拡大培養(REPと称される拡大
培養を含む)は、先述の通りT-175フラスコ及びガス透過性バッグ(Tran KQ, Zhou J, Durflinger KH, et al., 2008, J Immunother., 31:742-751及びDudley ME, Wunderlich JR, Shelton TE, et al. 2003, J Immunother., 26:332-342)又はガス透過性G-Rexフラス
コを使用して実施することができる。一部の実施形態において、第2の拡大培養は、フラスコを使用して実施される。一部の実施形態において、第2の拡大培養は、ガス透過性G-Rexフラスコを使用して実施される。一部の実施形態において、T-175フラスコで実施される第2の拡大培養及び約1×106個のTILを約150mLの培地中に懸濁し、これを各T-175フラスコに加える。TILは、「フィーダー」細胞としての照射(50Gy)さ
れた同種異系PBMCと1:100の比で培養し、及び細胞は、3000IU/mLのIL-2及び30ng/mLの抗CD3を補充したCMとAIM-V培地との1:1混合物(5
0/50培地)で培養した。T-175フラスコは5%CO2下37℃でインキュベートする
。一部の実施形態において、培地は、5日目に3000IU/mLのIL-2を含む50/50培地を使用して交換される。一部の実施形態において、7日目、2つのT-175フラ
スコからの細胞を3Lバッグに合わせ、その300mLのTIL懸濁液に、5%ヒトAB血清及び3000IU/mLのIL-2を含む300mLのAIM-Vを加える。毎日又は2
日毎に各バッグの細胞数を計数し得、新鮮培地を加えて細胞数を約0.5~約2.0×106細胞/mLに保ち得る。
培養を含む)は、先述の通りT-175フラスコ及びガス透過性バッグ(Tran KQ, Zhou J, Durflinger KH, et al., 2008, J Immunother., 31:742-751及びDudley ME, Wunderlich JR, Shelton TE, et al. 2003, J Immunother., 26:332-342)又はガス透過性G-Rexフラス
コを使用して実施することができる。一部の実施形態において、第2の拡大培養は、フラスコを使用して実施される。一部の実施形態において、第2の拡大培養は、ガス透過性G-Rexフラスコを使用して実施される。一部の実施形態において、T-175フラスコで実施される第2の拡大培養及び約1×106個のTILを約150mLの培地中に懸濁し、これを各T-175フラスコに加える。TILは、「フィーダー」細胞としての照射(50Gy)さ
れた同種異系PBMCと1:100の比で培養し、及び細胞は、3000IU/mLのIL-2及び30ng/mLの抗CD3を補充したCMとAIM-V培地との1:1混合物(5
0/50培地)で培養した。T-175フラスコは5%CO2下37℃でインキュベートする
。一部の実施形態において、培地は、5日目に3000IU/mLのIL-2を含む50/50培地を使用して交換される。一部の実施形態において、7日目、2つのT-175フラ
スコからの細胞を3Lバッグに合わせ、その300mLのTIL懸濁液に、5%ヒトAB血清及び3000IU/mLのIL-2を含む300mLのAIM-Vを加える。毎日又は2
日毎に各バッグの細胞数を計数し得、新鮮培地を加えて細胞数を約0.5~約2.0×106細胞/mLに保ち得る。
[00521] 一部の実施形態において、第2の拡大培養(REPと称される拡大培養を含
む)は、100cm2ガス透過性シリコン底の500mL容量フラスコ(G-Rex 100、Wilson Wolf)において実施され(図1)、3000IU/mLのIL-2及び30ng/mLの抗CD3を補充した400mLの50/50培地中で約5×106又は10×106個のTILを照射同種異系PBMCと1:100の比で培養する。G-Rex 100フラスコは
5%CO2下37℃でインキュベートされる。一部の実施形態において、5日目に、250mLの上清を取り出して遠心ボトルに入れ、1500rpm(491g)で10分間遠心する。次に3000IU/mLのIL-2を含む150mLの新鮮50/50培地にTILペレットを再懸濁し、元のG-Rex100フラスコに加え戻し得る。TILがG-Rex100フラスコ内で連続的に拡大培養される実施形態において、7日目に各G-Rex100内のTILを各フラスコ内に存在する300mLの培地に懸濁し、且つ細胞懸濁液を3つの100mLアリコートに分割しており、それらを3つのG-Rex100フラスコの播種に使用する。次に、5%ヒトAB血清及び3000IU/mLのIL-2を含む150mLのAIM-Vを各フラス
コに加える。G-Rex 100フラスコは5%CO2下37℃でインキュベートされ、4日後、
各G-Rex100フラスコに3000IU/mLのIL-2を含む150mLのAIM-Vを加える
。細胞は培養14日目に回収される。
む)は、100cm2ガス透過性シリコン底の500mL容量フラスコ(G-Rex 100、Wilson Wolf)において実施され(図1)、3000IU/mLのIL-2及び30ng/mLの抗CD3を補充した400mLの50/50培地中で約5×106又は10×106個のTILを照射同種異系PBMCと1:100の比で培養する。G-Rex 100フラスコは
5%CO2下37℃でインキュベートされる。一部の実施形態において、5日目に、250mLの上清を取り出して遠心ボトルに入れ、1500rpm(491g)で10分間遠心する。次に3000IU/mLのIL-2を含む150mLの新鮮50/50培地にTILペレットを再懸濁し、元のG-Rex100フラスコに加え戻し得る。TILがG-Rex100フラスコ内で連続的に拡大培養される実施形態において、7日目に各G-Rex100内のTILを各フラスコ内に存在する300mLの培地に懸濁し、且つ細胞懸濁液を3つの100mLアリコートに分割しており、それらを3つのG-Rex100フラスコの播種に使用する。次に、5%ヒトAB血清及び3000IU/mLのIL-2を含む150mLのAIM-Vを各フラス
コに加える。G-Rex 100フラスコは5%CO2下37℃でインキュベートされ、4日後、
各G-Rex100フラスコに3000IU/mLのIL-2を含む150mLのAIM-Vを加える
。細胞は培養14日目に回収される。
[00522] T及びBリンパ球の多様な抗原受容体は、限られているが多数の遺伝子セグ
メントの体細胞組換えによって産生される。V(可変)、D(多様性)、J(結合)及びC(定数)の遺伝子セグメントは、免疫グロブリン及びT細胞受容体(TCR)の結合特異性及び下流側での適用を決定する。本発明は、T細胞レパートリーの多様性を示し、増加させるTILを生成する方法を提供する。一部の実施形態において、本方法により得られたTILは、T細胞レパートリー多様性の増加を示す。一部の実施形態において、第2の拡大培養で得られたTILは、T細胞レパートリー多様性の増加を示す。一部の実施形態において、多様性の増加は、免疫グロブリンの多様性及び/又はT細胞受容体の多様性の増加である。一部の実施形態において、免疫グロブリンの多様性は、免疫グロブリン重鎖にある。一部の実施形態において、免疫グロブリンの多様性は、免疫グロブリン軽鎖にある。一部の実施形態において、多様性は、T細胞受容体にある。一部の実施形態において、多様性は、α、β、γ及びδ受容体からなる群から選択されるT細胞受容体の1つにある。一部の実施形態において、T細胞受容体(TCR)α及び/又はβの発現が増加す
る。一部の実施形態において、T細胞受容体(TCR)αの発現が増加する。一部の実施形態において、T細胞受容体(TCR)βの発現が増加する。一部の実施形態において、TCRab(即ちTCRα/β)の発現が増加する。
メントの体細胞組換えによって産生される。V(可変)、D(多様性)、J(結合)及びC(定数)の遺伝子セグメントは、免疫グロブリン及びT細胞受容体(TCR)の結合特異性及び下流側での適用を決定する。本発明は、T細胞レパートリーの多様性を示し、増加させるTILを生成する方法を提供する。一部の実施形態において、本方法により得られたTILは、T細胞レパートリー多様性の増加を示す。一部の実施形態において、第2の拡大培養で得られたTILは、T細胞レパートリー多様性の増加を示す。一部の実施形態において、多様性の増加は、免疫グロブリンの多様性及び/又はT細胞受容体の多様性の増加である。一部の実施形態において、免疫グロブリンの多様性は、免疫グロブリン重鎖にある。一部の実施形態において、免疫グロブリンの多様性は、免疫グロブリン軽鎖にある。一部の実施形態において、多様性は、T細胞受容体にある。一部の実施形態において、多様性は、α、β、γ及びδ受容体からなる群から選択されるT細胞受容体の1つにある。一部の実施形態において、T細胞受容体(TCR)α及び/又はβの発現が増加す
る。一部の実施形態において、T細胞受容体(TCR)αの発現が増加する。一部の実施形態において、T細胞受容体(TCR)βの発現が増加する。一部の実施形態において、TCRab(即ちTCRα/β)の発現が増加する。
[00523] 一部の実施形態において、第2の拡大培養培地(例えば、CM2又は第2の
細胞培養培地と称されることもある)は、以下で更に詳細に考察する通り、IL-2、OKT-3並びに抗原提示フィーダー細胞(APC)を含む。
細胞培養培地と称されることもある)は、以下で更に詳細に考察する通り、IL-2、OKT-3並びに抗原提示フィーダー細胞(APC)を含む。
[00524] 一部の実施形態において、第2の拡大培養、例えば図8によるステップDは
、閉鎖系バイオリアクターで実施される。一部の実施形態において、本明細書に記載される通り、TIL拡大培養のために閉鎖系が用いられる。一部の実施形態において、単一のバイオリアクターが用いられる。一部の実施形態において、用いられる単一のバイオリアクターは、例えば、G-REX-10又はG-REX-100である。一部の実施形態において、閉鎖系バ
イオリアクターは、単一のバイオリアクターである。
、閉鎖系バイオリアクターで実施される。一部の実施形態において、本明細書に記載される通り、TIL拡大培養のために閉鎖系が用いられる。一部の実施形態において、単一のバイオリアクターが用いられる。一部の実施形態において、用いられる単一のバイオリアクターは、例えば、G-REX-10又はG-REX-100である。一部の実施形態において、閉鎖系バ
イオリアクターは、単一のバイオリアクターである。
[00525] 一部の実施形態において、PD-1、LAG-3、TIM-3、CISH及
びCBLBを含む、本明細書に記載の遺伝子を標的とする1つ以上のsd-RNAは、0.1μM sd-RNA/10,000TIL/100μL培地、0.5μM sd-RNA/10,000TIL/100μL培地、0.75μM sd-RNA/10,000TIL/100μL培地、1μM sd-RNA/10,000TIL/100μL培地、1.25μM sd-RNA/10,000TIL/100μL培地、1.5μM sd-RNA/10,000TIL/100μL培地、2μM sd-RNA/10,000TIL/100μL培地、5μM sd-RNA/10,000TIL/100μL培地又は10μM sd-RNA/10,000TIL/100μL培地からなる群から選択される量において、第2の拡大培養、例えば図8のステップD中、TIL及び他の薬剤を含む細胞培養培地に添加され得る。一部の実施形態において、PD-1、LAG-3、TIM-3、CISH及びCBLBを含む、本明細書に記載の遺伝子を標的とする1つ以上のsd-RNAは、第2の拡大培養、例えば図8のステップD中、1日2回、1日1回、2日毎、3日毎、4日毎、5日毎、6日毎又は7日毎にTIL培養物に添加され得る。一実施形態において、PD-1、LAG-3、TIM-3、CISH及びCBLBを含む、本明細書に記載の遺伝子を標的とする1つ以上のsd-RNAは、0.1μM sd-RNA/10,000TIL、0.5μM sd-RNA/10,000TIL、0.75μM sd-RNA/10,000TIL、1μM sd-RNA/10,000TIL、1.25μM sd-RNA/10,000TIL、1.5μM sd-RNA/10,000TIL、2μM sd-RNA/10,000TIL、5μM sd-RNA/10,000TIL又は10μM sd-RNA/10,000TILからなる群から選択される量において、第2の拡大培養、例えば図8のステップD中、TIL及び他の薬剤を含む細胞培養培地に添加され得る。一実施形態において、PD-1、LAG-3、TIM-3、CISH及びCBLBを含む、本明細書に記載の遺伝子を標的とする1つ以上のsd-RNAは、第2の拡大培養、例えば図8のステップD中、1日2回、1日1回、2日毎、3日毎、4日毎、5日毎、6日毎又は7日毎にTIL培養物に添加され得る。
びCBLBを含む、本明細書に記載の遺伝子を標的とする1つ以上のsd-RNAは、0.1μM sd-RNA/10,000TIL/100μL培地、0.5μM sd-RNA/10,000TIL/100μL培地、0.75μM sd-RNA/10,000TIL/100μL培地、1μM sd-RNA/10,000TIL/100μL培地、1.25μM sd-RNA/10,000TIL/100μL培地、1.5μM sd-RNA/10,000TIL/100μL培地、2μM sd-RNA/10,000TIL/100μL培地、5μM sd-RNA/10,000TIL/100μL培地又は10μM sd-RNA/10,000TIL/100μL培地からなる群から選択される量において、第2の拡大培養、例えば図8のステップD中、TIL及び他の薬剤を含む細胞培養培地に添加され得る。一部の実施形態において、PD-1、LAG-3、TIM-3、CISH及びCBLBを含む、本明細書に記載の遺伝子を標的とする1つ以上のsd-RNAは、第2の拡大培養、例えば図8のステップD中、1日2回、1日1回、2日毎、3日毎、4日毎、5日毎、6日毎又は7日毎にTIL培養物に添加され得る。一実施形態において、PD-1、LAG-3、TIM-3、CISH及びCBLBを含む、本明細書に記載の遺伝子を標的とする1つ以上のsd-RNAは、0.1μM sd-RNA/10,000TIL、0.5μM sd-RNA/10,000TIL、0.75μM sd-RNA/10,000TIL、1μM sd-RNA/10,000TIL、1.25μM sd-RNA/10,000TIL、1.5μM sd-RNA/10,000TIL、2μM sd-RNA/10,000TIL、5μM sd-RNA/10,000TIL又は10μM sd-RNA/10,000TILからなる群から選択される量において、第2の拡大培養、例えば図8のステップD中、TIL及び他の薬剤を含む細胞培養培地に添加され得る。一実施形態において、PD-1、LAG-3、TIM-3、CISH及びCBLBを含む、本明細書に記載の遺伝子を標的とする1つ以上のsd-RNAは、第2の拡大培養、例えば図8のステップD中、1日2回、1日1回、2日毎、3日毎、4日毎、5日毎、6日毎又は7日毎にTIL培養物に添加され得る。
1.フィーダー細胞及び抗原提示細胞
[00526] 一実施形態において、本明細書に記載の第2の拡大培養手順(例えば、図8
のステップDに記載された拡大培養並びにREPと称される拡大培養を含む)は、REP
TIL拡大培養中及び/又は第2の拡大培養中に過剰量のフィーダー細胞が必要である。多くの実施形態において、フィーダー細胞は、健常供血者からの標準的な全血ユニットから得られる末梢血単核球(PBMC)である。PBMCは、Ficoll-Paque勾配分離などの標準方法を用いて得られる。
[00526] 一実施形態において、本明細書に記載の第2の拡大培養手順(例えば、図8
のステップDに記載された拡大培養並びにREPと称される拡大培養を含む)は、REP
TIL拡大培養中及び/又は第2の拡大培養中に過剰量のフィーダー細胞が必要である。多くの実施形態において、フィーダー細胞は、健常供血者からの標準的な全血ユニットから得られる末梢血単核球(PBMC)である。PBMCは、Ficoll-Paque勾配分離などの標準方法を用いて得られる。
[00527] 一般に、同種異系PBMCは、照射又は熱処理のいずれかにより不活性化さ
れ、同種異系PBMCの複製能力を評価するための例示的なプロトコルを提供する実施例に記載されるように、REP手順で使用される。
れ、同種異系PBMCの複製能力を評価するための例示的なプロトコルを提供する実施例に記載されるように、REP手順で使用される。
[00528] 一部の実施形態において、14日目の生細胞の総数がREPの0日目及び/
又は第2の拡大培養の0日目に培養(即ち第2の拡大培養の開始日)に移行した初期生細胞数より少ない場合、PBMCは、複製不能と見なされ、本明細書に記載のTIL拡大培養手順での使用が認められる。
又は第2の拡大培養の0日目に培養(即ち第2の拡大培養の開始日)に移行した初期生細胞数より少ない場合、PBMCは、複製不能と見なされ、本明細書に記載のTIL拡大培養手順での使用が認められる。
[00529] 一部の実施形態において、OKT3及びIL-2の存在下で培養された生細
胞の総数が、7日目及び14日目に、REPの0日目及び/又は第2の拡大培養の0日目(即ち第2の拡大培養の開始日)に培養に移行した初期生細胞数から増加していない場合、PBMCは、複製不能と見なされ、本明細書に記載のTIL拡大培養手順での使用が認められる。一部の実施形態において、PBMCは、30ng/mlのOKT3抗体及び3000IU/mlのIL-2の存在下で培養される。
胞の総数が、7日目及び14日目に、REPの0日目及び/又は第2の拡大培養の0日目(即ち第2の拡大培養の開始日)に培養に移行した初期生細胞数から増加していない場合、PBMCは、複製不能と見なされ、本明細書に記載のTIL拡大培養手順での使用が認められる。一部の実施形態において、PBMCは、30ng/mlのOKT3抗体及び3000IU/mlのIL-2の存在下で培養される。
[00530] 一部の実施形態において、OKT3及びIL-2の存在下で培養された生細
胞の総数が、7日目及び14日目に、REPの0日目及び/又は第2の拡大培養の0日目(即ち第2の拡大培養の開始日)に培養に移行した初期生細胞数から増加していない場合、PBMCは、複製不能と見なされ、本明細書に記載のTIL拡大培養手順での使用が認められる。一部の実施形態において、PBMCは、5~60ng/mlのOKT3抗体及び1000~6000IU/mlのIL-2の存在下で培養される。一部の実施形態において、PBMCは、10~50ng/mlのOKT3抗体及び2000~5000IU/mlのIL-2の存在下で培養される。一部の実施形態において、PBMCは、20~40ng/mlのOKT3抗体及び2000~4000IU/mlのIL-2の存在下で培養される。一部の実施形態において、PBMCは、25~35ng/mlのOKT3抗体及び2500~3500IU/mlのIL-2の存在下で培養される。
胞の総数が、7日目及び14日目に、REPの0日目及び/又は第2の拡大培養の0日目(即ち第2の拡大培養の開始日)に培養に移行した初期生細胞数から増加していない場合、PBMCは、複製不能と見なされ、本明細書に記載のTIL拡大培養手順での使用が認められる。一部の実施形態において、PBMCは、5~60ng/mlのOKT3抗体及び1000~6000IU/mlのIL-2の存在下で培養される。一部の実施形態において、PBMCは、10~50ng/mlのOKT3抗体及び2000~5000IU/mlのIL-2の存在下で培養される。一部の実施形態において、PBMCは、20~40ng/mlのOKT3抗体及び2000~4000IU/mlのIL-2の存在下で培養される。一部の実施形態において、PBMCは、25~35ng/mlのOKT3抗体及び2500~3500IU/mlのIL-2の存在下で培養される。
[00531] 一部の実施形態において、抗原提示フィーダー細胞は、PBMCである。一
部の実施形態において、抗原提示フィーダー細胞は、人工抗原提示フィーダー細胞である。一実施形態において、第2の拡大培養におけるTILと抗原提示フィーダー細胞との比は、約1:25、約1:50、約1:100、約1:125、約1:150、約1:175、約1:200、約1:225、約1:250、約1:275、約1:300、約1:325、約1:350、約1:375、約1:400又は約1:500である。一実施形態において、第2の拡大培養におけるTILと抗原提示フィーダー細胞との比は、1:50~1:300である。一実施形態において、第2の拡大培養におけるTILと抗原提示フィーダー細胞との比は、1:100~1:200である。
部の実施形態において、抗原提示フィーダー細胞は、人工抗原提示フィーダー細胞である。一実施形態において、第2の拡大培養におけるTILと抗原提示フィーダー細胞との比は、約1:25、約1:50、約1:100、約1:125、約1:150、約1:175、約1:200、約1:225、約1:250、約1:275、約1:300、約1:325、約1:350、約1:375、約1:400又は約1:500である。一実施形態において、第2の拡大培養におけるTILと抗原提示フィーダー細胞との比は、1:50~1:300である。一実施形態において、第2の拡大培養におけるTILと抗原提示フィーダー細胞との比は、1:100~1:200である。
[00532] ある実施形態において、本明細書に記載の第2の拡大培養手順は、約2.5
×109個のフィーダー細胞と約100×106個のTILの比を必要とする。別の実施形態において、本明細書に記載の第2の拡大培養手順は、約2.5×109個のフィーダー細胞と約50×106個のTILの比を必要とする。更に別の実施形態において、本明細書に記載の第2の拡大培養手順は、約2.5×109個のフィーダー細胞と約25×106個のTILを必要とする。
×109個のフィーダー細胞と約100×106個のTILの比を必要とする。別の実施形態において、本明細書に記載の第2の拡大培養手順は、約2.5×109個のフィーダー細胞と約50×106個のTILの比を必要とする。更に別の実施形態において、本明細書に記載の第2の拡大培養手順は、約2.5×109個のフィーダー細胞と約25×106個のTILを必要とする。
[00533] 一実施形態において、本明細書に記載の第2の拡大培養手順は、第2の拡大
培養中に過剰量のフィーダー細胞を必要とする。多くの実施形態において、フィーダー細胞は、健常供血者からの標準的な全血ユニットから得られる末梢血単核球(PBMC)である。PBMCは、Ficoll-Paque勾配分離などの標準方法を用いて得られる。一実施形態において、PBMCの代わりに人工抗原提示(aAPC)細胞が使用される。
培養中に過剰量のフィーダー細胞を必要とする。多くの実施形態において、フィーダー細胞は、健常供血者からの標準的な全血ユニットから得られる末梢血単核球(PBMC)である。PBMCは、Ficoll-Paque勾配分離などの標準方法を用いて得られる。一実施形態において、PBMCの代わりに人工抗原提示(aAPC)細胞が使用される。
[00534] 一般に、同種異系PBMCは、照射又は熱処理のいずれかによって不活性化
され、図4、5、6及び7に記載された例示的な手順を含む、本明細書に記載されたTIL拡大培養手順で使用される。
され、図4、5、6及び7に記載された例示的な手順を含む、本明細書に記載されたTIL拡大培養手順で使用される。
[00535] 一実施形態において、人工抗原提示細胞は、PBMCの代替として又はそれ
と組み合わせて、第2の拡大培養で使用される。
と組み合わせて、第2の拡大培養で使用される。
2.サイトカイン
[00536] 本明細書に記載の拡大培養方法は、一般に、当技術分野において公知の通り
、高用量のサイトカイン、特にIL-2を含む培養培地を使用する。
[00536] 本明細書に記載の拡大培養方法は、一般に、当技術分野において公知の通り
、高用量のサイトカイン、特にIL-2を含む培養培地を使用する。
[00537] 代わりに、TILの急速拡大培養及び/又は第2の拡大培養にサイトカイン
の組み合わせを使用することが更に可能であり、IL-2、IL-15及びIL-21の2つ以上の組み合わせについては、概して国際公開第2015/189356号及び国際公開第2015/189357号(参照により全体として明示的に本明細書に組み込まれる)に概説される通りである。従って、可能な組み合わせとしては、IL-2とIL-15、IL-2とIL-21、IL-15とIL-21とIL-2、IL-15とIL-21が挙げられ、後者には多くの実施形態において特定の使用が見出される。これらの明細書に記載される通り、サイトカインの組み合わせを使用することは、特にリンパ球、詳細にはT細胞の生成に有利である。
の組み合わせを使用することが更に可能であり、IL-2、IL-15及びIL-21の2つ以上の組み合わせについては、概して国際公開第2015/189356号及び国際公開第2015/189357号(参照により全体として明示的に本明細書に組み込まれる)に概説される通りである。従って、可能な組み合わせとしては、IL-2とIL-15、IL-2とIL-21、IL-15とIL-21とIL-2、IL-15とIL-21が挙げられ、後者には多くの実施形態において特定の使用が見出される。これらの明細書に記載される通り、サイトカインの組み合わせを使用することは、特にリンパ球、詳細にはT細胞の生成に有利である。
E.ステップE:TILの回収
[00538] 第2の拡大培養ステップ後、細胞は回収することができる。一部の実施形態
において、TILは、例えば、図8に提供される通り、1、2、3、4回又はそれ以上の拡大培養ステップ後に回収される。一部の実施形態において、TILは、例えば、図8に提供される通り、2つの拡大培養ステップ後に回収される。
[00538] 第2の拡大培養ステップ後、細胞は回収することができる。一部の実施形態
において、TILは、例えば、図8に提供される通り、1、2、3、4回又はそれ以上の拡大培養ステップ後に回収される。一部の実施形態において、TILは、例えば、図8に提供される通り、2つの拡大培養ステップ後に回収される。
[00539] TILは、例えば、遠心によることを含め、任意の適切な且つ無菌の方法で
回収することができる。TIL回収方法は、当技術分野において周知であり、本プロセスと共に任意のかかる公知の方法を用いることができる。一部の実施形態において、TILは自動化系を使用して回収される。
回収することができる。TIL回収方法は、当技術分野において周知であり、本プロセスと共に任意のかかる公知の方法を用いることができる。一部の実施形態において、TILは自動化系を使用して回収される。
[00540] 細胞回収機及び/又は細胞処理系は、例えば、Fresenius Kabi、Tomtec Life
Science、Perkin Elmer及びInotech Biosystems International, Inc.を含む様々な供給源から市販されている。任意選択による細胞ベースのハーベスターを本方法で使用することができる。一部の実施形態において、細胞回収機及び/又は細胞処理系は、膜ベースの細胞ハーベスターである。一部の実施形態において、細胞回収は、LOVO系(Fresenius Kabi製)などの細胞処理系を介して行われる。用語「LOVO細胞処理系」は、滅菌及び/又は閉鎖系環境で回転膜又は回転フィルターなどの膜又はフィルターを通して、細胞を含む溶液を送り出すことができ、ペレット化せずに上清又は細胞培養培地を除去する連続フロー及び細胞処理を可能にする、あらゆる販売業者によって製造された機器又は装置も指す。一部の実施形態において、細胞回収機及び/又は細胞処理系は、閉鎖、無菌系で細胞分離、洗浄、流体交換、濃縮及び/又は他の細胞処理ステップを実施することができる。
Science、Perkin Elmer及びInotech Biosystems International, Inc.を含む様々な供給源から市販されている。任意選択による細胞ベースのハーベスターを本方法で使用することができる。一部の実施形態において、細胞回収機及び/又は細胞処理系は、膜ベースの細胞ハーベスターである。一部の実施形態において、細胞回収は、LOVO系(Fresenius Kabi製)などの細胞処理系を介して行われる。用語「LOVO細胞処理系」は、滅菌及び/又は閉鎖系環境で回転膜又は回転フィルターなどの膜又はフィルターを通して、細胞を含む溶液を送り出すことができ、ペレット化せずに上清又は細胞培養培地を除去する連続フロー及び細胞処理を可能にする、あらゆる販売業者によって製造された機器又は装置も指す。一部の実施形態において、細胞回収機及び/又は細胞処理系は、閉鎖、無菌系で細胞分離、洗浄、流体交換、濃縮及び/又は他の細胞処理ステップを実施することができる。
[00541] 一部の実施形態において、回収、例えば図8によるステップEは、閉鎖系バ
イオリアクターから実施される。一部の実施形態において、本明細書に記載される通り、TIL拡大培養のために閉鎖系が用いられる。一部の実施形態において、単一のバイオリアクターが用いられる。一部の実施形態において、用いられる単一のバイオリアクターは、例えば、G-REX-10又はG-REX-100である。一部の実施形態において、閉鎖系バイオリア
クターは、単一のバイオリアクターである。
イオリアクターから実施される。一部の実施形態において、本明細書に記載される通り、TIL拡大培養のために閉鎖系が用いられる。一部の実施形態において、単一のバイオリアクターが用いられる。一部の実施形態において、用いられる単一のバイオリアクターは、例えば、G-REX-10又はG-REX-100である。一部の実施形態において、閉鎖系バイオリア
クターは、単一のバイオリアクターである。
[00542] 一部の実施形態において、図8によるステップEは、実施例16に記載のプ
ロセスに従って実施される。一部の実施形態において、系の無菌性及び閉鎖性を維持するために、閉鎖系は、滅菌条件下でシリンジを介してアクセスされる。一部の実施形態において、実施例16に記載されるような閉鎖系が使用される。
ロセスに従って実施される。一部の実施形態において、系の無菌性及び閉鎖性を維持するために、閉鎖系は、滅菌条件下でシリンジを介してアクセスされる。一部の実施形態において、実施例16に記載されるような閉鎖系が使用される。
[00543] 一部の実施形態において、実施例16に記載された方法に従ってTILが回
収される。一部の実施形態において、セクション8.5(実施例16では、11日目のTIL回収と称される)に記載されるような方法を使用して、1日目~11日目にTILが回収される。一部の実施形態において、セクション8.12(実施例16では、22日目のTIL回収と称される)に記載されるような方法を使用して、12日目~22日目にTILが回収される。
収される。一部の実施形態において、セクション8.5(実施例16では、11日目のTIL回収と称される)に記載されるような方法を使用して、1日目~11日目にTILが回収される。一部の実施形態において、セクション8.12(実施例16では、22日目のTIL回収と称される)に記載されるような方法を使用して、12日目~22日目にTILが回収される。
F.ステップF:最終的な製剤化/輸注バッグへの移動
[00544] 図8に例示的順序で提供される通りの、且つ上記及び本明細書に詳細に概説
される通りのステップA~Eが完了した後、細胞は患者への投与における使用のため容器に移される。一部の実施形態において、上記に記載される拡大培養方法を用いて治療上十分な数のTILが得られると、TILは患者への投与における使用のため容器に移される。
[00544] 図8に例示的順序で提供される通りの、且つ上記及び本明細書に詳細に概説
される通りのステップA~Eが完了した後、細胞は患者への投与における使用のため容器に移される。一部の実施形態において、上記に記載される拡大培養方法を用いて治療上十分な数のTILが得られると、TILは患者への投与における使用のため容器に移される。
[00545] 一実施形態において、本開示のAPCを使用して拡大培養したTILは、医
薬組成物として患者に投与される。一実施形態において、医薬組成物は滅菌緩衝液中のTILの懸濁液である。本開示のPBMCを使用して拡大培養したTILは、当技術分野において公知の通りの任意の好適な経路によって投与され得る。一部の実施形態において、T細胞は単回動脈内又は静脈内注入として投与され、これは好ましくは約30~60分間継続される。他の好適な投与経路としては、腹腔内、髄腔内及びリンパ内が挙げられる。
薬組成物として患者に投与される。一実施形態において、医薬組成物は滅菌緩衝液中のTILの懸濁液である。本開示のPBMCを使用して拡大培養したTILは、当技術分野において公知の通りの任意の好適な経路によって投与され得る。一部の実施形態において、T細胞は単回動脈内又は静脈内注入として投与され、これは好ましくは約30~60分間継続される。他の好適な投与経路としては、腹腔内、髄腔内及びリンパ内が挙げられる。
1.医薬組成物、投薬量及び投与レジメン
[00546] 一実施形態において、本開示の方法を使用して拡大培養したTILは医薬組
成物として患者に投与される。一実施形態において、医薬組成物は滅菌緩衝液中のTILの懸濁液である。本開示のPBMCを使用して拡大培養したTILは、当技術分野において公知の通りの任意の好適な経路によって投与され得る。一部の実施形態において、T細胞は単回動脈内又は静脈内注入として投与され、これは好ましくは約30~60分間継続される。他の適切な投与経路には、腹腔内投与、髄腔内投与及びリンパ管内投与が含まれる。
[00546] 一実施形態において、本開示の方法を使用して拡大培養したTILは医薬組
成物として患者に投与される。一実施形態において、医薬組成物は滅菌緩衝液中のTILの懸濁液である。本開示のPBMCを使用して拡大培養したTILは、当技術分野において公知の通りの任意の好適な経路によって投与され得る。一部の実施形態において、T細胞は単回動脈内又は静脈内注入として投与され、これは好ましくは約30~60分間継続される。他の適切な投与経路には、腹腔内投与、髄腔内投与及びリンパ管内投与が含まれる。
[00547] 任意の適切な用量のTILを投与することができる。一部の実施形態におい
て、特に癌が黒色腫である場合、平均が約7.8×1010TILである約2.3×1010~約13.7×1010TILが投与される。一実施形態において、約1.2×1010~約4.3×1010のTILが投与される。一部の実施形態において、約3×1010~約12×1010のTILが投与される。一部の実施形態において、約4×1010~約10×1010のTILが投与される。一部の実施形態において、約5×1010~約8×1010のTILが投与される。一部の実施形態において、約6×1010~約8×1010のTILが投与される。一部の実施形態において、約7×1010~約8×1010のTILが投与される。一部の実施形態において、治療有効投与量は、約2.3×1010~約13.7×1010個である。一部の実施形態において、特に癌が黒色腫である場合、治療有効投与量は約7.8×1010個のTILである。一部の実施形態において、治療有効投与量は、約1.2×1010~約4.3×1010個のTILである。一部の実施形態において、治療有効投与量は、約3×1010~約12×1010個の
TILである。一部の実施形態において、治療有効投与量は、約4×1010~約10×1010個のTILである。一部の実施形態において、治療有効投与量は、約5×1010~約8×1010個のTILである。一部の実施形態において、治療有効投与量は、約6×1010~約8×1010個のTILである。一部の実施形態において、治療有効投与量は、約7×1010~約8×1010個のTILである。
て、特に癌が黒色腫である場合、平均が約7.8×1010TILである約2.3×1010~約13.7×1010TILが投与される。一実施形態において、約1.2×1010~約4.3×1010のTILが投与される。一部の実施形態において、約3×1010~約12×1010のTILが投与される。一部の実施形態において、約4×1010~約10×1010のTILが投与される。一部の実施形態において、約5×1010~約8×1010のTILが投与される。一部の実施形態において、約6×1010~約8×1010のTILが投与される。一部の実施形態において、約7×1010~約8×1010のTILが投与される。一部の実施形態において、治療有効投与量は、約2.3×1010~約13.7×1010個である。一部の実施形態において、特に癌が黒色腫である場合、治療有効投与量は約7.8×1010個のTILである。一部の実施形態において、治療有効投与量は、約1.2×1010~約4.3×1010個のTILである。一部の実施形態において、治療有効投与量は、約3×1010~約12×1010個の
TILである。一部の実施形態において、治療有効投与量は、約4×1010~約10×1010個のTILである。一部の実施形態において、治療有効投与量は、約5×1010~約8×1010個のTILである。一部の実施形態において、治療有効投与量は、約6×1010~約8×1010個のTILである。一部の実施形態において、治療有効投与量は、約7×1010~約8×1010個のTILである。
[00548] 一部の実施形態において、本発明の医薬組成物中に提供されるTILの数は
、約1×106、2×106、3×106、4×106、5×106、6×106、7×106、8×106、9×106、1×107、2×107、3×107、4×107、5×107、6×107、7×107、8×107、9×107、1×108、2×108、3×108、4×108、5×108、6×108、7×108、8×108、9×108、1×109、2×109、3×109、4×109、5×109、6×109、7×109、8×109、9×109、1×1010、2×1010、3×1010、4×1010、5×1010、6×1010、7×1010、8×1010、9×1010、1×1011、2×1011、3×1011、4×1011、5×1011、6×1011、7×1011、8×1011、9×1011、1×1012、2×1012、3×1012、4×1012、5×1012、6×1012、7×1012、8×1012、9×1012、1×1013、2×1013、3×1013、4×1013、5×1013、6×1013、7×1013、8×1013及び9×1013個である。一実施形態において、本発明の医薬組成物中に提供されるTILの数は、1×106~5×106、5×106~1×107、1×107~5×107、5×107~1×108、1×108~5×108、5×108~1×109、1×109~5×109、5×109~1×1010、1×1010~5×1010、5×1010~1×1011、5×1011~1×1012、1×1012~5×1012及び5×1012~1×1013の範囲内である。
、約1×106、2×106、3×106、4×106、5×106、6×106、7×106、8×106、9×106、1×107、2×107、3×107、4×107、5×107、6×107、7×107、8×107、9×107、1×108、2×108、3×108、4×108、5×108、6×108、7×108、8×108、9×108、1×109、2×109、3×109、4×109、5×109、6×109、7×109、8×109、9×109、1×1010、2×1010、3×1010、4×1010、5×1010、6×1010、7×1010、8×1010、9×1010、1×1011、2×1011、3×1011、4×1011、5×1011、6×1011、7×1011、8×1011、9×1011、1×1012、2×1012、3×1012、4×1012、5×1012、6×1012、7×1012、8×1012、9×1012、1×1013、2×1013、3×1013、4×1013、5×1013、6×1013、7×1013、8×1013及び9×1013個である。一実施形態において、本発明の医薬組成物中に提供されるTILの数は、1×106~5×106、5×106~1×107、1×107~5×107、5×107~1×108、1×108~5×108、5×108~1×109、1×109~5×109、5×109~1×1010、1×1010~5×1010、5×1010~1×1011、5×1011~1×1012、1×1012~5×1012及び5×1012~1×1013の範囲内である。
[00549] 一部の実施形態において、本発明の医薬組成物中に提供されるTILの濃度
は、例えば、医薬組成物の100%、90%、80%、70%、60%、50%、40%、30%、20%、19%、18%、17%、16%、15%、14%、13%、12%、11%、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%、0.5%、0.4%、0.3%、0.2%、0.1%、0.09%、0.08%、0.07%、0.06%、0.05%、0.04%、0.03%、0.02%、0.01%、0.009%、0.008%、0.007%、0.006%、0.005%、0.004%、0.003%、0.002%、0.001%、0.0009%、0.0008%、0.0007%、0.0006%、0.0005%、0.0004%、0.0003%、0.0002%又は0.0001%w/w、w/v又はv/vより低い。
は、例えば、医薬組成物の100%、90%、80%、70%、60%、50%、40%、30%、20%、19%、18%、17%、16%、15%、14%、13%、12%、11%、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%、0.5%、0.4%、0.3%、0.2%、0.1%、0.09%、0.08%、0.07%、0.06%、0.05%、0.04%、0.03%、0.02%、0.01%、0.009%、0.008%、0.007%、0.006%、0.005%、0.004%、0.003%、0.002%、0.001%、0.0009%、0.0008%、0.0007%、0.0006%、0.0005%、0.0004%、0.0003%、0.0002%又は0.0001%w/w、w/v又はv/vより低い。
[00550] 一部の実施形態において、本発明の医薬組成物中に提供されるTILの濃度
は、医薬組成物の90%、80%、70%、60%、50%、40%、30%、20%、19.75%、19.50%、19.25%、19%、18.75%、18.50%、18.25%、18%、17.75%、17.50%、17.25%、17%、16.75%、16.50%、16.25%、16%、15.75%、15.50%、15.25%、15%、14.75%、14.50%、14.25%、14%、13.75%、13.50%、13.25%、13%、12.75%、12.50%、12.25%、12%、11.75%、11.50%、11.25%、11%、10.75%、10.50%、10.25%、10%、9.75%、9.50%、9.25%、9%、8.75%、8.50%、8.25%、8%、7.75%、7.50%、7.25%、7%、6.75%、6.50%、6.25%、6%、5.75%、5.50%、5.25%、5%、4.75%、4.50%、4.25%、4%、3.75%、3.50%、3.25%、3%、2.75%、2.50%、2.25%、2%、1.75%、1.50%、125%、1%、0.
5%、0.4%、0.3%、0.2%、0.1%、0.09%、0.08%、0.07%、0.06%、0.05%、0.04%、0.03%、0.02%、0.01%、0.009%、0.008%、0.007%、0.006%、0.005%、0.004%、0.003%、0.002%、0.001%、0.0009%、0.0008%、0.0007%、0.0006%、0.0005%、0.0004%、0.0003%、0.0002%又は0.0001%w/w、w/v又はv/vより高い。
は、医薬組成物の90%、80%、70%、60%、50%、40%、30%、20%、19.75%、19.50%、19.25%、19%、18.75%、18.50%、18.25%、18%、17.75%、17.50%、17.25%、17%、16.75%、16.50%、16.25%、16%、15.75%、15.50%、15.25%、15%、14.75%、14.50%、14.25%、14%、13.75%、13.50%、13.25%、13%、12.75%、12.50%、12.25%、12%、11.75%、11.50%、11.25%、11%、10.75%、10.50%、10.25%、10%、9.75%、9.50%、9.25%、9%、8.75%、8.50%、8.25%、8%、7.75%、7.50%、7.25%、7%、6.75%、6.50%、6.25%、6%、5.75%、5.50%、5.25%、5%、4.75%、4.50%、4.25%、4%、3.75%、3.50%、3.25%、3%、2.75%、2.50%、2.25%、2%、1.75%、1.50%、125%、1%、0.
5%、0.4%、0.3%、0.2%、0.1%、0.09%、0.08%、0.07%、0.06%、0.05%、0.04%、0.03%、0.02%、0.01%、0.009%、0.008%、0.007%、0.006%、0.005%、0.004%、0.003%、0.002%、0.001%、0.0009%、0.0008%、0.0007%、0.0006%、0.0005%、0.0004%、0.0003%、0.0002%又は0.0001%w/w、w/v又はv/vより高い。
[00551] 一部の実施形態において、本発明の医薬組成物中に提供されるTILの濃度
は、医薬組成物の約0.0001%~約50%、約0.001%~約40%、約0.01%~約30%、約0.02%~約29%、約0.03%~約28%、約0.04%~約27%、約0.05%~約26%、約0.06%~約25%、約0.07%~約24%、約0.08%~約23%、約0.09%~約22%、約0.1%~約21%、約0.2%~約20%、約0.3%~約19%、約0.4%~約18%、約0.5%~約17%、約0.6%~約16%、約0.7%~約15%、約0.8%~約14%、約0.9%~約12%又は約1%~約10%w/w、w/v又はv/vの範囲内である。
は、医薬組成物の約0.0001%~約50%、約0.001%~約40%、約0.01%~約30%、約0.02%~約29%、約0.03%~約28%、約0.04%~約27%、約0.05%~約26%、約0.06%~約25%、約0.07%~約24%、約0.08%~約23%、約0.09%~約22%、約0.1%~約21%、約0.2%~約20%、約0.3%~約19%、約0.4%~約18%、約0.5%~約17%、約0.6%~約16%、約0.7%~約15%、約0.8%~約14%、約0.9%~約12%又は約1%~約10%w/w、w/v又はv/vの範囲内である。
[00552] 一部の実施形態において、本発明の医薬組成物中に提供されるTILの濃度
は、医薬組成物の約0.001%~約10%、約0.01%~約5%、約0.02%~約4.5%、約0.03%~約4%、約0.04%~約3.5%、約0.05%~約3%、約0.06%~約2.5%、約0.07%~約2%、約0.08%~約1.5%、約0.09%~約1%、約0.1%~約0.9%w/w、w/v又はv/vの範囲内である。
は、医薬組成物の約0.001%~約10%、約0.01%~約5%、約0.02%~約4.5%、約0.03%~約4%、約0.04%~約3.5%、約0.05%~約3%、約0.06%~約2.5%、約0.07%~約2%、約0.08%~約1.5%、約0.09%~約1%、約0.1%~約0.9%w/w、w/v又はv/vの範囲内である。
[00553] 一部の実施形態において、本発明の医薬組成物中に提供されるTILの量は
、10g、9.5g、9.0g、8.5g、8.0g、7.5g、7.0g、6.5g、6.0g、5.5g、5.0g、4.5g、4.0g、3.5g、3.0g、2.5g、2.0g、1.5g、1.0g、0.95g、0.9g、0.85g、0.8g、0.75g、0.7g、0.65g、0.6g、0.55g、0.5g、0.45g、0.4g、0.35g、0.3g、0.25g、0.2g、0.15g、0.1g、0.09g、0.08g、0.07g、0.06g、0.05g、0.04g、0.03g、0.02g、0.01g、0.009g、0.008g、0.007g、0.006g、0.005g、0.004g、0.003g、0.002g、0.001g、0.0009g、0.0008g、0.0007g、0.0006g、0.0005g、0.0004g、0.0003g、0.0002g又は0.0001g以下である。
、10g、9.5g、9.0g、8.5g、8.0g、7.5g、7.0g、6.5g、6.0g、5.5g、5.0g、4.5g、4.0g、3.5g、3.0g、2.5g、2.0g、1.5g、1.0g、0.95g、0.9g、0.85g、0.8g、0.75g、0.7g、0.65g、0.6g、0.55g、0.5g、0.45g、0.4g、0.35g、0.3g、0.25g、0.2g、0.15g、0.1g、0.09g、0.08g、0.07g、0.06g、0.05g、0.04g、0.03g、0.02g、0.01g、0.009g、0.008g、0.007g、0.006g、0.005g、0.004g、0.003g、0.002g、0.001g、0.0009g、0.0008g、0.0007g、0.0006g、0.0005g、0.0004g、0.0003g、0.0002g又は0.0001g以下である。
[00554] 一部の実施形態において、本発明の医薬組成物中に提供されるTILの量は
、0.0001g、0.0002g、0.0003g、0.0004g、0.0005g、0.0006g、0.0007g、0.0008g、0.0009g、0.001g、0.0015g、0.002g、0.0025g、0.003g、0.0035g、0.004g、0.0045g、0.005g、0.0055g、0.006g、0.0065g、0.007g、0.0075g、0.008g、0.0085g、0.009g、0.0095g、0.01g、0.015g、0.02g、0.025g、0.03g、0.035g、0.04g、0.045g、0.05g、0.055g、0.06g、0.065g、0.07g、0.075g、0.08g、0.085g、0.09g、0.095g、0.1g、0.15g、0.2g、0.25g、0.3g、0.35g、0.4g、0.45g、0.5g、0.55g、0.6g、0.65g、0.7g、0.75g、0.8g、0.85g、0.9g、0.95g、1g、1.5g、2g、2.5、3g、3.5、4g、4.5g、5g、5.5g、6g、6.5g、7g、7.5g、8g、8.5g、9g、9.5g又は10g超である。
、0.0001g、0.0002g、0.0003g、0.0004g、0.0005g、0.0006g、0.0007g、0.0008g、0.0009g、0.001g、0.0015g、0.002g、0.0025g、0.003g、0.0035g、0.004g、0.0045g、0.005g、0.0055g、0.006g、0.0065g、0.007g、0.0075g、0.008g、0.0085g、0.009g、0.0095g、0.01g、0.015g、0.02g、0.025g、0.03g、0.035g、0.04g、0.045g、0.05g、0.055g、0.06g、0.065g、0.07g、0.075g、0.08g、0.085g、0.09g、0.095g、0.1g、0.15g、0.2g、0.25g、0.3g、0.35g、0.4g、0.45g、0.5g、0.55g、0.6g、0.65g、0.7g、0.75g、0.8g、0.85g、0.9g、0.95g、1g、1.5g、2g、2.5、3g、3.5、4g、4.5g、5g、5.5g、6g、6.5g、7g、7.5g、8g、8.5g、9g、9.5g又は10g超である。
[00555] 本発明の医薬組成物において提供されるTILは、広い投与量範囲にわたっ
て有効である。正確な投与量は、投与経路、化合物が投与される形態、処置されるべき対象の性別及び年齢、処置されるべき対象の体重並びに担当医の選好及び経験に依存するであろう。臨床的に確立されたTILの投与量も適切な場合に使用され得る。TILの投与量など、本明細書の方法を使用して投与される医薬組成物の量は、処置されるヒト又は哺乳動物、疾患又は状態の重症度、投与速度、活性医薬成分の性質及び処方医の裁量に依存するであろう。
て有効である。正確な投与量は、投与経路、化合物が投与される形態、処置されるべき対象の性別及び年齢、処置されるべき対象の体重並びに担当医の選好及び経験に依存するであろう。臨床的に確立されたTILの投与量も適切な場合に使用され得る。TILの投与量など、本明細書の方法を使用して投与される医薬組成物の量は、処置されるヒト又は哺乳動物、疾患又は状態の重症度、投与速度、活性医薬成分の性質及び処方医の裁量に依存するであろう。
[00556] 一部の実施形態において、TILは単回投与で投与され得る。そのような投
与は、注射、例えば静脈内注射によるものであり得る。一部の実施形態において、TILは複数回投与で投与され得る。投与は、1年に1回、2回、3回、4回、5回、6回又は6回を超え得る。投与は、月に1回、2週間に1回、週に1回又は隔日に1回であり得る。TILの投与は必要な限り継続し得る。
与は、注射、例えば静脈内注射によるものであり得る。一部の実施形態において、TILは複数回投与で投与され得る。投与は、1年に1回、2回、3回、4回、5回、6回又は6回を超え得る。投与は、月に1回、2週間に1回、週に1回又は隔日に1回であり得る。TILの投与は必要な限り継続し得る。
[00557] 一部の実施形態において、TILの有効投与量は、約1×106、2×10
6、3×106、4×106、5×106、6×106、7×106、8×106、9×106、1×107、2×107、3×107、4×107、5×107、6×107、7×107、8×107、9×107、1×108、2×108、3×108、4×108、5×108、6×108、7×108、8×108、9×108、1×109、2×109、3×109、4×109、5×109、6×109、7×109、8×109、9×109、1×1010、2×1010、3×1010、4×1010、5×1010、6×1010、7×1010、8×1010、9×1010、1×1011、2×1011、3×1011、4×1011、5×1011、6×1011、7×1011、8×1011、9×1011、1×1012、2×1012、3×1012、4×1012、5×1012、6×1012、7×1012、8×1012、9×1012、1×1013、2×1013、3×1013、4×1013、5×1013、6×1013、7×1013、8×1013及び9×1013個である。一部の実施形態において、TILの有効投与量は、1×106~5×106、5×106~1×107、1×107~5×107、5×107~1×108、1×108~5×108、5×108~1×109、1×109~5×109、5×109~1×1010、1×1010~5×1010、5×1010~1×1011、5×1011~1×1012、1×1012~5×1012及び5×1012~1×1013の範囲内である。
6、3×106、4×106、5×106、6×106、7×106、8×106、9×106、1×107、2×107、3×107、4×107、5×107、6×107、7×107、8×107、9×107、1×108、2×108、3×108、4×108、5×108、6×108、7×108、8×108、9×108、1×109、2×109、3×109、4×109、5×109、6×109、7×109、8×109、9×109、1×1010、2×1010、3×1010、4×1010、5×1010、6×1010、7×1010、8×1010、9×1010、1×1011、2×1011、3×1011、4×1011、5×1011、6×1011、7×1011、8×1011、9×1011、1×1012、2×1012、3×1012、4×1012、5×1012、6×1012、7×1012、8×1012、9×1012、1×1013、2×1013、3×1013、4×1013、5×1013、6×1013、7×1013、8×1013及び9×1013個である。一部の実施形態において、TILの有効投与量は、1×106~5×106、5×106~1×107、1×107~5×107、5×107~1×108、1×108~5×108、5×108~1×109、1×109~5×109、5×109~1×1010、1×1010~5×1010、5×1010~1×1011、5×1011~1×1012、1×1012~5×1012及び5×1012~1×1013の範囲内である。
[00558] 一部の実施形態において、TILの有効投与量は、約0.01mg/kg~
約4.3mg/kg、約0.15mg/kg~約3.6mg/kg、約0.3mg/kg~約3.2mg/kg、約0.35mg/kg~約2.85mg/kg、約0.15mg/kg~約2.85mg/kg、約0.3mg~約2.15mg/kg、約0.45mg/kg~約1.7mg/kg、約0.15mg/kg~約1.3mg/kg、約0.3mg/kg~約1.15mg/kg、約0.45mg/kg~約1mg/kg、約0.55mg/kg~約0.85mg/kg、約0.65mg/kg~約0.8mg/kg、約0.7mg/kg~約0.75mg/kg、約0.7mg/kg~約2.15mg/kg、約0.85mg/kg~約2mg/kg、約1mg/kg~約1.85mg/kg、約1.15mg/kg~約1.7mg/kg、約1.3mg/kgmg~約1.6mg/kg、約1.35mg/kg~約1.5mg/kg、約2.15mg/kg~約3.6mg/kg、約2.3mg/kg~約3.4mg/kg、約2.4mg/kg~約3.3mg/kg、約2.6mg/kg~約3.15mg/kg、約2.7mg/kg~約3mg/kg、約2.8mg/kg~約3mg/kg又は約2.85mg/kg~約2.95mg/kgの範囲内である。
約4.3mg/kg、約0.15mg/kg~約3.6mg/kg、約0.3mg/kg~約3.2mg/kg、約0.35mg/kg~約2.85mg/kg、約0.15mg/kg~約2.85mg/kg、約0.3mg~約2.15mg/kg、約0.45mg/kg~約1.7mg/kg、約0.15mg/kg~約1.3mg/kg、約0.3mg/kg~約1.15mg/kg、約0.45mg/kg~約1mg/kg、約0.55mg/kg~約0.85mg/kg、約0.65mg/kg~約0.8mg/kg、約0.7mg/kg~約0.75mg/kg、約0.7mg/kg~約2.15mg/kg、約0.85mg/kg~約2mg/kg、約1mg/kg~約1.85mg/kg、約1.15mg/kg~約1.7mg/kg、約1.3mg/kgmg~約1.6mg/kg、約1.35mg/kg~約1.5mg/kg、約2.15mg/kg~約3.6mg/kg、約2.3mg/kg~約3.4mg/kg、約2.4mg/kg~約3.3mg/kg、約2.6mg/kg~約3.15mg/kg、約2.7mg/kg~約3mg/kg、約2.8mg/kg~約3mg/kg又は約2.85mg/kg~約2.95mg/kgの範囲内である。
[00559] 一部の実施形態において、TILの有効投与量は、約1mg~約500mg
、約10mg~約300mg、約20mg~約250mg、約25mg~約200mg、
約1mg~約50mg、約5mg~約45mg、約10mg~約40mg、約15mg~約35mg、約20mg~約30mg、約23mg~約28mg、約50mg~約150mg、約60mg~約140mg、約70mg~約130mg、約80mg~約120mg、約90mg~約110mg又は約95mg~約105mg、約98mg~約102mg、約150mg~約250mg、約160mg~約240mg、約170mg~約230mg、約180mg~約220mg、約190mg~約210mg、約195mg~約205mg又は約198~約207mgの範囲内である。
、約10mg~約300mg、約20mg~約250mg、約25mg~約200mg、
約1mg~約50mg、約5mg~約45mg、約10mg~約40mg、約15mg~約35mg、約20mg~約30mg、約23mg~約28mg、約50mg~約150mg、約60mg~約140mg、約70mg~約130mg、約80mg~約120mg、約90mg~約110mg又は約95mg~約105mg、約98mg~約102mg、約150mg~約250mg、約160mg~約240mg、約170mg~約230mg、約180mg~約220mg、約190mg~約210mg、約195mg~約205mg又は約198~約207mgの範囲内である。
[00560] 有効量のTILは、鼻腔内及び経皮経路、動脈内注射によること、静脈内、
腹腔内、非経口的、筋肉内、皮下、局所、移植によること又は吸入によることを含め、同様の有用性を有する薬剤について認められている任意の投与方式により、単回用量又は複数回用量のいずれでも投与され得る。
腹腔内、非経口的、筋肉内、皮下、局所、移植によること又は吸入によることを含め、同様の有用性を有する薬剤について認められている任意の投与方式により、単回用量又は複数回用量のいずれでも投与され得る。
G.任意選択による細胞培養培地成分
1.抗CD3抗体
[00561] 一部の実施形態において、本明細書に記載の拡大培養方法で使用される培養
培地(REPと称されるものを含み、例えば図Aを参照されたい)は、抗CD3抗体も含む。抗CD3抗体をIL-2と併用すると、TIL集団においてT細胞活性化及び細胞分裂が誘導される。この効果は、完全長抗体並びにFab及びF(ab’)2断片で見ることができ、前者が概して好ましく;例えばTsoukas et al., J. Immunol. 1985, 135, 1719(参照により全体として本明細書に組み込まれる)を参照されたい。
1.抗CD3抗体
[00561] 一部の実施形態において、本明細書に記載の拡大培養方法で使用される培養
培地(REPと称されるものを含み、例えば図Aを参照されたい)は、抗CD3抗体も含む。抗CD3抗体をIL-2と併用すると、TIL集団においてT細胞活性化及び細胞分裂が誘導される。この効果は、完全長抗体並びにFab及びF(ab’)2断片で見ることができ、前者が概して好ましく;例えばTsoukas et al., J. Immunol. 1985, 135, 1719(参照により全体として本明細書に組み込まれる)を参照されたい。
[00562] 当業者が理解し得る通り、本発明において使用が見出される好適な抗ヒトC
D3抗体は、限定はされないが、ネズミ科動物、ヒト、霊長類、ラット及びイヌ科動物抗体を含めた、様々な哺乳類からの抗ヒトCD3ポリクローナル及びモノクローナル抗体を含め、幾つも存在する。詳細な実施形態において、OKT3抗CD3抗体が使用される(Ortho-McNeil、Raritan, NJ又はMiltenyi Biotech、Auburn, CAから市販されている)。
D3抗体は、限定はされないが、ネズミ科動物、ヒト、霊長類、ラット及びイヌ科動物抗体を含めた、様々な哺乳類からの抗ヒトCD3ポリクローナル及びモノクローナル抗体を含め、幾つも存在する。詳細な実施形態において、OKT3抗CD3抗体が使用される(Ortho-McNeil、Raritan, NJ又はMiltenyi Biotech、Auburn, CAから市販されている)。
2.4-1BB(CD137)アゴニスト
[00563] 一実施形態において、TNFRSFアゴニストは、4-1BB(CD137
)アゴニストである。4-1BBアゴニストは、当技術分野で公知の任意の4-1BB結合分子であり得る。4-1BB結合分子は、ヒト又は哺乳類4-1BBに結合できるモノクローナル抗体又は融合タンパク質であり得る。4-1BBアゴニスト又は4-1BB結合分子は、免疫グロブリン分子の任意のアイソタイプ(例えば、IgG、IgE、IgM、IgD、IgA及びIgY)、クラス(例えば、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1及びIgA2)又はサブクラスの免疫グロブリン重鎖を含み得る。4-1BBアゴニスト又は4-1BB結合分子は、重鎖及び軽鎖の両方を有し得る。本明細書で使用される場合、結合分子という用語は、抗体(全長抗体を含む)、モノクローナル抗体(全長モノクローナル抗体を含む)、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体(例えば、二重特異性抗体)、ヒト、ヒト化又はキメラ抗体並びに抗体断片、例えばFab断片、F(ab’)断片、Fab発現ライブラリーにより産生される断片、上記のいずれかのエピトープ結合断片及び4-1BBに結合する抗体の操作された形態、例えばscFv分子も含む。一実施形態において、4-1BBアゴニストは、完全ヒト抗体である抗原結合タンパク質である。一実施形態において、4-1BBアゴニストは、ヒト化抗体である抗原結合タンパク質である。一部の実施形態において、本開示の方法及び組成物における使用のための4-1BBアゴニストは、抗4-1BB抗体、ヒト抗4-1BB抗体、マウス抗4-1BB抗体、哺乳動物抗4-1BB抗体、モノクローナル抗4-1BB抗体、ポリクローナル抗4-1BB抗体、キメラ抗4-1BB抗体、抗4-1BBアドネクチン、抗4-1BBドメイン抗体、単鎖抗4-1BB断片、重鎖抗4-1BB断片、軽鎖抗4-1BB断片、抗4-1BB融合タンパク質及びそれらの断片、誘導体、コンジュゲート、変異体若
しくはバイオシミラーを含む。アゴニスト性抗4-1BB抗体は、強い免疫応答を誘導することが知られている。Lee, et al., PLOS One 2013, 8, e69677。好ましい実施形態に
おいて、4-1BBアゴニストは、アゴニスト性、抗4-1BBヒト化又は完全ヒトモノクローナル抗体(即ち単一細胞株に由来する抗体)である。一実施形態において、4-1BBアゴニストは、EU-101(Eutilex Co. Ltd.)、ウトミルマブ若しくはウレルマブ又はそれらの断片、誘導体、コンジュゲート、変異体若しくはバイオシミラーである。好ましい一実施形態において、4-1BBアゴニストは、ウトミルマブ又はウレルマブ又はそれらの断片、誘導体、コンジュゲート、変異体若しくはバイオシミラーである。
[00563] 一実施形態において、TNFRSFアゴニストは、4-1BB(CD137
)アゴニストである。4-1BBアゴニストは、当技術分野で公知の任意の4-1BB結合分子であり得る。4-1BB結合分子は、ヒト又は哺乳類4-1BBに結合できるモノクローナル抗体又は融合タンパク質であり得る。4-1BBアゴニスト又は4-1BB結合分子は、免疫グロブリン分子の任意のアイソタイプ(例えば、IgG、IgE、IgM、IgD、IgA及びIgY)、クラス(例えば、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1及びIgA2)又はサブクラスの免疫グロブリン重鎖を含み得る。4-1BBアゴニスト又は4-1BB結合分子は、重鎖及び軽鎖の両方を有し得る。本明細書で使用される場合、結合分子という用語は、抗体(全長抗体を含む)、モノクローナル抗体(全長モノクローナル抗体を含む)、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体(例えば、二重特異性抗体)、ヒト、ヒト化又はキメラ抗体並びに抗体断片、例えばFab断片、F(ab’)断片、Fab発現ライブラリーにより産生される断片、上記のいずれかのエピトープ結合断片及び4-1BBに結合する抗体の操作された形態、例えばscFv分子も含む。一実施形態において、4-1BBアゴニストは、完全ヒト抗体である抗原結合タンパク質である。一実施形態において、4-1BBアゴニストは、ヒト化抗体である抗原結合タンパク質である。一部の実施形態において、本開示の方法及び組成物における使用のための4-1BBアゴニストは、抗4-1BB抗体、ヒト抗4-1BB抗体、マウス抗4-1BB抗体、哺乳動物抗4-1BB抗体、モノクローナル抗4-1BB抗体、ポリクローナル抗4-1BB抗体、キメラ抗4-1BB抗体、抗4-1BBアドネクチン、抗4-1BBドメイン抗体、単鎖抗4-1BB断片、重鎖抗4-1BB断片、軽鎖抗4-1BB断片、抗4-1BB融合タンパク質及びそれらの断片、誘導体、コンジュゲート、変異体若
しくはバイオシミラーを含む。アゴニスト性抗4-1BB抗体は、強い免疫応答を誘導することが知られている。Lee, et al., PLOS One 2013, 8, e69677。好ましい実施形態に
おいて、4-1BBアゴニストは、アゴニスト性、抗4-1BBヒト化又は完全ヒトモノクローナル抗体(即ち単一細胞株に由来する抗体)である。一実施形態において、4-1BBアゴニストは、EU-101(Eutilex Co. Ltd.)、ウトミルマブ若しくはウレルマブ又はそれらの断片、誘導体、コンジュゲート、変異体若しくはバイオシミラーである。好ましい一実施形態において、4-1BBアゴニストは、ウトミルマブ又はウレルマブ又はそれらの断片、誘導体、コンジュゲート、変異体若しくはバイオシミラーである。
[00564] 好ましい実施形態において、4-1BBアゴニスト又は4-1BB結合分子
は、融合タンパク質でもあり得る。好ましい実施形態において、三量体又は六量体4-1BBアゴニスト(3つ又は6つのリガンド結合ドメインを有する)などの多量体4-1BBアゴニストは、典型的には2つのリガンド結合ドメインを保有するアゴニスト性モノクローナル抗体と比較して、優れた受容体(4-1BBL)のクラスター化及び内部細胞シグナル伝達複合体形成を誘導し得る。3つのTNFRSF結合ドメイン及びIgG1-Fcを含み、任意選択によりこれらの融合タンパク質の2つ以上を更に連結する、三量体(三価)又は六量体(又は六価)又はそれより大きい融合タンパク質は、例えば、Gieffers, et al., Mol.Cancer Therapeutics 2013, 12, 2735-47に記載される。
は、融合タンパク質でもあり得る。好ましい実施形態において、三量体又は六量体4-1BBアゴニスト(3つ又は6つのリガンド結合ドメインを有する)などの多量体4-1BBアゴニストは、典型的には2つのリガンド結合ドメインを保有するアゴニスト性モノクローナル抗体と比較して、優れた受容体(4-1BBL)のクラスター化及び内部細胞シグナル伝達複合体形成を誘導し得る。3つのTNFRSF結合ドメイン及びIgG1-Fcを含み、任意選択によりこれらの融合タンパク質の2つ以上を更に連結する、三量体(三価)又は六量体(又は六価)又はそれより大きい融合タンパク質は、例えば、Gieffers, et al., Mol.Cancer Therapeutics 2013, 12, 2735-47に記載される。
[00565] アゴニスト性4-1BB抗体及び融合タンパク質は、強い免疫応答を誘導す
ることが知られている。好ましい実施形態において、4-1BBアゴニストは、毒性を低減するのに十分な方法で4-1BB抗原に特異的に結合するモノクローナル抗体又は融合タンパク質である。一部の実施形態において、4-1BBアゴニストは、抗体依存性細胞傷害性(ADCC)、例えばNK細胞の細胞傷害性を抑制する、アゴニスト性4-1BBモノクローナル抗体又は融合タンパク質である。一部の実施形態において、4-1BBアゴニストは、抗体依存性細胞食作用(ADCP)を抑制する、アゴニスト性4-1BBモノクローナル抗体又は融合タンパク質である。一部の実施形態において、4-1BBアゴニストは、補体依存性細胞毒性(CDC)を抑制する、アゴニスト性4-1BBモノクローナル抗体又は融合タンパク質である。一部の実施形態において、4-1BBアゴニストは、Fc領域機能性を抑制する、アゴニスト性4-1BBモノクローナル抗体又は融合タンパク質である。
ることが知られている。好ましい実施形態において、4-1BBアゴニストは、毒性を低減するのに十分な方法で4-1BB抗原に特異的に結合するモノクローナル抗体又は融合タンパク質である。一部の実施形態において、4-1BBアゴニストは、抗体依存性細胞傷害性(ADCC)、例えばNK細胞の細胞傷害性を抑制する、アゴニスト性4-1BBモノクローナル抗体又は融合タンパク質である。一部の実施形態において、4-1BBアゴニストは、抗体依存性細胞食作用(ADCP)を抑制する、アゴニスト性4-1BBモノクローナル抗体又は融合タンパク質である。一部の実施形態において、4-1BBアゴニストは、補体依存性細胞毒性(CDC)を抑制する、アゴニスト性4-1BBモノクローナル抗体又は融合タンパク質である。一部の実施形態において、4-1BBアゴニストは、Fc領域機能性を抑制する、アゴニスト性4-1BBモノクローナル抗体又は融合タンパク質である。
[00566] 一部の実施形態において、4-1BBアゴニストは、高い親和性及びアゴニ
スト活性でヒト4-1BB(配列番号9)に結合することを特徴とする。一実施形態において、4-1BBアゴニストは、ヒト4-1BB(配列番号9)に結合する結合分子である。一実施形態において、4-1BBアゴニストは、マウス4-1BB(配列番号10)に結合する結合分子である。4-1BBアゴニスト又は結合分子が結合する4-1BB抗原のアミノ酸配列を表3に概括する。
スト活性でヒト4-1BB(配列番号9)に結合することを特徴とする。一実施形態において、4-1BBアゴニストは、ヒト4-1BB(配列番号9)に結合する結合分子である。一実施形態において、4-1BBアゴニストは、マウス4-1BB(配列番号10)に結合する結合分子である。4-1BBアゴニスト又は結合分子が結合する4-1BB抗原のアミノ酸配列を表3に概括する。
[00567] 一部の実施形態において、記載される組成物、プロセス及び方法は、約10
0pM以下のKDでヒト又はマウス4-1BBに結合するか、約90pM以下のKDでヒト又はマウス4-1BBに結合するか、約80pM以下のKDでヒト又はマウス4-1BBに結合するか、約70pM以下のKDでヒト又はマウス4-1BBに結合するか、約60pM以下のKDでヒト又はマウス4-1BBに結合するか、約50pM以下のKDでヒト又はマウス4-1BBに結合するか、約40pM以下のKDでヒト又はマウス4-1BBに結合するか、又は約30pM以下のKDでヒト又はマウス4-1BBに結合する、4-1BBアゴニストを含む。
0pM以下のKDでヒト又はマウス4-1BBに結合するか、約90pM以下のKDでヒト又はマウス4-1BBに結合するか、約80pM以下のKDでヒト又はマウス4-1BBに結合するか、約70pM以下のKDでヒト又はマウス4-1BBに結合するか、約60pM以下のKDでヒト又はマウス4-1BBに結合するか、約50pM以下のKDでヒト又はマウス4-1BBに結合するか、約40pM以下のKDでヒト又はマウス4-1BBに結合するか、又は約30pM以下のKDでヒト又はマウス4-1BBに結合する、4-1BBアゴニストを含む。
[00568] 一部の実施形態において、記載される組成物、プロセス及び方法は、約7.
5×105 1/M・s以上のkassocでヒト又はマウス4-1BBに結合するか、約7.5×105 1/M・s以上のkassocでヒト又はマウス4-1BBに結合するか、約8×105 1/M・s以上のkassocでヒト又はマウス4-1BBに結合するか、約8.5×105 1/M・s以上のkassocでヒト又はマウス4-1BBに結合するか、約9×105 1/M・s以上のkassocでヒト又はマウス4-1BBに結合するか、約9.5×105 1/M・s以上のkassocでヒト又はマウス4-1BBに結合するか、又は約1×106 1/M・s以上のkassocでヒト又はマウス4-1BBに結合する、4-1BBアゴニストを含む。
5×105 1/M・s以上のkassocでヒト又はマウス4-1BBに結合するか、約7.5×105 1/M・s以上のkassocでヒト又はマウス4-1BBに結合するか、約8×105 1/M・s以上のkassocでヒト又はマウス4-1BBに結合するか、約8.5×105 1/M・s以上のkassocでヒト又はマウス4-1BBに結合するか、約9×105 1/M・s以上のkassocでヒト又はマウス4-1BBに結合するか、約9.5×105 1/M・s以上のkassocでヒト又はマウス4-1BBに結合するか、又は約1×106 1/M・s以上のkassocでヒト又はマウス4-1BBに結合する、4-1BBアゴニストを含む。
[00569] 一部の実施形態において、記載される組成物、プロセス及び方法は、約2×
10-5 1/s以下のkdissocでヒト又はマウス4-1BBに結合するか、約2.1×10-5 1/s以下のkdissocでヒト又はマウス4-1BBに結合するか、約2.2×10-5 1/s以下のkdissocでヒト又はマウス4-1BBに結合するか、約2.3×10-5 1/s以下のkdissocでヒト又はマウス4-1BBに結合するか、約2.4×10-5 1/s以下のkdissocでヒト又はマウス4-1BBに結合するか、約2.5×10-5 1/s以下のkdissocでヒト又はマウス4-1BBに結合するか、約2.6×10-5 1/s以下のkdissocでヒト又はマウス4-1BBに結合するか、又は約2.7×10-5 1/s以下のkdissocでヒト又はマウス4-1BBに結合するか、約2.8×10-5 1/s以下のkdissocでヒト又はマウス4-1BBに結合するか、約2.9×10-5 1/s以下のkdissocでヒト又はマウス4-1BBに結合するか、又は約3×10-5 1/s以下のkdissocでヒト又はマウス4-1BBに結合する、4-1BBアゴニストを含む。
10-5 1/s以下のkdissocでヒト又はマウス4-1BBに結合するか、約2.1×10-5 1/s以下のkdissocでヒト又はマウス4-1BBに結合するか、約2.2×10-5 1/s以下のkdissocでヒト又はマウス4-1BBに結合するか、約2.3×10-5 1/s以下のkdissocでヒト又はマウス4-1BBに結合するか、約2.4×10-5 1/s以下のkdissocでヒト又はマウス4-1BBに結合するか、約2.5×10-5 1/s以下のkdissocでヒト又はマウス4-1BBに結合するか、約2.6×10-5 1/s以下のkdissocでヒト又はマウス4-1BBに結合するか、又は約2.7×10-5 1/s以下のkdissocでヒト又はマウス4-1BBに結合するか、約2.8×10-5 1/s以下のkdissocでヒト又はマウス4-1BBに結合するか、約2.9×10-5 1/s以下のkdissocでヒト又はマウス4-1BBに結合するか、又は約3×10-5 1/s以下のkdissocでヒト又はマウス4-1BBに結合する、4-1BBアゴニストを含む。
[00570] 一部の実施形態において、記載される組成物、プロセス及び方法は、約10
nM以下のIC50でヒト又はマウス4-1BBに結合するか、約9nM以下のIC50でヒト又はマウス4-1BBに結合するか、約8nM以下のIC50でヒト又はマウス4-1BBに結合するか、約7nM以下のIC50でヒト又はマウス4-1BBに結合するか、約6nM以下のIC50でヒト又はマウス4-1BBに結合するか、約5nM以下のIC50でヒト又はマウス4-1BBに結合するか、約4nM以下のIC50でヒト又はマウス4-1BBに結合するか、約3nM以下のIC50でヒト又はマウス4-1BBに結合するか、約2nM以下のIC50でヒト又はマウス4-1BBに結合するか、又は約1nM以下のIC50でヒト又はマウス4-1BBに結合する、4-1BBアゴニストを含む。
nM以下のIC50でヒト又はマウス4-1BBに結合するか、約9nM以下のIC50でヒト又はマウス4-1BBに結合するか、約8nM以下のIC50でヒト又はマウス4-1BBに結合するか、約7nM以下のIC50でヒト又はマウス4-1BBに結合するか、約6nM以下のIC50でヒト又はマウス4-1BBに結合するか、約5nM以下のIC50でヒト又はマウス4-1BBに結合するか、約4nM以下のIC50でヒト又はマウス4-1BBに結合するか、約3nM以下のIC50でヒト又はマウス4-1BBに結合するか、約2nM以下のIC50でヒト又はマウス4-1BBに結合するか、又は約1nM以下のIC50でヒト又はマウス4-1BBに結合する、4-1BBアゴニストを含む。
[00571] 好ましい実施形態において、4-1BBアゴニストは、PF-050825
66又はMOR-7480としても知られるウトミルマブ又はその断片、誘導体、変異体若しくはバイオシミラーである。ウトミルマブはPfizer, Inc.から入手できる。ウトミルマブは、免疫グロブリンG2-ラムダ、抗[ヒト(Homo sapiens)TNFRSF9(腫瘍壊死因子受容体(TNFR)スーパーファミリーメンバー9、4-1BB、T細胞抗原ILA、CD137)]、ヒト(Homo sapiens)(完全ヒト)モノクローナル抗体である。ウトミルマブのアミノ酸配列を表4に示す。ウトミルマブは、Asn59及びAsn292のグリコシル化部位;位置22-96(VH-VL)、143-199(CH1-CL)、256-316(CH2)及び362-420(CH3)の重鎖内ジスルフィド架橋;位置22’-87’(VH-VL)及び136’-195’(CH1-CL)の軽鎖内ジスルフィド架橋;IgG2Aアイソフォーム位置218-218、219-219、222-222及び225-225、IgG2A/Bアイソフォーム位置218-130、219-219、222-222及び225-225並びにIgG2Bアイソフォーム位置219-130(2)、222-222及び225-225の鎖内重鎖-重鎖ジスルフィド架橋;IgG2Aアイソフォーム位置130-213’(2)、IgG2A/Bアイソフォーム位置218-213’及び130-213’並びにIgG2Bアイソフォーム位置218-213’(2)の鎖内重鎖-軽鎖ジスルフィド架橋を含む。ウトミルマブ並びにその変異体及び断片の調製並びに特性は、米国特許第8,821,867号;第8,337,850号;及び第9,468,678号並びに国際公開第2012/032433 A1号に記載され、これらのそれぞれの開示は、参照により本明細書に組み込まれる。ウトミルマブの前臨床的特徴は、Fisher, et al., Cancer Immunolog. & Immunother.2012, 61, 1721-33に記載される。様々な血液学的及び固形腫瘍の適応症におけるウトミルマブの現在の臨床試験には、米国国立衛生研究所Clinicaltrials.gov識別子NCT02444793、NCT01307267、NCT02315066及びNCT02554812が含まれる。
66又はMOR-7480としても知られるウトミルマブ又はその断片、誘導体、変異体若しくはバイオシミラーである。ウトミルマブはPfizer, Inc.から入手できる。ウトミルマブは、免疫グロブリンG2-ラムダ、抗[ヒト(Homo sapiens)TNFRSF9(腫瘍壊死因子受容体(TNFR)スーパーファミリーメンバー9、4-1BB、T細胞抗原ILA、CD137)]、ヒト(Homo sapiens)(完全ヒト)モノクローナル抗体である。ウトミルマブのアミノ酸配列を表4に示す。ウトミルマブは、Asn59及びAsn292のグリコシル化部位;位置22-96(VH-VL)、143-199(CH1-CL)、256-316(CH2)及び362-420(CH3)の重鎖内ジスルフィド架橋;位置22’-87’(VH-VL)及び136’-195’(CH1-CL)の軽鎖内ジスルフィド架橋;IgG2Aアイソフォーム位置218-218、219-219、222-222及び225-225、IgG2A/Bアイソフォーム位置218-130、219-219、222-222及び225-225並びにIgG2Bアイソフォーム位置219-130(2)、222-222及び225-225の鎖内重鎖-重鎖ジスルフィド架橋;IgG2Aアイソフォーム位置130-213’(2)、IgG2A/Bアイソフォーム位置218-213’及び130-213’並びにIgG2Bアイソフォーム位置218-213’(2)の鎖内重鎖-軽鎖ジスルフィド架橋を含む。ウトミルマブ並びにその変異体及び断片の調製並びに特性は、米国特許第8,821,867号;第8,337,850号;及び第9,468,678号並びに国際公開第2012/032433 A1号に記載され、これらのそれぞれの開示は、参照により本明細書に組み込まれる。ウトミルマブの前臨床的特徴は、Fisher, et al., Cancer Immunolog. & Immunother.2012, 61, 1721-33に記載される。様々な血液学的及び固形腫瘍の適応症におけるウトミルマブの現在の臨床試験には、米国国立衛生研究所Clinicaltrials.gov識別子NCT02444793、NCT01307267、NCT02315066及びNCT02554812が含まれる。
[00572] 一実施形態において、4-1BBアゴニストは、配列番号11で示される重
鎖及び配列番号12で示される軽鎖を含む。一実施形態において、4-1BBアゴニストは、それぞれ配列番号11及び配列番号12に示される配列を有する重鎖及び軽鎖又は抗原結合断片、Fab断片、単鎖可変断片(scFv)、それらの変異体若しくはコンジュゲートを含む。一実施形態において、4-1BBアゴニストは、それぞれ配列番号11及び配列番号12に示される配列とそれぞれ少なくとも99%同一である重鎖及び軽鎖を含む。一実施形態において、4-1BBアゴニストは、それぞれ配列番号11及び配列番号12に示される配列とそれぞれ少なくとも98%同一である重鎖及び軽鎖を含む。一実施形態において、4-1BBアゴニストは、それぞれ配列番号11及び配列番号12に示される配列とそれぞれ少なくとも97%同一である重鎖及び軽鎖を含む。一実施形態において、4-1BBアゴニストは、それぞれ配列番号11及び配列番号12に示される配列とそれぞれ少なくとも96%同一である重鎖及び軽鎖を含む。一実施形態において、4-1BBアゴニストは、それぞれ配列番号11及び配列番号12に示される配列とそれぞれ少
なくとも95%同一である重鎖及び軽鎖を含む。
鎖及び配列番号12で示される軽鎖を含む。一実施形態において、4-1BBアゴニストは、それぞれ配列番号11及び配列番号12に示される配列を有する重鎖及び軽鎖又は抗原結合断片、Fab断片、単鎖可変断片(scFv)、それらの変異体若しくはコンジュゲートを含む。一実施形態において、4-1BBアゴニストは、それぞれ配列番号11及び配列番号12に示される配列とそれぞれ少なくとも99%同一である重鎖及び軽鎖を含む。一実施形態において、4-1BBアゴニストは、それぞれ配列番号11及び配列番号12に示される配列とそれぞれ少なくとも98%同一である重鎖及び軽鎖を含む。一実施形態において、4-1BBアゴニストは、それぞれ配列番号11及び配列番号12に示される配列とそれぞれ少なくとも97%同一である重鎖及び軽鎖を含む。一実施形態において、4-1BBアゴニストは、それぞれ配列番号11及び配列番号12に示される配列とそれぞれ少なくとも96%同一である重鎖及び軽鎖を含む。一実施形態において、4-1BBアゴニストは、それぞれ配列番号11及び配列番号12に示される配列とそれぞれ少
なくとも95%同一である重鎖及び軽鎖を含む。
[00573] 一実施形態において、4-1BBアゴニストは、ウトミルマブの重鎖及び軽
鎖CDR又は可変領域(VR)を含む。一実施形態において、4-1BBアゴニスト重鎖可変領域(VH)は配列番号13に示される配列を含み、4-1BBアゴニスト軽鎖可変領域(VL)は配列番号14に示される配列及びその保存的アミノ酸置換を含む。一実施形態において、4-1BBアゴニストは、それぞれ配列番号13及び配列番号14に示される配列とそれぞれ少なくとも99%同一であるVH及びVL領域を含む。一実施形態において、4-1BBアゴニストは、それぞれ配列番号13及び配列番号14に示される配列とそれぞれ少なくとも98%同一であるVH及びVL領域を含む。一実施形態において、4-1BBアゴニストは、それぞれ配列番号13及び配列番号14に示される配列とそれぞれ少なくとも97%同一であるVH及びVL領域を含む。一実施形態において、4-1BBアゴニストは、それぞれ配列番号13及び配列番号14に示される配列とそれぞれ少なくとも96%同一であるVH及びVL領域を含む。一実施形態において、4-1BBアゴニストは、それぞれ配列番号13及び配列番号14に示される配列とそれぞれ少なくとも95%同一であるVH及びVL領域を含む。一実施形態において、4-1BBアゴニストは、配列番号13及び配列番号14に示される配列とそれぞれ少なくとも99%同一であるVH及びVL領域を含むscFv抗体を含む。
鎖CDR又は可変領域(VR)を含む。一実施形態において、4-1BBアゴニスト重鎖可変領域(VH)は配列番号13に示される配列を含み、4-1BBアゴニスト軽鎖可変領域(VL)は配列番号14に示される配列及びその保存的アミノ酸置換を含む。一実施形態において、4-1BBアゴニストは、それぞれ配列番号13及び配列番号14に示される配列とそれぞれ少なくとも99%同一であるVH及びVL領域を含む。一実施形態において、4-1BBアゴニストは、それぞれ配列番号13及び配列番号14に示される配列とそれぞれ少なくとも98%同一であるVH及びVL領域を含む。一実施形態において、4-1BBアゴニストは、それぞれ配列番号13及び配列番号14に示される配列とそれぞれ少なくとも97%同一であるVH及びVL領域を含む。一実施形態において、4-1BBアゴニストは、それぞれ配列番号13及び配列番号14に示される配列とそれぞれ少なくとも96%同一であるVH及びVL領域を含む。一実施形態において、4-1BBアゴニストは、それぞれ配列番号13及び配列番号14に示される配列とそれぞれ少なくとも95%同一であるVH及びVL領域を含む。一実施形態において、4-1BBアゴニストは、配列番号13及び配列番号14に示される配列とそれぞれ少なくとも99%同一であるVH及びVL領域を含むscFv抗体を含む。
[00574] 一実施形態において、4-1BBアゴニストは、それぞれ配列番号15、配
列番号16及び配列番号17に記載の配列を有する重鎖CDR1、CDR2及びCDR3ドメイン並びにその保存的アミノ酸置換並びにそれぞれ配列番号18、配列番号19及び配列番号20に記載の配列を有する軽鎖CDR1、CDR2及びCDR3ドメイン並びにそれらの保存的アミノ酸置換を含む。
列番号16及び配列番号17に記載の配列を有する重鎖CDR1、CDR2及びCDR3ドメイン並びにその保存的アミノ酸置換並びにそれぞれ配列番号18、配列番号19及び配列番号20に記載の配列を有する軽鎖CDR1、CDR2及びCDR3ドメイン並びにそれらの保存的アミノ酸置換を含む。
[00575] 一実施形態において、4-1BBアゴニストは、ウトミルマブに関して薬物
規制当局によって承認された4-1BBアゴニストバイオシミラーモノクローナル抗体である。一実施形態において、バイオシミラーモノクローナル抗体は、参照医薬品又は参照生物学的製剤のアミノ酸配列に対して少なくとも97%の配列同一性、例えば97%、98%、99%又は100%の配列同一性を有し、参照医薬品又は参照生物学的製剤と比較して1つ以上の翻訳後改変を含む、アミノ酸配列を含む4-1BB抗体を含み、ここで、参照医薬品又は参照生物学的製剤はウトミルマブである。一部の実施形態において、1つ以上の翻訳後改変は、グリコシル化、酸化、脱アミド化及び切断の1つ以上から選択される。一部の実施形態において、バイオシミラーは、認可された又は認可のために提出された4-1BBアゴニスト抗体であり、4-1BBアゴニスト抗体は、参照医薬品又は参照生物学的製剤の製剤と異なる製剤で提供され、参照医薬品又は参照生物学的製剤はウトミルマブである。4-1BBアゴニスト抗体は、米国FDA及び/又は欧州連合のEMAなどの薬物規制当局によって認可されていることがあり得る。一部の実施形態において、バイオシミラーは、1つ以上の賦形剤を更に含む組成物として提供され、ここで、1つ以上の賦形剤は、参照医薬品又は参照生物学的製剤に含まれる賦形剤と同一又は異なっており、参照医薬品又は参照生物学的製剤はウトミルマブである。一部の実施形態において、バイオシミラーは、1つ以上の賦形剤を更に含む組成物として提供され、ここで、1つ以上の賦形剤は、参照医薬品又は参照生物学的製剤に含まれる賦形剤と同一又は異なっており、参照医薬品又は参照生物学的製剤はウトミルマブである。
規制当局によって承認された4-1BBアゴニストバイオシミラーモノクローナル抗体である。一実施形態において、バイオシミラーモノクローナル抗体は、参照医薬品又は参照生物学的製剤のアミノ酸配列に対して少なくとも97%の配列同一性、例えば97%、98%、99%又は100%の配列同一性を有し、参照医薬品又は参照生物学的製剤と比較して1つ以上の翻訳後改変を含む、アミノ酸配列を含む4-1BB抗体を含み、ここで、参照医薬品又は参照生物学的製剤はウトミルマブである。一部の実施形態において、1つ以上の翻訳後改変は、グリコシル化、酸化、脱アミド化及び切断の1つ以上から選択される。一部の実施形態において、バイオシミラーは、認可された又は認可のために提出された4-1BBアゴニスト抗体であり、4-1BBアゴニスト抗体は、参照医薬品又は参照生物学的製剤の製剤と異なる製剤で提供され、参照医薬品又は参照生物学的製剤はウトミルマブである。4-1BBアゴニスト抗体は、米国FDA及び/又は欧州連合のEMAなどの薬物規制当局によって認可されていることがあり得る。一部の実施形態において、バイオシミラーは、1つ以上の賦形剤を更に含む組成物として提供され、ここで、1つ以上の賦形剤は、参照医薬品又は参照生物学的製剤に含まれる賦形剤と同一又は異なっており、参照医薬品又は参照生物学的製剤はウトミルマブである。一部の実施形態において、バイオシミラーは、1つ以上の賦形剤を更に含む組成物として提供され、ここで、1つ以上の賦形剤は、参照医薬品又は参照生物学的製剤に含まれる賦形剤と同一又は異なっており、参照医薬品又は参照生物学的製剤はウトミルマブである。
[00576] 好ましい実施形態において、4-1BBアゴニストは、BMS-66351
3及び20H4.9.h4aとしても知られるモノクローナル抗体ウレルマブ又はその断片、誘導体、変異体若しくはバイオシミラーである。ウレルマブは、Bristol-Myers Squibb, Inc.及びCreative Biolabs, Inc.から入手できる。ウレルマブは、免疫グロブリンG4-カッパ、抗[ヒト(Homo sapiens)TNFRSF9(腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー9、4-1BB、T細胞抗原ILA、CD137)]、ヒト(Homo sapiens)(完全ヒト)モノクローナル抗体である。ウレルマブのアミノ酸配列を表5に示す。ウレルマブは、位置298(及び298’’)のN-グリコシル化部位;位置22-95(VH-VL)、148-204(CH1-CL)、262-322(CH2)及び368-426(CH3)(並びに位置22’’-95’’、148’’-204’’、262’’-322’’及び368’’-426’’)の重鎖内ジスルフィド架橋;位置23’-88’(VH-VL)及び136’-196’(CH1-CL)(並びに位置23’’’-88’’’及び136’’’-196’’’)の軽鎖内ジスルフィド架橋;位置227-227’’及び230-230’’の鎖内重鎖-重鎖ジスルフィド架橋;並びに位置135-216’及び135’’-216’’’の鎖内重鎖-軽鎖ジスルフィド架橋を含む。ウレルマブ並びにその変異体及び断片の調製及び特性は、米国特許第7,288,638号及び第8,962,804号に記載され、その開示は、参照により本明細書に組み込まれる。ウレルマブの前臨床的及び臨床的特徴は、http:/dx.doi.org/ 10.1158/1078-0432.CCR-16-1272で入手可能なSegal, et al., Clin.Cancer Res.2016に記載される。様々な血液学的及び固形腫瘍の適応症におけるウレルマブの現在の臨床試験には、米国国
立衛生研究所Clinicaltrials.gov識別子NCT01775631、NCT02110082、NCT02253992及びNCT01471210が含まれる。
3及び20H4.9.h4aとしても知られるモノクローナル抗体ウレルマブ又はその断片、誘導体、変異体若しくはバイオシミラーである。ウレルマブは、Bristol-Myers Squibb, Inc.及びCreative Biolabs, Inc.から入手できる。ウレルマブは、免疫グロブリンG4-カッパ、抗[ヒト(Homo sapiens)TNFRSF9(腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー9、4-1BB、T細胞抗原ILA、CD137)]、ヒト(Homo sapiens)(完全ヒト)モノクローナル抗体である。ウレルマブのアミノ酸配列を表5に示す。ウレルマブは、位置298(及び298’’)のN-グリコシル化部位;位置22-95(VH-VL)、148-204(CH1-CL)、262-322(CH2)及び368-426(CH3)(並びに位置22’’-95’’、148’’-204’’、262’’-322’’及び368’’-426’’)の重鎖内ジスルフィド架橋;位置23’-88’(VH-VL)及び136’-196’(CH1-CL)(並びに位置23’’’-88’’’及び136’’’-196’’’)の軽鎖内ジスルフィド架橋;位置227-227’’及び230-230’’の鎖内重鎖-重鎖ジスルフィド架橋;並びに位置135-216’及び135’’-216’’’の鎖内重鎖-軽鎖ジスルフィド架橋を含む。ウレルマブ並びにその変異体及び断片の調製及び特性は、米国特許第7,288,638号及び第8,962,804号に記載され、その開示は、参照により本明細書に組み込まれる。ウレルマブの前臨床的及び臨床的特徴は、http:/dx.doi.org/ 10.1158/1078-0432.CCR-16-1272で入手可能なSegal, et al., Clin.Cancer Res.2016に記載される。様々な血液学的及び固形腫瘍の適応症におけるウレルマブの現在の臨床試験には、米国国
立衛生研究所Clinicaltrials.gov識別子NCT01775631、NCT02110082、NCT02253992及びNCT01471210が含まれる。
[00577] 一実施形態において、4-1BBアゴニストは、配列番号21で示される重
鎖及び配列番号22で示される軽鎖を含む。一実施形態において、4-1BBアゴニストは、それぞれ配列番号21及び配列番号22に示される配列を有する重鎖及び軽鎖又は抗原結合断片、Fab断片、単鎖可変断片(scFv)、それらの変異体若しくはコンジュゲートを含む。一実施形態において、4-1BBアゴニストは、それぞれ配列番号21及び配列番号22に示される配列とそれぞれ少なくとも99%同一である重鎖及び軽鎖を含む。一実施形態において、4-1BBアゴニストは、それぞれ配列番号21及び配列番号22に示される配列とそれぞれ少なくとも98%同一である重鎖及び軽鎖を含む。一実施形態において、4-1BBアゴニストは、それぞれ配列番号21及び配列番号22に示される配列とそれぞれ少なくとも97%同一である重鎖及び軽鎖を含む。一実施形態において、4-1BBアゴニストは、それぞれ配列番号21及び配列番号22に示される配列とそれぞれ少なくとも96%同一である重鎖及び軽鎖を含む。一実施形態において、4-1BBアゴニストは、それぞれ配列番号21及び配列番号22に示される配列とそれぞれ少なくとも95%同一である重鎖及び軽鎖を含む。
鎖及び配列番号22で示される軽鎖を含む。一実施形態において、4-1BBアゴニストは、それぞれ配列番号21及び配列番号22に示される配列を有する重鎖及び軽鎖又は抗原結合断片、Fab断片、単鎖可変断片(scFv)、それらの変異体若しくはコンジュゲートを含む。一実施形態において、4-1BBアゴニストは、それぞれ配列番号21及び配列番号22に示される配列とそれぞれ少なくとも99%同一である重鎖及び軽鎖を含む。一実施形態において、4-1BBアゴニストは、それぞれ配列番号21及び配列番号22に示される配列とそれぞれ少なくとも98%同一である重鎖及び軽鎖を含む。一実施形態において、4-1BBアゴニストは、それぞれ配列番号21及び配列番号22に示される配列とそれぞれ少なくとも97%同一である重鎖及び軽鎖を含む。一実施形態において、4-1BBアゴニストは、それぞれ配列番号21及び配列番号22に示される配列とそれぞれ少なくとも96%同一である重鎖及び軽鎖を含む。一実施形態において、4-1BBアゴニストは、それぞれ配列番号21及び配列番号22に示される配列とそれぞれ少なくとも95%同一である重鎖及び軽鎖を含む。
[00578] 一実施形態において、4-1BBアゴニストは、ウレルマブの重鎖及び軽鎖
CDR又は可変領域(VR)を含む。一実施形態において、4-1BBアゴニスト重鎖可変領域(VH)は配列番号23に示される配列を含み、4-1BBアゴニスト軽鎖可変領域(VL)は配列番号24に示される配列及びその保存的アミノ酸置換を含む。一実施形態において、4-1BBアゴニストは、それぞれ配列番号23及び配列番号24に示される配列とそれぞれ少なくとも99%同一であるVH及びVL領域を含む。一実施形態において、4-1BBアゴニストは、それぞれ配列番号23及び配列番号24に示される配列とそれぞれ少なくとも98%同一であるVH及びVL領域を含む。一実施形態において、4-1BBアゴニストは、それぞれ配列番号23及び配列番号24に示される配列とそれぞれ少なくとも97%同一であるVH及びVL領域を含む。一実施形態において、4-1BBアゴニストは、それぞれ配列番号23及び配列番号24に示される配列とそれぞれ少なくとも96%同一であるVH及びVL領域を含む。一実施形態において、4-1BBアゴニストは、それぞれ配列番号23及び配列番号24に示される配列とそれぞれ少なくとも95%同一であるVH及びVL領域を含む。一実施形態において、4-1BBアゴニストは、配列番号23及び配列番号24に示される配列とそれぞれ少なくとも99%同一であるVH及びVL領域を含むscFv抗体を含む。
CDR又は可変領域(VR)を含む。一実施形態において、4-1BBアゴニスト重鎖可変領域(VH)は配列番号23に示される配列を含み、4-1BBアゴニスト軽鎖可変領域(VL)は配列番号24に示される配列及びその保存的アミノ酸置換を含む。一実施形態において、4-1BBアゴニストは、それぞれ配列番号23及び配列番号24に示される配列とそれぞれ少なくとも99%同一であるVH及びVL領域を含む。一実施形態において、4-1BBアゴニストは、それぞれ配列番号23及び配列番号24に示される配列とそれぞれ少なくとも98%同一であるVH及びVL領域を含む。一実施形態において、4-1BBアゴニストは、それぞれ配列番号23及び配列番号24に示される配列とそれぞれ少なくとも97%同一であるVH及びVL領域を含む。一実施形態において、4-1BBアゴニストは、それぞれ配列番号23及び配列番号24に示される配列とそれぞれ少なくとも96%同一であるVH及びVL領域を含む。一実施形態において、4-1BBアゴニストは、それぞれ配列番号23及び配列番号24に示される配列とそれぞれ少なくとも95%同一であるVH及びVL領域を含む。一実施形態において、4-1BBアゴニストは、配列番号23及び配列番号24に示される配列とそれぞれ少なくとも99%同一であるVH及びVL領域を含むscFv抗体を含む。
[00579] 一実施形態において、4-1BBアゴニストは、それぞれ配列番号25、配
列番号26及び配列番号27に記載の配列を有する重鎖CDR1、CDR2及びCDR3ドメイン並びにその保存的アミノ酸置換並びにそれぞれ配列番号28、配列番号29及び配列番号30に記載の配列を有する軽鎖CDR1、CDR2及びCDR3ドメイン並びにその保存的アミノ酸置換を含む。
列番号26及び配列番号27に記載の配列を有する重鎖CDR1、CDR2及びCDR3ドメイン並びにその保存的アミノ酸置換並びにそれぞれ配列番号28、配列番号29及び配列番号30に記載の配列を有する軽鎖CDR1、CDR2及びCDR3ドメイン並びにその保存的アミノ酸置換を含む。
[00580] 一実施形態において、4-1BBアゴニストは、ウレルマブに関して薬物規
制当局によって承認された4-1BBアゴニストバイオシミラーモノクローナル抗体である。一実施形態において、バイオシミラーモノクローナル抗体は、参照医薬品又は参照生物学的製剤のアミノ酸配列に対して少なくとも97%の配列同一性、例えば97%、98%、99%又は100%の配列同一性を有し、参照医薬品又は参照生物学的製剤と比較して1つ以上の翻訳後改変を含む、アミノ酸配列を含む4-1BB抗体を含み、ここで、参照医薬品又は参照生物学的製剤はウレルマブである。一部の実施形態において、1つ以上の翻訳後改変は、グリコシル化、酸化、脱アミド化及び切断の1つ以上から選択される。一部の実施形態において、バイオシミラーは、認可された又は認可のために提出された4
-1BBアゴニスト抗体であり、4-1BBアゴニスト抗体は、参照医薬品又は参照生物学的製剤の製剤と異なる製剤で提供され、参照医薬品又は参照生物学的製剤はウレルマブである。4-1BBアゴニスト抗体は、米国FDA及び/又は欧州連合のEMAなどの薬物規制当局によって認可されていることがあり得る。一部の実施形態において、バイオシミラーは、1つ以上の賦形剤を更に含む組成物として提供され、ここで、1つ以上の賦形剤は、参照医薬品又は参照生物学的製剤に含まれる賦形剤と同一又は異なっており、参照医薬品又は参照生物学的製剤はウレルマブである。一部の実施形態において、バイオシミラーは、1つ以上の賦形剤を更に含む組成物として提供され、ここで、1つ以上の賦形剤は、参照医薬品又は参照生物学的製剤に含まれる賦形剤と同一又は異なっており、参照医薬品又は参照生物学的製剤はウレルマブである。
制当局によって承認された4-1BBアゴニストバイオシミラーモノクローナル抗体である。一実施形態において、バイオシミラーモノクローナル抗体は、参照医薬品又は参照生物学的製剤のアミノ酸配列に対して少なくとも97%の配列同一性、例えば97%、98%、99%又は100%の配列同一性を有し、参照医薬品又は参照生物学的製剤と比較して1つ以上の翻訳後改変を含む、アミノ酸配列を含む4-1BB抗体を含み、ここで、参照医薬品又は参照生物学的製剤はウレルマブである。一部の実施形態において、1つ以上の翻訳後改変は、グリコシル化、酸化、脱アミド化及び切断の1つ以上から選択される。一部の実施形態において、バイオシミラーは、認可された又は認可のために提出された4
-1BBアゴニスト抗体であり、4-1BBアゴニスト抗体は、参照医薬品又は参照生物学的製剤の製剤と異なる製剤で提供され、参照医薬品又は参照生物学的製剤はウレルマブである。4-1BBアゴニスト抗体は、米国FDA及び/又は欧州連合のEMAなどの薬物規制当局によって認可されていることがあり得る。一部の実施形態において、バイオシミラーは、1つ以上の賦形剤を更に含む組成物として提供され、ここで、1つ以上の賦形剤は、参照医薬品又は参照生物学的製剤に含まれる賦形剤と同一又は異なっており、参照医薬品又は参照生物学的製剤はウレルマブである。一部の実施形態において、バイオシミラーは、1つ以上の賦形剤を更に含む組成物として提供され、ここで、1つ以上の賦形剤は、参照医薬品又は参照生物学的製剤に含まれる賦形剤と同一又は異なっており、参照医薬品又は参照生物学的製剤はウレルマブである。
[00581] 一実施形態において、4-1BBアゴニストは、1D8、3Elor、4B
4(BioLegend 309809)、H4-1BB-M127(BD Pharmingen 552532)、BBK2(Thermo Fisher MS621PABX)、145501(Leinco Technologies B591)、ATCC
番号HB-11248として寄託され、米国特許第6,974,863号に開示されている細胞株によって産生される抗体、5F4(BioLegend 31 1503)、C65-485(BD Pharmingen 559446)、米国特許出願公開第2005/0095244号に開示されてい
る抗体、米国特許第7,288,638号に開示されている抗体(20H4.9-IgGl(BMS-663031)など)、同第6,887,673号に開示されている抗体(4E9又はBMS-554271など)、同第7,214,493号に開示されている抗
体、同第6,303,121号に開示されている抗体、同第6,569,997号に開示されている抗体、同第6,905,685号に開示されている抗体(4E9又はBMS-554271など)、同第6,362,325号に開示されている抗体(1D8又はBMS-469492;3H3又はBMS-469497;又は3Elなど)、同第6,974,863号に開示されている抗体(53A2など);同第6,210,669号に開示されている抗体(1D8、3B8又は3E1など)、同第5,928,893号に記載されている抗体、同第6,303,121号に開示されている抗体、同第6,569,997号に開示されている抗体、国際公開第2012/177788号、同第2015/119923号及び同第2010/042433号に開示されている抗体並びにそれらの断片、誘導体、コンジュゲート、変異体又はバイオシミラー、からなる群から選択され、ここで、前述の特許又は特許出願公開のそれぞれの開示は、参照により本明細書に組み込まれる。
4(BioLegend 309809)、H4-1BB-M127(BD Pharmingen 552532)、BBK2(Thermo Fisher MS621PABX)、145501(Leinco Technologies B591)、ATCC
番号HB-11248として寄託され、米国特許第6,974,863号に開示されている細胞株によって産生される抗体、5F4(BioLegend 31 1503)、C65-485(BD Pharmingen 559446)、米国特許出願公開第2005/0095244号に開示されてい
る抗体、米国特許第7,288,638号に開示されている抗体(20H4.9-IgGl(BMS-663031)など)、同第6,887,673号に開示されている抗体(4E9又はBMS-554271など)、同第7,214,493号に開示されている抗
体、同第6,303,121号に開示されている抗体、同第6,569,997号に開示されている抗体、同第6,905,685号に開示されている抗体(4E9又はBMS-554271など)、同第6,362,325号に開示されている抗体(1D8又はBMS-469492;3H3又はBMS-469497;又は3Elなど)、同第6,974,863号に開示されている抗体(53A2など);同第6,210,669号に開示されている抗体(1D8、3B8又は3E1など)、同第5,928,893号に記載されている抗体、同第6,303,121号に開示されている抗体、同第6,569,997号に開示されている抗体、国際公開第2012/177788号、同第2015/119923号及び同第2010/042433号に開示されている抗体並びにそれらの断片、誘導体、コンジュゲート、変異体又はバイオシミラー、からなる群から選択され、ここで、前述の特許又は特許出願公開のそれぞれの開示は、参照により本明細書に組み込まれる。
[00582] 一実施形態において、4-1BBアゴニストは、国際公開第2008/02
5516 A1号、同第2009/007120 A1号、同第2010/003766
A1号、同第2010/010051 A1号及び同第2010/078966 A1号;米国特許出願公開第2011/0027218 A1号、同第2015/0126709 A1号、同第2011/0111494 A1号、同第2015/0110734
A1号及び同第2015/0126710 A1号;並びに米国特許第9,359,420号、同第9,340,599号、同第8,921,519号及び同第8,450,460号に記載されている4-1BBアゴニスト性融合タンパク質であり、その開示は、参照により本明細書に組み込まれる。
5516 A1号、同第2009/007120 A1号、同第2010/003766
A1号、同第2010/010051 A1号及び同第2010/078966 A1号;米国特許出願公開第2011/0027218 A1号、同第2015/0126709 A1号、同第2011/0111494 A1号、同第2015/0110734
A1号及び同第2015/0126710 A1号;並びに米国特許第9,359,420号、同第9,340,599号、同第8,921,519号及び同第8,450,460号に記載されている4-1BBアゴニスト性融合タンパク質であり、その開示は、参照により本明細書に組み込まれる。
[00583] 一実施形態において、4-1BBアゴニストは、構造I-A(C末端Fc抗
体断片融合タンパク質)又は構造I-B(N末端Fc抗体断片融合タンパク質)に示される4-1BBアゴニスト性融合タンパク質又はその断片、誘導体、コンジュゲート、変異体若しくはバイオシミラーである。
構造I-A及びI-Bにおいて、円柱は個々のポリペプチド結合ドメインを指す。構造I
-A及びI-Bは、例えば、4-1BBL又は4-1BBに結合する抗体、に由来する、3つの直鎖状に連結されたTNFRSF結合ドメインを含み、これは折り畳まれて三価タンパク質を形成し、次いで、IgG1-Fc(CH3及びCH2ドメインを含む)を介して第2の三価(triavelent)タンパク質に連結され、次いで、これはジスルフィド結合(小さい細長い楕円形)を介して2つの三価タンパク質を連結するために使用され、構造を安定化し、6つの受容体の細胞内シグナル伝達ドメイン及びシグナル伝達タンパク質をあわせてシグナル伝達複合体を形成できるアゴニストを提供する。円柱として示されるTNFRSF結合ドメインは、例えば、親水性残基並びに柔軟性のためのGly及びSer配列並びに溶解性のためのGlu及びLysを含み得るリンカーにより接続されたVH及びVL鎖を含む、scFvドメインであり得る。de Marco, Microbial Cell Factories, 2011, 10, 44;Ahmad, et al., Clin. & Dev.Immunol.2012, 980250;Monnier, et al., Antibodies, 2013, 2, 193-208;又は本明細書の別の箇所に組み込まれた参考文献に記載されているものなどの任意のscFvドメイン設計が使用され得る。この形態の融合タンパク質構造は、米国特許第9,359,420号、同第9,340,599号、同第8,921,519号及び同第8,450,460号に記載されており、その開示は、参照により本明細書に組み込まれる。
体断片融合タンパク質)又は構造I-B(N末端Fc抗体断片融合タンパク質)に示される4-1BBアゴニスト性融合タンパク質又はその断片、誘導体、コンジュゲート、変異体若しくはバイオシミラーである。
-A及びI-Bは、例えば、4-1BBL又は4-1BBに結合する抗体、に由来する、3つの直鎖状に連結されたTNFRSF結合ドメインを含み、これは折り畳まれて三価タンパク質を形成し、次いで、IgG1-Fc(CH3及びCH2ドメインを含む)を介して第2の三価(triavelent)タンパク質に連結され、次いで、これはジスルフィド結合(小さい細長い楕円形)を介して2つの三価タンパク質を連結するために使用され、構造を安定化し、6つの受容体の細胞内シグナル伝達ドメイン及びシグナル伝達タンパク質をあわせてシグナル伝達複合体を形成できるアゴニストを提供する。円柱として示されるTNFRSF結合ドメインは、例えば、親水性残基並びに柔軟性のためのGly及びSer配列並びに溶解性のためのGlu及びLysを含み得るリンカーにより接続されたVH及びVL鎖を含む、scFvドメインであり得る。de Marco, Microbial Cell Factories, 2011, 10, 44;Ahmad, et al., Clin. & Dev.Immunol.2012, 980250;Monnier, et al., Antibodies, 2013, 2, 193-208;又は本明細書の別の箇所に組み込まれた参考文献に記載されているものなどの任意のscFvドメイン設計が使用され得る。この形態の融合タンパク質構造は、米国特許第9,359,420号、同第9,340,599号、同第8,921,519号及び同第8,450,460号に記載されており、その開示は、参照により本明細書に組み込まれる。
[00584] 構造I-Aの他のポリペプチドドメインのアミノ酸配列を表6に示す。Fc
ドメインは、好ましくは、完全定常ドメイン(配列番号31のアミノ酸17~230)、完全ヒンジドメイン(配列番号31のアミノ酸1~16)又はヒンジドメインの一部(例えば、配列番号31のアミノ酸4~16)を含む。C末端Fc抗体を接続するための好ましいリンカーは、追加的ポリペプチドの融合に適したリンカーを含む、配列番号32~配列番号41に示される実施形態から選択され得る。
ドメインは、好ましくは、完全定常ドメイン(配列番号31のアミノ酸17~230)、完全ヒンジドメイン(配列番号31のアミノ酸1~16)又はヒンジドメインの一部(例えば、配列番号31のアミノ酸4~16)を含む。C末端Fc抗体を接続するための好ましいリンカーは、追加的ポリペプチドの融合に適したリンカーを含む、配列番号32~配列番号41に示される実施形態から選択され得る。
[00585] 構造I-Bの他のポリペプチドドメインのアミノ酸配列を表7に示す。構造
I-BのようにFc抗体断片がTNRFSF融合タンパク質のN末端に融合される場合、Fcモジュールの配列は好ましくは配列番号42に示されるものであり、リンカー配列は
好ましくは配列番号43~配列番号45に示される実施形態から選択される。
I-BのようにFc抗体断片がTNRFSF融合タンパク質のN末端に融合される場合、Fcモジュールの配列は好ましくは配列番号42に示されるものであり、リンカー配列は
好ましくは配列番号43~配列番号45に示される実施形態から選択される。
[00586] 一実施形態において、構造I-A又はI-Bによる4-1BBアゴニスト融
合タンパク質は、ウトミルマブの可変重鎖及び可変軽鎖、ウレルマブの可変重鎖及び可変軽鎖、ウトミルマブの可変重鎖及び可変軽鎖、表8に記載されている可変重鎖及び可変軽鎖から選択される可変重鎖及び可変軽鎖、上記の可変重鎖及び可変軽鎖の任意の組み合わせ並びにそれらの断片、誘導体、コンジュゲート、変異体及びバイオシミラーからなる群から選択される1つ以上の4-1BB結合ドメインを含む。
合タンパク質は、ウトミルマブの可変重鎖及び可変軽鎖、ウレルマブの可変重鎖及び可変軽鎖、ウトミルマブの可変重鎖及び可変軽鎖、表8に記載されている可変重鎖及び可変軽鎖から選択される可変重鎖及び可変軽鎖、上記の可変重鎖及び可変軽鎖の任意の組み合わせ並びにそれらの断片、誘導体、コンジュゲート、変異体及びバイオシミラーからなる群から選択される1つ以上の4-1BB結合ドメインを含む。
[00587] 一実施形態において、構造I-A又はI-Bによる4-1BBアゴニスト融
合タンパク質は、4-1BBL配列を含む1つ以上の4-1BB結合ドメインを含む。一実施形態において、構造I-A又はI-Bによる4-1BBアゴニスト融合タンパク質は、配列番号46による配列を含む1つ以上の4-1BB結合ドメインを含む。一実施形態において、構造I-A又はI-Bによる4-1BBアゴニスト融合タンパク質は、可溶性4-1BBL配列を含む1つ以上の4-1BB結合ドメインを含む。一実施形態において、構造I-A又はI-Bによる4-1BBアゴニスト融合タンパク質は、配列番号47による配列を含む1つ以上の4-1BB結合ドメインを含む。
合タンパク質は、4-1BBL配列を含む1つ以上の4-1BB結合ドメインを含む。一実施形態において、構造I-A又はI-Bによる4-1BBアゴニスト融合タンパク質は、配列番号46による配列を含む1つ以上の4-1BB結合ドメインを含む。一実施形態において、構造I-A又はI-Bによる4-1BBアゴニスト融合タンパク質は、可溶性4-1BBL配列を含む1つ以上の4-1BB結合ドメインを含む。一実施形態において、構造I-A又はI-Bによる4-1BBアゴニスト融合タンパク質は、配列番号47による配列を含む1つ以上の4-1BB結合ドメインを含む。
[00588] 一実施形態において、構造I-A又はI-Bによる4-1BBアゴニスト融
合タンパク質は、それぞれ配列番号13及び配列番号14に示される配列とそれぞれ少なくとも95%同一であるVH及びVL領域を含むscFvドメインである1つ以上の4-1BB結合ドメインを含み、ここで、VH及びVLドメインはリンカーによって接続されている。一実施形態において、構造I-A又はI-Bによる4-1BBアゴニスト融合タンパク質は、それぞれ配列番号23及び配列番号24に示される配列とそれぞれ少なくとも95%同一であるVH及びVL領域を含むscFvドメインである1つ以上の4-1BB結合ドメインを含み、ここで、VH及びVLドメインはリンカーによって接続されている。一実施形態において、構造I-A又はI-Bによる4-1BBアゴニスト融合タンパク質は、表8に示されるVH及びVL配列とそれぞれ少なくとも95%同一であるVH及びVL領域を含むscFvドメインである1つ以上の4-1BB結合ドメインを含み、ここで、VH及びVLドメインはリンカーによって接続されている。
合タンパク質は、それぞれ配列番号13及び配列番号14に示される配列とそれぞれ少なくとも95%同一であるVH及びVL領域を含むscFvドメインである1つ以上の4-1BB結合ドメインを含み、ここで、VH及びVLドメインはリンカーによって接続されている。一実施形態において、構造I-A又はI-Bによる4-1BBアゴニスト融合タンパク質は、それぞれ配列番号23及び配列番号24に示される配列とそれぞれ少なくとも95%同一であるVH及びVL領域を含むscFvドメインである1つ以上の4-1BB結合ドメインを含み、ここで、VH及びVLドメインはリンカーによって接続されている。一実施形態において、構造I-A又はI-Bによる4-1BBアゴニスト融合タンパク質は、表8に示されるVH及びVL配列とそれぞれ少なくとも95%同一であるVH及びVL領域を含むscFvドメインである1つ以上の4-1BB結合ドメインを含み、ここで、VH及びVLドメインはリンカーによって接続されている。
[00589] 一実施形態において、4-1BBアゴニストは、(i)第1の可溶性4-1
BB結合ドメイン、(ii)第1のペプチドリンカー、(iii)第2の可溶性4-1BB結合ドメイン、(iv)第2のペプチドリンカー、及び(v)第3の可溶性4-1BB結合ドメインを含む4-1BBアゴニスト性単鎖融合ポリペプチドであり、N末端及び/又はC末端に追加のドメインを更に含み、ここで、追加のドメインは、Fab又はFc断片ドメインである。一実施形態において、4-1BBアゴニストは、(i)第1の可溶性4-1BB結合ドメイン、(ii)第1のペプチドリンカー、(iii)第2の可溶性4-1BB結合ドメイン、(iv)第2のペプチドリンカー、及び(v)第3の可溶性4-1BB結合ドメインを含む4-1BBアゴニスト性単鎖融合ポリペプチドであり、N末端及び/又はC末端に追加のドメインを更に含み、ここで、追加のドメインは、Fab又はFc断片ドメインであり、可溶性4-1BBドメインのそれぞれは、ストーク領域(三量体化に寄与し、細胞膜まで一定の距離を提供するが、4-1BB結合ドメインの一部ではない)を欠き、第1及び第2のペプチドリンカーは、独立して3~8アミノ酸長を有する。
BB結合ドメイン、(ii)第1のペプチドリンカー、(iii)第2の可溶性4-1BB結合ドメイン、(iv)第2のペプチドリンカー、及び(v)第3の可溶性4-1BB結合ドメインを含む4-1BBアゴニスト性単鎖融合ポリペプチドであり、N末端及び/又はC末端に追加のドメインを更に含み、ここで、追加のドメインは、Fab又はFc断片ドメインである。一実施形態において、4-1BBアゴニストは、(i)第1の可溶性4-1BB結合ドメイン、(ii)第1のペプチドリンカー、(iii)第2の可溶性4-1BB結合ドメイン、(iv)第2のペプチドリンカー、及び(v)第3の可溶性4-1BB結合ドメインを含む4-1BBアゴニスト性単鎖融合ポリペプチドであり、N末端及び/又はC末端に追加のドメインを更に含み、ここで、追加のドメインは、Fab又はFc断片ドメインであり、可溶性4-1BBドメインのそれぞれは、ストーク領域(三量体化に寄与し、細胞膜まで一定の距離を提供するが、4-1BB結合ドメインの一部ではない)を欠き、第1及び第2のペプチドリンカーは、独立して3~8アミノ酸長を有する。
[00590] 一実施形態において、4-1BBアゴニストは、(i)第1の可溶性腫瘍壊
死因子(TNF)スーパーファミリーサイトカインドメイン、(ii)第1のペプチドリンカー、(iii)第2の可溶性TNFスーパーファミリーサイトカインドメイン、(iv)第2のペプチドリンカー、及び(v)第3の可溶性TNFスーパーファミリーサイトカインドメインを含む4-1BBアゴニスト性単鎖融合ポリペプチドであり、ここで、可溶性TNFスーパーファミリーサイトカインドメインのそれぞれは、ストーク領域を欠き、第1及び第2のペプチドリンカーは、独立して3~8アミノ酸長を有し、各TNFスーパーファミリーサイトカインドメインは4-1BB結合ドメインである。
死因子(TNF)スーパーファミリーサイトカインドメイン、(ii)第1のペプチドリンカー、(iii)第2の可溶性TNFスーパーファミリーサイトカインドメイン、(iv)第2のペプチドリンカー、及び(v)第3の可溶性TNFスーパーファミリーサイトカインドメインを含む4-1BBアゴニスト性単鎖融合ポリペプチドであり、ここで、可溶性TNFスーパーファミリーサイトカインドメインのそれぞれは、ストーク領域を欠き、第1及び第2のペプチドリンカーは、独立して3~8アミノ酸長を有し、各TNFスーパーファミリーサイトカインドメインは4-1BB結合ドメインである。
[00591] 一実施形態において、4-1BBアゴニストは、前述のVLドメインのいず
れかに連結された前述のVHドメインのいずれかを含む4-1BBアゴニスト性scFv抗体である。
れかに連結された前述のVHドメインのいずれかを含む4-1BBアゴニスト性scFv抗体である。
[00592] 一実施形態において、4-1BBアゴニストは、BPS Bioscience4-1BB
アゴニスト抗体カタログ番号79097-2であり、これはBPS Bioscience, San Diego,
CA, USAから市販されている。一実施形態において、4-1BBアゴニストは、Creative
Biolabs4-1BBアゴニスト抗体カタログ番号MOM-18179であり、これはCreative Biolabs, Shirley, NY, USAから市販されている。
アゴニスト抗体カタログ番号79097-2であり、これはBPS Bioscience, San Diego,
CA, USAから市販されている。一実施形態において、4-1BBアゴニストは、Creative
Biolabs4-1BBアゴニスト抗体カタログ番号MOM-18179であり、これはCreative Biolabs, Shirley, NY, USAから市販されている。
3.OX40(CD134)アゴニスト
[00593] 一実施形態において、TNFRSFアゴニストは、OX40(CD134)
アゴニストである。OX40アゴニストは、当技術分野で公知の任意のOX40結合分子であり得る。OX40結合分子は、ヒト又は哺乳類OX40に結合できるモノクローナル抗体又は融合タンパク質であり得る。OX40アゴニスト又はOX40結合分子は、免疫グロブリン分子の任意のアイソタイプ(例えば、IgG、IgE、IgM、IgD、IgA及びIgY)、クラス(例えば、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1及びIgA2)又はサブクラスの免疫グロブリン重鎖を含み得る。OX40アゴニスト又はOX40結合分子は、重鎖及び軽鎖の両方を有し得る。本明細書で使用される場合、結合分子という用語は、抗体(全長抗体を含む)、モノクローナル抗体(全長モノクローナル抗体を含む)、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体(例えば、二重特異性抗体)、ヒト、ヒト化又はキメラ抗体並びに抗体断片、例えばFab断片、F(ab’)断片、Fab発現ライブラリーにより産生される断片、上記のいずれかのエピトープ結合断片及びOX40に結合する抗体の操作された形態、例えばscFv分子も含む。一実施形態において、OX40アゴニストは、完全ヒト抗体である抗原結合タンパク質である。一実施形態において、OX40アゴニストは、ヒト化抗体である抗原結合タンパク質である。一部の実施形態において、本開示の方法及び組成物における使用のためのOX40アゴニストは、抗OX40抗体、ヒト抗OX40抗体、マウス抗OX40抗体、哺乳動物抗OX40抗体、モノクローナル抗OX40抗体、ポリクローナル抗OX40抗体、キメラ抗OX40抗体、抗OX40アドネクチン、抗OX40ドメイン抗体、単鎖抗OX40断片、重鎖抗OX40断片、軽鎖抗OX40断片、抗OX40融合タンパク質及びそれらの断片、誘導体、コンジュゲート、変異体若しくはバイオシミラーを含む。好ましい実施形態において、OX40アゴニストは、アゴニスト性、抗OX40ヒト化又は完全ヒトモノクローナル抗体(即ち単一細胞株に由来する抗体)である。
[00593] 一実施形態において、TNFRSFアゴニストは、OX40(CD134)
アゴニストである。OX40アゴニストは、当技術分野で公知の任意のOX40結合分子であり得る。OX40結合分子は、ヒト又は哺乳類OX40に結合できるモノクローナル抗体又は融合タンパク質であり得る。OX40アゴニスト又はOX40結合分子は、免疫グロブリン分子の任意のアイソタイプ(例えば、IgG、IgE、IgM、IgD、IgA及びIgY)、クラス(例えば、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1及びIgA2)又はサブクラスの免疫グロブリン重鎖を含み得る。OX40アゴニスト又はOX40結合分子は、重鎖及び軽鎖の両方を有し得る。本明細書で使用される場合、結合分子という用語は、抗体(全長抗体を含む)、モノクローナル抗体(全長モノクローナル抗体を含む)、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体(例えば、二重特異性抗体)、ヒト、ヒト化又はキメラ抗体並びに抗体断片、例えばFab断片、F(ab’)断片、Fab発現ライブラリーにより産生される断片、上記のいずれかのエピトープ結合断片及びOX40に結合する抗体の操作された形態、例えばscFv分子も含む。一実施形態において、OX40アゴニストは、完全ヒト抗体である抗原結合タンパク質である。一実施形態において、OX40アゴニストは、ヒト化抗体である抗原結合タンパク質である。一部の実施形態において、本開示の方法及び組成物における使用のためのOX40アゴニストは、抗OX40抗体、ヒト抗OX40抗体、マウス抗OX40抗体、哺乳動物抗OX40抗体、モノクローナル抗OX40抗体、ポリクローナル抗OX40抗体、キメラ抗OX40抗体、抗OX40アドネクチン、抗OX40ドメイン抗体、単鎖抗OX40断片、重鎖抗OX40断片、軽鎖抗OX40断片、抗OX40融合タンパク質及びそれらの断片、誘導体、コンジュゲート、変異体若しくはバイオシミラーを含む。好ましい実施形態において、OX40アゴニストは、アゴニスト性、抗OX40ヒト化又は完全ヒトモノクローナル抗体(即ち単一細胞株に由来する抗体)である。
[00594] 好ましい実施形態において、OX40アゴニスト又はOX40結合分子は、
融合タンパク質でもあり得る。OX40Lに融合したFcドメインを含むOX40融合タンパク質は、例えば、Sadun, et al., J. Immunother.2009, 182, 1481-89に記載されて
いる。好ましい実施形態において、三量体又は六量体OX40アゴニスト(3つ又は6つのリガンド結合ドメインを有する)などの多量体OX40アゴニストは、典型的には2つのリガンド結合ドメインを保有するアゴニスト性モノクローナル抗体と比較して、優れた受容体(OX40L)のクラスター化及び内部細胞シグナル伝達複合体形成を誘導し得る。3つのTNFRSF結合ドメイン及びIgG1-Fcを含み、任意選択によりこれらの融合タンパク質の2つ以上を更に連結する、三量体(三価)又は六量体(又は六価)又はそれより大きい融合タンパク質は、例えば、Gieffers, et al., Mol.Cancer Therapeutics 2013, 12, 2735-47に記載される。
融合タンパク質でもあり得る。OX40Lに融合したFcドメインを含むOX40融合タンパク質は、例えば、Sadun, et al., J. Immunother.2009, 182, 1481-89に記載されて
いる。好ましい実施形態において、三量体又は六量体OX40アゴニスト(3つ又は6つのリガンド結合ドメインを有する)などの多量体OX40アゴニストは、典型的には2つのリガンド結合ドメインを保有するアゴニスト性モノクローナル抗体と比較して、優れた受容体(OX40L)のクラスター化及び内部細胞シグナル伝達複合体形成を誘導し得る。3つのTNFRSF結合ドメイン及びIgG1-Fcを含み、任意選択によりこれらの融合タンパク質の2つ以上を更に連結する、三量体(三価)又は六量体(又は六価)又はそれより大きい融合タンパク質は、例えば、Gieffers, et al., Mol.Cancer Therapeutics 2013, 12, 2735-47に記載される。
[00595] アゴニスト性OX40抗体及び融合タンパク質は、強い免疫応答を誘発する
ことが知られている。Curti, et al., Cancer Res.2013, 73, 7189-98。好ましい実施形
態において、OX40アゴニストは、毒性を低減するのに十分な方法でOX40抗原に特異的に結合するモノクローナル抗体又は融合タンパク質である。一部の実施形態において、OX40アゴニストは、抗体依存性細胞傷害性(ADCC)、例えばNK細胞の細胞傷害性を抑制する、アゴニスト性OX40モノクローナル抗体又は融合タンパク質である。一部の実施形態において、OX40アゴニストは、抗体依存性細胞食作用(ADCP)を抑制する、アゴニスト性OX40モノクローナル抗体又は融合タンパク質である。一部の実施形態において、OX40アゴニストは、補体依存性細胞毒性(CDC)を抑制する、アゴニスト性OX40モノクローナル抗体又は融合タンパク質である。一部の実施形態において、OX40アゴニストは、Fc領域機能性を抑制する、アゴニスト性OX40モノクローナル抗体又は融合タンパク質である。
ことが知られている。Curti, et al., Cancer Res.2013, 73, 7189-98。好ましい実施形
態において、OX40アゴニストは、毒性を低減するのに十分な方法でOX40抗原に特異的に結合するモノクローナル抗体又は融合タンパク質である。一部の実施形態において、OX40アゴニストは、抗体依存性細胞傷害性(ADCC)、例えばNK細胞の細胞傷害性を抑制する、アゴニスト性OX40モノクローナル抗体又は融合タンパク質である。一部の実施形態において、OX40アゴニストは、抗体依存性細胞食作用(ADCP)を抑制する、アゴニスト性OX40モノクローナル抗体又は融合タンパク質である。一部の実施形態において、OX40アゴニストは、補体依存性細胞毒性(CDC)を抑制する、アゴニスト性OX40モノクローナル抗体又は融合タンパク質である。一部の実施形態において、OX40アゴニストは、Fc領域機能性を抑制する、アゴニスト性OX40モノクローナル抗体又は融合タンパク質である。
[00596] 一部の実施形態において、OX40アゴニストは、高い親和性及びアゴニス
ト活性でヒトOX40(配列番号54)に結合することを特徴とする。一実施形態において、OX40アゴニストは、ヒトOX40(配列番号54)に結合する結合分子である。一実施形態において、OX40アゴニストは、マウスOX40(配列番号55)に結合する結合分子である。OX40アゴニスト又は結合分子が結合するOX40抗原のアミノ酸配列を表9に概括する。
ト活性でヒトOX40(配列番号54)に結合することを特徴とする。一実施形態において、OX40アゴニストは、ヒトOX40(配列番号54)に結合する結合分子である。一実施形態において、OX40アゴニストは、マウスOX40(配列番号55)に結合する結合分子である。OX40アゴニスト又は結合分子が結合するOX40抗原のアミノ酸配列を表9に概括する。
[00597] 一部の実施形態において、記載される組成物、プロセス及び方法は、約10
0pM以下のKDでヒト又はマウスOX40に結合するか、約90pM以下のKDでヒト又はマウスOX40に結合するか、約80pM以下のKDでヒト又はマウスOX40に結合するか、約70pM以下のKDでヒト又はマウスOX40に結合するか、約60pM以下のKDでヒト又はマウスOX40に結合するか、約50pM以下のKDでヒト又はマウスOX40に結合するか、約40pM以下のKDでヒト又はマウスOX40に結合するか、又は約30pM以下のKDでヒト又はマウスOX40に結合する、OX40アゴニストを含む。
0pM以下のKDでヒト又はマウスOX40に結合するか、約90pM以下のKDでヒト又はマウスOX40に結合するか、約80pM以下のKDでヒト又はマウスOX40に結合するか、約70pM以下のKDでヒト又はマウスOX40に結合するか、約60pM以下のKDでヒト又はマウスOX40に結合するか、約50pM以下のKDでヒト又はマウスOX40に結合するか、約40pM以下のKDでヒト又はマウスOX40に結合するか、又は約30pM以下のKDでヒト又はマウスOX40に結合する、OX40アゴニストを含む。
[00598] 一部の実施形態において、記載される組成物、プロセス及び方法は、約7.
