JP2002142784A - 新規ｈｉｓＳ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 ｈｉｓＳポリペプチドおよびそれをコードす
るポリヌクレオチドを提供する。 【解決手段】 本発明は、ｈｉｓＳポリペプチドおよび
ｈｉｓＳポリペプチドをコードしているＤＮＡ（ＲＮ
Ａ）ならびに組み換え法によるかかるポリペプチドの製
造方法を提供する。また、抗細菌化合物のスクリーニン
グのためのｈｉｓＳポリペプチドの使用方法も提供され
る。

Description

【発明の詳細な説明】 【発明の属する技術分野】

【０００１】本発明は、新規に同定されたポリヌクレオ
チドおよびポリペプチド、およびその製造および使用、
ならびにそれらの変種、アゴニストおよびアンタゴニス
トおよびそれらの使用に関する。詳細には、これらのお
よびその他の点に関して、本発明は本明細書で「ｈｉｓ
Ｓ」と称する、ヒスチジルｔＲＮＡファミリーの新規ポ
リヌクレオチドおよびポリペプチドに関する。

【０００２】

【従来の技術】ストレプトコッカス属は、医学上重要な
微生物の属であり、ヒトにおいていくつかのタイプの疾
病、例えば、中耳炎、結膜炎、肺炎、菌血症、髄膜炎、
副鼻腔炎、膿胸および心内膜炎、最も詳細には髄膜炎
（例えば、脳脊髄液の感染）等の原因であることが知ら
れている。その単離は１００年以上も前であるので、ス
トレプトコッカス・ニューモニアエ（Streptcoccus pne
umoniae）は魅力的な研究対象微生物の１つである。例
えば、ＤＮＡが実際に遺伝物質であるという我々の初期
の知識の多くは、この微生物を用いたGriffithおよびAv
ery、MacleodおよびMcCartyの研究に基づいて予想され
たものであった。エス・ニューモニアエ（S.pneumonia
e）に関する膨大な研究にもかかわらず、この微生物の
毒性に関する多くの疑問があった。ストレプトコッカス
の遺伝子および遺伝子産物を抗生物質の開発のための標
的として用いることが特に好ましい。ストレプトコッカ
ス・ニューモニアエ感染の頻度は過去２０年間で飛躍的
に増大した。これは多剤耐性株の出現および免疫系が弱
体化した人々の増加による。標準的な抗生物質のいくつ
かまたはすべてに耐性であるストレプトコッカス・ニュ
ーモニアエを単離することは、もはや異常なことではな
い。このことは、新規抗生物質およびこの生物に関する
新規診断方法の両方に対する必要性を生じさせた。

【０００３】ｔＲＮＡシンセターゼは以下のスキームに
従って、蛋白合成に主要な役割を果たす： 酵素＋ＡＴＰ＋ＡＡ⇔酵素.ＡＡ-ＡＭＰ＋ＰＰｉ 酵素.ＡＡ-ＡＭＰ＋ｔＲＮＡ⇔酵素＋ＡＭＰ＋ＡＡ-ｔ
ＲＮＡ （ＡＡはアミノ酸である）この過程を阻害すると、荷電
ｔＲＮＡのレベル低下を導き、緊縮応答として知られて
いるカスケード反応の引き金となり、結果的に生体の休
眠状態を誘導する。そのようなものとして、細菌ｔ−Ｒ
ＮＡシンセターゼに対する選択的阻害剤は抗菌剤として
の潜在能力を有する。かかる一例としてムピロシンがあ
り、それはイソロイシルｔ−ＲＮＡシンセターゼの選択
的阻害剤である。他のｔ−ＲＮＡシンセターゼは、現
在、使用可能な抗菌剤としての試験中であり、シンセタ
ーゼの単離によりこの方法は大いに利用しやすくなる。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】明らかに、化合物の抗
生物質活性をスクリーニングするために用いることがで
きる因子、ならびに感染、機能障害および疾患の病因に
おける役割を決定するためにも用いることができる因子
が必要とされている。また、感染、機能障害または疾患
の予防、改善または抑制に役割を果たすことができるこ
のような因子ならびにアンタゴニストおよびアゴニスト
の同定および特徴づけも必要とされている。本発明のポ
リペプチドは、既知のストレプトコッカス・エクイシミ
ルス（Streptococcus equisimilus）のヒスチジルｔＲ
ＮＡシンセターゼ蛋白に相同的なアミノ酸配列を有す
る。