5×105 1/M・s以上のkassocでヒト又はマウスOX40に結合するか、約7.5×105 1/M・s以上のkassocでヒト又はマウスOX40に結合するか、約8×105 1/M・s以上のkassocでヒト又はマウスOX40に結合するか、約8.5×105 1/M・s以上のkassocでヒト又はマウスOX40に結合するか、約9×105 1/M・s以上のkassocでヒト又はマウスOX40に結合するか、約9.5×105 1/M・s以上のkassocでヒト又はマウスOX40に結合するか、又は約1×106 1/M・s以上のkassocでヒト又はマウスOX40に結合する、OX40アゴニストを含む。
5×105 1/M・s以上のkassocでヒト又はマウスOX40に結合するか、約7.5×105 1/M・s以上のkassocでヒト又はマウスOX40に結合するか、約8×105 1/M・s以上のkassocでヒト又はマウスOX40に結合するか、約8.5×105 1/M・s以上のkassocでヒト又はマウスOX40に結合するか、約9×105 1/M・s以上のkassocでヒト又はマウスOX40に結合するか、約9.5×105 1/M・s以上のkassocでヒト又はマウスOX40に結合するか、又は約1×106 1/M・s以上のkassocでヒト又はマウスOX40に結合する、OX40アゴニストを含む。
[00599] 一部の実施形態において、記載される組成物、プロセス及び方法は、約2×
10-5 1/s以下のkdissocでヒト又はマウスOX40に結合するか、約2.1×10-5 1/s以下のkdissocでヒト又はマウスOX40に結合するか、約2.2×10-5 1/s以下のkdissocでヒト又はマウスOX40に結合するか、約2.3×10-5 1/s以下のkdissocでヒト又はマウスOX40に結合するか、約2.4×10-5 1/s以下のkdissocでヒト又はマウスOX40に結合するか、約2.5×10-5 1/s以下のkdissocでヒト又はマウスOX40に結合するか、約2.6×10-5 1/s以下のkdissocでヒト又はマウスOX40に結合するか、又は約2.7×10-5 1/s以下のkdissocでヒト又はマウスOX40に結合するか、約2.8×10-5 1/s以下のkdissocでヒト又はマウスOX40に結合するか、約2.9×10-5 1/s以下のkdissocでヒト又はマウスOX40に結合するか、又は約3×10-5 1/s以下のkdissocでヒト又はマウスOX40に結合する、OX40アゴニストを含む。
10-5 1/s以下のkdissocでヒト又はマウスOX40に結合するか、約2.1×10-5 1/s以下のkdissocでヒト又はマウスOX40に結合するか、約2.2×10-5 1/s以下のkdissocでヒト又はマウスOX40に結合するか、約2.3×10-5 1/s以下のkdissocでヒト又はマウスOX40に結合するか、約2.4×10-5 1/s以下のkdissocでヒト又はマウスOX40に結合するか、約2.5×10-5 1/s以下のkdissocでヒト又はマウスOX40に結合するか、約2.6×10-5 1/s以下のkdissocでヒト又はマウスOX40に結合するか、又は約2.7×10-5 1/s以下のkdissocでヒト又はマウスOX40に結合するか、約2.8×10-5 1/s以下のkdissocでヒト又はマウスOX40に結合するか、約2.9×10-5 1/s以下のkdissocでヒト又はマウスOX40に結合するか、又は約3×10-5 1/s以下のkdissocでヒト又はマウスOX40に結合する、OX40アゴニストを含む。
[00600] 一部の実施形態において、記載される組成物、プロセス及び方法は、約10
nM以下のIC50でヒト又はマウスOX40に結合するか、約9nM以下のIC50でヒト又はマウスOX40に結合するか、約8nM以下のIC50でヒト又はマウスOX40に結合するか、約7nM以下のIC50でヒト又はマウスOX40に結合するか、約6nM以下のIC50でヒト又はマウスOX40に結合するか、約5nM以下のIC50でヒト又はマウスOX40に結合するか、約4nM以下のIC50でヒト又はマウスOX40に結合するか、約3nM以下のIC50でヒト又はマウスOX40に結合するか、約2nM以下のIC50でヒト又はマウスOX40に結合するか、又は約1nM以下のIC50でヒト又はマウスOX40に結合する、OX40アゴニストを含む。
nM以下のIC50でヒト又はマウスOX40に結合するか、約9nM以下のIC50でヒト又はマウスOX40に結合するか、約8nM以下のIC50でヒト又はマウスOX40に結合するか、約7nM以下のIC50でヒト又はマウスOX40に結合するか、約6nM以下のIC50でヒト又はマウスOX40に結合するか、約5nM以下のIC50でヒト又はマウスOX40に結合するか、約4nM以下のIC50でヒト又はマウスOX40に結合するか、約3nM以下のIC50でヒト又はマウスOX40に結合するか、約2nM以下のIC50でヒト又はマウスOX40に結合するか、又は約1nM以下のIC50でヒト又はマウスOX40に結合する、OX40アゴニストを含む。
[00601] 一部の実施形態において、OX40アゴニストは、MEDI0562又はM
EDI-0562としても知られるタボリキシズマブである。タボリキシズマブは、AstraZeneca, Incの子会社MedImmuneから入手できる。タボリキシズマブは、免疫グロブリン
G1-カッパ、抗[ヒト(Homo sapiens)TNFRSF4(腫瘍壊死因子受容体(TNFR)スーパーファミリーメンバー4、OX40、CD134)]、ヒト化及びキメラモノクローナル抗体である。タボリキシズマブのアミノ酸配列を表10に示す。タボリキシズマブは、フコシル化複合二分岐CHO型グリカンを伴い位置301及び301’’のN-グリコシル化部位;位置22-95(VH-VL)、148-204(CH1-CL)、265-325(CH2)及び371-429(CH3)(並びに位置22’’-95’’、148’’-204’’、265’’-325’’及び371’’-429’’)の重鎖内ジスルフィド架橋;位置23’-88’(VH-VL)及び134’-194’(CH1-CL)(並びに位置23’’’-88’’’及び134’’’-194’’’)の軽鎖内ジスルフィド架橋;位置230-230’’及び233-233’’の鎖内重鎖-重鎖ジスルフィド架橋;並びに位置224-214’及び224’’-214’’’の鎖内重鎖-軽鎖ジスルフィド架橋を含む。様々な固形腫瘍の適応症におけるタボリキシズマブの現在の臨床試験には、米国国立衛生研究所Clinicaltrials.gov識別子NCT02318394及びNCT02705482が含まれる。
EDI-0562としても知られるタボリキシズマブである。タボリキシズマブは、AstraZeneca, Incの子会社MedImmuneから入手できる。タボリキシズマブは、免疫グロブリン
G1-カッパ、抗[ヒト(Homo sapiens)TNFRSF4(腫瘍壊死因子受容体(TNFR)スーパーファミリーメンバー4、OX40、CD134)]、ヒト化及びキメラモノクローナル抗体である。タボリキシズマブのアミノ酸配列を表10に示す。タボリキシズマブは、フコシル化複合二分岐CHO型グリカンを伴い位置301及び301’’のN-グリコシル化部位;位置22-95(VH-VL)、148-204(CH1-CL)、265-325(CH2)及び371-429(CH3)(並びに位置22’’-95’’、148’’-204’’、265’’-325’’及び371’’-429’’)の重鎖内ジスルフィド架橋;位置23’-88’(VH-VL)及び134’-194’(CH1-CL)(並びに位置23’’’-88’’’及び134’’’-194’’’)の軽鎖内ジスルフィド架橋;位置230-230’’及び233-233’’の鎖内重鎖-重鎖ジスルフィド架橋;並びに位置224-214’及び224’’-214’’’の鎖内重鎖-軽鎖ジスルフィド架橋を含む。様々な固形腫瘍の適応症におけるタボリキシズマブの現在の臨床試験には、米国国立衛生研究所Clinicaltrials.gov識別子NCT02318394及びNCT02705482が含まれる。
[00602] 一実施形態において、OX40アゴニストは、配列番号56で示される重鎖
及び配列番号57で示される軽鎖を含む。一実施形態において、OX40アゴニストは、それぞれ配列番号56及び配列番号57に示される配列を有する重鎖及び軽鎖又は抗原結合断片、Fab断片、単鎖可変断片(scFv)、それらの変異体若しくはコンジュゲートを含む。一実施形態において、OX40アゴニストは、それぞれ配列番号56及び配列番号57に示される配列とそれぞれ少なくとも99%同一である重鎖及び軽鎖を含む。一実施形態において、OX40アゴニストは、それぞれ配列番号56及び配列番号57に示される配列とそれぞれ少なくとも98%同一である重鎖及び軽鎖を含む。一実施形態にお
いて、OX40アゴニストは、それぞれ配列番号56及び配列番号57に示される配列とそれぞれ少なくとも97%同一である重鎖及び軽鎖を含む。一実施形態において、OX40アゴニストは、それぞれ配列番号56及び配列番号57に示される配列とそれぞれ少なくとも96%同一である重鎖及び軽鎖を含む。一実施形態において、OX40アゴニストは、それぞれ配列番号56及び配列番号57に示される配列とそれぞれ少なくとも95%同一である重鎖及び軽鎖を含む。
及び配列番号57で示される軽鎖を含む。一実施形態において、OX40アゴニストは、それぞれ配列番号56及び配列番号57に示される配列を有する重鎖及び軽鎖又は抗原結合断片、Fab断片、単鎖可変断片(scFv)、それらの変異体若しくはコンジュゲートを含む。一実施形態において、OX40アゴニストは、それぞれ配列番号56及び配列番号57に示される配列とそれぞれ少なくとも99%同一である重鎖及び軽鎖を含む。一実施形態において、OX40アゴニストは、それぞれ配列番号56及び配列番号57に示される配列とそれぞれ少なくとも98%同一である重鎖及び軽鎖を含む。一実施形態にお
いて、OX40アゴニストは、それぞれ配列番号56及び配列番号57に示される配列とそれぞれ少なくとも97%同一である重鎖及び軽鎖を含む。一実施形態において、OX40アゴニストは、それぞれ配列番号56及び配列番号57に示される配列とそれぞれ少なくとも96%同一である重鎖及び軽鎖を含む。一実施形態において、OX40アゴニストは、それぞれ配列番号56及び配列番号57に示される配列とそれぞれ少なくとも95%同一である重鎖及び軽鎖を含む。
[00603] 一実施形態において、OX40アゴニストは、タボリキシズマブの重鎖及び
軽鎖CDR又は可変領域(VR)を含む。一実施形態において、OX40アゴニスト重鎖可変領域(VH)は配列番号58に示される配列を含み、OX40アゴニスト軽鎖可変領域(VL)は配列番号59に示される配列及びその保存的アミノ酸置換を含む。一実施形態において、OX40アゴニストは、それぞれ配列番号58及び配列番号59に示される配列とそれぞれ少なくとも99%同一であるVH及びVL領域を含む。一実施形態において、OX40アゴニストは、それぞれ配列番号58及び配列番号59に示される配列とそれぞれ少なくとも98%同一であるVH及びVL領域を含む。一実施形態において、OX40アゴニストは、それぞれ配列番号58及び配列番号59に示される配列とそれぞれ少なくとも97%同一であるVH及びVL領域を含む。一実施形態において、OX40アゴニストは、それぞれ配列番号58及び配列番号59に示される配列とそれぞれ少なくとも96%同一であるVH及びVL領域を含む。一実施形態において、OX40アゴニストは、それぞれ配列番号58及び配列番号59に示される配列とそれぞれ少なくとも95%同一であるVH及びVL領域を含む。一実施形態において、OX40アゴニストは、配列番号58及び配列番号59に示される配列とそれぞれ少なくとも99%同一であるVH及びVL領域を含むscFv抗体を含む。
軽鎖CDR又は可変領域(VR)を含む。一実施形態において、OX40アゴニスト重鎖可変領域(VH)は配列番号58に示される配列を含み、OX40アゴニスト軽鎖可変領域(VL)は配列番号59に示される配列及びその保存的アミノ酸置換を含む。一実施形態において、OX40アゴニストは、それぞれ配列番号58及び配列番号59に示される配列とそれぞれ少なくとも99%同一であるVH及びVL領域を含む。一実施形態において、OX40アゴニストは、それぞれ配列番号58及び配列番号59に示される配列とそれぞれ少なくとも98%同一であるVH及びVL領域を含む。一実施形態において、OX40アゴニストは、それぞれ配列番号58及び配列番号59に示される配列とそれぞれ少なくとも97%同一であるVH及びVL領域を含む。一実施形態において、OX40アゴニストは、それぞれ配列番号58及び配列番号59に示される配列とそれぞれ少なくとも96%同一であるVH及びVL領域を含む。一実施形態において、OX40アゴニストは、それぞれ配列番号58及び配列番号59に示される配列とそれぞれ少なくとも95%同一であるVH及びVL領域を含む。一実施形態において、OX40アゴニストは、配列番号58及び配列番号59に示される配列とそれぞれ少なくとも99%同一であるVH及びVL領域を含むscFv抗体を含む。
[00604] 一実施形態において、OX40アゴニストは、それぞれ配列番号60、配列
番号61及び配列番号62に記載の配列を有する重鎖CDR1、CDR2及びCDR3ドメイン並びにその保存的アミノ酸置換並びにそれぞれ配列番号63、配列番号64及び配列番号65に記載の配列を有する軽鎖CDR1、CDR2及びCDR3ドメイン並びにその保存的アミノ酸置換を含む。
番号61及び配列番号62に記載の配列を有する重鎖CDR1、CDR2及びCDR3ドメイン並びにその保存的アミノ酸置換並びにそれぞれ配列番号63、配列番号64及び配列番号65に記載の配列を有する軽鎖CDR1、CDR2及びCDR3ドメイン並びにその保存的アミノ酸置換を含む。
[00605] 一実施形態において、OX40アゴニストは、タボリキシズマブに関して薬
物規制当局によって承認されたOX40アゴニストバイオシミラーモノクローナル抗体である。一実施形態において、バイオシミラーモノクローナル抗体は、参照医薬品又は参照生物学的製剤のアミノ酸配列に対して少なくとも97%の配列同一性、例えば97%、98%、99%又は100%の配列同一性を有し、参照医薬品又は参照生物学的製剤と比較して1つ以上の翻訳後改変を含む、アミノ酸配列を含むOX40抗体を含み、ここで、参照医薬品又は参照生物学的製剤はタボリキシズマブである。一部の実施形態において、1つ以上の翻訳後改変は、グリコシル化、酸化、脱アミド化及び切断の1つ以上から選択される。一部の実施形態において、バイオシミラーは、認可された又は認可のために提出されたOX40アゴニスト抗体であり、OX40アゴニスト抗体は、参照医薬品又は参照生物学的製剤の製剤と異なる製剤で提供され、参照医薬品又は参照生物学的製剤はタボリキシズマブである。OX40アゴニスト抗体は、米国FDA及び/又は欧州連合のEMAなどの薬物規制当局によって認可されていることがあり得る。一部の実施形態において、バイオシミラーは、1つ以上の賦形剤を更に含む組成物として提供され、ここで、1つ以上の賦形剤は、参照医薬品又は参照生物学的製剤に含まれる賦形剤と同一又は異なっており、参照医薬品又は参照生物学的製剤はタボリキシズマブである。一部の実施形態において、バイオシミラーは、1つ以上の賦形剤を更に含む組成物として提供され、ここで、1つ以上の賦形剤は、参照医薬品又は参照生物学的製剤に含まれる賦形剤と同一又は異なっており、参照医薬品又は参照生物学的製剤はタボリキシズマブである。
物規制当局によって承認されたOX40アゴニストバイオシミラーモノクローナル抗体である。一実施形態において、バイオシミラーモノクローナル抗体は、参照医薬品又は参照生物学的製剤のアミノ酸配列に対して少なくとも97%の配列同一性、例えば97%、98%、99%又は100%の配列同一性を有し、参照医薬品又は参照生物学的製剤と比較して1つ以上の翻訳後改変を含む、アミノ酸配列を含むOX40抗体を含み、ここで、参照医薬品又は参照生物学的製剤はタボリキシズマブである。一部の実施形態において、1つ以上の翻訳後改変は、グリコシル化、酸化、脱アミド化及び切断の1つ以上から選択される。一部の実施形態において、バイオシミラーは、認可された又は認可のために提出されたOX40アゴニスト抗体であり、OX40アゴニスト抗体は、参照医薬品又は参照生物学的製剤の製剤と異なる製剤で提供され、参照医薬品又は参照生物学的製剤はタボリキシズマブである。OX40アゴニスト抗体は、米国FDA及び/又は欧州連合のEMAなどの薬物規制当局によって認可されていることがあり得る。一部の実施形態において、バイオシミラーは、1つ以上の賦形剤を更に含む組成物として提供され、ここで、1つ以上の賦形剤は、参照医薬品又は参照生物学的製剤に含まれる賦形剤と同一又は異なっており、参照医薬品又は参照生物学的製剤はタボリキシズマブである。一部の実施形態において、バイオシミラーは、1つ以上の賦形剤を更に含む組成物として提供され、ここで、1つ以上の賦形剤は、参照医薬品又は参照生物学的製剤に含まれる賦形剤と同一又は異なっており、参照医薬品又は参照生物学的製剤はタボリキシズマブである。
[00606] 一部の実施形態において、OX40アゴニストは11D4であり、これはPfizer, Inc.から入手可能な完全ヒト抗体である。11D4の調製及び特性は、米国特許第
7,960,515号;同第8,236,930号;及び同第9,028,824号に記載され、その開示は、参照により本明細書に組み込まれる。11D4のアミノ酸配列を表11に示す。
7,960,515号;同第8,236,930号;及び同第9,028,824号に記載され、その開示は、参照により本明細書に組み込まれる。11D4のアミノ酸配列を表11に示す。
[00607] 一実施形態において、OX40アゴニストは、配列番号66で示される重鎖
及び配列番号67で示される軽鎖を含む。一実施形態において、OX40アゴニストは、それぞれ配列番号66及び配列番号67に示される配列を有する重鎖及び軽鎖又は抗原結合断片、Fab断片、単鎖可変断片(scFv)、それらの変異体若しくはコンジュゲートを含む。一実施形態において、OX40アゴニストは、それぞれ配列番号66及び配列番号67に示される配列とそれぞれ少なくとも99%同一である重鎖及び軽鎖を含む。一実施形態において、OX40アゴニストは、それぞれ配列番号66及び配列番号67に示される配列とそれぞれ少なくとも98%同一である重鎖及び軽鎖を含む。一実施形態において、OX40アゴニストは、それぞれ配列番号66及び配列番号67に示される配列とそれぞれ少なくとも97%同一である重鎖及び軽鎖を含む。一実施形態において、OX4
0アゴニストは、それぞれ配列番号66及び配列番号67に示される配列とそれぞれ少なくとも96%同一である重鎖及び軽鎖を含む。一実施形態において、OX40アゴニストは、それぞれ配列番号66及び配列番号67に示される配列とそれぞれ少なくとも95%同一である重鎖及び軽鎖を含む。
及び配列番号67で示される軽鎖を含む。一実施形態において、OX40アゴニストは、それぞれ配列番号66及び配列番号67に示される配列を有する重鎖及び軽鎖又は抗原結合断片、Fab断片、単鎖可変断片(scFv)、それらの変異体若しくはコンジュゲートを含む。一実施形態において、OX40アゴニストは、それぞれ配列番号66及び配列番号67に示される配列とそれぞれ少なくとも99%同一である重鎖及び軽鎖を含む。一実施形態において、OX40アゴニストは、それぞれ配列番号66及び配列番号67に示される配列とそれぞれ少なくとも98%同一である重鎖及び軽鎖を含む。一実施形態において、OX40アゴニストは、それぞれ配列番号66及び配列番号67に示される配列とそれぞれ少なくとも97%同一である重鎖及び軽鎖を含む。一実施形態において、OX4
0アゴニストは、それぞれ配列番号66及び配列番号67に示される配列とそれぞれ少なくとも96%同一である重鎖及び軽鎖を含む。一実施形態において、OX40アゴニストは、それぞれ配列番号66及び配列番号67に示される配列とそれぞれ少なくとも95%同一である重鎖及び軽鎖を含む。
[00608] 一実施形態において、OX40アゴニストは、11D4の重鎖及び軽鎖CD
R又は可変領域(VR)を含む。一実施形態において、OX40アゴニスト重鎖可変領域(VH)は配列番号68に示される配列を含み、OX40アゴニスト軽鎖可変領域(VL)は配列番号69に示される配列及びその保存的アミノ酸置換を含む。一実施形態において、OX40アゴニストは、それぞれ配列番号68及び配列番号69に示される配列とそれぞれ少なくとも99%同一であるVH及びVL領域を含む。一実施形態において、OX40アゴニストは、それぞれ配列番号68及び配列番号69に示される配列とそれぞれ少なくとも98%同一であるVH及びVL領域を含む。一実施形態において、OX40アゴニストは、それぞれ配列番号68及び配列番号69に示される配列とそれぞれ少なくとも97%同一であるVH及びVL領域を含む。一実施形態において、OX40アゴニストは、それぞれ配列番号68及び配列番号69に示される配列とそれぞれ少なくとも96%同一であるVH及びVL領域を含む。一実施形態において、OX40アゴニストは、それぞれ配列番号68及び配列番号69に示される配列とそれぞれ少なくとも95%同一であるVH及びVL領域を含む。
R又は可変領域(VR)を含む。一実施形態において、OX40アゴニスト重鎖可変領域(VH)は配列番号68に示される配列を含み、OX40アゴニスト軽鎖可変領域(VL)は配列番号69に示される配列及びその保存的アミノ酸置換を含む。一実施形態において、OX40アゴニストは、それぞれ配列番号68及び配列番号69に示される配列とそれぞれ少なくとも99%同一であるVH及びVL領域を含む。一実施形態において、OX40アゴニストは、それぞれ配列番号68及び配列番号69に示される配列とそれぞれ少なくとも98%同一であるVH及びVL領域を含む。一実施形態において、OX40アゴニストは、それぞれ配列番号68及び配列番号69に示される配列とそれぞれ少なくとも97%同一であるVH及びVL領域を含む。一実施形態において、OX40アゴニストは、それぞれ配列番号68及び配列番号69に示される配列とそれぞれ少なくとも96%同一であるVH及びVL領域を含む。一実施形態において、OX40アゴニストは、それぞれ配列番号68及び配列番号69に示される配列とそれぞれ少なくとも95%同一であるVH及びVL領域を含む。
[00609] 一実施形態において、OX40アゴニストは、それぞれ配列番号70、配列
番号71及び配列番号72に記載の配列を有する重鎖CDR1、CDR2及びCDR3ドメイン並びにその保存的アミノ酸置換並びにそれぞれ配列番号73、配列番号74及び配列番号75に記載の配列を有する軽鎖CDR1、CDR2及びCDR3ドメイン並びにその保存的アミノ酸置換を含む。
番号71及び配列番号72に記載の配列を有する重鎖CDR1、CDR2及びCDR3ドメイン並びにその保存的アミノ酸置換並びにそれぞれ配列番号73、配列番号74及び配列番号75に記載の配列を有する軽鎖CDR1、CDR2及びCDR3ドメイン並びにその保存的アミノ酸置換を含む。
[00610] 一実施形態において、OX40アゴニストは、11D4に関して薬物規制当
局によって承認されたOX40アゴニストバイオシミラーモノクローナル抗体である。一実施形態において、バイオシミラーモノクローナル抗体は、参照医薬品又は参照生物学的製剤のアミノ酸配列に対して少なくとも97%の配列同一性、例えば97%、98%、99%又は100%の配列同一性を有し、参照医薬品又は参照生物学的製剤と比較して1つ以上の翻訳後改変を含む、アミノ酸配列を含むOX40抗体を含み、ここで、参照医薬品又は参照生物学的製剤は11D4である。一部の実施形態において、1つ以上の翻訳後改変は、グリコシル化、酸化、脱アミド化及び切断の1つ以上から選択される。一部の実施形態において、バイオシミラーは、認可された又は認可のために提出されたOX40アゴニスト抗体であり、OX40アゴニスト抗体は、参照医薬品又は参照生物学的製剤の製剤と異なる製剤で提供され、参照医薬品又は参照生物学的製剤は11D4である。OX40アゴニスト抗体は、米国FDA及び/又は欧州連合のEMAなどの薬物規制当局によって認可されていることがあり得る。一部の実施形態において、バイオシミラーは、1つ以上の賦形剤を更に含む組成物として提供され、ここで、1つ以上の賦形剤は、参照医薬品又は参照生物学的製剤に含まれる賦形剤と同一又は異なっており、参照医薬品又は参照生物学的製剤は11D4である。一部の実施形態において、バイオシミラーは、1つ以上の賦形剤を更に含む組成物として提供され、ここで、1つ以上の賦形剤は、参照医薬品又は参照生物学的製剤に含まれる賦形剤と同一又は異なっており、参照医薬品又は参照生物学的製剤は11D4である。
局によって承認されたOX40アゴニストバイオシミラーモノクローナル抗体である。一実施形態において、バイオシミラーモノクローナル抗体は、参照医薬品又は参照生物学的製剤のアミノ酸配列に対して少なくとも97%の配列同一性、例えば97%、98%、99%又は100%の配列同一性を有し、参照医薬品又は参照生物学的製剤と比較して1つ以上の翻訳後改変を含む、アミノ酸配列を含むOX40抗体を含み、ここで、参照医薬品又は参照生物学的製剤は11D4である。一部の実施形態において、1つ以上の翻訳後改変は、グリコシル化、酸化、脱アミド化及び切断の1つ以上から選択される。一部の実施形態において、バイオシミラーは、認可された又は認可のために提出されたOX40アゴニスト抗体であり、OX40アゴニスト抗体は、参照医薬品又は参照生物学的製剤の製剤と異なる製剤で提供され、参照医薬品又は参照生物学的製剤は11D4である。OX40アゴニスト抗体は、米国FDA及び/又は欧州連合のEMAなどの薬物規制当局によって認可されていることがあり得る。一部の実施形態において、バイオシミラーは、1つ以上の賦形剤を更に含む組成物として提供され、ここで、1つ以上の賦形剤は、参照医薬品又は参照生物学的製剤に含まれる賦形剤と同一又は異なっており、参照医薬品又は参照生物学的製剤は11D4である。一部の実施形態において、バイオシミラーは、1つ以上の賦形剤を更に含む組成物として提供され、ここで、1つ以上の賦形剤は、参照医薬品又は参照生物学的製剤に含まれる賦形剤と同一又は異なっており、参照医薬品又は参照生物学的製剤は11D4である。
[00611] 一部の実施形態において、OX40アゴニストは18D8であり、これはPfizer, Inc.から入手可能な完全ヒト抗体である。18D8の調製及び特性は、米国特許第
7,960,515号;同第8,236,930号;及び同第9,028,824号に記載され、その開示は、参照により本明細書に組み込まれる。18D8のアミノ酸配列を表12に示す。
7,960,515号;同第8,236,930号;及び同第9,028,824号に記載され、その開示は、参照により本明細書に組み込まれる。18D8のアミノ酸配列を表12に示す。
[00612] 一実施形態において、OX40アゴニストは、配列番号76で示される重鎖
及び配列番号77で示される軽鎖を含む。一実施形態において、OX40アゴニストは、それぞれ配列番号76及び配列番号77に示される配列を有する重鎖及び軽鎖又は抗原結合断片、Fab断片、単鎖可変断片(scFv)、それらの変異体若しくはコンジュゲートを含む。一実施形態において、OX40アゴニストは、それぞれ配列番号76及び配列番号77に示される配列とそれぞれ少なくとも99%同一である重鎖及び軽鎖を含む。一実施形態において、OX40アゴニストは、それぞれ配列番号76及び配列番号77に示される配列とそれぞれ少なくとも98%同一である重鎖及び軽鎖を含む。一実施形態において、OX40アゴニストは、それぞれ配列番号76及び配列番号77に示される配列とそれぞれ少なくとも97%同一である重鎖及び軽鎖を含む。一実施形態において、OX40アゴニストは、それぞれ配列番号76及び配列番号77に示される配列とそれぞれ少なくとも96%同一である重鎖及び軽鎖を含む。一実施形態において、OX40アゴニストは、それぞれ配列番号76及び配列番号77に示される配列とそれぞれ少なくとも95%
同一である重鎖及び軽鎖を含む。
及び配列番号77で示される軽鎖を含む。一実施形態において、OX40アゴニストは、それぞれ配列番号76及び配列番号77に示される配列を有する重鎖及び軽鎖又は抗原結合断片、Fab断片、単鎖可変断片(scFv)、それらの変異体若しくはコンジュゲートを含む。一実施形態において、OX40アゴニストは、それぞれ配列番号76及び配列番号77に示される配列とそれぞれ少なくとも99%同一である重鎖及び軽鎖を含む。一実施形態において、OX40アゴニストは、それぞれ配列番号76及び配列番号77に示される配列とそれぞれ少なくとも98%同一である重鎖及び軽鎖を含む。一実施形態において、OX40アゴニストは、それぞれ配列番号76及び配列番号77に示される配列とそれぞれ少なくとも97%同一である重鎖及び軽鎖を含む。一実施形態において、OX40アゴニストは、それぞれ配列番号76及び配列番号77に示される配列とそれぞれ少なくとも96%同一である重鎖及び軽鎖を含む。一実施形態において、OX40アゴニストは、それぞれ配列番号76及び配列番号77に示される配列とそれぞれ少なくとも95%
同一である重鎖及び軽鎖を含む。
[00613] 一実施形態において、OX40アゴニストは、18D8の重鎖及び軽鎖CD
R又は可変領域(VR)を含む。一実施形態において、OX40アゴニスト重鎖可変領域(VH)は配列番号78に示される配列を含み、OX40アゴニスト軽鎖可変領域(VL)は配列番号79に示される配列及びその保存的アミノ酸置換を含む。一実施形態において、OX40アゴニストは、それぞれ配列番号78及び配列番号79に示される配列とそれぞれ少なくとも99%同一であるVH及びVL領域を含む。一実施形態において、OX40アゴニストは、それぞれ配列番号78及び配列番号79に示される配列とそれぞれ少なくとも98%同一であるVH及びVL領域を含む。一実施形態において、OX40アゴニストは、それぞれ配列番号78及び配列番号79に示される配列とそれぞれ少なくとも97%同一であるVH及びVL領域を含む。一実施形態において、OX40アゴニストは、それぞれ配列番号78及び配列番号79に示される配列とそれぞれ少なくとも96%同一であるVH及びVL領域を含む。一実施形態において、OX40アゴニストは、それぞれ配列番号78及び配列番号79に示される配列とそれぞれ少なくとも95%同一であるVH及びVL領域を含む。
R又は可変領域(VR)を含む。一実施形態において、OX40アゴニスト重鎖可変領域(VH)は配列番号78に示される配列を含み、OX40アゴニスト軽鎖可変領域(VL)は配列番号79に示される配列及びその保存的アミノ酸置換を含む。一実施形態において、OX40アゴニストは、それぞれ配列番号78及び配列番号79に示される配列とそれぞれ少なくとも99%同一であるVH及びVL領域を含む。一実施形態において、OX40アゴニストは、それぞれ配列番号78及び配列番号79に示される配列とそれぞれ少なくとも98%同一であるVH及びVL領域を含む。一実施形態において、OX40アゴニストは、それぞれ配列番号78及び配列番号79に示される配列とそれぞれ少なくとも97%同一であるVH及びVL領域を含む。一実施形態において、OX40アゴニストは、それぞれ配列番号78及び配列番号79に示される配列とそれぞれ少なくとも96%同一であるVH及びVL領域を含む。一実施形態において、OX40アゴニストは、それぞれ配列番号78及び配列番号79に示される配列とそれぞれ少なくとも95%同一であるVH及びVL領域を含む。
[00614] 一実施形態において、OX40アゴニストは、それぞれ配列番号80、配列
番号81及び配列番号82に記載の配列を有する重鎖CDR1、CDR2及びCDR3ドメイン並びにその保存的アミノ酸置換並びにそれぞれ配列番号83、配列番号84及び配列番号85に記載の配列を有する軽鎖CDR1、CDR2及びCDR3ドメイン並びにその保存的アミノ酸置換を含む。
番号81及び配列番号82に記載の配列を有する重鎖CDR1、CDR2及びCDR3ドメイン並びにその保存的アミノ酸置換並びにそれぞれ配列番号83、配列番号84及び配列番号85に記載の配列を有する軽鎖CDR1、CDR2及びCDR3ドメイン並びにその保存的アミノ酸置換を含む。
[00615] 一実施形態において、OX40アゴニストは、18D8に関して薬物規制当
局によって承認されたOX40アゴニストバイオシミラーモノクローナル抗体である。一実施形態において、バイオシミラーモノクローナル抗体は、参照医薬品又は参照生物学的製剤のアミノ酸配列に対して少なくとも97%の配列同一性、例えば97%、98%、99%又は100%の配列同一性を有し、参照医薬品又は参照生物学的製剤と比較して1つ以上の翻訳後改変を含む、アミノ酸配列を含むOX40抗体を含み、ここで、参照医薬品又は参照生物学的製剤は18D8である。一部の実施形態において、1つ以上の翻訳後改変は、グリコシル化、酸化、脱アミド化及び切断の1つ以上から選択される。一部の実施形態において、バイオシミラーは、認可された又は認可のために提出されたOX40アゴニスト抗体であり、OX40アゴニスト抗体は、参照医薬品又は参照生物学的製剤の製剤と異なる製剤で提供され、参照医薬品又は参照生物学的製剤は18D8である。OX40アゴニスト抗体は、米国FDA及び/又は欧州連合のEMAなどの薬物規制当局によって認可されていることがあり得る。一部の実施形態において、バイオシミラーは、1つ以上の賦形剤を更に含む組成物として提供され、ここで、1つ以上の賦形剤は、参照医薬品又は参照生物学的製剤に含まれる賦形剤と同一又は異なっており、参照医薬品又は参照生物学的製剤は18D8である。一部の実施形態において、バイオシミラーは、1つ以上の賦形剤を更に含む組成物として提供され、ここで、1つ以上の賦形剤は、参照医薬品又は参照生物学的製剤に含まれる賦形剤と同一又は異なっており、参照医薬品又は参照生物学的製剤は18D8である。
局によって承認されたOX40アゴニストバイオシミラーモノクローナル抗体である。一実施形態において、バイオシミラーモノクローナル抗体は、参照医薬品又は参照生物学的製剤のアミノ酸配列に対して少なくとも97%の配列同一性、例えば97%、98%、99%又は100%の配列同一性を有し、参照医薬品又は参照生物学的製剤と比較して1つ以上の翻訳後改変を含む、アミノ酸配列を含むOX40抗体を含み、ここで、参照医薬品又は参照生物学的製剤は18D8である。一部の実施形態において、1つ以上の翻訳後改変は、グリコシル化、酸化、脱アミド化及び切断の1つ以上から選択される。一部の実施形態において、バイオシミラーは、認可された又は認可のために提出されたOX40アゴニスト抗体であり、OX40アゴニスト抗体は、参照医薬品又は参照生物学的製剤の製剤と異なる製剤で提供され、参照医薬品又は参照生物学的製剤は18D8である。OX40アゴニスト抗体は、米国FDA及び/又は欧州連合のEMAなどの薬物規制当局によって認可されていることがあり得る。一部の実施形態において、バイオシミラーは、1つ以上の賦形剤を更に含む組成物として提供され、ここで、1つ以上の賦形剤は、参照医薬品又は参照生物学的製剤に含まれる賦形剤と同一又は異なっており、参照医薬品又は参照生物学的製剤は18D8である。一部の実施形態において、バイオシミラーは、1つ以上の賦形剤を更に含む組成物として提供され、ここで、1つ以上の賦形剤は、参照医薬品又は参照生物学的製剤に含まれる賦形剤と同一又は異なっており、参照医薬品又は参照生物学的製剤は18D8である。
[00616] 一部の実施形態において、OX40アゴニストはHu119-122であり
、これはGlaxoSmithKline plc.から入手可能なヒト化抗体である。Hu119-122の調製及び特性は、米国特許第9,006,399号及び同第9,163,085号並びに国際公開第2012/027328号に記載され、その開示は、参照により本明細書に組み込まれる。Hu119-122のアミノ酸配列を表13に示す。
、これはGlaxoSmithKline plc.から入手可能なヒト化抗体である。Hu119-122の調製及び特性は、米国特許第9,006,399号及び同第9,163,085号並びに国際公開第2012/027328号に記載され、その開示は、参照により本明細書に組み込まれる。Hu119-122のアミノ酸配列を表13に示す。
[00617] 一実施形態において、OX40アゴニストは、Hu119-122の重鎖及
び軽鎖CDR又は可変領域(VR)を含む。一実施形態において、OX40アゴニスト重鎖可変領域(VH)は配列番号86に示される配列を含み、OX40アゴニスト軽鎖可変領域(VL)は配列番号87に示される配列及びその保存的アミノ酸置換を含む。一実施形態において、OX40アゴニストは、それぞれ配列番号86及び配列番号87に示される配列とそれぞれ少なくとも99%同一であるVH及びVL領域を含む。一実施形態において、OX40アゴニストは、それぞれ配列番号86及び配列番号87に示される配列とそれぞれ少なくとも98%同一であるVH及びVL領域を含む。一実施形態において、OX40アゴニストは、それぞれ配列番号86及び配列番号87に示される配列とそれぞれ少なくとも97%同一であるVH及びVL領域を含む。一実施形態において、OX40アゴニストは、それぞれ配列番号86及び配列番号87に示される配列とそれぞれ少なくとも96%同一であるVH及びVL領域を含む。一実施形態において、OX40アゴニストは、それぞれ配列番号86及び配列番号87に示される配列とそれぞれ少なくとも95%同一であるVH及びVL領域を含む。
び軽鎖CDR又は可変領域(VR)を含む。一実施形態において、OX40アゴニスト重鎖可変領域(VH)は配列番号86に示される配列を含み、OX40アゴニスト軽鎖可変領域(VL)は配列番号87に示される配列及びその保存的アミノ酸置換を含む。一実施形態において、OX40アゴニストは、それぞれ配列番号86及び配列番号87に示される配列とそれぞれ少なくとも99%同一であるVH及びVL領域を含む。一実施形態において、OX40アゴニストは、それぞれ配列番号86及び配列番号87に示される配列とそれぞれ少なくとも98%同一であるVH及びVL領域を含む。一実施形態において、OX40アゴニストは、それぞれ配列番号86及び配列番号87に示される配列とそれぞれ少なくとも97%同一であるVH及びVL領域を含む。一実施形態において、OX40アゴニストは、それぞれ配列番号86及び配列番号87に示される配列とそれぞれ少なくとも96%同一であるVH及びVL領域を含む。一実施形態において、OX40アゴニストは、それぞれ配列番号86及び配列番号87に示される配列とそれぞれ少なくとも95%同一であるVH及びVL領域を含む。
[00618] 一実施形態において、OX40アゴニストは、それぞれ配列番号88、配列
番号89及び配列番号90に記載の配列を有する重鎖CDR1、CDR2及びCDR3ドメイン並びにその保存的アミノ酸置換並びにそれぞれ配列番号91、配列番号92及び配列番号93に記載の配列を有する軽鎖CDR1、CDR2及びCDR3ドメイン並びにその保存的アミノ酸置換を含む。
番号89及び配列番号90に記載の配列を有する重鎖CDR1、CDR2及びCDR3ドメイン並びにその保存的アミノ酸置換並びにそれぞれ配列番号91、配列番号92及び配列番号93に記載の配列を有する軽鎖CDR1、CDR2及びCDR3ドメイン並びにその保存的アミノ酸置換を含む。
[00619] 一実施形態において、OX40アゴニストは、Hu119-122に関して
薬物規制当局によって承認されたOX40アゴニストバイオシミラーモノクローナル抗体である。一実施形態において、バイオシミラーモノクローナル抗体は、参照医薬品又は参照生物学的製剤のアミノ酸配列に対して少なくとも97%の配列同一性、例えば97%、98%、99%又は100%の配列同一性を有し、参照医薬品又は参照生物学的製剤と比較して1つ以上の翻訳後改変を含む、アミノ酸配列を含むOX40抗体を含み、ここで、参照医薬品又は参照生物学的製剤はHu119-122である。一部の実施形態において、1つ以上の翻訳後改変は、グリコシル化、酸化、脱アミド化及び切断の1つ以上から選択される。一部の実施形態において、バイオシミラーは、認可された又は認可のために提出されたOX40アゴニスト抗体であり、OX40アゴニスト抗体は、参照医薬品又は参照生物学的製剤の製剤と異なる製剤で提供され、参照医薬品又は参照生物学的製剤はHu119-122である。OX40アゴニスト抗体は、米国FDA及び/又は欧州連合のEMAなどの薬物規制当局によって認可されていることがあり得る。一部の実施形態において、バイオシミラーは、1つ以上の賦形剤を更に含む組成物として提供され、ここで、1つ以上の賦形剤は、参照医薬品又は参照生物学的製剤に含まれる賦形剤と同一又は異なっており、参照医薬品又は参照生物学的製剤はHu119-122である。一部の実施形態において、バイオシミラーは、1つ以上の賦形剤を更に含む組成物として提供され、ここで、1つ以上の賦形剤は、参照医薬品又は参照生物学的製剤に含まれる賦形剤と同一又は異なっており、参照医薬品又は参照生物学的製剤はHu119-122である。
薬物規制当局によって承認されたOX40アゴニストバイオシミラーモノクローナル抗体である。一実施形態において、バイオシミラーモノクローナル抗体は、参照医薬品又は参照生物学的製剤のアミノ酸配列に対して少なくとも97%の配列同一性、例えば97%、98%、99%又は100%の配列同一性を有し、参照医薬品又は参照生物学的製剤と比較して1つ以上の翻訳後改変を含む、アミノ酸配列を含むOX40抗体を含み、ここで、参照医薬品又は参照生物学的製剤はHu119-122である。一部の実施形態において、1つ以上の翻訳後改変は、グリコシル化、酸化、脱アミド化及び切断の1つ以上から選択される。一部の実施形態において、バイオシミラーは、認可された又は認可のために提出されたOX40アゴニスト抗体であり、OX40アゴニスト抗体は、参照医薬品又は参照生物学的製剤の製剤と異なる製剤で提供され、参照医薬品又は参照生物学的製剤はHu119-122である。OX40アゴニスト抗体は、米国FDA及び/又は欧州連合のEMAなどの薬物規制当局によって認可されていることがあり得る。一部の実施形態において、バイオシミラーは、1つ以上の賦形剤を更に含む組成物として提供され、ここで、1つ以上の賦形剤は、参照医薬品又は参照生物学的製剤に含まれる賦形剤と同一又は異なっており、参照医薬品又は参照生物学的製剤はHu119-122である。一部の実施形態において、バイオシミラーは、1つ以上の賦形剤を更に含む組成物として提供され、ここで、1つ以上の賦形剤は、参照医薬品又は参照生物学的製剤に含まれる賦形剤と同一又は異なっており、参照医薬品又は参照生物学的製剤はHu119-122である。
[00620] 一部の実施形態において、OX40アゴニストはHu106-222であり
、これはGlaxoSmithKline PLC.から入手可能なヒト化抗体である。Hu106-222の調製及び特性は、米国特許第9,006,399号及び同第9,163,085号並びに国際公開第2012/027328号に記載され、その開示は、参照により本明細書に組み込まれる。Hu106-222のアミノ酸配列を表14に示す。
、これはGlaxoSmithKline PLC.から入手可能なヒト化抗体である。Hu106-222の調製及び特性は、米国特許第9,006,399号及び同第9,163,085号並びに国際公開第2012/027328号に記載され、その開示は、参照により本明細書に組み込まれる。Hu106-222のアミノ酸配列を表14に示す。
[00621] 一実施形態において、OX40アゴニストは、Hu106-222の重鎖及
び軽鎖CDR又は可変領域(VR)を含む。一実施形態において、OX40アゴニスト重鎖可変領域(VH)は配列番号94に示される配列を含み、OX40アゴニスト軽鎖可変領域(VL)は配列番号95に示される配列及びその保存的アミノ酸置換を含む。一実施形態において、OX40アゴニストは、それぞれ配列番号94及び配列番号95に示される配列とそれぞれ少なくとも99%同一であるVH及びVL領域を含む。一実施形態において、OX40アゴニストは、それぞれ配列番号94及び配列番号95に示される配列とそれぞれ少なくとも98%同一であるVH及びVL領域を含む。一実施形態において、OX40アゴニストは、それぞれ配列番号94及び配列番号95に示される配列とそれぞれ少なくとも97%同一であるVH及びVL領域を含む。一実施形態において、OX40アゴニストは、それぞれ配列番号94及び配列番号95に示される配列とそれぞれ少なくとも96%同一であるVH及びVL領域を含む。一実施形態において、OX40アゴニストは、それぞれ配列番号94及び配列番号95に示される配列とそれぞれ少なくとも95%同一であるVH及びVL領域を含む。
び軽鎖CDR又は可変領域(VR)を含む。一実施形態において、OX40アゴニスト重鎖可変領域(VH)は配列番号94に示される配列を含み、OX40アゴニスト軽鎖可変領域(VL)は配列番号95に示される配列及びその保存的アミノ酸置換を含む。一実施形態において、OX40アゴニストは、それぞれ配列番号94及び配列番号95に示される配列とそれぞれ少なくとも99%同一であるVH及びVL領域を含む。一実施形態において、OX40アゴニストは、それぞれ配列番号94及び配列番号95に示される配列とそれぞれ少なくとも98%同一であるVH及びVL領域を含む。一実施形態において、OX40アゴニストは、それぞれ配列番号94及び配列番号95に示される配列とそれぞれ少なくとも97%同一であるVH及びVL領域を含む。一実施形態において、OX40アゴニストは、それぞれ配列番号94及び配列番号95に示される配列とそれぞれ少なくとも96%同一であるVH及びVL領域を含む。一実施形態において、OX40アゴニストは、それぞれ配列番号94及び配列番号95に示される配列とそれぞれ少なくとも95%同一であるVH及びVL領域を含む。
[00622] 一実施形態において、OX40アゴニストは、それぞれ配列番号96、配列
番号97及び配列番号98に記載の配列を有する重鎖CDR1、CDR2及びCDR3ドメイン並びにその保存的アミノ酸置換並びにそれぞれ配列番号99、配列番号100及び配列番号101に記載の配列を有する軽鎖CDR1、CDR2及びCDR3ドメイン並びにその保存的アミノ酸置換を含む。
番号97及び配列番号98に記載の配列を有する重鎖CDR1、CDR2及びCDR3ドメイン並びにその保存的アミノ酸置換並びにそれぞれ配列番号99、配列番号100及び配列番号101に記載の配列を有する軽鎖CDR1、CDR2及びCDR3ドメイン並びにその保存的アミノ酸置換を含む。
[00623] 一実施形態において、OX40アゴニストは、Hu106-222に関して
薬物規制当局によって承認されたOX40アゴニストバイオシミラーモノクローナル抗体である。一実施形態において、バイオシミラーモノクローナル抗体は、参照医薬品又は参照生物学的製剤のアミノ酸配列に対して少なくとも97%の配列同一性、例えば97%、98%、99%又は100%の配列同一性を有し、参照医薬品又は参照生物学的製剤と比較して1つ以上の翻訳後改変を含む、アミノ酸配列を含むOX40抗体を含み、ここで、参照医薬品又は参照生物学的製剤はHu106-222である。一部の実施形態において、1つ以上の翻訳後改変は、グリコシル化、酸化、脱アミド化及び切断の1つ以上から選択される。一部の実施形態において、バイオシミラーは、認可された又は認可のために提出されたOX40アゴニスト抗体であり、OX40アゴニスト抗体は、参照医薬品又は参照生物学的製剤の製剤と異なる製剤で提供され、参照医薬品又は参照生物学的製剤はHu106-222である。OX40アゴニスト抗体は、米国FDA及び/又は欧州連合のEMAなどの薬物規制当局によって認可されていることがあり得る。一部の実施形態において、バイオシミラーは、1つ以上の賦形剤を更に含む組成物として提供され、ここで、1つ以上の賦形剤は、参照医薬品又は参照生物学的製剤に含まれる賦形剤と同一又は異なっており、参照医薬品又は参照生物学的製剤はHu106-222である。一部の実施形態において、バイオシミラーは、1つ以上の賦形剤を更に含む組成物として提供され、ここで、1つ以上の賦形剤は、参照医薬品又は参照生物学的製剤に含まれる賦形剤と同一又は異なっており、参照医薬品又は参照生物学的製剤はHu106-222である。
薬物規制当局によって承認されたOX40アゴニストバイオシミラーモノクローナル抗体である。一実施形態において、バイオシミラーモノクローナル抗体は、参照医薬品又は参照生物学的製剤のアミノ酸配列に対して少なくとも97%の配列同一性、例えば97%、98%、99%又は100%の配列同一性を有し、参照医薬品又は参照生物学的製剤と比較して1つ以上の翻訳後改変を含む、アミノ酸配列を含むOX40抗体を含み、ここで、参照医薬品又は参照生物学的製剤はHu106-222である。一部の実施形態において、1つ以上の翻訳後改変は、グリコシル化、酸化、脱アミド化及び切断の1つ以上から選択される。一部の実施形態において、バイオシミラーは、認可された又は認可のために提出されたOX40アゴニスト抗体であり、OX40アゴニスト抗体は、参照医薬品又は参照生物学的製剤の製剤と異なる製剤で提供され、参照医薬品又は参照生物学的製剤はHu106-222である。OX40アゴニスト抗体は、米国FDA及び/又は欧州連合のEMAなどの薬物規制当局によって認可されていることがあり得る。一部の実施形態において、バイオシミラーは、1つ以上の賦形剤を更に含む組成物として提供され、ここで、1つ以上の賦形剤は、参照医薬品又は参照生物学的製剤に含まれる賦形剤と同一又は異なっており、参照医薬品又は参照生物学的製剤はHu106-222である。一部の実施形態において、バイオシミラーは、1つ以上の賦形剤を更に含む組成物として提供され、ここで、1つ以上の賦形剤は、参照医薬品又は参照生物学的製剤に含まれる賦形剤と同一又は異なっており、参照医薬品又は参照生物学的製剤はHu106-222である。
[00624] 一部の実施形態において、OX40アゴニスト抗体はMEDI6469(9
B12とも称される)である。MEDI6469はマウスモノクローナル抗体である。Weinberg, et al., J. Immunother.2006, 29, 575-585。一部の実施形態において、OX4
0アゴニストは、Weinberg, et al., J. Immunother.2006, 29, 575-585に記載されてい
るように、Biovest Inc.(Malvern, MA, USA)に寄託された、9B12ハイブリドーマによって産生される抗体であり、その開示は、参照により全体として本明細書に組み込まれる。一部の実施形態において、抗体は、MEDI6469のCDR配列を含む。一部の実施形態において、抗体は、MEDI6469の重鎖可変領域配列及び/又は軽鎖可変領域配列を含む。
B12とも称される)である。MEDI6469はマウスモノクローナル抗体である。Weinberg, et al., J. Immunother.2006, 29, 575-585。一部の実施形態において、OX4
0アゴニストは、Weinberg, et al., J. Immunother.2006, 29, 575-585に記載されてい
るように、Biovest Inc.(Malvern, MA, USA)に寄託された、9B12ハイブリドーマによって産生される抗体であり、その開示は、参照により全体として本明細書に組み込まれる。一部の実施形態において、抗体は、MEDI6469のCDR配列を含む。一部の実施形態において、抗体は、MEDI6469の重鎖可変領域配列及び/又は軽鎖可変領域配列を含む。
[00625] 一実施形態において、OX40アゴニストは、L106 BD(Pharmingen Product #340420)である。一部の実施形態において、OX40アゴニストは、抗体L106(BD Pharmingen Product #340420)のCDRを含む。一部の実施形態において、OX
40アゴニストは、抗体L106(BD Pharmingen Product #340420)の重鎖可変領域配
列及び/又は軽鎖可変領域配列を含む。一実施形態において、OX40アゴニストはACT35(Santa Cruz Biotechnology、カタログ番号20073)である。一部の実施形態において、OX40アゴニストは、抗体ACT35(Santa Cruz Biotechnology、カタログ番号20073)のCDRを含む。一部の実施形態において、OX40アゴニストは、抗体ACT35(Santa Cruz Biotechnology、カタログ番号20073)の重鎖可変領域配列及び/又は軽鎖可変領域配列を含む。一実施形態において、OX40アゴニストは、マウスモノクローナル抗体抗mCD134/mOX40(クローンOX86)であり、InVivoMAb, BioXcell Inc, West Lebanon, NHから市販されている。
40アゴニストは、抗体L106(BD Pharmingen Product #340420)の重鎖可変領域配
列及び/又は軽鎖可変領域配列を含む。一実施形態において、OX40アゴニストはACT35(Santa Cruz Biotechnology、カタログ番号20073)である。一部の実施形態において、OX40アゴニストは、抗体ACT35(Santa Cruz Biotechnology、カタログ番号20073)のCDRを含む。一部の実施形態において、OX40アゴニストは、抗体ACT35(Santa Cruz Biotechnology、カタログ番号20073)の重鎖可変領域配列及び/又は軽鎖可変領域配列を含む。一実施形態において、OX40アゴニストは、マウスモノクローナル抗体抗mCD134/mOX40(クローンOX86)であり、InVivoMAb, BioXcell Inc, West Lebanon, NHから市販されている。
[00626] 一実施形態において、OX40アゴニストは、国際公開第95/12673
号、同第95/21925号、同第2006/121810号、同第2012/027328号、同第2013/028231号、同第2013/038191号及び同第2014/148895号;欧州特許第0672141号;米国特許出願公開第2010/13
6030号、同第2014/377284号、同第2015/190506号及び同第2015/132288号;並びに米国特許第7,504,101号、同第7,550,140号、同第7,622,444号、同第7,696,175号、同第7,960,515号、同第7,961,515号、同第8,133,983号、同第9,006,399号及び同第9,163,085号(20E5及び12H3を含む)に記載されるOX40アゴニストから選択され、それぞれの開示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
号、同第95/21925号、同第2006/121810号、同第2012/027328号、同第2013/028231号、同第2013/038191号及び同第2014/148895号;欧州特許第0672141号;米国特許出願公開第2010/13
6030号、同第2014/377284号、同第2015/190506号及び同第2015/132288号;並びに米国特許第7,504,101号、同第7,550,140号、同第7,622,444号、同第7,696,175号、同第7,960,515号、同第7,961,515号、同第8,133,983号、同第9,006,399号及び同第9,163,085号(20E5及び12H3を含む)に記載されるOX40アゴニストから選択され、それぞれの開示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
[00627] 一実施形態において、OX40アゴニストは、構造I-A(C末端Fc抗体
断片融合タンパク質)又は構造I-B(N末端Fc抗体断片融合タンパク質)に示されるOX40アゴニスト性融合タンパク質又はその断片、誘導体、コンジュゲート、変異体若しくはバイオシミラーである。構造I-A及びI-Bの特性は、上記並びに米国特許第9,359,420号、同第9,340,599号、同第8,921,519号及び同第8,450,460号に記載され、その開示は、参照により本明細書に組み込まれる。構造I-Aのポリペプチドドメインのアミノ酸配列を表6に示す。Fcドメインは、好ましくは、完全定常ドメイン(配列番号31のアミノ酸17~230)、完全ヒンジドメイン(配列番号31のアミノ酸1~16)又はヒンジドメインの一部(例えば、配列番号31のアミノ酸4~16)を含む。C末端Fc抗体を接続するための好ましいリンカーは、追加的ポリペプチドの融合に適したリンカーを含む、配列番号32~配列番号41に示される実施形態から選択され得る。同様に、構造I-Bのポリペプチドドメインのアミノ酸配列を表7に示す。構造I-BのようにFc抗体断片がTNRFSF融合タンパク質のN末端に融合される場合、Fcモジュールの配列は好ましくは配列番号42に示されるものであり、リンカー配列は好ましくは配列番号43~配列番号45に示される実施形態から選択される。
断片融合タンパク質)又は構造I-B(N末端Fc抗体断片融合タンパク質)に示されるOX40アゴニスト性融合タンパク質又はその断片、誘導体、コンジュゲート、変異体若しくはバイオシミラーである。構造I-A及びI-Bの特性は、上記並びに米国特許第9,359,420号、同第9,340,599号、同第8,921,519号及び同第8,450,460号に記載され、その開示は、参照により本明細書に組み込まれる。構造I-Aのポリペプチドドメインのアミノ酸配列を表6に示す。Fcドメインは、好ましくは、完全定常ドメイン(配列番号31のアミノ酸17~230)、完全ヒンジドメイン(配列番号31のアミノ酸1~16)又はヒンジドメインの一部(例えば、配列番号31のアミノ酸4~16)を含む。C末端Fc抗体を接続するための好ましいリンカーは、追加的ポリペプチドの融合に適したリンカーを含む、配列番号32~配列番号41に示される実施形態から選択され得る。同様に、構造I-Bのポリペプチドドメインのアミノ酸配列を表7に示す。構造I-BのようにFc抗体断片がTNRFSF融合タンパク質のN末端に融合される場合、Fcモジュールの配列は好ましくは配列番号42に示されるものであり、リンカー配列は好ましくは配列番号43~配列番号45に示される実施形態から選択される。
[00628] 一実施形態において、構造I-A又はI-BによるOX40アゴニスト融合
タンパク質は、タボリキシズマブの可変重鎖及び可変軽鎖、11D4の可変重鎖及び可変軽鎖、18D8の可変重鎖及び可変軽鎖、Hu119-122の可変重鎖及び可変軽鎖、Hu106-222の可変重鎖及び可変軽鎖、表15に記載されている可変重鎖及び可変軽鎖から選択される可変重鎖及び可変軽鎖、上記の可変重鎖及び可変軽鎖の任意の組み合わせ並びにそれらの断片、誘導体、コンジュゲート、変異体及びバイオシミラーからなる群から選択される1つ以上のOX40結合ドメインを含む。
タンパク質は、タボリキシズマブの可変重鎖及び可変軽鎖、11D4の可変重鎖及び可変軽鎖、18D8の可変重鎖及び可変軽鎖、Hu119-122の可変重鎖及び可変軽鎖、Hu106-222の可変重鎖及び可変軽鎖、表15に記載されている可変重鎖及び可変軽鎖から選択される可変重鎖及び可変軽鎖、上記の可変重鎖及び可変軽鎖の任意の組み合わせ並びにそれらの断片、誘導体、コンジュゲート、変異体及びバイオシミラーからなる群から選択される1つ以上のOX40結合ドメインを含む。
[00629] 一実施形態において、構造I-A又はI-BによるOX40アゴニスト融合
タンパク質は、OX40L配列を含む1つ以上のOX40結合ドメインを含む。一実施形態において、構造I-A又はI-BによるOX40アゴニスト融合タンパク質は、配列番号102による配列を含む1つ以上のOX40結合ドメインを含む。一実施形態において、構造I-A又はI-BによるOX40アゴニスト融合タンパク質は、可溶性OX40L配列を含む1つ以上のOX40結合ドメインを含む。一実施形態において、構造I-A又はI-BによるOX40アゴニスト融合タンパク質は、配列番号103による配列を含む1つ以上のOX40結合ドメインを含む。一実施形態において、構造I-A又はI-BによるOX40アゴニスト融合タンパク質は、配列番号104による配列を含む1つ以上のOX40結合ドメインを含む。
タンパク質は、OX40L配列を含む1つ以上のOX40結合ドメインを含む。一実施形態において、構造I-A又はI-BによるOX40アゴニスト融合タンパク質は、配列番号102による配列を含む1つ以上のOX40結合ドメインを含む。一実施形態において、構造I-A又はI-BによるOX40アゴニスト融合タンパク質は、可溶性OX40L配列を含む1つ以上のOX40結合ドメインを含む。一実施形態において、構造I-A又はI-BによるOX40アゴニスト融合タンパク質は、配列番号103による配列を含む1つ以上のOX40結合ドメインを含む。一実施形態において、構造I-A又はI-BによるOX40アゴニスト融合タンパク質は、配列番号104による配列を含む1つ以上のOX40結合ドメインを含む。
[00630] 一実施形態において、構造I-A又はI-BによるOX40アゴニスト融合
タンパク質は、それぞれ配列番号58及び配列番号59に示される配列とそれぞれ少なくとも95%同一であるVH及びVL領域を含むscFvドメインである1つ以上のOX40結合ドメインを含み、ここで、VH及びVLドメインはリンカーによって接続されている。一実施形態において、構造I-A又はI-BによるOX40アゴニスト融合タンパク質は、それぞれ配列番号68及び配列番号69に示される配列とそれぞれ少なくとも95
%同一であるVH及びVL領域を含むscFvドメインである1つ以上のOX40結合ドメインを含み、ここで、VH及びVLドメインはリンカーによって接続されている。一実施形態において、構造I-A又はI-BによるOX40アゴニスト融合タンパク質は、それぞれ配列番号78及び配列番号79に示される配列とそれぞれ少なくとも95%同一であるVH及びVL領域を含むscFvドメインである1つ以上のOX40結合ドメインを含み、ここで、VH及びVLドメインはリンカーによって接続されている。一実施形態において、構造I-A又はI-BによるOX40アゴニスト融合タンパク質は、それぞれ配列番号86及び配列番号87に示される配列とそれぞれ少なくとも95%同一であるVH及びVL領域を含むscFvドメインである1つ以上のOX40結合ドメインを含み、ここで、VH及びVLドメインはリンカーによって接続されている。一実施形態において、構造I-A又はI-BによるOX40アゴニスト融合タンパク質は、それぞれ配列番号94及び配列番号95に示される配列とそれぞれ少なくとも95%同一であるVH及びVL領域を含むscFvドメインである1つ以上のOX40結合ドメインを含み、ここで、VH及びVLドメインはリンカーによって接続されている。一実施形態において、構造I-A又はI-BによるOX40アゴニスト融合タンパク質は、表15に示されるVH及びVL配列とそれぞれ少なくとも95%同一であるVH及びVL領域を含むscFvドメインである1つ以上のOX40結合ドメインを含み、ここで、VH及びVLドメインはリンカーによって接続されている。
タンパク質は、それぞれ配列番号58及び配列番号59に示される配列とそれぞれ少なくとも95%同一であるVH及びVL領域を含むscFvドメインである1つ以上のOX40結合ドメインを含み、ここで、VH及びVLドメインはリンカーによって接続されている。一実施形態において、構造I-A又はI-BによるOX40アゴニスト融合タンパク質は、それぞれ配列番号68及び配列番号69に示される配列とそれぞれ少なくとも95
%同一であるVH及びVL領域を含むscFvドメインである1つ以上のOX40結合ドメインを含み、ここで、VH及びVLドメインはリンカーによって接続されている。一実施形態において、構造I-A又はI-BによるOX40アゴニスト融合タンパク質は、それぞれ配列番号78及び配列番号79に示される配列とそれぞれ少なくとも95%同一であるVH及びVL領域を含むscFvドメインである1つ以上のOX40結合ドメインを含み、ここで、VH及びVLドメインはリンカーによって接続されている。一実施形態において、構造I-A又はI-BによるOX40アゴニスト融合タンパク質は、それぞれ配列番号86及び配列番号87に示される配列とそれぞれ少なくとも95%同一であるVH及びVL領域を含むscFvドメインである1つ以上のOX40結合ドメインを含み、ここで、VH及びVLドメインはリンカーによって接続されている。一実施形態において、構造I-A又はI-BによるOX40アゴニスト融合タンパク質は、それぞれ配列番号94及び配列番号95に示される配列とそれぞれ少なくとも95%同一であるVH及びVL領域を含むscFvドメインである1つ以上のOX40結合ドメインを含み、ここで、VH及びVLドメインはリンカーによって接続されている。一実施形態において、構造I-A又はI-BによるOX40アゴニスト融合タンパク質は、表15に示されるVH及びVL配列とそれぞれ少なくとも95%同一であるVH及びVL領域を含むscFvドメインである1つ以上のOX40結合ドメインを含み、ここで、VH及びVLドメインはリンカーによって接続されている。
[00631] 一実施形態において、OX40アゴニストは、(i)第1の可溶性OX40
結合ドメイン、(ii)第1のペプチドリンカー、(iii)第2の可溶性OX40結合ドメイン、(iv)第2のペプチドリンカー、及び(v)第3の可溶性OX40結合ドメインを含むOX40アゴニスト性単鎖融合ポリペプチドであり、N末端及び/又はC末端に追加のドメインを更に含み、ここで、追加のドメインは、Fab又はFc断片ドメインである。一実施形態において、OX40アゴニストは、(i)第1の可溶性OX40結合ドメイン、(ii)第1のペプチドリンカー、(iii)第2の可溶性OX40結合ドメイン、(iv)第2のペプチドリンカー、及び(v)第3の可溶性OX40結合ドメインを含むOX40アゴニスト性単鎖融合ポリペプチドであり、N末端及び/又はC末端に追加のドメインを更に含み、ここで、追加のドメインは、Fab又はFc断片ドメインであり、可溶性OX40結合ドメインのそれぞれは、ストーク領域(三量体化に寄与し、細胞膜まで一定の距離を提供するが、OX40結合ドメインの一部ではない)を欠き、第1及び第2のペプチドリンカーは、独立して3~8アミノ酸長を有する。
結合ドメイン、(ii)第1のペプチドリンカー、(iii)第2の可溶性OX40結合ドメイン、(iv)第2のペプチドリンカー、及び(v)第3の可溶性OX40結合ドメインを含むOX40アゴニスト性単鎖融合ポリペプチドであり、N末端及び/又はC末端に追加のドメインを更に含み、ここで、追加のドメインは、Fab又はFc断片ドメインである。一実施形態において、OX40アゴニストは、(i)第1の可溶性OX40結合ドメイン、(ii)第1のペプチドリンカー、(iii)第2の可溶性OX40結合ドメイン、(iv)第2のペプチドリンカー、及び(v)第3の可溶性OX40結合ドメインを含むOX40アゴニスト性単鎖融合ポリペプチドであり、N末端及び/又はC末端に追加のドメインを更に含み、ここで、追加のドメインは、Fab又はFc断片ドメインであり、可溶性OX40結合ドメインのそれぞれは、ストーク領域(三量体化に寄与し、細胞膜まで一定の距離を提供するが、OX40結合ドメインの一部ではない)を欠き、第1及び第2のペプチドリンカーは、独立して3~8アミノ酸長を有する。
[00632] 一実施形態において、OX40アゴニストは、(i)第1の可溶性腫瘍壊死
因子(TNF)スーパーファミリーサイトカインドメイン、(ii)第1のペプチドリンカー、(iii)第2の可溶性TNFスーパーファミリーサイトカインドメイン、(iv)第2のペプチドリンカー、及び(v)第3の可溶性TNFスーパーファミリーサイトカインドメインを含むOX40アゴニスト性単鎖融合ポリペプチドであり、ここで、可溶性TNFスーパーファミリーサイトカインドメインのそれぞれは、ストーク領域を欠き、第1及び第2のペプチドリンカーは、独立して3~8アミノ酸長を有し、TNFスーパーファミリーサイトカインドメインはOX40結合ドメインである。
因子(TNF)スーパーファミリーサイトカインドメイン、(ii)第1のペプチドリンカー、(iii)第2の可溶性TNFスーパーファミリーサイトカインドメイン、(iv)第2のペプチドリンカー、及び(v)第3の可溶性TNFスーパーファミリーサイトカインドメインを含むOX40アゴニスト性単鎖融合ポリペプチドであり、ここで、可溶性TNFスーパーファミリーサイトカインドメインのそれぞれは、ストーク領域を欠き、第1及び第2のペプチドリンカーは、独立して3~8アミノ酸長を有し、TNFスーパーファミリーサイトカインドメインはOX40結合ドメインである。
[00633] 一部の実施形態において、OX40アゴニストはMEDI6383である。
MEDI6383はOX40アゴニスト性融合タンパク質であり、米国特許第6,312,700号に記載されているように調製することができ、その開示は、参照により本明細書に組み込まれる。
MEDI6383はOX40アゴニスト性融合タンパク質であり、米国特許第6,312,700号に記載されているように調製することができ、その開示は、参照により本明細書に組み込まれる。
[00634] 一実施形態において、OX40アゴニストは、前述のVLドメインのいずれ
かに連結された前述のVHドメインのいずれかを含むOX40アゴニスト性scFv抗体である。
かに連結された前述のVHドメインのいずれかを含むOX40アゴニスト性scFv抗体である。
[00635] 一実施形態において、OX40アゴニストは、Creative BiolabsOX40ア
ゴニストモノクローナル抗体MOM-18455であり、これはCreative Biolabs, Inc., Shirley, NY, USAから市販されている。
ゴニストモノクローナル抗体MOM-18455であり、これはCreative Biolabs, Inc., Shirley, NY, USAから市販されている。
[00636] 一実施形態において、OX40アゴニストは、BioLegend, Inc., San Diego,
CA, USAから市販されているOX40アゴニスト性抗体クローンBer-ACT35であ
る。
CA, USAから市販されているOX40アゴニスト性抗体クローンBer-ACT35であ
る。
H.任意選択による細胞生存率分析
[00637] 任意選択により、ステップBの第1の拡大培養後、当技術分野において公知
の標準アッセイを用いて細胞生存率アッセイを実施することができる。任意選択により、第1の拡大培養(初めのバルク拡大培養と称されることがある)後、当技術分野において公知の標準アッセイを用いて細胞生存率アッセイを実施することができる。例えば、バルクTILのサンプルに対してトリパンブルー色素排除アッセイを行うことができ、これは、死細胞を選択的に標識して生存率の評価を可能にするものである。生存率の試験に用いられる他のアッセイとしては、限定はされないが、アラマーブルーアッセイ;及びMTTアッセイを挙げることができる。
[00637] 任意選択により、ステップBの第1の拡大培養後、当技術分野において公知
の標準アッセイを用いて細胞生存率アッセイを実施することができる。任意選択により、第1の拡大培養(初めのバルク拡大培養と称されることがある)後、当技術分野において公知の標準アッセイを用いて細胞生存率アッセイを実施することができる。例えば、バルクTILのサンプルに対してトリパンブルー色素排除アッセイを行うことができ、これは、死細胞を選択的に標識して生存率の評価を可能にするものである。生存率の試験に用いられる他のアッセイとしては、限定はされないが、アラマーブルーアッセイ;及びMTTアッセイを挙げることができる。
1.細胞数、生存率、フローサイトメトリー
[00638] 一部の実施形態において、細胞数及び/又は生存率が測定される。限定はさ
れないが、CD3、CD4、CD8及びCD56などのマーカー並びに本明細書に開示又は記載される任意の他のものの発現を抗体によるフローサイトメトリー、例えば、限定はされないが、FACSCanto(商標)フローサイトメーター(BD Biosciences)を使用してBD Bio-sciences(BD Biosciences、San Jose, CA)から市販されているものによって測定することができる。細胞は、ディスポーザブルc-chip血球計算盤(VWR、Batavia, IL)を使用して手動でカウントすることができ、及び生存率は、限定はされないがトリパンブルー染色を含め、当技術分野において公知の任意の方法を用いて評価することができる。
[00638] 一部の実施形態において、細胞数及び/又は生存率が測定される。限定はさ
れないが、CD3、CD4、CD8及びCD56などのマーカー並びに本明細書に開示又は記載される任意の他のものの発現を抗体によるフローサイトメトリー、例えば、限定はされないが、FACSCanto(商標)フローサイトメーター(BD Biosciences)を使用してBD Bio-sciences(BD Biosciences、San Jose, CA)から市販されているものによって測定することができる。細胞は、ディスポーザブルc-chip血球計算盤(VWR、Batavia, IL)を使用して手動でカウントすることができ、及び生存率は、限定はされないがトリパンブルー染色を含め、当技術分野において公知の任意の方法を用いて評価することができる。
[00639] ある場合には、バルクTIL集団は、以下で考察するプロトコルを用いて直
ちに凍結保存することができる。代わりに、バルクTIL集団は、以下で考察する通り、REPに供し、次に凍結保存することができる。同様に、療法において遺伝子修飾TILが使用されることになる場合、バルク又はREP TIL集団を好適な処置のための遺伝子修飾に供することができる。
ちに凍結保存することができる。代わりに、バルクTIL集団は、以下で考察する通り、REPに供し、次に凍結保存することができる。同様に、療法において遺伝子修飾TILが使用されることになる場合、バルク又はREP TIL集団を好適な処置のための遺伝子修飾に供することができる。
2.細胞培養
[00640] 一実施形態において、TILの拡大培養方法は、約5,000mL~約25
,000mLの細胞培養培地、約5,000mL~約10,000mLの細胞培養培地又は約5,800mL~約8,700mLの細胞培養培地を使用することを含み得る。一実施形態において、TIL数の拡大には1種類以下の細胞培養培地が使用される。任意の好適な細胞培養培地は、例えば、AIM-V細胞培養培地(L-グルタミン、50μM硫酸スト
レプトマイシン及び10μM硫酸ゲンタマイシン)細胞培養培地(Invitrogen、Carlsbad
CA)を使用し得る。この点に関して、本発明の方法では有利には、TIL数の拡大に必
要な培地の量及び培地の種類の数が減少する。一実施形態において、TIL数の拡大は、2日又は3日おき以下の頻度で細胞に新鮮細胞培養培地を加える(細胞をフィードするとも称される)ことを含み得る。ガス透過性容器内の細胞数を増やすことは、細胞を拡大培養するのに必要なフィード頻度を減らすことによって細胞数を増やすのに必要な手順を単純化する。
[00640] 一実施形態において、TILの拡大培養方法は、約5,000mL~約25
,000mLの細胞培養培地、約5,000mL~約10,000mLの細胞培養培地又は約5,800mL~約8,700mLの細胞培養培地を使用することを含み得る。一実施形態において、TIL数の拡大には1種類以下の細胞培養培地が使用される。任意の好適な細胞培養培地は、例えば、AIM-V細胞培養培地(L-グルタミン、50μM硫酸スト
レプトマイシン及び10μM硫酸ゲンタマイシン)細胞培養培地(Invitrogen、Carlsbad
CA)を使用し得る。この点に関して、本発明の方法では有利には、TIL数の拡大に必
要な培地の量及び培地の種類の数が減少する。一実施形態において、TIL数の拡大は、2日又は3日おき以下の頻度で細胞に新鮮細胞培養培地を加える(細胞をフィードするとも称される)ことを含み得る。ガス透過性容器内の細胞数を増やすことは、細胞を拡大培養するのに必要なフィード頻度を減らすことによって細胞数を増やすのに必要な手順を単純化する。
[00641] 一実施形態において、第1及び/又は第2のガス透過性容器内の細胞培養培
地は、ろ過されていない。ろ過されていない細胞培養培地の使用は、細胞数を拡大培養させるために必要な手順を単純化し得る。一実施形態において、第1及び/又は第2のガス透過性容器内の細胞培養培地は、β-メルカプトエタノール(BME)を欠いている。
地は、ろ過されていない。ろ過されていない細胞培養培地の使用は、細胞数を拡大培養させるために必要な手順を単純化し得る。一実施形態において、第1及び/又は第2のガス透過性容器内の細胞培養培地は、β-メルカプトエタノール(BME)を欠いている。
[00642] ある実施形態において、哺乳類から腫瘍組織サンプルを得ること;細胞培養
培地が中に入った第1のガス透過性容器内で腫瘍組織サンプルを培養すること;腫瘍組織サンプルからTILを得ること;aAPCを使用して、細胞培養培地が中に入った第2の
ガス透過性容器内でTIL数を約14~約42日間、例えば約28日間拡大することを含む本方法の所要期間である。
培地が中に入った第1のガス透過性容器内で腫瘍組織サンプルを培養すること;腫瘍組織サンプルからTILを得ること;aAPCを使用して、細胞培養培地が中に入った第2の
ガス透過性容器内でTIL数を約14~約42日間、例えば約28日間拡大することを含む本方法の所要期間である。
[00643] 一実施形態において、TILは、ガス透過性容器内で拡大培養する。ガス透
過性容器は、米国特許出願公開第2005/0106717 A1号(この開示は、参照により本明細書に組み込まれる)に記載されるものを含め、当技術分野において公知の方法、組成物及び装置を用いたPBMCを使用したTILの拡大培養に用いられている。ある実施形態において、TILは、ガス透過性バッグ内で拡大培養される。一実施形態において、TILは、Xuri Cell Expansion System W25(GE Healthcare)などのガス透過性
バッグ内でTILを拡大培養する細胞拡大培養システムを使用して拡大培養される。ある実施形態において、TILは、Xuri Cell Expansion System W5(GE Healthcare)としても知られるWAVE Bioreactor Systemなど、ガス透過性バッグ内でTILを拡大培養する細胞拡大培養システムを使用して拡大培養される。ある実施形態において、細胞拡大培養システムは、約100mL、約200mL、約300mL、約400mL、約500mL、約600mL、約700mL、約800mL、約900mL、約1L、約2L、約3L、約4L、約5L、約6L、約7L、約8L、約9L及び約10Lからなる群から選択される容積を有するガス透過性細胞バッグを含む。
過性容器は、米国特許出願公開第2005/0106717 A1号(この開示は、参照により本明細書に組み込まれる)に記載されるものを含め、当技術分野において公知の方法、組成物及び装置を用いたPBMCを使用したTILの拡大培養に用いられている。ある実施形態において、TILは、ガス透過性バッグ内で拡大培養される。一実施形態において、TILは、Xuri Cell Expansion System W25(GE Healthcare)などのガス透過性
バッグ内でTILを拡大培養する細胞拡大培養システムを使用して拡大培養される。ある実施形態において、TILは、Xuri Cell Expansion System W5(GE Healthcare)としても知られるWAVE Bioreactor Systemなど、ガス透過性バッグ内でTILを拡大培養する細胞拡大培養システムを使用して拡大培養される。ある実施形態において、細胞拡大培養システムは、約100mL、約200mL、約300mL、約400mL、約500mL、約600mL、約700mL、約800mL、約900mL、約1L、約2L、約3L、約4L、約5L、約6L、約7L、約8L、約9L及び約10Lからなる群から選択される容積を有するガス透過性細胞バッグを含む。
[00644] 一実施形態において、TILは、G-Rexフラスコ(Wilson Wolf Manufacturingから市販されている)において拡大培養することができる。かかる実施形態は、細胞集
団を約5×105細胞/cm2から10×106~30×106細胞/cm2に拡大培養することを可能にする。一実施形態において、この拡大培養は、細胞に新鮮な細胞培養培地を加える(細胞をフィードするとも称される)ことなく行われる。ある実施形態において、これは、G-Rexフラスコ内に約10cmの高さの培地がある限りフィーディングなし
である。ある実施形態において、これにフィーディングはないが、1つ以上のサイトカインが加えられる。一実施形態において、サイトカインを培地と混合する必要なく、サイトカインをボーラスとして添加することができる。かかる容器、装置及び方法は、当技術分野において公知であり、TILの拡大培養に用いられており、米国特許出願公開第2014/0377739A1号、国際公開第2014/210036 A1号、米国特許出願公開第2013/0115617 A1号、国際公開第2013/188427 A1号、米国特許出願公開第2011/0136228 A1号、米国特許第8,809,050 B2号、国際公開第2011/072088 A2号、米国特許出願公開第2016/0208216 A1号、米国特許出願公開第2012/0244133 A1号、国際公開第2012/129201 A1号、米国特許出願公開第2013/0102075 A1号、米国特許第8,956,860 B2号、国際公開第2013/173835 A1号、米国特許出願公開第2015/0175966 A1号(これらの開示は、参照により本明細書に組み込まれる)に記載されるものが含まれる。かかるプロセスは、Jin et al., J. Immunotherapy, 2012, 35:283-292.にも記載されている。
団を約5×105細胞/cm2から10×106~30×106細胞/cm2に拡大培養することを可能にする。一実施形態において、この拡大培養は、細胞に新鮮な細胞培養培地を加える(細胞をフィードするとも称される)ことなく行われる。ある実施形態において、これは、G-Rexフラスコ内に約10cmの高さの培地がある限りフィーディングなし
である。ある実施形態において、これにフィーディングはないが、1つ以上のサイトカインが加えられる。一実施形態において、サイトカインを培地と混合する必要なく、サイトカインをボーラスとして添加することができる。かかる容器、装置及び方法は、当技術分野において公知であり、TILの拡大培養に用いられており、米国特許出願公開第2014/0377739A1号、国際公開第2014/210036 A1号、米国特許出願公開第2013/0115617 A1号、国際公開第2013/188427 A1号、米国特許出願公開第2011/0136228 A1号、米国特許第8,809,050 B2号、国際公開第2011/072088 A2号、米国特許出願公開第2016/0208216 A1号、米国特許出願公開第2012/0244133 A1号、国際公開第2012/129201 A1号、米国特許出願公開第2013/0102075 A1号、米国特許第8,956,860 B2号、国際公開第2013/173835 A1号、米国特許出願公開第2015/0175966 A1号(これらの開示は、参照により本明細書に組み込まれる)に記載されるものが含まれる。かかるプロセスは、Jin et al., J. Immunotherapy, 2012, 35:283-292.にも記載されている。
I.任意選択によるTIL遺伝子改変
[00645] 一部の実施形態において、TILは、任意選択により、限定はされないが、
高親和性T細胞受容体(TCR)、例えばMAGE-1、HER2若しくはNY-ESO-1などの腫瘍関連抗原を標的とするTCR又は腫瘍関連細胞表面分子(例えば、メソテリン)若しくは系統限定的細胞表面分子(例えば、CD19)に結合するキメラ抗原受容体(CAR)を含め、追加の機能性を含むように遺伝子改変される。
[00645] 一部の実施形態において、TILは、任意選択により、限定はされないが、
高親和性T細胞受容体(TCR)、例えばMAGE-1、HER2若しくはNY-ESO-1などの腫瘍関連抗原を標的とするTCR又は腫瘍関連細胞表面分子(例えば、メソテリン)若しくは系統限定的細胞表面分子(例えば、CD19)に結合するキメラ抗原受容体(CAR)を含め、追加の機能性を含むように遺伝子改変される。
J.任意選択によるTIL凍結保存
[00646] 上記で考察し、且つ図8に提供されるステップA~Eにおいて例示した通り
、TIL拡大培養プロセス全体を通じて数々の時点で凍結保存を行うことができる。一部の実施形態において、(例えば、図8のステップDに従って提供される)第2の拡大培養
後の拡大培養されたTIL集団は、凍結保存することができる。凍結保存は、概して、凍結溶液、例えば85%補体不活性化AB血清及び15%ジメチルスルホキシド(DMSO)中にTIL集団を置くことにより達成され得る。この溶液中の細胞を極低温バイアルに入れ、-80℃で24時間貯蔵し、任意選択により凍結保存のため気体窒素フリーザーに移す。Sadeghi, et al., Acta Oncologica 2013, 52, 978-986を参照されたい。一部の実施形態において、TILは、5%DMSO中に凍結保存される。一部の実施形態において、TILは、細胞培養培地+5%DMSO中に凍結保存される。一部の実施形態において、TILは、実施例8及び9に提供される方法に従って凍結保存される。
[00646] 上記で考察し、且つ図8に提供されるステップA~Eにおいて例示した通り
、TIL拡大培養プロセス全体を通じて数々の時点で凍結保存を行うことができる。一部の実施形態において、(例えば、図8のステップDに従って提供される)第2の拡大培養
後の拡大培養されたTIL集団は、凍結保存することができる。凍結保存は、概して、凍結溶液、例えば85%補体不活性化AB血清及び15%ジメチルスルホキシド(DMSO)中にTIL集団を置くことにより達成され得る。この溶液中の細胞を極低温バイアルに入れ、-80℃で24時間貯蔵し、任意選択により凍結保存のため気体窒素フリーザーに移す。Sadeghi, et al., Acta Oncologica 2013, 52, 978-986を参照されたい。一部の実施形態において、TILは、5%DMSO中に凍結保存される。一部の実施形態において、TILは、細胞培養培地+5%DMSO中に凍結保存される。一部の実施形態において、TILは、実施例8及び9に提供される方法に従って凍結保存される。
[00647] 適切な場合、細胞をフリーザーから取り出し、37℃の水浴中で溶液の約5
分の4が解凍されるまで解凍する。細胞は、概して完全培地中に再懸濁され、任意選択により1回以上洗浄される。一部の実施形態において、当技術分野において公知の通りに解凍TILをカウントし、生存率に関して評価することができる。
分の4が解凍されるまで解凍する。細胞は、概して完全培地中に再懸濁され、任意選択により1回以上洗浄される。一部の実施形態において、当技術分野において公知の通りに解凍TILをカウントし、生存率に関して評価することができる。
K.拡大培養されたTILの表現型特徴付けの方法
[00648] グランザイムB産生:グランザイムBは、TILが標的細胞を死滅させる能
力の別の尺度である。CD3、CD28及びCD137/4-1BBに対する抗体を使用して上記に記載した通り再刺激した培地上清について、そのグランザイムBレベルも、Human Granzyme B DuoSet ELISA Kit(R & D Systems、Minneapolis, MN)を製造者の指示
に従って使用して評価した。一部の実施形態において、第2の拡大培養TIL又は第2の追加の拡大培養TIL(例えば、reREP TILと称されるTILを含め、図8のステップDに記載されるものなど)は、グランザイムB産生が増加する。
[00648] グランザイムB産生:グランザイムBは、TILが標的細胞を死滅させる能
力の別の尺度である。CD3、CD28及びCD137/4-1BBに対する抗体を使用して上記に記載した通り再刺激した培地上清について、そのグランザイムBレベルも、Human Granzyme B DuoSet ELISA Kit(R & D Systems、Minneapolis, MN)を製造者の指示
に従って使用して評価した。一部の実施形態において、第2の拡大培養TIL又は第2の追加の拡大培養TIL(例えば、reREP TILと称されるTILを含め、図8のステップDに記載されるものなど)は、グランザイムB産生が増加する。
[00649] 一部の実施形態において、テロメア長は、細胞生存率及び/又は細胞機能の
尺度として使用することができる。一部の実施形態において、テロメアは、図8に具体化された方法以外の方法を含む、本明細書で提供する以外の方法を使用して調製されたTILと比較して、驚くべきことに、本発明によって作製されたTILと同一の長さであった。テロメア長の測定:ゲノムDNA及び細胞学的調製物中のテロメア長を測定するために、様々な方法が使用されてきた。テロメア制限断片(TRF)分析は、テロメア長を測定するための究極の判断基準である(de Lange et al., 1990)。ただし、TRFの主な制
限は、大量のDNA(1.5^g)を必要とすることである。テロメア長の測定に広く使用されている2つの技術、即ち蛍光インサイチューハイブリダイゼーション(FISH;Agilent Technologies、Santa Clara、CA)及び定量的PCRを本発明で用い得る。
尺度として使用することができる。一部の実施形態において、テロメアは、図8に具体化された方法以外の方法を含む、本明細書で提供する以外の方法を使用して調製されたTILと比較して、驚くべきことに、本発明によって作製されたTILと同一の長さであった。テロメア長の測定:ゲノムDNA及び細胞学的調製物中のテロメア長を測定するために、様々な方法が使用されてきた。テロメア制限断片(TRF)分析は、テロメア長を測定するための究極の判断基準である(de Lange et al., 1990)。ただし、TRFの主な制
限は、大量のDNA(1.5^g)を必要とすることである。テロメア長の測定に広く使用されている2つの技術、即ち蛍光インサイチューハイブリダイゼーション(FISH;Agilent Technologies、Santa Clara、CA)及び定量的PCRを本発明で用い得る。
[00650] 一部の実施形態において、TILの健康は、IFN-ガンマ(IFN-γ)
分泌によって測定される。一部の実施形態において、IFN-γ分泌は、活性TILの指標である。一部の実施形態において、IFN-γ産生の効力アッセイが用いられる。IFN-γ産生は、細胞傷害能のもう1つの尺度である。IFN-γ産生は、CD3、CD28及びCD137/4-1BBに対する抗体で刺激されたTILの培地中のサイトカインIFN-γのレベルを決定することで測定できる。これらの刺激したTILからの培地中のIFN-γレベルは、IFN-γ遊離を測定することにより決定できる。
分泌によって測定される。一部の実施形態において、IFN-γ分泌は、活性TILの指標である。一部の実施形態において、IFN-γ産生の効力アッセイが用いられる。IFN-γ産生は、細胞傷害能のもう1つの尺度である。IFN-γ産生は、CD3、CD28及びCD137/4-1BBに対する抗体で刺激されたTILの培地中のサイトカインIFN-γのレベルを決定することで測定できる。これらの刺激したTILからの培地中のIFN-γレベルは、IFN-γ遊離を測定することにより決定できる。
[00651] 一部の実施形態において、標的細胞を溶解するTILの細胞傷害能は、高感
度の用量依存的方法でTILの細胞傷害能を測定するTILアッセイのための生物発光リダイレクト溶解アッセイ(効力アッセイ)に従い、生物発光細胞株P815(クローンG6)とのTILの共培養アッセイを使用して評価された。
度の用量依存的方法でTILの細胞傷害能を測定するTILアッセイのための生物発光リダイレクト溶解アッセイ(効力アッセイ)に従い、生物発光細胞株P815(クローンG6)とのTILの共培養アッセイを使用して評価された。
[00652] 一部の実施形態において、本方法は、上記に記載した通りの方法を用いた、
TIL生存率を評価するためのアッセイを提供する。一部の実施形態において、TILは、例えば、図8に提供される通りのものを含め、上記で考察した通りに拡大培養される。
一部の実施形態において、TILは、生存率の評価前に凍結保存される。一部の実施形態において、生存率評価は、第1の拡大培養、第2の拡大培養及び追加の第2の拡大培養の実施前にTILを解凍することを含む。一部の実施形態において、本方法は、TIL集団の細胞増殖、細胞毒性、細胞死及び/又は他の生存率に関連する事項を評価するためのアッセイを提供する。生存率は、上記に記載されるTIL代謝アッセイのいずれか並びに当技術分野において公知の細胞生存率の評価について公知の任意の方法によって測定することができる。一部の実施形態において、本方法は、図8に例示されるものを含め、本明細書に記載される方法を用いて拡大培養されたTILの細胞増殖、細胞毒性、細胞死及び/又は他の生存率に関連する事項を評価するためのアッセイを提供する。
TIL生存率を評価するためのアッセイを提供する。一部の実施形態において、TILは、例えば、図8に提供される通りのものを含め、上記で考察した通りに拡大培養される。
一部の実施形態において、TILは、生存率の評価前に凍結保存される。一部の実施形態において、生存率評価は、第1の拡大培養、第2の拡大培養及び追加の第2の拡大培養の実施前にTILを解凍することを含む。一部の実施形態において、本方法は、TIL集団の細胞増殖、細胞毒性、細胞死及び/又は他の生存率に関連する事項を評価するためのアッセイを提供する。生存率は、上記に記載されるTIL代謝アッセイのいずれか並びに当技術分野において公知の細胞生存率の評価について公知の任意の方法によって測定することができる。一部の実施形態において、本方法は、図8に例示されるものを含め、本明細書に記載される方法を用いて拡大培養されたTILの細胞増殖、細胞毒性、細胞死及び/又は他の生存率に関連する事項を評価するためのアッセイを提供する。
[00653] 本発明は、TIL生存率を決定するためのアッセイ方法も提供する。一部の
実施形態において、TILは、新鮮に回収されたTIL及び/又は例えば図8に具体化された方法以外の方法を含む、本明細書で提供する以外の方法を使用して調製されたTILと比較して同等の生存率を有する。一部の実施形態において、TILは、新鮮に回収されたTIL及び/又は例えば図8に具体化された方法以外の方法を含む、本明細書で提供する以外の方法を使用して調製されたTILと比較して生存率が増加した。本開示は、腫瘍浸潤リンパ球(TIL)をより大きいTIL集団に拡大培養することにより、TILの生存率をアッセイする方法も提供し、この方法は、
(i)予め拡大培養された第1のTIL集団を得ること;
(ii)IL-2及び任意選択によりOKT-3を含む細胞培養培地中で第1のTIL集団を培養することにより、第1の拡大培養を実施して第2のTIL集団を生じさせること;及び
(iii)第2のTIL集団の細胞培養培地に追加のIL-2、OKT-3及び抗原提示細胞(APC)を補充することにより、第2の拡大培養を実施して第3のTIL集団を生じさせることであって、第3のTIL集団は、第2のTIL集団よりも数において少なくとも100倍多く、第2の拡大培養は、第3のTIL集団を得るために少なくとも14日間にわたって実施され、第3のTIL集団は、生存率について更にアッセイされる、生じさせること
を含む。
実施形態において、TILは、新鮮に回収されたTIL及び/又は例えば図8に具体化された方法以外の方法を含む、本明細書で提供する以外の方法を使用して調製されたTILと比較して同等の生存率を有する。一部の実施形態において、TILは、新鮮に回収されたTIL及び/又は例えば図8に具体化された方法以外の方法を含む、本明細書で提供する以外の方法を使用して調製されたTILと比較して生存率が増加した。本開示は、腫瘍浸潤リンパ球(TIL)をより大きいTIL集団に拡大培養することにより、TILの生存率をアッセイする方法も提供し、この方法は、
(i)予め拡大培養された第1のTIL集団を得ること;
(ii)IL-2及び任意選択によりOKT-3を含む細胞培養培地中で第1のTIL集団を培養することにより、第1の拡大培養を実施して第2のTIL集団を生じさせること;及び
(iii)第2のTIL集団の細胞培養培地に追加のIL-2、OKT-3及び抗原提示細胞(APC)を補充することにより、第2の拡大培養を実施して第3のTIL集団を生じさせることであって、第3のTIL集団は、第2のTIL集団よりも数において少なくとも100倍多く、第2の拡大培養は、第3のTIL集団を得るために少なくとも14日間にわたって実施され、第3のTIL集団は、生存率について更にアッセイされる、生じさせること
を含む。
[00654] 一部の実施形態において、本方法は、
(iv)第3のTIL集団の細胞培養培地に追加のIL-2、追加のOKT-3及び追加のAPCを補充することにより、追加の第2の拡大培養を実施することであって、追加の第2の拡大培養は、ステップ(iii)で得られたよりも大きいTIL集団を得るために少なくとも14日間にわたって実施され、第3の集団は、生存率について更にアッセイされる、実施すること
を更に含む。
(iv)第3のTIL集団の細胞培養培地に追加のIL-2、追加のOKT-3及び追加のAPCを補充することにより、追加の第2の拡大培養を実施することであって、追加の第2の拡大培養は、ステップ(iii)で得られたよりも大きいTIL集団を得るために少なくとも14日間にわたって実施され、第3の集団は、生存率について更にアッセイされる、実施すること
を更に含む。
[00655] 一部の実施形態において、ステップ(i)前に、細胞は、凍結保存される。
[00656] 一部の実施形態において、細胞は、ステップ(i)の実施前に解凍される。
[00657] 一部の実施形態において、分析に十分なTILを得るため、ステップ(iv
)が1~4回繰り返される。
)が1~4回繰り返される。
[00658] 一部の実施形態において、ステップ(i)~(iii)又は(iv)は、約
40日~約50日の期間内に実施される。
40日~約50日の期間内に実施される。
[00659] 一部の実施形態において、ステップ(i)~(iii)又は(iv)は、約
42日~約48日の期間内に実施される。
42日~約48日の期間内に実施される。
[00660] 一部の実施形態において、ステップ(i)~(iii)又は(iv)は、約
42日~約45日の期間内に実施される。
42日~約45日の期間内に実施される。
[00661] 一部の実施形態において、ステップ(i)~(iii)又は(iv)は、約
44日以下で実施される。
44日以下で実施される。
[00662] 一部の実施形態において、ステップ(iii)又は(iv)からの細胞は、
CD4、CD8及びTCRαβを、新鮮に回収された細胞と同程度に発現する。
CD4、CD8及びTCRαβを、新鮮に回収された細胞と同程度に発現する。
[00663] 一部の実施形態において、抗原提示細胞は、末梢血単核球(PBMC)であ
る。
る。
[00664] 一部の実施形態において、PBMCは、ステップ(iii)において9~1
7日目のいずれかに細胞培養物に添加される。
7日目のいずれかに細胞培養物に添加される。
[00665] 一部の実施形態において、APCは、人工APC(aAPC)である。
[00666] 一部の実施形態において、本方法は、高親和性T細胞受容体をコードする核
酸を含む発現ベクターで第1のTIL集団を形質導入するステップを更に含む。
酸を含む発現ベクターで第1のTIL集団を形質導入するステップを更に含む。
[00667] 一部の実施形態において、形質導入ステップは、ステップ(i)前に行われ
る。
る。
[00668] 一部の実施形態において、本方法は、T細胞シグナル伝達分子の少なくとも
1つのエンドドメインに融合した単鎖可変断片抗体を含むキメラ抗原受容体(CAR)をコードする核酸を含む発現ベクターで第1のTIL集団を形質導入するステップを更に含む。
1つのエンドドメインに融合した単鎖可変断片抗体を含むキメラ抗原受容体(CAR)をコードする核酸を含む発現ベクターで第1のTIL集団を形質導入するステップを更に含む。
[00669] 一部の実施形態において、形質導入ステップは、ステップ(i)前に行われ
る。
る。
[00670] 一部の実施形態において、TILは、生存率に関してアッセイされる。
[00671] 一部の実施形態において、TILは、凍結保存後に生存率に関してアッセイ
される。
される。
[00672] 一部の実施形態において、TILは、凍結保存後及びステップ(iv)後に
生存率に関してアッセイされる。
生存率に関してアッセイされる。
[00673] T及びBリンパ球の多様な抗原受容体は、限られているが多数の遺伝子セグ
メントの体細胞組換えによって産生される。V(可変)、D(多様性)、J(結合)及びC(定数)の遺伝子セグメントは、免疫グロブリン及びT細胞受容体(TCR)の結合特異性及び下流側での適用を決定する。本発明は、T細胞レパートリーの多様性を示し、増加させるTILを生成する方法を提供する(ポリクローナル性と称されることがある)。一部の実施形態において、T細胞レパートリーの多様性の増加は、新鮮に回収されたTIL及び/又は例えば図8に具体化された方法以外の方法を含む、本明細書で提供する以外の方法を使用して調製されたTILと比較して生存率が増加した。一部の実施形態において、本方法により得られたTILは、T細胞レパートリー多様性の増加を示す。一部の実施形態において、第1の拡大培養で得られたTILは、T細胞レパートリー多様性の増加
を示す。一部の実施形態において、多様性の増加は、免疫グロブリンの多様性及び/又はT細胞受容体の多様性の増加である。一部の実施形態において、免疫グロブリンの多様性は、免疫グロブリン重鎖にある。一部の実施形態において、免疫グロブリンの多様性は、免疫グロブリン軽鎖にある。一部の実施形態において、多様性は、T細胞受容体にある。一部の実施形態において、多様性は、α、β、γ及びδ受容体からなる群から選択されるT細胞受容体の1つにある。一部の実施形態において、T細胞受容体(TCR)α及び/又はβの発現が増加する。一部の実施形態において、T細胞受容体(TCR)αの発現が増加する。一部の実施形態において、T細胞受容体(TCR)βの発現が増加する。一部の実施形態において、TCRab(即ちTCRα/β)の発現が増加する。
メントの体細胞組換えによって産生される。V(可変)、D(多様性)、J(結合)及びC(定数)の遺伝子セグメントは、免疫グロブリン及びT細胞受容体(TCR)の結合特異性及び下流側での適用を決定する。本発明は、T細胞レパートリーの多様性を示し、増加させるTILを生成する方法を提供する(ポリクローナル性と称されることがある)。一部の実施形態において、T細胞レパートリーの多様性の増加は、新鮮に回収されたTIL及び/又は例えば図8に具体化された方法以外の方法を含む、本明細書で提供する以外の方法を使用して調製されたTILと比較して生存率が増加した。一部の実施形態において、本方法により得られたTILは、T細胞レパートリー多様性の増加を示す。一部の実施形態において、第1の拡大培養で得られたTILは、T細胞レパートリー多様性の増加
を示す。一部の実施形態において、多様性の増加は、免疫グロブリンの多様性及び/又はT細胞受容体の多様性の増加である。一部の実施形態において、免疫グロブリンの多様性は、免疫グロブリン重鎖にある。一部の実施形態において、免疫グロブリンの多様性は、免疫グロブリン軽鎖にある。一部の実施形態において、多様性は、T細胞受容体にある。一部の実施形態において、多様性は、α、β、γ及びδ受容体からなる群から選択されるT細胞受容体の1つにある。一部の実施形態において、T細胞受容体(TCR)α及び/又はβの発現が増加する。一部の実施形態において、T細胞受容体(TCR)αの発現が増加する。一部の実施形態において、T細胞受容体(TCR)βの発現が増加する。一部の実施形態において、TCRab(即ちTCRα/β)の発現が増加する。
[00674] 本開示によれば、TILの生存率をアッセイする方法及び/又は対象への投
与における更なる使用である。一部の実施形態において、腫瘍浸潤リンパ球(TIL)をアッセイする方法は、
(i)第1のTIL集団を得ること;
(ii)IL-2及び任意選択によりOKT-3を含む細胞培養培地中で第1のTIL集団を培養することにより、第1の拡大培養を実施して第2のTIL集団を生じさせること;及び
(iii)第2のTIL集団の細胞培養培地に追加のIL-2、OKT-3及び抗原提示細胞(APC)を補充することにより、第2の拡大培養を実施して第3のTIL集団を生じさせることであって、第3のTIL集団は、第2のTIL集団よりも数において少なくとも50倍多い、生じさせること;
(iv)第3のTIL集団を回収し、洗浄し、且つ凍結保存すること;
(v)凍結保存TILを極低温で貯蔵すること;
(vi)第3のTIL集団を解凍して、解凍された第3のTIL集団を提供すること;及び
(vii)第3の集団の細胞培養培地にIL-2、OKT-3及びAPCを添加することにより、解凍された第3のTIL集団の一部の追加の第2の拡大培養を少なくとも3日の追加的拡大培養期間(reREP期間と称される場合もある)にわたって実施することであって、この第3の拡大培養は、第4のTIL集団を得るために実施され、第4のTIL集団中のTIL数は、比を求めるために第3のTIL集団中のTIL数と比較される、実施すること;
(viii)ステップ(vii)の比に基づき、解凍されたTIL集団が患者への投与に好適であるかどうかを決定すること;
(ix)ステップ(viii)において、第4のTIL集団中のTIL数と第3のTIL集団中のTIL数との比が5:1より大きいと決定されるとき、治療有効投与量の解凍された第3のTIL集団を患者に投与すること
を含む。
与における更なる使用である。一部の実施形態において、腫瘍浸潤リンパ球(TIL)をアッセイする方法は、
(i)第1のTIL集団を得ること;
(ii)IL-2及び任意選択によりOKT-3を含む細胞培養培地中で第1のTIL集団を培養することにより、第1の拡大培養を実施して第2のTIL集団を生じさせること;及び
(iii)第2のTIL集団の細胞培養培地に追加のIL-2、OKT-3及び抗原提示細胞(APC)を補充することにより、第2の拡大培養を実施して第3のTIL集団を生じさせることであって、第3のTIL集団は、第2のTIL集団よりも数において少なくとも50倍多い、生じさせること;
(iv)第3のTIL集団を回収し、洗浄し、且つ凍結保存すること;
(v)凍結保存TILを極低温で貯蔵すること;
(vi)第3のTIL集団を解凍して、解凍された第3のTIL集団を提供すること;及び
(vii)第3の集団の細胞培養培地にIL-2、OKT-3及びAPCを添加することにより、解凍された第3のTIL集団の一部の追加の第2の拡大培養を少なくとも3日の追加的拡大培養期間(reREP期間と称される場合もある)にわたって実施することであって、この第3の拡大培養は、第4のTIL集団を得るために実施され、第4のTIL集団中のTIL数は、比を求めるために第3のTIL集団中のTIL数と比較される、実施すること;
(viii)ステップ(vii)の比に基づき、解凍されたTIL集団が患者への投与に好適であるかどうかを決定すること;
(ix)ステップ(viii)において、第4のTIL集団中のTIL数と第3のTIL集団中のTIL数との比が5:1より大きいと決定されるとき、治療有効投与量の解凍された第3のTIL集団を患者に投与すること
を含む。
[00675] 一部の実施形態において、追加の拡大培養期間(reREP期間と称される
場合もある)は、第4のTIL集団中のTIL数と第3のTIL集団中のTIL数との比が50:1より大きくなるまで実施される。
場合もある)は、第4のTIL集団中のTIL数と第3のTIL集団中のTIL数との比が50:1より大きくなるまで実施される。
[00676] 一部の実施形態において、治療有効投与量のために十分なTILの数は、約
2.3×1010~約13.7×1010個である。
2.3×1010~約13.7×1010個である。
[00677] 一部の実施形態において、ステップ(i)~(vii)は、約40日~約5
0日の期間内に実施される。一部の実施形態において、ステップ(i)~(vii)は、約42日~約48日の期間内に実施される。一部の実施形態において、ステップ(i)~(vii)は、約42日~約45日の期間内に実施される。一部の実施形態において、ステップ(i)~(vii)は、約44日以下で実施される。
0日の期間内に実施される。一部の実施形態において、ステップ(i)~(vii)は、約42日~約48日の期間内に実施される。一部の実施形態において、ステップ(i)~(vii)は、約42日~約45日の期間内に実施される。一部の実施形態において、ステップ(i)~(vii)は、約44日以下で実施される。
[00678] 一部の実施形態において、ステップ(iii)又は(vii)からの細胞は
、CD4、CD8及びTCRαβを、新鮮に回収された細胞と同程度に発現する。一部の実施形態において、細胞は、TILである。
、CD4、CD8及びTCRαβを、新鮮に回収された細胞と同程度に発現する。一部の実施形態において、細胞は、TILである。
[00679] 一部の実施形態において、抗原提示細胞は、末梢血単核球(PBMC)であ
る。一部の実施形態において、PBMCは、ステップ(iii)において9~17日目のいずれかに細胞培養物に添加される。
る。一部の実施形態において、PBMCは、ステップ(iii)において9~17日目のいずれかに細胞培養物に添加される。
[00680] 一部の実施形態において、APCは、人工APC(aAPC)である。
[00681] 一部の実施形態において、高親和性T細胞受容体をコードする核酸を含む発
現ベクターで第1のTIL集団を形質導入するステップである。
現ベクターで第1のTIL集団を形質導入するステップである。
[00682] 一部の実施形態において、形質導入ステップは、ステップ(i)前に行われ
る。
る。
[00683] 一部の実施形態において、T細胞シグナル伝達分子の少なくとも1つのエン
ドドメインに融合した単鎖可変断片抗体を含むキメラ抗原受容体(CAR)をコードする核酸を含む発現ベクターで第1のTIL集団を形質導入するステップである。
ドドメインに融合した単鎖可変断片抗体を含むキメラ抗原受容体(CAR)をコードする核酸を含む発現ベクターで第1のTIL集団を形質導入するステップである。
[00684] 一部の実施形態において、形質導入ステップは、ステップ(i)前に行われ
る。
る。
[00685] 一部の実施形態において、TILは、ステップ(vii)後に生存率に関し
てアッセイされる。
てアッセイされる。
[00686] 本開示は、TILをアッセイする更なる方法も提供する。一部の実施形態に
おいて、本開示は、TILをアッセイする方法を提供し、この方法は、
(i)第1の凍結保存TIL集団の一部を得ること;
(ii)第1の凍結保存TIL集団の一部を解凍すること;
(iii)IL-2、OKT-3及び抗原提示細胞(APC)を含む細胞培養培地中で第1のTIL集団の一部を少なくとも3日の追加的拡大培養期間(reREP期間と称される場合もある)にわたって培養することにより、第1の拡大培養を実施して第2のTIL集団を生じさせることであって、第1のTIL集団からの一部は、比を求めるために第2のTIL集団と比較され、第2のTIL集団中のTIL数と第1のTIL集団の一部のTIL数との比は、5:1より大きいこと、生じさせること;
(iv)ステップ(iii)の比に基づき、第1のTIL集団が患者への治療的投与における使用に好適であるかどうかを決定すること;
(v)ステップ(iv)において、第2のTIL集団中のTIL数と第1のTIL集団中のTIL数との比が5:1より大きいと決定されるとき、第1のTIL集団が治療的投与における使用に好適であると決定すること
を含む。
おいて、本開示は、TILをアッセイする方法を提供し、この方法は、
(i)第1の凍結保存TIL集団の一部を得ること;
(ii)第1の凍結保存TIL集団の一部を解凍すること;
(iii)IL-2、OKT-3及び抗原提示細胞(APC)を含む細胞培養培地中で第1のTIL集団の一部を少なくとも3日の追加的拡大培養期間(reREP期間と称される場合もある)にわたって培養することにより、第1の拡大培養を実施して第2のTIL集団を生じさせることであって、第1のTIL集団からの一部は、比を求めるために第2のTIL集団と比較され、第2のTIL集団中のTIL数と第1のTIL集団の一部のTIL数との比は、5:1より大きいこと、生じさせること;
(iv)ステップ(iii)の比に基づき、第1のTIL集団が患者への治療的投与における使用に好適であるかどうかを決定すること;
(v)ステップ(iv)において、第2のTIL集団中のTIL数と第1のTIL集団中のTIL数との比が5:1より大きいと決定されるとき、第1のTIL集団が治療的投与における使用に好適であると決定すること
を含む。
[00687] 一部の実施形態において、第2のTIL集団中のTIL数と第1のTIL集
団の一部のTIL数との比は、50:1より大きい。
団の一部のTIL数との比は、50:1より大きい。
[00688] 一部の実施形態において、本方法は、本明細書に提供される任意の実施形態
に記載される通りの方法により、ステップ(i)からの第1の凍結保存TIL集団全体の拡大培養を実施することを更に含む。
に記載される通りの方法により、ステップ(i)からの第1の凍結保存TIL集団全体の拡大培養を実施することを更に含む。
[00689] 一部の実施形態において、本方法は、ステップ(i)からの第1の凍結保存
TIL集団全体を患者に投与することを更に含む。
TIL集団全体を患者に投与することを更に含む。
L.TIL製造用閉鎖系
[00690] 本発明は、TIL培養プロセス中の閉鎖系の使用を提供する。かかる閉鎖系
は、微生物汚染の防止及び/又は削減を可能にし、使用するフラスコの数が少なくなり、コスト削減が可能となる。一部の実施形態において、閉鎖系は、2つの容器を使用する。
[00690] 本発明は、TIL培養プロセス中の閉鎖系の使用を提供する。かかる閉鎖系
は、微生物汚染の防止及び/又は削減を可能にし、使用するフラスコの数が少なくなり、コスト削減が可能となる。一部の実施形態において、閉鎖系は、2つの容器を使用する。
[00691] かかる閉鎖系は、当技術分野で公知であり、例えばhttp://www.fda.gov/cber/guidelines.htm及びhttps://www.fda.gov/BiologicsBloodVaccines/GuidanceComplianceRegulatoryInformation/Guidances/Blood/ucm076779.htm.に記載されている。
[00692] 一部の実施形態において、閉鎖系は、例えば、実施例16に記載されるよう
なルアーロック及びヒートシール系を含む。一部の実施形態において、系の無菌性及び閉鎖性を維持するために、閉鎖系は、滅菌条件下でシリンジを介してアクセスされる。一部の実施形態において、実施例16に記載されるような閉鎖系が使用される。一部の実施形態において、TILは、セクション8.14「最終製剤及び充填」の実施例16に記載される方法に従って最終製品製剤容器中に製剤化される。
なルアーロック及びヒートシール系を含む。一部の実施形態において、系の無菌性及び閉鎖性を維持するために、閉鎖系は、滅菌条件下でシリンジを介してアクセスされる。一部の実施形態において、実施例16に記載されるような閉鎖系が使用される。一部の実施形態において、TILは、セクション8.14「最終製剤及び充填」の実施例16に記載される方法に従って最終製品製剤容器中に製剤化される。
[00693] FDAのウェブサイトで提供されているように、滅菌方法を備えた閉鎖系は
、公知であり、詳細に記載されている。https://www.fda.gov/BiologicsBloodVaccines/GuidanceComplianceRegulatoryInformation/Guidances/Blood/ucm076779.htmを参照されたい。上記で参照され、以下の関連箇所において提供されている。
、公知であり、詳細に記載されている。https://www.fda.gov/BiologicsBloodVaccines/GuidanceComplianceRegulatoryInformation/Guidances/Blood/ucm076779.htmを参照されたい。上記で参照され、以下の関連箇所において提供されている。
序論
[00694] 滅菌接続装置(STCD)は、互換性のある2つの配管間に滅菌溶接を産生
する。この手順により、様々な直径の容器及びチューブを滅菌接続できる。このガイダンスでは、これらの装置の使用に関する推奨管理基準及び手順について記載する。このガイダンスは、滅菌接続装置の製造業者がマーケティングの承認又は認可を得るためにFDAに提出しなければならないデータ又は情報は取り扱っていない。また、表示方法において許可されていない目的で承認又は認可された滅菌接続装置を使用すると、米連邦食品医薬品化粧品法下で装置が粗悪品及び不正表示品と見なされる可能性があることに注意することも重要である。
[00694] 滅菌接続装置(STCD)は、互換性のある2つの配管間に滅菌溶接を産生
する。この手順により、様々な直径の容器及びチューブを滅菌接続できる。このガイダンスでは、これらの装置の使用に関する推奨管理基準及び手順について記載する。このガイダンスは、滅菌接続装置の製造業者がマーケティングの承認又は認可を得るためにFDAに提出しなければならないデータ又は情報は取り扱っていない。また、表示方法において許可されていない目的で承認又は認可された滅菌接続装置を使用すると、米連邦食品医薬品化粧品法下で装置が粗悪品及び不正表示品と見なされる可能性があることに注意することも重要である。
[00695] 一部の実施形態において、閉鎖系は、腫瘍断片が得られた時点から、TIL
が、患者への投与又は凍結保存の準備が整うまで1つの容器を使用する。一部の実施形態において、2つの容器が使用される場合、第1の容器は、閉鎖型Gコンテナであり、TIL集団は、遠心され、第1の閉鎖型Gコンテナを開かずに輸注バッグに移される。一部の実施形態において、2つの容器が使用される場合、輸注バッグは、HypoThermosol含有輸
注バッグである。閉鎖系又は閉鎖TIL細胞培養系は、腫瘍サンプル及び/又は腫瘍断片が追加されると、系が外側から確実に密閉され、細菌、真菌及び/又は他の微生物汚染がない閉鎖環境を形成する。
が、患者への投与又は凍結保存の準備が整うまで1つの容器を使用する。一部の実施形態において、2つの容器が使用される場合、第1の容器は、閉鎖型Gコンテナであり、TIL集団は、遠心され、第1の閉鎖型Gコンテナを開かずに輸注バッグに移される。一部の実施形態において、2つの容器が使用される場合、輸注バッグは、HypoThermosol含有輸
注バッグである。閉鎖系又は閉鎖TIL細胞培養系は、腫瘍サンプル及び/又は腫瘍断片が追加されると、系が外側から確実に密閉され、細菌、真菌及び/又は他の微生物汚染がない閉鎖環境を形成する。
[00696] 一部の実施形態において、微生物汚染の減少は、約5%~約100%である
。一部の実施形態において、微生物汚染の減少は、約5%~約95%である。一部の実施形態において、微生物汚染の減少は、約5%~約90%である。一部の実施形態において、微生物汚染の減少は、約10%~約90%である。一部の実施形態において、微生物汚染の減少は、約15%~約85%である。一部の実施形態において、微生物汚染の減少は、約5%、約10%、約15%、約20%、約25%、約30%、約35%、約40%、
約45%、約50%、約55%、約60%、約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約95%、約97%、約98%、約99%又は約100%である。
。一部の実施形態において、微生物汚染の減少は、約5%~約95%である。一部の実施形態において、微生物汚染の減少は、約5%~約90%である。一部の実施形態において、微生物汚染の減少は、約10%~約90%である。一部の実施形態において、微生物汚染の減少は、約15%~約85%である。一部の実施形態において、微生物汚染の減少は、約5%、約10%、約15%、約20%、約25%、約30%、約35%、約40%、
約45%、約50%、約55%、約60%、約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約95%、約97%、約98%、約99%又は約100%である。
[00697] 閉鎖系は、微生物汚染の不在下及び/又は大幅に減少させ、TILを成長さ
せる。
せる。
[00698] 更に、TIL細胞培養環境のpH、二酸化炭素分圧及び酸素分圧は、細胞が
培養されるにつれてそれぞれ変化する。したがって、細胞培養に適した培地が流通していても、TIL成長に最適な環境として閉鎖環境を常に維持する必要がある。このため、閉鎖環境の培地内のpH、二酸化炭素分圧及び酸素分圧の物理的要因は、センサーによって監視され、そのセンサーの信号は、培養環境の入口に設置されたガス交換器の制御に使用され、閉鎖環境のガス分圧は、細胞培養環境を最適化するため、培地の変化に従ってリアルタイムで調整されることが望ましい。一部の実施形態において、本発明は、閉鎖環境への入口に、閉鎖環境のpH、二酸化炭素分圧及び酸素分圧を測定し、監視装置からの信号に基づいてガス濃度を自動的に調整することにより、細胞培養環境を最適化する監視装置を備えたガス交換器を一体化した閉鎖細胞培養系を提供する。
培養されるにつれてそれぞれ変化する。したがって、細胞培養に適した培地が流通していても、TIL成長に最適な環境として閉鎖環境を常に維持する必要がある。このため、閉鎖環境の培地内のpH、二酸化炭素分圧及び酸素分圧の物理的要因は、センサーによって監視され、そのセンサーの信号は、培養環境の入口に設置されたガス交換器の制御に使用され、閉鎖環境のガス分圧は、細胞培養環境を最適化するため、培地の変化に従ってリアルタイムで調整されることが望ましい。一部の実施形態において、本発明は、閉鎖環境への入口に、閉鎖環境のpH、二酸化炭素分圧及び酸素分圧を測定し、監視装置からの信号に基づいてガス濃度を自動的に調整することにより、細胞培養環境を最適化する監視装置を備えたガス交換器を一体化した閉鎖細胞培養系を提供する。
[00699] 一部の実施形態において、閉鎖環境内の圧力は、連続的又は断続的に制御さ
れる。即ち、閉鎖環境内の圧力は、例えば、圧力維持装置によって変化させることができ、即ち空間が陽圧状態のTILの成長に適していることを保証するか、又は陰圧状態の流体の滲出を促進し、したがって細胞成長を促進することを確実にする。更に、断続的に負圧を加えることにより、閉鎖環境の容積の一時的な収縮によって閉鎖環境内の循環液を均一且つ効率的に交換することが可能である。
れる。即ち、閉鎖環境内の圧力は、例えば、圧力維持装置によって変化させることができ、即ち空間が陽圧状態のTILの成長に適していることを保証するか、又は陰圧状態の流体の滲出を促進し、したがって細胞成長を促進することを確実にする。更に、断続的に負圧を加えることにより、閉鎖環境の容積の一時的な収縮によって閉鎖環境内の循環液を均一且つ効率的に交換することが可能である。
[00700] 一部の実施形態において、TILの成長に最適な培養成分を置換又は追加す
ることができ、IL-2及び/又はOKT3などの要因並びに組み合わせを追加し得る。
ることができ、IL-2及び/又はOKT3などの要因並びに組み合わせを追加し得る。
C.細胞培養
[00701] ある実施形態において、TILの拡大培養方法は、上記で考察され図8で例
示されているものを含み、約5,000mL~約25,000mLの細胞培養培地、約5,000mL~約10,000mLの細胞培養培地又は約5,800mL~約8,700mLの細胞培養培地を使用することを含み得る。一部の実施形態において、培地は、例えば、実施例21に記載されるように、無血清培地である。一部の実施形態において、第1の拡大培養の培地は、無血清である。一部の実施形態において、第2の拡大培養の培地は、無血清である。一部の実施形態において、第1及び第2の拡大培養の培地は、両方とも無血清である。ある実施形態において、TIL数の拡大には1種類以下の細胞培養培地が使用される。任意の好適な細胞培養培地、例えばAIM-V細胞培養培地(L-グルタミン、
50μM硫酸ストレプトマイシン及び10μM硫酸ゲンタマイシン)細胞培養培地(Invitrogen、Carlsbad CA)を使用し得る。この点に関して、本発明の方法では、有利には、
TIL数の拡大に必要な培地の量及び培地の種類の数が減少する。一実施形態において、TILの数を拡大することは、3日又は4日に1回以下の頻度で細胞にフィードすることを含み得る。ガス透過性容器内の細胞数を増やすことは、細胞を拡大培養するのに必要なフィード頻度を減らすことによって細胞数を増やすのに必要な手順を単純化する。
[00701] ある実施形態において、TILの拡大培養方法は、上記で考察され図8で例
示されているものを含み、約5,000mL~約25,000mLの細胞培養培地、約5,000mL~約10,000mLの細胞培養培地又は約5,800mL~約8,700mLの細胞培養培地を使用することを含み得る。一部の実施形態において、培地は、例えば、実施例21に記載されるように、無血清培地である。一部の実施形態において、第1の拡大培養の培地は、無血清である。一部の実施形態において、第2の拡大培養の培地は、無血清である。一部の実施形態において、第1及び第2の拡大培養の培地は、両方とも無血清である。ある実施形態において、TIL数の拡大には1種類以下の細胞培養培地が使用される。任意の好適な細胞培養培地、例えばAIM-V細胞培養培地(L-グルタミン、
50μM硫酸ストレプトマイシン及び10μM硫酸ゲンタマイシン)細胞培養培地(Invitrogen、Carlsbad CA)を使用し得る。この点に関して、本発明の方法では、有利には、
TIL数の拡大に必要な培地の量及び培地の種類の数が減少する。一実施形態において、TILの数を拡大することは、3日又は4日に1回以下の頻度で細胞にフィードすることを含み得る。ガス透過性容器内の細胞数を増やすことは、細胞を拡大培養するのに必要なフィード頻度を減らすことによって細胞数を増やすのに必要な手順を単純化する。
[00702] 一実施形態において、第1及び/又は第2のガス透過性容器内の細胞培養培
地は、ろ過されていない。ろ過されていない細胞培養培地の使用は、細胞数を拡大培養させるために必要な手順を単純化し得る。一実施形態において、第1及び/又は第2のガス透過性容器内の細胞培養培地は、β-メルカプトエタノール(BME)を欠いている。
地は、ろ過されていない。ろ過されていない細胞培養培地の使用は、細胞数を拡大培養させるために必要な手順を単純化し得る。一実施形態において、第1及び/又は第2のガス透過性容器内の細胞培養培地は、β-メルカプトエタノール(BME)を欠いている。
[00703] ある実施形態において、哺乳類から腫瘍組織サンプルを得ること;細胞培養
培地が中に入った第1のガス透過性容器内で腫瘍組織サンプルを培養すること;腫瘍組織サンプルからTILを得ること;細胞培養培地を含有する第2のガス透過性容器内でTIL数を約7~14日間、例えば約11日間拡大することを含む本方法の所要期間である。一部の実施形態において、プレREPは、約7~14日間、例えば約11日間である。一部の実施形態において、REPは、約7~14日間、例えば約11日間である。
培地が中に入った第1のガス透過性容器内で腫瘍組織サンプルを培養すること;腫瘍組織サンプルからTILを得ること;細胞培養培地を含有する第2のガス透過性容器内でTIL数を約7~14日間、例えば約11日間拡大することを含む本方法の所要期間である。一部の実施形態において、プレREPは、約7~14日間、例えば約11日間である。一部の実施形態において、REPは、約7~14日間、例えば約11日間である。
[00704] 一実施形態において、TILは、ガス透過性容器内で拡大培養する。ガス透
過性容器は、米国特許出願公開第2005/0106717 A1号(この開示は、参照により本明細書に組み込まれる)に記載されるものを含め、当技術分野において公知の方法、組成物及び装置を用いたPBMCを使用したTILの拡大培養に用いられている。一実施形態において、TILは、ガス透過性バッグ内で拡大培養される。一実施形態において、TILは、Xuri Cell Expansion System W25(GE Healthcare)など、ガス透過性バ
ッグ内でTILを拡大培養する細胞拡大培養システムを使用して拡大培養される。一実施形態において、TILは、Xuri Cell Expansion System W5(GE Healthcare)としても知られるWAVE Bioreactor Systemなど、ガス透過性バッグ内でTILを拡大培養する細胞拡大培養システムを使用して拡大培養される。一実施形態において、細胞拡大培養システムは、約100mL、約200mL、約300mL、約400mL、約500mL、約600mL、約700mL、約800mL、約900mL、約1L、約2L、約3L、約4L、約5L、約6L、約7L、約8L、約9L及び約10Lからなる群から選択される容積を有するガス透過性細胞バッグを含む。
過性容器は、米国特許出願公開第2005/0106717 A1号(この開示は、参照により本明細書に組み込まれる)に記載されるものを含め、当技術分野において公知の方法、組成物及び装置を用いたPBMCを使用したTILの拡大培養に用いられている。一実施形態において、TILは、ガス透過性バッグ内で拡大培養される。一実施形態において、TILは、Xuri Cell Expansion System W25(GE Healthcare)など、ガス透過性バ
ッグ内でTILを拡大培養する細胞拡大培養システムを使用して拡大培養される。一実施形態において、TILは、Xuri Cell Expansion System W5(GE Healthcare)としても知られるWAVE Bioreactor Systemなど、ガス透過性バッグ内でTILを拡大培養する細胞拡大培養システムを使用して拡大培養される。一実施形態において、細胞拡大培養システムは、約100mL、約200mL、約300mL、約400mL、約500mL、約600mL、約700mL、約800mL、約900mL、約1L、約2L、約3L、約4L、約5L、約6L、約7L、約8L、約9L及び約10Lからなる群から選択される容積を有するガス透過性細胞バッグを含む。
[00705] 一実施形態において、TILは、G-Rexフラスコ(Wilson Wolf Manufacturingから市販されている)において拡大培養することができる。そのような実施形態は、細
胞集団が約5×105細胞/cm2から10×106~30×106細胞/cm2に拡大培養することを可能にする。一実施形態において、これは、フィードなしである。一実施形態において、これは、G-Rexフラスコ内に約10cmの高さの培地がある限りフィード
なしである。一実施形態において、これにフィードはないが、1つ以上のサイトカインが加えられる。一実施形態において、サイトカインを培地と混合する必要なく、サイトカインをボーラスとして添加することができる。かかる容器、装置及び方法は、当技術分野において公知であり、TILの拡大培養に用いられており、米国特許出願公開第2014/0377739A1号、国際公開第2014/210036 A1号、米国特許出願公開第2013/0115617 A1号、国際公開第2013/188427 A1号、米国特許出願公開第2011/0136228 A1号、米国特許第8,809,050 B2号、国際公開第2011/072088 A2号、米国特許出願公開第2016/0208216 A1号、米国特許出願公開第2012/0244133 A1号、国際公開第2012/129201 A1号、米国特許出願公開第2013/0102075 A1号、米国特許第8,956,860 B2号、国際公開第2013/173835 A1号、米国特許出願公開第2015/0175966 A1号(これらの開示は、参照により本明細書に組み込まれる)に記載されるものが含まれる。かかるプロセスは、Jin et al., J. Immunotherapy, 2012, 35:283-292にも記載されている。
胞集団が約5×105細胞/cm2から10×106~30×106細胞/cm2に拡大培養することを可能にする。一実施形態において、これは、フィードなしである。一実施形態において、これは、G-Rexフラスコ内に約10cmの高さの培地がある限りフィード
なしである。一実施形態において、これにフィードはないが、1つ以上のサイトカインが加えられる。一実施形態において、サイトカインを培地と混合する必要なく、サイトカインをボーラスとして添加することができる。かかる容器、装置及び方法は、当技術分野において公知であり、TILの拡大培養に用いられており、米国特許出願公開第2014/0377739A1号、国際公開第2014/210036 A1号、米国特許出願公開第2013/0115617 A1号、国際公開第2013/188427 A1号、米国特許出願公開第2011/0136228 A1号、米国特許第8,809,050 B2号、国際公開第2011/072088 A2号、米国特許出願公開第2016/0208216 A1号、米国特許出願公開第2012/0244133 A1号、国際公開第2012/129201 A1号、米国特許出願公開第2013/0102075 A1号、米国特許第8,956,860 B2号、国際公開第2013/173835 A1号、米国特許出願公開第2015/0175966 A1号(これらの開示は、参照により本明細書に組み込まれる)に記載されるものが含まれる。かかるプロセスは、Jin et al., J. Immunotherapy, 2012, 35:283-292にも記載されている。
D.任意選択のTIL遺伝子改変
[00706] 一部の実施形態において、TILは、任意選択により、限定はされないが、
高親和性T細胞受容体(TCR)、例えばMAGE-1、HER2若しくはNY-ESO-1などの腫瘍関連抗原を標的とするTCR又は腫瘍関連細胞表面分子(例えば、メソテリン)若しくは系統限定的細胞表面分子(例えば、CD19)に結合するキメラ抗原受容体(CAR)を含め、追加の機能性を含むように遺伝子改変される。
[00706] 一部の実施形態において、TILは、任意選択により、限定はされないが、
高親和性T細胞受容体(TCR)、例えばMAGE-1、HER2若しくはNY-ESO-1などの腫瘍関連抗原を標的とするTCR又は腫瘍関連細胞表面分子(例えば、メソテリン)若しくは系統限定的細胞表面分子(例えば、CD19)に結合するキメラ抗原受容体(CAR)を含め、追加の機能性を含むように遺伝子改変される。
[00707] E.任意選択のTIL凍結保存
[00708] バルクTIL集団又は拡大培養されたTIL集団は、任意選択により凍結保
存できる。一部の実施形態において、治療用TIL集団で凍結保存が行われる。一部の実施形態において、凍結保存は、第2の拡大培養後に回収されたTILで生じる。一部の実施形態において、図8の例示的ステップFのTILで凍結保存が行われる。一部の実施形態において、TILは輸注バッグ中に凍結保存される。一部の実施形態において、TILは、輸注バッグでの置換前に凍結保存される。一部の実施形態において、TILは、凍結保存されるが輸注バッグ中には置かれない。一部の実施形態において、凍結保存は凍結保存培地を使用して実施される。一部の実施形態において、凍結保存培地は、ジメチルスルホキシド(DMSO)を含有する。これは、概して、凍結溶液、例えば85%補体不活性化AB血清及び15%ジメチルスルホキシド(DMSO)中にTIL集団を入れることにより達成される。この溶液中の細胞を極低温バイアルに入れ、-80℃で24時間貯蔵し、任意選択により凍結保存のため気体窒素フリーザーに移す。Sadeghi, et al., Acta Oncologica 2013, 52, 978-986を参照されたい。
[00708] バルクTIL集団又は拡大培養されたTIL集団は、任意選択により凍結保
存できる。一部の実施形態において、治療用TIL集団で凍結保存が行われる。一部の実施形態において、凍結保存は、第2の拡大培養後に回収されたTILで生じる。一部の実施形態において、図8の例示的ステップFのTILで凍結保存が行われる。一部の実施形態において、TILは輸注バッグ中に凍結保存される。一部の実施形態において、TILは、輸注バッグでの置換前に凍結保存される。一部の実施形態において、TILは、凍結保存されるが輸注バッグ中には置かれない。一部の実施形態において、凍結保存は凍結保存培地を使用して実施される。一部の実施形態において、凍結保存培地は、ジメチルスルホキシド(DMSO)を含有する。これは、概して、凍結溶液、例えば85%補体不活性化AB血清及び15%ジメチルスルホキシド(DMSO)中にTIL集団を入れることにより達成される。この溶液中の細胞を極低温バイアルに入れ、-80℃で24時間貯蔵し、任意選択により凍結保存のため気体窒素フリーザーに移す。Sadeghi, et al., Acta Oncologica 2013, 52, 978-986を参照されたい。
[00709] 適切な場合、細胞をフリーザーから取り出し、37℃の水浴中で溶液の約5
分の4が解凍されるまで解凍する。細胞は、概して完全培地中に再懸濁され、任意選択により1回以上洗浄される。一部の実施形態において、当技術分野において公知の通り解凍TILをカウントし、生存率に関して評価することができる。
分の4が解凍されるまで解凍する。細胞は、概して完全培地中に再懸濁され、任意選択により1回以上洗浄される。一部の実施形態において、当技術分野において公知の通り解凍TILをカウントし、生存率に関して評価することができる。
[00710] 好ましい実施形態において、TILの集団はCS10凍結保存培地(CryoStor 10、BioLife Solutions)を用いて凍結保存される。好ましい実施形態において、TI
Lの集団は凍結保存培地(ジメチルスルホキシド(DMSO)を含有する)を用いて凍結保存される。好ましい実施形態において、TILの集団は、1:1(容積:容積)の比のCS10及び細胞培養培地を用いて凍結保存される。好ましい実施形態において、TILの集団は、約1:1(容積:容積)の比のCS10及び細胞培養培地を使用し、更に追加のIL-2を含んで凍結保存される。
Lの集団は凍結保存培地(ジメチルスルホキシド(DMSO)を含有する)を用いて凍結保存される。好ましい実施形態において、TILの集団は、1:1(容積:容積)の比のCS10及び細胞培養培地を用いて凍結保存される。好ましい実施形態において、TILの集団は、約1:1(容積:容積)の比のCS10及び細胞培養培地を使用し、更に追加のIL-2を含んで凍結保存される。
[00711] ステップA~Eにおいて上記で考察した通り、TIL拡大培養プロセス全体
を通じて数々の時点で凍結保存を行うことができる。
を通じて数々の時点で凍結保存を行うことができる。
[00712] 上記で考察し、且つ図8に提供されるステップA~Eにおいて例示した通り
、TIL拡大培養プロセス全体を通じて数々の時点で凍結保存を行うことができる。一部の実施形態において、(例えば、図AのステップDに従って提供される)第2の拡大培養後の拡大培養されたTIL集団は、凍結保存することができる。凍結保存は、概して、凍結溶液、例えば85%補体不活性化AB血清及び15%ジメチルスルホキシド(DMSO)中にTIL集団を置くことにより達成され得る。この溶液中の細胞を極低温バイアルに入れ、-80℃で24時間貯蔵し、任意選択により凍結保存のため気体窒素フリーザーに移す。Sadeghi, et al., Acta Oncologica 2013, 52, 978-986を参照されたい。一部の実施形態において、TILは、5%DMSO中に凍結保存される。一部の実施形態において、TILは、細胞培養培地+5%DMSO中に凍結保存される。一部の実施形態において、TILは、実施例16に提供される方法に従って凍結保存される。
、TIL拡大培養プロセス全体を通じて数々の時点で凍結保存を行うことができる。一部の実施形態において、(例えば、図AのステップDに従って提供される)第2の拡大培養後の拡大培養されたTIL集団は、凍結保存することができる。凍結保存は、概して、凍結溶液、例えば85%補体不活性化AB血清及び15%ジメチルスルホキシド(DMSO)中にTIL集団を置くことにより達成され得る。この溶液中の細胞を極低温バイアルに入れ、-80℃で24時間貯蔵し、任意選択により凍結保存のため気体窒素フリーザーに移す。Sadeghi, et al., Acta Oncologica 2013, 52, 978-986を参照されたい。一部の実施形態において、TILは、5%DMSO中に凍結保存される。一部の実施形態において、TILは、細胞培養培地+5%DMSO中に凍結保存される。一部の実施形態において、TILは、実施例16に提供される方法に従って凍結保存される。
[00713] 一部の実施形態において、ステップBに係る第1の拡大培養後のバルクTI
L集団又はステップDに係る1回以上の第2の拡大培養後の拡大培養TIL集団が凍結保存され得る。凍結保存は、概して、凍結溶液、例えば85%補体不活性化AB血清及び15%ジメチルスルホキシド(DMSO)中にTIL集団を置くことにより達成され得る。この溶液中の細胞を極低温バイアルに入れ、-80℃で24時間貯蔵し、任意選択により凍結保存のため気体窒素フリーザーに移す。Sadeghi, et al., Acta Oncologica 2013, 52, 978-986を参照されたい。
L集団又はステップDに係る1回以上の第2の拡大培養後の拡大培養TIL集団が凍結保存され得る。凍結保存は、概して、凍結溶液、例えば85%補体不活性化AB血清及び15%ジメチルスルホキシド(DMSO)中にTIL集団を置くことにより達成され得る。この溶液中の細胞を極低温バイアルに入れ、-80℃で24時間貯蔵し、任意選択により凍結保存のため気体窒素フリーザーに移す。Sadeghi, et al., Acta Oncologica 2013, 52, 978-986を参照されたい。
[00714] 適切な場合、細胞をフリーザーから取り出し、37℃の水浴中で溶液の約5
分の4が解凍されるまで解凍する。細胞は、概して完全培地中に再懸濁され、任意選択により1回以上洗浄される。一部の実施形態において、当技術分野において公知の通り解凍TILをカウントし、生存率に関して評価することができる。
分の4が解凍されるまで解凍する。細胞は、概して完全培地中に再懸濁され、任意選択により1回以上洗浄される。一部の実施形態において、当技術分野において公知の通り解凍TILをカウントし、生存率に関して評価することができる。
[00715] ある場合には、ステップBのTIL集団は、以下で考察するプロトコルを用
いて直ちに凍結保存することができる。代わりに、バルクTIL集団にステップC及びステップDを施し、ステップD後に凍結保存することができる。同様に、遺伝子修飾TILを治療に使用する場合、ステップB又はステップDのTIL集団は、適切な処置のため遺伝子修飾の対象となり得る。
いて直ちに凍結保存することができる。代わりに、バルクTIL集団にステップC及びステップDを施し、ステップD後に凍結保存することができる。同様に、遺伝子修飾TILを治療に使用する場合、ステップB又はステップDのTIL集団は、適切な処置のため遺伝子修飾の対象となり得る。
V.患者の処置方法
[00716] 処置方法は、最初のTIL収集及びTILの培養から始まる。かかる方法に
ついては、両方とも当技術分野において例えばJin et al., J. Immunotherapy, 2012, 35(3):283-292(全体として参照により本明細書に組み込まれる)により記載されている。
処置方法の実施形態は、実施例を含む以下のセクション全体で説明される。
[00716] 処置方法は、最初のTIL収集及びTILの培養から始まる。かかる方法に
ついては、両方とも当技術分野において例えばJin et al., J. Immunotherapy, 2012, 35(3):283-292(全体として参照により本明細書に組み込まれる)により記載されている。
処置方法の実施形態は、実施例を含む以下のセクション全体で説明される。
[00717] 本明細書に記載の方法、例えば上記のステップA~Fに記載の方法を含むか
、又は上記のステップA~Fに記載の方法(例えば、図8にも示される)に従って作製された拡大培養TILは、癌患者の処置における特定の使用(例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるGoff, et al., J. Clinical Oncology, 2016, 34(20):2389-239並びに補足内容)が見出される。一部の実施形態において、TILは、先述の通り転移
性黒色腫の寄託切除物から成長させた(Dudley, et al., J Immunother., 2003, 26:332-342を参照されたい;全体として参照により本明細書に組み込まれる)。新鮮腫瘍は無菌
条件下で剥離し得る。正式な病理解析のため、代表サンプルを収集し得る。2mm3~3mm3の単一の断片が使用され得る。一部の実施形態において、患者1人あたり5、10、15、20、25又は30のサンプルを得る。一部の実施形態において、患者1人あたり20、25又は30のサンプルを得る。一部の実施形態において、患者1人あたり20、22、24、26又は28のサンプルを得る。一部の実施形態において、患者1人あたり24のサンプルを得る。サンプルを24ウェルプレートの個々のウェルに置き、高用量IL-2(6,000IU/mL)を含む成長培地中に維持し、腫瘍の破壊及び/又はTILの増殖に関してモニターし得る。処理後に生細胞が残っている任意の腫瘍を酵素消化して単一細胞懸濁液にし、本明細書に記載される通り凍結保存し得る。
、又は上記のステップA~Fに記載の方法(例えば、図8にも示される)に従って作製された拡大培養TILは、癌患者の処置における特定の使用(例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるGoff, et al., J. Clinical Oncology, 2016, 34(20):2389-239並びに補足内容)が見出される。一部の実施形態において、TILは、先述の通り転移
性黒色腫の寄託切除物から成長させた(Dudley, et al., J Immunother., 2003, 26:332-342を参照されたい;全体として参照により本明細書に組み込まれる)。新鮮腫瘍は無菌
条件下で剥離し得る。正式な病理解析のため、代表サンプルを収集し得る。2mm3~3mm3の単一の断片が使用され得る。一部の実施形態において、患者1人あたり5、10、15、20、25又は30のサンプルを得る。一部の実施形態において、患者1人あたり20、25又は30のサンプルを得る。一部の実施形態において、患者1人あたり20、22、24、26又は28のサンプルを得る。一部の実施形態において、患者1人あたり24のサンプルを得る。サンプルを24ウェルプレートの個々のウェルに置き、高用量IL-2(6,000IU/mL)を含む成長培地中に維持し、腫瘍の破壊及び/又はTILの増殖に関してモニターし得る。処理後に生細胞が残っている任意の腫瘍を酵素消化して単一細胞懸濁液にし、本明細書に記載される通り凍結保存し得る。
[00718] 一部の実施形態において、表現型分析(CD3、CD4、CD8及びCD5
6)のため、増殖に成功したTILをサンプリングし、利用可能な場合には自己腫瘍に対して試験し得る。TILは、一晩の共培養によりインターフェロンγ(IFN-γ)レベル>200pg/mL及びバックグラウンドの2倍となった場合に応答性であると見なすことができる。(Goff, et al., J Immunother., 2010, 33:840-847;全体として参照に
より本明細書に組み込まれる)。一部の実施形態において、自己応答性又は十分な成長パターンのエビデンスを有する培養物が、急速拡大培養(REP)と称されることもある第2の拡大培養を含め、第2の拡大培養(例えば、図8のステップDにおいて提供される通りの第2の拡大培養)に選択され得る。一部の実施形態において、高い自己応答性(例えば、第2の拡大培養中の高い増殖)を有する拡大培養TILが、追加の第2の拡大培養に選択される。一部の実施形態において、自己応答性(例えば、図8のステップDに提供される通りの第2の拡大培養中の高い増殖)を有するTILが、図8のステップDに係る追加の第2の拡大培養に選択される。
6)のため、増殖に成功したTILをサンプリングし、利用可能な場合には自己腫瘍に対して試験し得る。TILは、一晩の共培養によりインターフェロンγ(IFN-γ)レベル>200pg/mL及びバックグラウンドの2倍となった場合に応答性であると見なすことができる。(Goff, et al., J Immunother., 2010, 33:840-847;全体として参照に
より本明細書に組み込まれる)。一部の実施形態において、自己応答性又は十分な成長パターンのエビデンスを有する培養物が、急速拡大培養(REP)と称されることもある第2の拡大培養を含め、第2の拡大培養(例えば、図8のステップDにおいて提供される通りの第2の拡大培養)に選択され得る。一部の実施形態において、高い自己応答性(例えば、第2の拡大培養中の高い増殖)を有する拡大培養TILが、追加の第2の拡大培養に選択される。一部の実施形態において、自己応答性(例えば、図8のステップDに提供される通りの第2の拡大培養中の高い増殖)を有するTILが、図8のステップDに係る追加の第2の拡大培養に選択される。
[00719] 一部の実施形態において、患者はACT(養子細胞移入)に直接移されず、
例えば一部の実施形態において、腫瘍回収後及び/又は第1の拡大培養後、細胞は、直ちには利用されない。そのような実施形態において、TILは凍結保存し、患者への投与の
2日前に解凍することができる。そのような実施形態において、TILは凍結保存し、患者への投与の1日前に解凍することができる。一部の実施形態において、TILは凍結保存し、患者への投与の直前に解凍することができる。
例えば一部の実施形態において、腫瘍回収後及び/又は第1の拡大培養後、細胞は、直ちには利用されない。そのような実施形態において、TILは凍結保存し、患者への投与の
2日前に解凍することができる。そのような実施形態において、TILは凍結保存し、患者への投与の1日前に解凍することができる。一部の実施形態において、TILは凍結保存し、患者への投与の直前に解凍することができる。
[00720] 輸注バッグTILの凍結保存サンプルの細胞表現型は、表面マーカーCD3
、CD4、CD8、CCR7及びCD45RA(BD BioSciences)に関するフローサイトメトリー(例えば、FlowJo)並びに本明細書に記載される方法のいずれかによって分析することができる。血清サイトカインは標準的な酵素結合免疫吸着アッセイ法を用いることにより測定した。血清IFN-gの上昇は、>100pg/mL及び4、3ベースラインレベル超と定義した。
、CD4、CD8、CCR7及びCD45RA(BD BioSciences)に関するフローサイトメトリー(例えば、FlowJo)並びに本明細書に記載される方法のいずれかによって分析することができる。血清サイトカインは標準的な酵素結合免疫吸着アッセイ法を用いることにより測定した。血清IFN-gの上昇は、>100pg/mL及び4、3ベースラインレベル超と定義した。
[00721] 一部の実施形態において、本明細書で提供される方法、例えば図8に例示さ
れる方法により作製されるTILは、TILの臨床有効性の驚くべき改善を提供する。一部の実施形態において、本明細書で提供される方法、例えば図8に例示される方法により作製されるTILは、例えば図8に例示される方法以外の方法を含む、本明細書に記載されるもの以外の方法により作製されるTILと比べて臨床有効性が増加する。一部の実施形態において、本明細書に記載されているもの以外の方法は、プロセス1C及び/又はジェネレーション1(Gen1)と称される方法を含む。一部の実施形態において、有効性の増加は、DCR、ORR及び/又は他の臨床応答によって測定される。一部の実施形態において、本明細書で提供される方法、例えば図8に例示される方法により作製されるTILは、例えば図8に例示される方法以外の、例えばGen1プロセスを含む、本明細書に記載されるもの以外の方法により作製されるTILと比べて同様の応答時間及び安全プロファイルを示す。
れる方法により作製されるTILは、TILの臨床有効性の驚くべき改善を提供する。一部の実施形態において、本明細書で提供される方法、例えば図8に例示される方法により作製されるTILは、例えば図8に例示される方法以外の方法を含む、本明細書に記載されるもの以外の方法により作製されるTILと比べて臨床有効性が増加する。一部の実施形態において、本明細書に記載されているもの以外の方法は、プロセス1C及び/又はジェネレーション1(Gen1)と称される方法を含む。一部の実施形態において、有効性の増加は、DCR、ORR及び/又は他の臨床応答によって測定される。一部の実施形態において、本明細書で提供される方法、例えば図8に例示される方法により作製されるTILは、例えば図8に例示される方法以外の、例えばGen1プロセスを含む、本明細書に記載されるもの以外の方法により作製されるTILと比べて同様の応答時間及び安全プロファイルを示す。
[00722] 一部の実施形態において、IFN-ガンマ(IFN-γ)は、処置有効性及
び/又は臨床有効性の増加の指標である。一部の実施形態において、TILで処置された対象の血液中のIFN-γは、活性TILの指標である。一部の実施形態において、IFN-γ産生の効力アッセイが用いられる。IFN-γ産生は、細胞傷害能のもう1つの尺度である。IFN-γ産生は、本発明の方法、例えば図8に例示されるものを含む方法により調製されたTILで処置された対象の血液、血清又はTILエキソビボ中のサイトカインIFN-γのレベルを決定することにより測定できる。一部の実施形態において、IFN-γの増加は、本発明の方法により作製されたTILで処置された患者における処置有効性の指標である。一部の実施形態において、IFN-γは、未処置患者と比較して、及び/又は本明細書で提供するもの以外の方法、例えば図8で具体化された方法以外の方法を使用して調製されたTILで処置された患者と比較して、1倍、2倍、3倍、4倍又は5倍以上増加する。一部の実施形態において、IFN-γ分泌は、未処置患者と比較して、及び/又は本明細書で提供するもの以外の方法、例えば図8で具体化された方法以外の方法を使用して調製されたTILで処置された患者と比較して、1倍増加する。一部の実施形態において、IFN-γ分泌は、未処置患者と比較して、及び/又は本明細書で提供するもの以外の方法、例えば図8で具体化された方法以外の方法を使用して調製されたTILで処置された患者と比較して、2倍増加する。一部の実施形態において、IFN-γ分泌は、未処置患者と比較して、及び/又は本明細書で提供するもの以外の方法、例えば図8で具体化された方法以外の方法を使用して調製されたTILで処置された患者と比較して、3倍増加する。一部の実施形態において、IFN-γ分泌は、未処置患者と比較して、及び/又は本明細書で提供するもの以外の方法、例えば図8で具体化された方法以外の方法を使用して調製されたTILで処置された患者と比較して、4倍増加する。一部の実施形態において、IFN-γ分泌は、未処置患者と比較して、及び/又は本明細書で提供するもの以外の方法、例えば図8で具体化された方法以外の方法を使用して調製されたTILで処置された患者と比較して、5倍増加する。一部の実施形態において、IFN-γは、Quantikine ELISA kitを使用して測定される。一部の実施形態において、IFN
-γは、例えば、図8に記載されるものを含む、本発明の方法により調製されたTILで処置された対象のTILエキソビボで測定される。一部の実施形態において、IFN-γは、例えば、図8に記載されるものを含む、本発明の方法により調製されたTILで処置された対象の血液で測定される。一部の実施形態において、IFN-γは、例えば、図8に記載されるものを含む、本発明の方法により調製されたTILで処置された対象のTIL血清で測定される。
び/又は臨床有効性の増加の指標である。一部の実施形態において、TILで処置された対象の血液中のIFN-γは、活性TILの指標である。一部の実施形態において、IFN-γ産生の効力アッセイが用いられる。IFN-γ産生は、細胞傷害能のもう1つの尺度である。IFN-γ産生は、本発明の方法、例えば図8に例示されるものを含む方法により調製されたTILで処置された対象の血液、血清又はTILエキソビボ中のサイトカインIFN-γのレベルを決定することにより測定できる。一部の実施形態において、IFN-γの増加は、本発明の方法により作製されたTILで処置された患者における処置有効性の指標である。一部の実施形態において、IFN-γは、未処置患者と比較して、及び/又は本明細書で提供するもの以外の方法、例えば図8で具体化された方法以外の方法を使用して調製されたTILで処置された患者と比較して、1倍、2倍、3倍、4倍又は5倍以上増加する。一部の実施形態において、IFN-γ分泌は、未処置患者と比較して、及び/又は本明細書で提供するもの以外の方法、例えば図8で具体化された方法以外の方法を使用して調製されたTILで処置された患者と比較して、1倍増加する。一部の実施形態において、IFN-γ分泌は、未処置患者と比較して、及び/又は本明細書で提供するもの以外の方法、例えば図8で具体化された方法以外の方法を使用して調製されたTILで処置された患者と比較して、2倍増加する。一部の実施形態において、IFN-γ分泌は、未処置患者と比較して、及び/又は本明細書で提供するもの以外の方法、例えば図8で具体化された方法以外の方法を使用して調製されたTILで処置された患者と比較して、3倍増加する。一部の実施形態において、IFN-γ分泌は、未処置患者と比較して、及び/又は本明細書で提供するもの以外の方法、例えば図8で具体化された方法以外の方法を使用して調製されたTILで処置された患者と比較して、4倍増加する。一部の実施形態において、IFN-γ分泌は、未処置患者と比較して、及び/又は本明細書で提供するもの以外の方法、例えば図8で具体化された方法以外の方法を使用して調製されたTILで処置された患者と比較して、5倍増加する。一部の実施形態において、IFN-γは、Quantikine ELISA kitを使用して測定される。一部の実施形態において、IFN
-γは、例えば、図8に記載されるものを含む、本発明の方法により調製されたTILで処置された対象のTILエキソビボで測定される。一部の実施形態において、IFN-γは、例えば、図8に記載されるものを含む、本発明の方法により調製されたTILで処置された対象の血液で測定される。一部の実施形態において、IFN-γは、例えば、図8に記載されるものを含む、本発明の方法により調製されたTILで処置された対象のTIL血清で測定される。
[00723] 一部の実施形態において、例えば図8に記載されるものを含む本発明の方法
により調製されたTILは、例えば、図8に例示されない、例えばプロセス1Cメソッドと称されるものを含む他の方法により作製されるTILと比較してポリクローナル性の増加を示す。一部の実施形態において、有意に改善されたポリクローナル性及び/又は増加したポリクローナル性は、処置有効性及び/又は臨床有効性の増加の指標である。一部の実施形態において、ポリクローナル性とは、T細胞レパートリーの多様性を指す。一部の実施形態において、ポリクローナル性の増加は、本発明の方法に作製されたTILを投与された患者に関する処置有効性の指標である。一部の実施形態において、ポリクローナル性は、例えば、図8に具体化された方法以外の方法を含む、本明細書で提供する以外の方法を使用して調製されたTILと比較して1倍、2倍、10倍、100倍、500倍又は1000倍が増加する。一部の実施形態において、ポリクローナル性は、未処置患者と比較して、及び/又は本明細書で提供するもの以外の方法、例えば図8で具体化された方法以外の方法を使用して調製されたTILで処置された患者と比較して、1倍増加する。一部の実施形態において、ポリクローナル性は、未処置患者と比較して、及び/又は本明細書で提供するもの以外の方法、例えば図8で具体化された方法以外の方法を使用して調製されたTILで処置された患者と比較して、2倍増加する。一部の実施形態において、ポリクローナル性は、未処置患者と比較して、及び/又は本明細書で提供するもの以外の方法、例えば図8で具体化された方法以外の方法を使用して調製されたTILで処置された患者と比較して、10倍増加する。一部の実施形態において、ポリクローナル性は、未処置患者と比較して、及び/又は本明細書で提供するもの以外の方法、例えば図8で具体化された方法以外の方法を使用して調製されたTILで処置された患者と比較して、100倍増加する。一部の実施形態において、ポリクローナル性は、未処置患者と比較して、及び/又は本明細書で提供するもの以外の方法、例えば図8で具体化された方法以外の方法を使用して調製されたTILで処置された患者と比較して、500倍増加する。一部の実施形態において、ポリクローナル性は、未処置患者と比較して、及び/又は本明細書で提供するもの以外の方法、例えば図8で具体化された方法以外の方法を使用して調製されたTILで処置された患者と比較して、1000倍増加する。
により調製されたTILは、例えば、図8に例示されない、例えばプロセス1Cメソッドと称されるものを含む他の方法により作製されるTILと比較してポリクローナル性の増加を示す。一部の実施形態において、有意に改善されたポリクローナル性及び/又は増加したポリクローナル性は、処置有効性及び/又は臨床有効性の増加の指標である。一部の実施形態において、ポリクローナル性とは、T細胞レパートリーの多様性を指す。一部の実施形態において、ポリクローナル性の増加は、本発明の方法に作製されたTILを投与された患者に関する処置有効性の指標である。一部の実施形態において、ポリクローナル性は、例えば、図8に具体化された方法以外の方法を含む、本明細書で提供する以外の方法を使用して調製されたTILと比較して1倍、2倍、10倍、100倍、500倍又は1000倍が増加する。一部の実施形態において、ポリクローナル性は、未処置患者と比較して、及び/又は本明細書で提供するもの以外の方法、例えば図8で具体化された方法以外の方法を使用して調製されたTILで処置された患者と比較して、1倍増加する。一部の実施形態において、ポリクローナル性は、未処置患者と比較して、及び/又は本明細書で提供するもの以外の方法、例えば図8で具体化された方法以外の方法を使用して調製されたTILで処置された患者と比較して、2倍増加する。一部の実施形態において、ポリクローナル性は、未処置患者と比較して、及び/又は本明細書で提供するもの以外の方法、例えば図8で具体化された方法以外の方法を使用して調製されたTILで処置された患者と比較して、10倍増加する。一部の実施形態において、ポリクローナル性は、未処置患者と比較して、及び/又は本明細書で提供するもの以外の方法、例えば図8で具体化された方法以外の方法を使用して調製されたTILで処置された患者と比較して、100倍増加する。一部の実施形態において、ポリクローナル性は、未処置患者と比較して、及び/又は本明細書で提供するもの以外の方法、例えば図8で具体化された方法以外の方法を使用して調製されたTILで処置された患者と比較して、500倍増加する。一部の実施形態において、ポリクローナル性は、未処置患者と比較して、及び/又は本明細書で提供するもの以外の方法、例えば図8で具体化された方法以外の方法を使用して調製されたTILで処置された患者と比較して、1000倍増加する。
[00724] 有効性の尺度には、当技術分野において公知であり、本明細書に記載される
ように、疾患制御率(DCR)並びに全奏効率(ORR)が含まれ得る。
ように、疾患制御率(DCR)並びに全奏効率(ORR)が含まれ得る。
1.癌及び他の疾患の処置方法
[00725] 本明細書に記載の組成物及び方法は、疾患の処置方法で使用することができ
る。一実施形態において、それらは過剰成長性障害の処置に使用するためのものである。それらは、本明細書及び以下の段落に記載されている通り他の障害の処置にも使用され得る。
[00725] 本明細書に記載の組成物及び方法は、疾患の処置方法で使用することができ
る。一実施形態において、それらは過剰成長性障害の処置に使用するためのものである。それらは、本明細書及び以下の段落に記載されている通り他の障害の処置にも使用され得る。
[00726] 一部の実施形態において、過剰成長性障害は癌である。一部の実施形態にお
いて、過剰成長性障害は固形腫瘍癌である。一部の実施形態において、固形腫瘍癌は、黒色腫、卵巣癌、子宮頸癌、非小細胞肺癌(NSCLC)、肺癌、膀胱癌、乳癌、ヒトパピローマウイルスによって引き起こされる癌、頭頸部癌(頭頸部扁平上皮癌(HNSCC)を含む)、腎癌及び腎細胞癌からなる群から選択される。一部の実施形態において、過剰成長性障害は血液学的悪性腫瘍である。一部の実施形態において、固形腫瘍癌は、慢性リ
ンパ球性白血病、急性リンパ芽球性白血病、びまん性大細胞型B細胞リンパ腫、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、濾胞性リンパ腫及びマントル細胞リンパ腫からなる群から選択される。
いて、過剰成長性障害は固形腫瘍癌である。一部の実施形態において、固形腫瘍癌は、黒色腫、卵巣癌、子宮頸癌、非小細胞肺癌(NSCLC)、肺癌、膀胱癌、乳癌、ヒトパピローマウイルスによって引き起こされる癌、頭頸部癌(頭頸部扁平上皮癌(HNSCC)を含む)、腎癌及び腎細胞癌からなる群から選択される。一部の実施形態において、過剰成長性障害は血液学的悪性腫瘍である。一部の実施形態において、固形腫瘍癌は、慢性リ
ンパ球性白血病、急性リンパ芽球性白血病、びまん性大細胞型B細胞リンパ腫、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、濾胞性リンパ腫及びマントル細胞リンパ腫からなる群から選択される。
[00727] 一実施形態において、本発明は、TIL集団で癌を処置する方法を含み、こ
こで患者は本開示に係るTILの注入前に骨髄非破壊的化学療法で前処置される。一実施形態において、骨髄非破壊的化学療法は、2日間(TIL注入の27日前及び26日前)のシクロホスファミド60mg/kg/日及び5日間(TIL注入の27~23日前)のフルダラビン25mg/m2/日である。一実施形態において、本開示による骨髄非破壊的化学療法及びTIL注入(0日目)後、患者は生理学的許容量まで8時間毎に720,000IU/kgでIL-2の静脈内注入を受ける。
こで患者は本開示に係るTILの注入前に骨髄非破壊的化学療法で前処置される。一実施形態において、骨髄非破壊的化学療法は、2日間(TIL注入の27日前及び26日前)のシクロホスファミド60mg/kg/日及び5日間(TIL注入の27~23日前)のフルダラビン25mg/m2/日である。一実施形態において、本開示による骨髄非破壊的化学療法及びTIL注入(0日目)後、患者は生理学的許容量まで8時間毎に720,000IU/kgでIL-2の静脈内注入を受ける。
[00728] 示された疾患又は障害の処置、予防及び/又は管理における本明細書に記載
の化合物及び化合物の組み合わせの有効性は、ヒト疾患の処置のためのガイダンスを提供する当技術分野でにおいて公知の様々なモデルを使用して試験することができる。例えば、卵巣癌の処置の有効性を決定するためのモデルは、例えば、Mullany, et al., Endocrinology 2012, 153, 1585-92;及びFong, et al., J. Ovarian Res. 2009, 2, 12に記載がある。膵臓癌の処置の有効性を決定するためのモデルは、Herreros-Villanueva, et al.,
World J. Gastroenterol. 2012, 18, 1286-1294に記載がある。乳癌の処置の有効性を決定するためのモデルは、例えば、Fantozzi, Breast Cancer Res. 2006, 8, 212に記載が
ある。黒色腫の処置の有効性を決定するためのモデルは、例えば、Damsky, et al., Pigment Cell & Melanoma Res. 2010, 23, 853-859に記載がある。肺癌の処置の有効性を決定するためのモデルは、例えば、Meuwissen, et al., Genes & Development, 2005, 19, 643-664に記載がある。肺癌処置の有効性を決定するためのモデルは、例えば、Kim, Clin. Exp. Otorhinolaryngol. 2009, 2, 55-60;及びSano, Head Neck Oncol. 2009, 1, 32に
記載がある。
の化合物及び化合物の組み合わせの有効性は、ヒト疾患の処置のためのガイダンスを提供する当技術分野でにおいて公知の様々なモデルを使用して試験することができる。例えば、卵巣癌の処置の有効性を決定するためのモデルは、例えば、Mullany, et al., Endocrinology 2012, 153, 1585-92;及びFong, et al., J. Ovarian Res. 2009, 2, 12に記載がある。膵臓癌の処置の有効性を決定するためのモデルは、Herreros-Villanueva, et al.,
World J. Gastroenterol. 2012, 18, 1286-1294に記載がある。乳癌の処置の有効性を決定するためのモデルは、例えば、Fantozzi, Breast Cancer Res. 2006, 8, 212に記載が
ある。黒色腫の処置の有効性を決定するためのモデルは、例えば、Damsky, et al., Pigment Cell & Melanoma Res. 2010, 23, 853-859に記載がある。肺癌の処置の有効性を決定するためのモデルは、例えば、Meuwissen, et al., Genes & Development, 2005, 19, 643-664に記載がある。肺癌処置の有効性を決定するためのモデルは、例えば、Kim, Clin. Exp. Otorhinolaryngol. 2009, 2, 55-60;及びSano, Head Neck Oncol. 2009, 1, 32に
記載がある。
[00729] 一部の実施形態において、IFN-ガンマ(IFN-γ)は、過剰成長性傷
害の処置有効性の指標である。一部の実施形態において、TILで処置された対象の血液中のIFN-γは、活性TILの指標である。一部の実施形態において、IFN-γ産生の効力アッセイが用いられる。IFN-γ産生は、細胞傷害能のもう1つの尺度である。IFN-γ産生は、本発明の方法、例えば図8に例示されるものを含む方法により調製されたTILで処置された対象の血液中のサイトカインIFN-γのレベルを決定することにより測定できる。一部の実施形態において、本方法で得られたTILは、図13及び本出願全体に例示されるように、プロセス1Cと称される方法を使用して調製されたTILで処置された対象と比較して、本方法のTILで処置された対象の血液中のIFN-γの増加をもたらす。一部の実施形態において、IFN-γの増加は、本発明の方法により作製されたTILで処置された患者における処置有効性の指標である。一部の実施形態において、IFN-γは、未処置患者と比較して、及び/又は本明細書で提供するもの以外の方法、例えば図8で具体化された方法以外の方法を使用して調製されたTILで処置された患者と比較して、1倍、2倍、3倍、4倍又は5倍以上増加する。一部の実施形態において、IFN-γ分泌は、未処置患者と比較して、及び/又は本明細書で提供するもの以外の方法、例えば図8で具体化された方法以外の方法を使用して調製されたTILで処置された患者と比較して、1倍増加する。一部の実施形態において、IFN-γ分泌は、未処置患者と比較して、及び/又は本明細書で提供するもの以外の方法、例えば図8で具体化された方法以外の方法を使用して調製されたTILで処置された患者と比較して、2倍増加する。一部の実施形態において、IFN-γ分泌は、未処置患者と比較して、及び/又は本明細書で提供するもの以外の方法、例えば図8で具体化された方法以外の方法を使用して調製されたTILで処置された患者と比較して、3倍増加する。一部の実施形態において、IFN-γ分泌は、未処置患者と比較して、及び/又は本明細書で提供するもの
以外の方法、例えば図8で具体化された方法以外の方法を使用して調製されたTILで処置された患者と比較して、4倍増加する。一部の実施形態において、IFN-γ分泌は、未処置患者と比較して、及び/又は本明細書で提供するもの以外の方法、例えば図8で具体化された方法以外の方法を使用して調製されたTILで処置された患者と比較して、5倍増加する。一部の実施形態において、IFN-γは、Quantikine ELISA kitを使用して測定される。一部の実施形態において、IFN-γは、本発明の方法により作製されたTILで処置された患者からのTILエキソビボにおいて測定される。一部の実施形態において、IFN-γは、本発明の方法により作製されたTILで処置された患者の血液において測定される。一部の実施形態において、IFN-γは、本発明の方法により作製されたTILで処置された患者の血清において測定される。
害の処置有効性の指標である。一部の実施形態において、TILで処置された対象の血液中のIFN-γは、活性TILの指標である。一部の実施形態において、IFN-γ産生の効力アッセイが用いられる。IFN-γ産生は、細胞傷害能のもう1つの尺度である。IFN-γ産生は、本発明の方法、例えば図8に例示されるものを含む方法により調製されたTILで処置された対象の血液中のサイトカインIFN-γのレベルを決定することにより測定できる。一部の実施形態において、本方法で得られたTILは、図13及び本出願全体に例示されるように、プロセス1Cと称される方法を使用して調製されたTILで処置された対象と比較して、本方法のTILで処置された対象の血液中のIFN-γの増加をもたらす。一部の実施形態において、IFN-γの増加は、本発明の方法により作製されたTILで処置された患者における処置有効性の指標である。一部の実施形態において、IFN-γは、未処置患者と比較して、及び/又は本明細書で提供するもの以外の方法、例えば図8で具体化された方法以外の方法を使用して調製されたTILで処置された患者と比較して、1倍、2倍、3倍、4倍又は5倍以上増加する。一部の実施形態において、IFN-γ分泌は、未処置患者と比較して、及び/又は本明細書で提供するもの以外の方法、例えば図8で具体化された方法以外の方法を使用して調製されたTILで処置された患者と比較して、1倍増加する。一部の実施形態において、IFN-γ分泌は、未処置患者と比較して、及び/又は本明細書で提供するもの以外の方法、例えば図8で具体化された方法以外の方法を使用して調製されたTILで処置された患者と比較して、2倍増加する。一部の実施形態において、IFN-γ分泌は、未処置患者と比較して、及び/又は本明細書で提供するもの以外の方法、例えば図8で具体化された方法以外の方法を使用して調製されたTILで処置された患者と比較して、3倍増加する。一部の実施形態において、IFN-γ分泌は、未処置患者と比較して、及び/又は本明細書で提供するもの
以外の方法、例えば図8で具体化された方法以外の方法を使用して調製されたTILで処置された患者と比較して、4倍増加する。一部の実施形態において、IFN-γ分泌は、未処置患者と比較して、及び/又は本明細書で提供するもの以外の方法、例えば図8で具体化された方法以外の方法を使用して調製されたTILで処置された患者と比較して、5倍増加する。一部の実施形態において、IFN-γは、Quantikine ELISA kitを使用して測定される。一部の実施形態において、IFN-γは、本発明の方法により作製されたTILで処置された患者からのTILエキソビボにおいて測定される。一部の実施形態において、IFN-γは、本発明の方法により作製されたTILで処置された患者の血液において測定される。一部の実施形態において、IFN-γは、本発明の方法により作製されたTILで処置された患者の血清において測定される。
[00730] 一部の実施形態において、例えば図8に記載されるものを含む本発明の方法
により調製されたTILは、例えば、図8に例示されない、例えばプロセス1Cメソッドと称されるものを含む他の方法により作製されるTILと比較してポリクローナル性の増加を示す。一部の実施形態において、有意に改善されたポリクローナル性及び/又は増加したポリクローナル性は、癌処置の処置有効性及び/又は臨床有効性の増加の指標である。一部の実施形態において、ポリクローナル性とは、T細胞レパートリーの多様性を指す。一部の実施形態において、ポリクローナル性の増加は、本発明の方法によって作製されたTILの投与に関する処置有効性の指標である。一部の実施形態において、ポリクローナル性は、例えば、図8に具体化された方法以外の方法を含む、本明細書で提供する以外の方法を使用して調製されたTILと比較して1倍、2倍、10倍、100倍、500倍又は1000倍が増加する。一部の実施形態において、ポリクローナル性は、未処置患者と比較して、及び/又は本明細書で提供するもの以外の方法、例えば図8で具体化された方法以外の方法を使用して調製されたTILで処置された患者と比較して、1倍増加する。一部の実施形態において、ポリクローナル性は、未処置患者と比較して、及び/又は本明細書で提供するもの以外の方法、例えば図8で具体化された方法以外の方法を使用して調製されたTILで処置された患者と比較して、2倍増加する。一部の実施形態において、ポリクローナル性は、未処置患者と比較して、及び/又は本明細書で提供するもの以外の方法、例えば図8で具体化された方法以外の方法を使用して調製されたTILで処置された患者と比較して、10倍増加する。一部の実施形態において、ポリクローナル性は、未処置患者と比較して、及び/又は本明細書で提供するもの以外の方法、例えば図8で具体化された方法以外の方法を使用して調製されたTILで処置された患者と比較して、100倍増加する。一部の実施形態において、ポリクローナル性は、未処置患者と比較して、及び/又は本明細書で提供するもの以外の方法、例えば図8で具体化された方法以外の方法を使用して調製されたTILで処置された患者と比較して、500倍増加する。一部の実施形態において、ポリクローナル性は、未処置患者と比較して、及び/又は本明細書で提供するもの以外の方法、例えば図8で具体化された方法以外の方法を使用して調製されたTILで処置された患者と比較して、1000倍増加する。
により調製されたTILは、例えば、図8に例示されない、例えばプロセス1Cメソッドと称されるものを含む他の方法により作製されるTILと比較してポリクローナル性の増加を示す。一部の実施形態において、有意に改善されたポリクローナル性及び/又は増加したポリクローナル性は、癌処置の処置有効性及び/又は臨床有効性の増加の指標である。一部の実施形態において、ポリクローナル性とは、T細胞レパートリーの多様性を指す。一部の実施形態において、ポリクローナル性の増加は、本発明の方法によって作製されたTILの投与に関する処置有効性の指標である。一部の実施形態において、ポリクローナル性は、例えば、図8に具体化された方法以外の方法を含む、本明細書で提供する以外の方法を使用して調製されたTILと比較して1倍、2倍、10倍、100倍、500倍又は1000倍が増加する。一部の実施形態において、ポリクローナル性は、未処置患者と比較して、及び/又は本明細書で提供するもの以外の方法、例えば図8で具体化された方法以外の方法を使用して調製されたTILで処置された患者と比較して、1倍増加する。一部の実施形態において、ポリクローナル性は、未処置患者と比較して、及び/又は本明細書で提供するもの以外の方法、例えば図8で具体化された方法以外の方法を使用して調製されたTILで処置された患者と比較して、2倍増加する。一部の実施形態において、ポリクローナル性は、未処置患者と比較して、及び/又は本明細書で提供するもの以外の方法、例えば図8で具体化された方法以外の方法を使用して調製されたTILで処置された患者と比較して、10倍増加する。一部の実施形態において、ポリクローナル性は、未処置患者と比較して、及び/又は本明細書で提供するもの以外の方法、例えば図8で具体化された方法以外の方法を使用して調製されたTILで処置された患者と比較して、100倍増加する。一部の実施形態において、ポリクローナル性は、未処置患者と比較して、及び/又は本明細書で提供するもの以外の方法、例えば図8で具体化された方法以外の方法を使用して調製されたTILで処置された患者と比較して、500倍増加する。一部の実施形態において、ポリクローナル性は、未処置患者と比較して、及び/又は本明細書で提供するもの以外の方法、例えば図8で具体化された方法以外の方法を使用して調製されたTILで処置された患者と比較して、1000倍増加する。
2.共投与方法
[00731] 一部の実施形態において、本明細書に記載されるように作製されるTIL(
例えば、図8のステップA~Fに記載される方法から得られたTILを含む)は、以下に記載する抗体など、1つ以上の免疫チェックポイント調節因子と併用して投与することができる。例えば、PD-1を標的とする、且つ本発明のTILと共投与し得る抗体としては、例えば、限定はされないが、ニボルマブ(BMS-936558、Bristol-Myers Squibb;Opdivo(登録商標))、ペンブロリズマブ(ランブロリズマブ、MK03475又はMK-3475、Merck;Keytruda(登録商標))、ヒト化抗PD-1抗体JS001
(ShangHai JunShi)、モノクローナル抗PD-1抗体TSR-042(Tesaro, Inc.)
、ピジリズマブ(抗PD-1 mAb CT-011、Medivation)、抗PD-1モノクローナル抗体BGB-A317(BeiGene)及び/又は抗PD-1抗体SHR-1210
(ShangHai HengRui)、ヒトモノクローナル抗体REGN2810(Regeneron)、ヒト
モノクローナル抗体MDX-1106(Bristol-Myers Squibb)及び/又はヒト化抗PD1 IgG4抗体PDR001(Novartis)が挙げられる。一部の実施形態において、PD-1抗体は、クローン:RMP1-14(ラットIgG)-BioXcellカタログ番号BP0146からのものである。本明細書に記載される通りのステップA~Fにより作製されるTILとの共投与方法における使用に好適な他の好適な抗体は、米国特許第8,008,449号(参照により本明細書に組み込まれる)に開示される抗PD-1抗体である。一部の実施形態において、抗体又はその抗原結合部分はPD-L1に特異的に結合し、PD-1とのその相互作用を阻害し、それにより免疫活性を増加させる。PD-L1に結合してPD-1とPD-L1との間の相互作用を破壊し、且つ抗腫瘍免疫応答を刺激する当技術分野において公知の任意の抗体が、本明細書に記載される通りのステップA~Fにより作製されるTILとの共投与方法における使用に好適である。例えば、PD-L1を標的とする臨床試験中の抗体としては、BMS-936559(Bristol-Myers Squibb)及びMPDL3280A(Genentech)が挙げられる。PD-L1を標的とする他の好適な抗体は
、米国特許第7,943,743号(参照により本明細書に組み込まれる)に開示される。当業者は、PD-1又はPD-L1に結合し、PD-1/PD-L1相互作用を破壊し、且つ抗腫瘍免疫応答を刺激する任意の抗体が、本明細書に記載される通りのステップA~Fにより作製されるTILとの共投与方法における使用に好適であることを理解するであろう。一部の実施形態において、ステップA~Fにより作製されるTILの組み合わせを投与される対象は、患者が抗PD-1抗体単独の投与に不応性の癌型を有するとき抗PD-1抗体と共投与される。一部の実施形態において、患者が難治性黒色腫を有するとき、患者はTILを抗PD-1と併用して投与される。一部の実施形態において、患者が非小細胞肺癌(NSCLC)を有するとき、患者はTILを抗PD-1と併用して投与される。
[00731] 一部の実施形態において、本明細書に記載されるように作製されるTIL(
例えば、図8のステップA~Fに記載される方法から得られたTILを含む)は、以下に記載する抗体など、1つ以上の免疫チェックポイント調節因子と併用して投与することができる。例えば、PD-1を標的とする、且つ本発明のTILと共投与し得る抗体としては、例えば、限定はされないが、ニボルマブ(BMS-936558、Bristol-Myers Squibb;Opdivo(登録商標))、ペンブロリズマブ(ランブロリズマブ、MK03475又はMK-3475、Merck;Keytruda(登録商標))、ヒト化抗PD-1抗体JS001
(ShangHai JunShi)、モノクローナル抗PD-1抗体TSR-042(Tesaro, Inc.)