【０００５】

【課題を解決するための手段および発明の実施の形態】
本発明の目的は、表１〜６の［配列番号：２］に示すア
ミノ酸配列とストレプトコッカス・エクイシミルスのヒ
スチジルｔＲＮＡシンセターゼ等のその他の蛋白の既知
アミノ酸配列との相同性により、新規ｈｉｓＳポリペプ
チドとして同定されたポリペプチドを提供することであ
る。本発明のさらなる目的は、ｈｉｓＳポリペプチドを
コードするポリヌクレオチド、特に本明細書においてｈ
ｉｓＳと称するポリペプチドをコードするポリヌクレオ
チドを提供することである。本発明のとりわけ好ましい
態様において、ポリヌクレオチドは、表１〜６の[配列
番号：１]に示す配列を含む新規ｈｉｓＳポリペプチ
ド、またはそれらの変種をコードする領域を包含する。
本発明の特に好ましい具体例において、ポリペプチド
は、表１〜６の［配列番号：１］に示す配列を含むｈｉ
ｓＳポリペプチドをコードしている領域を含み、それは
全長の遺伝子またはその変種を包含する。本発明の別の
とりわけ好ましい態様において、表１〜６の[配列番
号：２]に示すアミノ酸配列を含む、ストレプトコッカ
ス・ニューモニアエ由来の新規ｈｉｓＳ蛋白、またはそ
れらの変種がある。本発明のこの態様によれば、寄託株
に含まれるストレプトコッカス・ニューモニアエ０１０
０９９３株により発現可能な成熟ポリペプチドをコード
する単離核酸分子が提供される。本発明のこの態様によ
れば、ｈｉｓＳ、とりわけストレプトコッカス・ニュー
モニアエのｈｉｓＳをコードする、ｍＲＮＡ、ｃＤＮ
Ａ、ゲノムＤＮＡ等の単離核酸分子が提供される。本発
明のさらなる態様は、生物学的、診断学的、予防的、臨
床的または治療的に有用なそれらの変種、およびこれら
を含有する組成物を包含する。

【０００６】本発明の別の態様によれば、治療的、予防
的目的で、とりわけ遺伝学的免疫において本発明のポリ
ヌクレオチドの使用が提供される。本発明のこの態様に
おけるとりわけ好ましい具体例は、ｈｉｓＳの自然発生
対立遺伝子変種およびそれによりコードされるポリペプ
チドである。本発明のこの態様によれば、本明細書でｈ
ｉｓＳと称するストレプトコッカス・ニューモニアエの
新規ポリペプチド、ならびに生物学的、診断学的、予防
的、臨床的または治療的に有用なそれらの変種、および
これらを含んでなる組成物が提供される。本発明のとり
わけ好ましい具体例は、ｈｉｓＳ遺伝子の自然発生対立
遺伝子によりコードされるｈｉｓＳポリペプチドの変種
である。本発明のこの態様における好ましい具体例にお
いて、前述のｈｉｓＳポリペプチドの製造方法が提供さ
れる。本発明の別の態様によれば、例えば抗体等の抗菌
物質として有用な、このようなポリペプチドに対する阻
害物質が提供される。

【０００７】本発明のこの態様における１の好ましい態
様によれば、ｈｉｓＳ発現の評価、および疾病の処置、
例えば中耳炎、結膜炎、肺炎、菌血症、髄膜炎、副鼻腔
炎、膿胸および心内膜炎、最も詳細には髄膜炎（例え
ば、脳脊髄液の感染）の処置、遺伝学的変種のアッセ
イ、ならびに生物にｈｉｓＳポリペプチドまたはポリヌ
クレオチドを投与して細菌（詳細にはストレプトコッカ
ス・ニューモニアエ細菌）に対する免疫学的応答の生起
のための製品、組成物および方法が提供される。