、ピジリズマブ(抗PD-1 mAb CT-011、Medivation)、抗PD-1モノクローナル抗体BGB-A317(BeiGene)及び/又は抗PD-1抗体SHR-1210
(ShangHai HengRui)、ヒトモノクローナル抗体REGN2810(Regeneron)、ヒト
モノクローナル抗体MDX-1106(Bristol-Myers Squibb)及び/又はヒト化抗PD1 IgG4抗体PDR001(Novartis)が挙げられる。一部の実施形態において、PD-1抗体は、クローン:RMP1-14(ラットIgG)-BioXcellカタログ番号BP0146からのものである。本明細書に記載される通りのステップA~Fにより作製されるTILとの共投与方法における使用に好適な他の好適な抗体は、米国特許第8,008,449号(参照により本明細書に組み込まれる)に開示される抗PD-1抗体である。一部の実施形態において、抗体又はその抗原結合部分はPD-L1に特異的に結合し、PD-1とのその相互作用を阻害し、それにより免疫活性を増加させる。PD-L1に結合してPD-1とPD-L1との間の相互作用を破壊し、且つ抗腫瘍免疫応答を刺激する当技術分野において公知の任意の抗体が、本明細書に記載される通りのステップA~Fにより作製されるTILとの共投与方法における使用に好適である。例えば、PD-L1を標的とする臨床試験中の抗体としては、BMS-936559(Bristol-Myers Squibb)及びMPDL3280A(Genentech)が挙げられる。PD-L1を標的とする他の好適な抗体は
、米国特許第7,943,743号(参照により本明細書に組み込まれる)に開示される。当業者は、PD-1又はPD-L1に結合し、PD-1/PD-L1相互作用を破壊し、且つ抗腫瘍免疫応答を刺激する任意の抗体が、本明細書に記載される通りのステップA~Fにより作製されるTILとの共投与方法における使用に好適であることを理解するであろう。一部の実施形態において、ステップA~Fにより作製されるTILの組み合わせを投与される対象は、患者が抗PD-1抗体単独の投与に不応性の癌型を有するとき抗PD-1抗体と共投与される。一部の実施形態において、患者が難治性黒色腫を有するとき、患者はTILを抗PD-1と併用して投与される。一部の実施形態において、患者が非小細胞肺癌(NSCLC)を有するとき、患者はTILを抗PD-1と併用して投与される。
3.任意選択による患者のリンパ球枯渇プレコンディショニング
[00732] 一実施形態において、本発明は、TIL集団で癌を処置する方法を含み、こ
こで患者は本開示に係るTILの注入前に骨髄非破壊的化学療法で前処置される。一実施形態において、本発明は、骨髄非破壊的化学療法で前処置された患者の癌処置に使用するためのTILの集団を含む。一実施形態において、TILの集団は注入による投与用である。一実施形態において、骨髄非破壊的化学療法は、2日間(TIL注入の27日前及び26日前)のシクロホスファミド60mg/kg/日及び5日間(TIL注入の27~23日前)のフルダラビン25mg/m2/日である。一実施形態において、骨髄非破壊的化学療法及び本開示に係るTIL注入(0日目)後、患者は生理学的忍容量まで8時間毎に静脈内に720,000IU/kgのIL-2(アルデスロイキン、PROLEUKINとして
市販)の静脈内注入を受ける。特定の実施形態において、TILの集団は、IL-2と組み合わせて癌を処置するのに使用され、IL-2はTILの集団後に投与される。
[00732] 一実施形態において、本発明は、TIL集団で癌を処置する方法を含み、こ
こで患者は本開示に係るTILの注入前に骨髄非破壊的化学療法で前処置される。一実施形態において、本発明は、骨髄非破壊的化学療法で前処置された患者の癌処置に使用するためのTILの集団を含む。一実施形態において、TILの集団は注入による投与用である。一実施形態において、骨髄非破壊的化学療法は、2日間(TIL注入の27日前及び26日前)のシクロホスファミド60mg/kg/日及び5日間(TIL注入の27~23日前)のフルダラビン25mg/m2/日である。一実施形態において、骨髄非破壊的化学療法及び本開示に係るTIL注入(0日目)後、患者は生理学的忍容量まで8時間毎に静脈内に720,000IU/kgのIL-2(アルデスロイキン、PROLEUKINとして
市販)の静脈内注入を受ける。特定の実施形態において、TILの集団は、IL-2と組み合わせて癌を処置するのに使用され、IL-2はTILの集団後に投与される。
[00733] 実験的知見は、腫瘍特異的Tリンパ球の養子移入前のリンパ球枯渇が、調節
性T細胞及び免疫系の競合要素(「サイトカインシンク」)を排除することによって処置効果を高めるのに重要な役割を果たすことを示す。従って、本発明の一部の実施形態は、本発明のTILを導入する前に患者に対してリンパ球枯渇ステップ(「免疫抑制コンディショニング」とも称される)を利用する。
性T細胞及び免疫系の競合要素(「サイトカインシンク」)を排除することによって処置効果を高めるのに重要な役割を果たすことを示す。従って、本発明の一部の実施形態は、本発明のTILを導入する前に患者に対してリンパ球枯渇ステップ(「免疫抑制コンディショニング」とも称される)を利用する。
[00734] 一般的に、リンパ球枯渇はフルダラビン又はシクロホスファミド(活性型は
マホスファミドと称される)及びその組み合わせの投与を使用して達成される。かかる方法については、Gassner, et al., Cancer Immunol. Immunother. 2011, 60, 75-85, Muranski, et al., Nat. Clin. Pract. Oncol., 2006, 3, 668-681, Dudley, et al., J. Clin. Oncol. 2008, 26, 5233-5239及びDudley, et al., J. Clin. Oncol. 2005, 23, 2346-2357(これらは、全て参照により全体として本明細書に組み込まれる)に記載されている
。
マホスファミドと称される)及びその組み合わせの投与を使用して達成される。かかる方法については、Gassner, et al., Cancer Immunol. Immunother. 2011, 60, 75-85, Muranski, et al., Nat. Clin. Pract. Oncol., 2006, 3, 668-681, Dudley, et al., J. Clin. Oncol. 2008, 26, 5233-5239及びDudley, et al., J. Clin. Oncol. 2005, 23, 2346-2357(これらは、全て参照により全体として本明細書に組み込まれる)に記載されている
。
[00735] 一部の実施形態において、フルダラビンは、0.5μg/mL~10μg/
mLフルダラビンの濃度で投与される。一部の実施形態において、フルダラビンは、1μg/mLフルダラビンの濃度で投与される。一部の実施形態において、フルダラビン処置は、1日、2日、3日、4日、5日、6日又は7日以上にわたって実施される。一部の実施形態において、フルダラビンは、10mg/kg/日、15mg/kg/日、20mg/kg/日、25mg/kg/日、30mg/kg/日、35mg/kg/日、40mg/kg/日又は45mg/kg/日の投薬量で投与される。一部の実施形態において、フルダラビン処置は、35mg/kg/日で2~7日間にわたって実施される。一部の実施形態において、フルダラビン処置は、35mg/kg/日で4~5日間にわたって実施される。一部の実施形態において、フルダラビン処置は、25mg/kg/日で4~5日間にわたって実施される。
mLフルダラビンの濃度で投与される。一部の実施形態において、フルダラビンは、1μg/mLフルダラビンの濃度で投与される。一部の実施形態において、フルダラビン処置は、1日、2日、3日、4日、5日、6日又は7日以上にわたって実施される。一部の実施形態において、フルダラビンは、10mg/kg/日、15mg/kg/日、20mg/kg/日、25mg/kg/日、30mg/kg/日、35mg/kg/日、40mg/kg/日又は45mg/kg/日の投薬量で投与される。一部の実施形態において、フルダラビン処置は、35mg/kg/日で2~7日間にわたって実施される。一部の実施形態において、フルダラビン処置は、35mg/kg/日で4~5日間にわたって実施される。一部の実施形態において、フルダラビン処置は、25mg/kg/日で4~5日間にわたって実施される。
[00736] 一部の実施形態において、シクロホスファミドの活性型であるマホスファミ
ドは、シクロホスファミドの投与により0.5μg/mL~10μg/mLの濃度で得られる。一部の実施形態において、シクロホスファミドの活性型であるマホスファミドは、シクロホスファミドの投与により1μg/mLの濃度で得られる。一部の実施形態において、シクロホスファミド処置は、1日、2日、3日、4日、5日、6日又は7日以上にわたって実施される。一部の実施形態において、シクロホスファミドは、100mg/m2/日、150mg/m2/日、175mg/m2/日、200mg/m2/日、225mg/m2/日、250mg/m2/日、275mg/m2/日又は300mg/m2/日の投薬量で投与される。一部の実施形態において、シクロホスファミドは静脈内(即ちi.v.)投与される。一部の実施形態において、シクロホスファミド処置は、35mg/kg/日で2~7日間にわたって実施される。一部の実施形態において、シクロホスファミド処置は、250mg/m2/日、i.v.で、4~5日間にわたって実施される。一部の実施形態において、シクロホスファミド処置は、250mg/m2/日、i.v.で、4日間にわたって実施される。
ドは、シクロホスファミドの投与により0.5μg/mL~10μg/mLの濃度で得られる。一部の実施形態において、シクロホスファミドの活性型であるマホスファミドは、シクロホスファミドの投与により1μg/mLの濃度で得られる。一部の実施形態において、シクロホスファミド処置は、1日、2日、3日、4日、5日、6日又は7日以上にわたって実施される。一部の実施形態において、シクロホスファミドは、100mg/m2/日、150mg/m2/日、175mg/m2/日、200mg/m2/日、225mg/m2/日、250mg/m2/日、275mg/m2/日又は300mg/m2/日の投薬量で投与される。一部の実施形態において、シクロホスファミドは静脈内(即ちi.v.)投与される。一部の実施形態において、シクロホスファミド処置は、35mg/kg/日で2~7日間にわたって実施される。一部の実施形態において、シクロホスファミド処置は、250mg/m2/日、i.v.で、4~5日間にわたって実施される。一部の実施形態において、シクロホスファミド処置は、250mg/m2/日、i.v.で、4日間にわたって実施される。
[00737] 一部の実施形態において、リンパ球枯渇は、フルダラビン及びシクロホスフ
ァミドを共に患者に投与することによって行われる。一部の実施形態において、4日間にわたって、フルダラビンは25mg/m2/日、i.v.で投与され、シクロホスファミドは、250mg/m2/日、i.v.で投与される。
ァミドを共に患者に投与することによって行われる。一部の実施形態において、4日間にわたって、フルダラビンは25mg/m2/日、i.v.で投与され、シクロホスファミドは、250mg/m2/日、i.v.で投与される。
[00738] 一実施形態において、リンパ球枯渇は、60mg/m2/日の用量で2日間
のシクロホスファミドの投与ステップと、それに続く25mg/m2/日の用量で5日間のフルダラビンの投与により実施される。
4.IL-2レジメン
のシクロホスファミドの投与ステップと、それに続く25mg/m2/日の用量で5日間のフルダラビンの投与により実施される。
4.IL-2レジメン
[00739] 一実施形態において、IL-2レジメンは、治療有効部分の投与の翌日から
静脈内投与される高用量IL-2レジメンを含み、治療用TIL集団の治療有効部分を投与した1日後から静脈に内投与され始め、高用量IL-2レジメンはアルデスロイキン又はそのバイオシミラー若しくはそれらの変異体を含み、アルデロイキン又はそのバイオシミラー若しくは変異体が8時間毎に15分ボーラス静脈内注入を使用して、最大14用量において0.037mg/kg又は0.044mg/kg IU/kg(患者の体重)の用量で投与される。9日間の静置後、このスケジュールを更に14回、合計で最大28回まで繰り返し得る。
静脈内投与される高用量IL-2レジメンを含み、治療用TIL集団の治療有効部分を投与した1日後から静脈に内投与され始め、高用量IL-2レジメンはアルデスロイキン又はそのバイオシミラー若しくはそれらの変異体を含み、アルデロイキン又はそのバイオシミラー若しくは変異体が8時間毎に15分ボーラス静脈内注入を使用して、最大14用量において0.037mg/kg又は0.044mg/kg IU/kg(患者の体重)の用量で投与される。9日間の静置後、このスケジュールを更に14回、合計で最大28回まで繰り返し得る。
[00740] 一実施形態において、IL-2レジメンは、漸減性IL-2レジメンを含む
。漸減性IL-2レジメンは、O’Day, et al., J. Clin. Oncol. 1999, 17, 2752-61及
びEton, et al., Cancer 2000, 88, 1703-9に記載されており、これらの開示は、参照に
より本明細書に組み込まれる。一実施形態において、漸減性IL-2レジメンは、18×106IU/m2の6時間にわたる静脈内投、それに続く18×106IU/m2の12時間にわたる静脈内投与、その後、18×106IU/m2の24時間にわたる静脈内投与、その後、4.5×106IU/m2の72時間にわたる静脈内投与を含む。この処置サイクルは、最大4サイクル、28日毎に繰り返し得る。一実施形態において、漸減性IL-2レジメンは、1日目の18,000,000IU/m2、2日目の9,000,000IU/m2、3日目及び4日目の4,500,000IU/m2を含む。
。漸減性IL-2レジメンは、O’Day, et al., J. Clin. Oncol. 1999, 17, 2752-61及
びEton, et al., Cancer 2000, 88, 1703-9に記載されており、これらの開示は、参照に
より本明細書に組み込まれる。一実施形態において、漸減性IL-2レジメンは、18×106IU/m2の6時間にわたる静脈内投、それに続く18×106IU/m2の12時間にわたる静脈内投与、その後、18×106IU/m2の24時間にわたる静脈内投与、その後、4.5×106IU/m2の72時間にわたる静脈内投与を含む。この処置サイクルは、最大4サイクル、28日毎に繰り返し得る。一実施形態において、漸減性IL-2レジメンは、1日目の18,000,000IU/m2、2日目の9,000,000IU/m2、3日目及び4日目の4,500,000IU/m2を含む。
[00741] 一実施形態において、IL-2レジメンは、0.10mg/日~50mg/
日の用量において1、2、4、6、7、14又は21日毎にペグ化IL-2を投与することを含む。
日の用量において1、2、4、6、7、14又は21日毎にペグ化IL-2を投与することを含む。
5.養子細胞移入
[00742] 養子細胞移入(ACT)は、非常に有効な形態の免疫療法であり、抗腫瘍活
性を有する免疫細胞を癌患者に移入することを含む。ACTは、抗腫瘍活性を有するリンパ球のインビトロ同定、それらの細胞の数を増やすインビトロ拡大培養及び癌担持宿主へのその注入を伴う治療手法である。養子移入に使用されるリンパ球は、切除された腫瘍の間質に由来し得る(腫瘍浸潤リンパ球又はTIL)。ACTのためのTILは、本明細書に記載される通り調製することができる。一部の実施形態において、TILは、例えば、図8に記載される通りの方法により調製される。TILは、抗腫瘍T細胞受容体(TCR)又はキメラ抗原受容体(CAR)を発現するように遺伝子改変されている場合に血液からも誘導され得るか、混合リンパ球腫瘍細胞培養物(MLTC)でエンリッチされ得るか、又は自己抗原提示細胞及び腫瘍由来ペプチドを使用してクローニングされ得る。注入される癌担持宿主にリンパ球が由来するACTは、自己ACTと称される。米国特許出願公開第2011/0052530号は、主に転移性黒色腫に罹患している患者の治療に向けた、癌退縮を促進するため養子細胞療法を実施する方法に関する(これらの方法に関して全体として参照により組み込まれる)。一部の実施形態において、TILは、本明細書に記載される通り投与することができる。一部の実施形態において、TILは単回用量で投与することができる。そのような投与は、注射、例えば静脈内注射によるものであり得る。一部の実施形態において、TIL及び/又は細胞傷害性リンパ球は複数回用量で投与され得る。投与は、1年に1回、2回、3回、4回、5回、6回又は6回を超え得る。投与は、月に1回、2週間に1回、週に1回又は隔日に1回であり得る。TIL及び/又は細胞傷害性リンパ球の投与は必要な限り継続され得る。
[00742] 養子細胞移入(ACT)は、非常に有効な形態の免疫療法であり、抗腫瘍活
性を有する免疫細胞を癌患者に移入することを含む。ACTは、抗腫瘍活性を有するリンパ球のインビトロ同定、それらの細胞の数を増やすインビトロ拡大培養及び癌担持宿主へのその注入を伴う治療手法である。養子移入に使用されるリンパ球は、切除された腫瘍の間質に由来し得る(腫瘍浸潤リンパ球又はTIL)。ACTのためのTILは、本明細書に記載される通り調製することができる。一部の実施形態において、TILは、例えば、図8に記載される通りの方法により調製される。TILは、抗腫瘍T細胞受容体(TCR)又はキメラ抗原受容体(CAR)を発現するように遺伝子改変されている場合に血液からも誘導され得るか、混合リンパ球腫瘍細胞培養物(MLTC)でエンリッチされ得るか、又は自己抗原提示細胞及び腫瘍由来ペプチドを使用してクローニングされ得る。注入される癌担持宿主にリンパ球が由来するACTは、自己ACTと称される。米国特許出願公開第2011/0052530号は、主に転移性黒色腫に罹患している患者の治療に向けた、癌退縮を促進するため養子細胞療法を実施する方法に関する(これらの方法に関して全体として参照により組み込まれる)。一部の実施形態において、TILは、本明細書に記載される通り投与することができる。一部の実施形態において、TILは単回用量で投与することができる。そのような投与は、注射、例えば静脈内注射によるものであり得る。一部の実施形態において、TIL及び/又は細胞傷害性リンパ球は複数回用量で投与され得る。投与は、1年に1回、2回、3回、4回、5回、6回又は6回を超え得る。投与は、月に1回、2週間に1回、週に1回又は隔日に1回であり得る。TIL及び/又は細胞傷害性リンパ球の投与は必要な限り継続され得る。
6.例示的処置の実施形態
[00743] 一部の実施形態において、本開示は、腫瘍浸潤リンパ球(TIL)集団によ
って癌を処置する方法を提供し、この方法は、(a)患者から切除された腫瘍から第1のTIL集団を得るステップ;(b)第1の細胞培養培地中で第1のTIL集団の初期拡大培養を実施することにより、第2のTIL集団を得るステップであって、第2のTIL集団は、第1のTIL集団よりも数において少なくとも5倍多く、第1の細胞培養培地は、IL-2を含む、ステップ;(c)第2の細胞培養培地中で骨髄系人工抗原提示細胞(骨髄系aAPC)集団を使用して第2のTIL集団の急速拡大培養を実施することにより、第3のTIL集団を得るステップであって、急速拡大培養の開始から7日後、第3のTIL集団は、第2のTIL集団よりも数において少なくとも50倍多く;第2の細胞培養培地は、IL-2及びOKT-3を含む、ステップ;(d)癌を有する患者に治療上有効な分量の第3のTIL集団を投与するステップを含む。一部の実施形態において、本開示は、癌の処置における使用のための腫瘍浸潤リンパ球(TIL)集団であり、TIL集団は、(b)第1の細胞培養培地中において、患者から切除された腫瘍から得られた第1のTIL集団の初期拡大培養を実施することにより、第2のTIL集団を得るステップであっ
て、第2のTIL集団は、第1のTIL集団よりも数において少なくとも5倍多く、第1の細胞培養培地は、IL-2を含む、ステップ;(c)第2の細胞培養培地中で骨髄系人工抗原提示細胞(骨髄系aAPC)集団を使用して第2のTIL集団の急速拡大培養を実施することにより、第3のTIL集団を得るステップであって、急速拡大培養の開始から7日後、第3のTIL集団は、第2のTIL集団よりも数において少なくとも50倍多く;第2の細胞培養培地は、IL-2及びOKT-3を含む、ステップ;(d)癌を有する患者に治療上有効な分量の第3のTIL集団を投与するステップを含む方法によって得ることができる。一部の実施形態において、本方法は、患者から切除された腫瘍から第1のTIL集団を得る第1のステップ(a)を含む。一部の実施形態において、第2の細胞培養培地中において、IL-2は、約3000IU/mLの初期濃度で存在し、及びOKT-3抗体は、約30ng/mLの初期濃度で存在する。一部の実施形態において、第1の拡大培養は、14日以下の期間にわたって実施される。一部の実施形態において、第1の拡大培養は、ガス透過性容器を使用して実施される。一部の実施形態において、第2の拡大培養は、ガス透過性容器を使用して実施される。一部の実施形態において、急速拡大培養における第2のTIL集団とaAPC集団との比は、1:80~1:400である。一部の実施形態において、急速拡大培養における第2のTIL集団とaAPC集団との比は、約1対300である。一部の実施形態において、処置される癌は、黒色腫、卵巣癌、子宮頸癌、非小細胞肺癌(NSCLC)、肺癌、膀胱癌、乳癌、ヒトパピローマウイルスによって引き起こされる癌、頭頸部癌(頭頸部扁平上皮癌(HNSCC)を含む)、腎癌及び腎細胞癌からなる群から選択される。一部の実施形態において、処置される癌は、黒色腫、卵巣癌及び子宮頸癌からなる群から選択される。一部の実施形態において、処置される癌は、黒色腫である。一部の実施形態において、処置される癌は、卵巣癌である。一部の実施形態において、処置される癌は、子宮頸癌である。一部の実施形態において、癌の処置方法は、患者に第3のTIL集団を投与する前に骨髄非破壊的リンパ球枯渇レジメンによって患者を処置するステップを更に含む。一部の実施形態において、骨髄非破壊的リンパ球枯渇レジメンは、60mg/m2/日の用量で2日間のシクロホスファミドの投与ステップと、それに続く25mg/m2/日の用量で5日間のフルダラビンの投与ステップを含む。一部の実施形態において、高用量IL-2レジメンは、忍容量まで8時間毎に15分ボーラス静脈内注入として投与される600,000又は720,000IU/kgのアルデスロイキン又はそのバイオシミラー若しくは変異体を含む。一部の実施形態において、処置に使用されるTILは、第1及び/又は第2の拡大培養、例えば図8のステップB、C及び/又はD中に細胞培養培地に添加され得るPD-1、LAG-3、TIM-3、CISH及びCBLBを含む、本明細書に記載の遺伝子を標的とする1つ以上のsd-RNAと接触しており、ここで、TIL及び他の薬剤は、0.1μM sd-RNA/10,000TIL/100μL培地、0.5μM sd-RNA/10,000TIL/100μL培地、0.75μM sd-RNA/10,000TIL/100μL培地、1μM sd-RNA/10,000TIL/100μL培地、1.25μM sd-RNA/10,000TIL/100μL培地、1.5μM sd-RNA/10,000TIL/100μL培地、2μM sd-RNA/10,000TIL/100μL培地、5μM sd-RNA/10,000TIL/100μL培地又は10μM sd-RNA/10,000TIL/100μL培地からなる群から選択される量で添加され得る。一部の実施形態において、処置に使用されるTILは、第1及び/又は第2の拡大培養、例えば図8のステップB、C及び/又はD中、1日2回、1日1回、2日毎、3日毎、4日毎、5日毎、6日毎又は7日毎にTIL培養物に添加され得る、PD-1、LAG-3、TIM-3、CISH及びCBLBを含む、本明細書に記載の遺伝子を標的とする1つ以上のsd-RNAと接触している。一実施形態において、処置に使用されるTILは、PD-1、LAG-3、TIM-3、CISH及びCBLBを含む、本明細書に記載の遺伝子を標的とする1つ以上のsd-RNAと接触しており、ここで、TIL及び他の薬剤は、0.1μM sd-RNA/10,000TIL、0.5μM sd-RNA/10,000TIL、0.75μM sd-RNA/10,000TIL、1μM s
d-RNA/10,000TIL、1.25μM sd-RNA/10,000TIL、1.5μM sd-RNA/10,000TIL、2μM sd-RNA/10,000TIL、5μM sd-RNA/10,000TIL又は10μM sd-RNA/10,000TILからなる群から選択される量において、第1及び/又は第2の拡大培養、例えば図8のステップB、C及び/又はD中に添加され得る。一実施形態において、処置に使用されるTILは、PD-1、LAG-3、TIM-3、CISH及びCBLBを含む、本明細書に記載の遺伝子を標的とする1つ以上のsd-RNAと接触しており、ここで、TIL及び他の薬剤は、第1及び/又は第2の拡大培養、例えば図8のステップB、C及び/又はD中、1日2回、1日1回、2日毎、3日毎、4日毎、5日毎、6日毎又は7日毎にTIL培養物に添加され得る。
[00743] 一部の実施形態において、本開示は、腫瘍浸潤リンパ球(TIL)集団によ
って癌を処置する方法を提供し、この方法は、(a)患者から切除された腫瘍から第1のTIL集団を得るステップ;(b)第1の細胞培養培地中で第1のTIL集団の初期拡大培養を実施することにより、第2のTIL集団を得るステップであって、第2のTIL集団は、第1のTIL集団よりも数において少なくとも5倍多く、第1の細胞培養培地は、IL-2を含む、ステップ;(c)第2の細胞培養培地中で骨髄系人工抗原提示細胞(骨髄系aAPC)集団を使用して第2のTIL集団の急速拡大培養を実施することにより、第3のTIL集団を得るステップであって、急速拡大培養の開始から7日後、第3のTIL集団は、第2のTIL集団よりも数において少なくとも50倍多く;第2の細胞培養培地は、IL-2及びOKT-3を含む、ステップ;(d)癌を有する患者に治療上有効な分量の第3のTIL集団を投与するステップを含む。一部の実施形態において、本開示は、癌の処置における使用のための腫瘍浸潤リンパ球(TIL)集団であり、TIL集団は、(b)第1の細胞培養培地中において、患者から切除された腫瘍から得られた第1のTIL集団の初期拡大培養を実施することにより、第2のTIL集団を得るステップであっ
て、第2のTIL集団は、第1のTIL集団よりも数において少なくとも5倍多く、第1の細胞培養培地は、IL-2を含む、ステップ;(c)第2の細胞培養培地中で骨髄系人工抗原提示細胞(骨髄系aAPC)集団を使用して第2のTIL集団の急速拡大培養を実施することにより、第3のTIL集団を得るステップであって、急速拡大培養の開始から7日後、第3のTIL集団は、第2のTIL集団よりも数において少なくとも50倍多く;第2の細胞培養培地は、IL-2及びOKT-3を含む、ステップ;(d)癌を有する患者に治療上有効な分量の第3のTIL集団を投与するステップを含む方法によって得ることができる。一部の実施形態において、本方法は、患者から切除された腫瘍から第1のTIL集団を得る第1のステップ(a)を含む。一部の実施形態において、第2の細胞培養培地中において、IL-2は、約3000IU/mLの初期濃度で存在し、及びOKT-3抗体は、約30ng/mLの初期濃度で存在する。一部の実施形態において、第1の拡大培養は、14日以下の期間にわたって実施される。一部の実施形態において、第1の拡大培養は、ガス透過性容器を使用して実施される。一部の実施形態において、第2の拡大培養は、ガス透過性容器を使用して実施される。一部の実施形態において、急速拡大培養における第2のTIL集団とaAPC集団との比は、1:80~1:400である。一部の実施形態において、急速拡大培養における第2のTIL集団とaAPC集団との比は、約1対300である。一部の実施形態において、処置される癌は、黒色腫、卵巣癌、子宮頸癌、非小細胞肺癌(NSCLC)、肺癌、膀胱癌、乳癌、ヒトパピローマウイルスによって引き起こされる癌、頭頸部癌(頭頸部扁平上皮癌(HNSCC)を含む)、腎癌及び腎細胞癌からなる群から選択される。一部の実施形態において、処置される癌は、黒色腫、卵巣癌及び子宮頸癌からなる群から選択される。一部の実施形態において、処置される癌は、黒色腫である。一部の実施形態において、処置される癌は、卵巣癌である。一部の実施形態において、処置される癌は、子宮頸癌である。一部の実施形態において、癌の処置方法は、患者に第3のTIL集団を投与する前に骨髄非破壊的リンパ球枯渇レジメンによって患者を処置するステップを更に含む。一部の実施形態において、骨髄非破壊的リンパ球枯渇レジメンは、60mg/m2/日の用量で2日間のシクロホスファミドの投与ステップと、それに続く25mg/m2/日の用量で5日間のフルダラビンの投与ステップを含む。一部の実施形態において、高用量IL-2レジメンは、忍容量まで8時間毎に15分ボーラス静脈内注入として投与される600,000又は720,000IU/kgのアルデスロイキン又はそのバイオシミラー若しくは変異体を含む。一部の実施形態において、処置に使用されるTILは、第1及び/又は第2の拡大培養、例えば図8のステップB、C及び/又はD中に細胞培養培地に添加され得るPD-1、LAG-3、TIM-3、CISH及びCBLBを含む、本明細書に記載の遺伝子を標的とする1つ以上のsd-RNAと接触しており、ここで、TIL及び他の薬剤は、0.1μM sd-RNA/10,000TIL/100μL培地、0.5μM sd-RNA/10,000TIL/100μL培地、0.75μM sd-RNA/10,000TIL/100μL培地、1μM sd-RNA/10,000TIL/100μL培地、1.25μM sd-RNA/10,000TIL/100μL培地、1.5μM sd-RNA/10,000TIL/100μL培地、2μM sd-RNA/10,000TIL/100μL培地、5μM sd-RNA/10,000TIL/100μL培地又は10μM sd-RNA/10,000TIL/100μL培地からなる群から選択される量で添加され得る。一部の実施形態において、処置に使用されるTILは、第1及び/又は第2の拡大培養、例えば図8のステップB、C及び/又はD中、1日2回、1日1回、2日毎、3日毎、4日毎、5日毎、6日毎又は7日毎にTIL培養物に添加され得る、PD-1、LAG-3、TIM-3、CISH及びCBLBを含む、本明細書に記載の遺伝子を標的とする1つ以上のsd-RNAと接触している。一実施形態において、処置に使用されるTILは、PD-1、LAG-3、TIM-3、CISH及びCBLBを含む、本明細書に記載の遺伝子を標的とする1つ以上のsd-RNAと接触しており、ここで、TIL及び他の薬剤は、0.1μM sd-RNA/10,000TIL、0.5μM sd-RNA/10,000TIL、0.75μM sd-RNA/10,000TIL、1μM s
d-RNA/10,000TIL、1.25μM sd-RNA/10,000TIL、1.5μM sd-RNA/10,000TIL、2μM sd-RNA/10,000TIL、5μM sd-RNA/10,000TIL又は10μM sd-RNA/10,000TILからなる群から選択される量において、第1及び/又は第2の拡大培養、例えば図8のステップB、C及び/又はD中に添加され得る。一実施形態において、処置に使用されるTILは、PD-1、LAG-3、TIM-3、CISH及びCBLBを含む、本明細書に記載の遺伝子を標的とする1つ以上のsd-RNAと接触しており、ここで、TIL及び他の薬剤は、第1及び/又は第2の拡大培養、例えば図8のステップB、C及び/又はD中、1日2回、1日1回、2日毎、3日毎、4日毎、5日毎、6日毎又は7日毎にTIL培養物に添加され得る。
実施例
[00744] ここで、本明細書に包含される実施形態は、以下の実施例を参照して説明さ
れる。これらの実施例は、説明のみを目的として提供され、本明細書に包含される開示は、決してこれらの実施例に限定されると解釈されるべきではなく、むしろ本明細書に提供される教示の結果として明らかになるあらゆる変形形態を包含すると解釈されるべきである。
[00744] ここで、本明細書に包含される実施形態は、以下の実施例を参照して説明さ
れる。これらの実施例は、説明のみを目的として提供され、本明細書に包含される開示は、決してこれらの実施例に限定されると解釈されるべきではなく、むしろ本明細書に提供される教示の結果として明らかになるあらゆる変形形態を包含すると解釈されるべきである。
実施例1:閉鎖系アッセイ
[00745] 本明細書で考察されるように、閉鎖系で患者の腫瘍からTILを開発するた
めのプロトコル及びアッセイが開発された。
[00745] 本明細書で考察されるように、閉鎖系で患者の腫瘍からTILを開発するた
めのプロトコル及びアッセイが開発された。
[00746] この実施例では、G-REX装置で患者の切除腫瘍組織から臨床的に重要な数のTILを産生し、最終細胞製品を凍結保存するための新規簡略手順について説明する。この手順の追加の側面については、実施例2~8で説明する。
手順
[00747] 高度な調製:0日目(最大36時間前に実施)、500mLのハンクス平衡
塩類溶液に50μg/mLのゲンタマイシンを添加して、TIL分離洗浄バッファー(TIWB)を調製した。10mg/mLのゲンタマイシンストック溶液には、2.5mLをHBSSに移した。50mg/mLのストック溶液には、0.5mLをHBSSに移した。
[00747] 高度な調製:0日目(最大36時間前に実施)、500mLのハンクス平衡
塩類溶液に50μg/mLのゲンタマイシンを添加して、TIL分離洗浄バッファー(TIWB)を調製した。10mg/mLのゲンタマイシンストック溶液には、2.5mLをHBSSに移した。50mg/mLのストック溶液には、0.5mLをHBSSに移した。
[00748] CM2の手順については、LAB-005「プレREP及びREPの培地の
調製」に従ってGlutaMax(商標)でCM1培地を調製した。4℃で最大24時間貯蔵。使用前に少なくとも1時間、37℃で温めた。
調製」に従ってGlutaMax(商標)でCM1培地を調製した。4℃で最大24時間貯蔵。使用前に少なくとも1時間、37℃で温めた。
[00749] IL-2アリコートを-20℃の冷凍庫から取り出し、2~8℃の冷蔵庫に
入れた。腫瘍標本を取り出し、処理の準備ができるまで4℃で貯蔵した。
入れた。腫瘍標本を取り出し、処理の準備ができるまで4℃で貯蔵した。
[00750] HypoThermasol又はCryoStor CS10(いずれもBioLife Solutions,Inc.から市
販されている)で凍結断片として未使用腫瘍を出荷した。
販されている)で凍結断片として未使用腫瘍を出荷した。
TILの腫瘍処理
[00751] 必要に応じて、以下の材料を無菌的にBSCに移し、以下の表16に従って
表示を付した。
[00751] 必要に応じて、以下の材料を無菌的にBSCに移し、以下の表16に従って
表示を付した。
[00752] 5mLのゲンタマイシンをHBSSボトルに移した。TIWBと表示を付し
た。混ざるように撹拌した。50mLのTIWBを各皿にピペットした。長鉗子を使用し、標本ボトルから腫瘍を取り出し、洗浄1皿に移した。洗浄皿で、周囲温度で3分間腫瘍をインキュベートした。腫瘍を洗浄皿に移し、洗浄皿で周囲温度において3分間腫瘍をインキュベートした。新しい洗浄皿で洗浄を繰り返す。
た。混ざるように撹拌した。50mLのTIWBを各皿にピペットした。長鉗子を使用し、標本ボトルから腫瘍を取り出し、洗浄1皿に移した。洗浄皿で、周囲温度で3分間腫瘍をインキュベートした。腫瘍を洗浄皿に移し、洗浄皿で周囲温度において3分間腫瘍をインキュベートした。新しい洗浄皿で洗浄を繰り返す。
[00753] 腫瘍の長さを測定及び記録した。腫瘍断片を初めに10の中間片に剥離し、
各中間片の腫瘍構造を保存した。一度に1つの中間腫瘍断片を使用して、腫瘍を最大3×3×3mmの断片に慎重に薄切りにした。残りの中間腫瘍断片について繰り返した。
各中間片の腫瘍構造を保存した。一度に1つの中間腫瘍断片を使用して、腫瘍を最大3×3×3mmの断片に慎重に薄切りにした。残りの中間腫瘍断片について繰り返した。
[00754] 利用可能な腫瘍断片が4つ未満である場合、40の断片の目標を達成するた
めに利用可能な他の断片を使用した。40個未満の断片の場合、10~40個を単一のG-Rex 100Mフラスコに入れた。
めに利用可能な他の断片を使用した。40個未満の断片の場合、10~40個を単一のG-Rex 100Mフラスコに入れた。
G-Rex 100Mフラスコに播種する
[00755] 必要に応じて、以下の材料を無菌的にBSCに移し、以下の表4に従って表
示を付した。
[00755] 必要に応じて、以下の材料を無菌的にBSCに移し、以下の表4に従って表
示を付した。
[00756] CM1にリットル毎に1mLのIL-2ストック溶液(6×106IU/m
L)を添加した。
L)を添加した。
[00757] 以下の表5で決定されるように、必要な各G-REX 100Mバイオリアクターに、
6,000IU/mLのIL-2を含む1000mLの予め温めたCM1を入れた。ホールピペットを使用して、適切な数の腫瘍断片を各G-Rex 100Mフラスコに移し、表5に従って断片を分配した。G-Rex 100Mフラスコに移した1つ以上の入手可能な腫瘍断片が浮かんでいる場合、追加の腫瘍断片を1つ取得し、G-Rex 100Mフラスコに移した。各フラスコに加えられた断片の総数を記録した。各G-REX 100Mバイオリアクターを37℃、5%CO2インキュベーターに入れた。
6,000IU/mLのIL-2を含む1000mLの予め温めたCM1を入れた。ホールピペットを使用して、適切な数の腫瘍断片を各G-Rex 100Mフラスコに移し、表5に従って断片を分配した。G-Rex 100Mフラスコに移した1つ以上の入手可能な腫瘍断片が浮かんでいる場合、追加の腫瘍断片を1つ取得し、G-Rex 100Mフラスコに移した。各フラスコに加えられた断片の総数を記録した。各G-REX 100Mバイオリアクターを37℃、5%CO2インキュベーターに入れた。
[00758] >41の断片が得られた場合、1000mLの予め温めた完全なCM1を第
2のG-REX 100Mバイオリアクターに入れた。
2のG-REX 100Mバイオリアクターに入れた。
高度な調製:11日目(最大24時間前に調製)
[00759] GlutaMaxで6LのCM2を調製した。CM2の手順については、「プレRE
P及びREPの培地の調製」の参考検査手順を使用した。使用の1時間前に37℃で加温した。IL-2アリコートを解凍した:冷凍庫からIL-2アリコートを取り出し、4℃
に置いた。
[00759] GlutaMaxで6LのCM2を調製した。CM2の手順については、「プレRE
P及びREPの培地の調製」の参考検査手順を使用した。使用の1時間前に37℃で加温した。IL-2アリコートを解凍した:冷凍庫からIL-2アリコートを取り出し、4℃
に置いた。
TILを回収する(11日目)
[00760] インキュベーターからG-REX-100Mフラスコを取り外し、BSC2に入れた。
フラスコの底にある細胞を乱さなかった。GatherRex又は蠕動式ポンプを使用して、フラ
スコから約900mLの細胞培養上清を吸引した。フラスコを静かに旋回させてTILを再懸濁した。全ての細胞が膜から遊離していることが観察された。残留細胞懸濁液を適切なサイズの血液移送パック(300~1000mL)に移した。断片が血液移送パックに移らないように注意した。移送パックに4インチ血漿移送セットを固定した。細胞懸濁液を混合し、3mLシリンジを使用して、細胞カウントのために1mLのTIL懸濁液を取り出した。使用する準備ができるまで移送パックをインキュベーターに入れた。
[00760] インキュベーターからG-REX-100Mフラスコを取り外し、BSC2に入れた。
フラスコの底にある細胞を乱さなかった。GatherRex又は蠕動式ポンプを使用して、フラ
スコから約900mLの細胞培養上清を吸引した。フラスコを静かに旋回させてTILを再懸濁した。全ての細胞が膜から遊離していることが観察された。残留細胞懸濁液を適切なサイズの血液移送パック(300~1000mL)に移した。断片が血液移送パックに移らないように注意した。移送パックに4インチ血漿移送セットを固定した。細胞懸濁液を混合し、3mLシリンジを使用して、細胞カウントのために1mLのTIL懸濁液を取り出した。使用する準備ができるまで移送パックをインキュベーターに入れた。
培地の調製
[00761] 培地を37℃で>1時間温めた。3mLの6×106IU/mLストックr
hIL-2を6LのCM2に加え、最終濃度3,000IU/mL rhIL-2にした(「完全CM2」)。メスルアー付きの4インチ血漿移送セットを1L移送パックに滅菌溶接した。500mLの完全CM2を1L移送パックに移した。針付きの1.0mLシリンジを使用して、150μLの1mg/mL抗CD3(クローンOKT3)を吸い上げ、500mLの「完全CM2」に移した。使用するまで37℃で貯蔵した。
[00761] 培地を37℃で>1時間温めた。3mLの6×106IU/mLストックr
hIL-2を6LのCM2に加え、最終濃度3,000IU/mL rhIL-2にした(「完全CM2」)。メスルアー付きの4インチ血漿移送セットを1L移送パックに滅菌溶接した。500mLの完全CM2を1L移送パックに移した。針付きの1.0mLシリンジを使用して、150μLの1mg/mL抗CD3(クローンOKT3)を吸い上げ、500mLの「完全CM2」に移した。使用するまで37℃で貯蔵した。
フラスコの調製
[00762] 4.5Lの「完全CM2」をG-REX-500Mフラスコに移し、準備ができるまで
フラスコを37℃のインキュベーターに入れた。
[00762] 4.5Lの「完全CM2」をG-REX-500Mフラスコに移し、準備ができるまで
フラスコを37℃のインキュベーターに入れた。
照射フィーダーを解凍する
[00763] 2人以上のドナーからの5.0×109の同種異系照射フィーダーを使用し
た。LN2冷凍庫からフィーダーを取り外した。フィーダーを37℃のインキュベーター又はビーズバスで解凍した。ほぼ完全に解凍されたが、依然として冷えているときにフィーダーを浴から取り出した。十分な数の照射細胞(5×109個の細胞、+/-20%)を確保するため、各フィーダーバッグをオープンG-Rex 500Mに直接加えた。500mLの「完全CM2」+OKT3を含む1L移送パックを取り外し、BSCに移した。フィーダーバッグの内容物全体をシリンジに引き込み、容積を記録し、5.0×109個の同種異系照射フィーダーを移送パックに分配した。
[00763] 2人以上のドナーからの5.0×109の同種異系照射フィーダーを使用し
た。LN2冷凍庫からフィーダーを取り外した。フィーダーを37℃のインキュベーター又はビーズバスで解凍した。ほぼ完全に解凍されたが、依然として冷えているときにフィーダーを浴から取り出した。十分な数の照射細胞(5×109個の細胞、+/-20%)を確保するため、各フィーダーバッグをオープンG-Rex 500Mに直接加えた。500mLの「完全CM2」+OKT3を含む1L移送パックを取り外し、BSCに移した。フィーダーバッグの内容物全体をシリンジに引き込み、容積を記録し、5.0×109個の同種異系照射フィーダーを移送パックに分配した。
[00764] 標的細胞数の+/-10%(5.0×109)に>70%の生存率で到達し
た場合に続行した。標的細胞数の90%未満(5.0×109)に>70%の生存率で到達した場合、別のバッグを解凍し、上記を繰り返した。標的細胞数の110%以上が達成された場合、所望の細胞用量に必要な適切容積を計算して進めた。
た場合に続行した。標的細胞数の90%未満(5.0×109)に>70%の生存率で到達した場合、別のバッグを解凍し、上記を繰り返した。標的細胞数の110%以上が達成された場合、所望の細胞用量に必要な適切容積を計算して進めた。
G-REX 500MフラスコでのTIL及びフィーダーの共培養
[00765] インキュベーターから調製済み培地を含むG-REX 500Mフラスコを取り外した
。フィーダー移送パックをG-REX-500Mに取り付け、バッグの内容物を500Mに排出できるようにした。合計200×106の生細胞を達成するために追加するTIL懸濁液の量を計算した。
(TVC/mL)/200×106=mL
[00765] インキュベーターから調製済み培地を含むG-REX 500Mフラスコを取り外した
。フィーダー移送パックをG-REX-500Mに取り付け、バッグの内容物を500Mに排出できるようにした。合計200×106の生細胞を達成するために追加するTIL懸濁液の量を計算した。
(TVC/mL)/200×106=mL
[00766] TILが5~200×106の合計生細胞である場合、全てのTIL(全量
)をG-REX-500Mに加えた。TILカウントが生細胞総数200×106を超えた場合、200×106個のTILを個々のG-REX-500Mに分配するのに必要な量計算して加えた。残りのTILをスピンダウンし、CS10で最大108/mLの少なくとも2つのクライオ
バイアルで凍結し、TIL識別表示及び凍結日付の表示を付した。
)をG-REX-500Mに加えた。TILカウントが生細胞総数200×106を超えた場合、200×106個のTILを個々のG-REX-500Mに分配するのに必要な量計算して加えた。残りのTILをスピンダウンし、CS10で最大108/mLの少なくとも2つのクライオ
バイアルで凍結し、TIL識別表示及び凍結日付の表示を付した。
[00767] G-REX-500Mを37℃、5%CO2インキュベーターに5日間入れた。
高度な調製:16~18日目
[00768] 50×106個未満のTILで開始した培養のためのAIM Vの10Lバッグ1つ、50×106個を超えるTILで開始したバッグ2つを37℃で少なくとも1時間又は使用する準備が整うまで温めた。
[00768] 50×106個未満のTILで開始した培養のためのAIM Vの10Lバッグ1つ、50×106個を超えるTILで開始したバッグ2つを37℃で少なくとも1時間又は使用する準備が整うまで温めた。
TIL細胞カウントを実施:16~18日目
[00769] インキュベーターからG-REX 500Mフラスコを取り外し、フラスコの底にある
細胞培養物を乱さないように注意した。G-REX-500Mフラスコから4Lの細胞培養培地を取り出し、滅菌容器に入れた。全てのTILが膜から再懸濁されるまでG-REX-500Mを旋回させた。細胞懸濁液を2L移送パックに移した。後で使用するために500Mフラスコを保持した。以下の式に従い、継代培養に必要なフラスコの総数を計算した。端数は切り上げた。総生細胞/1.0×109=フラスコ数
[00769] インキュベーターからG-REX 500Mフラスコを取り外し、フラスコの底にある
細胞培養物を乱さないように注意した。G-REX-500Mフラスコから4Lの細胞培養培地を取り出し、滅菌容器に入れた。全てのTILが膜から再懸濁されるまでG-REX-500Mを旋回させた。細胞懸濁液を2L移送パックに移した。後で使用するために500Mフラスコを保持した。以下の式に従い、継代培養に必要なフラスコの総数を計算した。端数は切り上げた。総生細胞/1.0×109=フラスコ数
CM4を調製する
[00770] 必要な500Mフラスコ2本毎に10LのAIM-Vバッグを準備した。必要に応じて追加の培地を温めた。AIM-Vが10L必要になる毎に100mLのGlutaMAXを加えてCM
4を作成した。3,000IU/mL rhIL-2の最終濃度のためにCM4培地にrhIL-2を添加した。細胞培養を分割する。各G-REX-500Mを5Lまで充填した。計算した数のG-REX-500MでTIL量を均等に分配した。REPの22日目に回収するまでフラスコを37℃、5%CO2インキュベーターに入れた。
[00770] 必要な500Mフラスコ2本毎に10LのAIM-Vバッグを準備した。必要に応じて追加の培地を温めた。AIM-Vが10L必要になる毎に100mLのGlutaMAXを加えてCM
4を作成した。3,000IU/mL rhIL-2の最終濃度のためにCM4培地にrhIL-2を添加した。細胞培養を分割する。各G-REX-500Mを5Lまで充填した。計算した数のG-REX-500MでTIL量を均等に分配した。REPの22日目に回収するまでフラスコを37℃、5%CO2インキュベーターに入れた。
高度な調製:22~24日目
[00771] PlasmaLyte A 7.4の2つの1Lバッグのそれぞれに40mLの25%HSA
を加え、2Lの1%HSA洗浄バッファーを調製した。LOVO補助バッグにプールする。600IU/mLのIL-2で200mLのCS10を添加した。4つの750mLアルミニウム冷凍庫キャニスターを4℃で予め冷却した。
[00771] PlasmaLyte A 7.4の2つの1Lバッグのそれぞれに40mLの25%HSA
を加え、2Lの1%HSA洗浄バッファーを調製した。LOVO補助バッグにプールする。600IU/mLのIL-2で200mLのCS10を添加した。4つの750mLアルミニウム冷凍庫キャニスターを4℃で予め冷却した。
TILを回収する:22~24日目
[00772] 37℃のインキュベーターからG-REX 500Mフラスコを取り外し、フラスコの
底にある細胞培養物を乱さないように注意した。各フラスコから細胞培養上清4.5Lを吸引して廃棄した。G-REX-500Mフラスコを旋回させて、TILを完全に再懸濁した。TILをバイオプロセスバッグに回収した。バッグをよく混合し、3mLシリンジを使用して、細胞カウントのために2×2mLのサンプルを採取した。バッグの重量を量り、初期重量と最終重量に差を発見した。以下の計算を使用して、細胞懸濁液の量を決定した。
細胞懸濁液の正味重量(mL)/1.03=容積(mL)
[00772] 37℃のインキュベーターからG-REX 500Mフラスコを取り外し、フラスコの
底にある細胞培養物を乱さないように注意した。各フラスコから細胞培養上清4.5Lを吸引して廃棄した。G-REX-500Mフラスコを旋回させて、TILを完全に再懸濁した。TILをバイオプロセスバッグに回収した。バッグをよく混合し、3mLシリンジを使用して、細胞カウントのために2×2mLのサンプルを採取した。バッグの重量を量り、初期重量と最終重量に差を発見した。以下の計算を使用して、細胞懸濁液の量を決定した。
細胞懸濁液の正味重量(mL)/1.03=容積(mL)
[00773] TILをろ過してLOVO原料バッグを準備する。全細胞がLOVO原料バッグに移
されると、全てのクランプを閉じ、LOVOソースバッグのチューブを密閉してフィルターを取り外し、秤量した。体積を計算した。
されると、全てのクランプを閉じ、LOVOソースバッグのチューブを密閉してフィルターを取り外し、秤量した。体積を計算した。
[00774] 600IU/mLのrhIL-2を添加した冷温のCS10でTIL1:1
を処方する。
を処方する。
[00775] 必要なクライオバッグの必要数を計算した。
(細胞製品の容積×2)/100=必要バッグ数(切り捨て)
(細胞製品の容積×2)/100=必要バッグ数(切り捨て)
[00776] 各バッグに分注する容積を計算した。
(細胞製品の容積×2)/必要バッグ数=各バッグに加える容積
(細胞製品の容積×2)/必要バッグ数=各バッグに加える容積
[00777] 表6の以下の材料をBSCに無菌的に移した。
TILの製剤
[00778] LOVO最終物、CS10バッグルアーロック及び適切な数のクライオバッグが
取り付けられた。必要なCS10容積は、LOVO最終物バッグの容積と同等であった。反転によりLOVO最終物バッグを混合した。
[00778] LOVO最終物、CS10バッグルアーロック及び適切な数のクライオバッグが
取り付けられた。必要なCS10容積は、LOVO最終物バッグの容積と同等であった。反転によりLOVO最終物バッグを混合した。
[00779] 製剤化された産物100mLを各クライオバッグに移した。クライオバッグ
から全ての気泡を取り除き、密封した。密封したバッグを4℃にし、予め冷却したアルミニウム製冷凍キャニスターに置いた。
から全ての気泡を取り除き、密封した。密封したバッグを4℃にし、予め冷却したアルミニウム製冷凍キャニスターに置いた。
コントロールレートフリーザー(CRF)を使用したTILの凍結保存。
[00780] 速度を制御された冷凍庫の標準手順に従った。CRFを使用した後、液体窒
素(LN2)にクライオバッグを貯蔵した。
[00780] 速度を制御された冷凍庫の標準手順に従った。CRFを使用した後、液体窒
素(LN2)にクライオバッグを貯蔵した。
実施例2:リンパ球枯渇
[00781] 細胞は、7日目及びリンパ球減少前にカウントできる。最終細胞製品には、Plasma-Lyte A(商標)の最小50%のHypoThermosol(商標)(容積/容積)及び300
IU/mLのIL2を含む最大0.5%HSA(ヒト注入に適合)で製剤化された最大約150×109個の生細胞が含まれる。最終産物は、注入のための2つの容積のいずれかで投与に使用できた。
1)回収された総TILが≦75×109個である場合、250mL(容量300mLの輸注バッグ内)、又は
2)回収された総TILが<150×109個である場合、500mL(容量600mL
の輸注バッグ内)
[00781] 細胞は、7日目及びリンパ球減少前にカウントできる。最終細胞製品には、Plasma-Lyte A(商標)の最小50%のHypoThermosol(商標)(容積/容積)及び300
IU/mLのIL2を含む最大0.5%HSA(ヒト注入に適合)で製剤化された最大約150×109個の生細胞が含まれる。最終産物は、注入のための2つの容積のいずれかで投与に使用できた。
1)回収された総TILが≦75×109個である場合、250mL(容量300mLの輸注バッグ内)、又は
2)回収された総TILが<150×109個である場合、500mL(容量600mL
の輸注バッグ内)
[00782] REPステップ中のT細胞拡大培養率に患者間で差があるため、各患者の最
終TIL注入産物のために産生される可能性のある細胞の総数は予測できない。3~14日間のREPの3、4、5、6、7日目の細胞の下限は、シクロホスファミド及びフルダラビンの化学療法レジメンを使用して患者をリンパ球枯渇させる判断を下すために必要な最小細胞数に基づいて設定される。この最小到達細胞数に基づいてリンパ球枯渇を開始すると、3日目から14日目のいずれか及び多くの場合には7日目までに、REPで生成されるTILの利用可能な数で患者を処置することが約束される。注入の範囲の上限(150×109個の生細胞)は、臨床応答が達成された場合に安全に注入された公知の公開上限に基づいている。Radvanyi, et al., Clin Cancer Res 2012, 18, 6758-6770。
終TIL注入産物のために産生される可能性のある細胞の総数は予測できない。3~14日間のREPの3、4、5、6、7日目の細胞の下限は、シクロホスファミド及びフルダラビンの化学療法レジメンを使用して患者をリンパ球枯渇させる判断を下すために必要な最小細胞数に基づいて設定される。この最小到達細胞数に基づいてリンパ球枯渇を開始すると、3日目から14日目のいずれか及び多くの場合には7日目までに、REPで生成されるTILの利用可能な数で患者を処置することが約束される。注入の範囲の上限(150×109個の生細胞)は、臨床応答が達成された場合に安全に注入された公知の公開上限に基づいている。Radvanyi, et al., Clin Cancer Res 2012, 18, 6758-6770。
実施例3:プロセス2A - 0日目
[00783] この実施例では、実施例3~6で説明した2Aプロセスの詳細な0日目のプ
ロトコルについて説明する。
[00783] この実施例では、実施例3~6で説明した2Aプロセスの詳細な0日目のプ
ロトコルについて説明する。
調製。
[00785] 腫瘍洗浄培地CM1及びIL-2は、有効期限内であることを確認した。イ
ンキュベーターにCM1(細胞培養培地1)を入れた。
[00785] 腫瘍洗浄培地CM1及びIL-2は、有効期限内であることを確認した。イ
ンキュベーターにCM1(細胞培養培地1)を入れた。
方法。
[00786] 6000IU/mLのIL-2を含むTIL培地CM1を調整した:1Lの
CM1及び1mlのIL-2(6,000,000IU/mL)。G-REXに加えるときに
断片に使用するため、25mlのCM1+IL2を50mlのコニカルに入れ、予温のため37℃のインキュベーターに入れた。
[00786] 6000IU/mLのIL-2を含むTIL培地CM1を調整した:1Lの
CM1及び1mlのIL-2(6,000,000IU/mL)。G-REXに加えるときに
断片に使用するため、25mlのCM1+IL2を50mlのコニカルに入れ、予温のため37℃のインキュベーターに入れた。
[00787] 各G-REX 100MCSバイオリアクターに、6,000IU/mlのIL-2を含
む予め温めた975mlのCM1を注入した。必要になるまでインキュベーターにG-REX 100MCSを入れた。
む予め温めた975mlのCM1を注入した。必要になるまでインキュベーターにG-REX 100MCSを入れた。
組織剥離
[00788] 腫瘍処理の開始時間を記録した。過剰な腫瘍断片のために、3~5mLの腫
瘍洗浄培地を1つの6ウェルプレートの各ウェルにピペットで入れた。50mLの腫瘍洗浄液をピペットで移し、皿1~3と保持皿を洗浄した。2つの150mm剥離皿をバイオセーフティキャビネットに入れた。3本の滅菌50mLコニカルチューブをBSCに入れた。5~20mLの腫瘍洗浄培地を各コニカルに追加した。腫瘍の洗浄及び剥離プロセス中、必要に応じて、鉗子及びメスを腫瘍洗浄媒体に浸した。
[00788] 腫瘍処理の開始時間を記録した。過剰な腫瘍断片のために、3~5mLの腫
瘍洗浄培地を1つの6ウェルプレートの各ウェルにピペットで入れた。50mLの腫瘍洗浄液をピペットで移し、皿1~3と保持皿を洗浄した。2つの150mm剥離皿をバイオセーフティキャビネットに入れた。3本の滅菌50mLコニカルチューブをBSCに入れた。5~20mLの腫瘍洗浄培地を各コニカルに追加した。腫瘍の洗浄及び剥離プロセス中、必要に応じて、鉗子及びメスを腫瘍洗浄媒体に浸した。
[00789] 標本ボトルから腫瘍を取り出し、洗浄1皿に移した。洗浄1皿で、周囲温度
で≧3分間腫瘍をインキュベートした。腫瘍を洗浄2皿に移した。洗浄2皿で、周囲温度で≧3分間腫瘍をインキュベートした。腫瘍を洗浄3皿に移した。洗浄3皿で、周囲温度で≧3分間腫瘍をインキュベートした。剥離皿に腫瘍を移し、腫瘍の長さを測定及び記録した。
で≧3分間腫瘍をインキュベートした。腫瘍を洗浄2皿に移した。洗浄2皿で、周囲温度で≧3分間腫瘍をインキュベートした。腫瘍を洗浄3皿に移した。洗浄3皿で、周囲温度で≧3分間腫瘍をインキュベートした。剥離皿に腫瘍を移し、腫瘍の長さを測定及び記録した。
[00790] 各中間片の腫瘍構造を保つように注意を払いながら、剥離皿の腫瘍断片を初
めに中間片に剥離した。全剥離手順中に組織が水和したままにあるように皿を保持しながら、積極的に断片に剥離されていない中間腫瘍断片を組織に移した。
めに中間片に剥離した。全剥離手順中に組織が水和したままにあるように皿を保持しながら、積極的に断片に剥離されていない中間腫瘍断片を組織に移した。
[00791] 一度に1つの中間腫瘍断片を使用して、剥離皿で腫瘍をおよそ3×3×3m
mの断片に慎重に薄切りにした。中間片の全ての組織が判定されるまで中間腫瘍断片から
断片を剥離し続けた。好ましい断片を選択し、トランスファーピペットを使用して、腫瘍断片皿の1つの円で洗浄培地の滴に最大4つの好ましい断片を移した。ホールピペット、メス又は鉗子を使用して、好ましくない組織及び廃棄物をできる限り多く好ましくない組織に移した。残りの全ての組織は、6ウェルプレートのウェルの1つに入れた。(黄色の脂肪組織又は壊死組織により、好ましくない組織が示された。)残りの中間腫瘍断片に対して処理を継続し、全ての腫瘍が処理されるまで一度に1つの中間片を処理した。
mの断片に慎重に薄切りにした。中間片の全ての組織が判定されるまで中間腫瘍断片から
断片を剥離し続けた。好ましい断片を選択し、トランスファーピペットを使用して、腫瘍断片皿の1つの円で洗浄培地の滴に最大4つの好ましい断片を移した。ホールピペット、メス又は鉗子を使用して、好ましくない組織及び廃棄物をできる限り多く好ましくない組織に移した。残りの全ての組織は、6ウェルプレートのウェルの1つに入れた。(黄色の脂肪組織又は壊死組織により、好ましくない組織が示された。)残りの中間腫瘍断片に対して処理を継続し、全ての腫瘍が処理されるまで一度に1つの中間片を処理した。
[00792] 最高50個の最良の腫瘍断片を、CM1を含む腫瘍断片と表示が付された5
0mLコニカルチューブに移した。50mLコニカルから浮遊物を取り除いた。断片及び浮遊物の数を記録した。腫瘍断片の入ったコニカルを旋回させ、50mlコニカルの内容物をG-Rex 100MCSフラスコに注いだ。G-Rex 100Mフラスコに移した1つ以上の腫瘍断片が浮かんでいる場合、好ましい組織の皿から入手可能な場合には追加の腫瘍断片を1つ取得し、G-Rex 100Mフラスコに移した。
0mLコニカルチューブに移した。50mLコニカルから浮遊物を取り除いた。断片及び浮遊物の数を記録した。腫瘍断片の入ったコニカルを旋回させ、50mlコニカルの内容物をG-Rex 100MCSフラスコに注いだ。G-Rex 100Mフラスコに移した1つ以上の腫瘍断片が浮かんでいる場合、好ましい組織の皿から入手可能な場合には追加の腫瘍断片を1つ取得し、G-Rex 100Mフラスコに移した。
[00793] インキュベーター数及び各フラスコに加えられた断片の総数を記録した。G-REX 100Mバイオリアクターを37℃、5%CO2インキュベーターに入れた。
実施例4:プロセス2A - 11日目
[00794] この実施例では、実施例3~6で説明した2Aプロセスの詳細な11日目の
プロトコルについて説明する。
[00794] この実施例では、実施例3~6で説明した2Aプロセスの詳細な11日目の
プロトコルについて説明する。
前回の調製
処理の前日:
[00795] CM2は、処理が行われる前日に準備できた。4℃に置いた。
処理の前日:
[00795] CM2は、処理が行われる前日に準備できた。4℃に置いた。
処理日。
[00797] フィーダーセルハーネスを準備した。CTF-FORM-318毎に5mLの凍結保存培
地を準備し、必要になるまで4℃に置く。
[00797] フィーダーセルハーネスを準備した。CTF-FORM-318毎に5mLの凍結保存培
地を準備し、必要になるまで4℃に置く。
[00798] G-Rex 500MCSフラスコを準備する。10mLシリンジを使用して、CM2(
細胞培養培地2)1リットルあたり0.5mLのIL-2(ストックは6×106IU/mL)を、未使用の滅菌メスルアーコネクタを通してバイオプロセスバッグに無菌的に移した。全てのIL-2が培地と混合されたことを確認した。4.5リットルのCM2培地をG-Rex 500MCSに送り込んだ。G-Rex 500MCSをインキュベーターに入れた。
細胞培養培地2)1リットルあたり0.5mLのIL-2(ストックは6×106IU/mL)を、未使用の滅菌メスルアーコネクタを通してバイオプロセスバッグに無菌的に移した。全てのIL-2が培地と混合されたことを確認した。4.5リットルのCM2培地をG-Rex 500MCSに送り込んだ。G-Rex 500MCSをインキュベーターに入れた。
照射フィーダー細胞を準備する
[00799] 1L移送パック(TP)の乾燥重量を記録した。重量で500mLのCM2
をTPに注入した。37℃(+/-1℃)の水浴中でフィーダー細胞を解凍した。最終フィーダー配合物をよく混合した。5mLシリンジ及び不要なポートを使用して、1mlの細胞を確実にサンプリング及び除去できるようにポートを細胞溶液ですすぎ、カウントのための表示が付されたチューブに入れた。フィーダー細胞サンプル及び記録データに対して一度の細胞カウントを実施し、バッチ記録に生データのカウントを添付した。細胞数が<5×109である場合、より多くの細胞を解凍してカウントし、フィーダー細胞に加えた。フィーダーバッグの容積を再秤量し容積を計算した。取り除く細胞の容積を計算した。
[00799] 1L移送パック(TP)の乾燥重量を記録した。重量で500mLのCM2
をTPに注入した。37℃(+/-1℃)の水浴中でフィーダー細胞を解凍した。最終フィーダー配合物をよく混合した。5mLシリンジ及び不要なポートを使用して、1mlの細胞を確実にサンプリング及び除去できるようにポートを細胞溶液ですすぎ、カウントのための表示が付されたチューブに入れた。フィーダー細胞サンプル及び記録データに対して一度の細胞カウントを実施し、バッチ記録に生データのカウントを添付した。細胞数が<5×109である場合、より多くの細胞を解凍してカウントし、フィーダー細胞に加えた。フィーダーバッグの容積を再秤量し容積を計算した。取り除く細胞の容積を計算した。
G-REXへのフィーダーの追加
[00801] 細胞をよく混合し、上記で計算した容積を取り除き、5.0×109個の細
胞を達成した。不要な細胞を廃棄した。1mLシリンジと18G針を使用して、0.150mLのOKT3を吸引し、針を取り外し、メスルアーを介してフィーダーTPに移した
。フィーダーバッグをG-Rex 500MCSの赤ラインに滅菌溶接した。ラインのクランプを外し、重力によりフィーダー細胞がフラスコに流れ込むようにした。G-Rex 500MCSをインキュベーターに戻し、時間を記録した。
[00801] 細胞をよく混合し、上記で計算した容積を取り除き、5.0×109個の細
胞を達成した。不要な細胞を廃棄した。1mLシリンジと18G針を使用して、0.150mLのOKT3を吸引し、針を取り外し、メスルアーを介してフィーダーTPに移した
。フィーダーバッグをG-Rex 500MCSの赤ラインに滅菌溶接した。ラインのクランプを外し、重力によりフィーダー細胞がフラスコに流れ込むようにした。G-Rex 500MCSをインキュベーターに戻し、時間を記録した。
TILを調整する:TIL回収の開始時間を記録する
[00803] インキュベーターからG-Rex 100MCSを慎重に取り出した。GatheRexを使用し
て、約900mLの培養上清を1L移送パックに移した。全ての細胞が膜から剥離するまでフラスコを旋回した。膜を確認し、全ての細胞が剥離していることを確認した。収集チューブから離してフラスコを傾け、腫瘍断片を縁に沿って沈降させた。断片がフラスコの反対側に残るように、収集チューブに向かってゆっくりとフラスコを傾けた。GatheRexを使用して、残留細胞懸濁液を、腫瘍断片を避けて300mLの移動パックに移した。全ての細胞が膜から離れたことを再確認した。必要に応じて、GatheRexのクランプを開放して逆洗し、重力によって一部の培地をG-Rex 100MCSフラスコに流入させた。フラスコを激しく叩いて細胞を遊離させ、300ml TPに注入した。収集が完了した後、赤ラインとヒートシールを閉じた。細胞懸濁液を含む300ml TPの記録質量(乾燥質量を含む)及び細胞懸濁液の容積を計算した。細胞をよく混合した。5mLシリンジドロー1mLを無菌的に取り付け、冷凍保存バイアルに入れた。第2のシリンジで繰り返した。これらは、細胞、生存率のカウントに使用された。インキュベーターに入れ、インキュベーターで時間及び場所を記録した。各サンプルに対して一度の細胞カウントを実施し、記録した。必要に応じて、総生細胞TIL密度を2×108個以下の生細胞に調整した。削除する容積を計算又は不要な調整を記録した。
[00803] インキュベーターからG-Rex 100MCSを慎重に取り出した。GatheRexを使用し
て、約900mLの培養上清を1L移送パックに移した。全ての細胞が膜から剥離するまでフラスコを旋回した。膜を確認し、全ての細胞が剥離していることを確認した。収集チューブから離してフラスコを傾け、腫瘍断片を縁に沿って沈降させた。断片がフラスコの反対側に残るように、収集チューブに向かってゆっくりとフラスコを傾けた。GatheRexを使用して、残留細胞懸濁液を、腫瘍断片を避けて300mLの移動パックに移した。全ての細胞が膜から離れたことを再確認した。必要に応じて、GatheRexのクランプを開放して逆洗し、重力によって一部の培地をG-Rex 100MCSフラスコに流入させた。フラスコを激しく叩いて細胞を遊離させ、300ml TPに注入した。収集が完了した後、赤ラインとヒートシールを閉じた。細胞懸濁液を含む300ml TPの記録質量(乾燥質量を含む)及び細胞懸濁液の容積を計算した。細胞をよく混合した。5mLシリンジドロー1mLを無菌的に取り付け、冷凍保存バイアルに入れた。第2のシリンジで繰り返した。これらは、細胞、生存率のカウントに使用された。インキュベーターに入れ、インキュベーターで時間及び場所を記録した。各サンプルに対して一度の細胞カウントを実施し、記録した。必要に応じて、総生細胞TIL密度を2×108個以下の生細胞に調整した。削除する容積を計算又は不要な調整を記録した。
[00804] 過剰な細胞を適切なサイズのコニカルチューブに移し、後に凍結保存するた
めにキャップを緩めてインキュベーターに入れた。
めにキャップを緩めてインキュベーターに入れた。
[00805] インキュベーターからG-Rex 500MCSを取り出し、細胞をフラスコへ汲み出し
た。G-Rex 500MCSをインキュベーターに戻し、G-Rexインキュベーターに置かれた時間を
記録した。
た。G-Rex 500MCSをインキュベーターに戻し、G-Rexインキュベーターに置かれた時間を
記録した。
過剰の凍結保存
[00806] 細胞に加える凍結培地の計算量:
[00806] 細胞に加える凍結培地の計算量:
[00807] TILを400×gにおいて20℃で5分間、最大減速及び最大加速で沈下
させた。無菌的に上清を吸引した。残った液体に細胞を再懸濁し、再懸濁中、準備した凍結培地をゆっくりと添加した。分注し、-80℃に置いた。
させた。無菌的に上清を吸引した。残った液体に細胞を再懸濁し、再懸濁中、準備した凍結培地をゆっくりと添加した。分注し、-80℃に置いた。
実施例5:プロセス2A - 16日目
[00808] この実施例では、実施例3~6で説明した2Aプロセスの詳細な16日目の
プロトコルについて説明する。
[00808] この実施例では、実施例3~6で説明した2Aプロセスの詳細な16日目の
プロトコルについて説明する。
TILの回収及びカウント。
[00809] 50×106個未満のTILで開始した培養物のCM4の10Lバッグ1つ
を37℃のインキュベーターで少なくとも30分又は使用準備が整うまで温めた。インキュベーターからG-Rex 500MCSフラスコを取り出し、GatheRexを使用して、約4Lの培養上清を10LのLabtainerに移した。適切なGatheRex回収指示に従って回収した。
[00809] 50×106個未満のTILで開始した培養物のCM4の10Lバッグ1つ
を37℃のインキュベーターで少なくとも30分又は使用準備が整うまで温めた。インキュベーターからG-Rex 500MCSフラスコを取り出し、GatheRexを使用して、約4Lの培養上清を10LのLabtainerに移した。適切なGatheRex回収指示に従って回収した。
[00810] 上清を除去した後、全ての細胞が膜から剥離するまでフラスコを旋回した。
フラスコを傾けて、ホースがフラスコの端にくるようにした。GatheRexを使用して、残留細胞懸濁液を2L TPに移し、全ての細胞が収集されるまで端を傾斜したまま維持した。付着した細胞について膜を検査した。フラスコを激しく叩いて細胞を遊離させた。2L
TPに細胞を加えた。2L移送パックをヒートシールした。細胞懸濁液を含む移送パックの質量を記録し、細胞懸濁液の容積を計算した。乾燥質量を含む、細胞懸濁液量を決定した。
フラスコを傾けて、ホースがフラスコの端にくるようにした。GatheRexを使用して、残留細胞懸濁液を2L TPに移し、全ての細胞が収集されるまで端を傾斜したまま維持した。付着した細胞について膜を検査した。フラスコを激しく叩いて細胞を遊離させた。2L
TPに細胞を加えた。2L移送パックをヒートシールした。細胞懸濁液を含む移送パックの質量を記録し、細胞懸濁液の容積を計算した。乾燥質量を含む、細胞懸濁液量を決定した。
[00811] 細胞を静かに混合し、11mlを吸い上げ、表21に示すように分注した。
[00812] 細胞懸濁液量及びQCのために除去された量に基づいた2L移送パック内の
新しい量を計算し、記録した(11mL)。
新しい量を計算し、記録した(11mL)。
[00813] 植菌及び指示された無菌試験。マイコプラズマ試験のため、保留中のラック
に4℃でマイコプラズマサンプルを貯蔵した。TILが播種されるまで取っておいた。
に4℃でマイコプラズマサンプルを貯蔵した。TILが播種されるまで取っておいた。
細胞カウント:
[00814] 記録データに対して一度の細胞カウントを実施し、バッチ記録に生データの
カウントを添付した。文書化された希釈。Cellometerカウントプログラムを文書化した。正しい希釈がCellometerに入力されたことを確認した。継代培養に必要なフラスコの総数を計算した。
[00814] 記録データに対して一度の細胞カウントを実施し、バッチ記録に生データの
カウントを添付した。文書化された希釈。Cellometerカウントプログラムを文書化した。正しい希釈がCellometerに入力されたことを確認した。継代培養に必要なフラスコの総数を計算した。
CMへのIL-2の追加
[00815] Aim Vの10LバッグをGlutamaxと共に配置した。5mLのIL-2をシリンジに吸い上げ(最終濃度は3000IU/ml)、IL-2をバッグに分配した。Aim V
の残りのバッグについても繰り返した。
[00815] Aim Vの10LバッグをGlutamaxと共に配置した。5mLのIL-2をシリンジに吸い上げ(最終濃度は3000IU/ml)、IL-2をバッグに分配した。Aim V
の残りのバッグについても繰り返した。
G-Rex 500MCSフラスコを調製する
フラスコに加えるCM4の量を決定した。フラスコ毎に加えられた細胞の容積及びCM4の5000mL-Aの容積を記録した。フラスコを37℃、5%CO2に入れた。
フラスコに加えるCM4の量を決定した。フラスコ毎に加えられた細胞の容積及びCM4の5000mL-Aの容積を記録した。フラスコを37℃、5%CO2に入れた。
TILの入ったフラスコに播種
[00816] 細胞産物バッグを化学天秤に置き、G-REXフラスコにTILを加えた時間を記録した。細胞をよく混合した。全てのフラスコで細胞の移動を繰り返した。フラスコを37℃、5%CO2に置き、TILをG-REXフラスコに加えた時間を記録した。微生物学研
究室へ沈降プレートの試験及び好気的及び嫌気的無菌性の試験の指示をした。
[00816] 細胞産物バッグを化学天秤に置き、G-REXフラスコにTILを加えた時間を記録した。細胞をよく混合した。全てのフラスコで細胞の移動を繰り返した。フラスコを37℃、5%CO2に置き、TILをG-REXフラスコに加えた時間を記録した。微生物学研
究室へ沈降プレートの試験及び好気的及び嫌気的無菌性の試験の指示をした。
流動性又は過剰細胞の凍結保存:
[00818] 必要な凍結培地の計算量:標的細胞濃度は、1×108/mlであった。除
去されたセルの総量を記録した。標的細胞濃度は、1×108細胞/mLであった。加える凍結培地の総量を計算した。
[00818] 必要な凍結培地の計算量:標的細胞濃度は、1×108/mlであった。除
去されたセルの総量を記録した。標的細胞濃度は、1×108細胞/mLであった。加える凍結培地の総量を計算した。
[00819] 凍結保存培地を調製し、必要になるまで40℃に置いた。TILを400×
gにおいて20℃で5分間、最大減速及び最大加速で沈下させた。上清を吸引した。チューブの底を穏やかに叩いて、残った液体に細胞を再懸濁し、チューブを穏やかに叩きながら、準備した凍結培地をゆっくりと添加した。適切なサイズの表示が付されたクライオチューブに分注した。-80℃の冷凍庫に入れた。72時間以内に恒久的な貯蔵場所に移し、-80℃の冷凍庫に入れた日時を文書化して記録した。
gにおいて20℃で5分間、最大減速及び最大加速で沈下させた。上清を吸引した。チューブの底を穏やかに叩いて、残った液体に細胞を再懸濁し、チューブを穏やかに叩きながら、準備した凍結培地をゆっくりと添加した。適切なサイズの表示が付されたクライオチューブに分注した。-80℃の冷凍庫に入れた。72時間以内に恒久的な貯蔵場所に移し、-80℃の冷凍庫に入れた日時を文書化して記録した。
実施例6:プロセス2A - 22日目
[00820] この実施例では、実施例3~6で説明した2Aプロセスの詳細な22日目の
プロトコルについて説明する。
[00820] この実施例では、実施例3~6で説明した2Aプロセスの詳細な22日目の
プロトコルについて説明する。
高度な調製
[00821] PlasmaLyte Aの3つの1LバッグをBSCに入れた。プールを準備し、PlasmaLyte Aバッグに1%HSAの表示を付した。25%の120mLを移送のために充填し
た。HSAを3LのPlasmaLyteバッグに移した。よく混合した。3リットルバッグの無針ポ
ートから5mLの1%HSAのPlasmaLyteを取り出した。LOVO洗浄バッファーと表示し、日付を付した。
[00821] PlasmaLyte Aの3つの1LバッグをBSCに入れた。プールを準備し、PlasmaLyte Aバッグに1%HSAの表示を付した。25%の120mLを移送のために充填し
た。HSAを3LのPlasmaLyteバッグに移した。よく混合した。3リットルバッグの無針ポ
ートから5mLの1%HSAのPlasmaLyteを取り出した。LOVO洗浄バッファーと表示し、日付を付した。
IL-2調製
[00823] 5mLシリンジから表示が付された50mlの滅菌コニカルチューブにPlasmalyte/1%HSAを分配した。PlasmaLyteを含むチューブに0.05mLのIL-2ス
トックを加え、IL-2 6×104個と表示を付した。2~8℃で保管した。
[00823] 5mLシリンジから表示が付された50mlの滅菌コニカルチューブにPlasmalyte/1%HSAを分配した。PlasmaLyteを含むチューブに0.05mLのIL-2ス
トックを加え、IL-2 6×104個と表示を付した。2~8℃で保管した。
細胞の調製
[00824] 37℃からG-REX 500Mフラスコを取り外した。GatheRexポンプを使用して、
第1のフラスコの容積を減少させた。飛散又は泡立ちを避けながらTILが完全に再懸濁されるまで、G-REX 500Mフラスコを旋回させた。全ての細胞が膜から乖離していることを確認した。G-Rexフラスコを傾けて、細胞懸濁液が収集ストローのあるフラスコの側面に
溜まるようにした。細胞懸濁液を収集するためにGatherRexを開始し、全ての細胞がフラ
スコから取り除かれるようにした。細胞がフラスコに残っている場合、100mLの上清をフラスコに戻し、旋回させて、細胞懸濁液バッグに集めた。追加のフラスコに対して繰り返した。ヒートシールし、LOVO原料バッグと表示を付した。乾燥重量を記録した。
[00824] 37℃からG-REX 500Mフラスコを取り外した。GatheRexポンプを使用して、
第1のフラスコの容積を減少させた。飛散又は泡立ちを避けながらTILが完全に再懸濁されるまで、G-REX 500Mフラスコを旋回させた。全ての細胞が膜から乖離していることを確認した。G-Rexフラスコを傾けて、細胞懸濁液が収集ストローのあるフラスコの側面に
溜まるようにした。細胞懸濁液を収集するためにGatherRexを開始し、全ての細胞がフラ
スコから取り除かれるようにした。細胞がフラスコに残っている場合、100mLの上清をフラスコに戻し、旋回させて、細胞懸濁液バッグに集めた。追加のフラスコに対して繰り返した。ヒートシールし、LOVO原料バッグと表示を付した。乾燥重量を記録した。
[00825] TILが細胞懸濁液バッグからフィルターを通ってLOVO原料バッグに排出さ
れるようにした。全細胞がLOVO原料バッグに移されると、全てのクランプを閉じ、印の直上をヒートシールし、取り外した。バッグをよく混合し、2つの3mLシリンジを使用して、細胞及び生存率のカウントのためにシリンジサンプルポートから2つの独立した2mLのサンプルを採取した。バッグの重量を量り、初期重量と最終重量との間の差を判定した。乾燥質量を含むデータを記録しインキュベーターに入れた。
れるようにした。全細胞がLOVO原料バッグに移されると、全てのクランプを閉じ、印の直上をヒートシールし、取り外した。バッグをよく混合し、2つの3mLシリンジを使用して、細胞及び生存率のカウントのためにシリンジサンプルポートから2つの独立した2mLのサンプルを採取した。バッグの重量を量り、初期重量と最終重量との間の差を判定した。乾燥質量を含むデータを記録しインキュベーターに入れた。
細胞カウント。
[00826] 各サンプル及び記録データに対して一度の細胞カウントを実施し、バッチ記
録に生データのカウントを添付した。Cellometerカウントプログラムを文書化した。正しい希釈がCellometerに入力されたことを確認した。有核細胞の総数を決定した。除去するTNCの数を決定し、LOVO処理のために=1.5×1011個の細胞を保持した。取り出した細胞を適切なサイズの容器に入れて廃棄した。
[00826] 各サンプル及び記録データに対して一度の細胞カウントを実施し、バッチ記
録に生データのカウントを添付した。Cellometerカウントプログラムを文書化した。正しい希釈がCellometerに入力されたことを確認した。有核細胞の総数を決定した。除去するTNCの数を決定し、LOVO処理のために=1.5×1011個の細胞を保持した。取り出した細胞を適切なサイズの容器に入れて廃棄した。
LOVOの回収
[00827] 事前準備で設定されたBaxter延長セットを備えた10LLabtainerは、LOVOキットに溶接された交換用ろ液バッグであった。LOVOディスプレイに従った。手順を開始するため、ドロップダウンメニューから「TIL G-Rex回収」プロトコルを選択し、指示
に従った。
[00827] 事前準備で設定されたBaxter延長セットを備えた10LLabtainerは、LOVOキットに溶接された交換用ろ液バッグであった。LOVOディスプレイに従った。手順を開始するため、ドロップダウンメニューから「TIL G-Rex回収」プロトコルを選択し、指示
に従った。
[00828] 最終産物量(保持量)画面が表示されると、表15の総有核細胞(TNC)
値を使用して、以下の表(表16)で最終産物の標的容積を決定した。LOVO手順の設定中、その細胞範囲に関連付けられた最終産物容積(mL)を入力した。
値を使用して、以下の表(表16)で最終産物の標的容積を決定した。LOVO手順の設定中、その細胞範囲に関連付けられた最終産物容積(mL)を入力した。
[00829] 表16から指定された容積を標的にするため、最終産物容積(mL)入力欄
に触れた。テンキーが表示された。mL単位で所望の最終産物量を入力した。
に触れた。テンキーが表示された。mL単位で所望の最終産物量を入力した。
[00830] ろ液及び溶液1に表示される容積を書き留めた(PlasmaLyteを読まれたい)
。ろ液及び溶液1に表示される容積を書き留めた(PlasmaLyteを読まれたい)。
。ろ液及び溶液1に表示される容積を書き留めた(PlasmaLyteを読まれたい)。
[00831] IPバッグを前塗布した。原料バッグを混合した。LOVO手順中、系は自動的
に一時停止して、作業者が異なるバッグを取り扱うことができるようにした。一時停止中に異なる画面が表示された。各画面に対応する指示に従った。
に一時停止して、作業者が異なるバッグを取り扱うことができるようにした。一時停止中に異なる画面が表示された。各画面に対応する指示に従った。
原料すすぎ一時停止
[00832] 原料バッグを排出させた後、LOVOが原料バッグに洗浄バッファーを加えバッ
グをすすいだ。設定量の洗浄バッファーが原料バッグに加えられた後、LOVOは自動的に一時停止し、原料すすぎ一時停止画面を表示した。
[00832] 原料バッグを排出させた後、LOVOが原料バッグに洗浄バッファーを加えバッ
グをすすいだ。設定量の洗浄バッファーが原料バッグに加えられた後、LOVOは自動的に一時停止し、原料すすぎ一時停止画面を表示した。
[00833] LOVOは原料バッグからのすすぎ液を処理し、自動化手順を続けた。
IPバッグの混合の一時停止
[00834] スピナを通過させる別の細胞を準備するため、IPバッグを洗浄バッファー
で希釈した。IPバッグに洗浄バッファーを追加すると、LOVOは自動的に一時停止し、「IPバッグ混合」一時停止画面が表示された。
[00834] スピナを通過させる別の細胞を準備するため、IPバッグを洗浄バッファー
で希釈した。IPバッグに洗浄バッファーを追加すると、LOVOは自動的に一時停止し、「IPバッグ混合」一時停止画面が表示された。
[00835] 「IPバッグ混合」一時停止画面が表示されると、作業者は、細胞懸濁液を
完全に混合するため、IPバッグを数回反転させた。指示に従い、LOVOのIPバッグからの液体の処理を再開した。
完全に混合するため、IPバッグを数回反転させた。指示に従い、LOVOのIPバッグからの液体の処理を再開した。
IPの角を揉むことの一時停止
[00836] LOVO手順の最終洗浄サイクル中、細胞をIPバッグからスピナを介して保持
液(最終産物)バッグに注入した。IPバッグが空になったら、10mLの洗浄バッファーをIPバッグの底部ポートに加え、バッグをすすいだ。すすぎ液を追加した後、LOVOは自動的に一時停止し、「IPの角を揉む」一時停止画面が表示された。
[00836] LOVO手順の最終洗浄サイクル中、細胞をIPバッグからスピナを介して保持
液(最終産物)バッグに注入した。IPバッグが空になったら、10mLの洗浄バッファーをIPバッグの底部ポートに加え、バッグをすすいだ。すすぎ液を追加した後、LOVOは自動的に一時停止し、「IPの角を揉む」一時停止画面が表示された。
[00837] 「IPの角を揉む」一時停止画面が表示されると、作業者は、バッグの角を
揉んで、いかなる残っている細胞も浮遊させた。LOVOを再開して、IPバッグからすすぎ液をポンプで排出した。
揉んで、いかなる残っている細胞も浮遊させた。LOVOを再開して、IPバッグからすすぎ液をポンプで排出した。
[00838] LOVO手順の最後に、産物除去画面が表示された。
[00839] 表17のフォーマットに従い、結果からデータを記録した。
シャットダウンLOVOシャットダウン手順
[00841] 最終的な製剤化された産物量を記録した。最終産物表から必要なIL-2の
量を計算した。
[00841] 最終的な製剤化された産物量を記録した。最終産物表から必要なIL-2の
量を計算した。
クライオバッグの数及び保持量を判定した
[00843] 標的容積に印を付け、凍結保存バッグの数と産物の保持サンプルの容積の下
の表を保持した。
[00843] 標的容積に印を付け、凍結保存バッグの数と産物の保持サンプルの容積の下
の表を保持した。
[00844] 標的容積/バッグ計算:(最終製剤量-100%回収率が得られないための
量調整=10mL)/バッグの数。
量調整=10mL)/バッグの数。
[00845] 1:1(容積:容積)のCS10(CryoStor 10、BioLife Solutions)及び
IL-2で細胞を調製した。
IL-2で細胞を調製した。
[00846] IL-2及び接続装置で細胞を調整した。細胞及び装置を移送バッグに入れ
、2~8℃で≦15分間置いた。
、2~8℃で≦15分間置いた。
CS10の添加
[00847] 「最終製剤産物量」表で決定された冷CS10の量を汲み上げた。ゆっくり
と穏やかに混合しながら、CS10(1:1、容積:容積)を細胞に加えた。
[00847] 「最終製剤産物量」表で決定された冷CS10の量を汲み上げた。ゆっくり
と穏やかに混合しながら、CS10(1:1、容積:容積)を細胞に加えた。
製剤細胞産物のクライオバッグへの添加
[00849] 各凍結バッグに入れる細胞の量に合わせて、シリンジを適切なサイズのシリ
ンジに交換した。細胞産物を混合した。細胞産物バッグに通じるクランプを開放し、適切な量を引き出した。
[00849] 各凍結バッグに入れる細胞の量に合わせて、シリンジを適切なサイズのシリ
ンジに交換した。細胞産物を混合した。細胞産物バッグに通じるクランプを開放し、適切な量を引き出した。
最終産物の量を記録した
[00850] 不要なポート及び適切なサイズのシリンジを使用して、事前に決定した保持
量を調製した。「保持」と表示を付した50mLコニカルチューブに保持した。ハーネスに取り付けられたシリンジを使用して、細胞を約1インチまでチューブに吸い上げながらバッグから全ての空気を取り除いた。2~8℃に置いた。細胞産物バッグ内の細胞を混合し、活栓上の新しいシリンジを使用して残りのCS750バッグに対してステップ3~8を繰り返して、細胞を保持した。産物がCRFに入ったら、処理のために取っておいた。
[00850] 不要なポート及び適切なサイズのシリンジを使用して、事前に決定した保持
量を調製した。「保持」と表示を付した50mLコニカルチューブに保持した。ハーネスに取り付けられたシリンジを使用して、細胞を約1インチまでチューブに吸い上げながらバッグから全ての空気を取り除いた。2~8℃に置いた。細胞産物バッグ内の細胞を混合し、活栓上の新しいシリンジを使用して残りのCS750バッグに対してステップ3~8を繰り返して、細胞を保持した。産物がCRFに入ったら、処理のために取っておいた。
制御速度フリーザー(CRF)手順(実施例16も参照されたい)
[00851] 冷凍庫は、サンプルを追加する準備ができるまで4℃で保持された。CRF
にサンプルを加えた。
[00851] 冷凍庫は、サンプルを追加する準備ができるまで4℃で保持された。CRF
にサンプルを加えた。
[00852] CRFが4℃に戻るまで待った。温度が達すると、CRFプログラムに従っ
て凍結保存した。容器の完全性、ポートの完全性、シールの完全性、細胞集塊の存在及び粒子の存在について、クライオバッグの目視検査を実施した(注:過剰又は不足検査は実施しなかった)。
て凍結保存した。容器の完全性、ポートの完全性、シールの完全性、細胞集塊の存在及び粒子の存在について、クライオバッグの目視検査を実施した(注:過剰又は不足検査は実施しなかった)。
[00853] クライオバッグを予め調整したカセットに入れ、CRFに移した。カセット
をCRFの棚に均等に並べた。リボン熱電対を中央カセットに使用するか、又はダミーバッグを中央位置に置いた。
をCRFの棚に均等に並べた。リボン熱電対を中央カセットに使用するか、又はダミーバッグを中央位置に置いた。
[00854] CRFの扉を閉じた。チャンバーの温度が4℃+/-1.5℃に達すると、
産物をCRFに移した時間及びチャンバー温度を記録した。
産物をCRFに移した時間及びチャンバー温度を記録した。
[00855] 品質管理サンプルの処理
必要に応じて、以下の材料を無菌的に移し、表25のQC及び保持に従って表示を付した。1-細胞カウントチューブ、1-エンドトキシンチューブ、1-マイコプラズマチューブ、1-グラム染色チューブ、1チューブ再刺激チューブ及び1-迅速な試験のためのQCへのフローチューブ。残りの複製チューブを制御速度フリーザーに入れた。
必要に応じて、以下の材料を無菌的に移し、表25のQC及び保持に従って表示を付した。1-細胞カウントチューブ、1-エンドトキシンチューブ、1-マイコプラズマチューブ、1-グラム染色チューブ、1チューブ再刺激チューブ及び1-迅速な試験のためのQCへのフローチューブ。残りの複製チューブを制御速度フリーザーに入れた。
細胞カウント
[00857] 各サンプル及び記録データに対し1度の細胞カウントを実施し、バッチ記録
に生データのカウントを添付した。Cellometerカウントプログラムを文書化した。正しい希釈がCellometerに入力されたことを確認した。
[00857] 各サンプル及び記録データに対し1度の細胞カウントを実施し、バッチ記録
に生データのカウントを添付した。Cellometerカウントプログラムを文書化した。正しい希釈がCellometerに入力されたことを確認した。
[00858] 製剤後の保持細胞の凍結保存:バイアルをCRFに入れた。凍結完了後に貯
蔵場所に移し、CFRに入れた日時を記録した。LN2に移した日時を記録した。
蔵場所に移し、CFRに入れた日時を記録した。LN2に移した日時を記録した。
[00859] 微生物検査:好気的及び嫌気的無菌性の試験の指示をした。
細胞産物バッグの凍結保存後
[00860] 実施完了後にフリーザーを停止した。カセットからクライオバッグを取り外
した。カセットを気相LN2に移した。
[00860] 実施完了後にフリーザーを停止した。カセットからクライオバッグを取り外
した。カセットを気相LN2に移した。
実施例7:IL-2、IL-15及びIL-21サイトカインカクテルの使用
[00861] この実施例では、追加のT細胞成長因子として機能するIL-2、IL-1
5及びIL-21サイトカインの使用を、実施例1~10のTILプロセスと組み合わせて説明する。
[00861] この実施例では、追加のT細胞成長因子として機能するIL-2、IL-1
5及びIL-21サイトカインの使用を、実施例1~10のTILプロセスと組み合わせて説明する。
[00862] 実施例1~10のプロセスを使用して、実験の片腕で、IL-2の存在下に
おいて、結腸直腸、黒色腫、子宮頸、三種陰性乳房、肺及び腎臓の腫瘍から、他方では培養の開始時にIL-2の代わりにIL-2、IL-15及びIL-21の組み合わせで、TILを成長させた。プレREPの完了時に、培養物の拡大率、表現型、機能(CD107a+及びIFN-γ)及びTCR Vβレパートリーを評価した。IL-15及びIL-21は、本明細書の他の箇所及びGruijl, et al.,に記載されている通り、IL-21
は、CD27+CD28+腫瘍浸潤リンパ球の成長を促進し、細胞傷害能が高く、制御性T細胞の副次的成長が少ない。Santegoets, S. J., J Transl Med., 2013, 11:37(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3626797/)。
おいて、結腸直腸、黒色腫、子宮頸、三種陰性乳房、肺及び腎臓の腫瘍から、他方では培養の開始時にIL-2の代わりにIL-2、IL-15及びIL-21の組み合わせで、TILを成長させた。プレREPの完了時に、培養物の拡大率、表現型、機能(CD107a+及びIFN-γ)及びTCR Vβレパートリーを評価した。IL-15及びIL-21は、本明細書の他の箇所及びGruijl, et al.,に記載されている通り、IL-21
は、CD27+CD28+腫瘍浸潤リンパ球の成長を促進し、細胞傷害能が高く、制御性T細胞の副次的成長が少ない。Santegoets, S. J., J Transl Med., 2013, 11:37(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3626797/)。
[00863] 結果は、IL-2、IL-15及びIL-21で処理した条件のCD4+及
びCD8+細胞の両方で、IL-2のみの条件と比較して複数の組織でTIL拡大培養の増強(>20%)が観察されたことを示した。IL-2のみの培養物に比べて、IL-2、IL-15及びIL-21で処理した培養物から得られたTILには、偏ったTCR Vβレパートリーを含むCD8+集団が主に偏っていた。IFN-γ及びCD107aは、IL-2のみで処理したTILと比較して、IL-2、IL-15及びIL-21で処理したTILで上昇した。
びCD8+細胞の両方で、IL-2のみの条件と比較して複数の組織でTIL拡大培養の増強(>20%)が観察されたことを示した。IL-2のみの培養物に比べて、IL-2、IL-15及びIL-21で処理した培養物から得られたTILには、偏ったTCR Vβレパートリーを含むCD8+集団が主に偏っていた。IFN-γ及びCD107aは、IL-2のみで処理したTILと比較して、IL-2、IL-15及びIL-21で処理したTILで上昇した。
実施例8:第2段階、多施設、黒色腫における3コホート研究
[00864] この第2段階の多施設3コホート研究は、転移性黒色腫患者のプロセス1C
(本明細書に記載される通り)に従って製造されたTIL療法の安全性及び有効性を評価するよう設計されている。コホート1及び2は、それぞれ最大30人の患者を登録し、コホート3は最大10人の患者への第2のTIL注入のための再処置コホートである。第1の2つのコホートは、2つの異なる製造プロセス:プロセス1C及びプロセス2Aの実施形態(それぞれ実施例1~10で説明)を評価している。コホート1の患者は新鮮な非凍結保存TILを受け取り、コホート2の患者は実施例1~10で説明したプロセスで製造された産物を受け取り、凍結保存製品を産生する。研究設計を図26に示す。この研究は、転移性黒色腫患者のサブ集団の処置のための自己TILの安全性及び有効性を評価する第2段階、多施設、3コホート研究である。主要な選択基準には、測定可能な転移性黒色腫及びTIL生成のために切除可能な病変が≧1;全身療法の少なくとも1つの前の段階;年齢≧18歳;0~1のECOGパフォーマンスステータス、が含まれる。処置コホートには、非凍結保存TIL産物(プロセス1Cを使用して調製)、凍結保存TIL産物(プロセス2Aの実施形態を使用して調製)及び無応答又は初期応答後に進行する患者に対するTIL産物による再処置が含まれる。プライマリエンドポイントは安全性であり、セカンダリエンドポイントは有効性であり、客観的奏効率(ORR)、完全寛解率(CRR)、無増悪生存率(PFS)、奏効期間(DOR)及び全生存期間(OS)で定義される。
[00864] この第2段階の多施設3コホート研究は、転移性黒色腫患者のプロセス1C
(本明細書に記載される通り)に従って製造されたTIL療法の安全性及び有効性を評価するよう設計されている。コホート1及び2は、それぞれ最大30人の患者を登録し、コホート3は最大10人の患者への第2のTIL注入のための再処置コホートである。第1の2つのコホートは、2つの異なる製造プロセス:プロセス1C及びプロセス2Aの実施形態(それぞれ実施例1~10で説明)を評価している。コホート1の患者は新鮮な非凍結保存TILを受け取り、コホート2の患者は実施例1~10で説明したプロセスで製造された産物を受け取り、凍結保存製品を産生する。研究設計を図26に示す。この研究は、転移性黒色腫患者のサブ集団の処置のための自己TILの安全性及び有効性を評価する第2段階、多施設、3コホート研究である。主要な選択基準には、測定可能な転移性黒色腫及びTIL生成のために切除可能な病変が≧1;全身療法の少なくとも1つの前の段階;年齢≧18歳;0~1のECOGパフォーマンスステータス、が含まれる。処置コホートには、非凍結保存TIL産物(プロセス1Cを使用して調製)、凍結保存TIL産物(プロセス2Aの実施形態を使用して調製)及び無応答又は初期応答後に進行する患者に対するTIL産物による再処置が含まれる。プライマリエンドポイントは安全性であり、セカンダリエンドポイントは有効性であり、客観的奏効率(ORR)、完全寛解率(CRR)、無増悪生存率(PFS)、奏効期間(DOR)及び全生存期間(OS)で定義される。
実施例9:γ線照射末梢単核球の個々のロットの適格性
[00865] 本実施例は、γ線照射した末梢単核球(PBMC、別名MNC)の個々のロ
ットが本明細書に記載される例示的方法における同種異系フィーダー細胞としての使用に適格か判定するための新規簡略手順について説明する。
[00865] 本実施例は、γ線照射した末梢単核球(PBMC、別名MNC)の個々のロ
ットが本明細書に記載される例示的方法における同種異系フィーダー細胞としての使用に適格か判定するための新規簡略手順について説明する。
[00866] 各照射MNCフィーダーロットは個別のドナーから調製した。精製抗CD3
(クローンOKT3)抗体及びインターロイキン-2(IL-2)の存在下におけるREPでTILを拡大培養するその能力に関して各ロット又はドナーを個別にスクリーニングした。加えて、フィーダー細胞の各ロットを、TILを加えずに試験して、受けたγ線線量がそれらを複製不能にするのに十分であったことを確認した。
(クローンOKT3)抗体及びインターロイキン-2(IL-2)の存在下におけるREPでTILを拡大培養するその能力に関して各ロット又はドナーを個別にスクリーニングした。加えて、フィーダー細胞の各ロットを、TILを加えずに試験して、受けたγ線線量がそれらを複製不能にするのに十分であったことを確認した。
背景
[00867] TILのREPには、γ線照射した拡大培養が止まったMNCフィーダー細
胞が必要であった。REPフラスコ内でフィーダーMNC上の膜受容体が抗CD3(クローンOKT3)抗体に結合し、TILに架橋することにより、TILが拡大培養されるように刺激される。フィーダーロットは、個別のドナーから採取された全血の白血球アフェレーシスから調製した。白血球アフェレーシス産物をFicoll-Hypaqueで遠心に供し、洗浄し、照射し、且つGMP条件下で凍結保存した。
[00867] TILのREPには、γ線照射した拡大培養が止まったMNCフィーダー細
胞が必要であった。REPフラスコ内でフィーダーMNC上の膜受容体が抗CD3(クローンOKT3)抗体に結合し、TILに架橋することにより、TILが拡大培養されるように刺激される。フィーダーロットは、個別のドナーから採取された全血の白血球アフェレーシスから調製した。白血球アフェレーシス産物をFicoll-Hypaqueで遠心に供し、洗浄し、照射し、且つGMP条件下で凍結保存した。
[00868] 移植片対宿主病(GVHD)を引き起こし得るため、TIL療法を受ける患
者が生細胞のフィーダー細胞を注入されないことが重要である。従って、フィーダー細胞は、γ線照射を細胞に与え、その結果二本鎖DNA切断が生じて再培養時にMNC細胞が細胞生存能力を失うことにより、拡大培養が止められる。
者が生細胞のフィーダー細胞を注入されないことが重要である。従って、フィーダー細胞は、γ線照射を細胞に与え、その結果二本鎖DNA切断が生じて再培養時にMNC細胞が細胞生存能力を失うことにより、拡大培養が止められる。
判定基準及び実験セットアップ
[00869] フィーダーロットは2つの基準で判定された。1)共培養においてTILを
100倍超に拡大培養するその能力、及び2)その複製不能性。
[00869] フィーダーロットは2つの基準で判定された。1)共培養においてTILを
100倍超に拡大培養するその能力、及び2)その複製不能性。
[00870] 直立T25組織培養フラスコ内で成長させた2つの初代プレREP TIL
株を利用するミニREPフォーマットでフィーダーロットを試験した。各TIL株がREPにおいて活性化に応答して拡大培養するその能力はユニークであるため、フィーダーロットは2つの異なるTIL株に対して試験した。制御として、後ろ向き的に上記の基準に適合することが示されている照射MNCフィーダー細胞の1ロットを、実験ロットと並行して実施した。
株を利用するミニREPフォーマットでフィーダーロットを試験した。各TIL株がREPにおいて活性化に応答して拡大培養するその能力はユニークであるため、フィーダーロットは2つの異なるTIL株に対して試験した。制御として、後ろ向き的に上記の基準に適合することが示されている照射MNCフィーダー細胞の1ロットを、実験ロットと並行して実施した。
[00871] 単一の実験で試験した全てのロットが等価な試験を受けることを確実にする
ため、全ての条件及び全てのフィーダーロットの試験に同じプレREP TIL株の十分なストックが利用可能であった。
ため、全ての条件及び全てのフィーダーロットの試験に同じプレREP TIL株の十分なストックが利用可能であった。
[00872] 試験したフィーダー細胞の各ロットについて、合計6つのT25フラスコが
あった:プレ-REP TILライン#1(2フラスコ);プレ-REP TILライン#2(2フラスコ);及びフィーダー制御(2フラスコ)。TIL株#1及び#2が入ったフラスコは、フィーダーロットがTILを拡大培養させる能力を判定した。フィーダー対照フラスコは、フィーダーロットの複製不能性を判定した。
あった:プレ-REP TILライン#1(2フラスコ);プレ-REP TILライン#2(2フラスコ);及びフィーダー制御(2フラスコ)。TIL株#1及び#2が入ったフラスコは、フィーダーロットがTILを拡大培養させる能力を判定した。フィーダー対照フラスコは、フィーダーロットの複製不能性を判定した。
実験プロトコル
-2/3日目、TIL株の解凍
[00873] CM2培地を調整した。37℃の水浴中でCM2を加温した。3000IU
/ml IL-2を添加した40mlのCM2を調製した。使用時まで保温する。使用したTIL株の名前の表示を付した2つの50mlコニカルチューブの各々に、IL-2を含まない20mlの予め加温したCM2を入れた。LN2貯蔵庫から2つの指定のプレREP TIL株を取り出し、バイアルを組織培養室に移した。残りの氷が少量になるまでバイアルを37℃の水浴中の密封されたジッパー式貯蔵用バッグの内部に置くことにより、バイアルを解凍した。
-2/3日目、TIL株の解凍
[00873] CM2培地を調整した。37℃の水浴中でCM2を加温した。3000IU
/ml IL-2を添加した40mlのCM2を調製した。使用時まで保温する。使用したTIL株の名前の表示を付した2つの50mlコニカルチューブの各々に、IL-2を含まない20mlの予め加温したCM2を入れた。LN2貯蔵庫から2つの指定のプレREP TIL株を取り出し、バイアルを組織培養室に移した。残りの氷が少量になるまでバイアルを37℃の水浴中の密封されたジッパー式貯蔵用バッグの内部に置くことにより、バイアルを解凍した。
[00874] 滅菌ホールピペットを使用してバイアルの内容物を直ちに表示を付した調製
済み50mlコニカルチューブ内の20mlのCM2中に移した。IL-2を含まないCM2を使用して40mlまでQSして細胞を洗浄した。400×CFで5分間遠心した。上清を吸引し、3000IU/ml IL-2を添加した5mlの温CM2に再懸濁した。
済み50mlコニカルチューブ内の20mlのCM2中に移した。IL-2を含まないCM2を使用して40mlまでQSして細胞を洗浄した。400×CFで5分間遠心した。上清を吸引し、3000IU/ml IL-2を添加した5mlの温CM2に再懸濁した。
[00875] 少量のアリコート(20μl)をデュプリケートで取り出し、自動セルカウ
ンターを使用して細胞をカウントした。カウントを記録した。カウントする一方、TIL
細胞が入った50mlコニカルチューブは、キャップを緩めてガス交換を可能にして、加湿した37℃、5%CO2インキュベーターに置いた。細胞濃度を決定し、3000IU/mlのIL-2を添加したCM2でTILを1×106細胞/mlに希釈した。
ンターを使用して細胞をカウントした。カウントを記録した。カウントする一方、TIL
細胞が入った50mlコニカルチューブは、キャップを緩めてガス交換を可能にして、加湿した37℃、5%CO2インキュベーターに置いた。細胞濃度を決定し、3000IU/mlのIL-2を添加したCM2でTILを1×106細胞/mlに希釈した。
[00876] 加湿した37℃インキュベーター内で必要に応じた数のウェルにおいて24
ウェル組織培養プレートの1ウェルあたり2mlでミニREPの0日目まで培養した。混同及び潜在的な交差汚染を避けるため、異なるTIL株は別個の24ウェル組織培養プレートにおいて培養した。
ウェル組織培養プレートの1ウェルあたり2mlでミニREPの0日目まで培養した。混同及び潜在的な交差汚染を避けるため、異なるTIL株は別個の24ウェル組織培養プレートにおいて培養した。
0日目、ミニREPを開始する
[00877] 試験するフィーダーロットの数に十分なCM2培地を調製した(例えば、1
回に4つのフィーダーロットを試験するために、800mlのCM2培地を調製した)。上記で調製したCM2の一部をアリコートに分け、細胞の培養のため、それに3000IU/ml IL-2を添加した(例えば、1回に4つのフィーダーロットを試験するために、500mlの3000IU/ml IL-2含有CM2培地を調製する)。
[00877] 試験するフィーダーロットの数に十分なCM2培地を調製した(例えば、1
回に4つのフィーダーロットを試験するために、800mlのCM2培地を調製した)。上記で調製したCM2の一部をアリコートに分け、細胞の培養のため、それに3000IU/ml IL-2を添加した(例えば、1回に4つのフィーダーロットを試験するために、500mlの3000IU/ml IL-2含有CM2培地を調製する)。
[00878] 各TIL株を別々に作業して交差汚染を防ぎながら、TIL培養物が入った
24ウェルプレートをインキュベーターから取り出し、BSCに移した。
24ウェルプレートをインキュベーターから取り出し、BSCに移した。
[00879] 滅菌ホールピペット又は100~1000μlピペッター及びチップを使用
して、使用するTILの各ウェルから約1mlの培地を取り出し、24ウェル組織培養プレートの使用されていないウェルに入れた。
して、使用するTILの各ウェルから約1mlの培地を取り出し、24ウェル組織培養プレートの使用されていないウェルに入れた。
[00880] 新鮮な滅菌ホールピペット又は100~1000μlピペッター及びチップ
を使用して、ウェル内で残りの培地をTILと混合して細胞を再懸濁し、次にTIL名が表示された50mlコニカルチューブに細胞懸濁液を移し、容積を記録した。
を使用して、ウェル内で残りの培地をTILと混合して細胞を再懸濁し、次にTIL名が表示された50mlコニカルチューブに細胞懸濁液を移し、容積を記録した。
[00881] 確保しておいた培地でウェルを洗浄し、その容積を同じ50mlコニカルチ
ューブに移した。細胞を400×CFでスピンして細胞ペレットを収集した。培地上清を吸引して取り除き、3000IU/ml IL-2を含有する2~5mlのCM2培地中に細胞ペレットを再懸濁する。使用される容積は、回収されるウェルの数及びペレットのサイズに基づく(容積は>1.3×106細胞/mlの濃度を確保するのに十分であろう)。
ューブに移した。細胞を400×CFでスピンして細胞ペレットを収集した。培地上清を吸引して取り除き、3000IU/ml IL-2を含有する2~5mlのCM2培地中に細胞ペレットを再懸濁する。使用される容積は、回収されるウェルの数及びペレットのサイズに基づく(容積は>1.3×106細胞/mlの濃度を確保するのに十分であろう)。
[00882] 血清用ピペットを使用して、細胞懸濁液を完全に混合し、容積を記録した。
200μlを取り出し、自動セルカウンターを使用して細胞をカウントした。カウントする一方、TIL細胞が入った50mlコニカルチューブは、キャップを緩めてガス交換を可能にして、加湿した、5%CO2、37℃のインキュベーターに置いた。カウントを記録した。
200μlを取り出し、自動セルカウンターを使用して細胞をカウントした。カウントする一方、TIL細胞が入った50mlコニカルチューブは、キャップを緩めてガス交換を可能にして、加湿した、5%CO2、37℃のインキュベーターに置いた。カウントを記録した。
[00883] TIL細胞が入った50mlコニカルチューブをインキュベーターから取り
出し、3000IU/ml IL-2を添加した温CM2中にそれらの細胞を1.3×106細胞/mlの濃度で再懸濁した。キャップを緩めたまま、50mlコニカルチューブをインキュベーターに戻した。
出し、3000IU/ml IL-2を添加した温CM2中にそれらの細胞を1.3×106細胞/mlの濃度で再懸濁した。キャップを緩めたまま、50mlコニカルチューブをインキュベーターに戻した。
[00884] 第2のTIL株について上記のステップを繰り返した。
[00885] 実験のためのT25フラスコにTILをプレーティングする直前に、TIL
は以下に従って1.3×105細胞/mlの最終濃度に1:10希釈した。
は以下に従って1.3×105細胞/mlの最終濃度に1:10希釈した。
MACS GMP CD3純粋(OKT3)作業溶液を調製する
[00886] 4℃の冷蔵庫からOKT3のストック溶液(1mg/ml)を取り出し、B
SCに置いた。ミニREPの培地中には30ng/ml OKT3の最終濃度を使用した。
[00886] 4℃の冷蔵庫からOKT3のストック溶液(1mg/ml)を取り出し、B
SCに置いた。ミニREPの培地中には30ng/ml OKT3の最終濃度を使用した。
[00887] 実験の各T25フラスコ内の20mlについて600ngのOKT3が必要
であった;これは各20mlについて60μlの10μg/ml溶液又は各フィーダーロットについて試験する6つ全てのフラスコについて360μlの相当量であった。
であった;これは各20mlについて60μlの10μg/ml溶液又は各フィーダーロットについて試験する6つ全てのフラスコについて360μlの相当量であった。
[00888] 試験する各フィーダーロットについて、10μg/mlの作業濃度に対して
400μlの1:100希釈の1mg/mlのOKT3を作成した(例えば、1回に4つのフィーダーロットを試験するために、1600μlの1:100希釈の1mg/mlのOKT3:16μlの1mg/mlのOKT3+1.584mlの3000IU/mlのIL-2含有CM2培地を作成した)。
400μlの1:100希釈の1mg/mlのOKT3を作成した(例えば、1回に4つのフィーダーロットを試験するために、1600μlの1:100希釈の1mg/mlのOKT3:16μlの1mg/mlのOKT3+1.584mlの3000IU/mlのIL-2含有CM2培地を作成した)。
T25フラスコを調製する
[00889] 各フラスコに表示を付し、フィーダー細胞を調製する前にフラスコにCM2
培地を充填した。フラスコを37℃の加湿された5%CO2インキュベーターに置くことにより、残りの構成成分を加えるまでの間、培地を保温した。フィーダー細胞を調製し終えたら、各フラスコ内のCM2に構成成分を加える。
[00889] 各フラスコに表示を付し、フィーダー細胞を調製する前にフラスコにCM2
培地を充填した。フラスコを37℃の加湿された5%CO2インキュベーターに置くことにより、残りの構成成分を加えるまでの間、培地を保温した。フィーダー細胞を調製し終えたら、各フラスコ内のCM2に構成成分を加える。
フィーダー細胞を調製する
[00890] 本プロトコルについては、試験した1ロットあたり最低78×106個のフ
ィーダー細胞が必要であった。SDBBによって凍結された各1mlバイアルは、凍結時に100×106個の生細胞を有した。LN2貯蔵庫からの解凍時に50%回収率と仮定すると、各REPについて推定100×106個の生細胞を所与として、1ロットあたりフィーダー細胞の1mlバイアルを少なくとも2本解凍することが推奨された。代わりに、1.8mlバイアルで供給される場合、1本のバイアルのみで十分なフィーダー細胞が提供された。
[00890] 本プロトコルについては、試験した1ロットあたり最低78×106個のフ
ィーダー細胞が必要であった。SDBBによって凍結された各1mlバイアルは、凍結時に100×106個の生細胞を有した。LN2貯蔵庫からの解凍時に50%回収率と仮定すると、各REPについて推定100×106個の生細胞を所与として、1ロットあたりフィーダー細胞の1mlバイアルを少なくとも2本解凍することが推奨された。代わりに、1.8mlバイアルで供給される場合、1本のバイアルのみで十分なフィーダー細胞が提供された。
[00891] フィーダー細胞の解凍前に、試験される各フィーダーロットについて約50
mlのIL-2不含CM2を予め加温した。LN2貯蔵庫から指定のフィーダーロットバイアルを取り出し、ジッパー式貯蔵用バッグに入れ、氷上に置いた。37℃の水浴に浸すことにより、閉じたジッパー式貯蔵用バッグ内でバイアルを解凍した。ジッパー式バッグ
からバイアルを取り出し、70%EtOHを噴霧するか又はそれで拭き取り、バイアルをBSCに移した。
mlのIL-2不含CM2を予め加温した。LN2貯蔵庫から指定のフィーダーロットバイアルを取り出し、ジッパー式貯蔵用バッグに入れ、氷上に置いた。37℃の水浴に浸すことにより、閉じたジッパー式貯蔵用バッグ内でバイアルを解凍した。ジッパー式バッグ
からバイアルを取り出し、70%EtOHを噴霧するか又はそれで拭き取り、バイアルをBSCに移した。
[00892] ホールピペットを使用して、フィーダーバイアルの内容物を50mlコニカ
ルチューブ内の30mlの温CM2中に直ちに移した。バイアルを少量のCM2で洗浄してバイアル内に残った細胞を全て取り出した。400×CFで5分間遠心した。上清を吸引し、4ml温CM2+3000IU/ml IL-2に再懸濁した。200μlを取り出し、自動セルカウンターを使用して細胞をカウントした。カウントを記録した。
ルチューブ内の30mlの温CM2中に直ちに移した。バイアルを少量のCM2で洗浄してバイアル内に残った細胞を全て取り出した。400×CFで5分間遠心した。上清を吸引し、4ml温CM2+3000IU/ml IL-2に再懸濁した。200μlを取り出し、自動セルカウンターを使用して細胞をカウントした。カウントを記録した。
[00893] 細胞を温CM2+3000IU/ml IL-2中に1.3×107細胞/
mlで再懸濁した。TIL細胞を1.3×106細胞/ml~1.3×105細胞/mlに希釈した。
mlで再懸濁した。TIL細胞を1.3×106細胞/ml~1.3×105細胞/mlに希釈した。
共培養をセットアップする
[00894] TIL細胞を1.3×106細胞/ml~1.3×105細胞/mlに希釈
した。15mlコニカルチューブに4.5mlのCM2培地を加えた。インキュベーターからTIL細胞を取り出し、10ml血清用ピペットを使用して十分に再懸濁した。1.3×106細胞/ml TIL懸濁液から0.5mlの細胞を取り出し、15mlコニカルチューブ内の4.5mlの培地に加えた。TILストックバイアルをインキュベーターに戻した。十分に混合した。第2のTIL株について繰り返した。単一のフィーダーロットについての予め加温した培地が入ったフラスコをインキュベーターからBSCに移した。1mlピペットチップで上下に数回ピペッティングすることによりフィーダー細胞を混合し、1ml(1.3×107細胞)をそのフィーダーロットの各フラスコに移した。各フラスコに60μlのOKT3作業ストック(10μg/ml)を加えた。2つの対照フラスコをインキュベーターに戻した。
[00894] TIL細胞を1.3×106細胞/ml~1.3×105細胞/mlに希釈
した。15mlコニカルチューブに4.5mlのCM2培地を加えた。インキュベーターからTIL細胞を取り出し、10ml血清用ピペットを使用して十分に再懸濁した。1.3×106細胞/ml TIL懸濁液から0.5mlの細胞を取り出し、15mlコニカルチューブ内の4.5mlの培地に加えた。TILストックバイアルをインキュベーターに戻した。十分に混合した。第2のTIL株について繰り返した。単一のフィーダーロットについての予め加温した培地が入ったフラスコをインキュベーターからBSCに移した。1mlピペットチップで上下に数回ピペッティングすることによりフィーダー細胞を混合し、1ml(1.3×107細胞)をそのフィーダーロットの各フラスコに移した。各フラスコに60μlのOKT3作業ストック(10μg/ml)を加えた。2つの対照フラスコをインキュベーターに戻した。
[00895] 1ml(1.3×105)の各TILロットを対応する表示のT25フラス
コに移した。フラスコをインキュベーターに戻し、直立でインキュベートした。5日目まで手を加えなかった。
コに移した。フラスコをインキュベーターに戻し、直立でインキュベートした。5日目まで手を加えなかった。
[00896] 試験した全てのフィーダーロットについて繰り返した。
5日目、培地交換
3000IU/mlのIL-2でCM2を調製した。各フラスコに10ml必要である。10mlピペットで、3000IU/ml IL-2を含む10ml温CM2を各フラスコに移した。フラスコをインキュベーターに戻し、7日目まで直立でインキュベートした。試験した全てのフィーダーロットについて繰り返した。
3000IU/mlのIL-2でCM2を調製した。各フラスコに10ml必要である。10mlピペットで、3000IU/ml IL-2を含む10ml温CM2を各フラスコに移した。フラスコをインキュベーターに戻し、7日目まで直立でインキュベートした。試験した全てのフィーダーロットについて繰り返した。
7日目、回収
[00897] インキュベーターからフラスコを取り出してBSCに移し、且つフラスコの
底にある細胞層を乱さないよう注意を払った。フラスコの底に成長する細胞を乱すことなく、各試験フラスコから10mlの培地及び対照フラスコの各々から15mlの培地を取り出した。
[00897] インキュベーターからフラスコを取り出してBSCに移し、且つフラスコの
底にある細胞層を乱さないよう注意を払った。フラスコの底に成長する細胞を乱すことなく、各試験フラスコから10mlの培地及び対照フラスコの各々から15mlの培地を取り出した。
[00898] 10ml血清用ピペットを使用して、残りの培地に細胞を再懸濁し、十分に
混合して細胞集塊を全て壊した。ピペッティングにより細胞懸濁液を完全に混合した後、200μlを取り出して細胞をカウントした。適切な標準実施要領を自動セルカウンター装置と併せて用いてTILをカウントした。7日目のカウントを記録した。
混合して細胞集塊を全て壊した。ピペッティングにより細胞懸濁液を完全に混合した後、200μlを取り出して細胞をカウントした。適切な標準実施要領を自動セルカウンター装置と併せて用いてTILをカウントした。7日目のカウントを記録した。
[00899] 試験した全てのフィーダーロットについて繰り返した。
[00900] 以下の表TTに従い、フィーダー対照フラスコについて複製不能性を判定し
、且つTILが入ったフラスコについて0日目からの拡大倍率を判定した。
、且つTILが入ったフラスコについて0日目からの拡大倍率を判定した。
7日目、14日目までのフィーダー対照フラスコの継続
[00901] 7日目にフィーダー対照フラスコをカウントし終えた後、対照フラスコの各
々に、3000IU/ml IL-2を含有する新鮮CM2培地15mlを加えた。対照フラスコをインキュベーターに戻し、14日目まで直立位置でインキュベートした。
[00901] 7日目にフィーダー対照フラスコをカウントし終えた後、対照フラスコの各
々に、3000IU/ml IL-2を含有する新鮮CM2培地15mlを加えた。対照フラスコをインキュベーターに戻し、14日目まで直立位置でインキュベートした。
14日目、フィーダー対照フラスコの非拡大培養の延長
[00902] インキュベーターからフラスコを取り出してBSCに移し、且つフラスコの
底にある細胞層を乱さないよう注意を払った。フラスコの底に成長する細胞を乱すことなく、各対照フラスコから約17mlの培地を取り出した。5ml血清用ピペットを使用して、残りの培地に細胞を再懸濁し、十分に混合して細胞集塊を全て壊した。各フラスコの容積を記録した。
[00902] インキュベーターからフラスコを取り出してBSCに移し、且つフラスコの
底にある細胞層を乱さないよう注意を払った。フラスコの底に成長する細胞を乱すことなく、各対照フラスコから約17mlの培地を取り出した。5ml血清用ピペットを使用して、残りの培地に細胞を再懸濁し、十分に混合して細胞集塊を全て壊した。各フラスコの容積を記録した。
[00903] ピペッティングにより細胞懸濁液を完全に混合した後、200μlを取り出
して細胞をカウントした。適切な標準実施要領を自動セルカウンター装置と併せて用いてTILをカウントした。カウントを記録した。
して細胞をカウントした。適切な標準実施要領を自動セルカウンター装置と併せて用いてTILをカウントした。カウントを記録した。
[00904] 試験した全てのフィーダーロットについて繰り返した。
結果及び適合基準
結果
[00905] γ線照射の線量はフィーダー細胞を複製不能にするのに十分であった。全て
のロットが判定基準に適合するものと予想され、また、0日目と比較してREP培養の7日目に残る生存フィーダー細胞総数の減少も実証された。
結果
[00905] γ線照射の線量はフィーダー細胞を複製不能にするのに十分であった。全て
のロットが判定基準に適合するものと予想され、また、0日目と比較してREP培養の7日目に残る生存フィーダー細胞総数の減少も実証された。
[00906] 全てのフィーダーロットが、REP培養の7日目までにTIL増殖の100
倍の拡大という判定基準に適合するものと予想された。
倍の拡大という判定基準に適合するものと予想された。
[00907] フィーダー対照フラスコの14日目のカウントは、7日目に見られた非拡大
培養傾向が続くものと予想された。
培養傾向が続くものと予想された。
適合基準
[00908] フィーダー細胞の各ロットについて試験した各複製TIL株は、以下の適合
基準を満たしていた。
[00908] フィーダー細胞の各ロットについて試験した各複製TIL株は、以下の適合
基準を満たしていた。
[00909] 以下の通り(以下の表27に概説する)、適合は2倍であった。
[00910] 30ng/ml OKT3抗体及び3000IU/ml IL-2の存在下
で培養したとき放射線量がMNCフィーダー細胞を複製不能にするのに十分であったかどうかを判定した。複製不能かどうかは、REPの7日目及び14日目に自動細胞カウントによって決定したときの総生細胞数(TVC)によって判定した。
で培養したとき放射線量がMNCフィーダー細胞を複製不能にするのに十分であったかどうかを判定した。複製不能かどうかは、REPの7日目及び14日目に自動細胞カウントによって決定したときの総生細胞数(TVC)によって判定した。
[00911] 適合基準は「成長なし」であったが、これは、REPの0日目に培養を開始
した初期生細胞数から7日目及び14日目に総生細胞数が増加しなかったことを意味した。
した初期生細胞数から7日目及び14日目に総生細胞数が増加しなかったことを意味した。
[00912] フィーダー細胞がTIL拡大培養を支持する能力を判定した。REPの0日
目の培養開始からREPの7日目までの生細胞の拡大倍率の点でTIL成長を測定した。7日目、自動細胞カウントによって判定したとき、TIL培養物は最低でも100倍の拡大(即ちREP 0日目に培養を開始した総TIL生細胞数の100倍より多い)を実現した。
目の培養開始からREPの7日目までの生細胞の拡大倍率の点でTIL成長を測定した。7日目、自動細胞カウントによって判定したとき、TIL培養物は最低でも100倍の拡大(即ちREP 0日目に培養を開始した総TIL生細胞数の100倍より多い)を実現した。
適合基準を満たさないMNCフィーダーロットのコンティンジェンシーテスト
[00913] MNCフィーダーロットが上記に概説される適合基準のいずれかを満たさな
かった場合、その原因として単純な実験者エラーを排除するため以下のステップを行ってロットを再試験する。
[00913] MNCフィーダーロットが上記に概説される適合基準のいずれかを満たさな
かった場合、その原因として単純な実験者エラーを排除するため以下のステップを行ってロットを再試験する。
[00914] ロットのサテライトの試験バイアルが2つ以上残っている場合、そのロット
は再試験した。ロットのサテライトの試験バイアルが1つ残っているか又は残っていなかった場合、上記に挙げる適合基準に基づきそのロットは不適合とした。
は再試験した。ロットのサテライトの試験バイアルが1つ残っているか又は残っていなかった場合、上記に挙げる適合基準に基づきそのロットは不適合とした。
[00915] 適格とされるには、問題のロット及び対照ロットが適合基準を達成しなけれ
ばならなかった。これらの基準に適合すると、そのロットは、使用のためにリリースされた。
ばならなかった。これらの基準に適合すると、そのロットは、使用のためにリリースされた。
実施例10:γ線照射末梢血単核球の個々のロットの適格性
[00916] 本実施例は、γ線照射末梢血単核球(PBMC)の個々のロットが本明細書
に記載される例示的方法における同種異系フィーダー細胞としての使用に適格か判定するための新規簡略手順について記載する。本例は、臨床用TILロットの産生における使用に関する照射PBMC細胞ロットの判定プロトコルを提供する。個別のドナーから各照射PBMCロットを調製した。100を超える適格性判定プロトコルを通して、いずれの場合にも、SDBB(サンディエゴ血液バンク)からの照射PBMCロットはREPの7日目にTILを>100倍に拡大することが示された。この改良された適格性判定プロトコルは、受けたγ線線量がそれらを複製不能にするのに十分であったことを確認するため更
に試験されたSDBBからの照射ドナーPBMCロットに適用することが意図された。それが14日間にわたって複製不能を維持することが実証されると、ドナーPBMCロットは、臨床用TILロットの産生への使用に「適格である」と見なした。
[00916] 本実施例は、γ線照射末梢血単核球(PBMC)の個々のロットが本明細書
に記載される例示的方法における同種異系フィーダー細胞としての使用に適格か判定するための新規簡略手順について記載する。本例は、臨床用TILロットの産生における使用に関する照射PBMC細胞ロットの判定プロトコルを提供する。個別のドナーから各照射PBMCロットを調製した。100を超える適格性判定プロトコルを通して、いずれの場合にも、SDBB(サンディエゴ血液バンク)からの照射PBMCロットはREPの7日目にTILを>100倍に拡大することが示された。この改良された適格性判定プロトコルは、受けたγ線線量がそれらを複製不能にするのに十分であったことを確認するため更
に試験されたSDBBからの照射ドナーPBMCロットに適用することが意図された。それが14日間にわたって複製不能を維持することが実証されると、ドナーPBMCロットは、臨床用TILロットの産生への使用に「適格である」と見なした。
背景
[00917] TILの現行の標準REPには、γ線照射した拡大培養が止まったPBMC
が必要であった。培養下でPBMC上の膜受容体が抗CD3(クローンOKT3)抗体に結合し、TILに架橋することにより、TILが拡大するように刺激される。PBMCロットは、個別のドナーから採取された全血の白血球アフェレーシスから調製した。白血球アフェレーシス産物をFicoll-Hypaqueで遠心に供し、洗浄し、照射し、且つGMP条件下で凍結保存した。
[00917] TILの現行の標準REPには、γ線照射した拡大培養が止まったPBMC
が必要であった。培養下でPBMC上の膜受容体が抗CD3(クローンOKT3)抗体に結合し、TILに架橋することにより、TILが拡大するように刺激される。PBMCロットは、個別のドナーから採取された全血の白血球アフェレーシスから調製した。白血球アフェレーシス産物をFicoll-Hypaqueで遠心に供し、洗浄し、照射し、且つGMP条件下で凍結保存した。
[00918] 移植片対宿主病(GVHD)を引き起こし得るため、TIL療法を受けた患
者が生細胞PBMCを注入されないことが重要である。従ってドナーPBMCは、γ線照射を細胞に与え、その結果二本鎖DNA切断が生じて再培養時にPBMCが細胞生存能力を失うことにより、拡大培養が止められる。
者が生細胞PBMCを注入されないことが重要である。従ってドナーPBMCは、γ線照射を細胞に与え、その結果二本鎖DNA切断が生じて再培養時にPBMCが細胞生存能力を失うことにより、拡大培養が止められる。
判定基準
[00919] 照射PBMCロットの判定基準はその複製不能性であった。
[00919] 照射PBMCロットの判定基準はその複製不能性であった。
実験セットアップ
[00920] 直立T25組織培養フラスコを使用して、フィーダーロットをTILと共培
養したかのようにミニREPフォーマットで試験した。対照ロット:歴史的に上記の基準に適合することが示されている照射PBMCの1つのロットを、対照として実験ロットと並行して実行した。試験する照射ドナーPBMCの各ロットについて、デュプリケートのフラスコを実行した。
[00920] 直立T25組織培養フラスコを使用して、フィーダーロットをTILと共培
養したかのようにミニREPフォーマットで試験した。対照ロット:歴史的に上記の基準に適合することが示されている照射PBMCの1つのロットを、対照として実験ロットと並行して実行した。試験する照射ドナーPBMCの各ロットについて、デュプリケートのフラスコを実行した。
実験プロトコル
0日目
[00921] 試験されるドナーPBMCの各ロットについて約90mlのCM2培地を調
製した。CM2は37℃の水浴中に保温した。6×106IU/ml IL-2のアリコートを解凍した。CM2培地をBSCに戻し、70%EtOHで拭き取った後、フードに置いた。試験するPBMCの各ロットについて、約60mlのCM2を別個の滅菌ボトルに取り出した。解凍した6×106IU/mlストック溶液からのIL-2を3000IU/mlの最終濃度でこの培地に加えた。このボトルに「CM2/IL2」(又は類似)の表示を付して、それを無添加のCM2と区別した。
0日目
[00921] 試験されるドナーPBMCの各ロットについて約90mlのCM2培地を調
製した。CM2は37℃の水浴中に保温した。6×106IU/ml IL-2のアリコートを解凍した。CM2培地をBSCに戻し、70%EtOHで拭き取った後、フードに置いた。試験するPBMCの各ロットについて、約60mlのCM2を別個の滅菌ボトルに取り出した。解凍した6×106IU/mlストック溶液からのIL-2を3000IU/mlの最終濃度でこの培地に加えた。このボトルに「CM2/IL2」(又は類似)の表示を付して、それを無添加のCM2と区別した。
OKT3を調製する
[00922] 4℃の冷蔵庫から抗CD3(OKT3)のストック溶液を取り出し、BSC
に置いた。ミニREPの培地中には30ng/ml OKT3の最終濃度を使用した。1mg/mlストック溶液からの抗CD3(OKT3)の10μg/ml作業溶液を調製した。必要になるまで冷蔵庫に置いた。
[00922] 4℃の冷蔵庫から抗CD3(OKT3)のストック溶液を取り出し、BSC
に置いた。ミニREPの培地中には30ng/ml OKT3の最終濃度を使用した。1mg/mlストック溶液からの抗CD3(OKT3)の10μg/ml作業溶液を調製した。必要になるまで冷蔵庫に置いた。
[00923] 試験した各PBMCロットについて、150μlの1:100希釈の抗CD
3(OKT3)ストックを調製する。例えば、1回に4つのPBMCロットを試験するために、3000IU/ml IL-2を添加した594μlのCM2に6μlの1mg/mlストック溶液を加えることにより、600μlの10μ/ml抗CD3(OKT3)を調製する。
3(OKT3)ストックを調製する。例えば、1回に4つのPBMCロットを試験するために、3000IU/ml IL-2を添加した594μlのCM2に6μlの1mg/mlストック溶液を加えることにより、600μlの10μ/ml抗CD3(OKT3)を調製する。
フラスコを調製する
[00924] 表示を付したT25フラスコに、1フラスコあたり19mlのCM2/IL
-2を加え、細胞を調製する間、フラスコを37℃の加湿5%CO2インキュベーターに置いた。
[00924] 表示を付したT25フラスコに、1フラスコあたり19mlのCM2/IL
-2を加え、細胞を調製する間、フラスコを37℃の加湿5%CO2インキュベーターに置いた。
照射PBMCを調製する
[00925] 試験されるPBMCロットのバイアルをLN2貯蔵庫から取り出した。それ
らのバイアルは解凍時まで-80℃に置くか、又はドライアイス上に保った。解凍される各ロットについて30mlのCM2(IL-2の添加なし)を50mlコニカルチューブに入れた。各チューブに解凍されるPBMCの異なるロット番号の表示を付した。使用時まで、チューブのキャップを確実に閉めて37℃の水浴中に置いた。必要に応じて、50mlコニカルチューブをBSCに戻し、70%EtOHで拭き取った後、フードに置いた。
[00925] 試験されるPBMCロットのバイアルをLN2貯蔵庫から取り出した。それ
らのバイアルは解凍時まで-80℃に置くか、又はドライアイス上に保った。解凍される各ロットについて30mlのCM2(IL-2の添加なし)を50mlコニカルチューブに入れた。各チューブに解凍されるPBMCの異なるロット番号の表示を付した。使用時まで、チューブのキャップを確実に閉めて37℃の水浴中に置いた。必要に応じて、50mlコニカルチューブをBSCに戻し、70%EtOHで拭き取った後、フードに置いた。
[00926] 低温貯蔵庫からバイアルPBMCを取り出し、37℃の水浴中のフローティ
ングチューブラックに置いて解凍した。解凍は、バイアル内に少量の氷が残るまで進行させた。滅菌ホールピペットを使用して、バイアルの内容物を50mlコニカルチューブ内の30mlのCM2中に直ちに移した。チューブから約1mlの培地を取り出してバイアルをすすいだ;すすぎ液を50mlコニカルチューブに戻した。キャップを確実に閉め、静かに回して細胞を洗浄した。
ングチューブラックに置いて解凍した。解凍は、バイアル内に少量の氷が残るまで進行させた。滅菌ホールピペットを使用して、バイアルの内容物を50mlコニカルチューブ内の30mlのCM2中に直ちに移した。チューブから約1mlの培地を取り出してバイアルをすすいだ;すすぎ液を50mlコニカルチューブに戻した。キャップを確実に閉め、静かに回して細胞を洗浄した。
[00927] 室温において400×gで5分間遠心した。上清を吸引し、1000μlピ
ペットチップを使用して1mlの温CM2/IL-2中に細胞ペレットを再懸濁した。代わりに、培地を加える前に、キャップを閉めたチューブを空のチューブラックに沿って引きずることにより細胞ペレットを再懸濁した。細胞ペレットの再懸濁後、CM2/IL-2培地を使用して容積を4mlにした。容積を記録した。
ペットチップを使用して1mlの温CM2/IL-2中に細胞ペレットを再懸濁した。代わりに、培地を加える前に、キャップを閉めたチューブを空のチューブラックに沿って引きずることにより細胞ペレットを再懸濁した。細胞ペレットの再懸濁後、CM2/IL-2培地を使用して容積を4mlにした。容積を記録した。
[00928] 少量のアリコート(例えば、100μl)を取り出し、自動セルカウンター
を使用して細胞をカウントした。カウントは、詳細な自動セルカウンターSOPに基づきデュプリケートで実施した。細胞カウントの実施前にPBMCの希釈を実施する必要がある可能性が最も高かった。推奨される出発希釈は1:10であったが、これは使用するセルカウンターのタイプに応じて異なっていた。カウントを記録した。
を使用して細胞をカウントした。カウントは、詳細な自動セルカウンターSOPに基づきデュプリケートで実施した。細胞カウントの実施前にPBMCの希釈を実施する必要がある可能性が最も高かった。推奨される出発希釈は1:10であったが、これは使用するセルカウンターのタイプに応じて異なっていた。カウントを記録した。
[00929] CM2/IL-2培地を使用してPBMCの濃度を1.3×107細胞/m
lに調整した。静かに回すことによるか、又は血清用ピペットを使用して静かに上下に吸引することにより十分に混合した。
lに調整した。静かに回すことによるか、又は血清用ピペットを使用して静かに上下に吸引することにより十分に混合した。
培養フラスコをセットアップ
[00930] 2つの表示を付したT25フラスコを組織培養インキュベーターからBSC
に戻した。抗CD3/OKT3の10μg/mlバイアルをBSCに戻した。フラスコに1mlの1.3×107PBMC細胞懸濁液を加えた。各フラスコに60μlの10μg/ml抗CD3/OKT3を加えた。キャップを閉めたフラスコを組織培養インキュベーターに戻し、手を加えることなく14日間成長させた。次のロットに必要になるまで抗CD3/OKT3バイアルを冷蔵庫に入れ戻した。判定されるPBMCのロット毎に繰り返した。
[00930] 2つの表示を付したT25フラスコを組織培養インキュベーターからBSC
に戻した。抗CD3/OKT3の10μg/mlバイアルをBSCに戻した。フラスコに1mlの1.3×107PBMC細胞懸濁液を加えた。各フラスコに60μlの10μg/ml抗CD3/OKT3を加えた。キャップを閉めたフラスコを組織培養インキュベーターに戻し、手を加えることなく14日間成長させた。次のロットに必要になるまで抗CD3/OKT3バイアルを冷蔵庫に入れ戻した。判定されるPBMCのロット毎に繰り返した。
14日目、PBMCの非拡大培養性の測定
[00931] 複製したT25フラスコをBSCに戻した。各フラスコについて、新鮮な1
0ml血清用ピペットを使用してフラスコの各々から約17mlを取り出し、次に残りの培地を慎重に抜き取って、フラスコ内に残る容積を測定した。容積を記録した。
[00931] 複製したT25フラスコをBSCに戻した。各フラスコについて、新鮮な1
0ml血清用ピペットを使用してフラスコの各々から約17mlを取り出し、次に残りの培地を慎重に抜き取って、フラスコ内に残る容積を測定した。容積を記録した。
[00932] 同じ血清用ピペットを使用して上下にピペッティングすることによりサンプ
ルを十分に混合した。
ルを十分に混合した。
[00933] カウントのため各フラスコから200μlサンプルを取り出した。自動セル
カウンターを使用して細胞をカウントした。判定されるPBMCのロット毎にステップ7.4.26~7.4.31を繰り返した。
カウンターを使用して細胞をカウントした。判定されるPBMCのロット毎にステップ7.4.26~7.4.31を繰り返した。
結果及び適合基準
結果
[00934] γ線照射の線量はフィーダー細胞を複製不能にするのに十分であると予想さ
れた。全てのロットが判定基準に適合するものと予想され、0日目と比較してREP培養の14日目に残る生存フィーダー細胞総数の減少が実証された。
結果
[00934] γ線照射の線量はフィーダー細胞を複製不能にするのに十分であると予想さ
れた。全てのロットが判定基準に適合するものと予想され、0日目と比較してREP培養の14日目に残る生存フィーダー細胞総数の減少が実証された。
適合基準
[00935] 試験した各照射ドナーPBMCロットについて、以下の適合基準が満たされ
た:「成長なし」 - 14日目の総生細胞数が、REPの0日目に培養を開始した初期生細胞数より少なかったことを意味した。
[00935] 試験した各照射ドナーPBMCロットについて、以下の適合基準が満たされ
た:「成長なし」 - 14日目の総生細胞数が、REPの0日目に培養を開始した初期生細胞数より少なかったことを意味した。
適合基準を満たさないPBMCロットのコンティンジェンシーテスト
[00936] 照射ドナーPBMCロットが上記の適合基準を満たさなかった場合、その不
適合の原因として単純な実験者エラーを排除するため以下のステップを行ってロットを再試験した。ロットのサテライトのバイアルが2つ以上残っていた場合、そのロットは再試験した。ロットのサテライトのバイアルが1つ残っているか又は残っていない場合、上記の適合基準に基づきそのロットは不適合とした。
[00936] 照射ドナーPBMCロットが上記の適合基準を満たさなかった場合、その不
適合の原因として単純な実験者エラーを排除するため以下のステップを行ってロットを再試験した。ロットのサテライトのバイアルが2つ以上残っていた場合、そのロットは再試験した。ロットのサテライトのバイアルが1つ残っているか又は残っていない場合、上記の適合基準に基づきそのロットは不適合とした。
[00937] 適格とされるには、コンティンジェンシーテストを受けるPBMCロットが
、適合基準を達成する対照ロットと問題のロットの両方の複製との両方を有していた。これらの基準に適合すると、そのロットは、使用のためにリリースされた。
、適合基準を達成する対照ロットと問題のロットの両方の複製との両方を有していた。これらの基準に適合すると、そのロットは、使用のためにリリースされた。
実施例11:IL-2ストック溶液の調製
[00938] この実施例は、精製され凍結乾燥された組換えヒトインターロイキン-2を
、rhIL-2の使用を含むものを含む本出願及び実施例に記載されたものを全て含む更なる組織培養プロトコルでの使用に適したストックサンプルに溶解するプロセスを説明する。
[00938] この実施例は、精製され凍結乾燥された組換えヒトインターロイキン-2を
、rhIL-2の使用を含むものを含む本出願及び実施例に記載されたものを全て含む更なる組織培養プロトコルでの使用に適したストックサンプルに溶解するプロセスを説明する。
手順
[00939] 0.2%酢酸溶液(HAc)を調製した。29mL滅菌水を50mLコニカ
ルチューブに移した。1mLの1N酢酸を50mLのコニカルチューブに加えた。チューブを2~3回反転させることにより十分に混合した。Steriflipフィルターを使用してろ
過することによりHAc溶液を滅菌した。
[00939] 0.2%酢酸溶液(HAc)を調製した。29mL滅菌水を50mLコニカ
ルチューブに移した。1mLの1N酢酸を50mLのコニカルチューブに加えた。チューブを2~3回反転させることにより十分に混合した。Steriflipフィルターを使用してろ
過することによりHAc溶液を滅菌した。
[00940] PBS中で1%HSAを調製した。150mL滅菌フィルターユニット内の
96mL PBSに4mLの25%HSAストック溶液を加えた。溶液をろ過した。4℃で貯蔵した。調製したrhIL-2の各バイアルについて、書式に記入した。
96mL PBSに4mLの25%HSAストック溶液を加えた。溶液をろ過した。4℃で貯蔵した。調製したrhIL-2の各バイアルについて、書式に記入した。
[00941] rhIL-2ストック溶液(6×106IU/mL最終濃度)を調製した。
rhIL-2はロット毎に異なり、製造者の分析証明書(COA)に掲載されている以下のような情報が必要であった:1)1バイアルあたりのrhIL-2の質量(mg)、2)rhIL-2の比活性(IU/mg)及び3)推奨0.2%HAc再構成容量(mL)。
rhIL-2はロット毎に異なり、製造者の分析証明書(COA)に掲載されている以下のような情報が必要であった:1)1バイアルあたりのrhIL-2の質量(mg)、2)rhIL-2の比活性(IU/mg)及び3)推奨0.2%HAc再構成容量(mL)。
[00942] rhIL-2ロットに必要な1%HSAの容積は、以下の式を用いて計算し
た。
た。
[00943] 例えば、CellGenixのrhIL-2ロット10200121 COAによれば、1mgバイアルの比活性は25×106lU/mgである。2mLの0.2%HAc中にrhIL-2を再構成することが推奨されている。
[00944] IL-2バイアルのゴム栓をアルコールワイプで拭き取った。3mLシリン
ジに取り付けた16G針を使用して、推奨容積の0.2%HAcをバイアルに注入した。針を引き抜くときに栓が外れないよう注意を払った。バイアルを3回反転させて、粉末が全て溶解するまで回した。栓を慎重に取り外し、アルコールワイプ上に置いておいた。計算した容積の1%HSAをバイアルに加えた。
ジに取り付けた16G針を使用して、推奨容積の0.2%HAcをバイアルに注入した。針を引き抜くときに栓が外れないよう注意を払った。バイアルを3回反転させて、粉末が全て溶解するまで回した。栓を慎重に取り外し、アルコールワイプ上に置いておいた。計算した容積の1%HSAをバイアルに加えた。
[00945] rhIL-2溶液の貯蔵。短期貯蔵(<72時間)の場合、バイアルを4℃
で貯蔵した。長期貯蔵(>72時間)については、バイアルを少量のアリコートに分け、使用直前まで-20℃でクライオバイアルに貯蔵した。凍結/解凍サイクルを避けた。調製日から6ヵ月後に期限切れとした。rh-IL-2表示には、販売業者及びカタログ番号、ロット番号、有効期限、作業者イニシャル、アリコートの濃度及び容積が含まれた。
で貯蔵した。長期貯蔵(>72時間)については、バイアルを少量のアリコートに分け、使用直前まで-20℃でクライオバイアルに貯蔵した。凍結/解凍サイクルを避けた。調製日から6ヵ月後に期限切れとした。rh-IL-2表示には、販売業者及びカタログ番号、ロット番号、有効期限、作業者イニシャル、アリコートの濃度及び容積が含まれた。
実施例12:プレREP及びREPプロセスのための培地調製
[00946] 本例は、限定はされないが、転移性黒色腫、頭頸部扁平上皮癌(HNSCC
)、卵巣癌、トリプルネガティブ乳癌及び肺腺癌を含めた様々な腫瘍型に由来する腫瘍浸潤リンパ球(TIL)の培養が関わるプロトコルに用いられる組織培養培地の調製手順について説明する。本出願及び実施例に記載される任意のTILの調製にこの培地を使用することができる。
[00946] 本例は、限定はされないが、転移性黒色腫、頭頸部扁平上皮癌(HNSCC
)、卵巣癌、トリプルネガティブ乳癌及び肺腺癌を含めた様々な腫瘍型に由来する腫瘍浸潤リンパ球(TIL)の培養が関わるプロトコルに用いられる組織培養培地の調製手順について説明する。本出願及び実施例に記載される任意のTILの調製にこの培地を使用することができる。
CM1の調製
[00947] 低温貯蔵庫から以下の試薬を取り出し、37℃の水浴中で加温した:(RP
MI1640、ヒトAB血清、200mML-グルタミン)。以下の表28に従い、ろ過される容積に適切な0.2μmフィルターユニットの上部に成分の各々を加えることによりCM1培地を調製した。4℃で保管する。
[00947] 低温貯蔵庫から以下の試薬を取り出し、37℃の水浴中で加温した:(RP
MI1640、ヒトAB血清、200mML-グルタミン)。以下の表28に従い、ろ過される容積に適切な0.2μmフィルターユニットの上部に成分の各々を加えることによりCM1培地を調製した。4℃で保管する。
[00948] 使用当日、所要量のCM1を37℃の水浴中で予め加温し、6000IU/
ml IL-2を添加した。
ml IL-2を添加した。
[00949] 追加の補充 - 必要があれば表29に準じる。
CM2の調製
[00950] 冷蔵庫から調製済みのCM1を取り出したか、又は上記セクション7.3に
従って新鮮CM1を調製する。AIM-V(登録商標)を冷蔵庫から取り出し、滅菌培地ボト
ル内に調製済みCM1を等容積のAIM-V(登録商標)と混合することにより、必要な量の
CM2を調製した。使用当日、CM2培地に3000IU/ml IL-2を加えた。使用当日、十分な量の3000IU/ml IL-2含有CM2を作成した。CM2培地ボトルに、その名前、調製者のイニシャル、それがろ過/調製された日付、2週間の有効期限の表示を付し、組織培養に必要になるまで4℃で貯蔵した。
[00950] 冷蔵庫から調製済みのCM1を取り出したか、又は上記セクション7.3に
従って新鮮CM1を調製する。AIM-V(登録商標)を冷蔵庫から取り出し、滅菌培地ボト
ル内に調製済みCM1を等容積のAIM-V(登録商標)と混合することにより、必要な量の
CM2を調製した。使用当日、CM2培地に3000IU/ml IL-2を加えた。使用当日、十分な量の3000IU/ml IL-2含有CM2を作成した。CM2培地ボトルに、その名前、調製者のイニシャル、それがろ過/調製された日付、2週間の有効期限の表示を付し、組織培養に必要になるまで4℃で貯蔵した。
CM3の調製
[00951] 使用が必要になった当日に、CM3を調製した。CM3はAIM-V(登録商標)
培地と同じであり、使用当日に3000IU/ml IL-2を添加した。AIM-Vのボト
ル又はバッグにIL-2ストック溶液を直接加えることにより、実験の必要上十分な量のCM3を調製した。軽く振盪することにより十分に混合した。AIM-Vに加えた直後に、ボ
トルに「3000IU/ml IL-2」の表示を付す。過剰なCM3がある場合、これを培地名、調製者のイニシャル、培地の調製日及びその有効期限(調製後7日)を表示したボトルに4℃で貯蔵した。IL-2を添加した培地は4℃で7日間の貯蔵後に廃棄した。
[00951] 使用が必要になった当日に、CM3を調製した。CM3はAIM-V(登録商標)
培地と同じであり、使用当日に3000IU/ml IL-2を添加した。AIM-Vのボト
ル又はバッグにIL-2ストック溶液を直接加えることにより、実験の必要上十分な量のCM3を調製した。軽く振盪することにより十分に混合した。AIM-Vに加えた直後に、ボ
トルに「3000IU/ml IL-2」の表示を付す。過剰なCM3がある場合、これを培地名、調製者のイニシャル、培地の調製日及びその有効期限(調製後7日)を表示したボトルに4℃で貯蔵した。IL-2を添加した培地は4℃で7日間の貯蔵後に廃棄した。
CM4の調製
[00952] CM4はCM3と同じであり、加えて2mMのGlutaMAX(商標)(最終濃度
)を添加した。1LのCM3について10mlの200mM GlutaMAX(商標)を加えた。AIM-Vのボトル又はバッグにIL-2ストック溶液及びGlutaMAX(商標)ストック溶液
を直接加えることにより、実験の必要上十分な量のCM4を調製した。軽く振盪することにより十分に混合した。AIM-Vに加えた直後に、ボトルに「3000IL/nil IL
-2及びGlutaMAX」の表示を付した。過剰なCM4がある場合、これを培地名「G1utaMAX」及び有効期限(調整後7日)とボトルにラベル付けし、4℃で貯蔵した。IL-2を添加した培地は4℃で7日間の貯蔵後に廃棄した。
[00952] CM4はCM3と同じであり、加えて2mMのGlutaMAX(商標)(最終濃度
)を添加した。1LのCM3について10mlの200mM GlutaMAX(商標)を加えた。AIM-Vのボトル又はバッグにIL-2ストック溶液及びGlutaMAX(商標)ストック溶液
を直接加えることにより、実験の必要上十分な量のCM4を調製した。軽く振盪することにより十分に混合した。AIM-Vに加えた直後に、ボトルに「3000IL/nil IL
-2及びGlutaMAX」の表示を付した。過剰なCM4がある場合、これを培地名「G1utaMAX」及び有効期限(調整後7日)とボトルにラベル付けし、4℃で貯蔵した。IL-2を添加した培地は4℃で7日間の貯蔵後に廃棄した。
実施例13:2Aプロセスで使用する無血清培地の評価
[00954] この実施例では、2Aプロセスで現在使用されている標準CM1、CM2及
びCM4培地の代替としての無血清培地の有効性の評価を示すデータを提供する。この研究では、3つの段階の代替として利用可能な無血清培地(SFM)及び無血清代替品の有効性を試験した。
[00954] この実施例では、2Aプロセスで現在使用されている標準CM1、CM2及
びCM4培地の代替としての無血清培地の有効性の評価を示すデータを提供する。この研究では、3つの段階の代替として利用可能な無血清培地(SFM)及び無血清代替品の有効性を試験した。
[00955] 段階 - 1:標準対CTS Optimizer又はPrime T CDM又はXvivo-20無血清培
地と、血清代替物又は血小板溶解物の有無を使用して、TIL拡大培養(n=3)の有効性を比較した。
地と、血清代替物又は血小板溶解物の有無を使用して、TIL拡大培養(n=3)の有効性を比較した。
[00956] 段階 - 2:G-Rex 5M(n=3)を使用して、ミニスケール2Aプロセス
で無血清培地条件の候補を試験した。
で無血清培地条件の候補を試験した。
背景情報
[00957] プレ及びポストREP培養で使用されている現在の培地の組み合わせは効果
的であることが証明されているが、AIM-VではREP障害が発生する可能性がある。効果
的な無血清代替物が特定された場合、使用する培地の種類の数を3から1に減らすことで、CMOで実施するプロセスをより容易且つ単純にすることができる。更に、SFMは、ヒト血清の使用を排除することにより、外因性疾患の可能性を減らす。この実施例は、2Aプロセスでの無血清培地の使用を裏付けるデータを提供する。
[00957] プレ及びポストREP培養で使用されている現在の培地の組み合わせは効果
的であることが証明されているが、AIM-VではREP障害が発生する可能性がある。効果
的な無血清代替物が特定された場合、使用する培地の種類の数を3から1に減らすことで、CMOで実施するプロセスをより容易且つ単純にすることができる。更に、SFMは、ヒト血清の使用を排除することにより、外因性疾患の可能性を減らす。この実施例は、2Aプロセスでの無血清培地の使用を裏付けるデータを提供する。
実験設計
[00958] プレREP及びREPは、LAB-008で述べた通りに開始された。この3つの段階の実験概要を以下のチャートに示す。
[00958] プレREP及びREPは、LAB-008で述べた通りに開始された。この3つの段階の実験概要を以下のチャートに示す。
[00959] 上記のチャートで提供されている通り、このプロジェクトは、2つのステッ
プで無血清培地及び添加物を試験するために入念に実施された。
プで無血清培地及び添加物を試験するために入念に実施された。
[00960] ステップ1:無血清培地提供者の選択。プレREP及びポストREPは、G-Rex24ウェルプレートで2Aプロセスを模倣するよう設定された。プレREPは、G-Rex
24ウェルプレートの各断片/ウェルを条件毎に3回又は4回培養することにより開始された。REPは、11日目にG-Rex24ウェルの4×10e5TIL/ウェルを培養して
開始し、16日目に分割し、22日目に回収した。CTS OpTimizer、X-Vivo 20及びPrime T-CDMは、プレREP及びREPで使用できる無血清培地の代替候補として使用された。CTS Immune SR血清代替品(Life Technologies)又は血小板溶解物血清(SDBB)をS
FMに3%加えた。各条件は、プレREP及びポストREPの両方で少なくとも3つの腫瘍で試験し、2Aプロセスを模倣するように計画された。
24ウェルプレートの各断片/ウェルを条件毎に3回又は4回培養することにより開始された。REPは、11日目にG-Rex24ウェルの4×10e5TIL/ウェルを培養して
開始し、16日目に分割し、22日目に回収した。CTS OpTimizer、X-Vivo 20及びPrime T-CDMは、プレREP及びREPで使用できる無血清培地の代替候補として使用された。CTS Immune SR血清代替品(Life Technologies)又は血小板溶解物血清(SDBB)をS
FMに3%加えた。各条件は、プレREP及びポストREPの両方で少なくとも3つの腫瘍で試験し、2Aプロセスを模倣するように計画された。
[00961] ステップ2:特定された候補者を、プロトコル(TP-17-007)毎に
ミニスケール2Aプロセスで更に試験した。簡潔に言えば、プレREPは、条件毎に2断片/G-Rex 5Mフラスコを3回培養することによって開始された。REPは、11日目に2×10e6/G-Rex 5Mフラスコを使用して開始され、16日目に分割され、22日目に回収された。
ミニスケール2Aプロセスで更に試験した。簡潔に言えば、プレREPは、条件毎に2断片/G-Rex 5Mフラスコを3回培養することによって開始された。REPは、11日目に2×10e6/G-Rex 5Mフラスコを使用して開始され、16日目に分割され、22日目に回収された。
[00962] 注記:いくつかの腫瘍は処理され、1実験で複数のパラメータを測定するた
めにセットアップされた。
めにセットアップされた。
観察
[00963] 無血清培地を2Aプロセスで使用される標準と比較した場合、同等又は統計
的に優れた細胞成長の結果が観察された。
[00963] 無血清培地を2Aプロセスで使用される標準と比較した場合、同等又は統計
的に優れた細胞成長の結果が観察された。
[00964] 2Aプロセスで使用される標準培地で成長したTILと比較した場合、無血
清培地で成長したTILから同様の表現型、IFN-y産生及び代謝物分析が観察された。
清培地で成長したTILから同様の表現型、IFN-y産生及び代謝物分析が観察された。
結果
プレ及びポストREP TIL拡大培養の無血清培地の有効性を試験する。
[00965] CTS Optimizer+SR(血清交換)は、増強したプレREP TIL拡大培養と同等のREP TIL拡大培養とを示した。CTS OpTimizer、X-Vivo 20及びPrime T-CDMは、3%CTS免疫CTS SRの有無にかかわらず追加され、標準条件に対して試験
された。M1079及びL4026では、CTS OpTimizer+CSR条件は、標準条件(C
M1、CM2、CM4)と比較した場合、プレREP TILの有意な増強(p<0.05)を示した。一方、CSRを使用しないCTS OptimizerはプレREP TILの拡大培
養に役立たなかった(付録-1、2、3)。CTS Optimizer+CSRは、試験された3つ
の腫瘍の2つでポストREPに匹敵するTIL拡大培養を示した(図2B)。X-Vivo 20
及びPrime T-CDM条件では、プレ及びポストREPで大きいばらつきが発生したが、CTS Optimizerは4組間で比較的一貫性があった。更に、血小板溶解物を加えたSFMは、標準と比較した場合、プレREP及びポストREP TILの拡大培養を促進しなかった。この調査結果は、当社の標準に匹敵する成長を提供するために血清置換が確かに必要であることを示唆しており、CTS optimizer+CSRが候補となり得る。
プレ及びポストREP TIL拡大培養の無血清培地の有効性を試験する。
[00965] CTS Optimizer+SR(血清交換)は、増強したプレREP TIL拡大培養と同等のREP TIL拡大培養とを示した。CTS OpTimizer、X-Vivo 20及びPrime T-CDMは、3%CTS免疫CTS SRの有無にかかわらず追加され、標準条件に対して試験
された。M1079及びL4026では、CTS OpTimizer+CSR条件は、標準条件(C
M1、CM2、CM4)と比較した場合、プレREP TILの有意な増強(p<0.05)を示した。一方、CSRを使用しないCTS OptimizerはプレREP TILの拡大培
養に役立たなかった(付録-1、2、3)。CTS Optimizer+CSRは、試験された3つ
の腫瘍の2つでポストREPに匹敵するTIL拡大培養を示した(図2B)。X-Vivo 20
及びPrime T-CDM条件では、プレ及びポストREPで大きいばらつきが発生したが、CTS Optimizerは4組間で比較的一貫性があった。更に、血小板溶解物を加えたSFMは、標準と比較した場合、プレREP及びポストREP TILの拡大培養を促進しなかった。この調査結果は、当社の標準に匹敵する成長を提供するために血清置換が確かに必要であることを示唆しており、CTS optimizer+CSRが候補となり得る。
[00966] G-Rex 5Mミニで候補条件を試験する。
[00967] ポストREP TILの表現型分析。以下の表31を参照されたい。
インターフェロンγの比較可能性
[00969] インターフェロンγELISA(Quantikine)。IFN-yの産生は、R&D SystemsのQuantikine ELISAキットを使用して測定した。CTS+SRは、標準条件と比較した場合、同量のIFNーyを産生した。
[00969] インターフェロンγELISA(Quantikine)。IFN-yの産生は、R&D SystemsのQuantikine ELISAキットを使用して測定した。CTS+SRは、標準条件と比較した場合、同量のIFNーyを産生した。
実施例14:T細胞成長因子カクテルIL-2/IL-15/IL-21は、腫瘍浸潤T細胞の拡大培養とエフェクター機能を増強する
[00970] 自己腫瘍浸潤リンパ球(TIL)を用いた養子T細胞療法は、転移性黒色腫
及び子宮頸癌の患者で臨床的有効性を実証している。いくつかの研究では、より良い臨床結果では、注入された細胞の総数及び/又はCD8+T細胞の割合と正の相関を示している。現在のほとんどの産生レジメンでは、TILの成長を促進するためにIL-2のみを使用している。IL-15及びIL-21を含むレジメンを使用すると、リンパ球の成長が促進されることが報告されている。この研究では、最近診療所で実施された第2のジェネレーションIL-2 TILプロトコルにIL-15及びIL-21を加えることの前向きな効果について説明する。
[00970] 自己腫瘍浸潤リンパ球(TIL)を用いた養子T細胞療法は、転移性黒色腫
及び子宮頸癌の患者で臨床的有効性を実証している。いくつかの研究では、より良い臨床結果では、注入された細胞の総数及び/又はCD8+T細胞の割合と正の相関を示している。現在のほとんどの産生レジメンでは、TILの成長を促進するためにIL-2のみを使用している。IL-15及びIL-21を含むレジメンを使用すると、リンパ球の成長が促進されることが報告されている。この研究では、最近診療所で実施された第2のジェネレーションIL-2 TILプロトコルにIL-15及びIL-21を加えることの前向きな効果について説明する。
材料及び方法
[00971] TILを生成するプロセスには、1~3mm3サイズの腫瘍断片を、IL-
2を含む培地に配置する、プレ急速拡大培養プロトコル(プレREP)が含まれる。プレREP中、TILは腫瘍断片から移り、IL-2刺激に応じて拡大培養する。
[00971] TILを生成するプロセスには、1~3mm3サイズの腫瘍断片を、IL-
2を含む培地に配置する、プレ急速拡大培養プロトコル(プレREP)が含まれる。プレREP中、TILは腫瘍断片から移り、IL-2刺激に応じて拡大培養する。
[00972] TILの成長を更に促進するために、TILは、照射PBMCフィーダー、
IL-2及び抗CD3を含む急速拡大培養プロトコル(REP)と呼ばれる二次培養期間を通して拡大培養される。この研究では、最終的なTIL産物の表現型と機能の属性を維持しながらTILを拡大培養するために、短縮プレREP及びREP拡大培養プロトコルが開発された。
IL-2及び抗CD3を含む急速拡大培養プロトコル(REP)と呼ばれる二次培養期間を通して拡大培養される。この研究では、最終的なTIL産物の表現型と機能の属性を維持しながらTILを拡大培養するために、短縮プレREP及びREP拡大培養プロトコルが開発された。
[00973] この短縮TIL産生プロトコルを使用し、IL-2単独とIL-2/IL-
15/IL-21の組み合わせの影響を評価した。これらの2つの培養レジメンは、結腸直腸癌、黒色腫、子宮頸癌、トリプルネガティブ乳癌、肺癌及び腎癌から成長したTILの産生について比較された。プレREPの完了時に、培養TILの拡大率、表現型、機能(CD107a+及びIFNγ)及びTCR Vβレパートリーを評価した。
15/IL-21の組み合わせの影響を評価した。これらの2つの培養レジメンは、結腸直腸癌、黒色腫、子宮頸癌、トリプルネガティブ乳癌、肺癌及び腎癌から成長したTILの産生について比較された。プレREPの完了時に、培養TILの拡大率、表現型、機能(CD107a+及びIFNγ)及びTCR Vβレパートリーを評価した。
[00974] プレREP培養は、標準IL-2(600IU/mL)プロトコルを使用し
て、又はIL-2に加えてIL-15(180IU/mL)及びIL-21(IU/mL)で開始した。プレREPの完了時に細胞の拡大を評価した。全体の成長が少なくとも20%向上した場合、培養はIL-2に比べて拡大が増加していると分類された。黒色腫及び肺癌の表現型及び機能についての研究をここに示す。以下の表32を参照されたい。
て、又はIL-2に加えてIL-15(180IU/mL)及びIL-21(IU/mL)で開始した。プレREPの完了時に細胞の拡大を評価した。全体の成長が少なくとも20%向上した場合、培養はIL-2に比べて拡大が増加していると分類された。黒色腫及び肺癌の表現型及び機能についての研究をここに示す。以下の表32を参照されたい。
[00975] これらのデータは、肺癌の表現型及び機能の違いに加え、IL-2単独と比
較してTILをIL-2/IL-15/IL-21と共に培養した場合のTIL産物収量
の増加を実証する。
較してTILをIL-2/IL-15/IL-21と共に培養した場合のTIL産物収量
の増加を実証する。
[00976] TILの拡大に対するトリプルカクテルの効果は適応症に特異的であり、ほ
とんどの低収量腫瘍に利益をもたらした。
とんどの低収量腫瘍に利益をもたらした。
[00977] CD8+/CD4+T細胞比は、NSCLC TIL産物での処理により増
加した。
加した。
[00978] T細胞活性は、黒色腫及びNSCLCの両方でのCD107a発現レベルに
よって評価されるように、IL-15及びIL-21をIL-2に加えることにより増強されるようであった。
よって評価されるように、IL-15及びIL-21をIL-2に加えることにより増強されるようであった。
[00979] ここで、提供されるデータは、本出願において本明細書及び他の実施例で説
明している2Aプロセスなど、より短く、より堅牢なプロセスを使用したTIL拡大培養を、IL-2/IL-15/IL-21サイトカインカクテルの包含に適応できることを示しており、これにより、特に特定の適応症においてTIL拡大培養を更に促進する手段を提供する。
明している2Aプロセスなど、より短く、より堅牢なプロセスを使用したTIL拡大培養を、IL-2/IL-15/IL-21サイトカインカクテルの包含に適応できることを示しており、これにより、特に特定の適応症においてTIL拡大培養を更に促進する手段を提供する。
[00980] 進行中の実験は、TIL機能に対するIL-2/IL-15/IL-21の
効果を更に評価している。
効果を更に評価している。
[00981] 追加の実験では、REP(第1の拡大培養)中のトリプルカクテルの効果を
判定する。
判定する。
[00982] これらの観察結果は、主流の抗癌療法に必要な幅広い適用性及び可用性を備
えたTILの大規模な製造に必要なTIL培養レジメンの最適化及び標準化に特に関連する。
えたTILの大規模な製造に必要なTIL培養レジメンの最適化及び標準化に特に関連する。
実施例15:同種異系フィーダー細胞の範囲を評価する:TIL比率100:1から25:1まで
[00983] この研究では、プロセス1Cで現在利用されているTILに対する100:
1の同種異系フィーダー細胞のコントロールに対して、25:1及び50:1でTILの成長を試験した。
[00983] この研究では、プロセス1Cで現在利用されているTILに対する100:
1の同種異系フィーダー細胞のコントロールに対して、25:1及び50:1でTILの成長を試験した。
[00984] 国立癌研究所の外科部門が発表した研究では、REP(1)の開始時に1c
m2あたり5×106個の同種異系フィーダー細胞でG-Rex 100フラスコのTILの最適
な活性化の閾値が示された。これは数学的モデリングを通じて検証されており、同モデルで、単位面積あたりの細胞:細胞接触に最適化されたフィーダー層を使用すると、TILの活性化及び拡大への影響は最小限で、TILに対する同種異系フィーダー細胞の割合は25:1に減少し得ることが予測された。
m2あたり5×106個の同種異系フィーダー細胞でG-Rex 100フラスコのTILの最適
な活性化の閾値が示された。これは数学的モデリングを通じて検証されており、同モデルで、単位面積あたりの細胞:細胞接触に最適化されたフィーダー層を使用すると、TILの活性化及び拡大への影響は最小限で、TILに対する同種異系フィーダー細胞の割合は25:1に減少し得ることが予測された。
[00985] この研究では、REP開始時に単位面積あたりのフィーダー細胞の最適密度
を確立し、1臨床ロットあたりの使用フィーダー細胞の量を減らして正規化するために必要なREP開始時の同種異系フィーダー比の有効範囲を検証した。本研究では、固定数のフィーダー細胞で200×106個未満の共培養されたTILを伴うREPの開始も実証された。
A.T細胞の容積(直径10μm):V=(4/3)πr3=523.6μm3
B.高さ40μm(4細胞)のG-Rex 100(M)の円柱フラスコ:V=(4/3)πr3
=4×1012μm3
C.円柱フラスコBを満たすために必要な細胞数:4×1012μm3/523.6μm
3=7.6×108μm3*0.64=4.86×108
D.4D空間で最適に活性化できる細胞数:4.86×108/24=20.25×106
E.G-Rex 500に外挿されたフィーダー及びTILの数:TIL:100×106及びフ
ィーダー:2.5×109
を確立し、1臨床ロットあたりの使用フィーダー細胞の量を減らして正規化するために必要なREP開始時の同種異系フィーダー比の有効範囲を検証した。本研究では、固定数のフィーダー細胞で200×106個未満の共培養されたTILを伴うREPの開始も実証された。
A.T細胞の容積(直径10μm):V=(4/3)πr3=523.6μm3
B.高さ40μm(4細胞)のG-Rex 100(M)の円柱フラスコ:V=(4/3)πr3
=4×1012μm3
C.円柱フラスコBを満たすために必要な細胞数:4×1012μm3/523.6μm
3=7.6×108μm3*0.64=4.86×108
D.4D空間で最適に活性化できる細胞数:4.86×108/24=20.25×106
E.G-Rex 500に外挿されたフィーダー及びTILの数:TIL:100×106及びフ
ィーダー:2.5×109
[00991] 式1.100cm2ベースのシリンダー内でTILを活性化するための正二
十面体ジオメトリを提供するために必要な単核細胞の数の概算。この計算は、NCIの実験データを厳密に反映したT細胞の閾値活性化の約5×108の実験結果を導き出す。(1)(C)乗数(0.64)は、1992年にJaeger及びNagelによって計算された等価
球のランダムデータ密度である(2)。(D)除数24は、4次元空間の「ニュートン数」(3)で同様のオブジェクトに接触する可能性のある等価球の数である。
十面体ジオメトリを提供するために必要な単核細胞の数の概算。この計算は、NCIの実験データを厳密に反映したT細胞の閾値活性化の約5×108の実験結果を導き出す。(1)(C)乗数(0.64)は、1992年にJaeger及びNagelによって計算された等価
球のランダムデータ密度である(2)。(D)除数24は、4次元空間の「ニュートン数」(3)で同様のオブジェクトに接触する可能性のある等価球の数である。
参照資料
(1) Jin, Jianjian, et.al., Simplified Method of the Growth of Human Tumor Infiltrating Lymphocytes (TIL) in Gas-Permeable Flasks to Numbers Needed for Patient Treatment. J Immunother. 2012 Apr; 35(3):283-292。
(2) Jaeger HM, Nagel SR. Physics of the granular state. Science. 1992 Mar 20; 255(5051):1523-31。
(3) O. R. Musin (2003). “The problem of the twenty-five spheres”. Russ. Math. Surv. 58 (4):794-795。
(1) Jin, Jianjian, et.al., Simplified Method of the Growth of Human Tumor Infiltrating Lymphocytes (TIL) in Gas-Permeable Flasks to Numbers Needed for Patient Treatment. J Immunother. 2012 Apr; 35(3):283-292。
(2) Jaeger HM, Nagel SR. Physics of the granular state. Science. 1992 Mar 20; 255(5051):1523-31。
(3) O. R. Musin (2003). “The problem of the twenty-five spheres”. Russ. Math. Surv. 58 (4):794-795。
実施例16:閉鎖系を使用した凍結保存TIL細胞療法の産生
[00995] この実施例では、Iovance Biotherapeutics,IncのcGMP製造について説明する。現行のヒト細胞・組織医薬品の製造・品質管理基準並びに現行の医薬品及び医薬部外品の製造管理及び品質管理に関する基準に従ったG-RexフラスコでのTIL細胞療法プ
ロセス。この資料は、米国FDA医薬品及び医薬部外品の製造管理及び品質管理に関する基準(21 CFR Part 210、211、1270及び1271)並びにフェーズIから商用資料まで適用されるICH Q7基準に基づいて製造される。
[00995] この実施例では、Iovance Biotherapeutics,IncのcGMP製造について説明する。現行のヒト細胞・組織医薬品の製造・品質管理基準並びに現行の医薬品及び医薬部外品の製造管理及び品質管理に関する基準に従ったG-RexフラスコでのTIL細胞療法プ
ロセス。この資料は、米国FDA医薬品及び医薬部外品の製造管理及び品質管理に関する基準(21 CFR Part 210、211、1270及び1271)並びにフェーズIから商用資料まで適用されるICH Q7基準に基づいて製造される。
[00996] プロセスの概要を以下の表33に示す。
[00997] 指定がない限り、この実施例全般的に1.0mL/L=1.0g/kgを前
提としている。開封後、2℃~8℃で次の期限が適用される。ヒト血清、タイプAB(HI)ジェミニ、1ヶ月;2-メルカプトエタノール、1か月。硫酸ゲンタマイシン、50mg/ml原料は、室温で1か月間保管し得る。10LのAIM-V培地を含む袋は、使用前
に最大24時間、1度のみ室温で温め得る。22日目の回収中、G-Rex500MCSフラスコか
らTILを回収するために2つのGatherex(商標)を使用し得る。
提としている。開封後、2℃~8℃で次の期限が適用される。ヒト血清、タイプAB(HI)ジェミニ、1ヶ月;2-メルカプトエタノール、1か月。硫酸ゲンタマイシン、50mg/ml原料は、室温で1か月間保管し得る。10LのAIM-V培地を含む袋は、使用前
に最大24時間、1度のみ室温で温め得る。22日目の回収中、G-Rex500MCSフラスコか
らTILを回収するために2つのGatherex(商標)を使用し得る。
0日目CM1培地の調整
[00998] RPMI1640培地を調整した。BSCにおいて、適切なサイズのピペッ
トを使用して、1000mL RPMI1640培地から100.0mLを取り出し、「廃棄物」とラベル付けされた適切なサイズの容器に入れた。
[00998] RPMI1640培地を調整した。BSCにおいて、適切なサイズのピペッ
トを使用して、1000mL RPMI1640培地から100.0mLを取り出し、「廃棄物」とラベル付けされた適切なサイズの容器に入れた。
[00999] BSCにおいて、RPMI1640培地ボトルに試薬を追加した。表に示す
ように、RPMI1640培地ボトルに次の試薬を追加した。追加された容積が記録された。ボトル毎の追加量:熱不活性化ヒトAB血清(100.0mL);GlutaMax(10.0mL);硫酸ゲンタマイシン、50mg/mL(1.0mL);2-メルカプトエタノール(1.0mL)
ように、RPMI1640培地ボトルに次の試薬を追加した。追加された容積が記録された。ボトル毎の追加量:熱不活性化ヒトAB血清(100.0mL);GlutaMax(10.0mL);硫酸ゲンタマイシン、50mg/mL(1.0mL);2-メルカプトエタノール(1.0mL)
[001000] 試薬が完全に混合されるように、RPMI1640培地ボトルにキャップを付け、ボトルを回転させた。ステップ8.1.6から1L 0.22-ミクロンフィルターユニットを通してRPMI1640培地をろ過した。ろ過された培地とラベル付けした。ろ過された培地に無菌的に蓋をし、以下の情報をラベル付けした。
[001001] 全ての氷が溶けるまで、1つの1.1mL IL-2アリコート(6×106IU/mL)(BR71424)を解凍した。IL-2を記録した。ロット番号と有効期限。IL-2原料溶液を培地に移した。BSCにおいて、1.0mLのIL-2原料溶液を、ステップ8.1.8で調整したCM1 0日目培地ボトルに移した。CM1 0日目培地1ボトル及びIL-2(6×106IU/mL)1.0mLを追加した。IL-2を含む培地を混合するために、ボトルに蓋をして回転させた。「完了CM1 0日目培地」というラベルが付けられた。
[001002] 適切なサイズのピペットを使用して20.0mLの培地を取り出し、50mLのコニカルチューブに分注した。BSCにおいて、「完了CM1 0日目培地」と表示された25.0mL(ステップ8.1.13で調整済)を50mLのコニカルチューブに移した。チューブに「組織片」とラベル付けした。G-Rex100MCS(W3013130)を
無菌的にBSCに入れた。BSCにおいて、ベントフィルタークランプを開いたままにし、G-Rex100MCSの全てのクランプを閉じた。ルアー接続を介して、G-Rex100MCSフラスコの赤い線をリピーターポンプ流体移送セット(W3009497)の長径端に接続した。BSCに隣接しているBaxaポンプを実行した。BSCからリピーターポンプ流体移送セットのポンプチューブセクションを取り外し、リピーターポンプに取り付けた。BSC内で、ポンプ式溶液分注システム(PLDS)(W3012720)からシリンジを取り外し、廃棄した。
無菌的にBSCに入れた。BSCにおいて、ベントフィルタークランプを開いたままにし、G-Rex100MCSの全てのクランプを閉じた。ルアー接続を介して、G-Rex100MCSフラスコの赤い線をリピーターポンプ流体移送セット(W3009497)の長径端に接続した。BSCに隣接しているBaxaポンプを実行した。BSCからリピーターポンプ流体移送セットのポンプチューブセクションを取り外し、リピーターポンプに取り付けた。BSC内で、ポンプ式溶液分注システム(PLDS)(W3012720)からシリンジを取り外し、廃棄した。
[001003] PLDSピペットを、ルアー接続を介してリピーターポンプ流体移送セットの小径端に接続し、吸引のために「完了CM1 0日目培地」にピペットチップを取り付けた。培地とG-Rex100MCSとの間の全てのクランプを開けた。完了CM1培地をG-Rex100MCSフラスコに送り込んだ。ポンプ速度を「高」及び「9」に設定し、全ての完了CM1 0日目培地をG-Rex100MCSフラスコに送り込んだ。全ての培地が送り込まれた時点で、ラ
インをクリアにし、ポンプを停止した。
インをクリアにし、ポンプを停止した。
[001004] フラスコからポンプを取り外した。ベントフィルターを除き、フラスコの全
てのクランプが閉じていることを確認した。赤い培地ラインからリピーターポンプ流体移送セットを取り外し、赤い培地ラインに赤いキャップ(W3012845)を取り付けた。BSCからG-Rex100MCSフラスコを取り除きターミナルルアー近くの赤いラインから赤
いキャップをヒートシールした。QAが用意したG-Rex100MCSフラスコにin-process「0
日目」ラベルを付けた。下記に「0日目」ラベルのサンプルを添付した。インキュベーターパラメーター:37.0±2.0℃;CO2パーセンテージ:5.0±1.5%CO2。
てのクランプが閉じていることを確認した。赤い培地ラインからリピーターポンプ流体移送セットを取り外し、赤い培地ラインに赤いキャップ(W3012845)を取り付けた。BSCからG-Rex100MCSフラスコを取り除きターミナルルアー近くの赤いラインから赤
いキャップをヒートシールした。QAが用意したG-Rex100MCSフラスコにin-process「0
日目」ラベルを付けた。下記に「0日目」ラベルのサンプルを添付した。インキュベーターパラメーター:37.0±2.0℃;CO2パーセンテージ:5.0±1.5%CO2。
[001005] 30分以上の加温のために、インキュベーターに50mLコニカルチューブを設置した。
0日目腫瘍洗浄培地の調整
[001006] ゲンタマイシンをHBSSに追加した。BSCにおいて、5.0mLのゲンタマイシン(W3009832又はW3012735)を1×500mL HBSS培地(W3013128)ボトルに追加した。容積を記録した。ボトル毎の追加量:HBSS(500.0mL);硫酸ゲンタマイシン、50mg/ml(5.0mL)。試薬を完全に混合した。ステップ8.2.1で調整したゲンタマイシンを含むHBSSを1L 0.22ミクロンフィルターユニット(W1218810)でろ過した。ろ過された培地に無菌的に蓋をし、以下の情報をラベル付けした。
[001006] ゲンタマイシンをHBSSに追加した。BSCにおいて、5.0mLのゲンタマイシン(W3009832又はW3012735)を1×500mL HBSS培地(W3013128)ボトルに追加した。容積を記録した。ボトル毎の追加量:HBSS(500.0mL);硫酸ゲンタマイシン、50mg/ml(5.0mL)。試薬を完全に混合した。ステップ8.2.1で調整したゲンタマイシンを含むHBSSを1L 0.22ミクロンフィルターユニット(W1218810)でろ過した。ろ過された培地に無菌的に蓋をし、以下の情報をラベル付けした。
0日目の腫瘍処置
[001007] 腫瘍標本を入手し、腫瘍情報を処理及び記録するために直ちに2℃~8℃の部屋に移した。3本の50mlコニカルチューブにラベルを付けた。1つ目は「鉗子」、2つ目は「メス」、3つ目は「新鮮な腫瘍洗浄培地」。5×100mmのペトリ皿に「洗浄1」、「洗浄2」、「洗浄3」、「保持」及び「良好でない」というラベルを付けた。1つの6ウェルプレートに「好ましい中間断片」というラベルを付けた。
[001007] 腫瘍標本を入手し、腫瘍情報を処理及び記録するために直ちに2℃~8℃の部屋に移した。3本の50mlコニカルチューブにラベルを付けた。1つ目は「鉗子」、2つ目は「メス」、3つ目は「新鮮な腫瘍洗浄培地」。5×100mmのペトリ皿に「洗浄1」、「洗浄2」、「洗浄3」、「保持」及び「良好でない」というラベルを付けた。1つの6ウェルプレートに「好ましい中間断片」というラベルを付けた。
[001008] 適切なサイズのピペットを使用して、5.0mLの「腫瘍洗浄培地」を1つの6ウェルプレートの各ウェルの良好な中間腫瘍断片を(合計30.0mL)に移した。適切なサイズのピペットを使用して、ステップ8.2.4で調整した50.0mLの「腫瘍洗浄培地」を「洗浄1」、「洗浄2」、「洗浄3」、「保持」の各100mmペトリ皿に移した(合計200.0mL)。適切なサイズのピペットを使用して、ステップ8.2.4で準備した20.0mLの「腫瘍洗浄培地」を各50mLコニカル(合計60.0mL)に移した。2つの6ウェルプレートから蓋を無菌的に取り外した。蓋は、選択された腫瘍断片に利用された。無菌的に腫瘍はBSCに移された。処理開始時間が記録された。
[001009] 腫瘍洗浄1:鉗子を使用し、標本ボトルから腫瘍を取り出し、「洗浄1」に移した。鉗子を使用して、腫瘍を優しくそっと洗浄し、時間を記録した。サンプル計画毎に腫瘍検体ボトルから20.0mL(又は利用可能な容積)の溶液を50mLのコニカルに移した。テストのために提出するまで収集したバイオバーデンサンプルを2~8℃でラベル付けし保存した。
[001010] 腫瘍洗浄2:新しい鉗子セットを使用し、「洗浄1」皿から腫瘍を取り出し、洗浄2皿に移した。鉗子を使用し、3分以上静かに攪拌して腫瘍標本を洗浄し、その後、静置した。時間を記録した。
[001011] 移送ピペットを使用して、コニカルから腫瘍洗浄培地を4滴ずつ、6ウェルプレートの裏返した蓋のそれぞれの6つの円に入れた(2つの蓋)。2つの円に追加で滴下し、合計で50滴入れた。
[001012] 腫瘍洗浄3:鉗子を使用し、「洗浄2」皿から腫瘍を取り出し、「洗浄3」皿に移した。鉗子を使用し、静かに攪拌して腫瘍標本を洗浄し、その後、3分以上静置した。時間を記録した。
[001013] 150mm皿の蓋の下に定規を置いた。鉗子を使用し、無菌的に腫瘍標本を150mm解剖皿の蓋に移した。腫瘍標本の全ての断片を端から端まで配置し、おおよその全長と断片の数を記録した。壊死/脂肪組織の腫瘍を評価した。腫瘍領域全体の30%以上が壊死組織及び/又は脂肪組織であると観察されたかどうかを評価した。はいの場合、腫瘍全体が適切な大きさであることを確認し、その場合、続行した。腫瘍領域全体の30%未満が壊死組織又は脂肪組織であることが観察されたかどうかを評価した。はいの場合、続行した。
[001014] 切離の処理。腫瘍が大きく、組織外部の30%超が壊死/脂肪質が観察された場合、メス及び/又は鉗子の組み合わせを用いて、腫瘍の内部構造を維持しつつ、壊死/脂肪組織を取り除くことにより「切離の処理」が行われた。腫瘍の内部構造を維持するために、垂直切断圧のみを使用した。メスによる鋸引き運動での切断はしなかった。
[001015] メス及び/又は鉗子の組み合わせを使用して、腫瘍標本を均一で適切なサイズの断片(最大6個の中間断片)に切断する。腫瘍の内部構造を維持するために、垂直切断圧のみを使用する。メスによる鋸引き運動での切断はしなかった。解剖されていない中間断片を「腫瘍洗浄培地」に完全に浸したままにすること。各中間断片を「保持」皿に移した。
[001016] 一度に1つの中間断片を操作し、解剖皿の腫瘍中間断片を約3×3×3mmのサイズの断片に切離し、各断片の出血、壊死及び/又は脂肪組織の量を最小限にした。腫瘍の内部構造を維持するために、垂直切断圧のみを使用した。メスによる鋸引き運動での切断はしなかった。
[001017] 出血、壊死及び/又は脂肪組織のない最大8個の腫瘍断片を選択した。参考として、定規を使用した。8個の良好な断片を得られるまで又は中間断片全体が切離されるまで解剖を続けた。選択した各断片を「腫瘍洗浄培地」の1滴に移した。
[001018] 中間断片から最大8個を選択した後、中間断片のレムナントを「好ましい中間断片」の6ウェルプレートの新しいシングルウェルに入れた。
[001019] 望ましい組織が残っている場合、最大50断片を滴下で充填するために、「好ましい中間断片」の6ウェルプレートから追加の好ましい腫瘍断片を選択した。作成された切離断片の総数を記録した。
[001020] インキュベーターから「組織片」50mLコニカルチューブを取り出した。コニカルチューブを30分以上温めること。「組織片」50mLコニカルをBSCに入れ、オープン処理表面の無菌性を損なわないようにする。
[001021] 移送ピペット、メス、鉗子又は組み合わせを使用して、良好な皿のふたから選択された50個の最良の腫瘍断片を「組織片」50mLコニカルチューブに移した。移動中に腫瘍断片を落とし、望ましい組織が残っている場合、好ましい腫瘍中間断片ウェルから追加の断片が加えられた。断片数を記録した。
[001022] インキュベーターから培地を含むG-Rex100MCSを取り出した。G-Rex100MCSを無菌的にBSCに入れた。フラスコを移す時、蓋又は容器の底から手に持たない。両サイ
ドから手に持ち容器を移動した。BSCでは、G-Rex100MCSフラスコキャップを持ち上げ
て、チューブ内部の無菌性が維持されるようにした。懸濁するために腫瘍断片の入ったコニカルチューブを攪拌し、内容物を素早くG-Rex100MCSフラスコに注いだ。腫瘍断片がフ
ラスコの膜全体に均一に分布するように確認した。必要に応じてフラスコを前後に静かに傾けて、腫瘍断片を均等に分散させた。容器の底膜の腫瘍断片の数及び容器内で確認できる浮遊物の数を記録した。注記:播種された断片の数が収集された数と同等でない場合、エリア管理に連絡し、セクション10.0の文書を作成すること。
ドから手に持ち容器を移動した。BSCでは、G-Rex100MCSフラスコキャップを持ち上げ
て、チューブ内部の無菌性が維持されるようにした。懸濁するために腫瘍断片の入ったコニカルチューブを攪拌し、内容物を素早くG-Rex100MCSフラスコに注いだ。腫瘍断片がフ
ラスコの膜全体に均一に分布するように確認した。必要に応じてフラスコを前後に静かに傾けて、腫瘍断片を均等に分散させた。容器の底膜の腫瘍断片の数及び容器内で確認できる浮遊物の数を記録した。注記:播種された断片の数が収集された数と同等でない場合、エリア管理に連絡し、セクション10.0の文書を作成すること。
[001023] 以下のパラメータでG-Rex100MCSをインキュベートした:G-Rexフラスコをインキュベートした。温度LEDディスプレイ:37.0±2.0℃;CO2パーセンテージ:5.0±1.5% CO2。インキュベーション11日目にG-Rex100MCSを取り出す
適切な時間を決定するための計算を実行した。計算:インキュベーション時間;下限=インキュベーション時間+252時間;上限=インキュベーション時間+276時間。
適切な時間を決定するための計算を実行した。計算:インキュベーション時間;下限=インキュベーション時間+252時間;上限=インキュベーション時間+276時間。
11日目 - 培地の調製
[001024] インキュベーターをモニターした。インキュベーターのパラメータ:温度LEDディスプレイ:37.0±2.0℃;CO2パーセンテージ:5.0±1.5% CO2。1000mL RPMI1640培地(W3013112)ボトル3本及び1000mLAIM-V(W3009501)ボトル3本を、インキュベーターで30分以上温めた
。時間を記録した。培地:RPMI1640及びAIM-V。後で使用するために、AIM-V培地(W3009501)の追加の1×1000mlボトルを室温で配置した。
[001024] インキュベーターをモニターした。インキュベーターのパラメータ:温度LEDディスプレイ:37.0±2.0℃;CO2パーセンテージ:5.0±1.5% CO2。1000mL RPMI1640培地(W3013112)ボトル3本及び1000mLAIM-V(W3009501)ボトル3本を、インキュベーターで30分以上温めた
。時間を記録した。培地:RPMI1640及びAIM-V。後で使用するために、AIM-V培地(W3009501)の追加の1×1000mlボトルを室温で配置した。
[001025] 時間に達した時にRPMI1640培地を取り出した。ステップ8.4.4でインキュベーション終了時間を記録した。培地が30分以上温められていることを確認する。BSCで、3本の予め温めておいた1000mL RPMI1640培地ボトルのそれぞれから100.0mLを取り出し、「廃棄物」というラベルが付いた適切なサイズの容器に入れた。BSCで、3本のRPMI1640培地ボトルそれぞれに以下の試薬を加え、各ボトルに加えた容積を記録した。GemCell Human serum, Heat Inactivated Type
AB(100.0mL)、GlutaMax(10.0mL)、硫酸ゲンタマイシン50mg/m
L(1.0mL)、2-メルカプトエタノール(1.0mL)。
AB(100.0mL)、GlutaMax(10.0mL)、硫酸ゲンタマイシン50mg/m
L(1.0mL)、2-メルカプトエタノール(1.0mL)。
[001026] 試薬が完全に混合されるように、ボトルに蓋をし、回転した。培地の各ボトルを個別の1L 0.22ミクロンフィルターユニットでろ過した。ろ過した培地を無菌的に蓋し、各ボトルにCM1 11日目培地ラベル付けした。全ての氷が溶けるまでIL-2の3×1.1mLアリコート(6×106IU/mL)(BR71424)を解凍し、IL2ロット番号と有効期限を記録した。
[001027] インキュベーターから3本のAIM-V培地を取り出した。インキュベーション
終了時間を記録した。30分以上培地を温めたか確認した。マイクロピペットを使用して、解凍したIL-2 3.0mLを事前に温めたAIM-V培地の1Lボトル1本に加えた。
IL-2を分注した後、マイクロピペットチップを培地ですすぐ。各アリコートに新しい滅菌マイクロピペットチップを使用する。追加された総量を記録した。「IL-2を含むAIM-V」とボトルにラベルを付けた。10LのLabtainerバッグとリピーターポンプ移送セットをBSCに無菌的に移した。10LのLabtainerバッグの全てのラインを閉じた。ル
アーロック接続を介して、リピーターポンプ移送セットの長径のチューブの端を10LのLabtainerバッグの中央メスポートに取り付けた。
終了時間を記録した。30分以上培地を温めたか確認した。マイクロピペットを使用して、解凍したIL-2 3.0mLを事前に温めたAIM-V培地の1Lボトル1本に加えた。
IL-2を分注した後、マイクロピペットチップを培地ですすぐ。各アリコートに新しい滅菌マイクロピペットチップを使用する。追加された総量を記録した。「IL-2を含むAIM-V」とボトルにラベルを付けた。10LのLabtainerバッグとリピーターポンプ移送セットをBSCに無菌的に移した。10LのLabtainerバッグの全てのラインを閉じた。ル
アーロック接続を介して、リピーターポンプ移送セットの長径のチューブの端を10LのLabtainerバッグの中央メスポートに取り付けた。
[001028] BSCに隣接しているBaxaポンプを実行した。移送セットチュービングをBaxaポンプに通した。Baxaポンプを「高」及び「9」に設定する。Pumpmatic Liquid-Dispensing System(PLDS)からシリンジを取り外し、廃棄した。PLDSピペットの無菌
性を損なわないようにすること。
性を損なわないようにすること。
[001029] ルアー接続を介してPLDSピペットをリピーターポンプ流体移送セットの小径端に接続し、吸引のためIL-2ボトル(ステップ8.4.13で調整済)を含むAIM-V培地にピペットの先端を入れた。培地ボトルと10LのLabtainer間の全てのクランプを開いた。
[001030] PLDSを使用して、調整したIL-2を含む予め温めておいたAIM-V培地
を2本の追加のAIM-Vボトルと同様に10LのLabtainerバッグに移す。ろ過されたCM1
11日目培地の3本のボトルを追加した。最終ボトルの追加後、バッグのラインをクリアにした。注記:培地の各ボトルの追加中にポンプを停止した。移送セットからPLDSを取り出し、BSCのラインのルアーに赤いキャップを取り付けた。バッグを優しく揉み混合した。次に記載する情報で培地バックにラベル付けした。有効期限は調整日から24時間であった。
を2本の追加のAIM-Vボトルと同様に10LのLabtainerバッグに移す。ろ過されたCM1
11日目培地の3本のボトルを追加した。最終ボトルの追加後、バッグのラインをクリアにした。注記:培地の各ボトルの追加中にポンプを停止した。移送セットからPLDSを取り出し、BSCのラインのルアーに赤いキャップを取り付けた。バッグを優しく揉み混合した。次に記載する情報で培地バックにラベル付けした。有効期限は調整日から24時間であった。
[001031] 「完全CM2 11日目培地」バッグの利用可能なメスポートに60mLシリンジを取り付けた。20.0mLの培地を取り出し、50mLのコニカルチューブに入れた。「完全CM2 11日目培地」バッグのメスポートに赤いキャップを取り付けた。テストのために提出するまで、培地参考サンプルを2~8℃でラベル付けし保存した。移送セットラインの赤いキャップを、赤いキャップの近くでヒートシールした。移送セットをバッグに接続したままにした。
[001032] BSCで、「細胞数希釈用」とロット番号でラベル付けされた4.5mLのAIM-V培地を4本の15mLコニカルチューブに追加した。ロット番号とチューブ番号(
1~4)をチューブにラベル付けした。4つのクライオバイアル「フィーダー」とバイアル番号(1~4)とラベル付けした。残りの2-メルカプトエタノール、GlutaMax及びヒト血清をBSCから2~8℃に移した。
1~4)をチューブにラベル付けした。4つのクライオバイアル「フィーダー」とバイアル番号(1~4)とラベル付けした。残りの2-メルカプトエタノール、GlutaMax及びヒト血清をBSCから2~8℃に移した。
[001033] BSCの外側で、調整した「完全CM2 11日目培地」バッグに取り付けられた移送セットに1L移送パックを溶接した。「フィーダー細胞CM2」及びロット番号を移送パックにラベル付けした。バッグから数インチ離れた場所に1Lの移送パックチューブのチューブに、マークを付けた。チューブがマークの位置までスケール上にあるように、空の移送パックをスケールの上に置いた。スケールを風袋引きし、スケールに空の移送パックを置いた。
[001034] Baxaポンプを「中」及び「4」に設定する。ステップ8.4.22で調整した「完全CM2 11日目」培地500.0±5.0mLを細胞CM2培地移送パックに注入した。重量で測定し、移送パックに追加された完全CM2培地の容積を記録した。
[001035] 充填したら、ラインをヒートシールした。フィーダーセル培地移送パックから移送セット付きのCM2 11日目の培地バッグを離し、1L移送パックに溶接したままにした。調整した「完全CM2 11日目培地」を使用するまでインキュベーターに入れた。
11日目 - TIL回収
[001036] インキュベーターのパラメータ:温度LEDディスプレイ:37.0±2.0℃;CO2パーセンテージ:5.0±1.5% CO2。G-Rex100MCSをインキュベー
ターから取り外す前に、インキュベーションパラメーターが満たされていることを確認するためのチェックを実行した。下限は上記と同じである。
[001036] インキュベーターのパラメータ:温度LEDディスプレイ:37.0±2.0℃;CO2パーセンテージ:5.0±1.5% CO2。G-Rex100MCSをインキュベー
ターから取り外す前に、インキュベーションパラメーターが満たされていることを確認するためのチェックを実行した。下限は上記と同じである。
[001037] インキュベーターからの取り出し時間を記録した。インキュベーターからG-Rex 100MCSを慎重に取り外し、大きいフィルターラインを除く全てのクランプが閉じられていることを確実にした。処理開始時間が記録された。
[001038] 300mL移送パックに「TIL懸濁液」のラベルを付けた。重力血液フィルターのTIL懸濁液移送(単線)を滅菌溶接した。300mL移送パックをはかりに置き、乾燥重量を記録した。1L移送パックに「上清」とラベル付けした。
[001039] G-Rex100MCSからの赤い培地除去ラインを「上清」移送パックに滅菌溶接し
た。「TIL懸濁液」移送パックに接続された血液フィルターの上部の2つのスパイクラインの1つにG-Rex100MCSからの透明細胞除去ラインを滅菌溶接した。G-Rex100MCSをGatheRexの左側に配置し、「上清」及び「TIL懸濁液」移送パックを右側に配置した。
た。「TIL懸濁液」移送パックに接続された血液フィルターの上部の2つのスパイクラインの1つにG-Rex100MCSからの透明細胞除去ラインを滅菌溶接した。G-Rex100MCSをGatheRexの左側に配置し、「上清」及び「TIL懸濁液」移送パックを右側に配置した。
[001040] G Rex100MCSから赤い培地除去ラインをGatheRexのクランプ上部(赤い線で
マーク)及びチューブガイドに取り付けた。G-Rex100MCSからのクリアハーベストライン
をGatheRexのクランプ底部(青い線でマーク)及びチューブガイドに取り付けた。GatheRexからG-Rex100MCSフラスコの滅菌フィルターにガスラインを取り付けた。G-Rex100MCSフラスコから上清を除去する前に、細胞除去ラインの全てのクランプが閉じていることを確認した。G-Rex100MCSから1L移送パックに約900mLの培地上清を移した。フラスコ
が水平であり、吸引ディップチューブの端まで培地が減少していることを確認するためにG-Rex100MCSフラスコを目視で検査した。
マーク)及びチューブガイドに取り付けた。G-Rex100MCSからのクリアハーベストライン
をGatheRexのクランプ底部(青い線でマーク)及びチューブガイドに取り付けた。GatheRexからG-Rex100MCSフラスコの滅菌フィルターにガスラインを取り付けた。G-Rex100MCSフラスコから上清を除去する前に、細胞除去ラインの全てのクランプが閉じていることを確認した。G-Rex100MCSから1L移送パックに約900mLの培地上清を移した。フラスコ
が水平であり、吸引ディップチューブの端まで培地が減少していることを確認するためにG-Rex100MCSフラスコを目視で検査した。
[001041] 上清を取り除いた後、赤いラインへのクランプを全て閉じた。
[001042] フラスコを激しく叩いて細胞を遊離させるために培地を攪拌した。全ての細胞が離れたことを確認するためにフラスコの検査を実施した。注記:細胞が離れなかった場合、エリア管理に連絡すること。収集チューブから離してフラスコを傾け、腫瘍断片を縁に沿って沈降させた。断片がフラスコの反対側に残るように、収集チューブに向かってゆっくりとフラスコを傾けた。細胞収集ストローが壁面及び底膜の接合部にない場合、ストローを適切に配置するには、通常、450の角度でフラスコを傾けたまま軽く叩くのみで十分である。
[001043] TILサスペンション移送パックにつながる全てのクランプを解放した。GatheRexを使用して、血液フィルターから細胞懸濁液を300mL移送パックに移した。全ての細胞と培地が収集されるまで、エッジを傾斜し続けた。付着した細胞について膜を検査した。G-Rex100MCSの底をすすいだ。ガス交換膜の約1/4をすすぎ培地で覆う。全て
のクランプが閉じていることを確認した。チューブ全体の長さがほぼ同じになるように、できる限り溶接部の近くでTILサスペンション移送パックをヒートシールした(プロセスノート5.12に従う)。「上清」トランスファパックをヒートシールした。溶接のための十分なラインを維持した。TIL懸濁液移送パックの重量を記録し、細胞懸濁液の容積を計算した。
のクランプが閉じていることを確認した。チューブ全体の長さがほぼ同じになるように、できる限り溶接部の近くでTILサスペンション移送パックをヒートシールした(プロセスノート5.12に従う)。「上清」トランスファパックをヒートシールした。溶接のための十分なラインを維持した。TIL懸濁液移送パックの重量を記録し、細胞懸濁液の容積を計算した。
[001044] 4インチプラズマ移送セットを「上清」移送パックに溶接し、4インチプラズマ移送セットのルアー接続を保持し、BSCに移した。4インチプラズマ移送セットを300mL「TIL懸濁」移送パックに溶接し、4インチプラズマ移送セットのルアー接続を保持し、BSCに移した。
[001045] 1Lの「上清」移送パックから約20.0mLの上清を吸い上げ、「Bac-T
」とラベル付けした滅菌50mLコニカルチューブに分注した。適切なサイズのシリンジを使用して、BacTとラベル付けされた50mLのコニカルから1.0mLのサンプルを取
り出し、嫌気性ボトルに播種した。
」とラベル付けした滅菌50mLコニカルチューブに分注した。適切なサイズのシリンジを使用して、BacTとラベル付けされた50mLのコニカルから1.0mLのサンプルを取
り出し、嫌気性ボトルに播種した。
[001046] バイアル番号(1~4)と4つのクライオバイアルにラベル付けした。別の3mLシリンジを使用して、ルアー接続を使用してTIL懸濁液移送パックから4×1.0mLの細胞カウントサンプルを引き出し、それぞれのクライオバイアルに入れた。ラインに赤いキャップ(W3012845)を取り付けた。必要になるまで、TIL移送パックをインキュベーターに入れた。細胞計数及び計算を実行した。希釈していない初期細胞計数を実行した。希釈が不要な場合、「サンプル[μL]」=200、「希釈[μL]」=0。
[001047] 細胞計数とTIL数を記録した。総生存TIL細胞が5×106未満である場合、「11日目のG-Rexの充填及び播種」に進めた。総生存TIL細胞が5×106を
超える場合、「フローサイトメトリーで計算」に進む。
超える場合、「フローサイトメトリーで計算」に進む。
フローサイトメトリーで計算。
[001048] 総生存TILセル数が4.0×107以上の場合、フローサイトメトリーのサンプルのために1.0×107個の細胞を得るために容積を計算した。フローサイトメトリーに必要な総生存細胞:1.0×107細胞。フローサイトメトリーに必要な細胞の容積:生存細胞濃度を1.0×107細胞で割った値。
[001048] 総生存TILセル数が4.0×107以上の場合、フローサイトメトリーのサンプルのために1.0×107個の細胞を得るために容積を計算した。フローサイトメトリーに必要な総生存細胞:1.0×107細胞。フローサイトメトリーに必要な細胞の容積:生存細胞濃度を1.0×107細胞で割った値。
[001049] 該当する場合:総生細胞及び容積のフローを再計算した。以下のサイトメトリーのサンプルを除去した後の残りの総生存細胞と残りの容積を計算した。
サンプルのTIL凍結保存
[001050] 該当する場合:凍結保存のための容積を計算した。凍結保存のために1×107個の細胞を得るために必要な細胞の体積を計算した。
[001050] 該当する場合:凍結保存のための容積を計算した。凍結保存のために1×107個の細胞を得るために必要な細胞の体積を計算した。
[001051] 該当する場合:凍結保存のためのサンプルを取り除いた。TIL懸濁液移送パックから計算された容積を取り出した。適切なサイズのコニカルチューブに入れ、「凍結保存サンプル1×107細胞」、日付及びロット番号をラベル付けした。TIL懸濁液移送パックに赤いキャップ(W3012845)を取り付けた。
[001052] 次のパラメータに従って「凍結保存サンプル1×107細胞」を遠心分離した。速度:350×g、時間:10:00分、温度:外気温度、ブレーキ:フル(9);加速:フル(9)。
[001053] CS-10を追加した。BSCにおいて、無菌的に上清を吸引した。チューブの底を軽く叩き、残った液体に細胞を再懸濁した。CS-10を追加した。0.5mL
のCS10をゆっくりと添加した。容積を記録した。凍結保存サンプルバイアルは、約0.5mLで満たされた。
のCS10をゆっくりと添加した。容積を記録した。凍結保存サンプルバイアルは、約0.5mLで満たされた。
11日目 - フィーダー細胞
[001054] LN2フリーザーから少なくとも2つの異なるロット番号を持つフィーダー細胞のバッグを3つ入手した。解凍の準備ができるまで、ドライアイス上に細胞を置いた。フィーダー細胞情報を記録した。少なくとも2つの異なるロット番号のフィーダー細胞が得られたことを確認した。フィーダー細胞バッグをロット番号に基づいて個々のジップトップバッグに入れ、37.0±2.0℃の水浴若しくはサイトサーモを約3~5分又は氷が消えるまで解凍した。
[001054] LN2フリーザーから少なくとも2つの異なるロット番号を持つフィーダー細胞のバッグを3つ入手した。解凍の準備ができるまで、ドライアイス上に細胞を置いた。フィーダー細胞情報を記録した。少なくとも2つの異なるロット番号のフィーダー細胞が得られたことを確認した。フィーダー細胞バッグをロット番号に基づいて個々のジップトップバッグに入れ、37.0±2.0℃の水浴若しくはサイトサーモを約3~5分又は氷が消えるまで解凍した。
[001055] フィーダー細胞ハーネスの準備。4S-4M60をCC2セルコネクト(W3012820)に溶接し、セルコネクト装置の単一スパイクを4S-4M60マニホールドの4スパイク
端に置き換えた。必要に応じて溶接した。
端に置き換えた。必要に応じて溶接した。
[001056] 「フィーダー細胞CM2 11培地」移送パックに溶接された培地移送パックをCC2ルアーに接続した。バッグは、ニードレスインジェクションポートでハーネスの
側面に取り付けられる。完全CM2 11日目培地を含む部品をBSCに移した。
側面に取り付けられる。完全CM2 11日目培地を含む部品をBSCに移した。
[001057] 解凍したフィーダー細胞を貯める。BSC内で、100mLシリンジに10mLの空気を引き込んだ。これを使用して、CC2の60mLシリンジを交換した。カバー
を取り外す前に、アルコールパッドでフィーダー細胞バックのポートを拭いた。CC2の3
つのスパイクを使用して、3つのフィーダーバッグをスパイクする。スパイクを一方向に回しながら一定の圧力を維持した。ポートの側面に穴を開けないようにすること。フィーダー細胞バッグからのラインが開き、ニードレスインジェクションポートへのラインが閉じるように、活栓を開いた。フィーダー細胞バッグの内容物をシリンジに入れた。3つのバッグは全て一度に排水された。シリンジの圧力を維持しながら、フィーダー細胞バッグから排水した時点で、フィーダー細胞バッグのラインを遮断した。下のシリンジからハーネスを取り外さなかった。シリンジ内のフィーダー細胞の総量を記録した。
を取り外す前に、アルコールパッドでフィーダー細胞バックのポートを拭いた。CC2の3
つのスパイクを使用して、3つのフィーダーバッグをスパイクする。スパイクを一方向に回しながら一定の圧力を維持した。ポートの側面に穴を開けないようにすること。フィーダー細胞バッグからのラインが開き、ニードレスインジェクションポートへのラインが閉じるように、活栓を開いた。フィーダー細胞バッグの内容物をシリンジに入れた。3つのバッグは全て一度に排水された。シリンジの圧力を維持しながら、フィーダー細胞バッグから排水した時点で、フィーダー細胞バッグのラインを遮断した。下のシリンジからハーネスを取り外さなかった。シリンジ内のフィーダー細胞の総量を記録した。
[001058] 移送パックにフィーダー細胞が追加された。活栓を回し、フィーダー細胞バッグのラインを閉じ、培地移送パックのラインを開けた。培地移送パックへのラインがクランプ解除されていることを確認した。フィーダー細胞をシリンジから「フィーダー細胞CM2培地」移送パックに分注した。フィーダー細胞を含む移送パックのラインのクランプを開放し、シリンジはハーネスに取り付けたままにした。移送パックの貯められたフィーダー細胞を混合するためにバッグを揉んだ。「フィーダー細胞懸濁液」とバッグにラベル付けした。
[001059] フィーダー細胞懸濁液の総量を計算した。細胞計数サンプルを取り除いた。各サンプルに個別の3mLシリンジを使用し、ニードレスインジェクションポートを使用してフィーダー細胞懸濁液移送パックから4×1.0mLの細胞数サンプルを引き出した。各サンプルをラベル付きクライオバイアルに分注した。
[001060] NC-200及びプロセスノート5.14を使用して、細胞数及び計算を実行した。0.5mLの細胞懸濁液を、ロット番号及び「細胞数希釈用」でラベル付けされた4.5mLのAIM-V培地に加えることにより、細胞数サンプルを希釈した。これにより1:1
0希釈となる。
0希釈となる。
[001061] 細胞数及びサンプル量を記録した。総生細胞が5×109未満である場合に続行する。総生細胞が5×109以上の場合、細胞数を増やすために上記のように進めた
。必要に応じて追加のフィーダーセルを得て、先に述べたように移送パックに追加した。生存可能な5×109のフィーダー細胞を得るために必要なフィーダー細胞懸濁液の容積を計算した。除去する過剰分のフィーダー細胞の容積を計算した。最も近い整数に切り捨てる。
。必要に応じて追加のフィーダーセルを得て、先に述べたように移送パックに追加した。生存可能な5×109のフィーダー細胞を得るために必要なフィーダー細胞懸濁液の容積を計算した。除去する過剰分のフィーダー細胞の容積を計算した。最も近い整数に切り捨てる。
[001062] 余分なフィーダー細胞を除去した。新しい100mLシリンジで、10mLの空気を吸い上げ、シリンジをハーネスに取り付けた。「フィーダー細胞懸濁液」移送パックへのラインを開いた。シリンジを使用して、計算されたフィーダー細胞の容積と移送パックからの追加の10.0mLを100mLシリンジに入れた。フィーダー細胞の容積を取り除いたら、フィーダー細胞懸濁液移送パックのラインを閉じた。最終シリンジは取り外さなかった。シリンジが満たされたら、新しいシリンジと交換した。複数のシリンジを使用して、総量を取り除いた。新しいシリンジ毎に10mLの空気を引き込んだ。除去されたフィーダー細胞の総量(追加の10mLを含む)を記録した。
[001063] OKT3を加えた。BSCで、1.0mLシリンジと16G針を使用して、0.15mLのOKT3を吸い上げた。シリンジから針を無菌的に取り外し、シリンジをニードルレスインジェクションポートに取り付ける。OKT3を注入した「フィーダー細胞懸濁液」移送パックの活栓を開き、先に取り出したフィーダー細胞10mLを追加して、ラインを通してOKT3を洗い流した。シリンジを逆さまにして、空気を押し通してフィーダー細胞懸濁液移送パックへのラインをクリアにした。残りのフィーダー細胞懸濁液をシリンジに残した。全てのクランプを閉じ、ハーネスをBSCから取り外した。溶接に十分なチューブを残し、フィーダー細胞懸濁液移送パックをヒートシールした。
11日目のG-Rexの充填及び播種
[001064] G-Rex500MCSのセットアップ。梱包からG-Rex500MCSを取り出し、フラスコに亀裂又はチューブにねじれがないか検査した。全てのルアー接続と閉鎖が確実であることを確認した。ベントフィルターラインを除くG-Rex500MCSラインの全てのクランプを閉じ
た。マーカーを使用して、4.5Lグラデーションで線を引いた。インキュベーターから「完全CM2 11日目培地」を取り出した。
[001064] G-Rex500MCSのセットアップ。梱包からG-Rex500MCSを取り出し、フラスコに亀裂又はチューブにねじれがないか検査した。全てのルアー接続と閉鎖が確実であることを確認した。ベントフィルターラインを除くG-Rex500MCSラインの全てのクランプを閉じ
た。マーカーを使用して、4.5Lグラデーションで線を引いた。インキュベーターから「完全CM2 11日目培地」を取り出した。
[001065] 培地を汲み上げる準備。G-Rex500MCSの赤い線を、完全CM2 11日目培
地に接続されたリピーターポンプ移送セットに溶接した。「完全CM2 11日目培地」バッグをIVポールに掛けた。ポンプチュービングをBaxaポンプに通した。G-Rex500MCS
に培地を注入した。Baxaポンプを「高」及び「9」に設定する。G-Rex500MCSに4.5L
の培地を注入し、4.5Lグラデーションでフラスコに印を付けた線まで満たした。溶接部の近くでG-Rex500MCSの赤い線をヒートシールした。フラスコに「11日目」とラベル
付けをした。フィーダーセルの溶接:懸濁液移送パックをフラスコへ。G-Rex500MCSの赤
い線を「フィーダー細胞懸濁液」移送パックに滅菌溶接した。
地に接続されたリピーターポンプ移送セットに溶接した。「完全CM2 11日目培地」バッグをIVポールに掛けた。ポンプチュービングをBaxaポンプに通した。G-Rex500MCS
に培地を注入した。Baxaポンプを「高」及び「9」に設定する。G-Rex500MCSに4.5L
の培地を注入し、4.5Lグラデーションでフラスコに印を付けた線まで満たした。溶接部の近くでG-Rex500MCSの赤い線をヒートシールした。フラスコに「11日目」とラベル
付けをした。フィーダーセルの溶接:懸濁液移送パックをフラスコへ。G-Rex500MCSの赤
い線を「フィーダー細胞懸濁液」移送パックに滅菌溶接した。
[001066] フィーダー細胞をG-Rex500MCSに加えた。フィーダー細胞懸濁液とG-Rex500MCSとの間の全てのクランプを開き、重力供給方式によりフラスコにフィーダー細胞懸濁液を追加した。溶接部近くの赤い線をヒートシールした。TIL懸濁液移送パックをフラスコに溶接した。G-Rex500MCSの赤い線を「TIL懸濁液」移送パックに滅菌溶接した。
[001067] TILをG-Rex500MCSに追加した。TIL懸濁液とG-Rex500MCSとの間の全てのクランプを開き、重力供給方式によりフラスコにTIL懸濁液を追加した。TIL懸濁液バッグを取り外すために、溶接部近くの赤い線をヒートシールした。
[001068] G-Rex500MCSをインキュベートした。大きいフィルターラインを除き、G-Rex
500MCSの全てのクランプが閉じていることを確認し、インキュベーターに置いた。イン
キュベーターのパラメータ:温度LEDディスプレイ:37.0±2.0℃;CO2パーセント:5.0±1.5% CO2。
500MCSの全てのクランプが閉じていることを確認し、インキュベーターに置いた。イン
キュベーターのパラメータ:温度LEDディスプレイ:37.0±2.0℃;CO2パーセント:5.0±1.5% CO2。
[001069] インキュベーションウィンドウを計算した。インキュベーション16日目にG-Rex500MCSを取り出す適切な時間を決定するための計算を実行した。下限:インキュベ
ーション時間+108時間。上限:インキュベーション時間+132時間。
ーション時間+108時間。上限:インキュベーション時間+132時間。
11日目、過剰TIL凍結保存
[001070] 過剰なTILバイアルを冷凍した。制御速度冷凍庫(CRF)に入れられたバイアルの総数を記録及び検証した。冷却が完了したら、バイアルをCRFから適切な保管容器に移す。
[001070] 過剰なTILバイアルを冷凍した。制御速度冷凍庫(CRF)に入れられたバイアルの総数を記録及び検証した。冷却が完了したら、バイアルをCRFから適切な保管容器に移す。
16日目 培地の調製
[001071] 事前に温められたAIM-V培地。使用の少なくとも12時間前までに2~8℃
から3つのCTS AIM V 10L培地バッグを取り外し、遮光して室温に置いた。各バッグ
にラベルを付けた。温め開始時刻と日付の記録。全てのバッグが12~24時間温められていることを確認した。
[001071] 事前に温められたAIM-V培地。使用の少なくとも12時間前までに2~8℃
から3つのCTS AIM V 10L培地バッグを取り外し、遮光して室温に置いた。各バッグ
にラベルを付けた。温め開始時刻と日付の記録。全てのバッグが12~24時間温められていることを確認した。
[001072] ルアー接続を使用して、10LのLabtainerバッグのメスポートの1つに、
流体移送セットの長径端を接続した。「上清」として上清のラベルを10LのLabtainer
に準備した。上清のために10LのLabtainerを準備した。BSCから取り外す前に、全
てのクランプが閉じられていることを確認すること。
流体移送セットの長径端を接続した。「上清」として上清のラベルを10LのLabtainer
に準備した。上清のために10LのLabtainerを準備した。BSCから取り外す前に、全
てのクランプが閉じられていることを確認すること。
[001073] 全ての氷が溶けるまで、CTS AIM V培地の1袋あたりIL-2(6×106
IU/mL)(BR71424)の5×1.1mLアリコートを解凍した。Glutamax100.0mLを適切なサイズのレシーバーに分注した。各レシーバーに追加された容積を記録し、各レシーバーに「GlutaMax」とラベル付けした。
IU/mL)(BR71424)の5×1.1mLアリコートを解凍した。Glutamax100.0mLを適切なサイズのレシーバーに分注した。各レシーバーに追加された容積を記録し、各レシーバーに「GlutaMax」とラベル付けした。
[001074] IL-2をGlutaMaxに追加した。マイクロピペットを使用して、各GlutaMaxレシーバーに5.0mLのIL-2を追加した。プロセスノート5.18毎にチップをすすぐことを確認し、追加した各mLに新しいピペットチップを使用した。各レシーバーに追加された容積を記録し、各レシーバーに「GlutaMax+IL-2」とラベル付けした。
[001075] 製剤のためにCTS AIM V培地バッグを準備した。CTS AIM V 10L培地バッ
グ(W3012717)が室温で温められ、使用前に12~24時間遮光されていることを確認した。インキュベーション終了時間を記録した。BSCで、4インチプラズマ移送セットのクランプを閉じ、スパイクポートを使用しバッグと接続した。スパイクを一方向に回しながら一定の圧力を維持した。ポートの側面に穴を開けないようにすること。ルアーを通じて、リピーターポンプ流体移送セットの長径端を4インチプラズマ移送セットに接続した。
グ(W3012717)が室温で温められ、使用前に12~24時間遮光されていることを確認した。インキュベーション終了時間を記録した。BSCで、4インチプラズマ移送セットのクランプを閉じ、スパイクポートを使用しバッグと接続した。スパイクを一方向に回しながら一定の圧力を維持した。ポートの側面に穴を開けないようにすること。ルアーを通じて、リピーターポンプ流体移送セットの長径端を4インチプラズマ移送セットに接続した。
[001076] BSCに隣接しているBaxaポンプを実行した。BSCからリピーターポンプ流体移送セットのポンプチューブセクションを取り外し、リピーターポンプに取り付けた。
[001077] 製剤用培地を準備した。BSC内で、ポンプ式溶液分注システム(PLDS)からシリンジを取り外し、廃棄した。PLDSピペットの無菌性を損なわないようにすること。PLDSピペットを、ルアー接続を介してリピーターポンプ流体移送セットの小径端に接続し、吸引のために「GlutaMax+IL-2」にピペットチップを取り付けた。レシーバー及び10Lバッグ間の全てのクランプを開く。
[001078] GlutaMax+IL-2をバッグに注入した。ポンプ速度を「中」と「3」に設定し、全ての「GlutaMax+IL-2」を10L CTS AIM V培地バッグに送った。溶液が
残っていない場合、ラインをクリアにし、ポンプを停止する。以下の各Aim Vバッグに追
加されたIL-2を含むGlutaMaxの容積を記録した。
残っていない場合、ラインをクリアにし、ポンプを停止する。以下の各Aim Vバッグに追
加されたIL-2を含むGlutaMaxの容積を記録した。
[001079] PLDSを取り外した。全てのクランプが閉じていることを確認し、リピーターポンプ流体移送セットからPLDSピペットを取り外した。リピーターポンプ流体移送セットを取り外し、4インチのプラズマ移送セットに赤いキャップを付けた。
[001080] 調整済み「完全CM4 16日目培地」と各バッグにラベル付けした。
[001081] サンプルプラン毎の培地参考品を除去した。30mLシリンジを使用して、シリンジを4インチプラズマ移送セットに取り付けて20.0mLの「完全CM4 16日目培地」取り出し、50mLコニカルチューブにサンプルを分注した。シリンジを取り外した後、4インチプラズマ移送セットが固定されているか又は赤いキャップが付いているか確認する。
[001082] 新しいリピーターポンプ流体移送セットを取り付けた。「完全CM4 16日目培地」バッグに接続された4インチプラズマ移送セットに新しいリ流体ポンプ移送セットの長径端を取り付けた。サンプルプラン在庫ラベルとラベル付けし、テストのために提出するまで、培地参考品サンプルを2~8℃で保存した。
[001083] インキュベーターをモニターした。該当する場合、準備された追加のバッグを監視する。インキュベーターのパラメータ:温度LEDディスプレイ:37.0±2.0℃、CO2パーセント:5.0±1.5% CO2。
[001084] 完全CM4 16日目培地を温めた。インキュベーター内の完全CM4 16日目培地の最初のバッグを、使用準備が整うまで30分以上温めた。該当する場合、追加のバッグを温めた。
[001085] 希釈の準備をした。BSCで、「細胞数希釈用」とラベル付けされたAIM-V
培地の4.5mLを各4×15mLコニカルチューブに加えた。コニカルチューブにラベルを付けた。4つのクライオバイアルにラベルを付けた。
培地の4.5mLを各4×15mLコニカルチューブに加えた。コニカルチューブにラベルを付けた。4つのクライオバイアルにラベルを付けた。
16日目 REP流出
[001086] インキュベーターをモニターした。インキュベーターのパラメータ:温度LEDディスプレイ:37.0±2.0℃、CO2パーセンテージ:5.0±1.5% CO2。
[001086] インキュベーターをモニターした。インキュベーターのパラメータ:温度LEDディスプレイ:37.0±2.0℃、CO2パーセンテージ:5.0±1.5% CO2。
[001087] インキュベーターからG-Rex500MCSを取り出した。G-Rex500MCSをインキュベーターから取り外す前に、インキュベーションパラメーター上限、下限、除去時間が満たされていることを確認するためのチェックを実行した。インキュベーターからG-Rex500MCSを取り出した。
[001088] 約12インチのラインを残し、1Lの移送パック(W3006645)をヒートシールした。1L移送パックに「TIL懸濁液」のラベルを付けた。ライン全体を含む1Lの移送パックをはかりの上に置き、乾燥重量を記録した。
[001089] GatheRexのセットアップ。G-Rex500MCSからの赤色の培地除去ラインを、上
記で調整した10LのLabtainerバッグ「上清」のリピーターポンプ移送セットに滅菌溶
接した。G-Rex500MCSからクリア細胞除去ラインを、上記で準備したTIL懸濁液移送パ
ックに滅菌溶接した。G-Rex500MCSフラスコをGatheRexの左側に配置した。上清Labtainerバッグを置き、その右側に及びTIL懸濁液移送パックを配置した。G-Rex500MCSからの
赤い培地除去ラインをGatheRexのクランプ上部(赤い線でマーク)及びチューブガイドに取り付けた。G-Rex500MCSからのクリアハーベストラインをクランプ底部(青い線でマー
ク)及びGatheRexのチューブガイドに取り付けた。GatheRexからガスラインをG-Rex500MCSの滅菌フィルターに取り付けた。注記:G-Rex500MCSから上清を除去する前に、細胞除去ラインの全てのクランプが閉じていることを確認した。
記で調整した10LのLabtainerバッグ「上清」のリピーターポンプ移送セットに滅菌溶
接した。G-Rex500MCSからクリア細胞除去ラインを、上記で準備したTIL懸濁液移送パ
ックに滅菌溶接した。G-Rex500MCSフラスコをGatheRexの左側に配置した。上清Labtainerバッグを置き、その右側に及びTIL懸濁液移送パックを配置した。G-Rex500MCSからの
赤い培地除去ラインをGatheRexのクランプ上部(赤い線でマーク)及びチューブガイドに取り付けた。G-Rex500MCSからのクリアハーベストラインをクランプ底部(青い線でマー
ク)及びGatheRexのチューブガイドに取り付けた。GatheRexからガスラインをG-Rex500MCSの滅菌フィルターに取り付けた。注記:G-Rex500MCSから上清を除去する前に、細胞除去ラインの全てのクランプが閉じていることを確認した。
[001090] G-Rex500MCSの容積削減。SOP-01777に従い、G-Rex500MCSから10LのLabtainerに約4.5Lの培養上清を移した。フラスコが水平であり、吸引ディップ
チューブの端まで培地が減少していることを確認するためにG-Rex500MCSフラスコを目視
で検査した。
チューブの端まで培地が減少していることを確認するためにG-Rex500MCSフラスコを目視
で検査した。
[001091] TIL回収のためにフラスコを準備した。上清を取り除いた後、赤いラインへのクランプを全て閉じた。
[001092] TIL回収の開始。TIL回収開始時間を記録した。フラスコを激しく叩き細胞を遊離させるために培地を攪拌した。全ての細胞が離れたことを確認するためにフラスコの検査を実施した。フラスコを傾けて、ホースがフラスコの端にくるようにした。細胞収集ストローが壁面及び底膜の接合部にない場合、ストローを適切に配置するには、通常、450の角度でフラスコを傾けたまま軽く叩くのみで十分である。
[001093] TILの回収。TIL懸濁液移送パックにつながる全てのクランプを解放した。GatheRexを使用して、細胞懸濁液をTIL懸濁液移送パックに移した。注記:全ての細胞と培地が収集されるまで、エッジを傾斜し続けることを確認する。付着した細胞について膜を検査した。
[001094] フラスコ膜をすすいだ。G-Rex500MCSの底をすすいだ。ガス交換膜の約1/
4をすすぎ培地で覆う。G-Rex500MCSのクランプを閉じた。G-Rex500MCSの全てのクランプが閉じていることを確認した。
4をすすぎ培地で覆う。G-Rex500MCSのクランプを閉じた。G-Rex500MCSの全てのクランプが閉じていることを確認した。
[001095] ヒートシールした。チューブ全体の長さがほぼ同じになるように、できる限り溶接部の近くでTIL含有移送パックをヒートシールした。上清を含む10LのLabtainerをヒートシールし、サンプル収集のためにBSCに通した。
[001096] 細胞懸濁液を含む移送パックの重量を記録し、細胞懸濁液の容積を計算した。サンプル除去のための移送パックを準備した。4インチプラズマ移送セットを上からTIL懸濁液移送パックに溶接し、できるだけバッグの近くにメスルアーの端に取り付けたままにした。
[001097] 細胞上清からテストサンプルを取り除いた。BSCで、メスのルアーポートと適切なサイズのシリンジを使用して、10LのLabtainerから10.0mLの上清を取
り除く。15mLのコニカルチューブに入れて「BacT」とラベルを付け、BacTサンプルのためにチューブを保持した。別のシリンジを使用して、10.0mLの上清を取り出し、15mLコニカルチューブに入れた。テストのためにマイコプラズマサンプルのためのチューブを保持した。「マイコプラズマ希釈剤」としてチューブにラベル付けした。上清バッグを閉じた。ルアーポートに赤いキャップを付けてバッグを閉じ、BSCから外した。
り除く。15mLのコニカルチューブに入れて「BacT」とラベルを付け、BacTサンプルのためにチューブを保持した。別のシリンジを使用して、10.0mLの上清を取り出し、15mLコニカルチューブに入れた。テストのためにマイコプラズマサンプルのためのチューブを保持した。「マイコプラズマ希釈剤」としてチューブにラベル付けした。上清バッグを閉じた。ルアーポートに赤いキャップを付けてバッグを閉じ、BSCから外した。
[001098] 細胞カウントサンプルを取り出した。BSCで、各サンプルに個別の3mLシリンジを使用して、ルアー接続を使用し「TIL懸濁液」移送パックから4×1.0mL細胞カウントサンプルを取り出した。上記で準備したクリオバイアルにサンプルを入れた。
[001099] マイコプラズマサンプルを取り出した。3mLシリンジを使用し、TIL懸濁液移送パックから1.0mL取り出し、上記で調整した「マイコプラズマ希釈液」とラベル付けした15mLコニカルに入れた。テストのために提出するまで、マイコプラズマサンプルを2~8℃でラベル付けし保存した。
[001100] 播種のための移送パックを準備した。BSCで、リピーターポンプ流体移送セットの長径チューブ端を、TILを含む移送パックのルアーアダプターに取り付けた。止血鉗子を使用して、移送パックの近くのラインを遮断した。移送セットの端に赤いキャップをした。
[001101] TILをインキュベーターに入れた。BSCから細胞懸濁液を取り除き、必要になるまでインキュベーターに入れた。時間を記録した。
[001102] セルカウントを実行した。NC-200使用して、細胞カウント及び計算を実行した。0.5mLの細胞懸濁液を上記で調製した4.5mLのAIM-V培地に加えて、最初に
細胞カウントサンプルを希釈した。これにより、1:10希釈になった。
細胞カウントサンプルを希釈した。これにより、1:10希釈になった。
[001103] 継代培養のためのフラスコを計算した。播種に必要なフラスコの総数を計算した。注記:G-Rex500MCSフラスコの数を四捨五入して、近い整数に表示した。
[001104] 播種のためのG-Rex500MCSフラスコの最大数は5であった。播種するフラス
コの計算数が5個を超えた場合、利用可能な全量の細胞懸濁液を使用して、5個のみを播種した。
コの計算数が5個を超えた場合、利用可能な全量の細胞懸濁液を使用して、5個のみを播種した。
[001105] 必要とする追加の培地バッグの数を決定した。上記で準備したバッグに加えて必要とする培地バッグの数を計算した。必要な培地バッグの数を次の整数に切り上げた。
[001106] 必要に応じて追加の培地を調整した。上記で計算したG-Rex-500Mフラスコが2つ必要なたびに、「CM4 16日目培地」の10Lバッグを1つ準備した。追加の培地を準備し温めながら、最初のGREX-500Mフラスコに進み、播種した。
[001107] 必要に応じて追加の培地バッグを調整した。上記で決定した追加の培地バッグの計算された数を準備し、温めた。
[001108] G-Rex500MCSを満たした。ベンチトップでG-Rex500MCSを開き、容器の亀裂又はチューブのねじれを検査した。全てのルアー接続と閉鎖が確実であることを確認した。フラスコの外側の4500mLラインにマーカーでマークを付けた。大きいフィルターラインを除いて、G-Rex 500MCSの全てのクランプを閉じた。G-Rex500MCSの赤い培地ライン
を、上記で準備した培地バッグの液体移送セットに滅菌溶接した。
を、上記で準備した培地バッグの液体移送セットに滅菌溶接した。
[001109] 培地を汲み上げる準備。IVポールに「CM4 16日目培地」を掛けた。ポンプチュービングをBaxaポンプに通した。
[001110] G-Rex500MCSに培地を注入した。Baxaポンプを「高」及び「9」に設定し、
4500mLの培地をフラスコに注入する。4.5Lの「CM4 16日目培地」をG-Rex500MCSに注入し、上記のようにフラスコにマークされた線まで満たした。4.5Lの培
地が移されたら直ちにポンプを停止した。
4500mLの培地をフラスコに注入する。4.5Lの「CM4 16日目培地」をG-Rex500MCSに注入し、上記のようにフラスコにマークされた線まで満たした。4.5Lの培
地が移されたら直ちにポンプを停止した。
[001111] ヒートシールした。G-Rex500MCSの赤い培地ラインを、作成された溶接部の
近くでヒートシールし、培地バッグを取り外した。
近くでヒートシールし、培地バッグを取り外した。
[001112] 充填の繰り返し。培地が温められ、使用の準備ができたら、上記で計算された各フラスコについて、充填とシーリングの手順を繰り返す。重力充填又は複数のポンプを使用して、複数のフラスコに同時に充填し得る。培地1バッグについて2つのフラスコのみを充填する。
[001113] 満たされたフラスコを記録しラベル付けした。各フラスコにアルファベット順に「16日目」のラベル付けした。
[001114] 必要に応じてフラスコをインキュベートした。TILを播種するのを待つ間、フラスコをインキュベーターで保存した。充填されたフラスコの総数を記録した。
[001115] 追加する細胞懸濁液の容量を計算した。新しいG-Rex500MCSフラスコに追加
するTIL懸濁液の目標量を計算した。
するTIL懸濁液の目標量を計算した。
[001116] フラスコの数が5個を超える場合、5個のみが播種され、細胞懸濁液の全量が使用される。
[001117] 播種のためにフラスコを準備した。インキュベーターからステップ8.10.70よりG-Rex500MCSを取り出した。
[001118] ポンピングの準備。大きいフィルターライン以外のG-Rex 500MCSの全てのクランプを閉じた。ポンプチュービングをBaxaポンプに通した。
[001119] インキュベーターからTILを取り出した。インキュベーターから「TIL懸濁液」移送パックを取り出し、インキュベーション終了時間を記録した。
[001120] 播種のために細胞懸濁液を調整した。「TIL懸濁液」移送パックを上からポンプインレットラインまで滅菌溶接した。
[001121] スケール上にTIL懸濁液バッグを置いた。「低」及び「2」に設定されたBaxaポンプを使用して、TIL懸濁液バッグから溶接までのラインをプライミングした。スケールを風袋引きした。
[001122] TIL懸濁液をフラスコに播種した。Baxaポンプを“中”及び“5”と設定する。上記で計算したTIL懸濁液の容量をフラスコに注入する。各フラスコに加えたTIL懸濁液の容量を記録する。
[001123] ヒートシールした。次のフラスコを溶接するのに十分なチューブを残し、「TIL懸濁液」移送パックをヒートシールした。
[001124] 残りのフラスコを充填した。播種した各フラスコ間で「TIL懸濁液」移送パックを混合したことを確認し、残りの全てのフラスコに播種するために充填とシーリングのステップを繰り返した。
[001125] インキュベーターをモニターした。フラスコが2つのインキュベーターに分けて入れる必要がある場合、両方をモニターすること。インキュベーターのパラメータ:温度LEDディスプレイ:37.0±2.0℃;CO2パーセント:5.0±1.5% CO2。各フラスコがインキュベーターに置かれた時間を記録した。
[001126] インキュベーションウィンドウを計算した。インキュベーション22日目にG-Rex500MCSを取り出す時間範囲を決定するために以下の計算を実行した。下限:時間+
132時間;上限:時間+156時間。
132時間;上限:時間+156時間。
22日目 洗浄バッファーの調製
[001127] 10LのLabtainerバッグを準備した。BSCで、ルアー接続を介して4イ
ンチプラズマ移送セットを10LのLabtainerバッグに取り付ける。「上清」、ロット番
号及び初期/日付として10LのLabtainerバッグラベルを調整した。BSCから取り出
し移す前に、全てのクランプを閉じた。注記:回収するG-Rex500MCSフラスコ2本毎に1
つの10LのLabtainerバッグを準備した。
[001127] 10LのLabtainerバッグを準備した。BSCで、ルアー接続を介して4イ
ンチプラズマ移送セットを10LのLabtainerバッグに取り付ける。「上清」、ロット番
号及び初期/日付として10LのLabtainerバッグラベルを調整した。BSCから取り出
し移す前に、全てのクランプを閉じた。注記:回収するG-Rex500MCSフラスコ2本毎に1
つの10LのLabtainerバッグを準備した。
[001128] 液体移送セットを溶接した。BSCの外側で、4S-4M60の全てのクランプを閉じた。4S-4M60のオスルアーの端の1つにセットされたリピーター液体移送セットを溶接し
た。
た。
[001129] Plasmalyte-A及びヒトアルブミンを25%BSCに移した。4S-4M60及びリ
ピーター移送セットの部品をBSCに移した。
ピーター移送セットの部品をBSCに移した。
[001130] Plasmalyteを3000mLバッグに注入した。Plasmalyte-Aの3袋を4S-4M60コネクタセットにスパイクした。注記:取り外す前にアルコール綿棒(W300948
8)でポートカバーを拭いた。注記:スパイクを一方向に回しながら一定の圧力を維持する。ポートの側面に穴を開けないようにすること。Origen3000mL収集バッグを、ルアー接続を介して、リピーターポンプ移送セットの長径端に接続した。3000mLのOrigenバッグの未使用ラインのクランプを閉じた。BSCに隣接しているBaxaポンプを実行した。BSCの外側に位置するBaxaポンプに移送セットチュービングを通した。ポンプを「高」及び「9」に設定した。Plasmalyte-Aから3000mL Origenバッグまでの全てのクランプを開いた。Plasmalyte-Aから3000mL Origenバッグまでの全てのクランプを開いた。全てのPlasmalyte-Aが移されたら直ちにポンプを停止した。必要に応じて、ポンプを逆転させてバッグの位置を操作することにより、3000mL Origenバッグから空気を取り除いた。全てのクランプを閉じた。
8)でポートカバーを拭いた。注記:スパイクを一方向に回しながら一定の圧力を維持する。ポートの側面に穴を開けないようにすること。Origen3000mL収集バッグを、ルアー接続を介して、リピーターポンプ移送セットの長径端に接続した。3000mLのOrigenバッグの未使用ラインのクランプを閉じた。BSCに隣接しているBaxaポンプを実行した。BSCの外側に位置するBaxaポンプに移送セットチュービングを通した。ポンプを「高」及び「9」に設定した。Plasmalyte-Aから3000mL Origenバッグまでの全てのクランプを開いた。Plasmalyte-Aから3000mL Origenバッグまでの全てのクランプを開いた。全てのPlasmalyte-Aが移されたら直ちにポンプを停止した。必要に応じて、ポンプを逆転させてバッグの位置を操作することにより、3000mL Origenバッグから空気を取り除いた。全てのクランプを閉じた。
[001131] ルアー接続を介してリピーターポンプ液体移送セットから3000mLバッグを取り外し、バッグへのラインに赤いキャップ(W3012845)を取り付けた。
[001132] 3000mLバッグにヒトアルブミン25%を追加した。ベント付きミニスパイクを開いた。スパイクの無菌性を損なうことなく、青いキャップを確実に締めた。ベント付きのミニスパイクで、ヒトアルブミン25%ボトルのセプタムをスパイクした。注記:スパイクの無菌性を損なわないようにすること。合計3回スパイクされたヒトアルブミン25%ボトルで2回繰り返された。1つのベント付きミニスパイクから青いキャップを取り外し、60mLシリンジをヒト血清アルブミン25%ボトルに取り付けた。25%のヒト血清アルブミン60mLを吸い上げる。25%ヒト血清アルブミンの複数のボトルを使用する必要があり得る。必要に応じて、ベント付きミニスパイクからシリンジを外し、ヒト血清アルブミン25%ボトルの次のベント付きミニスパイクに接続する。60mLが得られたら直ちにベント付きミニスパイクからシリンジを取り外す。Plasmalyte-Aで満たされた3000mL Origenバッグのニードルレスインジェクションポートにシリンジを取り付ける。全ての25%ヒトアルブミンを分注した。最終容量の25%ヒトアルブミン120.0mLを取得するために繰り返した。全ての25%ヒトアルブミンを追加した後、バッグを静かに混合した。「LOVO洗浄バッファー」とラベル付けされ、24時間の有効期限を割り当てた。
[001133] IL-2希釈液を調製した。10mLシリンジを使用し、LOVO洗浄緩衝液バッグのニードルレスインジェクションポートを使用して、5.0mLのLOVO洗浄バッファーを除去した。LOVO洗浄バッファーを50mLコニカルチューブに分注し、「IL-2希
釈液」とラベル付けした。
釈液」とラベル付けした。
[001134] CRFブランクバッグLOVO洗浄バッファーを分注した。100mLシリンジを使用して、ニードレスインジェクションポートから70.0mLのLOVO洗浄バッファーを吸い上げた。注記:使用する前に、毎回アルコールパッドでニードレスインジェクションポートを拭いた。シリンジに赤いキャップをし、「ブランククライオバッグ」及びロット番号とラベル付けした。注記:ステップ8.14.3で必要になるまで、シリンジを室温で保持した。
[001135] 洗浄バッファーの準備完了。LOVO洗浄バッファーバッグの全てのクランプを閉じた。
[001136] IL-2の解凍。全ての氷が溶けるまで、1つの1.1mLのIL-2(6×106IU/mL)を解凍した。IL-2のロット番号と有効期限を記録した。注記:IL-2ラベルが添付されていることを確認した。
[001137] IL-2調製。「IL-2希釈液」とラベル付けされた50mLコニカルチューブに50μL IL-2ストック(6×106IU/mL)を追加した。
[001138] IL-2調製。「IL-2 6×104」、日付、ロット番号及び24時間の有効期限としてコニカルのラベルを変更した。2℃~8℃で蓋をして保管する。
[001139] 凍結保存の準備。最終産物の凍結保存のために、2℃~8℃で5個の凍結カセットを置き、事前調整した。
[001140] 細胞カウント希釈を準備した。BSCで、ロット番号及び「細胞カウント希釈用」とラベル付けされた4.5mLのAIM-V培地を4本の個別の15mLコニカルチュ
ーブに追加し、チューブにラベル付けした。
ーブに追加し、チューブにラベル付けした。
[001141] 細胞カウントの準備。バイアル番号(1~4)と4つのクライオバイアルにラベル付けした。
22日目 TIL回収
[001142] インキュベーターをモニターした。インキュベーターのパラメータ温度LEDディスプレイ:37±2.0℃、CO2パーセンテージ:5%±1.5%。
[001142] インキュベーターをモニターした。インキュベーターのパラメータ温度LEDディスプレイ:37±2.0℃、CO2パーセンテージ:5%±1.5%。
[001143] インキュベーターからG-Rex500MCSを取り出した。G-Rex500MCSをインキュベーターから取り外す前に、フラスコをチェックし、インキュベーションパラメーターが満たされていることを確認した(インキュベーション時間)。
[001144] 3000mL収集バッグに「TIL懸濁液」、ロット番号及び初期/日付のラベル付けされたTIL収集バッグを準備した。
[001145] 余分な接続を封鎖した。各接続の端近くにある収集バッグの2つのルアー接続をヒートシールした。
[001146] GatheRexのセットアップ。G-Rex500MCSからの赤い培地除去ラインを上記で
準備した10LのLabtainerバッグに滅菌溶接した(プロセスノート5.11に従う)。
注記:複数のGatheRexデバイスの使用についてはプロセスノート5.16を参照されたい。G-Rex500MCSからのクリア細胞除去ラインを、上記で準備したTIL懸濁液収集バッグ
に滅菌溶接した(プロセスノート5.11に従う)。G-Rex500MCSフラスコをGatheRexの
左側に配置した。上清Labtainerバッグ及びその右側にプールされたTIL懸濁液収集バ
ッグを配置した。G-Rex500MCSからの赤い培地除去ラインをGatheRexのクランプ上部(赤
い線でマーク)及びチューブガイドに取り付けた。G-Rex500MCSからのクリアハーベスト
ラインをクランプ底部(青い線でマーク)及びGatheRexのチューブガイドに取り付けた。GatheRexからのガスラインとG-Rex500MCSの滅菌フィルターを接続した。G-Rex500MCSから上清を除去する前に、細胞除去ラインの全てのクランプが閉じていることを確認した。
準備した10LのLabtainerバッグに滅菌溶接した(プロセスノート5.11に従う)。
注記:複数のGatheRexデバイスの使用についてはプロセスノート5.16を参照されたい。G-Rex500MCSからのクリア細胞除去ラインを、上記で準備したTIL懸濁液収集バッグ
に滅菌溶接した(プロセスノート5.11に従う)。G-Rex500MCSフラスコをGatheRexの
左側に配置した。上清Labtainerバッグ及びその右側にプールされたTIL懸濁液収集バ
ッグを配置した。G-Rex500MCSからの赤い培地除去ラインをGatheRexのクランプ上部(赤
い線でマーク)及びチューブガイドに取り付けた。G-Rex500MCSからのクリアハーベスト
ラインをクランプ底部(青い線でマーク)及びGatheRexのチューブガイドに取り付けた。GatheRexからのガスラインとG-Rex500MCSの滅菌フィルターを接続した。G-Rex500MCSから上清を除去する前に、細胞除去ラインの全てのクランプが閉じていることを確認した。
[001147] 容量削減。G-Rex500MCSから約4.5Lの上清を上清バッグに移した。フラ
スコが水平であり、吸引ディップチューブの端まで培地が減少していることを確認するためにG-Rex500MCSを目視で検査した。必要に応じて手順を繰り返す。
スコが水平であり、吸引ディップチューブの端まで培地が減少していることを確認するためにG-Rex500MCSを目視で検査した。必要に応じて手順を繰り返す。
[001148] TIL回収のためにフラスコを準備した。上清を取り除いた後、赤いラインへのクランプを全て閉じた。
[001149] TILの収集を開始した。TIL回収開始時間を記録した。フラスコを激しく叩き細胞を遊離させるために培地を攪拌した。全ての細胞が離れたことを確認するためにフラスコの検査を実施した。「TIL懸濁液」3000mL収集バッグを平らな表面の乾いたワイプの上に置いた。フラスコを傾けて、ホースがフラスコの端にくるようにした。注記:細胞収集ホースが壁面及び底膜の接合部にない場合、ホースを適切に配置するには、通常、45°の角度でフラスコを傾けたまま軽く叩くのみで十分であった。
[001150] TILの回収。TIL懸濁液収集バッグにつながる全てのクランプを解放した。GatheRexを使用して、TIL懸濁液を3000mL収集バッグに移した。注記:全ての細胞と培地が収集されるまで、エッジを傾斜し続けた。付着した細胞について膜を検査した。
[001151] フラスコ膜をすすいだ。G-Rex500MCSの底をすすいだ。ガス交換膜の約1/
4をすすぎ培地で覆った。
4をすすぎ培地で覆った。
[001152] G-Rex500MCSのクランプを閉じた。全てのクランプが閉じていることを確認
する。
する。
[001153] ヒートシールした。チューブ全体の長さがほぼ同じになるように、できる限り溶接部の近くでTILを含む収集バッグをヒートシールする。上清バッグをヒートシールした。
[001154] 残りのG-Rex 500 MCSフラスコの収穫が完了した。上記の手順を繰り返し、
全てのTILを同じ収集バッグにプールする。2番目のフラスコ毎に10Lの上清バッグを交換する必要があった。
全てのTILを同じ収集バッグにプールする。2番目のフラスコ毎に10Lの上清バッグを交換する必要があった。
[001155] LOVO原料バッグを準備した。新しい3000mL収集バッグを入手した。「LOVO原料バッグ」、ロット番号及び初期/日付としてラベル付けされた。「LOVO原料バッグ」のチューブをヒートシールし、メスルアーを取り外して、溶接に十分なラインを残した。
[001156] LOVO原料バッグの重量を測定した。適切なサイズのプラスチック容器をスケールの上に置き風袋引きした。ポートとラインを含むLOVO原料バッグをビンに入れ、乾燥重量を記録する。
[001157] 細胞懸濁液をLOVO原料バッグに移した。170μmの重量血液フィルターの全てのクランプを閉じた。
[001158] 細胞懸濁液をLOVO原料バッグに移した。重量血液フィルターの長い終端をLOVO原料バッグに滅菌溶接した。「プールされたTIL懸濁液」収集バッグにフィルターの2つの供給源ラインの1つを滅菌溶接した。溶接が完了したら直ちに、取り去るためにフィルターの未使用ラインをヒートシールした。必要なクランプを全て開き、IVポールに収集バッグをぶら下げてTIL懸濁液を引き上げ、血液フィルターを介してLOVO原料バッグにTILの重力フロー移行を開始する。排出中、TILを均一なサスペンションに保つために、TIL懸濁液バッグを優しく回転又はこねた。
[001159] 全てのクランプを閉じた。全てのTILがLOVO原料バッグに移されたら、全てのクランプを閉じた。
[001160] ヒートシールした。重力血液フィルターを取り除くために、できる限り溶接の近くでヒートシールした(プロセスノート5.12に従って)。
[001161] 細胞カウントサンプルを取り出した。BSCで、各サンプルに個別の3mLシリンジを使用して、ニードルレスインジェクトンポートを使用しLOVO原料バッグから4×1.0mL細胞カウントサンプルを取り出した。ステップ8.11.36で準備したクライオバイアルにサンプルを入れた。
[001162] セルカウントを実行した。NC-200使用して、細胞カウント及び計算を実行した。0.5mLの細胞懸濁液を上記で調製した4.5mLのAIM-V培地に加えて、最初に
細胞カウントサンプルを希釈した。これにより、1:10希釈になった。
細胞カウントサンプルを希釈した。これにより、1:10希釈になった。
[001163] 細胞カウント及びサンプル量を記録した。総生存TIL細胞を計算した。総生細胞が1.5×109以上の場合に続行した。総有核細胞の計算。
[001164] マイコプラズマ希釈剤を準備した。BSCでは、ルアーサンプルポートを介して1つの上清バッグから10.0mLを取り出し、15mLコニカルに入れた。15mLのコニカル「マイコプラズマ希釈液」にラベルを付ける。
LOVO
[001165] LOVOをオンにして、「TIL G-Rex回収」プロトコルを開始し、画面のプ
ロンプトに従った。バッファータイプはPlasmaLyteであった。LOVOタッチスクリーンプロンプトに従った。
[001165] LOVOをオンにして、「TIL G-Rex回収」プロトコルを開始し、画面のプ
ロンプトに従った。バッファータイプはPlasmaLyteであった。LOVOタッチスクリーンプロンプトに従った。
[001166] 最終産物目標量の決定。総有核細胞(TNC)値及び以下の表を使用して、最終産物の標的容量(mL)を決定し記録した。
[001167] LOVOタッチスクリーンプロンプトに従った。
[001168] 使い捨てキットをロードした。使い捨てキットをロードする前に、アルコールワイプ、その後、糸くずの出ないワイプで圧力センサーポートを拭く。使い捨てキットをロードする。使い捨てキットのロードに関する画面の指示に従う。
[001169] ろ過バッグを取り外した。標準のLOVO使い捨てキットがロードされたら、次へボタンに触れた。容器情報及び場所情報画面が表示された。スケールからろ液バッグを取り外した。
ろ液容器は新しいこと及び測定限界であることの確認をした。
[001171] ろ液容量を入力した。既存のろ液バッグのオスルアーにLOVO補助バッグを溶接接続した。全てのクランプが開いており、流路が開いていることを確認した。ろ液容器容量入力欄に触れる。テンキーが表示される。新規合計ろ液容量(5,000mL)を入力する。ボタンに触れ、入力を受諾する。注記:推定ろ過量は5000mLを超えてはならない。
[001171] ろ液容量を入力した。既存のろ液バッグのオスルアーにLOVO補助バッグを溶接接続した。全てのクランプが開いており、流路が開いていることを確認した。ろ液容器容量入力欄に触れる。テンキーが表示される。新規合計ろ液容量(5,000mL)を入力する。ボタンに触れ、入力を受諾する。注記:推定ろ過量は5000mLを超えてはならない。
[001172] ベンチトップにろ液容器を置いた。注記:溶接中にチューブがFクランプから外れた場合、チューブをクランプに戻した。ベンチトップに新規ろ液容器を置いた。重量計#3にろ液バッグを掛けなかった。手順中に秤量計#3は空になる。
[001173] ろ液容器の変更後、LOVOタッチスクリーンのプロンプトに従った。
[001174] キットが正しくロードされたことを確認した。使い捨てキットドライチェックオーバーレイが表示された。キットが適切にロードされ、全てのクランプが開いていることを確認した。全てのチューブにねじれ又は他の障害物がないか確認し、可能であれば直す。キットが正しく取り付けられていることを確認し、全てのロバートクランプを確認した。はいボタンを押した。全てのLOVO臨床クランプが自動的に閉じ、使い捨てキット取り付け確認画面が表示される。LOVOには、キットを確認するために一連の加圧手順が実施された。
[001175] キットチェック結果。キットチェックに合格した場合、次の手順に進んだ。*いいえの場合、チェック完了後に2回目のキットチェックを実行し得た。*いいえの場合、全てのチューブのねじれ又は他の障害物をチェックして直した。*いいえの場合、キットが適切に取り付けられていることを確認し、全てのロバートクランプを確認した。2
回目のキットチェックに失敗した場合:エリア管理に連絡し、セクション10.0の新しいキットのインストールの準備をする。必要なステップ8.13.23~ステップ8.13.30を繰り返す。
回目のキットチェックに失敗した場合:エリア管理に連絡し、セクション10.0の新しいキットのインストールの準備をする。必要なステップ8.13.23~ステップ8.13.30を繰り返す。
[001176] Plasmalyteの接続解決画面が表示された。洗浄値は常に3000mLであるはずである。画面にこの値を入力した。
[001177] Plasmalyteの3000mLバッグを、クランプ1を通過するチューブに滅菌溶接した。IVポールにPlasmalyteのバッグをぶら下げ、バッグの両角のループをフックに取り付けた。
[001178] PlasmaLyteが接続されていることを確認した。全てのプラスチック製クランプを開けた。溶液量の入力が3000mLであったことを確認した。次へボタンに触れた。使い捨てキット準備オーバーレイが表示された。PlasmaLyteが取り付けられ、PlasmaLyteバッグにつながるチューブの全ての溶接部及びプラスチック製のクランプが開いていることを確認し、その後、はいボタンに触れた。
[001179] Plasmalyteが動いていることが観察された。使い捨てキット準備が開始され、使い捨てキット準備中画面が表示される。PlasmaLyteのバッグに接続されたチューブを介して、PlasmaLyteが移動することを視覚的に観察した。流体が動いていない場合、画面上の一時停止ボタンを押して、クランプ又は溶接が依然として閉じているか否かを確認した。問題が解決したら、画面の再開ボタンを押し、使い捨てキット準備を再開した。LOVOタッチスクリーンプロンプトに従った。
[001180] チューブに原料容器を接続した。ステップ8.12.31で準備したLOVO原料バッグを、プロセスノート5.11に従ってクランプSを通過するチューブに滅菌溶接する。クランプからチューブを取り外す必要がある場合があり得た。注記:取り外す場合、原料チューブをSクランプに取り変えることを確認する。
[001181] 原料容器をぶら下げた。原料容器をIVポールにぶら下げ、バッグの両角のループをフックに取り付けた。原料を重量計#1にぶら下げなかった。原料バッグへの全てのクランプを開いた。
[001182] 原料容器が取り付けられていることを検証した。次へボタンに触れた。原料準備オーバーレイが表示された。原料が使い捨てキットに取り付けられ、原料につながるチューブの全ての溶接部及びプラスチック製のクランプが開いていることを確認した。はいボタンに触れた。
[001183] Plasmalyteが動いていたことを確認する。原料準備が開始され、原料準備中画面が表示された。原料バッグに取り付けられたチューブを介して、PlasmaLyteが移動しているのを視覚的に観察した。流体が動いていない場合、画面上の一時停止ボタンを押して、クランプ又は溶接部が依然として閉じているか否かを確認する。問題が解決したら、画面上の再開ボタンを押し、原料準備を再開した。
[001184] 手順画面を開始した。原料の準備が正常に終了すると、手順開始画面が表示される。スタートを押した。スタートを押すと直ちに「前洗浄サイクル1」一時停止画面が表示された。
[001185] インプロセスバッグ内で反転した。重量計#2からインプロセスバッグを取り外し(インプロセストップポートチューブガイドからチューブを取り外すこともできる
)、それを手動で反転させ、使い捨てキットの準備ステップ中に加えた洗浄バッファーがバッグの全内部表面に塗布されるようにした。重量計#2のインプロセスバッグを再びぶら下げた(バックのラベルは左側を向いていた)。チューブガイドのトップポートチューブが外れた場合には交換する。
)、それを手動で反転させ、使い捨てキットの準備ステップ中に加えた洗浄バッファーがバッグの全内部表面に塗布されるようにした。重量計#2のインプロセスバッグを再びぶら下げた(バックのラベルは左側を向いていた)。チューブガイドのトップポートチューブが外れた場合には交換する。
[001186] 原料バッグを反転した。スタートボタンを押す前に、バッグの角を揉み、細胞を静かに撹拌して均質な細胞懸濁液を作成することにより、IVポールからそれを取り外すことなく原料バッグを混合した。再開ボタンを押した。LOVOは原料バッグからの流動を開始し、洗浄サイクル1画面が表示される。
[001187] 原料すすぎ一時停止。原料容器が空になり、LOVOが原料バッグに洗浄バッファーを追加すると、原料すすぎ一時停止画面が表示された。原料バッグをIVポールから取り外すことなく、角を揉んでよく混ぜた。再開を押した。
[001188] インプロセスバッグ混合の一時停止。スピナを通過させる別の細胞を準備するため、インプロセスバッグを洗浄バッファーで希釈した。インプロセスバッグに洗浄バッファーを加えた後、LOVOを自動的に一時停止し、「インプロセスバッグ混合」一時停止画面が表示された。重量計からバッグを取り出さずに、バッグを優しく絞って産物をよく混ぜた。再開を押した。
[001189] インプロセスの角を揉むことの一時停止。インプロセスバッグが空になったら、洗浄バッファーをインプロセスバッグの底部ポートに加え、バッグをすすいだ。すすぎ液を追加した後、LOVOは自動的に一時停止し、「IPの角を揉む」一時停止画面が表示された。「IPの角を揉む」一時停止画面が表示されたら、重量計#2からバッグを取り外さないこと。インプロセスバッグを重量計#2に掛けたまま、バッグの角を揉み、残っている細胞を懸濁液にした。バッグが重量計の上で揺れていないことを確認し、再開ボタンを押した。
[001190] 製品除去画面を待った。LOVO手順の最後に、産物除去画面が表示された。この画面が表示されると、LOVOキットの全てのバッグが操作でき得た。注記:産物除去が表示されるまで、バッグに触れないこと。
[001191] 保持液バッグを取り外した。未透過液バッグのポートに非常に近いチューブに止血剤を入れ、細胞懸濁液がチューブに落ちないようにした。ステップ8.13.48で溶接するのに十分なラインを維持するように、止血剤の下にヒートシールした(プロセスノート5.12に従う)。未透過液バッグを取り外した。
[001192] 製剤のための未透過液バッグを準備した。4インチプラズマ移送セットのメスルアーロックエンドを未透過液バッグに溶接した。未透過液バッグを移した。
[001193] 産物を取り出した。産物除去画面の指示に従った。液体の移動を防ぐため、LOVOキットの全てのクランプを閉じた。
[001194] 産物を取り出した。次へボタンに触れた。全てのLOVO臨床クランプが開放され、キット取外画面が表示された。
[001195] データを記録した。キット除去画面の指示に従った。次へボタンに触れた。全てのLOVO臨床クランプが閉鎖され、結果概要画面が表示される。結果概要画面のデータを記録した。全てのポンプを閉じ、支持剤をろ過した。LOVOから要求されたときにキットを取り外した。記録された時間は全て、LOVOから直接記録された。
最終製剤及び充填
[001196] 標的容積/バッグ計算。下の表DDDから、充填するCS750バッグの数、バッグ毎の目標充填量、バッグ毎に参考品として取り除く量及び上記のLOVO保持液の量に対応するバッグ毎の最終目標量を選択した。
[001196] 標的容積/バッグ計算。下の表DDDから、充填するCS750バッグの数、バッグ毎の目標充填量、バッグ毎に参考品として取り除く量及び上記のLOVO保持液の量に対応するバッグ毎の最終目標量を選択した。
[001197] CRFブランクの準備。空のバッグを作成するためCS-10及びLOVO洗浄バッファーの量を計算した。
[001198] CRFブランクの準備。BSCの外側で、上記で準備したLOVO洗浄バッファーのシリンジを使用して、計算された容積を、ルアー接続を介して空のCS750バッグに追加した。注記:ブランクCS750バッグ製剤は、無菌で行う必要はない。適切なサイズのシリンジを使用して、計算したCS-10の容積を上記で準備した同じCS750バッグに追加した。CS750バッグに赤いキャップを付けた。CS-750バッグから可能な限り多くの空気を取り除いた。CS750バッグをできる限りバッグに近づけてヒートシールし、チューブを取り外した。CS750バッグに「CRFブランク」、ロット番号及び初期/日付のラベルを付ける。CRFに置くまで、CRFブランクをコールドパックの上に置いた。
[001199] IL-2の必要量を計算した。最終産物に追加するIL-2の量を計算した。
[001200] 接続装置を組み立てた。4S-4M60をCC2セルコネクトに滅菌溶接し、セルコネクト装置の単一スパイクを4S-4M60マニホールドの4スパイク端に置き換えた。
[001201] 接続された装置を組み立てた。CS750クライオバッグを上記で準備したハーネスに滅菌溶接し、4つのオスルアーエンド(E)の1つを各バッグに交換した。4S-4M60のスパイクにCS-10バッグを溶接した(プロセスノート5.11に従う)。2
~8℃に調整された2つのコールドパック間にバッグを置くことによりCS-10を低温に保った。
~8℃に調整された2つのコールドパック間にバッグを置くことによりCS-10を低温に保った。
[001202] IL-2を保持するTILを準備した。適切なサイズのシリンジを使用して、「IL-2 6×104」アリコートから上記で決定した量のIL-2を取り除いた。ルアー接続を介して上記で準備した未透過液バッグにシリンジを接続し、IL-2を注入する。シリンジからラインを通して空気を押してラインをクリアする。
[001203] 製剤化されたTILバッグをラベル付けした。移送セットのクランプを閉じ、「製剤化TIL」としてバッグにラベルを付け、バッグをBSCから取り出した。
[001204] 製剤化されたTILバッグを装置に追加した。IL-2を追加したら直ちに「製剤化TIL」バッグを装置の残りのスパイクに溶接した。
[001205] CS10を追加した。組み立てられた装置を、付属の製剤化TIL、CS-750バッグ及びCS-10と共にBSCに移した。注記:CS-10バッグ及び全てのCS-750バッグは、2℃~8℃で事前調整された2つのコールドパック間に置かれた。製剤化TILバッグをコールドパック上に置かなかった。装置の全てのクランプが閉じていることを確認した。活栓を回し、シリンジを閉じた。
[001206] シリンジの交換。約10mLの空気を100mLシリンジに引き込み、装置の60mLシリンジと交換した。
[001207] CS10を追加した。CS750バッグへのラインが閉じるように活栓を回した。CS-10バッグのクランプを開き、上記で計算した容積をシリンジに引いた。注
記:適切な容量のCS-10を追加するには、複数のシリンジが使用される。CS-10のクランプを閉じ、製剤化TILバッグのクランプを開いて、CS-10を追加する。およそ10.0mL/分で最初の10.0mLのCS10を追加する。残りのCS-10をおよそ1.0mL/秒の速度で追加する。注記:複数のシリンジを使用して、CS-10の適切な量を追加した。時間を記録した。注記:CS-10の最初の追加から凍結の開始までの目標時間は30分である。各CS10追加の容量と追加された合計容量を記録した。CS10バッグの全てのクランプを閉じた。
記:適切な容量のCS-10を追加するには、複数のシリンジが使用される。CS-10のクランプを閉じ、製剤化TILバッグのクランプを開いて、CS-10を追加する。およそ10.0mL/分で最初の10.0mLのCS10を追加する。残りのCS-10をおよそ1.0mL/秒の速度で追加する。注記:複数のシリンジを使用して、CS-10の適切な量を追加した。時間を記録した。注記:CS-10の最初の追加から凍結の開始までの目標時間は30分である。各CS10追加の容量と追加された合計容量を記録した。CS10バッグの全てのクランプを閉じた。
[001208] CS-750バッグを準備した。活栓を回し、シリンジを開けた。製剤化TILバッグのクランプを開き、懸濁液が活栓に達する直前に懸濁液を引いた。製剤化TILバッグのクランプを閉じた。空のCS750最終産物バッグが開くように活栓を回した。新しいシリンジを使用して、空気を抜いてCS750最終産物バッグから可能な限り多くの空気を取り除いた。シリンジのプランジャーに圧力をかけながら、バッグを締めて閉じた。約20mLの空気を新しい100mLシリンジに引き込み、装置に接続する。注記:製剤化TIL懸濁液を低温に保つために、各CS750最終産物バッグは2つのコールドパック間にある必要がある。
[001209] 細胞を分注した。最終産物バッグへのラインが閉じられるように活栓を回した。上記で計算された量を、製剤化TILバッグからシリンジに引き込んだ。注記:複数のシリンジを使用して、正しい量を得ることができた。製剤化されたTILバッグへのラインが閉じられるように活栓を回した。一度に1つの最終産物バッグで作業し、細胞を最終産物バッグに分注した。上記の各CS750バッグに追加された細胞の量を記録した。細胞がスパイクポートの上部に均一であるようにシリンジから空気でラインをクリアした。満たされたバッグのクランプを閉じた。最終産物バッグ毎に手順を繰り返し、それぞれの間に製剤化TILバッグを静かに混合した。以下の各最終産物バッグに入れられたTILの量を記録した。
[001210] 最終産物バッグから空気を取り除き、参考品を保持した。最後の最終産物バッグが満たされたら、全てのクランプを閉じた。10mLの空気を新しい100mLシリンジに引き込み、装置のシリンジと交換する。一度に1つのバッグを操作し、各産物バッグから全ての空気と、上記で決定した参考のための製品の容積を引き出した。注記:サンプル量を取り除いたら、シリンジを逆さにし空気を利用して、産物バッグの上部ポートのラインをクリアにした。保持容量と空気が除去されたら、ラインをバッグにクランプした。
[001211] 各バッグからの参考品の容積を記録した。
[001212] 分配された参考品。50mLのコニカルチューブに参考品を分配し、チューブに「参考品」及びロット番号を表示した。バッグ毎に繰り返す。
[001213] 凍結保存のための最終産物を準備した。止血剤を使用して、バッグの近くでラインをクランプした。シリンジ及びシリンジが装着されていた装置の赤いキャップのルアー接続を取り除いた。BSCから装置を移した。Fでヒートシール(プロセスノート5.12に従って)し、空の未透過液バッグ及びCS-10バッグを取り外した。注記:装置上のシリンジのルアー接続を保持した。空の未透過液及びCS-10バッグを廃棄した。
[001214] 最終産物バッグをレベル付けした。以下の最終産物ラベルのサンプルを添付した。
[001215] 凍結保存のための最終産物を準備した。凍結保存するまで、コールドパック又は2~8℃でクライオバッグを保持した。
[001216] 細胞カウントサンプルを取り出した。適切なサイズのピペットを使用して、上記で取り出された参考品2.0mLを取り出し、15mLコニカルチューブに入れて細胞数を測定した。
[001217] セルカウントを実行した。NC-200使用して、細胞カウント及び計算を実行した。注記:1つのサンプルのみを適切な希釈に希釈して、希釈が十分であることを確認する。追加のサンプルを適切な希釈係数に希釈し、カウントを続行する。細胞カウントサンプル体積を記録した。注記:希釈が不要な場合、「サンプル[μL]」=200、「希釈[μL]」=0。生存細胞濃度の平均と実行された細胞カウントの生存率とを決定した。
[001218] フローサイトメトリーのサンプルを計算した。フローサイトメトリーのサンプリングに十分な細胞濃度を確保するために計算を実行した。
[001219] IFN-γを計算した。IFN-γサンプリングに十分な細胞濃度を確保するためにサンプルの計算を実行した。
[001220] ヒートシールした。サンプル量が決定されたら、最終産物バッグを可能な限りバッグの近くにヒートシールして、装置から取り出す。
[001221] マイコプラズマサンプルについては、上記の無菌及びBacTのテストサンプリングからの「マイコプラズマ希釈液」とラベル付けされた15mLのコニカルに製剤化細胞懸濁液量を追加する。BSCでは、適切なサイズのシリンジを使用して上記で参考品として収集した細胞懸濁液から1.0mLのサンプルを取り出し、嫌気性ボトルに播種する。好気性ボトルについて上記を繰り返す。
[001222] サンプルのラベルを付け及び保存した。サンプルプラン在庫ラベルと全てのサンプルにラベルを付け、移すまで適切に保管する。最終産物及びサンプルの凍結保存の次のステップに進んだ。
最終産物の凍結保存
[001223] 制御速度冷凍庫を準備した。凍結する前にCRFがセットアップされたことを確認した。CRF機器を記録した。凍結保存が実行される。
[001223] 制御速度冷凍庫を準備した。凍結する前にCRFがセットアップされたことを確認した。CRF機器を記録した。凍結保存が実行される。
[001224] CRFプローブをセットアップする。CRFブランクバッグのセプタムに穴を開けた。6mLバイアル温度プローブを挿入した。
[001225] 最終産物とサンプルをCRFに入れた。ブランクバッグを事前調整済みカセットに入れ、CRFラックのおよそ中央に移した。最終産物カセットをCRFラックに移し、バイアルをCRFバイアルラックに移した。製品ラック及びバイアルラックをCRFに移した。産物がCRFに移された時間及びチャンバー温度を記録した。
[001226] 4℃±1.5℃に達し、CRFの実行を続行するのに必要な時間を決定した。チャンバーの温度が4℃±1.5℃に達したら実行を開始した。時間を記録した。
[001227] 完了し、保存した。実施完了後にCRFを停止した。CRFからカセット及びバイアルを取り出す。カセット及びバイアルを保管のために気相LN2に移した。
実施例17:治療活性が強化された腫瘍抗原特異的T細胞について濃縮されたTIL産物の生成
[001228] 目標:治療活性が強化された腫瘍抗原特異的T細胞について濃縮されたTIL産物を生成すること。
[001228] 目標:治療活性が強化された腫瘍抗原特異的T細胞について濃縮されたTIL産物を生成すること。
背景:
[001229] 悪性病変に関連するT細胞は通常、機能不全であり、腫瘍の成長を制御/防止することができない(Schietinger et al.Immunity 2016)。この実施例における全て
の参考文献は、全ての目的のために、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
[001229] 悪性病変に関連するT細胞は通常、機能不全であり、腫瘍の成長を制御/防止することができない(Schietinger et al.Immunity 2016)。この実施例における全て
の参考文献は、全ての目的のために、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
[001230] 腫瘍浸潤リンパ球(TIL)は、エクスビボで抽出、活性化及び増殖させることができ、インビボ再注入時に効率的な抗腫瘍応答を誘発する(Rosenberg et al.Clin
Cancer Res 2011)。転移性黒色腫に罹患した患者で最初に実証された養子細胞移入アプローチは、追加の固形腫瘍組織で試験されている。黒色腫及び頭頸部並びに子宮頸がんにおけるTIL療法の臨床的活性化が報告されている(SITC、2017)。したがって、腫瘍特異的TILは、抑制性腫瘍微小環境から救出され、腫瘍を効率的に標的化するために十分な数まで再調整及び/又は増幅することができる。
Cancer Res 2011)。転移性黒色腫に罹患した患者で最初に実証された養子細胞移入アプローチは、追加の固形腫瘍組織で試験されている。黒色腫及び頭頸部並びに子宮頸がんにおけるTIL療法の臨床的活性化が報告されている(SITC、2017)。したがって、腫瘍特異的TILは、抑制性腫瘍微小環境から救出され、腫瘍を効率的に標的化するために十分な数まで再調整及び/又は増幅することができる。
[001231] TIL臨床試験のレトロスペクティブ分析は、頑強な増殖能力及び生存能力を備えた低分化型腫瘍反応性T細胞が、エフェクター及びエフェクターメモリーT細胞と比較して優れた抗腫瘍効果をもたらし、次世代のTIL産物は、低分化型T細胞が一貫して高いレベルで構成されるべきであることを示唆する(Klebanoff et al.J Immunother 2012)。
[001232] ステムメモリーT細胞(TSCM)は、抗原経験のあるセントラルメモリーT細胞の初期の前駆細胞であり、幹細胞を定義する長期生存、自己再生及び多能性能力を示し、したがって、効果的なTIL産物の生成に最も望ましいと考えられている。TSCMは、養子細胞移入のマウスモデルで他のT細胞サブセットと比較して強化された抗腫瘍活性を示している(Gattinoni et al. Nat Med 2009, 2011;Gattinoni, Nature Rev. Cancer, 2012;Cieri et al. Blood 2013)。
[001233] 最適な抗腫瘍活性を確実にするために、TIL組成をTSCMの高い割合に偏らせる戦略が必要である。
[001234] 抗原経験のあるT細胞の若返りは、人工多能性幹細胞(iPSC)技術を用いて開発された再プログラミングツールを使用して達成された(Nishimura et al. Cell Stem Cell 2012; Vizcardo et al. Cell Stem Cell 2012)。このアプローチでは、腫瘍
を治癒するために最も適したT細胞集団へのiPSCのエクスビボでの更なる分化が必要であり、これは、元のT細胞受容体(TCR)レパートリーを制限する傾向のある長い2ステップのプロセスになる。材料の細胞内送達のためのインビトロ及びインビボ送達の戦略に関するStewart, et al. 538:183-192 (2016)も参照されたい。
を治癒するために最も適したT細胞集団へのiPSCのエクスビボでの更なる分化が必要であり、これは、元のT細胞受容体(TCR)レパートリーを制限する傾向のある長い2ステップのプロセスになる。材料の細胞内送達のためのインビトロ及びインビボ送達の戦略に関するStewart, et al. 538:183-192 (2016)も参照されたい。
[001235] Wnt、NOTCH及びMybを含むシグナル伝達経路は、ナイーブT細胞及び/又は抗原経験のあるT細胞から直接TSCM様細胞の生成をサポートすることが示されている(Gattinoni et al. Nat Med 2009、Kondo et al. Nat Comm 2017、Gautam et
al. SITC 2017)。
al. SITC 2017)。
[001236] 細胞運命の再プログラミングは、適切な転写因子(TFs)への一過性の曝露を必要とする。TILの場合、腫瘍由来のTCRレパートリーを保存するために、この曝露はT細胞の大部分を標的にする必要がある。
[001237] SQZベクターを含まないマイクロ流体プラットフォームは、高度な細胞内送達戦略を表している。それは、T細胞を含む様々な初代ヒト細胞に転写因子を含むタンパク質を送達する能力を実証している(Sharei et al. PNAS 2013並びにSharei et al. PLOS ONE 2015及びGreisbeck et al. The J of Immunology vol.195, 2015)。国際公開第2013/059343A1号、国際公開第2017/008063A1号及び国際公開第2017/123663A1号(これらの全ては、その全体が参照により本明細書に組み込まれる)も参照されたい。国際公開第2013/059343A1号、国際公開第2017/008063A1号及び国際公開第2017/123663A1号に記載されるそのような方法は、転写因子(TF)及び/又は一過性のタンパク質発現を誘導することができる他の分子にTIL集団を曝露するために、本発明と共に使用することができ、ここで、TF及び/又は一過性のタンパク質発現を誘導することができる他の分子は、腫瘍抗原の増加した発現及び/又はTIL集団における腫瘍抗原特異的T細胞の数の増加を提供し、したがって、TIL集団の再プログラミング及び再プログラミングされたTIL集団の治療効果の再プログラミングされていないTIL集団と比較した増加をもたらす。
戦略:
[001238] SQZ細胞内TFタンパク質送達技術を使用して、治療活性を強化された腫瘍抗原特異的T細胞について濃縮されたTIL産物を生成するための様々な再プログラミング戦略の能力を比較することが提案されている。
[001238] SQZ細胞内TFタンパク質送達技術を使用して、治療活性を強化された腫瘍抗原特異的T細胞について濃縮されたTIL産物を生成するための様々な再プログラミング戦略の能力を比較することが提案されている。
[001239] 以下のポイント/質問を含む作業計画:
1.腫瘍の種類
・黒色腫
2.最適な送達条件
・SQZヒトT細胞最適化プロトコル+追加条件
・送達効率のモニター
3.TFの選択
・TCF-1
・NOTCH1/2 ICD
・MYB
・+/-以前のiPSCカクテルで「完全な」再プログラミング?
4.TILを標的とする活性化/拡大培養ステージ
・REP0日目
・その他?
5.再プログラミングの速度論
・7日目、11日目、14日目、18日目…
6.標的とするTILサブセット
・最初のバルク
・後で比較するために分類分けした個々のサブセット(TCM、TEM、TEFF、TEMRA)。
7.培養培地への追加因子の必要性
・IL7
・RSPO3/WNT3A
・その他?
8.読み出し
・プレ及びポストREP TIL拡大培養表現型解析(修飾された?)パネル1、2及び3
・ポストREP TILエフェクター機能評価(サイトカイン及び/又は活性化マーカー産生アッセイ)
・ポストREP TIL腫瘍応答性評価(自己腫瘍細胞共培養アッセイ)
・TCRレパートリー分析(フローサイトメトリー及び/又はRNA-seq)
・タツノオトシゴなどの生細胞代謝アッセイ
・他の考慮事項
1.タンパク質TF産生
2.腫瘍の入手
3.物流管理(細胞の出荷)
1.腫瘍の種類
・黒色腫
2.最適な送達条件
・SQZヒトT細胞最適化プロトコル+追加条件
・送達効率のモニター
3.TFの選択
・TCF-1
・NOTCH1/2 ICD
・MYB
・+/-以前のiPSCカクテルで「完全な」再プログラミング?
4.TILを標的とする活性化/拡大培養ステージ
・REP0日目
・その他?
5.再プログラミングの速度論
・7日目、11日目、14日目、18日目…
6.標的とするTILサブセット
・最初のバルク
・後で比較するために分類分けした個々のサブセット(TCM、TEM、TEFF、TEMRA)。
7.培養培地への追加因子の必要性
・IL7
・RSPO3/WNT3A
・その他?
8.読み出し
・プレ及びポストREP TIL拡大培養表現型解析(修飾された?)パネル1、2及び3
・ポストREP TILエフェクター機能評価(サイトカイン及び/又は活性化マーカー産生アッセイ)
・ポストREP TIL腫瘍応答性評価(自己腫瘍細胞共培養アッセイ)
・TCRレパートリー分析(フローサイトメトリー及び/又はRNA-seq)
・タツノオトシゴなどの生細胞代謝アッセイ
・他の考慮事項
1.タンパク質TF産生
2.腫瘍の入手
3.物流管理(細胞の出荷)
実施例18:凍結保存プロセス
[001240] この実施例では、CryoMed Controlled Rate Freezer、Model 7454(Thermo Scientific)を使用して、実施例16で説明した短縮閉鎖手順で調製したTILの凍結保存プロセス方法について説明する。
[001240] この実施例では、CryoMed Controlled Rate Freezer、Model 7454(Thermo Scientific)を使用して、実施例16で説明した短縮閉鎖手順で調製したTILの凍結保存プロセス方法について説明する。
[001241] 使用した機器は、アルミニウム製カセットホルダーラック(CS750冷凍バッグと互換性あり)、750mLバッグのための低温保存カセット、低圧(22psi)液体窒素タンク、冷蔵庫、熱電対センサー(バッグのためのリボンタイプ)及びCryoStore CS750凍結バッグ(OriGen Scientific)であった。
[001242] 凍結プロセスは、核形成から-20℃まで0.5℃の速度及び最終温度-80℃まで1分間に1℃の冷却速度を提供する。プログラムパラメーターは、以下の通りである:ステップ1-4℃で待機;ステップ2:1.0℃/分(サンプル温度)から-4℃;ステップ3:20.0℃/分(チャンバー温度)から-45℃;ステップ4:10.0℃/分(チャンバー温度)から-10.0℃;ステップ5:0.5℃/分(チャンバー温度)から-20℃;及びステップ6:1.0℃/分(サンプル温度)から-80℃。
[001243] この実施例の手順の描写を、実施例16のプロセスと組み合わせて提供される。
実施例19:治療活性が強化された腫瘍抗原特異的T細胞について濃縮されたTIL産物の生成手順
段階1a:効率的及び特異的サイレンシングのための1つの検証済みsd-RNAfmの調達
[001244] 最初の段階では、以下の3つの遺伝子:PD-1(PDCD1とも呼ばれる)、TIM3及びCBLBを効率的且つ特異的サイレンシングのために、1つの検証済みsd-RNAfmを調達する。
段階1b:LAG3及びCISHの強力なサイレンシングのための配列の同定
段階1a:効率的及び特異的サイレンシングのための1つの検証済みsd-RNAfmの調達
[001244] 最初の段階では、以下の3つの遺伝子:PD-1(PDCD1とも呼ばれる)、TIM3及びCBLBを効率的且つ特異的サイレンシングのために、1つの検証済みsd-RNAfmを調達する。
段階1b:LAG3及びCISHの強力なサイレンシングのための配列の同定
[001245] 新しい標的のために最大20のsd-RNAが設計される。遺伝子サイレンシングは、外因性標的のヒーラ細胞及び内因性標的の活性化された初代T細胞で評価される。PD-1及びLAG-3を含めた発現レベルを80%より多く低減する対象の遺伝子毎に1つから2つのリードが選択される。選択されたsd-RNAの完全に修飾されたバージョンが生成される。
[001246] 1つから2つのLAG3及びCISH特異的sd-RNAfmが生成されることが予想される。標的遺伝子毎に2つの標的RNAが好ましい。
段階2:プレREP TILにおけるsd-RNA媒介遺伝子サイレンシングの検証。
[001247] sd-RNA標的(PD-1、TIM3、CBLB、LAG3及びCISHを含む)を検証するために、最大6つの凍結黒色腫/他のプレREPラインが使用される。条件は、sd-RNA濃度、解凍後のタイミング、反復/逐次送達及び培養条件を試験する。読み出しは、フロー及び/又はqPCRにより評価された遺伝子サイレンシングの割合である。TILの成長及び経時的なサイレンシングの持続性についてのRNA送達の影響は、TILの拡大培養することにより評価される。
[001247] sd-RNA標的(PD-1、TIM3、CBLB、LAG3及びCISHを含む)を検証するために、最大6つの凍結黒色腫/他のプレREPラインが使用される。条件は、sd-RNA濃度、解凍後のタイミング、反復/逐次送達及び培養条件を試験する。読み出しは、フロー及び/又はqPCRにより評価された遺伝子サイレンシングの割合である。TILの成長及び経時的なサイレンシングの持続性についてのRNA送達の影響は、TILの拡大培養することにより評価される。
[001248] REP回収後24時間で80%のサイレンシングがリードで得られることが予想される。総細胞数は未処置対照の10%以内である。
段階3:プロセス2Aへのsd-RNA媒介遺伝子サイレンシングの実施。
[001249] 遺伝子サイレンシングは、3~6の研究スケールの新鮮なTIL調製物で最適化される。条件は、sd-RNA濃度、タイミング、反復/逐次送達及び培養条件を試験する。読み出しは、フロー及び/又はqPCRにより評価されたポストREP TILにおける遺伝子サイレンシングの割合である。TIL表現型及び機能に対する遺伝子サイレンシングの影響は、フローサイトメトリーアッセイを使用して評価される。効果の特異性(例えば、潜在的なオフターゲットサイレンシングの範囲と影響)を検証するために、任意選択によるレスキュー実験及び/又は遺伝子発現分析が行われた。今後の作業のために、少なくとも2つの標的/sd-RNAペアが選択される。その後、TIL表現型が特徴付けられる。対照TIL活性と同等以上の非特異的及び特異的なTIL活性を評価し、
最適な標的/sd-RNAを決定する。
[001249] 遺伝子サイレンシングは、3~6の研究スケールの新鮮なTIL調製物で最適化される。条件は、sd-RNA濃度、タイミング、反復/逐次送達及び培養条件を試験する。読み出しは、フロー及び/又はqPCRにより評価されたポストREP TILにおける遺伝子サイレンシングの割合である。TIL表現型及び機能に対する遺伝子サイレンシングの影響は、フローサイトメトリーアッセイを使用して評価される。効果の特異性(例えば、潜在的なオフターゲットサイレンシングの範囲と影響)を検証するために、任意選択によるレスキュー実験及び/又は遺伝子発現分析が行われた。今後の作業のために、少なくとも2つの標的/sd-RNAペアが選択される。その後、TIL表現型が特徴付けられる。対照TIL活性と同等以上の非特異的及び特異的なTIL活性を評価し、
最適な標的/sd-RNAを決定する。
段階4:フルスケールのTIL調製への最適化されたサイレンシングプロトコルの実施。標的遺伝子毎に1つのフルスケールのTIL調製を行う。発売に必要な製品に加えて、段階3で定義された新しい特徴を持つTIL産物が開発される。
実施例20:例示的なSD-RNAの調製及び使用
sd-RNAの設計
[001250] およそ2~20のsd-RNA配列が所定の標的に対して生成される。場合により、sd-RNA配列は、500を超えるsd-RNA配列の機能的スクリーニングに基づいて設計された選択アルゴリズム(Advirna LLCから市販される、マサチューセッツ州ウースター、米国)に基づいて選択される。回帰分析を使用して、特定のヌクレオチドの出現頻度と、sd-RNA二重鎖の任意の特定の位置における修飾及び遺伝子抑制アッセイにおけるその機能性との間の相関関係を確立する。選択された配列は、0.2μmoleスケールで、商業的に合成され(例えば、TriLink Biotechnologiesに
よって)、注射のための滅菌RNase、DNaseフリーの水に溶解される(CalBiochemから市販される、4.86505)。二重鎖は、95℃で5分間加熱し、室温まで徐々に冷却することでアニールできる。
sd-RNAの設計
[001250] およそ2~20のsd-RNA配列が所定の標的に対して生成される。場合により、sd-RNA配列は、500を超えるsd-RNA配列の機能的スクリーニングに基づいて設計された選択アルゴリズム(Advirna LLCから市販される、マサチューセッツ州ウースター、米国)に基づいて選択される。回帰分析を使用して、特定のヌクレオチドの出現頻度と、sd-RNA二重鎖の任意の特定の位置における修飾及び遺伝子抑制アッセイにおけるその機能性との間の相関関係を確立する。選択された配列は、0.2μmoleスケールで、商業的に合成され(例えば、TriLink Biotechnologiesに
よって)、注射のための滅菌RNase、DNaseフリーの水に溶解される(CalBiochemから市販される、4.86505)。二重鎖は、95℃で5分間加熱し、室温まで徐々に冷却することでアニールできる。
sd-RNA直接送達(受動的取り込み)
[001251] 本明細書に記載されているsd-RNA標的遺伝子を含むオリゴヌクレオチドは、無血清培地で希釈し、3回、96ウェル培養プレートに分注することができる。細胞は、指示された時間にわたり、予め希釈された化合物を含むプレートに還元型FBSを含む適切な培養培地に播種することができる。ヒーラ細胞は、10,000細胞/ウェルの3%FBSを含むEMEM培地でトランスフェクトできる。初代ヒトT細胞(AllCells、カリフォルニア州)は、500IU/ml IL2(ProSpec)を含むAIM-V(Gibco)
完全培地で培養できる。細胞は、トランスフェクション前の少なくとも4日間、製造元の取扱説明書に従って抗CD3/CD28ダイナビーズ(Gibco、11131)で活性化することができる。T細胞は、特に明記されていない限り、ダイナビーズを取り出さずに100,000細胞/ウェルの5%FBSでトランスフェクトできる。トランスフェクション効率を確認するために、オリンパスBX-60顕微鏡を使用して、Cy3結合sd-RNAをトランスフェクトした生細胞から蛍光画像を入手できる。核染色は、トランスフェクトした細胞に添加したHoechst 33342(Molecular Probes、H1398)を30分間使用し、画像処理することにより入手できる。
[001251] 本明細書に記載されているsd-RNA標的遺伝子を含むオリゴヌクレオチドは、無血清培地で希釈し、3回、96ウェル培養プレートに分注することができる。細胞は、指示された時間にわたり、予め希釈された化合物を含むプレートに還元型FBSを含む適切な培養培地に播種することができる。ヒーラ細胞は、10,000細胞/ウェルの3%FBSを含むEMEM培地でトランスフェクトできる。初代ヒトT細胞(AllCells、カリフォルニア州)は、500IU/ml IL2(ProSpec)を含むAIM-V(Gibco)
完全培地で培養できる。細胞は、トランスフェクション前の少なくとも4日間、製造元の取扱説明書に従って抗CD3/CD28ダイナビーズ(Gibco、11131)で活性化することができる。T細胞は、特に明記されていない限り、ダイナビーズを取り出さずに100,000細胞/ウェルの5%FBSでトランスフェクトできる。トランスフェクション効率を確認するために、オリンパスBX-60顕微鏡を使用して、Cy3結合sd-RNAをトランスフェクトした生細胞から蛍光画像を入手できる。核染色は、トランスフェクトした細胞に添加したHoechst 33342(Molecular Probes、H1398)を30分間使用し、画像処理することにより入手できる。
リードsd-RNA化合物の同定
[001252] 実施例18に記載のリードは、このプロトコルを使用して識別できる。ルシフェラーゼレポータープラスミドは、PDCD1標的領域をpsiCheck2プラスミド(Promega、C8021)下流ウミシイタケ(Renilla)ルシフェラーゼ配列に挿入すること
により構築することができる。比較のために、以前に検証されたMAP4K4 sd-RNA配列をポジティブコントロールとして挿入できる。
[001252] 実施例18に記載のリードは、このプロトコルを使用して識別できる。ルシフェラーゼレポータープラスミドは、PDCD1標的領域をpsiCheck2プラスミド(Promega、C8021)下流ウミシイタケ(Renilla)ルシフェラーゼ配列に挿入すること
により構築することができる。比較のために、以前に検証されたMAP4K4 sd-RNA配列をポジティブコントロールとして挿入できる。
[001253] スクリーニングのために、ヒーラ細胞を製造元の取扱説明書に従い、Fugene
HD(Promega、E2311)を使用しクローン化されたプラスミドでトランスフェクトすることができる。簡単に言えば、抗生物質を含まないEMEM(ATCC、30-2003)培地に2.5×106細胞/10cm2390ディッシュで細胞を播種することができ、6時間後に2.5:1のFuGENE:DNA比率でプラスミドをトランスフェクトする。細胞を16~18時間インキュベートすることができ、PBSで3回洗浄し、トリプシン処理し、3%FBSを含む最終濃度1μM sd-RNA/10,000細胞/100μlEMEMで希釈したsd-RNA化合物を96ウェルプレートに播種する。細胞を48
時間sd-RNAで処置することができ、化合物の受動的な細胞取り込みを促進し、Glo溶解バッファー(Promega、E266A)で溶解し、ウミシイタケルシフェラーゼ(Renilla)及びホタルルシフェラーゼ(Firefly luciferase)発現をアッセイできる。そのために、各溶解物の20μlアリコートを二重の不透明96ウェルプレートに加え、Matthews(ウミシイタケ(Renilla))アッセイバッファー59 397又はホタルル
シフェラーゼ398アッセイバッファー(25mMグリシルグリシン、15mM MgSO4、4mM EGTA、1mM DTT、2mM ATP、15 mM 399 K2PO4、pH7.8及び1 mM D-ルシフェリン)と混合した。使用直前に、基質D-ルシフェリン(Promega、E1605)及びh-セレンテラジン(NanoLight、301)を加えた。発光はSpectraMax i3(Molecular Devices)で測定し、正規化(ウミシイタケ(Renilla)/ホタル(Firefly))し、未処置対照のパーセントとして表すことができる。
HD(Promega、E2311)を使用しクローン化されたプラスミドでトランスフェクトすることができる。簡単に言えば、抗生物質を含まないEMEM(ATCC、30-2003)培地に2.5×106細胞/10cm2390ディッシュで細胞を播種することができ、6時間後に2.5:1のFuGENE:DNA比率でプラスミドをトランスフェクトする。細胞を16~18時間インキュベートすることができ、PBSで3回洗浄し、トリプシン処理し、3%FBSを含む最終濃度1μM sd-RNA/10,000細胞/100μlEMEMで希釈したsd-RNA化合物を96ウェルプレートに播種する。細胞を48
時間sd-RNAで処置することができ、化合物の受動的な細胞取り込みを促進し、Glo溶解バッファー(Promega、E266A)で溶解し、ウミシイタケルシフェラーゼ(Renilla)及びホタルルシフェラーゼ(Firefly luciferase)発現をアッセイできる。そのために、各溶解物の20μlアリコートを二重の不透明96ウェルプレートに加え、Matthews(ウミシイタケ(Renilla))アッセイバッファー59 397又はホタルル
シフェラーゼ398アッセイバッファー(25mMグリシルグリシン、15mM MgSO4、4mM EGTA、1mM DTT、2mM ATP、15 mM 399 K2PO4、pH7.8及び1 mM D-ルシフェリン)と混合した。使用直前に、基質D-ルシフェリン(Promega、E1605)及びh-セレンテラジン(NanoLight、301)を加えた。発光はSpectraMax i3(Molecular Devices)で測定し、正規化(ウミシイタケ(Renilla)/ホタル(Firefly))し、未処置対照のパーセントとして表すことができる。
qPCRによるmRNAの定量
[001254] メーカーの推奨に従い、PureLinkTM Pro96精製キット(Invitrogen、12173-011A)を使用して、トランスフェクトされた細胞から総RNAを分離することができる。1:5及び1:25のトランスフェクトされていない(NT)細胞の希釈液を標準曲線作成について調製できる。20~40ngの精製RNAをQuanta qScript RT-qPCR ToughMix(VWR、89236672)及びTaqmanプローブ-PDCD1-FAM(Taqman、Hs
01550088_m1)並びにGAPDH-VIC(Applied Biosystems、4326317E)
と同じ反応で混合して、ワンステップマルチプレックスqPCR 407で遺伝子発現を分析した。サンプルは、StepOnePlus qPCR機器(Applied Biosystems)でQuantaの推奨設定を使用して増幅することができる。PDCD1の発現は、GAPDHに正規化し、標準曲線に合わせて調整し、非標的対照(NTC)トランスフェクト細胞のパーセントとして表すことができる。
[001254] メーカーの推奨に従い、PureLinkTM Pro96精製キット(Invitrogen、12173-011A)を使用して、トランスフェクトされた細胞から総RNAを分離することができる。1:5及び1:25のトランスフェクトされていない(NT)細胞の希釈液を標準曲線作成について調製できる。20~40ngの精製RNAをQuanta qScript RT-qPCR ToughMix(VWR、89236672)及びTaqmanプローブ-PDCD1-FAM(Taqman、Hs
01550088_m1)並びにGAPDH-VIC(Applied Biosystems、4326317E)
と同じ反応で混合して、ワンステップマルチプレックスqPCR 407で遺伝子発現を分析した。サンプルは、StepOnePlus qPCR機器(Applied Biosystems)でQuantaの推奨設定を使用して増幅することができる。PDCD1の発現は、GAPDHに正規化し、標準曲線に合わせて調整し、非標的対照(NTC)トランスフェクト細胞のパーセントとして表すことができる。
細胞生存率アッセイ
[001255] 本発明による拡大培養されたTILは、様々な用量のsd-RNAオリゴヌクレオチドで72時間トランスフェクトされ得る。細胞を洗浄し、1:10に希釈したCellTiter-Blue試薬(Promega、G808A)と37℃で1時間インキュベートした。プレ
ートを室温に戻し、蛍光を530nm ex/590nm emで記録した。同一条件で2倍細胞希釈液を4系列プレーティングし、蛍光測定値をプロットすることで、直線範囲を確認できる。
[001255] 本発明による拡大培養されたTILは、様々な用量のsd-RNAオリゴヌクレオチドで72時間トランスフェクトされ得る。細胞を洗浄し、1:10に希釈したCellTiter-Blue試薬(Promega、G808A)と37℃で1時間インキュベートした。プレ
ートを室温に戻し、蛍光を530nm ex/590nm emで記録した。同一条件で2倍細胞希釈液を4系列プレーティングし、蛍光測定値をプロットすることで、直線範囲を確認できる。
腫瘍浸潤リンパ球の分離
[001256] 本明細書に記載されるように、腫瘍浸潤リンパ球は、例えば、図8及び図14に概説されるように調製することができる。
[001256] 本明細書に記載されるように、腫瘍浸潤リンパ球は、例えば、図8及び図14に概説されるように調製することができる。
TIL拡大培養
[001257] 本明細書に記載されるように、TILをフラスコに播種し、第1及び/又は第2の拡大培養ステップを行うことができる。第1の拡大培養中、例えばステップb、第1の拡大培養後、例えばステップC中、第2の拡大培養前又はその間、例えばステップD前又はその間、ステップD後且つステップEにおける回収前、ステップFの回収中又はその後、ステップFの最終的な製剤化及び/又は輸注バッグへの移動前又はその間及びステップFのいずれかの任意選択による凍結保存ステップ前にsd-RNAを添加することができる。更に、sd-RNAは、ステップFの任意の凍結保存ステップから解凍した後に添加することができる。
[001257] 本明細書に記載されるように、TILをフラスコに播種し、第1及び/又は第2の拡大培養ステップを行うことができる。第1の拡大培養中、例えばステップb、第1の拡大培養後、例えばステップC中、第2の拡大培養前又はその間、例えばステップD前又はその間、ステップD後且つステップEにおける回収前、ステップFの回収中又はその後、ステップFの最終的な製剤化及び/又は輸注バッグへの移動前又はその間及びステップFのいずれかの任意選択による凍結保存ステップ前にsd-RNAを添加することができる。更に、sd-RNAは、ステップFの任意の凍結保存ステップから解凍した後に添加することができる。
チミジン組み込みアッセイ
[001258] TILサンプルは、拡大培養ステップのいずれかで回収でき、2%ヒトAB
血清を補充したCellGro培地の96ウェルプレート(104 443細胞/ウェル)に3
回播種できる。1時間後、1μCi/ウェルの[メチル-3444 H]チミジン(PerkinElmer、ウォルサム、マサチューセッツ州)を各ウェルに添加し、4時間インキュベー
トすることができる。次に、細胞を回収し、Trilux1450microBeta液体シンチレーション
カウンター(Wallac)で3H-チミジンの組み込みを測定して、TILの成長を調べることができる。
[001258] TILサンプルは、拡大培養ステップのいずれかで回収でき、2%ヒトAB
血清を補充したCellGro培地の96ウェルプレート(104 443細胞/ウェル)に3
回播種できる。1時間後、1μCi/ウェルの[メチル-3444 H]チミジン(PerkinElmer、ウォルサム、マサチューセッツ州)を各ウェルに添加し、4時間インキュベー
トすることができる。次に、細胞を回収し、Trilux1450microBeta液体シンチレーション
カウンター(Wallac)で3H-チミジンの組み込みを測定して、TILの成長を調べることができる。
sd-RNA処置細胞のIFN-γ分泌
[001259] 刺激されたT細胞によるIFN-γの産生は、製造元の取扱説明書に従い、ヒトIFN-γELISA開発キット(Mabtech)を使用して上清中で測定できる。TI
Lは、本明細書で提供されるように調製され、例えば2μM sd-RNAで数日間、場合により4日間処置することができる。この期間後、上清をELISA分析のために採取して、IFN-γ産生レベルを決定することができる。
[001259] 刺激されたT細胞によるIFN-γの産生は、製造元の取扱説明書に従い、ヒトIFN-γELISA開発キット(Mabtech)を使用して上清中で測定できる。TI
Lは、本明細書で提供されるように調製され、例えば2μM sd-RNAで数日間、場合により4日間処置することができる。この期間後、上清をELISA分析のために採取して、IFN-γ産生レベルを決定することができる。
TIL処置
[001260] sd-RNAで処置されたTILは、癌患者を治療する方法において本明細書に記載されているように使用することができる。
[001260] sd-RNAで処置されたTILは、癌患者を治療する方法において本明細書に記載されているように使用することができる。
実施例21:例示的なエレクトロポレーション法
[001261] 本明細書に記載のいずれかの方法に従ってTILを調製した。次のトランスフェクション法がテストされる:リポフェクチン及びリポフェクタミンリポフェクション、短径波BTX ECM 830装置又はBio-Rad Gene Pulser IIを使用したエレクトロポレーショ
ン、エッペンドルフマルチポレーターを使用した指数関数的逓減波エレクトロポレーション及びAmaxaヌクレオフェクター。全ての方法は、最初は、必要に応じて変更される可能
性がある製造元の推奨に基づいている。Amaxaヌクレオフェクターのプロトコルは、最大
のトランスフェクション効率を与え得る。Amaxaの手順は、3つの溶液(V、R及びT)
の1つ及びエレクトロポレーションの8つのプログラムの異なる組み合わせを使用して最適化される。また、米国特許出願公開第2016/0230188号及び米国特許第8,859,229号に記載された方法を参照されたい。これら両方が参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。エレクトロポレーションは、Menger et al., Cancer Res., 2016 Apr 15; 76(8):2087-93によって記載された方法に従って実行され得、Agile Pulse BTXシステム(ハーバード装置(Harvard Apparatus))を使用し、その開示は、参照により本明細書に組み込まれる。エレクトロポレーションされた細胞は、本明細書の他の場所に記載されたプレREP及びREP法により拡大培養され得る。米国特許第6,010,613号及び同第6,078,490号(これらの開示は、参照により本明細書に組み込まれる)に記載のものなど、当技術分野で公知のエレクトロポレーション法を使用し得る。パルスエレクトロポレーションの最適化は、以下のプログラム又はその変更を使用して記述されている方法を使用して実行され得る。
[001261] 本明細書に記載のいずれかの方法に従ってTILを調製した。次のトランスフェクション法がテストされる:リポフェクチン及びリポフェクタミンリポフェクション、短径波BTX ECM 830装置又はBio-Rad Gene Pulser IIを使用したエレクトロポレーショ
ン、エッペンドルフマルチポレーターを使用した指数関数的逓減波エレクトロポレーション及びAmaxaヌクレオフェクター。全ての方法は、最初は、必要に応じて変更される可能
性がある製造元の推奨に基づいている。Amaxaヌクレオフェクターのプロトコルは、最大
のトランスフェクション効率を与え得る。Amaxaの手順は、3つの溶液(V、R及びT)
の1つ及びエレクトロポレーションの8つのプログラムの異なる組み合わせを使用して最適化される。また、米国特許出願公開第2016/0230188号及び米国特許第8,859,229号に記載された方法を参照されたい。これら両方が参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。エレクトロポレーションは、Menger et al., Cancer Res., 2016 Apr 15; 76(8):2087-93によって記載された方法に従って実行され得、Agile Pulse BTXシステム(ハーバード装置(Harvard Apparatus))を使用し、その開示は、参照により本明細書に組み込まれる。エレクトロポレーションされた細胞は、本明細書の他の場所に記載されたプレREP及びREP法により拡大培養され得る。米国特許第6,010,613号及び同第6,078,490号(これらの開示は、参照により本明細書に組み込まれる)に記載のものなど、当技術分野で公知のエレクトロポレーション法を使用し得る。パルスエレクトロポレーションの最適化は、以下のプログラム又はその変更を使用して記述されている方法を使用して実行され得る。
[001262] TILは、異なるエレクトロポレーションプログラム又は方法を使用して、GFPをコード化するプラスミド約20μg及び対照プラスミドpUCを含む0.4cmギャップキュベット(約106細胞/mL程度)でエレクトロポレーションされ得る。エレクトロポレーションの約24時間後、GFP発現をフローサイトメトリーによってエレクトロポレーションした細胞で分析し、トランスフェクション効率を決定した。TILにおけるプラスミドエレクトロポレーションに必要な最小電圧は、国際特許出願公開国際公開第2014/184744号及び米国特許出願公開第2013/0315884 A1号で以前に報告されており、それらの開示は、参照により本明細書に組み込まれる。
実施例22:治療活性が強化された腫瘍抗原特異的T細胞について濃縮されたTIL産物の調製のための一過性トランスフェクションプロトコル
[001263] この実施例の実験では、TIL改善戦略の2つの異なる効果を調べる。戦略1:IL-2又は膜結合型IL-15(mb-IL15)の一過性発現。戦略2:NOTCH媒介性TILの再プログラミング。いくつかの実施形態では、NOTCH媒介性再プログラミングは、NOTCH1又はNOTCH2の細胞内ドメイン(ICD)のmRNA発現を含む。いくつかの実施形態では、NOTCH媒介性再プログラミングは、NOTCHリガンドDLL1のmRNA発現を含む。
[001263] この実施例の実験では、TIL改善戦略の2つの異なる効果を調べる。戦略1:IL-2又は膜結合型IL-15(mb-IL15)の一過性発現。戦略2:NOTCH媒介性TILの再プログラミング。いくつかの実施形態では、NOTCH媒介性再プログラミングは、NOTCH1又はNOTCH2の細胞内ドメイン(ICD)のmRNA発現を含む。いくつかの実施形態では、NOTCH媒介性再プログラミングは、NOTCHリガンドDLL1のmRNA発現を含む。
[001264] 研究対象の腫瘍の種類は、黒色腫、肺、肉腫などである。
[001265] TILは、例えば、実施例16に記載されているプロセスを含む、本明細書で上記に記載されるようなプロセスを使用して生成される。
[001266] RNA分子は、例えば、実施例21に記載される方法を使用し送達される(また、米国特許出願公開第2016/0230188号及び米国特許第8,859,229号に記載された方法を参照されたい。これら両方が参照によりその全体が本明細書に組み込まれる)。
[001267] 例えば、mRNA試薬の検証、一過性トランスフェクション及び再プログラミングのタイミング、エレクトロポレーションのタイミングと使用するTILプロセスとの互換性、効率(トランスフェクション効率を含む)及び拡張性などを含み、送達条件が決定される。
[001268] 実験の読み出しは、TIL表現型(フローサイトメトリー)、TILエフェクター機能(サイトカイン産生アッセイ)、TIL腫瘍応答性(自己腫瘍細胞共培養アッセイ)、TCRレパートリーアッセイ(フローサイトメトリー及び/又はRNA-seq
)及びTIL代謝状態(タツノオトシゴなどの生細胞代謝アッセイ)又は本明細書の上記の他のパラメータのいずれかを含む。
)及びTIL代謝状態(タツノオトシゴなどの生細胞代謝アッセイ)又は本明細書の上記の他のパラメータのいずれかを含む。
予想される結果:
[001269] 送達条件は、ポストREP TILで対象のたんぱく質を高発現させるために必要に応じて設計される。凍結黒色腫プレREPサンプルをスクリーニング条件に使用する。最適化実験のために提供される試薬はGFP mRNAである。条件は、いくつかのTIL活性化方法及びエレクトロポレーションプロトコルを試験する。読み出しは、フローサイトメトリーで評価された、エレクトロポレーションされていない対照に対する細胞生存率及びGFP陽性細胞の割合である。選択条件は、利用可能な組織の新鮮なTIL調製物2~3個で確認される。いくつかの実施形態では、トランスフェクション効率(ET)は、蛍光活性化細胞選別(FACS)によるトランスフェクションの約3時間、6時間、9時間、12時間、15時間及び/又は18時間後に決定することができる。一部の実験では、GFPがもはや検出できなくなるまで、トランスフェクタントを12時間~24時間毎に更に分析できる。一部の実施形態では、細胞生存率は、トリパンブルー染色排除により決定することができる。このプロトコルは、80%を超える生存率及び70を超えるトランスフェクション効率をもたらすと予想される。
[001269] 送達条件は、ポストREP TILで対象のたんぱく質を高発現させるために必要に応じて設計される。凍結黒色腫プレREPサンプルをスクリーニング条件に使用する。最適化実験のために提供される試薬はGFP mRNAである。条件は、いくつかのTIL活性化方法及びエレクトロポレーションプロトコルを試験する。読み出しは、フローサイトメトリーで評価された、エレクトロポレーションされていない対照に対する細胞生存率及びGFP陽性細胞の割合である。選択条件は、利用可能な組織の新鮮なTIL調製物2~3個で確認される。いくつかの実施形態では、トランスフェクション効率(ET)は、蛍光活性化細胞選別(FACS)によるトランスフェクションの約3時間、6時間、9時間、12時間、15時間及び/又は18時間後に決定することができる。一部の実験では、GFPがもはや検出できなくなるまで、トランスフェクタントを12時間~24時間毎に更に分析できる。一部の実施形態では、細胞生存率は、トリパンブルー染色排除により決定することができる。このプロトコルは、80%を超える生存率及び70を超えるトランスフェクション効率をもたらすと予想される。
[001270] ヒトIL-2及びmb結合IL-15 mRNAが生成され、機能的に試験される。検証済みの条件を使用して、様々な組織から最大6つのTIL培養物をトランスフェクトする。読み出しは、トランスフェクション効率、TIL表現型及びTILエフェクター機能である。このプロトコルは、80%を超える生存率、70%を超えるトランスフェクション効率、対照と比較して同等又は改善されたTIL表現型及びTILエフェクター機能の顕著な増加をもたらすと予想される。
[001271] 送達条件は、T細胞再プログラミングをもたらすために必要に応じて設計される。Iovanceに保存された凍結黒色腫プレREPサンプルをスクリーニング条件に使用
する。提供される試薬は、NOTCH1又は2 ICD mRNAである。条件は、いくつかのTIL活性化方法及びエレクトロポレーションのタイミングを試験する。読み出しは、フローサイトメトリーで評価された、エレクトロポレーションされていない対照に対する細胞生存率、トランスフェクション効率及びステムメモリーT細胞(TSCM)の割合である。選択条件は、利用可能な組織の新鮮なTIL調製物2~3個で確認される。このプロトコルにより、80%を超える生存率、70%を超えるトランスフェクション効率及びTSCM頻度の顕著な増加をもたらすと予想される。
する。提供される試薬は、NOTCH1又は2 ICD mRNAである。条件は、いくつかのTIL活性化方法及びエレクトロポレーションのタイミングを試験する。読み出しは、フローサイトメトリーで評価された、エレクトロポレーションされていない対照に対する細胞生存率、トランスフェクション効率及びステムメモリーT細胞(TSCM)の割合である。選択条件は、利用可能な組織の新鮮なTIL調製物2~3個で確認される。このプロトコルにより、80%を超える生存率、70%を超えるトランスフェクション効率及びTSCM頻度の顕著な増加をもたらすと予想される。
[001272] 再プログラミング実験は、上記で決定されたトランスフェクション条件を使用して、様々な組織からの最大6つのTIL調製物で実行される。読み出しは、トランスフェクション効率、TIL表現型、TCRレパートリー及びTILエフェクター機能である。このプロトコルは、TSCM頻度が顕著に増加し、TIL全体に対するTSCMサブセットのTCRレパートリーの維持を可能にし、対照に対するエフェクター機能の維持を可能にすると予想する。
実施例23:SD-RXRNAの入手及び検証
[001273] この実施例の実験は、5つの対象となる標的:PDCD1、TIM3、CBLB、LAG3及びCISHについてsd-rxRNA構築物に関するデータを提供する。
[001273] この実施例の実験は、5つの対象となる標的:PDCD1、TIM3、CBLB、LAG3及びCISHについてsd-rxRNA構築物に関するデータを提供する。
[001274] 段階1:対象となる5つの標的のためのsd-rxRNAの入手。
[001275] 段階2:プレREP TILにおけるsd-rxRNA媒介遺伝子サイレン
シングの検証(8週間)。
シングの検証(8週間)。
[001276] 最大6つの凍結黒色腫/他のプレREPライン。実験条件の決定。
[001277] 読み出し:
・%サイレンシング:80%以上が予想される
・サイレンシングの持続
・TILの成長:対照の10%以内が予想される
・TIL機能:サイトカイン産生の増加が予想される。
・%サイレンシング:80%以上が予想される
・サイレンシングの持続
・TILの成長:対照の10%以内が予想される
・TIL機能:サイトカイン産生の増加が予想される。
[001278] 段階3:Gen2及び/又は3プロセスへのsd-rxRNA媒介遺伝子サイレンシングの実施(3か月)。
・3~6の研究スケールの新鮮TIL調製物
・上記と同じ読み出し
・TIL表現型
・TIL腫瘍応答性
・今後の作業のために、少なくとも2つの標的/sd-rxRNAペアが選択される。
・3~6の研究スケールの新鮮TIL調製物
・上記と同じ読み出し
・TIL表現型
・TIL腫瘍応答性
・今後の作業のために、少なくとも2つの標的/sd-rxRNAペアが選択される。
[001279] 段階4:フルスケールのTIL調製への最適化されたサイレンシングプロトコルの実施(8週間)。
標的遺伝子毎に1つのフルスケール調製。
標的遺伝子毎に1つのフルスケール調製。
根拠:
[001280] TMEでは、TILは、エフェクター機能を負に調節するいくつかの阻害分子を発現する。
[001280] TMEでは、TILは、エフェクター機能を負に調節するいくつかの阻害分子を発現する。
[001281] TILをエクスビボで培養すると機能は回復できるが、再注入後に免疫抑制は再び引き起こされる。
[001282] 再注入後のT細胞阻害経路が少なくとも数日間サイレンス化していることを確実にすることで、ACTに対するTILの効力が向上する可能性がある。
[001283] 自己送達siRNA(sd-rxRNA)は、T細胞遺伝子をノックダウンする効率的な方法を提供する。例えば、Ligtenberg, et al., Mol. Therapy, 26(6):1482-1493 (2018)を参照されたい。
目標:
[001284] 阻害経路をサイレンシングすることにより、TILエフェクター機能を再確立する。
[001284] 阻害経路をサイレンシングすることにより、TILエフェクター機能を再確立する。
戦略:
[001285] 急速拡大培養プロトコル中のsd-rxRNAを使用した1)PDCD1、2)TIM3、3)CBLB、4)LAG3及び5)CISHの一過性のノックダウン。急速拡大培養プロトコル中のsd-rxRNAを使用したPD1の一過性のノックダウンに特に焦点を当てる。
[001285] 急速拡大培養プロトコル中のsd-rxRNAを使用した1)PDCD1、2)TIM3、3)CBLB、4)LAG3及び5)CISHの一過性のノックダウン。急速拡大培養プロトコル中のsd-rxRNAを使用したPD1の一過性のノックダウンに特に焦点を当てる。
手順:
[001286] REP’ed TILにおけるsd-rxRNA媒介遺伝子サイレンシングの検証(KDの効率及び持続性、T細胞の生存率)。
[001286] REP’ed TILにおけるsd-rxRNA媒介遺伝子サイレンシングの検証(KDの効率及び持続性、T細胞の生存率)。
[001287] TIL表現型及び機能(腫瘍応答性)に対する遺伝子サイレンシングの影響。
結果要約
[001288] REP中の標的sd-rxRNAの追加は、5つの標的の3つで遺伝子KDが成功し、80%超え(>80%)のPD1ノックダウンが含まれた。
・PD1:>80%
・TIM3:約70%
・LAG3:約70%
・CISH:約40%
・CBLB:検出不可。
[001288] REP中の標的sd-rxRNAの追加は、5つの標的の3つで遺伝子KDが成功し、80%超え(>80%)のPD1ノックダウンが含まれた。
・PD1:>80%
・TIM3:約70%
・LAG3:約70%
・CISH:約40%
・CBLB:検出不可。
[001289] PD1 KD(ノックダウン)は、生存率の低減と関連していた。PD1 KDはTILの拡大培養の低減と関連していた。
[001290] 表現型の顕著な変化は、PD1及びTIM3 KDと関連しており、より高いレベルの活性化を示唆する(増強されたCD25、CCR7、CD56、4-1BB及びOX40の発現)。特に、表現型の顕著な変化は、PD1 KDと関連しており、高レベルの活性化を示唆する(NTC対照と比較して、増強されたCD25、CCR7、4-1BB及びOX40の発現)。
[001291] これらの実験では、sd-rxRNAのいずれも、再刺激(INF g/IL-2/TNF-a)に応答してサイトカイン分泌の増加をもたらさなかった。特に、PDCD1 sd-rxRNAへのTILの曝露は、再刺激に応答してCD107a動員又はサイトカイン分泌(INFγ/IL-2/TNF-α)を増加させなかった。例えば、図54を参照されたい。
[001292] PD1 KD(ノックダウン)は、TILのインビトロで殺傷能力を増加させた(例えば、図49を参照されたい)。
方法:
・0日目:プレREPが開始された。培地にIL-2を追加。
・11日目:REPは、IL-2とPBMCを含む培地を使用して、解凍/新鮮プレREP+sd-rxRNA(即ち第2の拡大培養開始)を開始した。
・14日目:培地交換+IL-2を含むsd-rxRNA(任意選択によりOKT3及びフィーダー(PBMC));ただし、IL-2のみを使用して実行した(例えば、IL-2培地を含むsd-rxRNA)。
・17日目:培地交換+sd-rxRNA(追加でsd-rxRNAの追加)(例えば、IL-2培地を含むsd-rxRNA)。
・21日目:培地交換+sd-rxRNA(追加でsd-rxRNAの追加)(例えば、IL-2培地を含むsd-rxRNA)。
・22日目:上記のように回収されたTIL。
・細胞数をカウントし、生存率を決定した。
・決定されたKD(ノックダウン)効率(Q-PCR、フロー)
・上記のように、TILを特徴付ける表現型アッセイを実施した。
・調査された活性化マーカー(CD107a、IFNγ)(例えば、図45、阻害/疲弊マーカー及び図46、IFNγを参照されたい)。
・0日目:プレREPが開始された。培地にIL-2を追加。
・11日目:REPは、IL-2とPBMCを含む培地を使用して、解凍/新鮮プレREP+sd-rxRNA(即ち第2の拡大培養開始)を開始した。
・14日目:培地交換+IL-2を含むsd-rxRNA(任意選択によりOKT3及びフィーダー(PBMC));ただし、IL-2のみを使用して実行した(例えば、IL-2培地を含むsd-rxRNA)。
・17日目:培地交換+sd-rxRNA(追加でsd-rxRNAの追加)(例えば、IL-2培地を含むsd-rxRNA)。
・21日目:培地交換+sd-rxRNA(追加でsd-rxRNAの追加)(例えば、IL-2培地を含むsd-rxRNA)。
・22日目:上記のように回収されたTIL。
・細胞数をカウントし、生存率を決定した。
・決定されたKD(ノックダウン)効率(Q-PCR、フロー)
・上記のように、TILを特徴付ける表現型アッセイを実施した。
・調査された活性化マーカー(CD107a、IFNγ)(例えば、図45、阻害/疲弊マーカー及び図46、IFNγを参照されたい)。
[001293] この実験は、図40に示すように、黒色腫、乳房、肺、肉腫及び卵巣の5種類の腫瘍タイプで行われた。
実施例24:実施例23の変形実施形態
[001294] 実施例23で考察される方法に従い、一過性に変化するタンパク質発現と組み合わせてTILを拡大培養する方法が記載される。この実施例は、実施例23に記載された方法に沿って更に変化した実施形態を提供する。
[001294] 実施例23で考察される方法に従い、一過性に変化するタンパク質発現と組み合わせてTILを拡大培養する方法が記載される。この実施例は、実施例23に記載された方法に沿って更に変化した実施形態を提供する。
[001295] 上記の方法の一部の実施形態において、腫瘍浸潤リンパ球(TIL)を治療用TIL集団に拡大培養する方法は、
(i)患者から切除された腫瘍から第1のTIL集団を得ること;
(ii)IL-2及び任意選択によりOKT-3を含む細胞培養培地中で第1のTIL集団を培養することにより、第1の拡大培養を実施して第2のTIL集団を生じさせること;
(iii)第2のTIL集団の細胞培養培地に追加のIL-2、OKT-3及び抗原提示細胞(APC)を補充することにより、第2の拡大培養を実施して第3のTIL集団を生じさせることであって、第3のTIL集団は、第2のTIL集団よりも数において少なくとも100倍多く、第2の拡大培養は、第3のTIL集団を得るために少なくとも14日間にわたって実施され、第3のTIL集団は、治療用TIL集団である、生じさせること;及び
(iv)第2及び/又は第3のTIL集団を、転写因子(TF)及び/又はタンパク質発現を一過性に変化させることができる他の分子に11日目~21日目に曝露することであって、TF及び/又はタンパク質発現を一過性に変化させることができる他の分子は、腫瘍抗原の変化した発現及び/又は治療用TIL集団における腫瘍抗原特異的T細胞の数の変化を提供する、曝露すること;及び
(v)22日目以降にステップ(iv)から得られた治療用TIL集団を回収すること;及び
(vi)任意選択により、ステップ(v)からの回収されたTIL集団を輸注バッグに移すこと
を含み得る。
(i)患者から切除された腫瘍から第1のTIL集団を得ること;
(ii)IL-2及び任意選択によりOKT-3を含む細胞培養培地中で第1のTIL集団を培養することにより、第1の拡大培養を実施して第2のTIL集団を生じさせること;
(iii)第2のTIL集団の細胞培養培地に追加のIL-2、OKT-3及び抗原提示細胞(APC)を補充することにより、第2の拡大培養を実施して第3のTIL集団を生じさせることであって、第3のTIL集団は、第2のTIL集団よりも数において少なくとも100倍多く、第2の拡大培養は、第3のTIL集団を得るために少なくとも14日間にわたって実施され、第3のTIL集団は、治療用TIL集団である、生じさせること;及び
(iv)第2及び/又は第3のTIL集団を、転写因子(TF)及び/又はタンパク質発現を一過性に変化させることができる他の分子に11日目~21日目に曝露することであって、TF及び/又はタンパク質発現を一過性に変化させることができる他の分子は、腫瘍抗原の変化した発現及び/又は治療用TIL集団における腫瘍抗原特異的T細胞の数の変化を提供する、曝露すること;及び
(v)22日目以降にステップ(iv)から得られた治療用TIL集団を回収すること;及び
(vi)任意選択により、ステップ(v)からの回収されたTIL集団を輸注バッグに移すこと
を含み得る。
[001296] 一部の変形実施形態において、タンパク質発現を一過性に変化させることができる他の分子は、例えば、sd-rxRNAを含むが、これに限定されないsd-RNAを含む。一部の実施形態において、TILは、11日目、14日目、17日目及び/又は21日目にsd-RNAに曝露される。一部の変形実施形態において、TILは、11日目、14日目、17日目及び/又は21日目の少なくとも2日、sd-RNAに曝露される。一部の変形実施形態において、TILは、11日目、14日目、17日目及び/又は21日目の少なくとも3日、sd-RNAに曝露される。一部の変形実施形態において、TILは、11日目、14日目、17日目及び21日目の全てでsd-RNAに曝露される。一部の実施形態において、sd-RNAは、PD-1を標的とする。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、標的遺伝子の発現において、70%の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、標的遺伝子の発現において、75%の低減を示す。
[001297] 一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、標的遺伝子の発現において、80%の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、標的遺伝子の発現において、85%の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、標的遺伝子の発現において、90%の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、標的遺伝子の発現において、95%の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、標的遺伝子の発現において、99%の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約0.25μM~約10μM
の濃度、一部の実施形態では約0.25μM~約4μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約0.25μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約0.5μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約0.75μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約1.0μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約1.25μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約1.5μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約1.75μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約2.0μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約2.25μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約2.5μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約2.75μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約3.0μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約3.25μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約3.5μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約3.75μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約4.0μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約5.0μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約6.0μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約7.0μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約8.0μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約9.0μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約10.0μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。前述の実施形態のいずれかにおいて、指定された濃度は、培地交換前又は後にTIL培養培地に関して決定され得る。
の濃度、一部の実施形態では約0.25μM~約4μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約0.25μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約0.5μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約0.75μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約1.0μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約1.25μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約1.5μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約1.75μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約2.0μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約2.25μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約2.5μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約2.75μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約3.0μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約3.25μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約3.5μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約3.75μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約4.0μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約5.0μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約6.0μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約7.0μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約8.0μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約9.0μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約10.0μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。前述の実施形態のいずれかにおいて、指定された濃度は、培地交換前又は後にTIL培養培地に関して決定され得る。
[001298] 一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、PD-1の発現において、70%の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、PD-1の発現において、75%の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、PD-1の発現において、80%の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、PD-1の発現において、85%の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、PD-1の発現において、90%の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、PD-1の発現において、95%の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、PD-1の発現において、99%の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd
-RNA配列は、約0.25μM~約10μMの濃度、一部の実施形態では約0.25μM~約4μMの濃度で送達された場合、PD-1の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約0.25μMの濃度で送達された場合、PD-1の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約0.5μMの濃度で送達された場合、PD-1の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約0.75μMの濃度で送達された場合、PD-1の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約1.0μMの濃度で送達された場合、PD-1の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約1.25μMの濃度で送達された場合、PD-1の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約1.5μMの濃度で送達された場合、PD-1の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約1.75μMの濃度で送達された場合、PD-1の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約2.0μMの濃度で送達された場合、PD-1の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約2.25μMの濃度で送達された場合、PD-1の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約2.5μMの濃度で送達された場合、PD-1の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約2.75μMの濃度で送達された場合、PD-1の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約3.0μMの濃度で送達された場合、PD-1の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約3.25μMの濃度で送達された場合、PD-1の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約3.5μMの濃度で送達された場合、PD-1の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約3.75μMの濃度で送達された場合、PD-1の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約4.0μMの濃度で送達された場合、PD-1の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約5.0μMの濃度で送達された場合、PD-1の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約6.0μMの濃度で送達された場合、PD-1の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約7.0μMの濃度で送達された場合、PD-1の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約8.0μMの濃度で送達された場合、PD-1の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約9.0μMの濃度で送達された場合、PD-1の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約10.0μMの濃度で送達された場合、PD-1の発現の低減を示す。前述の実施形態のいずれかにおいて、指定された濃度は、培地交換前又は後にTIL培養培地に関して決定され得る。
-RNA配列は、約0.25μM~約10μMの濃度、一部の実施形態では約0.25μM~約4μMの濃度で送達された場合、PD-1の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約0.25μMの濃度で送達された場合、PD-1の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約0.5μMの濃度で送達された場合、PD-1の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約0.75μMの濃度で送達された場合、PD-1の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約1.0μMの濃度で送達された場合、PD-1の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約1.25μMの濃度で送達された場合、PD-1の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約1.5μMの濃度で送達された場合、PD-1の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約1.75μMの濃度で送達された場合、PD-1の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約2.0μMの濃度で送達された場合、PD-1の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約2.25μMの濃度で送達された場合、PD-1の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約2.5μMの濃度で送達された場合、PD-1の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約2.75μMの濃度で送達された場合、PD-1の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約3.0μMの濃度で送達された場合、PD-1の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約3.25μMの濃度で送達された場合、PD-1の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約3.5μMの濃度で送達された場合、PD-1の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約3.75μMの濃度で送達された場合、PD-1の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約4.0μMの濃度で送達された場合、PD-1の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約5.0μMの濃度で送達された場合、PD-1の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約6.0μMの濃度で送達された場合、PD-1の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約7.0μMの濃度で送達された場合、PD-1の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約8.0μMの濃度で送達された場合、PD-1の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約9.0μMの濃度で送達された場合、PD-1の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約10.0μMの濃度で送達された場合、PD-1の発現の低減を示す。前述の実施形態のいずれかにおいて、指定された濃度は、培地交換前又は後にTIL培養培地に関して決定され得る。
[001299] 一部の変形実施形態において、TILは、約0.75μM~約3μMのsd-RNA濃度において11日目、14日目、17日目及び/又は21日目の少なくとも2日、sd-RNAに曝露される。一部の変形実施形態において、TILは、約0.75μM~約3μMのsd-RNA濃度において11日目、14日目、17日目及び/又は21日目の少なくとも3日、sd-RNAに曝露される。一部の変形実施形態において、TILは、約0.75μM~約3μMのsd-RNA濃度において11日目、14日目、17日目及び21日目の全てでsd-RNAに曝露される。一部の変形実施形態において、sd-RNAは、約0.75μM~約3μMのsd-RNA濃度で培地交換と共に添加される。一部の実施形態において、sd-RNAは、PD-1を標的とする。
[001300] 一部の変形実施形態において、TILは、約1.0μM~約2.5μMのs
d-RNA濃度において11日目、14日目、17日目及び/又は21日目の少なくとも2日、sd-RNAに曝露される。一部の変形実施形態において、TILは、約1.0μM~約2.5μMのsd-RNA濃度において11日目、14日目、17日目及び/又は21日目の少なくとも3日、sd-RNAに曝露される。一部の変形実施形態において、TILは、約1.0μM~約2.5μMのsd-RNA濃度において11日目、14日目、17日目及び21日目の全てでsd-RNAに曝露される。一部の変形実施形態において、sd-RNAは、約1.0μM~約2.5μMのsd-RNA濃度で培地交換と共に添加される。一部の実施形態において、sd-RNAは、PD-1を標的とする。
d-RNA濃度において11日目、14日目、17日目及び/又は21日目の少なくとも2日、sd-RNAに曝露される。一部の変形実施形態において、TILは、約1.0μM~約2.5μMのsd-RNA濃度において11日目、14日目、17日目及び/又は21日目の少なくとも3日、sd-RNAに曝露される。一部の変形実施形態において、TILは、約1.0μM~約2.5μMのsd-RNA濃度において11日目、14日目、17日目及び21日目の全てでsd-RNAに曝露される。一部の変形実施形態において、sd-RNAは、約1.0μM~約2.5μMのsd-RNA濃度で培地交換と共に添加される。一部の実施形態において、sd-RNAは、PD-1を標的とする。
[001301] 一部の変形実施形態において、TILは、約1.5μM~約2.5μMのsd-RNA濃度において11日目、14日目、17日目及び/又は21日目の少なくとも2日、sd-RNAに曝露される。一部の変形実施形態において、TILは、約1.5μM~約2.5μMのsd-RNA濃度において11日目、14日目、17日目及び/又は21日目の少なくとも3日、sd-RNAに曝露される。一部の変形実施形態において、TILは、約1.5μM~約2.5μMのsd-RNA濃度において11日目、14日目、17日目及び21日目の全てでsd-RNAに曝露される。一部の変形実施形態において、sd-RNAは、約1.5μM~約2.5μMのsd-RNA濃度で培地交換と共に添加される。一部の実施形態において、sd-RNAは、PD-1を標的とする。
[001302] 一部の変形実施形態において、TILは、2μMのsd-RNA濃度において11日目、14日目、17日目及び/又は21日目の少なくとも2日、sd-RNAに曝露される。一部の変形実施形態において、TILは、約2μMのsd-RNA濃度において11日目、14日目、17日目及び/又は21日目の少なくとも3日、sd-RNAに曝露される。一部の変形実施形態において、TILは、約2μMのsd-RNA濃度において11日目、14日目、17日目及び21日目の全てでsd-RNAに曝露される。一部の変形実施形態において、sd-RNAは、約2μMのsd-RNA濃度で培地交換と共に添加される。一部の実施形態において、sd-RNAは、PD-1を標的とする。
[001303] 一部の実施形態において、11日目に添加されるsd-RNAは、sd-RNA、IL-2、OKT3及びAPC(例えば、PBMCを含む)を含む培地に添加される。一部の実施形態において、14日目に添加されるsd-RNAは、sd-RNAを含み、任意選択によりIL-2、OKT3及びAPC(例えば、PBMCを含む)の1つ以上を含む培地に添加される。一部の実施形態において、17日目に添加されるsd-RNAは、sd-RNAを含み、任意選択によりIL-2、OKT3及びAPC(例えば、PBMCを含む)の1つ以上を含む培地に添加される。一部の実施形態において、21日目に添加されるsd-RNAは、sd-RNAを含み、任意選択によりIL-2、OKT3及びAPC(例えば、PBMCを含む)の1つ以上を含む培地に添加される。一部の実施形態において、14日目に添加されるsd-RNAは、sd-RNA及びIL-2を含む培地に添加される。一部の実施形態において、17日目に添加されるsd-RNAは、sd-RNA及びIL-2を含む培地に添加される。一部の実施形態において、21日目に添加されるsd-RNAは、sd-RNA及びIL-2を含む培地に添加される。一部の実施形態において、更なるsd-RNAが14日目に添加される。一部の実施形態において、更なるsd-RNAが17日目に添加される。一部の実施形態において、更なるsd-RNAが21日目に添加される。一部の実施形態において、sd-RNAは、11日目、14日目、17日目及び21日目に同じ濃度で添加される。一部の実施形態において、sd-RNAは、11日目、14日目、17日目及び/又は21日目に異なる濃度で添加される。一部の実施形態において、sd-RNAは、PD-1を標的とする。
実施例25:実施例23の変形実施形態
[001304] 実施例23で考察される方法に従い、一過性に変化するタンパク質発現と組
み合わせてTILを拡大培養する方法が記載される。この実施例は、実施例23に記載された方法に沿って更に変化した実施形態を提供する。
[001304] 実施例23で考察される方法に従い、一過性に変化するタンパク質発現と組
み合わせてTILを拡大培養する方法が記載される。この実施例は、実施例23に記載された方法に沿って更に変化した実施形態を提供する。
[001305] 上記の方法の一部の実施形態において、腫瘍浸潤リンパ球(TIL)を治療用TIL集団に拡大培養する方法は、
(a)患者から得られた腫瘍サンプルを複数の腫瘍断片に処理することにより、患者から切除された腫瘍から第1のTIL集団を得ること;
(b)腫瘍断片を閉鎖系に添加すること;
(c)IL-2及び任意選択によりOKT-3を含む細胞培養培地中で第1のTIL集団を培養することにより、第1の拡大培養を実施して第2のTIL集団を生じさせることであって、第1の拡大培養は、第1のガス透過性表面積を提供する閉鎖型容器内で実施され、第1の拡大培養は、第2のTIL集団を得るために約3~14日間にわたって実施され、第2のTIL集団は、第1のTIL集団よりも数において少なくとも50倍多く、ステップ(b)からステップ(c)への移行は、系を開放することなく行われる、生じさせること;
(d)第2のTIL集団の細胞培養培地に追加のIL-2、OKT-3及び抗原提示細胞(APC)を補充することにより、第2の拡大培養を実施して第3のTIL集団を生じさせることであって、第2の拡大培養は、第3のTIL集団を得るために約7~14日間にわたって実施され、第3のTIL集団は、治療用TIL集団であり、第2の拡大培養は、第2のガス透過性表面積を提供する閉鎖型容器内で実施され、ステップ(c)からステップ(d)への移行は、系を開放することなく行われる、生じさせること;
(e)第2及び/又は第3のTIL集団を、転写因子(TF)及び/又はタンパク質発現を一過性に変化させることができる他の分子に11日目~21日目に曝露することであって、TF及び/又はタンパク質発現を一過性に変化させることができる他の分子は、腫瘍抗原の変化した発現及び/又は治療用TIL集団における腫瘍抗原特異的T細胞の数の変化を提供する、曝露すること;
(f)ステップ(d)から得られた治療用TIL集団を22日目以降に回収することであって、ステップ(d)からステップ(e)への移行は、系を開放することなく行われる、回収すること;及び
(g)ステップ(e)からの回収されたTIL集団を輸注バッグに移すことであって、ステップ(e)から(f)への移行は、系を開放することなく行われる、移すこと
を含み得る。
(a)患者から得られた腫瘍サンプルを複数の腫瘍断片に処理することにより、患者から切除された腫瘍から第1のTIL集団を得ること;
(b)腫瘍断片を閉鎖系に添加すること;
(c)IL-2及び任意選択によりOKT-3を含む細胞培養培地中で第1のTIL集団を培養することにより、第1の拡大培養を実施して第2のTIL集団を生じさせることであって、第1の拡大培養は、第1のガス透過性表面積を提供する閉鎖型容器内で実施され、第1の拡大培養は、第2のTIL集団を得るために約3~14日間にわたって実施され、第2のTIL集団は、第1のTIL集団よりも数において少なくとも50倍多く、ステップ(b)からステップ(c)への移行は、系を開放することなく行われる、生じさせること;
(d)第2のTIL集団の細胞培養培地に追加のIL-2、OKT-3及び抗原提示細胞(APC)を補充することにより、第2の拡大培養を実施して第3のTIL集団を生じさせることであって、第2の拡大培養は、第3のTIL集団を得るために約7~14日間にわたって実施され、第3のTIL集団は、治療用TIL集団であり、第2の拡大培養は、第2のガス透過性表面積を提供する閉鎖型容器内で実施され、ステップ(c)からステップ(d)への移行は、系を開放することなく行われる、生じさせること;
(e)第2及び/又は第3のTIL集団を、転写因子(TF)及び/又はタンパク質発現を一過性に変化させることができる他の分子に11日目~21日目に曝露することであって、TF及び/又はタンパク質発現を一過性に変化させることができる他の分子は、腫瘍抗原の変化した発現及び/又は治療用TIL集団における腫瘍抗原特異的T細胞の数の変化を提供する、曝露すること;
(f)ステップ(d)から得られた治療用TIL集団を22日目以降に回収することであって、ステップ(d)からステップ(e)への移行は、系を開放することなく行われる、回収すること;及び
(g)ステップ(e)からの回収されたTIL集団を輸注バッグに移すことであって、ステップ(e)から(f)への移行は、系を開放することなく行われる、移すこと
を含み得る。
[001306] 一部の変形実施形態において、タンパク質発現を一過性に変化させることができる他の分子は、例えば、sd-rxRNAを含むが、これに限定されないsd-RNAを含む。一部の実施形態において、TILは、11日目、14日目、17日目及び/又は21日目にsd-RNAに曝露される。一部の変形実施形態において、TILは、11日目、14日目、17日目及び/又は21日目の少なくとも2日、sd-RNAに曝露される。一部の変形実施形態において、TILは、11日目、14日目、17日目及び/又は21日目の少なくとも3日、sd-RNAに曝露される。一部の変形実施形態において、TILは、11日目、14日目、17日目及び21日目の全てでsd-RNAに曝露される。一部の実施形態において、sd-RNAは、PD-1を標的とする。
[001307] 一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、標的遺伝子の発現において、70%の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、標的遺伝子の発現において、75%の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、標的遺伝子の発現において、80%の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、標的遺伝子の発現において、85%の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、標的遺伝子の発現において、90%の低減を示す。一部の実
施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、標的遺伝子の発現において、95%の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、標的遺伝子の発現において、99%の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約0.25μM~約10μMの濃度、一部の実施形態では約0.25μM~約4μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約0.25μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約0.5μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約0.75μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約1.0μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約1.25μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約1.5μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約1.75μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約2.0μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約2.25μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約2.5μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約2.75μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約3.0μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約3.25μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約3.5μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約3.75μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約4.0μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約5.0μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約6.0μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約7.0μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約8.0μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約9.0μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約10.0μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。前述の実施形態のいずれかにおいて、指定された濃度は、培地交換前又は後にTIL培養培地に関して決定され得る。
施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、標的遺伝子の発現において、95%の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、標的遺伝子の発現において、99%の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約0.25μM~約10μMの濃度、一部の実施形態では約0.25μM~約4μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約0.25μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約0.5μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約0.75μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約1.0μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約1.25μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約1.5μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約1.75μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約2.0μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約2.25μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約2.5μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約2.75μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約3.0μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約3.25μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約3.5μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約3.75μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約4.0μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約5.0μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約6.0μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約7.0μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約8.0μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約9.0μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約10.0μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。前述の実施形態のいずれかにおいて、指定された濃度は、培地交換前又は後にTIL培養培地に関して決定され得る。
[001308] 一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、PD-1の発現において、70%の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、PD-1の発現において、75%の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、PD-1の発現において、80%の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、PD-1の発現において、85%の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、PD-1の発現において、90%の低減を示す。一部の実施形態にお
いて、本発明で使用されるsd-RNA配列は、PD-1の発現において、95%の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、PD-1の発現において、99%の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約0.25μM~約10μMの濃度、一部の実施形態では約0.25μM~約4μMの濃度で送達された場合、PD-1の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約0.25μMの濃度で送達された場合、PD-1の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約0.5μMの濃度で送達された場合、PD-1の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約0.75μMの濃度で送達された場合、PD-1の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約1.0μMの濃度で送達された場合、PD-1の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約1.25μMの濃度で送達された場合、PD-1の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約1.5μMの濃度で送達された場合、PD-1の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約1.75μMの濃度で送達された場合、PD-1の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約2.0μMの濃度で送達された場合、PD-1の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約2.25μMの濃度で送達された場合、PD-1の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約2.5μMの濃度で送達された場合、PD-1の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約2.75μMの濃度で送達された場合、PD-1の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約3.0μMの濃度で送達された場合、PD-1の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約3.25μMの濃度で送達された場合、PD-1の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約3.5μMの濃度で送達された場合、PD-1の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約3.75μMの濃度で送達された場合、PD-1の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約4.0μMの濃度で送達された場合、PD-1の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約5.0μMの濃度で送達された場合、PD-1の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約6.0μMの濃度で送達された場合、PD-1の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約7.0μMの濃度で送達された場合、PD-1の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約8.0μMの濃度で送達された場合、PD-1の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約9.0μMの濃度で送達された場合、PD-1の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約10.0μMの濃度で送達された場合、PD-1の発現の低減を示す。前述の実施形態のいずれかにおいて、指定された濃度は、培地交換前又は後にTIL培養培地に関して決定され得る。
いて、本発明で使用されるsd-RNA配列は、PD-1の発現において、95%の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、PD-1の発現において、99%の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約0.25μM~約10μMの濃度、一部の実施形態では約0.25μM~約4μMの濃度で送達された場合、PD-1の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約0.25μMの濃度で送達された場合、PD-1の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約0.5μMの濃度で送達された場合、PD-1の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約0.75μMの濃度で送達された場合、PD-1の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約1.0μMの濃度で送達された場合、PD-1の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約1.25μMの濃度で送達された場合、PD-1の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約1.5μMの濃度で送達された場合、PD-1の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約1.75μMの濃度で送達された場合、PD-1の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約2.0μMの濃度で送達された場合、PD-1の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約2.25μMの濃度で送達された場合、PD-1の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約2.5μMの濃度で送達された場合、PD-1の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約2.75μMの濃度で送達された場合、PD-1の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約3.0μMの濃度で送達された場合、PD-1の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約3.25μMの濃度で送達された場合、PD-1の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約3.5μMの濃度で送達された場合、PD-1の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約3.75μMの濃度で送達された場合、PD-1の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約4.0μMの濃度で送達された場合、PD-1の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約5.0μMの濃度で送達された場合、PD-1の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約6.0μMの濃度で送達された場合、PD-1の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約7.0μMの濃度で送達された場合、PD-1の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約8.0μMの濃度で送達された場合、PD-1の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約9.0μMの濃度で送達された場合、PD-1の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約10.0μMの濃度で送達された場合、PD-1の発現の低減を示す。前述の実施形態のいずれかにおいて、指定された濃度は、培地交換前又は後にTIL培養培地に関して決定され得る。
[001309] 一部の変形実施形態において、TILは、約0.75μM~約3μMのsd-RNA濃度において11日目、14日目、17日目及び/又は21日目の少なくとも2日、sd-RNAに曝露される。一部の変形実施形態において、TILは、約0.75μM~約3μMのsd-RNA濃度において11日目、14日目、17日目及び/又は21日目の少なくとも3日、sd-RNAに曝露される。一部の変形実施形態において、TILは、約0.75μM~約3μMのsd-RNA濃度において11日目、14日目、17日目及び21日目の全てでsd-RNAに曝露される。一部の変形実施形態において、sd-RNAは、約0.75μM~約3μMのsd-RNA濃度で培地交換と共に添加され
る。一部の実施形態において、sd-RNAは、PD-1を標的とする。
る。一部の実施形態において、sd-RNAは、PD-1を標的とする。
[001310] 一部の変形実施形態において、TILは、約1.0μM~約2.5μMのsd-RNA濃度において11日目、14日目、17日目及び/又は21日目の少なくとも2日、sd-RNAに曝露される。一部の変形実施形態において、TILは、約1.0μM~約2.5μMのsd-RNA濃度において11日目、14日目、17日目及び/又は21日目の少なくとも3日、sd-RNAに曝露される。一部の変形実施形態において、TILは、約1.0μM~約2.5μMのsd-RNA濃度において11日目、14日目、17日目及び21日目の全てでsd-RNAに曝露される。一部の変形実施形態において、sd-RNAは、約1.0μM~約2.5μMのsd-RNA濃度で培地交換と共に添加される。一部の実施形態において、sd-RNAは、PD-1を標的とする。
[001311] 一部の変形実施形態において、TILは、約1.5μM~約2.5μMのsd-RNA濃度において11日目、14日目、17日目及び/又は21日目の少なくとも2日、sd-RNAに曝露される。一部の変形実施形態において、TILは、約1.5μM~約2.5μMのsd-RNA濃度において11日目、14日目、17日目及び/又は21日目の少なくとも3日、sd-RNAに曝露される。一部の変形実施形態において、TILは、約1.5μM~約2.5μMのsd-RNA濃度において11日目、14日目、17日目及び21日目の全てでsd-RNAに曝露される。一部の変形実施形態において、sd-RNAは、約1.5μM~約2.5μMのsd-RNA濃度で培地交換と共に添加される。一部の実施形態において、sd-RNAは、PD-1を標的とする。
[001312] 一部の変形実施形態において、TILは、2μMのsd-RNA濃度において11日目、14日目、17日目及び/又は21日目の少なくとも2日、sd-RNAに曝露される。一部の変形実施形態において、TILは、約2μMのsd-RNA濃度において11日目、14日目、17日目及び/又は21日目の少なくとも3日、sd-RNAに曝露される。一部の変形実施形態において、TILは、約2μMのsd-RNA濃度において11日目、14日目、17日目及び21日目の全てでsd-RNAに曝露される。一部の変形実施形態において、sd-RNAは、約2μMのsd-RNA濃度で培地交換と共に添加される。一部の実施形態において、sd-RNAは、PD-1を標的とする。
[001313] 一部の実施形態において、11日目に添加されるsd-RNAは、sd-RNA、IL-2、OKT3及びAPC(例えば、PBMCを含む)を含む培地に添加される。一部の実施形態において、14日目に添加されるsd-RNAは、sd-RNAを含み、任意選択によりIL-2、OKT3及びAPC(例えば、PBMCを含む)の1つ以上を含む培地に添加される。一部の実施形態において、17日目に添加されるsd-RNAは、sd-RNAを含み、任意選択によりIL-2、OKT3及びAPC(例えば、PBMCを含む)の1つ以上を含む培地に添加される。一部の実施形態において、21日目に添加されるsd-RNAは、sd-RNAを含み、任意選択によりIL-2、OKT3及びAPC(例えば、PBMCを含む)の1つ以上を含む培地に添加される。一部の実施形態において、14日目に添加されるsd-RNAは、sd-RNA及びIL-2を含む培地に添加される。一部の実施形態において、17日目に添加されるsd-RNAは、sd-RNA及びIL-2を含む培地に添加される。一部の実施形態において、21日目に添加されるsd-RNAは、sd-RNA及びIL-2を含む培地に添加される。一部の実施形態において、更なるsd-RNAが14日目に添加される。一部の実施形態において、更なるsd-RNAが17日目に添加される。一部の実施形態において、更なるsd-RNAが21日目に添加される。一部の実施形態において、sd-RNAは、11日目、14日目、17日目及び21日目に同じ濃度で添加される。一部の実施形態において、sd-RNAは、11日目、14日目、17日目及び/又は21日目に異なる濃度で添加される。一部の実施形態において、sd-RNAは、PD-1を標的とする。
実施例26:実施例23の変形実施形態
[001314] 実施例23で考察される方法に従い、一過性に変化するタンパク質発現と組み合わせてTILを拡大培養する方法が記載される。この実施例は、実施例23に記載された方法に沿って更に変化した実施形態を提供する。
[001314] 実施例23で考察される方法に従い、一過性に変化するタンパク質発現と組み合わせてTILを拡大培養する方法が記載される。この実施例は、実施例23に記載された方法に沿って更に変化した実施形態を提供する。
[001315] 上記の方法の一部の実施形態において、癌を有する対象の処置方法が提供され、そのような方法は、
(a)患者象から得られた腫瘍サンプルを複数の腫瘍断片に処理することにより、対象から切除された腫瘍から第1のTIL集団を得ること;
(b)腫瘍断片を閉鎖系に添加すること;
(c)IL-2及び任意選択によりOKT-3を含む細胞培養培地中で第1のTIL集団を培養することにより、第1の拡大培養を実施して第2のTIL集団を生じさせることであって、第1の拡大培養は、第1のガス透過性表面積を提供する閉鎖型容器内で実施され、第1の拡大培養は、第2のTIL集団を得るために約3~14日間にわたって実施され、第2のTIL集団は、第1のTIL集団よりも数において少なくとも50倍多く、ステップ(b)からステップ(c)への移行は、系を開放することなく行われる、生じさせること;
(d)第2のTIL集団の細胞培養培地に追加のIL-2、OKT-3及び抗原提示細胞(APC)を補充することにより、第2の拡大培養を実施して第3のTIL集団を生じさせることであって、第2の拡大培養は、第3のTIL集団を得るために約7~14日間にわたって実施され、第3のTIL集団は、治療用TIL集団であり、第2の拡大培養は、第2のガス透過性表面積を提供する閉鎖型容器内で実施され、ステップ(c)からステップ(d)への移行は、系を開放することなく行われる、生じさせること;
(e)第2及び/又は第3のTIL集団を、転写因子(TF)及び/又はタンパク質発現を一過性に変化させることができる他の分子に11日目~21日目に曝露することであって、TF及び/又はタンパク質発現を一過性に変化させることができる他の分子は、腫瘍抗原の増加した発現及び/又は治療用TIL集団における腫瘍抗原特異的T細胞の数の増加を提供する、曝露すること;
(f)ステップ(d)から得られた治療用TIL集団を回収することであって、ステップ(d)からステップ(e)への移行は、系を開放することなく行われる、回収すること;及び
(g)ステップ(e)からの回収されたTIL集団を輸注バッグに移すことであって、ステップ(e)から(f)への移行は、系を開放することなく行われる、移すこと;
(h)任意選択により、凍結保存プロセスを使用して、ステップ(f)からの回収されたTIL集団を含む輸注バッグを凍結保存すること;及び
(i)ステップ(g)における輸注バッグから治療有効投与量の第3のTIL集団を患者に投与すること
を含む、拡大培養された腫瘍浸潤リンパ球(TIL)を投与することを含む。
(a)患者象から得られた腫瘍サンプルを複数の腫瘍断片に処理することにより、対象から切除された腫瘍から第1のTIL集団を得ること;
(b)腫瘍断片を閉鎖系に添加すること;
(c)IL-2及び任意選択によりOKT-3を含む細胞培養培地中で第1のTIL集団を培養することにより、第1の拡大培養を実施して第2のTIL集団を生じさせることであって、第1の拡大培養は、第1のガス透過性表面積を提供する閉鎖型容器内で実施され、第1の拡大培養は、第2のTIL集団を得るために約3~14日間にわたって実施され、第2のTIL集団は、第1のTIL集団よりも数において少なくとも50倍多く、ステップ(b)からステップ(c)への移行は、系を開放することなく行われる、生じさせること;
(d)第2のTIL集団の細胞培養培地に追加のIL-2、OKT-3及び抗原提示細胞(APC)を補充することにより、第2の拡大培養を実施して第3のTIL集団を生じさせることであって、第2の拡大培養は、第3のTIL集団を得るために約7~14日間にわたって実施され、第3のTIL集団は、治療用TIL集団であり、第2の拡大培養は、第2のガス透過性表面積を提供する閉鎖型容器内で実施され、ステップ(c)からステップ(d)への移行は、系を開放することなく行われる、生じさせること;
(e)第2及び/又は第3のTIL集団を、転写因子(TF)及び/又はタンパク質発現を一過性に変化させることができる他の分子に11日目~21日目に曝露することであって、TF及び/又はタンパク質発現を一過性に変化させることができる他の分子は、腫瘍抗原の増加した発現及び/又は治療用TIL集団における腫瘍抗原特異的T細胞の数の増加を提供する、曝露すること;
(f)ステップ(d)から得られた治療用TIL集団を回収することであって、ステップ(d)からステップ(e)への移行は、系を開放することなく行われる、回収すること;及び
(g)ステップ(e)からの回収されたTIL集団を輸注バッグに移すことであって、ステップ(e)から(f)への移行は、系を開放することなく行われる、移すこと;
(h)任意選択により、凍結保存プロセスを使用して、ステップ(f)からの回収されたTIL集団を含む輸注バッグを凍結保存すること;及び
(i)ステップ(g)における輸注バッグから治療有効投与量の第3のTIL集団を患者に投与すること
を含む、拡大培養された腫瘍浸潤リンパ球(TIL)を投与することを含む。
[001316] 一部の変形実施形態において、タンパク質発現を一過性に変化させることができる他の分子は、例えば、sd-rxRNAを含むが、これに限定されないsd-RNAを含む。一部の実施形態において、TILは、11日目、14日目、17日目及び/又は21日目にsd-RNAに曝露される。一部の変形実施形態において、TILは、11日目、14日目、17日目及び/又は21日目の少なくとも2日、sd-RNAに曝露される。一部の変形実施形態において、TILは、11日目、14日目、17日目及び/又は21日目の少なくとも3日、sd-RNAに曝露される。一部の変形実施形態において、TILは、11日目、14日目、17日目及び21日目の全てでsd-RNAに曝露される。一部の実施形態において、sd-RNAは、PD-1を標的とする。
[001317] 一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、標的遺伝子の発現において、70%の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、標的遺伝子の発現において、75%の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、標的遺伝子の発現において、80%の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、標的遺伝子の発現において、85%の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、標的遺伝子の発現において、90%の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、標的遺伝子の発現において、95%の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、標的遺伝子の発現において、99%の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約0.25μM~約10μMの濃度、一部の実施形態では約0.25μM~約4μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約0.25μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約0.5μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約0.75μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約1.0μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約1.25μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約1.5μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約1.75μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約2.0μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約2.25μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約2.5μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約2.75μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約3.0μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約3.25μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約3.5μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約3.75μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約4.0μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約5.0μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約6.0μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約7.0μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約8.0μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約9.0μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約10.0μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。前述の実施形態のいずれかにおいて、指定された濃度は、培地交換前又は後にTIL培養培地に関して決定され得る。
[001318] 一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、PD-1の発現において、70%の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、PD-1の発現において、75%の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、PD-1の発現において、80%の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、PD-1の発現において、85%の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、PD-1の発現において、90%の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、PD-1の発現において、95%の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、PD-1の発現において、99%の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約0.25μM~約10μMの濃度、一部の実施形態では約0.25μM~約4μMの濃度で送達された場合、PD-1の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約0.25μMの濃度で送達された場合、PD-1の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約0.5μMの濃度で送達された場合、PD-1の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約0.75μMの濃度で送達された場合、PD-1の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約1.0μMの濃度で送達された場合、PD-1の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約1.25μMの濃度で送達された場合、PD-1の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約1.5μMの濃度で送達された場合、PD-1の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約1.75μMの濃度で送達された場合、PD-1の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約2.0μMの濃度で送達された場合、PD-1の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約2.25μMの濃度で送達された場合、PD-1の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約2.5μMの濃度で送達された場合、PD-1の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約2.75μMの濃度で送達された場合、PD-1の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約3.0μMの濃度で送達された場合、PD-1の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約3.25μMの濃度で送達された場合、PD-1の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約3.5μMの濃度で送達された場合、PD-1の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約3.75μMの濃度で送達された場合、PD-1の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約4.0μMの濃度で送達された場合、PD-1の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約5.0μMの濃度で送達された場合、PD-1の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約6.0μMの濃度で送達された場合、PD-1の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約7.0μMの濃度で送達された場合、PD-1の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約8.0μMの濃度で送達された場合、PD-1の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約9.0μMの濃度で送達された場合、PD-1の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約10.0μMの濃度で送達された場合、PD-1の発現の低減を示す。前述の実施形態のいずれかにおいて、指定された濃度は、培地交換前又は後にTIL培養培地に関して決定され得る。
[001319] 一部の変形実施形態において、TILは、約0.75μM~約3μMのsd
-RNA濃度において11日目、14日目、17日目及び/又は21日目の少なくとも2日、sd-RNAに曝露される。一部の変形実施形態において、TILは、約0.75μM~約3μMのsd-RNA濃度において11日目、14日目、17日目及び/又は21日目の少なくとも3日、sd-RNAに曝露される。一部の変形実施形態において、TILは、約0.75μM~約3μMのsd-RNA濃度において11日目、14日目、17日目及び21日目の全てでsd-RNAに曝露される。一部の変形実施形態において、sd-RNAは、約0.75μM~約3μMのsd-RNA濃度で培地交換と共に添加される。一部の実施形態において、sd-RNAは、PD-1を標的とする。
-RNA濃度において11日目、14日目、17日目及び/又は21日目の少なくとも2日、sd-RNAに曝露される。一部の変形実施形態において、TILは、約0.75μM~約3μMのsd-RNA濃度において11日目、14日目、17日目及び/又は21日目の少なくとも3日、sd-RNAに曝露される。一部の変形実施形態において、TILは、約0.75μM~約3μMのsd-RNA濃度において11日目、14日目、17日目及び21日目の全てでsd-RNAに曝露される。一部の変形実施形態において、sd-RNAは、約0.75μM~約3μMのsd-RNA濃度で培地交換と共に添加される。一部の実施形態において、sd-RNAは、PD-1を標的とする。
[001320] 一部の変形実施形態において、TILは、約1.0μM~約2.5μMのsd-RNA濃度において11日目、14日目、17日目及び/又は21日目の少なくとも2日、sd-RNAに曝露される。一部の変形実施形態において、TILは、約1.0μM~約2.5μMのsd-RNA濃度において11日目、14日目、17日目及び/又は21日目の少なくとも3日、sd-RNAに曝露される。一部の変形実施形態において、TILは、約1.0μM~約2.5μMのsd-RNA濃度において11日目、14日目、17日目及び21日目の全てでsd-RNAに曝露される。一部の変形実施形態において、sd-RNAは、約1.0μM~約2.5μMのsd-RNA濃度で培地交換と共に添加される。一部の実施形態において、sd-RNAは、PD-1を標的とする。
[001321] 一部の変形実施形態において、TILは、約1.5μM~約2.5μMのsd-RNA濃度において11日目、14日目、17日目及び/又は21日目の少なくとも2日、sd-RNAに曝露される。一部の変形実施形態において、TILは、約1.5μM~約2.5μMのsd-RNA濃度において11日目、14日目、17日目及び/又は21日目の少なくとも3日、sd-RNAに曝露される。一部の変形実施形態において、TILは、約1.5μM~約2.5μMのsd-RNA濃度において11日目、14日目、17日目及び21日目の全てでsd-RNAに曝露される。一部の変形実施形態において、sd-RNAは、約1.5μM~約2.5μMのsd-RNA濃度で培地交換と共に添加される。一部の実施形態において、sd-RNAは、PD-1を標的とする。
[001322] 一部の変形実施形態において、TILは、2μMのsd-RNA濃度において11日目、14日目、17日目及び/又は21日目の少なくとも2日、sd-RNAに曝露される。一部の変形実施形態において、TILは、約2μMのsd-RNA濃度において11日目、14日目、17日目及び/又は21日目の少なくとも3日、sd-RNAに曝露される。一部の変形実施形態において、TILは、約2μMのsd-RNA濃度において11日目、14日目、17日目及び21日目の全てでsd-RNAに曝露される。一部の変形実施形態において、sd-RNAは、約2μMのsd-RNA濃度で培地交換と共に添加される。一部の実施形態において、sd-RNAは、PD-1を標的とする。
[001323] 一部の実施形態において、11日目に添加されるsd-RNAは、sd-RNA、IL-2、OKT3及びAPC(例えば、PBMCを含む)を含む培地に添加される。一部の実施形態において、14日目に添加されるsd-RNAは、sd-RNAを含み、任意選択によりIL-2、OKT3及びAPC(例えば、PBMCを含む)の1つ以上を含む培地に添加される。一部の実施形態において、17日目に添加されるsd-RNAは、sd-RNAを含み、任意選択によりIL-2、OKT3及びAPC(例えば、PBMCを含む)の1つ以上を含む培地に添加される。一部の実施形態において、21日目に添加されるsd-RNAは、sd-RNAを含み、任意選択によりIL-2、OKT3及びAPC(例えば、PBMCを含む)の1つ以上を含む培地に添加される。一部の実施形態において、14日目に添加されるsd-RNAは、sd-RNA及びIL-2を含む培地に添加される。一部の実施形態において、17日目に添加されるsd-RNAは、sd-RNA及びIL-2を含む培地に添加される。一部の実施形態において、21日目に
添加されるsd-RNAは、sd-RNA及びIL-2を含む培地に添加される。一部の実施形態において、更なるsd-RNAが14日目に添加される。一部の実施形態において、更なるsd-RNAが17日目に添加される。一部の実施形態において、更なるsd-RNAが21日目に添加される。一部の実施形態において、sd-RNAは、11日目、14日目、17日目及び21日目に同じ濃度で添加される。一部の実施形態において、sd-RNAは、11日目、14日目、17日目及び/又は21日目に異なる濃度で添加される。一部の実施形態において、sd-RNAは、PD-1を標的とする。
添加されるsd-RNAは、sd-RNA及びIL-2を含む培地に添加される。一部の実施形態において、更なるsd-RNAが14日目に添加される。一部の実施形態において、更なるsd-RNAが17日目に添加される。一部の実施形態において、更なるsd-RNAが21日目に添加される。一部の実施形態において、sd-RNAは、11日目、14日目、17日目及び21日目に同じ濃度で添加される。一部の実施形態において、sd-RNAは、11日目、14日目、17日目及び/又は21日目に異なる濃度で添加される。一部の実施形態において、sd-RNAは、PD-1を標的とする。
実施例27:実施例23の変形実施形態
[001324] 実施例23で考察される方法に従い、一過性に変化するタンパク質発現と組み合わせてTILを拡大培養する方法が記載される。この実施例は、実施例23に記載された方法に沿って更に変化した実施形態を提供する。
[001324] 実施例23で考察される方法に従い、一過性に変化するタンパク質発現と組み合わせてTILを拡大培養する方法が記載される。この実施例は、実施例23に記載された方法に沿って更に変化した実施形態を提供する。
[001325] 上記の方法の一部の実施形態において、癌を有する対象の処置に使用するための拡大培養されたTIL集団が提供され得、拡大培養されたTIL集団は、
(a)患者から得られた腫瘍サンプルを複数の腫瘍断片に処理することにより、対象から切除された腫瘍から第1のTIL集団を得ること;
(b)腫瘍断片を閉鎖系に添加すること;
(c)IL-2及び任意選択によりOKT-3を含む細胞培養培地中で第1のTIL集団を培養することにより、第1の拡大培養を実施して第2のTIL集団を生じさせることであって、第1の拡大培養は、第1のガス透過性表面積を提供する閉鎖型容器内で実施され、第1の拡大培養は、第2のTIL集団を得るために約3~14日間にわたって実施され、第2のTIL集団は、第1のTIL集団よりも数において少なくとも50倍多く、ステップ(b)からステップ(c)への移行は、系を開放することなく行われる、生じさせること;
(d)第2のTIL集団の細胞培養培地に追加のIL-2、OKT-3及び抗原提示細胞(APC)を補充することにより、第2の拡大培養を実施して第3のTIL集団を生じさせることであって、第2の拡大培養は、第3のTIL集団を得るために約7~14日間にわたって実施され、第3のTIL集団は、治療用TIL集団であり、第2の拡大培養は、第2のガス透過性表面積を提供する閉鎖型容器内で実施され、ステップ(c)からステップ(d)への移行は、系を開放することなく行われる、生じさせること;
(e)第2及び/又は第3のTIL集団を、転写因子(TF)及び/又はタンパク質発現を一過性に変化させることができる他の分子に11日目~21日目に曝露することであって、TF及び/又はタンパク質発現を一過性に変化させることができる他の分子は、腫瘍抗原の増加した発現及び/又は治療用TIL集団における腫瘍抗原特異的T細胞の数の増加を提供する、曝露すること;
(f)ステップ(d)から得られた治療用TIL集団を回収することであって、ステップ(e)からステップ(f)への移行は、系を開放することなく行われる、回収すること;及び
(g)ステップ(e)からの回収されたTIL集団を輸注バッグに移すことであって、ステップ(f)から(g)への移行は、系を開放することなく行われる、移すこと;及び
(h)任意選択により、凍結保存プロセスを使用して、ステップ(f)からの回収されたTIL集団を含む輸注バッグを凍結保存すること
を含む方法によって得ることができる第3のTIL集団である。
(a)患者から得られた腫瘍サンプルを複数の腫瘍断片に処理することにより、対象から切除された腫瘍から第1のTIL集団を得ること;
(b)腫瘍断片を閉鎖系に添加すること;
(c)IL-2及び任意選択によりOKT-3を含む細胞培養培地中で第1のTIL集団を培養することにより、第1の拡大培養を実施して第2のTIL集団を生じさせることであって、第1の拡大培養は、第1のガス透過性表面積を提供する閉鎖型容器内で実施され、第1の拡大培養は、第2のTIL集団を得るために約3~14日間にわたって実施され、第2のTIL集団は、第1のTIL集団よりも数において少なくとも50倍多く、ステップ(b)からステップ(c)への移行は、系を開放することなく行われる、生じさせること;
(d)第2のTIL集団の細胞培養培地に追加のIL-2、OKT-3及び抗原提示細胞(APC)を補充することにより、第2の拡大培養を実施して第3のTIL集団を生じさせることであって、第2の拡大培養は、第3のTIL集団を得るために約7~14日間にわたって実施され、第3のTIL集団は、治療用TIL集団であり、第2の拡大培養は、第2のガス透過性表面積を提供する閉鎖型容器内で実施され、ステップ(c)からステップ(d)への移行は、系を開放することなく行われる、生じさせること;
(e)第2及び/又は第3のTIL集団を、転写因子(TF)及び/又はタンパク質発現を一過性に変化させることができる他の分子に11日目~21日目に曝露することであって、TF及び/又はタンパク質発現を一過性に変化させることができる他の分子は、腫瘍抗原の増加した発現及び/又は治療用TIL集団における腫瘍抗原特異的T細胞の数の増加を提供する、曝露すること;
(f)ステップ(d)から得られた治療用TIL集団を回収することであって、ステップ(e)からステップ(f)への移行は、系を開放することなく行われる、回収すること;及び
(g)ステップ(e)からの回収されたTIL集団を輸注バッグに移すことであって、ステップ(f)から(g)への移行は、系を開放することなく行われる、移すこと;及び
(h)任意選択により、凍結保存プロセスを使用して、ステップ(f)からの回収されたTIL集団を含む輸注バッグを凍結保存すること
を含む方法によって得ることができる第3のTIL集団である。
[001326] 一部の変形実施形態において、タンパク質発現を一過性に変化させることができる他の分子は、例えば、sd-rxRNAを含むが、これに限定されないsd-RNAを含む。一部の実施形態において、TILは、11日目、14日目、17日目及び/又は21日目にsd-RNAに曝露される。一部の変形実施形態において、TILは、11日目、14日目、17日目及び/又は21日目の少なくとも2日、sd-RNAに曝露さ
れる。一部の変形実施形態において、TILは、11日目、14日目、17日目及び/又は21日目の少なくとも3日、sd-RNAに曝露される。一部の変形実施形態において、TILは、11日目、14日目、17日目及び21日目の全てでsd-RNAに曝露される。一部の実施形態において、sd-RNAは、PD-1を標的とする。
れる。一部の変形実施形態において、TILは、11日目、14日目、17日目及び/又は21日目の少なくとも3日、sd-RNAに曝露される。一部の変形実施形態において、TILは、11日目、14日目、17日目及び21日目の全てでsd-RNAに曝露される。一部の実施形態において、sd-RNAは、PD-1を標的とする。
[001327] 一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、標的遺伝子の発現において、70%の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、標的遺伝子の発現において、75%の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、標的遺伝子の発現において、80%の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、標的遺伝子の発現において、85%の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、標的遺伝子の発現において、90%の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、標的遺伝子の発現において、95%の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、標的遺伝子の発現において、99%の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約0.25μM~約10μMの濃度、一部の実施形態では約0.25μM~約4μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約0.25μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約0.5μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約0.75μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約1.0μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約1.25μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約1.5μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約1.75μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約2.0μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約2.25μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約2.5μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約2.75μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約3.0μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約3.25μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約3.5μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約3.75μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約4.0μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約5.0μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約6.0μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約7.0μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約8.0μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約
9.0μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約10.0μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。前述の実施形態のいずれかにおいて、指定された濃度は、培地交換前又は後にTIL培養培地に関して決定され得る。
9.0μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約10.0μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。前述の実施形態のいずれかにおいて、指定された濃度は、培地交換前又は後にTIL培養培地に関して決定され得る。
[001328] 一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、PD-1の発現において、70%の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、PD-1の発現において、75%の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、PD-1の発現において、80%の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、PD-1の発現において、85%の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、PD-1の発現において、90%の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、PD-1の発現において、95%の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、PD-1の発現において、99%の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約0.25μM~約10μMの濃度、一部の実施形態では約0.25μM~約4μMの濃度で送達された場合、PD-1の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約0.25μMの濃度で送達された場合、PD-1の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約0.5μMの濃度で送達された場合、PD-1の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約0.75μMの濃度で送達された場合、PD-1の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約1.0μMの濃度で送達された場合、PD-1の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約1.25μMの濃度で送達された場合、PD-1の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約1.5μMの濃度で送達された場合、PD-1の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約1.75μMの濃度で送達された場合、PD-1の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約2.0μMの濃度で送達された場合、PD-1の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約2.25μMの濃度で送達された場合、PD-1の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約2.5μMの濃度で送達された場合、PD-1の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約2.75μMの濃度で送達された場合、PD-1の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約3.0μMの濃度で送達された場合、PD-1の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約3.25μMの濃度で送達された場合、PD-1の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約3.5μMの濃度で送達された場合、PD-1の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約3.75μMの濃度で送達された場合、PD-1の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約4.0μMの濃度で送達された場合、PD-1の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約5.0μMの濃度で送達された場合、PD-1の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約6.0μMの濃度で送達された場合、PD-1の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約7.0μMの濃度で送達された場合、PD-1の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約8.0μMの濃度で送達された場合、PD-1の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約9.0μMの濃度で送達された場合、PD-1の発現の低減を
示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約10.0μMの濃度で送達された場合、PD-1の発現の低減を示す。前述の実施形態のいずれかにおいて、指定された濃度は、培地交換前又は後にTIL培養培地に関して決定され得る。
示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約10.0μMの濃度で送達された場合、PD-1の発現の低減を示す。前述の実施形態のいずれかにおいて、指定された濃度は、培地交換前又は後にTIL培養培地に関して決定され得る。
[001329] 一部の変形実施形態において、TILは、約0.75μM~約3μMのsd-RNA濃度において11日目、14日目、17日目及び/又は21日目の少なくとも2日、sd-RNAに曝露される。一部の変形実施形態において、TILは、約0.75μM~約3μMのsd-RNA濃度において11日目、14日目、17日目及び/又は21日目の少なくとも3日、sd-RNAに曝露される。一部の変形実施形態において、TILは、約0.75μM~約3μMのsd-RNA濃度において11日目、14日目、17日目及び21日目の全てでsd-RNAに曝露される。一部の変形実施形態において、sd-RNAは、約0.75μM~約3μMのsd-RNA濃度で培地交換と共に添加される。一部の実施形態において、sd-RNAは、PD-1を標的とする。
[001330] 一部の変形実施形態において、TILは、約1.0μM~約2.5μMのsd-RNA濃度において11日目、14日目、17日目及び/又は21日目の少なくとも2日、sd-RNAに曝露される。一部の変形実施形態において、TILは、約1.0μM~約2.5μMのsd-RNA濃度において11日目、14日目、17日目及び/又は21日目の少なくとも3日、sd-RNAに曝露される。一部の変形実施形態において、TILは、約1.0μM~約2.5μMのsd-RNA濃度において11日目、14日目、17日目及び21日目の全てでsd-RNAに曝露される。一部の変形実施形態において、sd-RNAは、約1.0μM~約2.5μMのsd-RNA濃度で培地交換と共に添加される。一部の実施形態において、sd-RNAは、PD-1を標的とする。
[001331] 一部の変形実施形態において、TILは、約1.5μM~約2.5μMのsd-RNA濃度において11日目、14日目、17日目及び/又は21日目の少なくとも2日、sd-RNAに曝露される。一部の変形実施形態において、TILは、約1.5μM~約2.5μMのsd-RNA濃度において11日目、14日目、17日目及び/又は21日目の少なくとも3日、sd-RNAに曝露される。一部の変形実施形態において、TILは、約1.5μM~約2.5μMのsd-RNA濃度において11日目、14日目、17日目及び21日目の全てでsd-RNAに曝露される。一部の変形実施形態において、sd-RNAは、約1.5μM~約2.5μMのsd-RNA濃度で培地交換と共に添加される。一部の実施形態において、sd-RNAは、PD-1を標的とする。
[001332] 一部の変形実施形態において、TILは、2μMのsd-RNA濃度において11日目、14日目、17日目及び/又は21日目の少なくとも2日、sd-RNAに曝露される。一部の変形実施形態において、TILは、約2μMのsd-RNA濃度において11日目、14日目、17日目及び/又は21日目の少なくとも3日、sd-RNAに曝露される。一部の変形実施形態において、TILは、約2μMのsd-RNA濃度において11日目、14日目、17日目及び21日目の全てでsd-RNAに曝露される。一部の変形実施形態において、sd-RNAは、約2μMのsd-RNA濃度で培地交換と共に添加される。一部の実施形態において、sd-RNAは、PD-1を標的とする。
[001333] 一部の実施形態において、11日目に添加されるsd-RNAは、sd-RNA、IL-2、OKT3及びAPC(例えば、PBMCを含む)を含む培地に添加される。一部の実施形態において、14日目に添加されるsd-RNAは、sd-RNAを含み、任意選択によりIL-2、OKT3及びAPC(例えば、PBMCを含む)の1つ以上を含む培地に添加される。一部の実施形態において、17日目に添加されるsd-RNAは、sd-RNAを含み、任意選択によりIL-2、OKT3及びAPC(例えば、PBMCを含む)の1つ以上を含む培地に添加される。一部の実施形態において、21日目
に添加されるsd-RNAは、sd-RNAを含み、任意選択によりIL-2、OKT3及びAPC(例えば、PBMCを含む)の1つ以上を含む培地に添加される。一部の実施形態において、14日目に添加されるsd-RNAは、sd-RNA及びIL-2を含む培地に添加される。一部の実施形態において、17日目に添加されるsd-RNAは、sd-RNA及びIL-2を含む培地に添加される。一部の実施形態において、21日目に添加されるsd-RNAは、sd-RNA及びIL-2を含む培地に添加される。一部の実施形態において、更なるsd-RNAが14日目に添加される。一部の実施形態において、更なるsd-RNAが17日目に添加される。一部の実施形態において、更なるsd-RNAが21日目に添加される。一部の実施形態において、sd-RNAは、11日目、14日目、17日目及び21日目に同じ濃度で添加される。一部の実施形態において、sd-RNAは、11日目、14日目、17日目及び/又は21日目に異なる濃度で添加される。一部の実施形態において、sd-RNAは、PD-1を標的とする。
に添加されるsd-RNAは、sd-RNAを含み、任意選択によりIL-2、OKT3及びAPC(例えば、PBMCを含む)の1つ以上を含む培地に添加される。一部の実施形態において、14日目に添加されるsd-RNAは、sd-RNA及びIL-2を含む培地に添加される。一部の実施形態において、17日目に添加されるsd-RNAは、sd-RNA及びIL-2を含む培地に添加される。一部の実施形態において、21日目に添加されるsd-RNAは、sd-RNA及びIL-2を含む培地に添加される。一部の実施形態において、更なるsd-RNAが14日目に添加される。一部の実施形態において、更なるsd-RNAが17日目に添加される。一部の実施形態において、更なるsd-RNAが21日目に添加される。一部の実施形態において、sd-RNAは、11日目、14日目、17日目及び21日目に同じ濃度で添加される。一部の実施形態において、sd-RNAは、11日目、14日目、17日目及び/又は21日目に異なる濃度で添加される。一部の実施形態において、sd-RNAは、PD-1を標的とする。
実施例28:実施例23の変形実施形態
[001334] 実施例23で考察される方法に従い、一過性に変化するタンパク質発現と組み合わせてTILを拡大培養する方法が記載される。この実施例は、実施例23に記載された方法に沿って更に変化した実施形態を提供する。
[001334] 実施例23で考察される方法に従い、一過性に変化するタンパク質発現と組み合わせてTILを拡大培養する方法が記載される。この実施例は、実施例23に記載された方法に沿って更に変化した実施形態を提供する。
[001335] 上記の方法の一部の実施形態において、
(a)患者から得られた腫瘍サンプルを複数の腫瘍断片に処理することにより、患者から切除された腫瘍から第1のTIL集団を得ること;
(b)腫瘍断片を閉鎖系に添加すること;
(c)IL-2を含み、且つ任意選択により4-1BBアゴニスト抗体を含む細胞培養培地中で約2~5日間にわたって第1のTIL集団を培養することにより、第1の拡大培養を実施すること;
(d)OKT-3を添加して第2のTIL集団を生じさせることであって、第1の拡大培養は、第1のガス透過性表面積を提供する閉鎖型容器内で実施され、第1の拡大培養は、第2のTIL集団を得るために約1~3日間にわたって実施され、第2のTIL集団は、第1のTIL集団よりも数において少なくとも50倍多く、ステップ(c)からステップ(d)への移行は、系を開放することなく行われる、生じさせること;
(e)第2のTIL集団を約1日間にわたって静置すること;
(f)第2のTIL集団の細胞培養培地に追加のIL-2、任意選択によりOKT-3抗体、任意選択によりOX40抗体及び抗原提示細胞(APC)を補充することにより、第2の拡大培養を実施して第3のTIL集団を生じさせることであって、第2の拡大培養は、第3のTIL集団を得るために約7~11日間にわたって実施され、第2の拡大培養は、第2のガス透過性表面積を提供する閉鎖型容器内で実施され、ステップ(c)からステップ(f)への移行は、系を開放することなく行われる、生じさせること;
(g)11~21日目を含む、ステップ(d)、(e)及び/又は(f)のいずれかの間に第2のTIL集団を少なくとも1つのsd-RNAと接触させることであって、sd-RNAは、0.1μM sd-RNA、0.5μM sd-RNA、0.75μM sd-RNA、1μM sd-RNA、1.25μM sd-RNA、1.5μM sd-RNA、2μM sd-RNA、5μM sd-RNA又は10μM sd-RNAの濃度で添加され、sd-RNAは、PD-1、LAG-3、TIM-3、CISH及びCBLB並びにそれらの組み合わせからなる群から選択される分子の発現を阻害するためのものである、接触させること;
(h)任意選択により、第2のTIL集団に対して無菌エレクトロポレーションステップを実施することであって、無菌エレクトロポレーションステップは、少なくとも1つのsd-RNAの移動を媒介する、実施すること;
(i)ステップ(g)又は(h)から得られた治療用TIL集団を回収して、回収されたTIL集団を提供することであって、ステップ(g)からステップ(i)への移行は、系
を開放することなく行われ、回収されたTIL集団は、治療用TIL集団である、提供すること;及び
(j)ステップ(i)からの回収されたTIL集団を輸注バッグに移すことであって、ステップ(i)から(j)への移行は、系を開放することなく行われる、移すこと
を含む、腫瘍浸潤リンパ球(TIL)を治療用TIL集団に拡大培養する方法が提供される。
(a)患者から得られた腫瘍サンプルを複数の腫瘍断片に処理することにより、患者から切除された腫瘍から第1のTIL集団を得ること;
(b)腫瘍断片を閉鎖系に添加すること;
(c)IL-2を含み、且つ任意選択により4-1BBアゴニスト抗体を含む細胞培養培地中で約2~5日間にわたって第1のTIL集団を培養することにより、第1の拡大培養を実施すること;
(d)OKT-3を添加して第2のTIL集団を生じさせることであって、第1の拡大培養は、第1のガス透過性表面積を提供する閉鎖型容器内で実施され、第1の拡大培養は、第2のTIL集団を得るために約1~3日間にわたって実施され、第2のTIL集団は、第1のTIL集団よりも数において少なくとも50倍多く、ステップ(c)からステップ(d)への移行は、系を開放することなく行われる、生じさせること;
(e)第2のTIL集団を約1日間にわたって静置すること;
(f)第2のTIL集団の細胞培養培地に追加のIL-2、任意選択によりOKT-3抗体、任意選択によりOX40抗体及び抗原提示細胞(APC)を補充することにより、第2の拡大培養を実施して第3のTIL集団を生じさせることであって、第2の拡大培養は、第3のTIL集団を得るために約7~11日間にわたって実施され、第2の拡大培養は、第2のガス透過性表面積を提供する閉鎖型容器内で実施され、ステップ(c)からステップ(f)への移行は、系を開放することなく行われる、生じさせること;
(g)11~21日目を含む、ステップ(d)、(e)及び/又は(f)のいずれかの間に第2のTIL集団を少なくとも1つのsd-RNAと接触させることであって、sd-RNAは、0.1μM sd-RNA、0.5μM sd-RNA、0.75μM sd-RNA、1μM sd-RNA、1.25μM sd-RNA、1.5μM sd-RNA、2μM sd-RNA、5μM sd-RNA又は10μM sd-RNAの濃度で添加され、sd-RNAは、PD-1、LAG-3、TIM-3、CISH及びCBLB並びにそれらの組み合わせからなる群から選択される分子の発現を阻害するためのものである、接触させること;
(h)任意選択により、第2のTIL集団に対して無菌エレクトロポレーションステップを実施することであって、無菌エレクトロポレーションステップは、少なくとも1つのsd-RNAの移動を媒介する、実施すること;
(i)ステップ(g)又は(h)から得られた治療用TIL集団を回収して、回収されたTIL集団を提供することであって、ステップ(g)からステップ(i)への移行は、系
を開放することなく行われ、回収されたTIL集団は、治療用TIL集団である、提供すること;及び
(j)ステップ(i)からの回収されたTIL集団を輸注バッグに移すことであって、ステップ(i)から(j)への移行は、系を開放することなく行われる、移すこと
を含む、腫瘍浸潤リンパ球(TIL)を治療用TIL集団に拡大培養する方法が提供される。
[001336] 一部の変形実施形態において、タンパク質発現を一過性に変化させることができる他の分子は、例えば、sd-rxRNAを含むが、これに限定されないsd-RNAを含む。一部の実施形態において、TILは、11日目、14日目、17日目及び/又は21日目にsd-RNAに曝露される。一部の変形実施形態において、TILは、11日目、14日目、17日目及び/又は21日目の少なくとも2日、sd-RNAに曝露される。一部の変形実施形態において、TILは、11日目、14日目、17日目及び/又は21日目の少なくとも3日、sd-RNAに曝露される。一部の変形実施形態において、TILは、11日目、14日目、17日目及び21日目の全てでsd-RNAに曝露される。一部の実施形態において、sd-RNAは、PD-1を標的とする。
[001337] 一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、標的遺伝子の発現において、70%の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、標的遺伝子の発現において、75%の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、標的遺伝子の発現において、80%の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、標的遺伝子の発現において、85%の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、標的遺伝子の発現において、90%の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、標的遺伝子の発現において、95%の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、標的遺伝子の発現において、99%の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約0.25μM~約10μMの濃度、一部の実施形態では約0.25μM~約4μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約0.25μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約0.5μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約0.75μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約1.0μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約1.25μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約1.5μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約1.75μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約2.0μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約2.25μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約2.5μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約2.75μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約3.0μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約3.25μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一
部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約3.5μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約3.75μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約4.0μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約5.0μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約6.0μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約7.0μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約8.0μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約9.0μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約10.0μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。前述の実施形態のいずれかにおいて、指定された濃度は、培地交換前又は後にTIL培養培地に関して決定され得る。
部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約3.5μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約3.75μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約4.0μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約5.0μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約6.0μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約7.0μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約8.0μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約9.0μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約10.0μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。前述の実施形態のいずれかにおいて、指定された濃度は、培地交換前又は後にTIL培養培地に関して決定され得る。
[001338] 一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、PD-1の発現において、70%の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、PD-1の発現において、75%の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、PD-1の発現において、80%の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、PD-1の発現において、85%の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、PD-1の発現において、90%の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、PD-1の発現において、95%の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、PD-1の発現において、99%の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約0.25μM~約10μMの濃度、一部の実施形態では約0.25μM~約4μMの濃度で送達された場合、PD-1の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約0.25μMの濃度で送達された場合、PD-1の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約0.5μMの濃度で送達された場合、PD-1の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約0.75μMの濃度で送達された場合、PD-1の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約1.0μMの濃度で送達された場合、PD-1の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約1.25μMの濃度で送達された場合、PD-1の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約1.5μMの濃度で送達された場合、PD-1の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約1.75μMの濃度で送達された場合、PD-1の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約2.0μMの濃度で送達された場合、PD-1の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約2.25μMの濃度で送達された場合、PD-1の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約2.5μMの濃度で送達された場合、PD-1の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約2.75μMの濃度で送達された場合、PD-1の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約3.0μMの濃度で送達された場合、PD-1の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約3.25μMの濃度で送達された場合、PD-1の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるs
d-RNA配列は、約3.5μMの濃度で送達された場合、PD-1の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約3.75μMの濃度で送達された場合、PD-1の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約4.0μMの濃度で送達された場合、PD-1の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約5.0μMの濃度で送達された場合、PD-1の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約6.0μMの濃度で送達された場合、PD-1の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約7.0μMの濃度で送達された場合、PD-1の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約8.0μMの濃度で送達された場合、PD-1の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約9.0μMの濃度で送達された場合、PD-1の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約10.0μMの濃度で送達された場合、PD-1の発現の低減を示す。前述の実施形態のいずれかにおいて、指定された濃度は、培地交換前又は後にTIL培養培地に関して決定され得る。
d-RNA配列は、約3.5μMの濃度で送達された場合、PD-1の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約3.75μMの濃度で送達された場合、PD-1の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約4.0μMの濃度で送達された場合、PD-1の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約5.0μMの濃度で送達された場合、PD-1の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約6.0μMの濃度で送達された場合、PD-1の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約7.0μMの濃度で送達された場合、PD-1の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約8.0μMの濃度で送達された場合、PD-1の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約9.0μMの濃度で送達された場合、PD-1の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約10.0μMの濃度で送達された場合、PD-1の発現の低減を示す。前述の実施形態のいずれかにおいて、指定された濃度は、培地交換前又は後にTIL培養培地に関して決定され得る。
[001339] 一部の変形実施形態において、TILは、約0.75μM~約3μMのsd-RNA濃度において11日目、14日目、17日目及び/又は21日目の少なくとも2日、sd-RNAに曝露される。一部の変形実施形態において、TILは、約0.75μM~約3μMのsd-RNA濃度において11日目、14日目、17日目及び/又は21日目の少なくとも3日、sd-RNAに曝露される。一部の変形実施形態において、TILは、約0.75μM~約3μMのsd-RNA濃度において11日目、14日目、17日目及び21日目の全てでsd-RNAに曝露される。一部の変形実施形態において、sd-RNAは、約0.75μM~約3μMのsd-RNA濃度で培地交換と共に添加される。一部の実施形態において、sd-RNAは、PD-1を標的とする。
[001340] 一部の変形実施形態において、TILは、約1.0μM~約2.5μMのsd-RNA濃度において11日目、14日目、17日目及び/又は21日目の少なくとも2日、sd-RNAに曝露される。一部の変形実施形態において、TILは、約1.0μM~約2.5μMのsd-RNA濃度において11日目、14日目、17日目及び/又は21日目の少なくとも3日、sd-RNAに曝露される。一部の変形実施形態において、TILは、約1.0μM~約2.5μMのsd-RNA濃度において11日目、14日目、17日目及び21日目の全てでsd-RNAに曝露される。一部の変形実施形態において、sd-RNAは、約1.0μM~約2.5μMのsd-RNA濃度で培地交換と共に添加される。一部の実施形態において、sd-RNAは、PD-1を標的とする。
[001341] 一部の変形実施形態において、TILは、約1.5μM~約2.5μMのsd-RNA濃度において11日目、14日目、17日目及び/又は21日目の少なくとも2日、sd-RNAに曝露される。一部の変形実施形態において、TILは、約1.5μM~約2.5μMのsd-RNA濃度において11日目、14日目、17日目及び/又は21日目の少なくとも3日、sd-RNAに曝露される。一部の変形実施形態において、TILは、約1.5μM~約2.5μMのsd-RNA濃度において11日目、14日目、17日目及び21日目の全てでsd-RNAに曝露される。一部の変形実施形態において、sd-RNAは、約1.5μM~約2.5μMのsd-RNA濃度で培地交換と共に添加される。一部の実施形態において、sd-RNAは、PD-1を標的とする。
[001342] 一部の変形実施形態において、TILは、2μMのsd-RNA濃度において11日目、14日目、17日目及び/又は21日目の少なくとも2日、sd-RNAに曝露される。一部の変形実施形態において、TILは、約2μMのsd-RNA濃度において11日目、14日目、17日目及び/又は21日目の少なくとも3日、sd-RNA
に曝露される。一部の変形実施形態において、TILは、約2μMのsd-RNA濃度において11日目、14日目、17日目及び21日目の全てでsd-RNAに曝露される。一部の変形実施形態において、sd-RNAは、約2μMのsd-RNA濃度で培地交換と共に添加される。一部の実施形態において、sd-RNAは、PD-1を標的とする。
に曝露される。一部の変形実施形態において、TILは、約2μMのsd-RNA濃度において11日目、14日目、17日目及び21日目の全てでsd-RNAに曝露される。一部の変形実施形態において、sd-RNAは、約2μMのsd-RNA濃度で培地交換と共に添加される。一部の実施形態において、sd-RNAは、PD-1を標的とする。
[001343] 一部の実施形態において、11日目に添加されるsd-RNAは、sd-RNA、IL-2、OKT3及びAPC(例えば、PBMCを含む)を含む培地に添加される。一部の実施形態において、14日目に添加されるsd-RNAは、sd-RNAを含み、任意選択によりIL-2、OKT3及びAPC(例えば、PBMCを含む)の1つ以上を含む培地に添加される。一部の実施形態において、17日目に添加されるsd-RNAは、sd-RNAを含み、任意選択によりIL-2、OKT3及びAPC(例えば、PBMCを含む)の1つ以上を含む培地に添加される。一部の実施形態において、21日目に添加されるsd-RNAは、sd-RNAを含み、任意選択によりIL-2、OKT3及びAPC(例えば、PBMCを含む)の1つ以上を含む培地に添加される。一部の実施形態において、14日目に添加されるsd-RNAは、sd-RNA及びIL-2を含む培地に添加される。一部の実施形態において、17日目に添加されるsd-RNAは、sd-RNA及びIL-2を含む培地に添加される。一部の実施形態において、21日目に添加されるsd-RNAは、sd-RNA及びIL-2を含む培地に添加される。一部の実施形態において、更なるsd-RNAが14日目に添加される。一部の実施形態において、更なるsd-RNAが17日目に添加される。一部の実施形態において、更なるsd-RNAが21日目に添加される。一部の実施形態において、sd-RNAは、11日目、14日目、17日目及び21日目に同じ濃度で添加される。一部の実施形態において、sd-RNAは、11日目、14日目、17日目及び/又は21日目に異なる濃度で添加される。一部の実施形態において、sd-RNAは、PD-1を標的とする。
実施例29:実施例23の変形実施形態
[001344] 実施例23で考察される方法に従い、一過性に変化するタンパク質発現と組み合わせてTILを拡大培養する方法が記載される。この実施例は、実施例23に記載された方法に沿って更に変化した実施形態を提供する。
[001344] 実施例23で考察される方法に従い、一過性に変化するタンパク質発現と組み合わせてTILを拡大培養する方法が記載される。この実施例は、実施例23に記載された方法に沿って更に変化した実施形態を提供する。
[001345] 上記の方法の一部の実施形態において、
(a)患者から得られた腫瘍サンプルを複数の腫瘍断片に処理することにより、患者から切除された腫瘍から第1のTIL集団を得ること;
(b)腫瘍断片を閉鎖系に添加すること;
(c)IL-2を含み、且つ任意選択により4-1BBアゴニスト抗体を含む細胞培養培地中で約2~5日間にわたって第1のTIL集団を培養することにより、第1の拡大培養を実施すること;
(d)OKT-3を添加して第2のTIL集団を生じさせることであって、第1の拡大培養は、第1のガス透過性表面積を提供する閉鎖型容器内で実施され、第1の拡大培養は、第2のTIL集団を得るために約1~3日間にわたって実施され、第2のTIL集団は、第1のTIL集団よりも数において少なくとも50倍多く、ステップ(c)からステップ(d)への移行は、系を開放することなく行われる、生じさせること;
(e)第2のTIL集団を約1日間にわたって静置すること;
(f)第2のTIL集団の細胞培養培地に追加のIL-2、任意選択によりOKT-3抗体、任意選択によりOX40抗体及び抗原提示細胞(APC)を補充することにより、第2の拡大培養を実施して第3のTIL集団を生じさせることであって、第2の拡大培養は、第3のTIL集団を得るために約7~11日間にわたって実施され、第2の拡大培養は、第2のガス透過性表面積を提供する閉鎖型容器内で実施され、ステップ(c)からステップ(f)への移行は、系を開放することなく行われる、生じさせること;
(g)11~21日目を含む、ステップ(d)、(e)及び/又は(f)のいずれかの間
に第2のTIL集団を少なくとも1つのsd-RNAと接触させることであって、sd-RNAは、2μM sd-RNAの濃度で添加され、sd-RNAは、PD-1、LAG-3、TIM-3、CISH及びCBLB並びにそれらの組み合わせからなる群から選択される分子の発現を阻害するためのものである、接触させること;
(h)任意選択により、第2のTIL集団に対して無菌エレクトロポレーションステップを実施することであって、無菌エレクトロポレーションステップは、少なくとも1つのsd-RNAの移動を媒介する、実施すること;
(i)ステップ(g)又は(h)から得られた治療用TIL集団を回収して、回収されたTIL集団を提供することであって、ステップ(g)からステップ(i)への移行は、系を開放することなく行われ、回収されたTIL集団は、治療用TIL集団である、提供すること;及び
(j)ステップ(i)からの回収されたTIL集団を輸注バッグに移すことであって、ステップ(i)から(j)への移行は、系を開放することなく行われる、移すこと
を含む、腫瘍浸潤リンパ球(TIL)を治療用TIL集団に拡大培養する方法が提供される。
(a)患者から得られた腫瘍サンプルを複数の腫瘍断片に処理することにより、患者から切除された腫瘍から第1のTIL集団を得ること;
(b)腫瘍断片を閉鎖系に添加すること;
(c)IL-2を含み、且つ任意選択により4-1BBアゴニスト抗体を含む細胞培養培地中で約2~5日間にわたって第1のTIL集団を培養することにより、第1の拡大培養を実施すること;
(d)OKT-3を添加して第2のTIL集団を生じさせることであって、第1の拡大培養は、第1のガス透過性表面積を提供する閉鎖型容器内で実施され、第1の拡大培養は、第2のTIL集団を得るために約1~3日間にわたって実施され、第2のTIL集団は、第1のTIL集団よりも数において少なくとも50倍多く、ステップ(c)からステップ(d)への移行は、系を開放することなく行われる、生じさせること;
(e)第2のTIL集団を約1日間にわたって静置すること;
(f)第2のTIL集団の細胞培養培地に追加のIL-2、任意選択によりOKT-3抗体、任意選択によりOX40抗体及び抗原提示細胞(APC)を補充することにより、第2の拡大培養を実施して第3のTIL集団を生じさせることであって、第2の拡大培養は、第3のTIL集団を得るために約7~11日間にわたって実施され、第2の拡大培養は、第2のガス透過性表面積を提供する閉鎖型容器内で実施され、ステップ(c)からステップ(f)への移行は、系を開放することなく行われる、生じさせること;
(g)11~21日目を含む、ステップ(d)、(e)及び/又は(f)のいずれかの間
に第2のTIL集団を少なくとも1つのsd-RNAと接触させることであって、sd-RNAは、2μM sd-RNAの濃度で添加され、sd-RNAは、PD-1、LAG-3、TIM-3、CISH及びCBLB並びにそれらの組み合わせからなる群から選択される分子の発現を阻害するためのものである、接触させること;
(h)任意選択により、第2のTIL集団に対して無菌エレクトロポレーションステップを実施することであって、無菌エレクトロポレーションステップは、少なくとも1つのsd-RNAの移動を媒介する、実施すること;
(i)ステップ(g)又は(h)から得られた治療用TIL集団を回収して、回収されたTIL集団を提供することであって、ステップ(g)からステップ(i)への移行は、系を開放することなく行われ、回収されたTIL集団は、治療用TIL集団である、提供すること;及び
(j)ステップ(i)からの回収されたTIL集団を輸注バッグに移すことであって、ステップ(i)から(j)への移行は、系を開放することなく行われる、移すこと
を含む、腫瘍浸潤リンパ球(TIL)を治療用TIL集団に拡大培養する方法が提供される。
[001346] 一部の変形実施形態において、タンパク質発現を一過性に変化させることができる他の分子は、例えば、sd-rxRNAを含むが、これに限定されないsd-RNAを含む。一部の実施形態において、TILは、11日目、14日目、17日目及び/又は21日目にsd-RNAに曝露される。一部の変形実施形態において、TILは、11日目、14日目、17日目及び/又は21日目の少なくとも2日、sd-RNAに曝露される。一部の変形実施形態において、TILは、11日目、14日目、17日目及び/又は21日目の少なくとも3日、sd-RNAに曝露される。一部の変形実施形態において、TILは、11日目、14日目、17日目及び21日目の全てでsd-RNAに曝露される。一部の実施形態において、sd-RNAは、PD-1を標的とする。
[001347] 一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、標的遺伝子の発現において、70%の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、標的遺伝子の発現において、75%の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、標的遺伝子の発現において、80%の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、標的遺伝子の発現において、85%の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、標的遺伝子の発現において、90%の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、標的遺伝子の発現において、95%の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、標的遺伝子の発現において、99%の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約2.0μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。前述の実施形態のいずれかにおいて、指定された濃度は、培地交換前又は後にTIL培養培地に関して決定され得る。
[001348] 一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、PD-1の発現において、70%の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、PD-1の発現において、75%の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、PD-1の発現において、80%の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、PD-1の発現において、85%の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、PD-1の発現において、90%の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、PD-1の発現において、95%の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、PD-1の発現において、99%の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd
-RNA配列は、約2.0μMの濃度で送達された場合、PD-1の発現の低減を示す。前述の実施形態のいずれかにおいて、指定された濃度は、培地交換前又は後にTIL培養培地に関して決定され得る。
-RNA配列は、約2.0μMの濃度で送達された場合、PD-1の発現の低減を示す。前述の実施形態のいずれかにおいて、指定された濃度は、培地交換前又は後にTIL培養培地に関して決定され得る。
[001349] 一部の変形実施形態において、TILは、約0.75μM~約3μMのsd-RNA濃度において11日目、14日目、17日目及び/又は21日目の少なくとも2日、sd-RNAに曝露される。一部の変形実施形態において、TILは、約0.75μM~約3μMのsd-RNA濃度において11日目、14日目、17日目及び/又は21日目の少なくとも3日、sd-RNAに曝露される。一部の変形実施形態において、TILは、約2μMのsd-RNA濃度において11日目、14日目、17日目及び21日目の全てでsd-RNAに曝露される。一部の変形実施形態において、sd-RNAは、約2μMのsd-RNA濃度で培地交換と共に添加される。一部の実施形態において、sd-RNAは、PD-1を標的とする。
[001350] 一部の変形実施形態において、TILは、約1.0μM~約2.5μMのsd-RNA濃度において11日目、14日目、17日目及び/又は21日目の少なくとも2日、sd-RNAに曝露される。一部の変形実施形態において、TILは、約1.0μM~約2.5μMのsd-RNA濃度において11日目、14日目、17日目及び/又は21日目の少なくとも3日、sd-RNAに曝露される。一部の変形実施形態において、TILは、約1.0μM~約2.5μMのsd-RNA濃度において11日目、14日目、17日目及び21日目の全てでsd-RNAに曝露される。一部の変形実施形態において、sd-RNAは、約2.0μM~約2.5μMのsd-RNA濃度で培地交換と共に添加される。一部の実施形態において、sd-RNAは、PD-1を標的とする。
[001351] 一部の変形実施形態において、TILは、約1.5μM~約2.5μMのsd-RNA濃度において11日目、14日目、17日目及び/又は21日目の少なくとも2日、sd-RNAに曝露される。一部の変形実施形態において、TILは、約1.5μM~約2.5μMのsd-RNA濃度において11日目、14日目、17日目及び/又は21日目の少なくとも3日、sd-RNAに曝露される。一部の変形実施形態において、TILは、約1.5μM~約2.5μMのsd-RNA濃度において11日目、14日目、17日目及び21日目の全てでsd-RNAに曝露される。一部の変形実施形態において、sd-RNAは、約1.75μM~約2.25μMのsd-RNA濃度で培地交換と共に添加される。一部の実施形態において、sd-RNAは、PD-1を標的とする。
[001352] 一部の変形実施形態において、TILは、2μMのsd-RNA濃度において11日目、14日目、17日目及び/又は21日目の少なくとも2日、sd-RNAに曝露される。一部の変形実施形態において、TILは、約2μMのsd-RNA濃度において11日目、14日目、17日目及び/又は21日目の少なくとも3日、sd-RNAに曝露される。一部の変形実施形態において、TILは、約2μMのsd-RNA濃度において11日目、14日目、17日目及び21日目の全てでsd-RNAに曝露される。一部の変形実施形態において、sd-RNAは、約2μMのsd-RNA濃度で培地交換と共に添加される。一部の実施形態において、sd-RNAは、PD-1を標的とする。
[001353] 一部の実施形態において、11日目に添加されるsd-RNAは、sd-RNA、IL-2、OKT3及びAPC(例えば、PBMCを含む)を含む培地に添加される。一部の実施形態において、14日目に添加されるsd-RNAは、sd-RNAを含み、任意選択によりIL-2、OKT3及びAPC(例えば、PBMCを含む)の1つ以上を含む培地に添加される。一部の実施形態において、17日目に添加されるsd-RNAは、sd-RNAを含み、任意選択によりIL-2、OKT3及びAPC(例えば、PBMCを含む)の1つ以上を含む培地に添加される。一部の実施形態において、21日目
に添加されるsd-RNAは、sd-RNAを含み、任意選択によりIL-2、OKT3及びAPC(例えば、PBMCを含む)の1つ以上を含む培地に添加される。一部の実施形態において、14日目に添加されるsd-RNAは、sd-RNA及びIL-2を含む培地に添加される。一部の実施形態において、17日目に添加されるsd-RNAは、sd-RNA及びIL-2を含む培地に添加される。一部の実施形態において、21日目に添加されるsd-RNAは、sd-RNA及びIL-2を含む培地に添加される。一部の実施形態において、更なるsd-RNAが14日目に添加される。一部の実施形態において、更なるsd-RNAが17日目に添加される。一部の実施形態において、更なるsd-RNAが21日目に添加される。一部の実施形態において、sd-RNAは、11日目、14日目、17日目及び21日目に同じ濃度で添加される。一部の実施形態において、sd-RNAは、11日目、14日目、17日目及び/又は21日目に異なる濃度で添加され、ここで、少なくとも1日、sd-RNAの濃度は約2μMで添加される。一部の実施形態において、sd-RNAは、PD-1を標的とする。
に添加されるsd-RNAは、sd-RNAを含み、任意選択によりIL-2、OKT3及びAPC(例えば、PBMCを含む)の1つ以上を含む培地に添加される。一部の実施形態において、14日目に添加されるsd-RNAは、sd-RNA及びIL-2を含む培地に添加される。一部の実施形態において、17日目に添加されるsd-RNAは、sd-RNA及びIL-2を含む培地に添加される。一部の実施形態において、21日目に添加されるsd-RNAは、sd-RNA及びIL-2を含む培地に添加される。一部の実施形態において、更なるsd-RNAが14日目に添加される。一部の実施形態において、更なるsd-RNAが17日目に添加される。一部の実施形態において、更なるsd-RNAが21日目に添加される。一部の実施形態において、sd-RNAは、11日目、14日目、17日目及び21日目に同じ濃度で添加される。一部の実施形態において、sd-RNAは、11日目、14日目、17日目及び/又は21日目に異なる濃度で添加され、ここで、少なくとも1日、sd-RNAの濃度は約2μMで添加される。一部の実施形態において、sd-RNAは、PD-1を標的とする。
実施例30:実施例23の変形実施形態
[001354] 実施例23で考察される方法に従い、一過性に変化するタンパク質発現と組み合わせてTILを拡大培養する方法が記載される。この実施例は、実施例23に記載された方法に沿って更に変化した実施形態を提供する。
[001354] 実施例23で考察される方法に従い、一過性に変化するタンパク質発現と組み合わせてTILを拡大培養する方法が記載される。この実施例は、実施例23に記載された方法に沿って更に変化した実施形態を提供する。
[001355] 上記の方法の一部の実施形態において、
(a)患者から得られた腫瘍サンプルを複数の腫瘍断片に処理することにより、患者から切除された腫瘍から第1のTIL集団を得ること;
(b)腫瘍断片を閉鎖系に添加すること;
(c)IL-2を含み、且つ任意選択により4-1BBアゴニスト抗体を含む細胞培養培地中で約2~5日間にわたって第1のTIL集団を培養することにより、第1の拡大培養を実施すること;
(d)OKT-3を添加して第2のTIL集団を生じさせることであって、第1の拡大培養は、第1のガス透過性表面積を提供する閉鎖型容器内で実施され、第1の拡大培養は、第2のTIL集団を得るために約1~3日間にわたって実施され、第2のTIL集団は、第1のTIL集団よりも数において少なくとも50倍多く、ステップ(c)からステップ(d)への移行は、系を開放することなく行われる、生じさせること;
(e)第2のTIL集団を約1日間にわたって静置すること;
(f)第2のTIL集団の細胞培養培地に追加のIL-2、任意選択によりOKT-3抗体、任意選択によりOX40抗体及び抗原提示細胞(APC)を補充することにより、第2の拡大培養を実施して第3のTIL集団を生じさせることであって、第2の拡大培養は、第3のTIL集団を得るために約7~11日間にわたって実施され、第2の拡大培養は、第2のガス透過性表面積を提供する閉鎖型容器内で実施され、ステップ(c)からステップ(f)への移行は、系を開放することなく行われる、生じさせること;
(g)11~21日目を含む、ステップ(d)、(e)及び/又は(f)のいずれかの間に第2のTIL集団を少なくとも1つのsd-RNAと接触させることであって、sd-RNAは、0.1μM sd-RNA、0.5μM sd-RNA、0.75μM sd-RNA、1μM sd-RNA、1.25μM sd-RNA、1.5μM sd-RNA、2μM sd-RNA、5μM sd-RNA又は10μM sd-RNAの濃度で添加され、sd-RNAは、PD-1、LAG-3、TIM-3、CISH及びCBLB並びにそれらの組み合わせからなる群から選択される分子の発現を阻害するためのものである、接触させること;
(h)任意選択により、第2のTIL集団に対して無菌エレクトロポレーションステップを実施することであって、無菌エレクトロポレーションステップは、少なくとも1つのsd-RNAの移動を媒介する、実施すること;
(i)ステップ(g)又は(h)から得られた治療用TIL集団を回収して、回収された
TIL集団を提供することであって、ステップ(g)からステップ(i)への移行は、系を開放することなく行われ、回収されたTIL集団は、治療用TIL集団である、提供すること;
(j)ステップ(i)からの回収されたTIL集団を輸注バッグに移すことであって、ステップ(i)から(j)への移行は、系を開放することなく行われる、移すこと;及び
(k)ジメチルスルホキシドベースの凍結保存培地を使用して、回収されたTIL集団を凍結保存すること
を含む、腫瘍浸潤リンパ球(TIL)を治療用TIL集団に拡大培養する方法が提供される。
(a)患者から得られた腫瘍サンプルを複数の腫瘍断片に処理することにより、患者から切除された腫瘍から第1のTIL集団を得ること;
(b)腫瘍断片を閉鎖系に添加すること;
(c)IL-2を含み、且つ任意選択により4-1BBアゴニスト抗体を含む細胞培養培地中で約2~5日間にわたって第1のTIL集団を培養することにより、第1の拡大培養を実施すること;
(d)OKT-3を添加して第2のTIL集団を生じさせることであって、第1の拡大培養は、第1のガス透過性表面積を提供する閉鎖型容器内で実施され、第1の拡大培養は、第2のTIL集団を得るために約1~3日間にわたって実施され、第2のTIL集団は、第1のTIL集団よりも数において少なくとも50倍多く、ステップ(c)からステップ(d)への移行は、系を開放することなく行われる、生じさせること;
(e)第2のTIL集団を約1日間にわたって静置すること;
(f)第2のTIL集団の細胞培養培地に追加のIL-2、任意選択によりOKT-3抗体、任意選択によりOX40抗体及び抗原提示細胞(APC)を補充することにより、第2の拡大培養を実施して第3のTIL集団を生じさせることであって、第2の拡大培養は、第3のTIL集団を得るために約7~11日間にわたって実施され、第2の拡大培養は、第2のガス透過性表面積を提供する閉鎖型容器内で実施され、ステップ(c)からステップ(f)への移行は、系を開放することなく行われる、生じさせること;
(g)11~21日目を含む、ステップ(d)、(e)及び/又は(f)のいずれかの間に第2のTIL集団を少なくとも1つのsd-RNAと接触させることであって、sd-RNAは、0.1μM sd-RNA、0.5μM sd-RNA、0.75μM sd-RNA、1μM sd-RNA、1.25μM sd-RNA、1.5μM sd-RNA、2μM sd-RNA、5μM sd-RNA又は10μM sd-RNAの濃度で添加され、sd-RNAは、PD-1、LAG-3、TIM-3、CISH及びCBLB並びにそれらの組み合わせからなる群から選択される分子の発現を阻害するためのものである、接触させること;
(h)任意選択により、第2のTIL集団に対して無菌エレクトロポレーションステップを実施することであって、無菌エレクトロポレーションステップは、少なくとも1つのsd-RNAの移動を媒介する、実施すること;
(i)ステップ(g)又は(h)から得られた治療用TIL集団を回収して、回収された
TIL集団を提供することであって、ステップ(g)からステップ(i)への移行は、系を開放することなく行われ、回収されたTIL集団は、治療用TIL集団である、提供すること;
(j)ステップ(i)からの回収されたTIL集団を輸注バッグに移すことであって、ステップ(i)から(j)への移行は、系を開放することなく行われる、移すこと;及び
(k)ジメチルスルホキシドベースの凍結保存培地を使用して、回収されたTIL集団を凍結保存すること
を含む、腫瘍浸潤リンパ球(TIL)を治療用TIL集団に拡大培養する方法が提供される。
[001356] 一部の変形実施形態において、タンパク質発現を一過性に変化させることができる他の分子は、例えば、sd-rxRNAを含むが、これに限定されないsd-RNAを含む。一部の実施形態において、TILは、11日目、14日目、17日目及び/又は21日目にsd-RNAに曝露される。一部の変形実施形態において、TILは、11日目、14日目、17日目及び/又は21日目の少なくとも2日、sd-RNAに曝露される。一部の変形実施形態において、TILは、11日目、14日目、17日目及び/又は21日目の少なくとも3日、sd-RNAに曝露される。一部の変形実施形態において、TILは、11日目、14日目、17日目及び21日目の全てでsd-RNAに曝露される。一部の実施形態において、sd-RNAは、PD-1を標的とする。
[001357] 一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、標的遺伝子の発現において、70%の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、標的遺伝子の発現において、75%の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、標的遺伝子の発現において、80%の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、標的遺伝子の発現において、85%の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、標的遺伝子の発現において、90%の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、標的遺伝子の発現において、95%の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、標的遺伝子の発現において、99%の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約0.25μM~約10μMの濃度、一部の実施形態では約0.25μM~約4μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約0.25μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約0.5μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約0.75μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約1.0μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約1.25μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約1.5μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約1.75μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約2.0μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約2.25μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約2.5μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約2.75μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態におい
て、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約3.0μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約3.25μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約3.5μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約3.75μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約4.0μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約5.0μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約6.0μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約7.0μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約8.0μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約9.0μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約10.0μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。前述の実施形態のいずれかにおいて、指定された濃度は、培地交換前又は後にTIL培養培地に関して決定され得る。
て、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約3.0μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約3.25μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約3.5μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約3.75μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約4.0μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約5.0μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約6.0μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約7.0μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約8.0μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約9.0μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約10.0μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。前述の実施形態のいずれかにおいて、指定された濃度は、培地交換前又は後にTIL培養培地に関して決定され得る。
[001358] 一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、PD-1の発現において、70%の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、PD-1の発現において、75%の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、PD-1の発現において、80%の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、PD-1の発現において、85%の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、PD-1の発現において、90%の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、PD-1の発現において、95%の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、PD-1の発現において、99%の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約0.25μM~約10μMの濃度、一部の実施形態では約0.25μM~約4μMの濃度で送達された場合、PD-1の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約0.25μMの濃度で送達された場合、PD-1の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約0.5μMの濃度で送達された場合、PD-1の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約0.75μMの濃度で送達された場合、PD-1の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約1.0μMの濃度で送達された場合、PD-1の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約1.25μMの濃度で送達された場合、PD-1の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約1.5μMの濃度で送達された場合、PD-1の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約1.75μMの濃度で送達された場合、PD-1の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約2.0μMの濃度で送達された場合、PD-1の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約2.25μMの濃度で送達された場合、PD-1の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約2.5μMの濃度で送達された場合、PD-1の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約2.75μMの濃度で送達された場合、PD-1の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列
は、約3.0μMの濃度で送達された場合、PD-1の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約3.25μMの濃度で送達された場合、PD-1の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約3.5μMの濃度で送達された場合、PD-1の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約3.75μMの濃度で送達された場合、PD-1の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約4.0μMの濃度で送達された場合、PD-1の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約5.0μMの濃度で送達された場合、PD-1の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約6.0μMの濃度で送達された場合、PD-1の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約7.0μMの濃度で送達された場合、PD-1の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約8.0μMの濃度で送達された場合、PD-1の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約9.0μMの濃度で送達された場合、PD-1の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約10.0μMの濃度で送達された場合、PD-1の発現の低減を示す。前述の実施形態のいずれかにおいて、指定された濃度は、培地交換前又は後にTIL培養培地に関して決定され得る。
は、約3.0μMの濃度で送達された場合、PD-1の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約3.25μMの濃度で送達された場合、PD-1の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約3.5μMの濃度で送達された場合、PD-1の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約3.75μMの濃度で送達された場合、PD-1の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約4.0μMの濃度で送達された場合、PD-1の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約5.0μMの濃度で送達された場合、PD-1の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約6.0μMの濃度で送達された場合、PD-1の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約7.0μMの濃度で送達された場合、PD-1の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約8.0μMの濃度で送達された場合、PD-1の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約9.0μMの濃度で送達された場合、PD-1の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約10.0μMの濃度で送達された場合、PD-1の発現の低減を示す。前述の実施形態のいずれかにおいて、指定された濃度は、培地交換前又は後にTIL培養培地に関して決定され得る。
[001359] 一部の変形実施形態において、TILは、約0.75μM~約3μMのsd-RNA濃度において11日目、14日目、17日目及び/又は21日目の少なくとも2日、sd-RNAに曝露される。一部の変形実施形態において、TILは、約0.75μM~約3μMのsd-RNA濃度において11日目、14日目、17日目及び/又は21日目の少なくとも3日、sd-RNAに曝露される。一部の変形実施形態において、TILは、約0.75μM~約3μMのsd-RNA濃度において11日目、14日目、17日目及び21日目の全てでsd-RNAに曝露される。一部の変形実施形態において、sd-RNAは、約0.75μM~約3μMのsd-RNA濃度で培地交換と共に添加される。一部の実施形態において、sd-RNAは、PD-1を標的とする。
[001360] 一部の変形実施形態において、TILは、約1.0μM~約2.5μMのsd-RNA濃度において11日目、14日目、17日目及び/又は21日目の少なくとも2日、sd-RNAに曝露される。一部の変形実施形態において、TILは、約1.0μM~約2.5μMのsd-RNA濃度において11日目、14日目、17日目及び/又は21日目の少なくとも3日、sd-RNAに曝露される。一部の変形実施形態において、TILは、約1.0μM~約2.5μMのsd-RNA濃度において11日目、14日目、17日目及び21日目の全てでsd-RNAに曝露される。一部の変形実施形態において、sd-RNAは、約1.0μM~約2.5μMのsd-RNA濃度で培地交換と共に添加される。一部の実施形態において、sd-RNAは、PD-1を標的とする。
[001361] 一部の変形実施形態において、TILは、約1.5μM~約2.5μMのsd-RNA濃度において11日目、14日目、17日目及び/又は21日目の少なくとも2日、sd-RNAに曝露される。一部の変形実施形態において、TILは、約1.5μM~約2.5μMのsd-RNA濃度において11日目、14日目、17日目及び/又は21日目の少なくとも3日、sd-RNAに曝露される。一部の変形実施形態において、TILは、約1.5μM~約2.5μMのsd-RNA濃度において11日目、14日目、17日目及び21日目の全てでsd-RNAに曝露される。一部の変形実施形態において、sd-RNAは、約1.5μM~約2.5μMのsd-RNA濃度で培地交換と共に添加される。一部の実施形態において、sd-RNAは、PD-1を標的とする。
[001362] 一部の変形実施形態において、TILは、2μMのsd-RNA濃度におい
て11日目、14日目、17日目及び/又は21日目の少なくとも2日、sd-RNAに曝露される。一部の変形実施形態において、TILは、約2μMのsd-RNA濃度において11日目、14日目、17日目及び/又は21日目の少なくとも3日、sd-RNAに曝露される。一部の変形実施形態において、TILは、約2μMのsd-RNA濃度において11日目、14日目、17日目及び21日目の全てでsd-RNAに曝露される。一部の変形実施形態において、sd-RNAは、約2μMのsd-RNA濃度で培地交換と共に添加される。一部の実施形態において、sd-RNAは、PD-1を標的とする。
て11日目、14日目、17日目及び/又は21日目の少なくとも2日、sd-RNAに曝露される。一部の変形実施形態において、TILは、約2μMのsd-RNA濃度において11日目、14日目、17日目及び/又は21日目の少なくとも3日、sd-RNAに曝露される。一部の変形実施形態において、TILは、約2μMのsd-RNA濃度において11日目、14日目、17日目及び21日目の全てでsd-RNAに曝露される。一部の変形実施形態において、sd-RNAは、約2μMのsd-RNA濃度で培地交換と共に添加される。一部の実施形態において、sd-RNAは、PD-1を標的とする。
[001363] 一部の実施形態において、11日目に添加されるsd-RNAは、sd-RNA、IL-2、OKT3及びAPC(例えば、PBMCを含む)を含む培地に添加される。一部の実施形態において、14日目に添加されるsd-RNAは、sd-RNAを含み、任意選択によりIL-2、OKT3及びAPC(例えば、PBMCを含む)の1つ以上を含む培地に添加される。一部の実施形態において、17日目に添加されるsd-RNAは、sd-RNAを含み、任意選択によりIL-2、OKT3及びAPC(例えば、PBMCを含む)の1つ以上を含む培地に添加される。一部の実施形態において、21日目に添加されるsd-RNAは、sd-RNAを含み、任意選択によりIL-2、OKT3及びAPC(例えば、PBMCを含む)の1つ以上を含む培地に添加される。一部の実施形態において、14日目に添加されるsd-RNAは、sd-RNA及びIL-2を含む培地に添加される。一部の実施形態において、17日目に添加されるsd-RNAは、sd-RNA及びIL-2を含む培地に添加される。一部の実施形態において、21日目に添加されるsd-RNAは、sd-RNA及びIL-2を含む培地に添加される。一部の実施形態において、更なるsd-RNAが14日目に添加される。一部の実施形態において、更なるsd-RNAが17日目に添加される。一部の実施形態において、更なるsd-RNAが21日目に添加される。一部の実施形態において、sd-RNAは、11日目、14日目、17日目及び21日目に同じ濃度で添加される。一部の実施形態において、sd-RNAは、11日目、14日目、17日目及び/又は21日目に異なる濃度で添加される。一部の実施形態において、sd-RNAは、PD-1を標的とする。
実施例31:実施例23の変形実施形態
[001364] 実施例23で考察される方法に従い、一過性に変化するタンパク質発現と組み合わせてTILを拡大培養する方法が記載される。この実施例は、実施例23に記載された方法に沿って更に変化した実施形態を提供する。
[001364] 実施例23で考察される方法に従い、一過性に変化するタンパク質発現と組み合わせてTILを拡大培養する方法が記載される。この実施例は、実施例23に記載された方法に沿って更に変化した実施形態を提供する。
[001365] 上記の方法の一部の実施形態において、
(a)患者から得られた腫瘍サンプルを複数の腫瘍断片に処理することにより、患者から切除された腫瘍から第1のTIL集団を得ること;
(b)腫瘍断片を閉鎖系に添加すること;
(c)IL-2を含み、且つ任意選択により4-1BBアゴニスト抗体を含む細胞培養培地中で約2~5日間にわたって第1のTIL集団を培養することにより、第1の拡大培養を実施すること;
(d)11~21日目に第1のTIL集団を少なくとも1つのsd-RNAと接触させることであって、sd-RNAは、0.1μM sd-RNA/10,000TIL/100μL培地、0.5μM sd-RNA/10,000TIL/100μL培地、0.75μM sd-RNA/10,000TIL/100μL培地、1μM sd-RNA/10,000TIL/100μL培地、1.25μM sd-RNA/10,000TIL/100μL培地、1.5μM sd-RNA/10,000TIL/100μL培地、2μM sd-RNA/10,000TIL/100μL培地、5μM sd-RNA/10,000TIL/100μL培地又は10μM sd-RNA/10,000TIL/100μL培地の濃度で添加され、sd-RNAは、PD-1、LAG-3、TIM-3、CISH及びCBLB並びにそれらの組み合わせからなる群から選択される分子の
発現を阻害するためのものである、接触させること;
(e)任意選択により、第1のTIL集団に対して無菌エレクトロポレーションステップを実施することであって、無菌エレクトロポレーションステップは、少なくとも1つのsd-RNAの移動を媒介する、実施すること;
(f)OKT-3を添加して第2のTIL集団を生じさせることであって、第1の拡大培養は、第1のガス透過性表面積を提供する閉鎖型容器内で実施され、第1の拡大培養は、第2のTIL集団を得るために約1~3日間にわたって実施され、第2のTIL集団は、第1のTIL集団よりも数において少なくとも50倍多く、ステップ(c)からステップ(f)への移行は、系を開放することなく行われる、生じさせること;
(g)第2のTIL集団を約1日間にわたって静置すること;
(h)第2のTIL集団の細胞培養培地に追加のIL-2、任意選択によりOKT-3抗体、任意選択によりOX40抗体及び抗原提示細胞(APC)を補充することにより、第2の拡大培養を実施して第3のTIL集団を生じさせることであって、第2の拡大培養は、第3のTIL集団を得るために約7~11日間にわたって実施され、第2の拡大培養は、第2のガス透過性表面積を提供する閉鎖型容器内で実施され、ステップ(c)からステップ(h)への移行は、系を開放することなく行われる、生じさせること;
(i)ステップ(h)から得られた治療用TIL集団を回収して、回収されたTIL集団を提供することであって、ステップ(h)からステップ(i)への移行は、系を開放することなく行われ、回収されたTIL集団は、治療用TIL集団である、提供すること;
(j)ステップ(i)からの回収されたTIL集団を輸注バッグに移すことであって、ステップ(i)から(j)への移行は、系を開放することなく行われる、移すこと;及び
(k)ジメチルスルホキシドベースの凍結保存培地を使用して、回収されたTIL集団を凍結保存すること
を含む、腫瘍浸潤リンパ球(TIL)を治療用TIL集団に拡大培養する方法が提供される。
(a)患者から得られた腫瘍サンプルを複数の腫瘍断片に処理することにより、患者から切除された腫瘍から第1のTIL集団を得ること;
(b)腫瘍断片を閉鎖系に添加すること;
(c)IL-2を含み、且つ任意選択により4-1BBアゴニスト抗体を含む細胞培養培地中で約2~5日間にわたって第1のTIL集団を培養することにより、第1の拡大培養を実施すること;
(d)11~21日目に第1のTIL集団を少なくとも1つのsd-RNAと接触させることであって、sd-RNAは、0.1μM sd-RNA/10,000TIL/100μL培地、0.5μM sd-RNA/10,000TIL/100μL培地、0.75μM sd-RNA/10,000TIL/100μL培地、1μM sd-RNA/10,000TIL/100μL培地、1.25μM sd-RNA/10,000TIL/100μL培地、1.5μM sd-RNA/10,000TIL/100μL培地、2μM sd-RNA/10,000TIL/100μL培地、5μM sd-RNA/10,000TIL/100μL培地又は10μM sd-RNA/10,000TIL/100μL培地の濃度で添加され、sd-RNAは、PD-1、LAG-3、TIM-3、CISH及びCBLB並びにそれらの組み合わせからなる群から選択される分子の
発現を阻害するためのものである、接触させること;
(e)任意選択により、第1のTIL集団に対して無菌エレクトロポレーションステップを実施することであって、無菌エレクトロポレーションステップは、少なくとも1つのsd-RNAの移動を媒介する、実施すること;
(f)OKT-3を添加して第2のTIL集団を生じさせることであって、第1の拡大培養は、第1のガス透過性表面積を提供する閉鎖型容器内で実施され、第1の拡大培養は、第2のTIL集団を得るために約1~3日間にわたって実施され、第2のTIL集団は、第1のTIL集団よりも数において少なくとも50倍多く、ステップ(c)からステップ(f)への移行は、系を開放することなく行われる、生じさせること;
(g)第2のTIL集団を約1日間にわたって静置すること;
(h)第2のTIL集団の細胞培養培地に追加のIL-2、任意選択によりOKT-3抗体、任意選択によりOX40抗体及び抗原提示細胞(APC)を補充することにより、第2の拡大培養を実施して第3のTIL集団を生じさせることであって、第2の拡大培養は、第3のTIL集団を得るために約7~11日間にわたって実施され、第2の拡大培養は、第2のガス透過性表面積を提供する閉鎖型容器内で実施され、ステップ(c)からステップ(h)への移行は、系を開放することなく行われる、生じさせること;
(i)ステップ(h)から得られた治療用TIL集団を回収して、回収されたTIL集団を提供することであって、ステップ(h)からステップ(i)への移行は、系を開放することなく行われ、回収されたTIL集団は、治療用TIL集団である、提供すること;
(j)ステップ(i)からの回収されたTIL集団を輸注バッグに移すことであって、ステップ(i)から(j)への移行は、系を開放することなく行われる、移すこと;及び
(k)ジメチルスルホキシドベースの凍結保存培地を使用して、回収されたTIL集団を凍結保存すること
を含む、腫瘍浸潤リンパ球(TIL)を治療用TIL集団に拡大培養する方法が提供される。
[001366] 一部の変形実施形態において、タンパク質発現を一過性に変化させることができる他の分子は、例えば、sd-rxRNAを含むが、これに限定されないsd-RNAを含む。一部の実施形態において、TILは、11日目、14日目、17日目及び/又は21日目にsd-RNAに曝露される。一部の変形実施形態において、TILは、11日目、14日目、17日目及び/又は21日目の少なくとも2日、sd-RNAに曝露される。一部の変形実施形態において、TILは、11日目、14日目、17日目及び/又は21日目の少なくとも3日、sd-RNAに曝露される。一部の変形実施形態において、TILは、11日目、14日目、17日目及び21日目の全てでsd-RNAに曝露される。一部の実施形態において、sd-RNAは、PD-1を標的とする。
[001367] 一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、標的遺伝子の発現において、70%の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、標的遺伝子の発現において、75%の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、標的遺伝子の発現において、80%の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、標的遺伝子の発現において、85%の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、標的遺伝子の発現において、90%の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、標的遺伝子の発現において、95%の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、標的遺伝子の発現において、99%の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約0.25μM~約10μMの濃度、一部の実施形態では約0.25μM~約4μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約0.25μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明
で使用されるsd-RNA配列は、約0.5μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約0.75μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約1.0μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約1.25μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約1.5μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約1.75μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約2.0μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約2.25μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約2.5μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約2.75μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約3.0μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約3.25μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約3.5μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約3.75μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約4.0μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約5.0μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約6.0μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約7.0μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約8.0μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約9.0μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約10.0μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。前述の実施形態のいずれかにおいて、指定された濃度は、培地交換前又は後にTIL培養培地に関して決定され得る。
で使用されるsd-RNA配列は、約0.5μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約0.75μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約1.0μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約1.25μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約1.5μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約1.75μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約2.0μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約2.25μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約2.5μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約2.75μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約3.0μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約3.25μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約3.5μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約3.75μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約4.0μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約5.0μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約6.0μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約7.0μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約8.0μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約9.0μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約10.0μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。前述の実施形態のいずれかにおいて、指定された濃度は、培地交換前又は後にTIL培養培地に関して決定され得る。
[001368] 一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、PD-1の発現において、70%の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、PD-1の発現において、75%の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、PD-1の発現において、80%の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、PD-1の発現において、85%の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、PD-1の発現において、90%の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、PD-1の発現において、95%の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、PD-1の発現において、99%の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約0.25μM~約10μMの濃度、一部の実施形態では約0.25μM~約4μMの濃度で送達された場合、PD-1の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約0.25μMの濃度で送達された場合、PD-1の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-
RNA配列は、約0.5μMの濃度で送達された場合、PD-1の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約0.75μMの濃度で送達された場合、PD-1の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約1.0μMの濃度で送達された場合、PD-1の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約1.25μMの濃度で送達された場合、PD-1の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約1.5μMの濃度で送達された場合、PD-1の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約1.75μMの濃度で送達された場合、PD-1の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約2.0μMの濃度で送達された場合、PD-1の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約2.25μMの濃度で送達された場合、PD-1の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約2.5μMの濃度で送達された場合、PD-1の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約2.75μMの濃度で送達された場合、PD-1の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約3.0μMの濃度で送達された場合、PD-1の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約3.25μMの濃度で送達された場合、PD-1の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約3.5μMの濃度で送達された場合、PD-1の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約3.75μMの濃度で送達された場合、PD-1の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約4.0μMの濃度で送達された場合、PD-1の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約5.0μMの濃度で送達された場合、PD-1の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約6.0μMの濃度で送達された場合、PD-1の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約7.0μMの濃度で送達された場合、PD-1の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約8.0μMの濃度で送達された場合、PD-1の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約9.0μMの濃度で送達された場合、PD-1の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約10.0μMの濃度で送達された場合、PD-1の発現の低減を示す。前述の実施形態のいずれかにおいて、指定された濃度は、培地交換前又は後にTIL培養培地に関して決定され得る。
RNA配列は、約0.5μMの濃度で送達された場合、PD-1の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約0.75μMの濃度で送達された場合、PD-1の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約1.0μMの濃度で送達された場合、PD-1の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約1.25μMの濃度で送達された場合、PD-1の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約1.5μMの濃度で送達された場合、PD-1の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約1.75μMの濃度で送達された場合、PD-1の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約2.0μMの濃度で送達された場合、PD-1の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約2.25μMの濃度で送達された場合、PD-1の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約2.5μMの濃度で送達された場合、PD-1の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約2.75μMの濃度で送達された場合、PD-1の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約3.0μMの濃度で送達された場合、PD-1の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約3.25μMの濃度で送達された場合、PD-1の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約3.5μMの濃度で送達された場合、PD-1の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約3.75μMの濃度で送達された場合、PD-1の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約4.0μMの濃度で送達された場合、PD-1の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約5.0μMの濃度で送達された場合、PD-1の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約6.0μMの濃度で送達された場合、PD-1の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約7.0μMの濃度で送達された場合、PD-1の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約8.0μMの濃度で送達された場合、PD-1の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約9.0μMの濃度で送達された場合、PD-1の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約10.0μMの濃度で送達された場合、PD-1の発現の低減を示す。前述の実施形態のいずれかにおいて、指定された濃度は、培地交換前又は後にTIL培養培地に関して決定され得る。
[001369] 一部の変形実施形態において、TILは、約0.75μM~約3μMのsd-RNA濃度において11日目、14日目、17日目及び/又は21日目の少なくとも2日、sd-RNAに曝露される。一部の変形実施形態において、TILは、約0.75μM~約3μMのsd-RNA濃度において11日目、14日目、17日目及び/又は21日目の少なくとも3日、sd-RNAに曝露される。一部の変形実施形態において、TILは、約0.75μM~約3μMのsd-RNA濃度において11日目、14日目、17日目及び21日目の全てでsd-RNAに曝露される。一部の変形実施形態において、sd-RNAは、約0.75μM~約3μMのsd-RNA濃度で培地交換と共に添加される。一部の実施形態において、sd-RNAは、PD-1を標的とする。
[001370] 一部の変形実施形態において、TILは、約1.0μM~約2.5μMのsd-RNA濃度において11日目、14日目、17日目及び/又は21日目の少なくとも2日、sd-RNAに曝露される。一部の変形実施形態において、TILは、約1.0μM~約2.5μMのsd-RNA濃度において11日目、14日目、17日目及び/又は21日目の少なくとも3日、sd-RNAに曝露される。一部の変形実施形態において、
TILは、約1.0μM~約2.5μMのsd-RNA濃度において11日目、14日目、17日目及び21日目の全てでsd-RNAに曝露される。一部の変形実施形態において、sd-RNAは、約1.0μM~約2.5μMのsd-RNA濃度で培地交換と共に添加される。一部の実施形態において、sd-RNAは、PD-1を標的とする。
TILは、約1.0μM~約2.5μMのsd-RNA濃度において11日目、14日目、17日目及び21日目の全てでsd-RNAに曝露される。一部の変形実施形態において、sd-RNAは、約1.0μM~約2.5μMのsd-RNA濃度で培地交換と共に添加される。一部の実施形態において、sd-RNAは、PD-1を標的とする。
[001371] 一部の変形実施形態において、TILは、約1.5μM~約2.5μMのsd-RNA濃度において11日目、14日目、17日目及び/又は21日目の少なくとも2日、sd-RNAに曝露される。一部の変形実施形態において、TILは、約1.5μM~約2.5μMのsd-RNA濃度において11日目、14日目、17日目及び/又は21日目の少なくとも3日、sd-RNAに曝露される。一部の変形実施形態において、TILは、約1.5μM~約2.5μMのsd-RNA濃度において11日目、14日目、17日目及び21日目の全てでsd-RNAに曝露される。一部の変形実施形態において、sd-RNAは、約1.5μM~約2.5μMのsd-RNA濃度で培地交換と共に添加される。一部の実施形態において、sd-RNAは、PD-1を標的とする。
[001372] 一部の変形実施形態において、TILは、2μMのsd-RNA濃度において11日目、14日目、17日目及び/又は21日目の少なくとも2日、sd-RNAに曝露される。一部の変形実施形態において、TILは、約2μMのsd-RNA濃度において11日目、14日目、17日目及び/又は21日目の少なくとも3日、sd-RNAに曝露される。一部の変形実施形態において、TILは、約2μMのsd-RNA濃度において11日目、14日目、17日目及び21日目の全てでsd-RNAに曝露される。一部の変形実施形態において、sd-RNAは、約2μMのsd-RNA濃度で培地交換と共に添加される。一部の実施形態において、sd-RNAは、PD-1を標的とする。
[001373] 一部の実施形態において、11日目に添加されるsd-RNAは、sd-RNA、IL-2、OKT3及びAPC(例えば、PBMCを含む)を含む培地に添加される。一部の実施形態において、14日目に添加されるsd-RNAは、sd-RNAを含み、任意選択によりIL-2、OKT3及びAPC(例えば、PBMCを含む)の1つ以上を含む培地に添加される。一部の実施形態において、17日目に添加されるsd-RNAは、sd-RNAを含み、任意選択によりIL-2、OKT3及びAPC(例えば、PBMCを含む)の1つ以上を含む培地に添加される。一部の実施形態において、21日目に添加されるsd-RNAは、sd-RNAを含み、任意選択によりIL-2、OKT3及びAPC(例えば、PBMCを含む)の1つ以上を含む培地に添加される。一部の実施形態において、14日目に添加されるsd-RNAは、sd-RNA及びIL-2を含む培地に添加される。一部の実施形態において、17日目に添加されるsd-RNAは、sd-RNA及びIL-2を含む培地に添加される。一部の実施形態において、21日目に添加されるsd-RNAは、sd-RNA及びIL-2を含む培地に添加される。一部の実施形態において、更なるsd-RNAが14日目に添加される。一部の実施形態において、更なるsd-RNAが17日目に添加される。一部の実施形態において、更なるsd-RNAが21日目に添加される。一部の実施形態において、sd-RNAは、11日目、14日目、17日目及び21日目に同じ濃度で添加される。一部の実施形態において、sd-RNAは、11日目、14日目、17日目及び/又は21日目に異なる濃度で添加される。一部の実施形態において、sd-RNAは、PD-1を標的とする。
実施例32:実施例23の変形実施形態
[001374] 実施例23で考察される方法に従い、一過性に変化するタンパク質発現と組み合わせてTILを拡大培養する方法が記載される。この実施例は、実施例23に記載された方法に沿って更に変化した実施形態を提供する。
[001374] 実施例23で考察される方法に従い、一過性に変化するタンパク質発現と組み合わせてTILを拡大培養する方法が記載される。この実施例は、実施例23に記載された方法に沿って更に変化した実施形態を提供する。
[001375] 上記の方法の一部の実施形態において、
(a)患者から得られた腫瘍サンプルを複数の腫瘍断片に処理することにより、患者から切除された腫瘍から第1のTIL集団を得ること;
(b)腫瘍断片を閉鎖系に添加すること;
(c)IL-2を含み、且つ任意選択により4-1BBアゴニスト抗体を含む細胞培養培地中で約2~5日間にわたって第1のTIL集団を培養することにより、第1の拡大培養を実施すること;
(d)11~21日目に第1のTIL集団を少なくとも1つのsd-RNAと接触させることであって、sd-RNAは、0.1μM sd-RNA/10,000TIL、0.5μM sd-RNA/10,000TIL、0.75μM sd-RNA/10,000TIL、1μM sd-RNA/10,000TIL、1.25μM sd-RNA/10,000TIL、1.5μM sd-RNA/10,000TIL、2μM sd-RNA/10,000TIL、5μM sd-RNA/10,000TIL又は10μM
sd-RNA/10,000TILの濃度で添加され、sd-RNAは、PD-1、LAG-3、TIM-3、CISH及びCBLB並びにそれらの組み合わせからなる群から選択される分子の発現を阻害するためのものである、接触させること;
(e)任意選択により、第1のTIL集団に対して無菌エレクトロポレーションステップを実施することであって、無菌エレクトロポレーションステップは、少なくとも1つのsd-RNAの移動を媒介する、実施すること;
(f)OKT-3を添加して第2のTIL集団を生じさせることであって、第1の拡大培養は、第1のガス透過性表面積を提供する閉鎖型容器内で実施され、第1の拡大培養は、第2のTIL集団を得るために約1~3日間にわたって実施され、第2のTIL集団は、第1のTIL集団よりも数において少なくとも50倍多く、ステップ(c)からステップ(f)への移行は、系を開放することなく行われる、生じさせること;
(g)第2のTIL集団を約1日間にわたって静置すること;
(h)第2のTIL集団の細胞培養培地に追加のIL-2、任意選択によりOKT-3抗体、任意選択によりOX40抗体及び抗原提示細胞(APC)を補充することにより、第2の拡大培養を実施して第3のTIL集団を生じさせることであって、第2の拡大培養は、第3のTIL集団を得るために約7~11日間にわたって実施され、第2の拡大培養は、第2のガス透過性表面積を提供する閉鎖型容器内で実施され、ステップ(g)からステップ(h)への移行は、系を開放することなく行われる、生じさせること;
(i)ステップ(h)から得られた治療用TIL集団を回収して、回収されたTIL集団を提供することであって、ステップ(h)からステップ(i)への移行は、系を開放することなく行われ、回収されたTIL集団は、治療用TIL集団である、提供すること;
(j)ステップ(i)からの回収されたTIL集団を輸注バッグに移すことであって、ステップ(i)から(j)への移行は、系を開放することなく行われる、移すこと;及び
(k)ジメチルスルホキシドベースの凍結保存培地を使用して、回収されたTIL集団を凍結保存すること
を含む、腫瘍浸潤リンパ球(TIL)を治療用TIL集団に拡大培養する方法が提供される。
(a)患者から得られた腫瘍サンプルを複数の腫瘍断片に処理することにより、患者から切除された腫瘍から第1のTIL集団を得ること;
(b)腫瘍断片を閉鎖系に添加すること;
(c)IL-2を含み、且つ任意選択により4-1BBアゴニスト抗体を含む細胞培養培地中で約2~5日間にわたって第1のTIL集団を培養することにより、第1の拡大培養を実施すること;
(d)11~21日目に第1のTIL集団を少なくとも1つのsd-RNAと接触させることであって、sd-RNAは、0.1μM sd-RNA/10,000TIL、0.5μM sd-RNA/10,000TIL、0.75μM sd-RNA/10,000TIL、1μM sd-RNA/10,000TIL、1.25μM sd-RNA/10,000TIL、1.5μM sd-RNA/10,000TIL、2μM sd-RNA/10,000TIL、5μM sd-RNA/10,000TIL又は10μM
sd-RNA/10,000TILの濃度で添加され、sd-RNAは、PD-1、LAG-3、TIM-3、CISH及びCBLB並びにそれらの組み合わせからなる群から選択される分子の発現を阻害するためのものである、接触させること;
(e)任意選択により、第1のTIL集団に対して無菌エレクトロポレーションステップを実施することであって、無菌エレクトロポレーションステップは、少なくとも1つのsd-RNAの移動を媒介する、実施すること;
(f)OKT-3を添加して第2のTIL集団を生じさせることであって、第1の拡大培養は、第1のガス透過性表面積を提供する閉鎖型容器内で実施され、第1の拡大培養は、第2のTIL集団を得るために約1~3日間にわたって実施され、第2のTIL集団は、第1のTIL集団よりも数において少なくとも50倍多く、ステップ(c)からステップ(f)への移行は、系を開放することなく行われる、生じさせること;
(g)第2のTIL集団を約1日間にわたって静置すること;
(h)第2のTIL集団の細胞培養培地に追加のIL-2、任意選択によりOKT-3抗体、任意選択によりOX40抗体及び抗原提示細胞(APC)を補充することにより、第2の拡大培養を実施して第3のTIL集団を生じさせることであって、第2の拡大培養は、第3のTIL集団を得るために約7~11日間にわたって実施され、第2の拡大培養は、第2のガス透過性表面積を提供する閉鎖型容器内で実施され、ステップ(g)からステップ(h)への移行は、系を開放することなく行われる、生じさせること;
(i)ステップ(h)から得られた治療用TIL集団を回収して、回収されたTIL集団を提供することであって、ステップ(h)からステップ(i)への移行は、系を開放することなく行われ、回収されたTIL集団は、治療用TIL集団である、提供すること;
(j)ステップ(i)からの回収されたTIL集団を輸注バッグに移すことであって、ステップ(i)から(j)への移行は、系を開放することなく行われる、移すこと;及び
(k)ジメチルスルホキシドベースの凍結保存培地を使用して、回収されたTIL集団を凍結保存すること
を含む、腫瘍浸潤リンパ球(TIL)を治療用TIL集団に拡大培養する方法が提供される。
[001376] 一部の変形実施形態において、タンパク質発現を一過性に変化させることができる他の分子は、例えば、sd-rxRNAを含むが、これに限定されないsd-RNAを含む。一部の実施形態において、TILは、11日目、14日目、17日目及び/又は21日目にsd-RNAに曝露される。一部の変形実施形態において、TILは、11日目、14日目、17日目及び/又は21日目の少なくとも2日、sd-RNAに曝露される。一部の変形実施形態において、TILは、11日目、14日目、17日目及び/又は21日目の少なくとも3日、sd-RNAに曝露される。一部の変形実施形態において、TILは、11日目、14日目、17日目及び21日目の全てでsd-RNAに曝露される。一部の実施形態において、sd-RNAは、PD-1を標的とする。
[001377] 一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、標的遺伝子の発現において、70%の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、標的遺伝子の発現において、75%の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、標的遺伝子の発現において、80%の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、標的遺伝子の発現において、85%の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、標的遺伝子の発現において、90%の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、標的遺伝子の発現において、95%の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、標的遺伝子の発現において、99%の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約0.25μM~約10μMの濃度、一部の実施形態では約0.25μM~約4μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約0.25μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約0.5μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約0.75μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約1.0μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約1.25μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約1.5μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約1.75μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約2.0μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約2.25μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約2.5μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約2.75μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約3.0μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約3.25μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約3.5μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約3.75μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約4.0μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約5.0μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約6.0μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約7.0μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約8.0μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約9.0μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約10.0μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。前述の実施形態のいずれかにおいて、指定された濃度は、培地交換前又は後にTIL培養培地に関して決定され得る。
[001378] 一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、PD-1の発現において、70%の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、PD-1の発現において、75%の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、PD-1の発現において、80%の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、PD-1の発現において、85%の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、PD-1の発現において、90%の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、PD-1の発現において、95%の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、PD-1の発現において、99%の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約0.25μM~約10μMの濃度、一部の実施形態では約0.25μM~約4μMの濃度で送達された場合、PD-1の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約0.25μMの濃度で送達された場合、PD-1の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約0.5μMの濃度で送達された場合、PD-1の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約0.75μMの濃度で送達された場合、PD-1の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約1.0μMの濃度で送達された場合、PD-1の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約1.25μMの濃度で送達された場合、PD-1の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約1.5μMの濃度で送達された場合、PD-1の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約1.75μMの濃度で送達された場合、PD-1の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約2.0μMの濃度で送達された場合、PD-1の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約2.25μMの濃度で送達された場合、PD-1の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約2.5μMの濃度で送達された場合、PD-1の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約2.75μMの濃度で送達された場合、PD-1の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約3.0μMの濃度で送達された場合、PD-1の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約3.25μMの濃度で送達された場合、PD-1の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約3.5μMの濃度で送達された場合、PD-1の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約3.75μMの濃度で送達された場合、PD-1の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約4.0μMの濃度で送達された場合、PD-1の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約5.0μMの濃度で送達された場合、PD-1の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約6.0μMの濃度で送達された場合、PD-1の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約7.0μMの濃度で送達された場合、PD-1の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約8.0μMの濃度で送達された場合、PD-1の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約9.0μMの濃度で送達された場合、PD-1の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約10.0μMの濃度で送達された場合、PD-1の発現の低減を示す。前述の実施形態のいずれかにおいて、指定された濃度は、培地交換前又は後にTIL培養培地に関して決定され得る。
[001379] 一部の変形実施形態において、TILは、約0.75μM~約3μMのsd
-RNA濃度において11日目、14日目、17日目及び/又は21日目の少なくとも2日、sd-RNAに曝露される。一部の変形実施形態において、TILは、約0.75μM~約3μMのsd-RNA濃度において11日目、14日目、17日目及び/又は21日目の少なくとも3日、sd-RNAに曝露される。一部の変形実施形態において、TILは、約0.75μM~約3μMのsd-RNA濃度において11日目、14日目、17日目及び21日目の全てでsd-RNAに曝露される。一部の変形実施形態において、sd-RNAは、約0.75μM~約3μMのsd-RNA濃度で培地交換と共に添加される。一部の実施形態において、sd-RNAは、PD-1を標的とする。
-RNA濃度において11日目、14日目、17日目及び/又は21日目の少なくとも2日、sd-RNAに曝露される。一部の変形実施形態において、TILは、約0.75μM~約3μMのsd-RNA濃度において11日目、14日目、17日目及び/又は21日目の少なくとも3日、sd-RNAに曝露される。一部の変形実施形態において、TILは、約0.75μM~約3μMのsd-RNA濃度において11日目、14日目、17日目及び21日目の全てでsd-RNAに曝露される。一部の変形実施形態において、sd-RNAは、約0.75μM~約3μMのsd-RNA濃度で培地交換と共に添加される。一部の実施形態において、sd-RNAは、PD-1を標的とする。
[001380] 一部の変形実施形態において、TILは、約1.0μM~約2.5μMのsd-RNA濃度において11日目、14日目、17日目及び/又は21日目の少なくとも2日、sd-RNAに曝露される。一部の変形実施形態において、TILは、約1.0μM~約2.5μMのsd-RNA濃度において11日目、14日目、17日目及び/又は21日目の少なくとも3日、sd-RNAに曝露される。一部の変形実施形態において、TILは、約1.0μM~約2.5μMのsd-RNA濃度において11日目、14日目、17日目及び21日目の全てでsd-RNAに曝露される。一部の変形実施形態において、sd-RNAは、約1.0μM~約2.5μMのsd-RNA濃度で培地交換と共に添加される。一部の実施形態において、sd-RNAは、PD-1を標的とする。
[001381] 一部の変形実施形態において、TILは、約1.5μM~約2.5μMのsd-RNA濃度において11日目、14日目、17日目及び/又は21日目の少なくとも2日、sd-RNAに曝露される。一部の変形実施形態において、TILは、約1.5μM~約2.5μMのsd-RNA濃度において11日目、14日目、17日目及び/又は21日目の少なくとも3日、sd-RNAに曝露される。一部の変形実施形態において、TILは、約1.5μM~約2.5μMのsd-RNA濃度において11日目、14日目、17日目及び21日目の全てでsd-RNAに曝露される。一部の変形実施形態において、sd-RNAは、約1.5μM~約2.5μMのsd-RNA濃度で培地交換と共に添加される。一部の実施形態において、sd-RNAは、PD-1を標的とする。
[001382] 一部の変形実施形態において、TILは、2μMのsd-RNA濃度において11日目、14日目、17日目及び/又は21日目の少なくとも2日、sd-RNAに曝露される。一部の変形実施形態において、TILは、約2μMのsd-RNA濃度において11日目、14日目、17日目及び/又は21日目の少なくとも3日、sd-RNAに曝露される。一部の変形実施形態において、TILは、約2μMのsd-RNA濃度において11日目、14日目、17日目及び21日目の全てでsd-RNAに曝露される。一部の変形実施形態において、sd-RNAは、約2μMのsd-RNA濃度で培地交換と共に添加される。一部の実施形態において、sd-RNAは、PD-1を標的とする。
[001383] 一部の実施形態において、11日目に添加されるsd-RNAは、sd-RNA、IL-2、OKT3及びAPC(例えば、PBMCを含む)を含む培地に添加される。一部の実施形態において、14日目に添加されるsd-RNAは、sd-RNAを含み、任意選択によりIL-2、OKT3及びAPC(例えば、PBMCを含む)の1つ以上を含む培地に添加される。一部の実施形態において、17日目に添加されるsd-RNAは、sd-RNAを含み、任意選択によりIL-2、OKT3及びAPC(例えば、PBMCを含む)の1つ以上を含む培地に添加される。一部の実施形態において、21日目に添加されるsd-RNAは、sd-RNAを含み、任意選択によりIL-2、OKT3及びAPC(例えば、PBMCを含む)の1つ以上を含む培地に添加される。一部の実施形態において、14日目に添加されるsd-RNAは、sd-RNA及びIL-2を含む培地に添加される。一部の実施形態において、17日目に添加されるsd-RNAは、sd-RNA及びIL-2を含む培地に添加される。一部の実施形態において、21日目に
添加されるsd-RNAは、sd-RNA及びIL-2を含む培地に添加される。一部の実施形態において、更なるsd-RNAが14日目に添加される。一部の実施形態において、更なるsd-RNAが17日目に添加される。一部の実施形態において、更なるsd-RNAが21日目に添加される。一部の実施形態において、sd-RNAは、11日目、14日目、17日目及び21日目に同じ濃度で添加される。一部の実施形態において、sd-RNAは、11日目、14日目、17日目及び/又は21日目に異なる濃度で添加される。一部の実施形態において、sd-RNAは、PD-1を標的とする。
添加されるsd-RNAは、sd-RNA及びIL-2を含む培地に添加される。一部の実施形態において、更なるsd-RNAが14日目に添加される。一部の実施形態において、更なるsd-RNAが17日目に添加される。一部の実施形態において、更なるsd-RNAが21日目に添加される。一部の実施形態において、sd-RNAは、11日目、14日目、17日目及び21日目に同じ濃度で添加される。一部の実施形態において、sd-RNAは、11日目、14日目、17日目及び/又は21日目に異なる濃度で添加される。一部の実施形態において、sd-RNAは、PD-1を標的とする。
実施例33:実施例23の変形実施形態
[001384] 実施例23で考察される方法に従い、一過性に変化するタンパク質発現と組み合わせてTILを拡大培養する方法が記載される。この実施例は、実施例23に記載された方法に沿って更に変化した実施形態を提供する。
[001384] 実施例23で考察される方法に従い、一過性に変化するタンパク質発現と組み合わせてTILを拡大培養する方法が記載される。この実施例は、実施例23に記載された方法に沿って更に変化した実施形態を提供する。
[001385] 上記の方法の一部の実施形態において、
(a)患者から得られた腫瘍サンプルを複数の腫瘍断片に処理することにより、患者から切除された腫瘍から第1のTIL集団を得ること;
(b)腫瘍断片を閉鎖系に添加すること;
(c)IL-2を含み、且つ任意選択により4-1BBアゴニスト抗体を含む細胞培養培地中で約2~5日間にわたって第1のTIL集団を培養することにより、第1の拡大培養を実施すること;
(d)OKT-3を添加して第2のTIL集団を生じさせることであって、第1の拡大培養は、第1のガス透過性表面積を提供する閉鎖型容器内で実施され、第1の拡大培養は、第2のTIL集団を得るために約1~3日間にわたって実施され、第2のTIL集団は、第1のTIL集団よりも数において少なくとも50倍多く、ステップ(c)からステップ(d)への移行は、系を開放することなく行われる、生じさせること;
(e)第2のTIL集団を約1日間にわたって静置すること;
(f)第2のTIL集団の細胞培養培地に追加のIL-2、任意選択によりOKT-3抗体、任意選択によりOX40抗体及び抗原提示細胞(APC)を補充することにより、第2の拡大培養を実施して第3のTIL集団を生じさせることであって、第2の拡大培養は、第3のTIL集団を得るために約7~11日間にわたって実施され、第2の拡大培養は、第2のガス透過性表面積を提供する閉鎖型容器内で実施され、ステップ(c)からステップ(f)への移行は、系を開放することなく行われる、生じさせること;
(g)11~21日目を含む、ステップ(d)、(e)及び/又は(f)のいずれかの間に第2のTIL集団を少なくとも1つのsd-RNAと接触させることであって、sd-RNAは、0.1μM sd-RNA/10,000TIL/100μL培地、0.5μM sd-RNA/10,000TIL/100μL培地、0.75μM sd-RNA/10,000TIL/100μL培地、1μM sd-RNA/10,000TIL/100μL培地、1.25μM sd-RNA/10,000TIL/100μL培地、1.5μM sd-RNA/10,000TIL/100μL培地、2μM sd-RNA/10,000TIL/100μL培地、5μM sd-RNA/10,000TIL/100μL培地又は10μM sd-RNA/10,000TIL/100μL培地の濃度で添加され、sd-RNAは、PD-1、LAG-3、TIM-3、CISH及びCBLB並びにそれらの組み合わせからなる群から選択される分子の発現を阻害するためのものである、接触させること;
(h)任意選択により、第2のTIL集団に対して無菌エレクトロポレーションステップを実施することであって、無菌エレクトロポレーションステップは、少なくとも1つのsd-RNAの移動を媒介する、実施すること;
(i)ステップ(g)又は(h)から得られた治療用TIL集団を回収して、回収されたTIL集団を提供することであって、ステップ(g)からステップ(i)への移行は、系を開放することなく行われ、回収されたTIL集団は、治療用TIL集団である、提供す
ること;
(j)ステップ(i)からの回収されたTIL集団を輸注バッグに移すことであって、ステップ(i)から(j)への移行は、系を開放することなく行われる、移すこと;及び
(k)ジメチルスルホキシドベースの凍結保存培地を使用して、回収されたTIL集団を凍結保存すること
を含む、腫瘍浸潤リンパ球(TIL)を治療用TIL集団に拡大培養する方法が提供される。
(a)患者から得られた腫瘍サンプルを複数の腫瘍断片に処理することにより、患者から切除された腫瘍から第1のTIL集団を得ること;
(b)腫瘍断片を閉鎖系に添加すること;
(c)IL-2を含み、且つ任意選択により4-1BBアゴニスト抗体を含む細胞培養培地中で約2~5日間にわたって第1のTIL集団を培養することにより、第1の拡大培養を実施すること;
(d)OKT-3を添加して第2のTIL集団を生じさせることであって、第1の拡大培養は、第1のガス透過性表面積を提供する閉鎖型容器内で実施され、第1の拡大培養は、第2のTIL集団を得るために約1~3日間にわたって実施され、第2のTIL集団は、第1のTIL集団よりも数において少なくとも50倍多く、ステップ(c)からステップ(d)への移行は、系を開放することなく行われる、生じさせること;
(e)第2のTIL集団を約1日間にわたって静置すること;
(f)第2のTIL集団の細胞培養培地に追加のIL-2、任意選択によりOKT-3抗体、任意選択によりOX40抗体及び抗原提示細胞(APC)を補充することにより、第2の拡大培養を実施して第3のTIL集団を生じさせることであって、第2の拡大培養は、第3のTIL集団を得るために約7~11日間にわたって実施され、第2の拡大培養は、第2のガス透過性表面積を提供する閉鎖型容器内で実施され、ステップ(c)からステップ(f)への移行は、系を開放することなく行われる、生じさせること;
(g)11~21日目を含む、ステップ(d)、(e)及び/又は(f)のいずれかの間に第2のTIL集団を少なくとも1つのsd-RNAと接触させることであって、sd-RNAは、0.1μM sd-RNA/10,000TIL/100μL培地、0.5μM sd-RNA/10,000TIL/100μL培地、0.75μM sd-RNA/10,000TIL/100μL培地、1μM sd-RNA/10,000TIL/100μL培地、1.25μM sd-RNA/10,000TIL/100μL培地、1.5μM sd-RNA/10,000TIL/100μL培地、2μM sd-RNA/10,000TIL/100μL培地、5μM sd-RNA/10,000TIL/100μL培地又は10μM sd-RNA/10,000TIL/100μL培地の濃度で添加され、sd-RNAは、PD-1、LAG-3、TIM-3、CISH及びCBLB並びにそれらの組み合わせからなる群から選択される分子の発現を阻害するためのものである、接触させること;
(h)任意選択により、第2のTIL集団に対して無菌エレクトロポレーションステップを実施することであって、無菌エレクトロポレーションステップは、少なくとも1つのsd-RNAの移動を媒介する、実施すること;
(i)ステップ(g)又は(h)から得られた治療用TIL集団を回収して、回収されたTIL集団を提供することであって、ステップ(g)からステップ(i)への移行は、系を開放することなく行われ、回収されたTIL集団は、治療用TIL集団である、提供す
ること;
(j)ステップ(i)からの回収されたTIL集団を輸注バッグに移すことであって、ステップ(i)から(j)への移行は、系を開放することなく行われる、移すこと;及び
(k)ジメチルスルホキシドベースの凍結保存培地を使用して、回収されたTIL集団を凍結保存すること
を含む、腫瘍浸潤リンパ球(TIL)を治療用TIL集団に拡大培養する方法が提供される。
[001386] 一部の変形実施形態において、タンパク質発現を一過性に変化させることができる他の分子は、例えば、sd-rxRNAを含むが、これに限定されないsd-RNAを含む。一部の実施形態において、TILは、11日目、14日目、17日目及び/又は21日目にsd-RNAに曝露される。一部の変形実施形態において、TILは、11日目、14日目、17日目及び/又は21日目の少なくとも2日、sd-RNAに曝露される。一部の変形実施形態において、TILは、11日目、14日目、17日目及び/又は21日目の少なくとも3日、sd-RNAに曝露される。一部の変形実施形態において、TILは、11日目、14日目、17日目及び21日目の全てでsd-RNAに曝露される。一部の実施形態において、sd-RNAは、PD-1を標的とする。
[001387] 一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、標的遺伝子の発現において、70%の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、標的遺伝子の発現において、75%の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、標的遺伝子の発現において、80%の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、標的遺伝子の発現において、85%の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、標的遺伝子の発現において、90%の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、標的遺伝子の発現において、95%の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、標的遺伝子の発現において、99%の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約0.25μM~約10μMの濃度、一部の実施形態では約0.25μM~約4μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約0.25μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約0.5μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約0.75μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約1.0μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約1.25μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約1.5μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約1.75μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約2.0μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約2.25μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約2.5μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約2.75μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約3.0μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RN
A配列は、約3.25μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約3.5μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約3.75μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約4.0μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約5.0μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約6.0μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約7.0μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約8.0μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約9.0μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約10.0μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。前述の実施形態のいずれかにおいて、指定された濃度は、培地交換前又は後にTIL培養培地に関して決定され得る。
A配列は、約3.25μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約3.5μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約3.75μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約4.0μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約5.0μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約6.0μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約7.0μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約8.0μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約9.0μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約10.0μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。前述の実施形態のいずれかにおいて、指定された濃度は、培地交換前又は後にTIL培養培地に関して決定され得る。
[001388] 一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、PD-1の発現において、70%の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、PD-1の発現において、75%の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、PD-1の発現において、80%の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、PD-1の発現において、85%の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、PD-1の発現において、90%の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、PD-1の発現において、95%の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、PD-1の発現において、99%の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約0.25μM~約10μMの濃度、一部の実施形態では約0.25μM~約4μMの濃度で送達された場合、PD-1の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約0.25μMの濃度で送達された場合、PD-1の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約0.5μMの濃度で送達された場合、PD-1の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約0.75μMの濃度で送達された場合、PD-1の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約1.0μMの濃度で送達された場合、PD-1の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約1.25μMの濃度で送達された場合、PD-1の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約1.5μMの濃度で送達された場合、PD-1の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約1.75μMの濃度で送達された場合、PD-1の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約2.0μMの濃度で送達された場合、PD-1の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約2.25μMの濃度で送達された場合、PD-1の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約2.5μMの濃度で送達された場合、PD-1の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約2.75μMの濃度で送達された場合、PD-1の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約3.0μMの濃度で送達された場合、PD-1の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約3.25μMの濃度で送達され
た場合、PD-1の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約3.5μMの濃度で送達された場合、PD-1の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約3.75μMの濃度で送達された場合、PD-1の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約4.0μMの濃度で送達された場合、PD-1の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約5.0μMの濃度で送達された場合、PD-1の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約6.0μMの濃度で送達された場合、PD-1の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約7.0μMの濃度で送達された場合、PD-1の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約8.0μMの濃度で送達された場合、PD-1の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約9.0μMの濃度で送達された場合、PD-1の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約10.0μMの濃度で送達された場合、PD-1の発現の低減を示す。前述の実施形態のいずれかにおいて、指定された濃度は、培地交換前又は後にTIL培養培地に関して決定され得る。
た場合、PD-1の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約3.5μMの濃度で送達された場合、PD-1の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約3.75μMの濃度で送達された場合、PD-1の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約4.0μMの濃度で送達された場合、PD-1の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約5.0μMの濃度で送達された場合、PD-1の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約6.0μMの濃度で送達された場合、PD-1の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約7.0μMの濃度で送達された場合、PD-1の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約8.0μMの濃度で送達された場合、PD-1の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約9.0μMの濃度で送達された場合、PD-1の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約10.0μMの濃度で送達された場合、PD-1の発現の低減を示す。前述の実施形態のいずれかにおいて、指定された濃度は、培地交換前又は後にTIL培養培地に関して決定され得る。
[001389] 一部の変形実施形態において、TILは、約0.75μM~約3μMのsd-RNA濃度において11日目、14日目、17日目及び/又は21日目の少なくとも2日、sd-RNAに曝露される。一部の変形実施形態において、TILは、約0.75μM~約3μMのsd-RNA濃度において11日目、14日目、17日目及び/又は21日目の少なくとも3日、sd-RNAに曝露される。一部の変形実施形態において、TILは、約0.75μM~約3μMのsd-RNA濃度において11日目、14日目、17日目及び21日目の全てでsd-RNAに曝露される。一部の変形実施形態において、sd-RNAは、約0.75μM~約3μMのsd-RNA濃度で培地交換と共に添加される。一部の実施形態において、sd-RNAは、PD-1を標的とする。
[001390] 一部の変形実施形態において、TILは、約1.0μM~約2.5μMのsd-RNA濃度において11日目、14日目、17日目及び/又は21日目の少なくとも2日、sd-RNAに曝露される。一部の変形実施形態において、TILは、約1.0μM~約2.5μMのsd-RNA濃度において11日目、14日目、17日目及び/又は21日目の少なくとも3日、sd-RNAに曝露される。一部の変形実施形態において、TILは、約1.0μM~約2.5μMのsd-RNA濃度において11日目、14日目、17日目及び21日目の全てでsd-RNAに曝露される。一部の変形実施形態において、sd-RNAは、約1.0μM~約2.5μMのsd-RNA濃度で培地交換と共に添加される。一部の実施形態において、sd-RNAは、PD-1を標的とする。
[001391] 一部の変形実施形態において、TILは、約1.5μM~約2.5μMのsd-RNA濃度において11日目、14日目、17日目及び/又は21日目の少なくとも2日、sd-RNAに曝露される。一部の変形実施形態において、TILは、約1.5μM~約2.5μMのsd-RNA濃度において11日目、14日目、17日目及び/又は21日目の少なくとも3日、sd-RNAに曝露される。一部の変形実施形態において、TILは、約1.5μM~約2.5μMのsd-RNA濃度において11日目、14日目、17日目及び21日目の全てでsd-RNAに曝露される。一部の変形実施形態において、sd-RNAは、約1.5μM~約2.5μMのsd-RNA濃度で培地交換と共に添加される。一部の実施形態において、sd-RNAは、PD-1を標的とする。
[001392] 一部の変形実施形態において、TILは、2μMのsd-RNA濃度において11日目、14日目、17日目及び/又は21日目の少なくとも2日、sd-RNAに曝露される。一部の変形実施形態において、TILは、約2μMのsd-RNA濃度にお
いて11日目、14日目、17日目及び/又は21日目の少なくとも3日、sd-RNAに曝露される。一部の変形実施形態において、TILは、約2μMのsd-RNA濃度において11日目、14日目、17日目及び21日目の全てでsd-RNAに曝露される。一部の変形実施形態において、sd-RNAは、約2μMのsd-RNA濃度で培地交換と共に添加される。一部の実施形態において、sd-RNAは、PD-1を標的とする。
いて11日目、14日目、17日目及び/又は21日目の少なくとも3日、sd-RNAに曝露される。一部の変形実施形態において、TILは、約2μMのsd-RNA濃度において11日目、14日目、17日目及び21日目の全てでsd-RNAに曝露される。一部の変形実施形態において、sd-RNAは、約2μMのsd-RNA濃度で培地交換と共に添加される。一部の実施形態において、sd-RNAは、PD-1を標的とする。
[001393] 一部の実施形態において、11日目に添加されるsd-RNAは、sd-RNA、IL-2、OKT3及びAPC(例えば、PBMCを含む)を含む培地に添加される。一部の実施形態において、14日目に添加されるsd-RNAは、sd-RNAを含み、任意選択によりIL-2、OKT3及びAPC(例えば、PBMCを含む)の1つ以上を含む培地に添加される。一部の実施形態において、7日目に添加されるsd-RNAは、sd-RNAを含み、任意選択によりIL-2、OKT3及びAPC(例えば、PBMCを含む)の1つ以上を含む培地に添加される。一部の実施形態において、21日目に添加されるsd-RNAは、sd-RNAを含み、任意選択によりIL-2、OKT3及びAPC(例えば、PBMCを含む)の1つ以上を含む培地に添加される。一部の実施形態において、14日目に添加されるsd-RNAは、sd-RNA及びIL-2を含む培地に添加される。一部の実施形態において、17日目に添加されるsd-RNAは、sd-RNA及びIL-2を含む培地に添加される。一部の実施形態において、21日目に添加されるsd-RNAは、sd-RNA及びIL-2を含む培地に添加される。一部の実施形態において、更なるsd-RNAが14日目に添加される。一部の実施形態において、更なるsd-RNAが17日目に添加される。一部の実施形態において、更なるsd-RNAが21日目に添加される。一部の実施形態において、sd-RNAは、11日目、14日目、17日目及び21日目に同じ濃度で添加される。一部の実施形態において、sd-RNAは、11日目、14日目、17日目及び/又は21日目に異なる濃度で添加される。一部の実施形態において、sd-RNAは、PD-1を標的とする。
実施例34:実施例23の変形実施形態
[001394] 実施例23で考察される方法に従い、一過性に変化するタンパク質発現と組み合わせてTILを拡大培養する方法が記載される。この実施例は、実施例23に記載された方法に沿って更に変化した実施形態を提供する。
[001394] 実施例23で考察される方法に従い、一過性に変化するタンパク質発現と組み合わせてTILを拡大培養する方法が記載される。この実施例は、実施例23に記載された方法に沿って更に変化した実施形態を提供する。
[001395] 上記の方法の一部の実施形態において、
(a)患者から得られた腫瘍サンプルを複数の腫瘍断片に処理することにより、患者から切除された腫瘍から第1のTIL集団を得ること;
(b)腫瘍断片を閉鎖系に添加すること;
(c)IL-2を含み、且つ任意選択により4-1BBアゴニスト抗体を含む細胞培養培地中で約2~5日間にわたって第1のTIL集団を培養することにより、第1の拡大培養を実施すること;
(d)OKT-3を添加して第2のTIL集団を生じさせることであって、第1の拡大培養は、第1のガス透過性表面積を提供する閉鎖型容器内で実施され、第1の拡大培養は、第2のTIL集団を得るために約1~3日間にわたって実施され、第2のTIL集団は、第1のTIL集団よりも数において少なくとも50倍多く、ステップ(c)からステップ(d)への移行は、系を開放することなく行われる、生じさせること;
(e)第2のTIL集団を約1日間にわたって静置すること;
(f)第2のTIL集団の細胞培養培地に追加のIL-2、任意選択によりOKT-3抗体、任意選択によりOX40抗体及び抗原提示細胞(APC)を補充することにより、第2の拡大培養を実施して第3のTIL集団を生じさせることであって、第2の拡大培養は、第3のTIL集団を得るために約7~11日間にわたって実施され、第2の拡大培養は、第2のガス透過性表面積を提供する閉鎖型容器内で実施され、ステップ(c)からステップ(f)への移行は、系を開放することなく行われる、生じさせること;
(g)11~21日目を含む、ステップ(d)、(e)及び/又は(f)のいずれかの間に第2のTIL集団を少なくとも1つのsd-RNAと接触させることであって、sd-RNAは、0.1μM sd-RNA/10,000TIL/100μL培地、0.5μM sd-RNA/10,000TIL/100μL培地、0.75μM sd-RNA/10,000TIL/100μL培地、1μM sd-RNA/10,000TIL/100μL培地、1.25μM sd-RNA/10,000TIL/100μL培地、1.5μM sd-RNA/10,000TIL/100μL培地、2μM sd-RNA/10,000TIL/100μL培地、5μM sd-RNA/10,000TIL/100μL培地又は10μM sd-RNA/10,000TIL/100μL培地の濃度で添加され、sd-RNAは、PD-1、LAG-3、TIM-3、CISH及びCBLB並びにそれらの組み合わせからなる群から選択される分子の発現を阻害するためのものである、接触させること;
(h)任意選択により、第2のTIL集団に対して無菌エレクトロポレーションステップを実施することであって、無菌エレクトロポレーションステップは、少なくとも1つのsd-RNAの移動を媒介する、実施すること;
(i)ステップ(g)又は(h)から得られた治療用TIL集団を回収して、回収されたTIL集団を提供することであって、ステップ(g)からステップ(i)への移行は、系を開放することなく行われ、回収されたTIL集団は、治療用TIL集団である、提供すること;
(j)ステップ(i)からの回収されたTIL集団を輸注バッグに移すことであって、ステップ(i)から(j)への移行は、系を開放することなく行われる、移すこと;及び
(k)ジメチルスルホキシドベースの凍結保存培地を使用して、回収されたTIL集団を凍結保存すること
を含む、腫瘍浸潤リンパ球(TIL)を治療用TIL集団に拡大培養する方法が提供される。
(a)患者から得られた腫瘍サンプルを複数の腫瘍断片に処理することにより、患者から切除された腫瘍から第1のTIL集団を得ること;
(b)腫瘍断片を閉鎖系に添加すること;
(c)IL-2を含み、且つ任意選択により4-1BBアゴニスト抗体を含む細胞培養培地中で約2~5日間にわたって第1のTIL集団を培養することにより、第1の拡大培養を実施すること;
(d)OKT-3を添加して第2のTIL集団を生じさせることであって、第1の拡大培養は、第1のガス透過性表面積を提供する閉鎖型容器内で実施され、第1の拡大培養は、第2のTIL集団を得るために約1~3日間にわたって実施され、第2のTIL集団は、第1のTIL集団よりも数において少なくとも50倍多く、ステップ(c)からステップ(d)への移行は、系を開放することなく行われる、生じさせること;
(e)第2のTIL集団を約1日間にわたって静置すること;
(f)第2のTIL集団の細胞培養培地に追加のIL-2、任意選択によりOKT-3抗体、任意選択によりOX40抗体及び抗原提示細胞(APC)を補充することにより、第2の拡大培養を実施して第3のTIL集団を生じさせることであって、第2の拡大培養は、第3のTIL集団を得るために約7~11日間にわたって実施され、第2の拡大培養は、第2のガス透過性表面積を提供する閉鎖型容器内で実施され、ステップ(c)からステップ(f)への移行は、系を開放することなく行われる、生じさせること;
(g)11~21日目を含む、ステップ(d)、(e)及び/又は(f)のいずれかの間に第2のTIL集団を少なくとも1つのsd-RNAと接触させることであって、sd-RNAは、0.1μM sd-RNA/10,000TIL/100μL培地、0.5μM sd-RNA/10,000TIL/100μL培地、0.75μM sd-RNA/10,000TIL/100μL培地、1μM sd-RNA/10,000TIL/100μL培地、1.25μM sd-RNA/10,000TIL/100μL培地、1.5μM sd-RNA/10,000TIL/100μL培地、2μM sd-RNA/10,000TIL/100μL培地、5μM sd-RNA/10,000TIL/100μL培地又は10μM sd-RNA/10,000TIL/100μL培地の濃度で添加され、sd-RNAは、PD-1、LAG-3、TIM-3、CISH及びCBLB並びにそれらの組み合わせからなる群から選択される分子の発現を阻害するためのものである、接触させること;
(h)任意選択により、第2のTIL集団に対して無菌エレクトロポレーションステップを実施することであって、無菌エレクトロポレーションステップは、少なくとも1つのsd-RNAの移動を媒介する、実施すること;
(i)ステップ(g)又は(h)から得られた治療用TIL集団を回収して、回収されたTIL集団を提供することであって、ステップ(g)からステップ(i)への移行は、系を開放することなく行われ、回収されたTIL集団は、治療用TIL集団である、提供すること;
(j)ステップ(i)からの回収されたTIL集団を輸注バッグに移すことであって、ステップ(i)から(j)への移行は、系を開放することなく行われる、移すこと;及び
(k)ジメチルスルホキシドベースの凍結保存培地を使用して、回収されたTIL集団を凍結保存すること
を含む、腫瘍浸潤リンパ球(TIL)を治療用TIL集団に拡大培養する方法が提供される。
[001396] 一部の変形実施形態において、タンパク質発現を一過性に変化させることができる他の分子は、例えば、sd-rxRNAを含むが、これに限定されないsd-RNAを含む。一部の実施形態において、TILは、11日目、14日目、17日目及び/又は21日目にsd-RNAに曝露される。一部の変形実施形態において、TILは、11日目、14日目、17日目及び/又は21日目の少なくとも2日、sd-RNAに曝露される。一部の変形実施形態において、TILは、11日目、14日目、17日目及び/又は21日目の少なくとも3日、sd-RNAに曝露される。一部の変形実施形態において、TILは、11日目、14日目、17日目及び21日目の全てでsd-RNAに曝露される。一部の実施形態において、sd-RNAは、PD-1を標的とする。
[001397] 一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、標的遺伝子の発現において、70%の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、標的遺伝子の発現において、75%の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、標的遺伝子の発現において、80%の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、標的遺伝子の発現において、85%の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、標的遺伝子の発現において、90%の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、標的遺伝子の発現において、95%の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、標的遺伝子の発現において、99%の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約0.25μM~約10μMの濃度、一部の実施形態では約0.25μM~約4μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約0.25μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明
で使用されるsd-RNA配列は、約0.5μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約0.75μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約1.0μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約1.25μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約1.5μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約1.75μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約2.0μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約2.25μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約2.5μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約2.75μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約3.0μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約3.25μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約3.5μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約3.75μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約4.0μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約5.0μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約6.0μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約7.0μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約8.0μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約9.0μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約10.0μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。前述の実施形態のいずれかにおいて、指定された濃度は、培地交換前又は後にTIL培養培地に関して決定され得る。
で使用されるsd-RNA配列は、約0.5μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約0.75μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約1.0μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約1.25μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約1.5μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約1.75μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約2.0μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約2.25μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約2.5μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約2.75μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約3.0μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約3.25μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約3.5μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約3.75μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約4.0μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約5.0μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約6.0μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約7.0μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約8.0μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約9.0μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約10.0μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。前述の実施形態のいずれかにおいて、指定された濃度は、培地交換前又は後にTIL培養培地に関して決定され得る。
[001398] 一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、PD-1の発現において、70%の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、PD-1の発現において、75%の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、PD-1の発現において、80%の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、PD-1の発現において、85%の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、PD-1の発現において、90%の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、PD-1の発現において、95%の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、PD-1の発現において、99%の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約0.25μM~約10μMの濃度、一部の実施形態では約0.25μM~約4μMの濃度で送達された場合、PD-1の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約0.25μMの濃度で送達された場合、PD-1の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-
RNA配列は、約0.5μMの濃度で送達された場合、PD-1の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約0.75μMの濃度で送達された場合、PD-1の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約1.0μMの濃度で送達された場合、PD-1の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約1.25μMの濃度で送達された場合、PD-1の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約1.5μMの濃度で送達された場合、PD-1の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約1.75μMの濃度で送達された場合、PD-1の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約2.0μMの濃度で送達された場合、PD-1の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約2.25μMの濃度で送達された場合、PD-1の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約2.5μMの濃度で送達された場合、PD-1の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約2.75μMの濃度で送達された場合、PD-1の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約3.0μMの濃度で送達された場合、PD-1の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約3.25μMの濃度で送達された場合、PD-1の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約3.5μMの濃度で送達された場合、PD-1の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約3.75μMの濃度で送達された場合、PD-1の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約4.0μMの濃度で送達された場合、PD-1の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約5.0μMの濃度で送達された場合、PD-1の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約6.0μMの濃度で送達された場合、PD-1の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約7.0μMの濃度で送達された場合、PD-1の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約8.0μMの濃度で送達された場合、PD-1の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約9.0μMの濃度で送達された場合、PD-1の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約10.0μMの濃度で送達された場合、PD-1の発現の低減を示す。前述の実施形態のいずれかにおいて、指定された濃度は、培地交換前又は後にTIL培養培地に関して決定され得る。
RNA配列は、約0.5μMの濃度で送達された場合、PD-1の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約0.75μMの濃度で送達された場合、PD-1の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約1.0μMの濃度で送達された場合、PD-1の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約1.25μMの濃度で送達された場合、PD-1の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約1.5μMの濃度で送達された場合、PD-1の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約1.75μMの濃度で送達された場合、PD-1の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約2.0μMの濃度で送達された場合、PD-1の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約2.25μMの濃度で送達された場合、PD-1の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約2.5μMの濃度で送達された場合、PD-1の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約2.75μMの濃度で送達された場合、PD-1の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約3.0μMの濃度で送達された場合、PD-1の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約3.25μMの濃度で送達された場合、PD-1の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約3.5μMの濃度で送達された場合、PD-1の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約3.75μMの濃度で送達された場合、PD-1の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約4.0μMの濃度で送達された場合、PD-1の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約5.0μMの濃度で送達された場合、PD-1の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約6.0μMの濃度で送達された場合、PD-1の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約7.0μMの濃度で送達された場合、PD-1の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約8.0μMの濃度で送達された場合、PD-1の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約9.0μMの濃度で送達された場合、PD-1の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約10.0μMの濃度で送達された場合、PD-1の発現の低減を示す。前述の実施形態のいずれかにおいて、指定された濃度は、培地交換前又は後にTIL培養培地に関して決定され得る。
[001399] 一部の変形実施形態において、TILは、約0.75μM~約3μMのsd-RNA濃度において11日目、14日目、17日目及び/又は21日目の少なくとも2日、sd-RNAに曝露される。一部の変形実施形態において、TILは、約0.75μM~約3μMのsd-RNA濃度において11日目、14日目、17日目及び/又は21日目の少なくとも3日、sd-RNAに曝露される。一部の変形実施形態において、TILは、約0.75μM~約3μMのsd-RNA濃度において11日目、14日目、17日目及び21日目の全てでsd-RNAに曝露される。一部の変形実施形態において、sd-RNAは、約0.75μM~約3μMのsd-RNA濃度で培地交換と共に添加される。一部の実施形態において、sd-RNAは、PD-1を標的とする。
[001400] 一部の変形実施形態において、TILは、約1.0μM~約2.5μMのsd-RNA濃度において11日目、14日目、17日目及び/又は21日目の少なくとも2日、sd-RNAに曝露される。一部の変形実施形態において、TILは、約1.0μM~約2.5μMのsd-RNA濃度において11日目、14日目、17日目及び/又は21日目の少なくとも3日、sd-RNAに曝露される。一部の変形実施形態において、
TILは、約1.0μM~約2.5μMのsd-RNA濃度において11日目、14日目、17日目及び21日目の全てでsd-RNAに曝露される。一部の変形実施形態において、sd-RNAは、約1.0μM~約2.5μMのsd-RNA濃度で培地交換と共に添加される。一部の実施形態において、sd-RNAは、PD-1を標的とする。
TILは、約1.0μM~約2.5μMのsd-RNA濃度において11日目、14日目、17日目及び21日目の全てでsd-RNAに曝露される。一部の変形実施形態において、sd-RNAは、約1.0μM~約2.5μMのsd-RNA濃度で培地交換と共に添加される。一部の実施形態において、sd-RNAは、PD-1を標的とする。
[001401] 一部の変形実施形態において、TILは、約1.5μM~約2.5μMのsd-RNA濃度において11日目、14日目、17日目及び/又は21日目の少なくとも2日、sd-RNAに曝露される。一部の変形実施形態において、TILは、約1.5μM~約2.5μMのsd-RNA濃度において11日目、14日目、17日目及び/又は21日目の少なくとも3日、sd-RNAに曝露される。一部の変形実施形態において、TILは、約1.5μM~約2.5μMのsd-RNA濃度において11日目、14日目、17日目及び21日目の全てでsd-RNAに曝露される。一部の変形実施形態において、sd-RNAは、約1.5μM~約2.5μMのsd-RNA濃度で培地交換と共に添加される。一部の実施形態において、sd-RNAは、PD-1を標的とする。
[001402] 一部の変形実施形態において、TILは、2μMのsd-RNA濃度において11日目、14日目、17日目及び/又は21日目の少なくとも2日、sd-RNAに曝露される。一部の変形実施形態において、TILは、約2μMのsd-RNA濃度において11日目、14日目、17日目及び/又は21日目の少なくとも3日、sd-RNAに曝露される。一部の変形実施形態において、TILは、約2μMのsd-RNA濃度において11日目、14日目、17日目及び21日目の全てでsd-RNAに曝露される。一部の変形実施形態において、sd-RNAは、約2μMのsd-RNA濃度で培地交換と共に添加される。一部の実施形態において、sd-RNAは、PD-1を標的とする。
[001403] 一部の実施形態において、11日目に添加されるsd-RNAは、sd-RNA、IL-2、OKT3及びAPC(例えば、PBMCを含む)を含む培地に添加される。一部の実施形態において、14日目に添加されるsd-RNAは、sd-RNAを含み、任意選択によりIL-2、OKT3及びAPC(例えば、PBMCを含む)の1つ以上を含む培地に添加される。一部の実施形態において、17日目に添加されるsd-RNAは、sd-RNAを含み、任意選択によりIL-2、OKT3及びAPC(例えば、PBMCを含む)の1つ以上を含む培地に添加される。一部の実施形態において、21日目に添加されるsd-RNAは、sd-RNAを含み、任意選択によりIL-2、OKT3及びAPC(例えば、PBMCを含む)の1つ以上を含む培地に添加される。一部の実施形態において、14日目に添加されるsd-RNAは、sd-RNA及びIL-2を含む培地に添加される。一部の実施形態において、17日目に添加されるsd-RNAは、sd-RNA及びIL-2を含む培地に添加される。一部の実施形態において、21日目に添加されるsd-RNAは、sd-RNA及びIL-2を含む培地に添加される。一部の実施形態において、更なるsd-RNAが14日目に添加される。一部の実施形態において、更なるsd-RNAが17日目に添加される。一部の実施形態において、更なるsd-RNAが21日目に添加される。一部の実施形態において、sd-RNAは、11日目、14日目、17日目及び21日目に同じ濃度で添加される。一部の実施形態において、sd-RNAは、11日目、14日目、17日目及び/又は21日目に異なる濃度で添加される。一部の実施形態において、sd-RNAは、PD-1を標的とする。
実施例35:実施例23の変形実施形態
[001404] 実施例23で考察される方法に従い、一過性に変化するタンパク質発現と組み合わせてTILを拡大培養する方法が記載される。この実施例は、実施例23に記載された方法に沿って更に変化した実施形態を提供する。
[001404] 実施例23で考察される方法に従い、一過性に変化するタンパク質発現と組み合わせてTILを拡大培養する方法が記載される。この実施例は、実施例23に記載された方法に沿って更に変化した実施形態を提供する。
[001405] 上記の方法の一部の実施形態において、
(a)患者から得られた腫瘍サンプルを複数の腫瘍断片に処理することにより、患者から切除された腫瘍から第1のTIL集団を得ること;
(b)腫瘍断片を閉鎖系に添加すること;
(c)IL-2を含み、且つ任意選択により4-1BBアゴニスト抗体を含む細胞培養培地中で約2~5日間にわたって第1のTIL集団を培養することにより、第1の拡大培養を実施すること;
(d)OKT-3を添加して第2のTIL集団を生じさせることであって、第1の拡大培養は、第1のガス透過性表面積を提供する閉鎖型容器内で実施され、第1の拡大培養は、第2のTIL集団を得るために約1~3日間にわたって実施され、第2のTIL集団は、第1のTIL集団よりも数において少なくとも50倍多く、ステップ(c)からステップ(d)への移行は、系を開放することなく行われる、生じさせること;
(e)第2のTIL集団を約1日間にわたって静置すること;
(f)第2のTIL集団の細胞培養培地に追加のIL-2、任意選択によりOKT-3抗体、任意選択によりOX40抗体及び抗原提示細胞(APC)を補充することにより、第2の拡大培養を実施して第3のTIL集団を生じさせることであって、第2の拡大培養は、第3のTIL集団を得るために約7~11日間にわたって実施され、第2の拡大培養は、第2のガス透過性表面積を提供する閉鎖型容器内で実施され、ステップ(e)からステップ(f)への移行は、系を開放することなく行われる、生じさせること;
(g)11~21日目を含む、ステップ(d)、(e)及び/又は(f)のいずれかの間に第2のTIL集団を少なくとも1つのsd-RNAと接触させることであって、sd-RNAは、0.1μM sd-RNA/10,000TIL、0.5μM sd-RNA/10,000TIL、0.75μM sd-RNA/10,000TIL、1μM sd-RNA/10,000TIL、1.25μM sd-RNA/10,000TIL、1.5μM sd-RNA/10,000TIL、2μM sd-RNA/10,000TIL、5μM sd-RNA/10,000TIL又は10μM sd-RNA/10,000TILの濃度で添加され、sd-RNAは、PD-1、LAG-3、TIM-3、CISH及びCBLB並びにそれらの組み合わせからなる群から選択される分子の発現を阻害するためのものである、接触させること;
(h)任意選択により、第2のTIL集団に対して無菌エレクトロポレーションステップを実施することであって、無菌エレクトロポレーションステップは、少なくとも1つのsd-RNAの移動を媒介する、実施すること;
(i)ステップ(g)又は(h)から得られた治療用TIL集団を回収して、回収されたTIL集団を提供することであって、ステップ(e)からステップ(h)への移行は、系を開放することなく行われ、回収されたTIL集団は、治療用TIL集団である、提供すること;
(j)ステップ(i)からの回収されたTIL集団を輸注バッグに移すことであって、ステップ(h)から(i)への移行は、系を開放することなく行われる、移すこと;及び
(k)ジメチルスルホキシドベースの凍結保存培地を使用して、回収されたTIL集団を凍結保存すること
を含む、腫瘍浸潤リンパ球(TIL)を治療用TIL集団に拡大培養する方法が提供される。
(a)患者から得られた腫瘍サンプルを複数の腫瘍断片に処理することにより、患者から切除された腫瘍から第1のTIL集団を得ること;
(b)腫瘍断片を閉鎖系に添加すること;
(c)IL-2を含み、且つ任意選択により4-1BBアゴニスト抗体を含む細胞培養培地中で約2~5日間にわたって第1のTIL集団を培養することにより、第1の拡大培養を実施すること;
(d)OKT-3を添加して第2のTIL集団を生じさせることであって、第1の拡大培養は、第1のガス透過性表面積を提供する閉鎖型容器内で実施され、第1の拡大培養は、第2のTIL集団を得るために約1~3日間にわたって実施され、第2のTIL集団は、第1のTIL集団よりも数において少なくとも50倍多く、ステップ(c)からステップ(d)への移行は、系を開放することなく行われる、生じさせること;
(e)第2のTIL集団を約1日間にわたって静置すること;
(f)第2のTIL集団の細胞培養培地に追加のIL-2、任意選択によりOKT-3抗体、任意選択によりOX40抗体及び抗原提示細胞(APC)を補充することにより、第2の拡大培養を実施して第3のTIL集団を生じさせることであって、第2の拡大培養は、第3のTIL集団を得るために約7~11日間にわたって実施され、第2の拡大培養は、第2のガス透過性表面積を提供する閉鎖型容器内で実施され、ステップ(e)からステップ(f)への移行は、系を開放することなく行われる、生じさせること;
(g)11~21日目を含む、ステップ(d)、(e)及び/又は(f)のいずれかの間に第2のTIL集団を少なくとも1つのsd-RNAと接触させることであって、sd-RNAは、0.1μM sd-RNA/10,000TIL、0.5μM sd-RNA/10,000TIL、0.75μM sd-RNA/10,000TIL、1μM sd-RNA/10,000TIL、1.25μM sd-RNA/10,000TIL、1.5μM sd-RNA/10,000TIL、2μM sd-RNA/10,000TIL、5μM sd-RNA/10,000TIL又は10μM sd-RNA/10,000TILの濃度で添加され、sd-RNAは、PD-1、LAG-3、TIM-3、CISH及びCBLB並びにそれらの組み合わせからなる群から選択される分子の発現を阻害するためのものである、接触させること;
(h)任意選択により、第2のTIL集団に対して無菌エレクトロポレーションステップを実施することであって、無菌エレクトロポレーションステップは、少なくとも1つのsd-RNAの移動を媒介する、実施すること;
(i)ステップ(g)又は(h)から得られた治療用TIL集団を回収して、回収されたTIL集団を提供することであって、ステップ(e)からステップ(h)への移行は、系を開放することなく行われ、回収されたTIL集団は、治療用TIL集団である、提供すること;
(j)ステップ(i)からの回収されたTIL集団を輸注バッグに移すことであって、ステップ(h)から(i)への移行は、系を開放することなく行われる、移すこと;及び
(k)ジメチルスルホキシドベースの凍結保存培地を使用して、回収されたTIL集団を凍結保存すること
を含む、腫瘍浸潤リンパ球(TIL)を治療用TIL集団に拡大培養する方法が提供される。
[001406] 一部の変形実施形態において、タンパク質発現を一過性に変化させることができる他の分子は、例えば、sd-rxRNAを含むが、これに限定されないsd-RNAを含む。一部の実施形態において、TILは、11日目、14日目、17日目及び/又は21日目にsd-RNAに曝露される。一部の変形実施形態において、TILは、11日目、14日目、17日目及び/又は21日目の少なくとも2日、sd-RNAに曝露される。一部の変形実施形態において、TILは、11日目、14日目、17日目及び/又は21日目の少なくとも3日、sd-RNAに曝露される。一部の変形実施形態において、TILは、11日目、14日目、17日目及び21日目の全てでsd-RNAに曝露さ
れる。一部の実施形態において、sd-RNAは、PD-1を標的とする。
れる。一部の実施形態において、sd-RNAは、PD-1を標的とする。
[001407] 一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、標的遺伝子の発現において、70%の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、標的遺伝子の発現において、75%の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、標的遺伝子の発現において、80%の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、標的遺伝子の発現において、85%の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、標的遺伝子の発現において、90%の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、標的遺伝子の発現において、95%の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、標的遺伝子の発現において、99%の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約0.25μM~約10μMの濃度、一部の実施形態では約0.25μM~約4μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約0.25μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約0.5μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約0.75μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約1.0μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約1.25μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約1.5μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約1.75μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約2.0μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約2.25μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約2.5μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約2.75μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約3.0μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約3.25μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約3.5μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約3.75μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約4.0μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約5.0μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約6.0μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約7.0μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約8.0μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約9.0μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約10.0μMの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。前述の実施形態のいずれかにおいて、指定された濃
度は、培地交換前又は後にTIL培養培地に関して決定され得る。
度は、培地交換前又は後にTIL培養培地に関して決定され得る。
[001408] 一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、PD-1の発現において、70%の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、PD-1の発現において、75%の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、PD-1の発現において、80%の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、PD-1の発現において、85%の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、PD-1の発現において、90%の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、PD-1の発現において、95%の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、PD-1の発現において、99%の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約0.25μM~約10μMの濃度、一部の実施形態では約0.25μM~約4μMの濃度で送達された場合、PD-1の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約0.25μMの濃度で送達された場合、PD-1の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約0.5μMの濃度で送達された場合、PD-1の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約0.75μMの濃度で送達された場合、PD-1の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約1.0μMの濃度で送達された場合、PD-1の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約1.25μMの濃度で送達された場合、PD-1の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約1.5μMの濃度で送達された場合、PD-1の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約1.75μMの濃度で送達された場合、PD-1の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約2.0μMの濃度で送達された場合、PD-1の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約2.25μMの濃度で送達された場合、PD-1の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約2.5μMの濃度で送達された場合、PD-1の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約2.75μMの濃度で送達された場合、PD-1の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約3.0μMの濃度で送達された場合、PD-1の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約3.25μMの濃度で送達された場合、PD-1の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約3.5μMの濃度で送達された場合、PD-1の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約3.75μMの濃度で送達された場合、PD-1の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約4.0μMの濃度で送達された場合、PD-1の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約5.0μMの濃度で送達された場合、PD-1の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約6.0μMの濃度で送達された場合、PD-1の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約7.0μMの濃度で送達された場合、PD-1の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約8.0μMの濃度で送達された場合、PD-1の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約9.0μMの濃度で送達された場合、PD-1の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるsd-RNA配列は、約10.0μMの濃度で送達された場合、PD-1の発現の低減を示す。前述の実施形態のいずれかにおいて、指定された濃度は、培地交換前又は後にTIL培養培地に関して決定され得る。
[001409] 一部の変形実施形態において、TILは、約0.75μM~約3μMのsd-RNA濃度において11日目、14日目、17日目及び/又は21日目の少なくとも2日、sd-RNAに曝露される。一部の変形実施形態において、TILは、約0.75μM~約3μMのsd-RNA濃度において11日目、14日目、17日目及び/又は21日目の少なくとも3日、sd-RNAに曝露される。一部の変形実施形態において、TILは、約0.75μM~約3μMのsd-RNA濃度において11日目、14日目、17日目及び21日目の全てでsd-RNAに曝露される。一部の変形実施形態において、sd-RNAは、約0.75μM~約3μMのsd-RNA濃度で培地交換と共に添加される。一部の実施形態において、sd-RNAは、PD-1を標的とする。
[001410] 一部の変形実施形態において、TILは、約1.0μM~約2.5μMのsd-RNA濃度において11日目、14日目、17日目及び/又は21日目の少なくとも2日、sd-RNAに曝露される。一部の変形実施形態において、TILは、約1.0μM~約2.5μMのsd-RNA濃度において11日目、14日目、17日目及び/又は21日目の少なくとも3日、sd-RNAに曝露される。一部の変形実施形態において、TILは、約1.0μM~約2.5μMのsd-RNA濃度において11日目、14日目、17日目及び21日目の全てでsd-RNAに曝露される。一部の変形実施形態において、sd-RNAは、約1.0μM~約2.5μMのsd-RNA濃度で培地交換と共に添加される。一部の実施形態において、sd-RNAは、PD-1を標的とする。
[001411] 一部の変形実施形態において、TILは、約1.5μM~約2.5μMのsd-RNA濃度において11日目、14日目、17日目及び/又は21日目の少なくとも2日、sd-RNAに曝露される。一部の変形実施形態において、TILは、約1.5μM~約2.5μMのsd-RNA濃度において11日目、14日目、17日目及び/又は21日目の少なくとも3日、sd-RNAに曝露される。一部の変形実施形態において、TILは、約1.5μM~約2.5μMのsd-RNA濃度において11日目、14日目、17日目及び21日目の全てでsd-RNAに曝露される。一部の変形実施形態において、sd-RNAは、約1.5μM~約2.5μMのsd-RNA濃度で培地交換と共に添加される。一部の実施形態において、sd-RNAは、PD-1を標的とする。
[001412] 一部の変形実施形態において、TILは、2μMのsd-RNA濃度において11日目、14日目、17日目及び/又は21日目の少なくとも2日、sd-RNAに曝露される。一部の変形実施形態において、TILは、約2μMのsd-RNA濃度において11日目、14日目、17日目及び/又は21日目の少なくとも3日、sd-RNAに曝露される。一部の変形実施形態において、TILは、約2μMのsd-RNA濃度において11日目、14日目、17日目及び21日目の全てでsd-RNAに曝露される。一部の変形実施形態において、sd-RNAは、約2μMのsd-RNA濃度で培地交換と共に添加される。一部の実施形態において、sd-RNAは、PD-1を標的とする。
[001413] 一部の実施形態において、11日目に添加されるsd-RNAは、sd-RNA、IL-2、OKT3及びAPC(例えば、PBMCを含む)を含む培地に添加される。一部の実施形態において、14日目に添加されるsd-RNAは、sd-RNAを含み、任意選択によりIL-2、OKT3及びAPC(例えば、PBMCを含む)の1つ以上を含む培地に添加される。一部の実施形態において、17日目に添加されるsd-RNAは、sd-RNAを含み、任意選択によりIL-2、OKT3及びAPC(例えば、PBMCを含む)の1つ以上を含む培地に添加される。一部の実施形態において、21日目に添加されるsd-RNAは、sd-RNAを含み、任意選択によりIL-2、OKT3及びAPC(例えば、PBMCを含む)の1つ以上を含む培地に添加される。一部の実施形態において、14日目に添加されるsd-RNAは、sd-RNA及びIL-2を含む
培地に添加される。一部の実施形態において、17日目に添加されるsd-RNAは、sd-RNA及びIL-2を含む培地に添加される。一部の実施形態において、21日目に添加されるsd-RNAは、sd-RNA及びIL-2を含む培地に添加される。一部の実施形態において、更なるsd-RNAが14日目に添加される。一部の実施形態において、更なるsd-RNAが17日目に添加される。一部の実施形態において、更なるsd-RNAが21日目に添加される。一部の実施形態において、sd-RNAは、11日目、14日目、17日目及び21日目に同じ濃度で添加される。一部の実施形態において、sd-RNAは、11日目、14日目、17日目及び/又は21日目に異なる濃度で添加される。一部の実施形態において、sd-RNAは、PD-1を標的とする。
培地に添加される。一部の実施形態において、17日目に添加されるsd-RNAは、sd-RNA及びIL-2を含む培地に添加される。一部の実施形態において、21日目に添加されるsd-RNAは、sd-RNA及びIL-2を含む培地に添加される。一部の実施形態において、更なるsd-RNAが14日目に添加される。一部の実施形態において、更なるsd-RNAが17日目に添加される。一部の実施形態において、更なるsd-RNAが21日目に添加される。一部の実施形態において、sd-RNAは、11日目、14日目、17日目及び21日目に同じ濃度で添加される。一部の実施形態において、sd-RNAは、11日目、14日目、17日目及び/又は21日目に異なる濃度で添加される。一部の実施形態において、sd-RNAは、PD-1を標的とする。
[001414] 上述の実施例は、本発明の組成物、システム及び方法の実施形態を作製及び使用する方法の全面開示及び説明を当業者に与えるために提供され、本発明者らが、その発明と見なす範囲を限定することを意図するものではない。当業者に明らかである本発明を実施するための上述の態様の修正は、以下の特許請求の範囲内であることが意図される。本明細書で言及される全ての特許及び刊行物は、本発明に属する当業者の技能のレベルを示す。
[001415] 全ての見出し及びセクションの指定は、明確化と参照の目的でのみ使用されており、決して限定と見なされるものではない。例えば、当業者は、本明細書に記載される本発明の趣旨及び範囲に従い、異なる見出し及びセクションからの様々な態様を適切に組み合わせることが有用であることを理解するであろう。
[001416] 本明細書に引用されている全ての参考文献は、個々の出版物若しくは特許又は特許出願が全ての目的についてその全体が参照により組み込まれることが具体的且つ個別に示されている場合と同程度に、その全体があらゆる目的について参照により本明細書に組み込まれる。
[001417] 当業者に明らかであるように、本出願の多くの修正形態及び変形形態は、その趣旨及び範囲から逸脱することなくなされ得る。本明細書に記載される特定の実施形態及び実施例は、ごく一実施例としてのみ提供され、本出願は、特許請求の範囲が権利を与えられる均等物の全範囲と共に添付の特許請求の範囲の条項よってのみ限定されるべきである。
Claims (70)
- 腫瘍浸潤リンパ球(TIL)を治療用TIL集団に拡大培養する方法であって、
(i)患者から切除された腫瘍から第1のTIL集団を得ること;
(ii)IL-2及び任意選択によりOKT-3を含む細胞培養培地中で前記第1のTIL集団を培養することにより、第1の拡大培養を実施して第2のTIL集団を生じさせること;
(iii)前記第2のTIL集団の前記細胞培養培地に追加のIL-2、OKT-3及び抗原提示細胞(APC)を補充することにより、第2の拡大培養を実施して第3のTIL集団を生じさせること、ここで、前記第3のTIL集団は、前記第2のTIL集団よりも数において少なくとも100倍多く、前記第2の拡大培養は、前記第3のTIL集団を得るために少なくとも14日間にわたって実施され、前記第3のTIL集団は、治療用TIL集団である;及び
(iv)前記第2及び/又は第3のTIL集団を、転写因子(TF)及び/又はタンパク質発現を一過性に変化させることができる他の分子に曝露すること、ここで、前記TF及び/又はタンパク質発現を一過性に変化させることができる他の分子は、腫瘍抗原の変化した発現及び/又は前記治療用TIL集団における腫瘍抗原特異的T細胞の数の変化を提供する;
を含む方法。 - (v)前記第3のTIL集団の前記細胞培養培地に追加のIL-2、追加のOKT-3及び追加のAPCを補充することにより、追加の第2の拡大培養をステップ(iv)前又は後に実施することを更に含み、前記追加の第2の拡大培養は、ステップ(iii)で得られたよりも大きい治療用TIL集団を得るために少なくとも14日間にわたって実施され、前記より大きい治療用TIL集団は、腫瘍抗原特異的T細胞の数の変化を示す、請求項1に記載の方法。
- 腫瘍浸潤リンパ球(TIL)を治療用TIL集団に拡大培養する方法であって、
(a)患者から得られた腫瘍サンプルを複数の腫瘍断片に処理することにより、前記患者から切除された腫瘍から第1のTIL集団を得ること;
(b)前記腫瘍断片を閉鎖系に添加すること;
(c)IL-2及び任意選択によりOKT-3を含む細胞培養培地中で前記第1のTIL集団を培養することにより、第1の拡大培養を実施して第2のTIL集団を生じさせること、ここで、前記第1の拡大培養は、第1のガス透過性表面積を提供する閉鎖型容器内で実施され、前記第1の拡大培養は、前記第2のTIL集団を得るために約3~14日間にわたって実施され、前記第2のTIL集団は、前記第1のTIL集団よりも数において少なくとも50倍多く、ステップ(b)からステップ(c)への移行は、前記系を開放することなく行われる;
(d)前記第2のTIL集団の前記細胞培養培地に追加のIL-2、OKT-3及び抗原提示細胞(APC)を補充することにより、第2の拡大培養を実施して第3のTIL集団を生じさせること、ここで、前記第2の拡大培養は、前記第3のTIL集団を得るために約7~14日間にわたって実施され、前記第3のTIL集団は、治療用TIL集団であり、前記第2の拡大培養は、第2のガス透過性表面積を提供する閉鎖型容器内で実施され、ステップ(c)からステップ(d)への移行は、前記系を開放することなく行われる;
(e)前記第2及び/又は第3のTIL集団を、転写因子(TF)及び/又はタンパク質発現を一過性に変化させることができる他の分子に曝露すること、ここで、前記TF及び/又はタンパク質発現を一過性に変化させることができる他の分子は、腫瘍抗原の変化した発現及び/又は前記治療用TIL集団における腫瘍抗原特異的T細胞の数の変化を提供する;
(f)ステップ(d)から得られた前記治療用TIL集団を回収すること、ここで、ステ
ップ(d)からステップ(e)への移行は、前記系を開放することなく行われる;及び
(g)ステップ(e)からの前記回収されたTIL集団を輸注バッグに移すこと、ここで、ステップ(e)から(f)への移行は、前記系を開放することなく行われる;
を含む方法。 - 凍結保存プロセスを使用して、ステップ(f)における前記回収されたTIL集団を含む前記輸注バッグを凍結保存するステップを更に含む、請求項3に記載の方法。
- 前記凍結保存プロセスは、回収されたTIL集団と凍結保存培地との1:1の比率を使用して実施される、請求項4に記載の方法。
- 前記抗原提示細胞は、末梢血単核球(PBMC)である、請求項4に記載の方法。
- 前記PBMCは、照射され、且つ同種異系である、請求項6に記載の方法。
- 前記PBMCは、ステップ(d)において9~14日目のいずれかに細胞培養物に添加される、請求項6に記載の方法。
- 前記抗原提示細胞は、人工抗原提示細胞である、請求項6に記載の方法。
- ステップ(e)における前記回収は、膜ベースの細胞処理系を使用して実施される、請求項3に記載の方法。
- ステップ(e)における前記回収は、LOVO細胞処理系を使用して実施される、請求項3に記載の方法。
- 前記複数の断片は、約4~約50個の断片を含み、各断片は、約27mm3の容積を有する、請求項3に記載の方法。
- 前記複数の断片は、約1300mm3~約1500mm3の総容積を有する約30~約60個の断片を含む、請求項3に記載の方法。
- 前記複数の断片は、約1350mm3の総容積を有する約50個の断片を含む、請求項13に記載の方法。
- 前記複数の断片は、約1グラム~約1.5グラムの総質量を有する約50個の断片を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記細胞培養培地は、Gコンテナ及びXuri細胞培養バッグからなる群から選択される容器内に提供される、請求項3に記載の方法。
- ステップ(d)における前記細胞培養培地は、IL-15及び/又はIL-21を更に含む、請求項3に記載の方法。
- IL-2濃度は、約10,000IU/mL~約5,000IU/mLである、請求項1~17のいずれか一項に記載の方法。
- IL-15濃度は、約500IU/mL~約100IU/mLである、請求項17に記載の方法。
- IL-21濃度は、約20IU/mL~約0.5IU/mLである、請求項17に記載の方法。
- ステップ(f)における前記輸注バッグは、HypoThermosol含有輸注バッグである、請
求項3に記載の方法。 - 前記凍結保存培地は、ジメチルスルホキシド(DMSO)を含む、請求項5に記載の方法。
- 前記凍結保存培地は、7%~10%のDMSOを含む、請求項22に記載の方法。
- ステップ(c)における第1の期間及びステップ(e)における第2の期間は、10日、11日又は12日の期間内にそれぞれ個別に実施される、請求項3に記載の方法。
- ステップ(c)における第1の期間及びステップ(e)における第2の期間は、11日の期間内にそれぞれ個別に実施される、請求項3に記載の方法。
- ステップ(a)~(f)は、約10日~約22日の期間内に実施される、請求項3に記載の方法。
- ステップ(a)~(f)は、約20日~約22日の期間内に実施される、請求項3に記載の方法。
- ステップ(a)~(f)は、約15日~約20日の期間内に実施される、請求項3に記載の方法。
- ステップ(a)~(f)は、約10日~約20日の期間内に実施される、請求項3に記載の方法。
- ステップ(a)~(f)は、約10日~約15日の期間内に実施される、請求項3に記載の方法。
- ステップ(a)~(f)は、22日以下で実施される、請求項3に記載の方法。
- ステップ(a)~(f)は、20日以下で実施される、請求項3に記載の方法。
- ステップ(a)~(f)は、15日以下で実施される、請求項3に記載の方法。
- ステップ(a)~(f)は、10日以下で実施される、請求項3に記載の方法。
- ステップ(a)~(f)及び凍結保存は、22日以下で実施される、請求項5に記載の方法。
- ステップ(e)で回収された前記治療用TIL集団は、治療有効投与量の前記TILのために十分なTILを含む、請求項3~35のいずれか一項に記載の方法。
- 治療有効投与量のために十分なTILの数は、約2.3×1010~約13.7×1010個である、請求項36に記載の方法。
- ステップ(b)~(e)は、単一の容器内で実施され、ステップ(b)~(e)を単一
の容器内で実施することは、ステップ(b)~(e)を複数の容器内で実施することと比較して、切除された腫瘍毎のTIL収率の増加をもたらす、請求項3~37のいずれか一項に記載の方法。 - 前記抗原提示細胞は、前記系を開放することなく、ステップ(d)における第2の期間中に前記TILに添加される、請求項3~38のいずれか一項に記載の方法。
- ステップ(d)における前記第3のTIL集団は、対象に投与されたときに少なくとも5倍以上のインターフェロンγ産生を提供する、請求項3~39のいずれか一項に記載の方法。
- 微生物汚染のリスクは、開放系と比較して低減される、請求項3~40のいずれか一項に記載の方法。
- ステップ(f)又は(g)からの前記TILは、患者に注入される、請求項3~41のいずれか一項に記載の方法。
- 前記複数の断片は、約4個の断片を含む、請求項3~42のいずれか一項に記載の方法。
- 癌を有する対象を処置する方法であって、
(a)患者から得られた腫瘍サンプルを複数の腫瘍断片に処理することにより、前記対象から切除された腫瘍から第1のTIL集団を得ること;
(b)前記腫瘍断片を閉鎖系に添加すること;
(c)IL-2及び任意選択によりOKT-3を含む細胞培養培地中で前記第1のTIL集団を培養することにより、第1の拡大培養を実施して第2のTIL集団を生じさせること、ここで、前記第1の拡大培養は、第1のガス透過性表面積を提供する閉鎖型容器内で実施され、前記第1の拡大培養は、前記第2のTIL集団を得るために約3~14日間にわたって実施され、前記第2のTIL集団は、前記第1のTIL集団よりも数において少なくとも50倍多く、ステップ(b)からステップ(c)への移行は、前記系を開放することなく行われる;
(d)前記第2のTIL集団の前記細胞培養培地に追加のIL-2、OKT-3及び抗原提示細胞(APC)を補充することにより、第2の拡大培養を実施して第3のTIL集団を生じさせること、ここで、前記第2の拡大培養は、前記第3のTIL集団を得るために約7~14日間にわたって実施され、前記第3のTIL集団は、治療用TIL集団であり、前記第2の拡大培養は、第2のガス透過性表面積を提供する閉鎖型容器内で実施され、ステップ(c)からステップ(d)への移行は、前記系を開放することなく行われる;
(e)前記第2及び/又は第3のTIL集団を、転写因子(TF)及び/又はタンパク質発現を一過性に変化させることができる他の分子に曝露すること、ここで、前記TF及び/又はタンパク質発現を一過性に変化させることができる他の分子は、腫瘍抗原の増加した発現及び/又は前記治療用TIL集団における腫瘍抗原特異的T細胞の数の増加を提供する;
(f)ステップ(d)から得られた前記治療用TIL集団を回収すること、ここで、ステップ(d)からステップ(e)への移行は、前記系を開放することなく行われる;及び
(g)ステップ(e)からの前記回収されたTIL集団を輸注バッグに移すこと、ここで、ステップ(e)から(f)への移行は、前記系を開放することなく行われる;
(h)任意選択により、凍結保存プロセスを使用して、ステップ(f)からの前記回収されたTIL集団を含む前記輸注バッグを凍結保存すること;及び
(i)ステップ(g)における前記輸注バッグから治療有効投与量の前記第3のTIL集団を前記患者に投与すること
を含む、拡大培養された腫瘍浸潤リンパ球(TIL)を投与することを含む方法。 - 癌を有する対象の処置に使用するための拡大培養TIL集団であって、
(a)患者から得られた腫瘍サンプルを複数の腫瘍断片に処理することにより、前記対象から切除された腫瘍から第1のTIL集団を得ること;
(b)前記腫瘍断片を閉鎖系に添加すること;
(c)IL-2及び任意選択によりOKT-3を含む細胞培養培地中で前記第1のTIL集団を培養することにより、第1の拡大培養を実施して第2のTIL集団を生じさせること、ここで、前記第1の拡大培養は、第1のガス透過性表面積を提供する閉鎖型容器内で実施され、前記第1の拡大培養は、前記第2のTIL集団を得るために約3~14日間にわたって実施され、前記第2のTIL集団は、前記第1のTIL集団よりも数において少なくとも50倍多く、ステップ(b)からステップ(c)への移行は、前記系を開放することなく行われる;
(d)前記第2のTIL集団の前記細胞培養培地に追加のIL-2、OKT-3及び抗原提示細胞(APC)を補充することにより、第2の拡大培養を実施して第3のTIL集団を生じさせること、ここで、前記第2の拡大培養は、前記第3のTIL集団を得るために約7~14日間にわたって実施され、前記第3のTIL集団は、治療用TIL集団であり、前記第2の拡大培養は、第2のガス透過性表面積を提供する閉鎖型容器内で実施され、ステップ(c)からステップ(d)への移行は、前記系を開放することなく行われる;
(e)前記第2及び/又は第3のTIL集団を、転写因子(TF)及び/又はタンパク質発現を一過性に変化させることができる他の分子に曝露すること、ここで、前記TF及び/又はタンパク質発現を一過性に変化させることができる他の分子は、腫瘍抗原の増加した発現及び/又は前記治療用TIL集団における腫瘍抗原特異的T細胞の数の増加を提供する;
(f)ステップ(d)から得られた前記治療用TIL集団を回収すること、ここで、ステップ(e)からステップ(f)への移行は、前記系を開放することなく行われる;及び
(g)ステップ(e)からの前記回収されたTIL集団を輸注バッグに移すこと、ここで、ステップ(f)から(g)への移行は、前記系を開放することなく行われる;及び
(h)任意選択により、凍結保存プロセスを使用して、ステップ(f)からの前記回収されたTIL集団を含む前記輸注バッグを凍結保存すること
を含む方法によって得ることができる第3のTIL集団である、拡大培養TIL集団。 - 前記方法は、請求項1~43のいずれか一項に記載の特徴の1つ以上を更に含む、請求項44又は45に記載の癌を有する対象を処置するのに使用するためのTIL集団。
- 腫瘍浸潤リンパ球(TIL)を治療用TIL集団に拡大培養する方法であって、治療用TIL集団を生成するために、転写因子(TF)及び/又はタンパク質発現を一過性に変化させることができる他の分子にTILを曝露することを含み、前記TF及び/又はタンパク質発現を一過性に変化させることができる他の分子は、腫瘍抗原の増加した発現及び/又は前記治療用TIL集団における腫瘍抗原特異的T細胞の数の増加を提供する、方法。
- タンパク質発現の前記一過性の変化は、タンパク質発現の誘導をもたらす、請求項1~47のいずれか一項に記載の方法。
- タンパク質発現の前記一過性の変化は、タンパク質発現の低減をもたらす、請求項1~48のいずれか一項に記載の方法。
- 1つ以上のsd-RNAは、前記一過性のタンパク質発現を低減するために利用される、請求項49に記載の方法。
- 転写因子(TF)及び/又はタンパク質発現を一過性に変化させることができる他の分子を評価する方法であって、治療用TIL集団を生成するために、転写因子(TF)及び/又はタンパク質発現を一過性に変化させることができる他の分子にTILを曝露して、腫瘍浸潤リンパ球(TIL)を治療用TIL集団に拡大培養することを含み、前記TF及び/又はタンパク質発現を一過性に変化させることができる他の分子は、腫瘍抗原の変化した発現及び/又は前記治療用TIL集団における腫瘍抗原特異的T細胞の数の変化を提供する、方法。
- タンパク質発現の前記一過性の変化は、PD-1、TGFBR2、CBLB(CBL-B)、CISH、CCR(キメラ共刺激受容体)、IL-2、IL-12、IL-15、IL-21、NOTCH 1/2 ICD、TIM3、LAG3、TIGIT、TGFβ、CCR2、CCR4、CCR5、CXCR1、CXCR2、CSCR3、CCL2(MCP-1)、CCL3(MIP-1α)、CCL4(MIP1-β)、CCL5(RANTES)、CXCL1/CXCL8、CCL22、CCL17、CXCL1/CXCL8、VHL、CD44、PIK3CD、SOCS1及びcAMPプロテインキナーゼA(PKA)からなる群から選択される遺伝子を標的とする、請求項1~51のいずれか一項に記載の方法。
- 腫瘍浸潤リンパ球(TIL)を治療用TIL集団に拡大培養する方法であって、
(a)患者から得られた腫瘍サンプルを複数の腫瘍断片に処理することにより、前記患者から切除された腫瘍から第1のTIL集団を得ること;
(b)前記腫瘍断片を閉鎖系に添加すること;
(c)IL-2を含み、且つ任意選択により4-1BBアゴニスト抗体を含む細胞培養培地中で約2~5日間にわたって前記第1のTIL集団を培養することにより、第1の拡大培養を実施すること;
(d)OKT-3を添加して第2のTIL集団を生じさせること、ここで、前記第1の拡大培養は、第1のガス透過性表面積を提供する閉鎖型容器内で実施され、前記第1の拡大培養は、前記第2のTIL集団を得るために約1~3日間にわたって実施され、前記第2のTIL集団は、前記第1のTIL集団よりも数において少なくとも50倍多く、ステップ(c)からステップ(d)への移行は、前記系を開放することなく行われる;
(e)前記第2のTIL集団に対して無菌エレクトロポレーションステップを実施すること、ここで、前記無菌エレクトロポレーションステップは、少なくとも1つの短鎖干渉RNA又は1つのメッセンジャーRNAの移動を媒介する;
(f)前記第2のTIL集団を約1日間にわたって静置すること;
(g)前記第2のTIL集団の前記細胞培養培地に追加のIL-2、任意選択によりOKT-3抗体、任意選択によりOX40抗体及び抗原提示細胞(APC)を補充することにより、第2の拡大培養を実施して第3のTIL集団を生じさせること、ここで、前記第2の拡大培養は、前記第3のTIL集団を得るために約7~11日間にわたって実施され、前記第2の拡大培養は、第2のガス透過性表面積を提供する閉鎖型容器内で実施され、ステップ(f)からステップ(g)への移行は、前記系を開放することなく行われる;
(h)ステップ(g)から得られた前記治療用TIL集団を回収して、回収されたTIL集団を提供すること、ここで、ステップ(g)からステップ(h)への移行は、前記系を開放することなく行われ、前記回収されたTIL集団は、治療用TIL集団である;
(i)ステップ(h)からの前記回収されたTIL集団を輸注バッグに移すこと、ここで、ステップ(h)から(i)への移行は、前記系を開放することなく行われる;及び
(j)ジメチルスルホキシドベースの凍結保存培地を使用して、前記回収されたTIL集団を凍結保存すること
を含み、前記無菌エレクトロポレーションステップは、PD-1、LAG-3、TIM-3、CTLA-4、TIGIT、CISH、TGFβR2、PKA、CBLB、BAFF
(BR3)及びそれらの組み合わせからなる群から選択される分子の発現を阻害するための短鎖干渉RNAの送達を含む、方法。 - 腫瘍浸潤リンパ球(TIL)を治療用TIL集団に拡大培養する方法であって、
(a)患者から得られた腫瘍サンプルを複数の腫瘍断片に処理することにより、前記患者から切除された腫瘍から第1のTIL集団を得ること;
(b)前記腫瘍断片を閉鎖系に添加すること;
(c)IL-2を含み、且つ任意選択により4-1BBアゴニスト抗体を含む細胞培養培地中で約2~5日間にわたって前記第1のTIL集団を培養することにより、第1の拡大培養を実施すること;
(d)OKT-3を添加して第2のTIL集団を生じさせること、ここで、前記第1の拡大培養は、第1のガス透過性表面積を提供する閉鎖型容器内で実施され、前記第1の拡大培養は、前記第2のTIL集団を得るために約1~3日間にわたって実施され、前記第2のTIL集団は、前記第1のTIL集団よりも数において少なくとも50倍多く、ステップ(c)からステップ(d)への移行は、前記系を開放することなく行われる、生じさせること;
(e)前記第2のTIL集団に対して無菌エレクトロポレーションステップ又はSQZマイクロ流体膜破壊ステップを実施すること、ここで、前記無菌エレクトロポレーションステップ又はSQZマイクロ流体膜破壊ステップは、少なくとも1つの短鎖干渉RNA又は1つのメッセンジャーRNAの移動を媒介する;
(f)前記第2のTIL集団を約1日間にわたって静置すること;
(g)前記第2のTIL集団の前記細胞培養培地に追加のIL-2、任意選択によりOKT-3抗体、任意選択によりOX40抗体及び抗原提示細胞(APC)を補充することにより、第2の拡大培養を実施して第3のTIL集団を生じさせること、前記第2の拡大培養は、前記第3のTIL集団を得るために約7~11日間にわたって実施され、前記第2の拡大培養は、第2のガス透過性表面積を提供する閉鎖型容器内で実施され、ステップ(f)からステップ(g)への移行は、前記系を開放することなく行われる;
(h)ステップ(g)から得られた前記治療用TIL集団を回収して、回収されたTIL集団を提供すること、ここで、ステップ(g)からステップ(h)への移行は、前記系を開放することなく行われ、前記回収されたTIL集団は、治療用TIL集団である;
(i)ステップ(h)からの前記回収されたTIL集団を輸注バッグに移すこと、ここで、ステップ(h)から(i)への移行は、前記系を開放することなく行われる;及び
(j)ジメチルスルホキシドベースの凍結保存培地を使用して、前記回収されたTIL集団を凍結保存すること
を含み、前記エレクトロポレーションステップは、PD-1、LAG-3、TIM-3、CTLA-4、TIGIT、CISH、TGFβR2、PKA、CBLB、BAFF(BR3)及びそれらの組み合わせからなる群から選択される分子の発現を阻害するための短鎖干渉RNAの送達を含み、更に、CCR2、CCR4、CCR5、CXCR2、CXCR3、CX3CR1及びそれらの組み合わせからなる群から選択される接着分子は、ガンマレトロウイルス又はレンチウイルス方法により、前記第1のTIL集団、第2のTIL集団又は回収されたTIL集団に挿入される、方法。 - 腫瘍浸潤リンパ球(TIL)を治療用TIL集団に拡大培養する方法であって、
(a)患者から得られた腫瘍サンプルを複数の腫瘍断片に処理することにより、前記患者から切除された腫瘍から第1のTIL集団を得ること;
(b)前記腫瘍断片を閉鎖系に添加すること;
(c)IL-2を含み、且つ任意選択により4-1BBアゴニスト抗体を含む細胞培養培地中で約2~5日間にわたって前記第1のTIL集団を培養することにより、第1の拡大培養を実施すること;
(d)OKT-3を添加して第2のTIL集団を生じさせること、ここで、前記第1の拡
大培養は、第1のガス透過性表面積を提供する閉鎖型容器内で実施され、前記第1の拡大培養は、前記第2のTIL集団を得るために約1~3日間にわたって実施され、前記第2のTIL集団は、前記第1のTIL集団よりも数において少なくとも50倍多く、ステップ(c)からステップ(d)への移行は、前記系を開放することなく行われる;
(e)前記第2のTIL集団に対して無菌エレクトロポレーションステップを実施すること、ここで、前記無菌エレクトロポレーションステップは、少なくとも1つの短鎖干渉RNA又は1つのメッセンジャーRNAの移動を媒介する;
(f)前記第2のTIL集団を約1日間にわたって静置すること;
(g)前記第2のTIL集団の前記細胞培養培地に追加のIL-2、任意選択によりOKT-3抗体、任意選択によりOX40抗体及び抗原提示細胞(APC)を補充することにより、第2の拡大培養を実施して第3のTIL集団を生じさせること、ここで、前記第2の拡大培養は、前記第3のTIL集団を得るために約7~11日間にわたって実施され、前記第2の拡大培養は、第2のガス透過性表面積を提供する閉鎖型容器内で実施され、ステップ(f)からステップ(g)への移行は、前記系を開放することなく行われる;
(h)ステップ(g)から得られた前記治療用TIL集団を回収して、回収されたTIL集団を提供すること、ここで、ステップ(g)からステップ(h)への移行は、前記系を開放することなく行われ、前記回収されたTIL集団は、治療用TIL集団である;
(i)ステップ(h)からの前記回収されたTIL集団を輸注バッグに移すこと、ここで、ステップ(h)から(i)への移行は、前記系を開放することなく行われる;及び
(j)ジメチルスルホキシドベースの凍結保存培地を使用して、前記回収されたTIL集団を凍結保存すること
を含み、前記無菌エレクトロポレーションステップは、PD-1、LAG-3、TIM-3、CISH及びCBLB並びにそれらの組み合わせからなる群から選択される分子の発現を阻害するための短鎖干渉RNAの送達を含む、方法。 - 腫瘍浸潤リンパ球(TIL)を治療用TIL集団に拡大培養する方法であって、
(a)患者から得られた腫瘍サンプルを複数の腫瘍断片に処理することにより、前記患者から切除された腫瘍から第1のTIL集団を得ること;
(b)前記腫瘍断片を閉鎖系に添加すること;
(c)IL-2を含み、且つ任意選択により4-1BBアゴニスト抗体を含む細胞培養培地中で約2~5日間にわたって前記第1のTIL集団を培養することにより、第1の拡大培養を実施すること;
(d)前記第1のTIL集団を少なくとも1つのsd-RNAと接触させること、ここで、前記sd-RNAは、0.1μM sd-RNA/10,000TIL/100μL培地、0.5μM sd-RNA/10,000TIL/100μL培地、0.75μM sd-RNA/10,000TIL/100μL培地、1μM sd-RNA/10,000TIL/100μL培地、1.25μM sd-RNA/10,000TIL/100μL培地、1.5μM sd-RNA/10,000TIL/100μL培地、2μM
sd-RNA/10,000TIL/100μL培地、5μM sd-RNA/10,000TIL/100μL培地又は10μM sd-RNA/10,000TIL/100μL培地の濃度で添加され、前記sd-RNAは、PD-1、LAG-3、TIM-3、CISH及びCBLB並びにそれらの組み合わせからなる群から選択される分子の発現を阻害するためのものである;
(e)任意選択により、前記第1のTIL集団に対して無菌エレクトロポレーションステップを実施すること、ここで、前記無菌エレクトロポレーションステップは、前記少なくとも1つのsd-RNAの移動を媒介する;
(f)OKT-3を添加して第2のTIL集団を生じさせること、ここで、前記第1の拡大培養は、第1のガス透過性表面積を提供する閉鎖型容器内で実施され、前記第1の拡大培養は、前記第2のTIL集団を得るために約1~3日間にわたって実施され、前記第2のTIL集団は、前記第1のTIL集団よりも数において少なくとも50倍多く、ステッ
プ(c)からステップ(f)への移行は、前記系を開放することなく行われる;
(g)前記第2のTIL集団を約1日間にわたって静置すること;
(h)前記第2のTIL集団の前記細胞培養培地に追加のIL-2、任意選択によりOKT-3抗体、任意選択によりOX40抗体及び抗原提示細胞(APC)を補充することにより、第2の拡大培養を実施して第3のTIL集団を生じさせること、ここで、前記第2の拡大培養は、前記第3のTIL集団を得るために約7~11日間にわたって実施され、前記第2の拡大培養は、第2のガス透過性表面積を提供する閉鎖型容器内で実施され、ステップ(c)からステップ(h)への移行は、前記系を開放することなく行われる;
(i)ステップ(h)から得られた前記治療用TIL集団を回収して、回収されたTIL集団を提供すること、ステップ(h)からステップ(i)への移行は、前記系を開放することなく行われ、前記回収されたTIL集団は、治療用TIL集団である;
(j)ステップ(i)からの前記回収されたTIL集団を輸注バッグに移すこと、ここで、ステップ(i)から(j)への移行は、前記系を開放することなく行われる;及び
(k)ジメチルスルホキシドベースの凍結保存培地を使用して、前記回収されたTIL集団を凍結保存すること
を含む方法。 - 腫瘍浸潤リンパ球(TIL)を治療用TIL集団に拡大培養する方法であって、
(a)患者から得られた腫瘍サンプルを複数の腫瘍断片に処理することにより、前記患者から切除された腫瘍から第1のTIL集団を得ること;
(b)前記腫瘍断片を閉鎖系に添加すること;
(c)IL-2を含み、且つ任意選択により4-1BBアゴニスト抗体を含む細胞培養培地中で約2~5日間にわたって前記第1のTIL集団を培養することにより、第1の拡大培養を実施すること;
(d)前記第1のTIL集団を少なくとも1つのsd-RNAと接触させること、ここで、前記sd-RNAは、0.1μM sd-RNA/10,000TIL、0.5μM sd-RNA/10,000TIL、0.75μM sd-RNA/10,000TIL、1μM sd-RNA/10,000TIL、1.25μM sd-RNA/10,000TIL、1.5μM sd-RNA/10,000TIL、2μM sd-RNA/10,000TIL、5μM sd-RNA/10,000TIL又は10μM sd-RNA/10,000TILの濃度で添加され、前記sd-RNAは、PD-1、LAG-3、TIM-3、CISH及びCBLB並びにそれらの組み合わせからなる群から選択される分子の発現を阻害するためのものである;
(e)任意選択により、前記第1のTIL集団に対して無菌エレクトロポレーションステップを実施すること、ここで、前記無菌エレクトロポレーションステップは、前記少なくとも1つのsd-RNAの移動を媒介する;
(f)OKT-3を添加して第2のTIL集団を生じさせること、ここで、前記第1の拡大培養は、第1のガス透過性表面積を提供する閉鎖型容器内で実施され、前記第1の拡大培養は、前記第2のTIL集団を得るために約1~3日間にわたって実施され、前記第2のTIL集団は、前記第1のTIL集団よりも数において少なくとも50倍多く、ステップ(c)からステップ(f)への移行は、前記系を開放することなく行われる;
(g)前記第2のTIL集団を約1日間にわたって静置すること;
(h)前記第2のTIL集団の前記細胞培養培地に追加のIL-2、任意選択によりOKT-3抗体、任意選択によりOX40抗体及び抗原提示細胞(APC)を補充することにより、第2の拡大培養を実施して第3のTIL集団を生じさせること、ここで、前記第2の拡大培養は、前記第3のTIL集団を得るために約7~11日間にわたって実施され、前記第2の拡大培養は、第2のガス透過性表面積を提供する閉鎖型容器内で実施され、ステップ(g)からステップ(h)への移行は、前記系を開放することなく行われる;
(i)ステップ(h)から得られた前記治療用TIL集団を回収して、回収されたTIL集団を提供すること、ステップ(h)からステップ(i)への移行は、前記系を開放する
ことなく行われ、前記回収されたTIL集団は、治療用TIL集団である;
(j)ステップ(i)からの前記回収されたTIL集団を輸注バッグに移すこと、ここで、ステップ(i)から(j)への移行は、前記系を開放することなく行われる;及び
(k)ジメチルスルホキシドベースの凍結保存培地を使用して、前記回収されたTIL集団を凍結保存すること
を含む方法。 - 腫瘍浸潤リンパ球(TIL)を治療用TIL集団に拡大培養する方法であって、
(a)患者から得られた腫瘍サンプルを複数の腫瘍断片に処理することにより、前記患者から切除された腫瘍から第1のTIL集団を得ること;
(b)前記腫瘍断片を閉鎖系に添加すること;
(c)IL-2を含み、且つ任意選択により4-1BBアゴニスト抗体を含む細胞培養培地中で約2~5日間にわたって前記第1のTIL集団を培養することにより、第1の拡大培養を実施すること;
(d)OKT-3を添加して第2のTIL集団を生じさせること、ここで、前記第1の拡大培養は、第1のガス透過性表面積を提供する閉鎖型容器内で実施され、前記第1の拡大培養は、前記第2のTIL集団を得るために約1~3日間にわたって実施され、前記第2のTIL集団は、前記第1のTIL集団よりも数において少なくとも50倍多く、ステップ(c)からステップ(d)への移行は、前記系を開放することなく行われる;
(e)前記第2のTIL集団を約1日間にわたって静置すること;
(f)前記第2のTIL集団の前記細胞培養培地に追加のIL-2、任意選択によりOKT-3抗体、任意選択によりOX40抗体及び抗原提示細胞(APC)を補充することにより、第2の拡大培養を実施して第3のTIL集団を生じさせること、ここで、前記第2の拡大培養は、前記第3のTIL集団を得るために約7~11日間にわたって実施され、前記第2の拡大培養は、第2のガス透過性表面積を提供する閉鎖型容器内で実施され、ステップ(c)からステップ(f)への移行は、前記系を開放することなく行われる;
(g)ステップ(d)、(e)及び/又は(f)のいずれかの間に前記第2のTIL集団を少なくとも1つのsd-RNAと接触させること、ここで、前記sd-RNAは、0.1μM sd-RNA/10,000TIL/100μL培地、0.5μM sd-RNA/10,000TIL/100μL培地、0.75μM sd-RNA/10,000TIL/100μL培地、1μM sd-RNA/10,000TIL/100μL培地、1.25μM sd-RNA/10,000TIL/100μL培地、1.5μM sd-RNA/10,000TIL/100μL培地、2μM sd-RNA/10,000TIL/100μL培地、5μM sd-RNA/10,000TIL/100μL培地又は10μM sd-RNA/10,000TIL/100μL培地の濃度で添加され、前記sd-RNAは、PD-1、LAG-3、TIM-3、CISH及びCBLB並びにそれらの組み合わせからなる群から選択される分子の発現を阻害するためのものである;
(h)任意選択により、前記第2のTIL集団に対して無菌エレクトロポレーションステップを実施すること、ここで、前記無菌エレクトロポレーションステップは、前記少なくとも1つのsd-RNAの移動を媒介する;
(i)ステップ(g)又は(h)から得られた前記治療用TIL集団を回収して、回収されたTIL集団を提供すること、ここで、ステップ(g)からステップ(i)への移行は、前記系を開放することなく行われ、前記回収されたTIL集団は、治療用TIL集団である;
(j)ステップ(i)からの前記回収されたTIL集団を輸注バッグに移すこと、ここで、ステップ(i)から(j)への移行は、前記系を開放することなく行われる;及び
(k)ジメチルスルホキシドベースの凍結保存培地を使用して、前記回収されたTIL集団を凍結保存すること
を含む方法。 - 腫瘍浸潤リンパ球(TIL)を治療用TIL集団に拡大培養する方法であって、
(a)患者から得られた腫瘍サンプルを複数の腫瘍断片に処理することにより、前記患者から切除された腫瘍から第1のTIL集団を得ること;
(b)前記腫瘍断片を閉鎖系に添加すること;
(c)IL-2を含み、且つ任意選択により4-1BBアゴニスト抗体を含む細胞培養培地中で約2~5日間にわたって前記第1のTIL集団を培養することにより、第1の拡大培養を実施すること;
(d)OKT-3を添加して第2のTIL集団を生じさせること、ここで、前記第1の拡大培養は、第1のガス透過性表面積を提供する閉鎖型容器内で実施され、前記第1の拡大培養は、前記第2のTIL集団を得るために約1~3日間にわたって実施され、前記第2のTIL集団は、前記第1のTIL集団よりも数において少なくとも50倍多く、ステップ(c)からステップ(d)への移行は、前記系を開放することなく行われる;
(e)前記第2のTIL集団を約1日間にわたって静置すること;
(f)前記第2のTIL集団の前記細胞培養培地に追加のIL-2、任意選択によりOKT-3抗体、任意選択によりOX40抗体及び抗原提示細胞(APC)を補充することにより、第2の拡大培養を実施して第3のTIL集団を生じさせること、ここで、前記第2の拡大培養は、前記第3のTIL集団を得るために約7~11日間にわたって実施され、前記第2の拡大培養は、第2のガス透過性表面積を提供する閉鎖型容器内で実施され、ステップ(e)からステップ(f)への移行は、前記系を開放することなく行われる;
(g)ステップ(d)、(e)及び/又は(f)のいずれかの間に前記第2のTIL集団を少なくとも1つのsd-RNAと接触させること、ここで、前記sd-RNAは、0.1μM sd-RNA/10,000TIL、0.5μM sd-RNA/10,000TIL、0.75μM sd-RNA/10,000TIL、1μM sd-RNA/10,000TIL、1.25μM sd-RNA/10,000TIL、1.5μM sd-RNA/10,000TIL、2μM sd-RNA/10,000TIL、5μM
sd-RNA/10,000TIL又は10μM sd-RNA/10,000TILの濃度で添加され、前記sd-RNAは、PD-1、LAG-3、TIM-3、CISH及びCBLB並びにそれらの組み合わせからなる群から選択される分子の発現を阻害するためのものである;
(h)任意選択により、前記第2のTIL集団に対して無菌エレクトロポレーションステップを実施すること、ここで、前記無菌エレクトロポレーションステップは、前記少なくとも1つのsd-RNAの移動を媒介する;
(i)ステップ(g)又は(h)から得られた前記治療用TIL集団を回収して、回収されたTIL集団を提供すること、ここで、ステップ(e)からステップ(h)への移行は、前記系を開放することなく行われ、前記回収されたTIL集団は、治療用TIL集団である;
(j)ステップ(i)からの前記回収されたTIL集団を輸注バッグに移すこと、ここで、ステップ(h)から(i)への移行は、前記系を開放することなく行われる;及び
(k)ジメチルスルホキシドベースの凍結保存培地を使用して、前記回収されたTIL集団を凍結保存すること
を含む方法。 - 前記sd-RNAは、第1の拡大培養期間中、1日2回、1日1回、2日毎、3日毎、4日毎、5日毎、6日毎又は7日毎に前記第1の細胞集団に添加される、請求項56~59のいずれか一項に記載の方法。
- 前記sd-RNAは、第1の拡大培養期間中、1日2回、1日1回、2日毎、3日毎、4日毎、5日毎、6日毎又は7日毎に前記第2の細胞集団に添加される、請求項56~59のいずれか一項に記載の方法。
- 2つのsd-RNAは、PD-1、LAG-3、TIM-3、CISH及びCBLBからなる群から選択される2つの分子の発現を阻害するために添加される、請求項56~61のいずれか一項に記載の方法。
- 2つのsd-RNAは、2つの分子の発現を阻害するために添加され、前記2つの分子は、
i.PD-1及びLAG-3、
ii.PD-1及びTIM-3、
iii.PD-1及びCISH、
iv.PD-1及びCBLB、
v.LAG-3及びTIM-3、
vi.LAG-3及びCISH、
vii.LAG-3及びCBLB、
viii.TIM-3及びCISH、
ix.TIM-3及びCBLB、及び
x.CISH及びCBLB
からなる群から選択される、請求項56~61のいずれか一項に記載の方法。 - 3つ以上のsd-RNAは、PD-1、LAG-3、TIM-3、CISH及びCBLBからなる群から選択される3つ以上の分子の発現を阻害するために添加される、請求項56~62のいずれか一項に記載の方法。
- PD-1、LAG-3、TIM-3、CISH及びCBLBからなる群から選択される少なくとも1つの分子の発現は、前記少なくとも1つのsd-RNAと接触された前記TILにおいて少なくとも80%、85%、90%又は95%だけ低減される、請求項56~64のいずれか一項に記載の方法。
- PD-1、LAG-3、TIM-3、CISH及びCBLBからなる群から選択される少なくとも1つの分子の発現は、前記少なくとも1つのsd-RNAと接触された前記TILにおいて少なくとも12時間、少なくとも24時間又は少なくとも48時間にわたって少なくとも80%、85%、90%又は95%だけ低減される、請求項56~64のいずれか一項に記載の方法。
- 前記sd-RNAは、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によって得られ、且つ前記sd-RNAのインビトロ転写に適した線状二本鎖DNAテンプレートであって、前記二本鎖DNAのコード鎖上のRNAポリメラーゼプロモーター、3,000ヌクレオチド長未満であり、且つ真核細胞へのトランスフェクション後にmRNAを検出可能なポリペプチドに翻訳するのに有効な5’非翻訳領域、前記ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームであって、前記ポリペプチドは、トランスフェクトされる前記細胞に対して異種であり、前記ポリペプチドは、免疫細胞のリガンド又は受容体、免疫系の機能を刺激又は阻害するポリペプチド及び発癌性ポリペプチドの機能を阻害するポリペプチドからなる群から選択される、オープンリーディングフレーム、真核細胞へのトランスフェクション後にmRNAを検出可能なポリペプチドに翻訳するのに有効な3’非翻訳領域及び前記二本鎖DNAの前記コード鎖上の50~5,000ヌクレオチドのポリ(A)ストレッチを5’から3’に含む線状二本鎖DNAテンプレートからのインビトロ転写を実施することを含む方法によって調製され、前記プロモーターは、前記オープンリーディングフレームに対して異種であり、前記DNAテンプレートは、DNAベクター内に含有されず、且つ前記ポリ(A)ストレッチの3’末端で終了する、請求項56~64のいずれか一項に記載の方法。
- 前記RNAポリメラーゼプロモーターは、T7、T3又はSP6 RNAポリメラーゼからなる群から選択されるRNAポリメラーゼのためのコンセンサス結合配列を含む、請求項67に記載の方法。
- 前記オープンリーディングフレームは、PD-1、LAG-3、TIM-3、CISH及びCBLBからなる群から選択されるポリペプチドをコードする、請求項67に記載の方法。
- 前記線状二本鎖DNAテンプレートは、内部リボソーム侵入部位を更に含む、請求項67に記載の方法。
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