【０００８】本発明のこの態様および他の態様における
１の好ましい具体例によれば、ｈｉｓＳポリヌクレオチ
ド配列に、とりわけ厳密な条件でハイブリダイズするポ
リヌクレオチドが提供される

【０００９】本発明のこの態様における１の好ましい具
体例において、ｈｉｓＳポリペプチドに対する抗体が提
供される。本発明の他の具体例において、本発明ポリペ
プチドまたはポリヌクレオチドに結合し、あるいはそれ
らと相互作用し、さらにはそれらの活性を阻害またが活
性化する方法が提供される。該方法は、化合物とポリペ
プチドまたはポリヌクレオチドとの間の結合または他の
相互作用を可能にする条件下で、本発明ポリペプチドま
たはポリヌクレオチドをスクリーニングすべき化合物と
接触させて化合物に対する結合または他の相互作用を評
価すること（かかる結合または相互作用は、ポリペプチ
ドまたはポリヌクレオチドと化合物との結合または相互
作用に応答した検出可能なシグナルを提供しうる第２の
成分に関連したものである）；次いで、化合物とポリペ
プチドまたはポリヌクレオチドとの結合または相互作用
から生じたシグナルの存在または不存在を検出すること
により、化合物がポリペプチドまたはポリヌクレオチド
と結合または相互作用して、その活性を活性化または阻
害するかどうかを決定することを特徴とする。

【００１０】本発明の別の態様によれば、各々好ましい
静菌性または殺菌性をも有するｈｉｓＳアゴニストおよ
びアンタゴニストを提供する。

【００１１】本発明のさらなる態様において、ｈｉｓＳ
ポリヌクレオチドまたはｈｉｓＳポリペプチドを含有す
る、細胞または多細胞生物への投与用の組成物が提供さ
れる。開示した本発明の意図および範囲内での種々の変
更および修飾は、以下の記載および本明細書のその他の
部分の知見により、当業者に容易に明らかとなろう。

【００１２】用語集 以下の定義は、本明細書、とりわけ実施例において汎用
される特定の用語の理解を容易にするために示すもので
ある。「宿主細胞」は外来ポリヌクレオチド配列により
形質転換もしくはトランスフェクションされた、または
形質転換もしくはトランスフェクションされ得る細胞で
ある。

【００１３】「同一性」とは、当該分野に周知であるよ
うに、二つもしくはそれ以上のポリペプチド配列また二
つもしくはそれ以上のポリヌクレオチド配列間の関係で
あり、配列を比較して決定する。当該分野において、
「同一性」とは、場合によってはこのような配列の鎖の
適合性により決定できる、ポリペプチドまたはポリヌク
レオチド配列の配列関連性の程度をも意味する。「同一
性」および「類似性」は共に既知の方法により容易に算
出できる（Computational Molecular Biology，Lesk,A.
M.編、オックスフォード・ユニバーシティー・プレス、
ニューヨーク、1988年；Biocomputing：Informatics an
d Genome Projects，Smith,D.W.編、アカデミック・プ
レス、ニューヨーク、1993年；Computer Analysis of S
equence Data，パートＩ，Griffin,A.M.およびGriffin,
H.G.編、ヒューマン・プレス、ニュージャージー、1994
年；Sequence Analysis in Molecular Biology，von He
inje,G.、アカデミック・プレス、1987年；およびSeque
nce Analysis Primer，Gribskov,M.およびDevereux,J.
編、Ｍストックトン・プレス、ニューヨーク、1991
年）。二つの配列の同一性および類似性を測定する方法
は多くあるが、両用語共当業者に周知である（Sequence
Analysis in Molecular Biology，von Heinje,G.、ア
カデミック・プレス、1987年；Sequence Analysis Prim
er，Gribskov,M.およびDevereux,J.編、Ｍストックトン
・プレス、ニューヨーク、1991年；ならびにCarillo,H.
およびLipman,D.，SIAM J.Applied Math.，48:1073（19
88））。配列間の同一性または類似性を測定するために
通常用いられる方法はCarillo,H.およびLipman,D.，SIA
M J.Applied Math.，48:1073（1988）等に開示されてい
るが、これらに限定するものではない。同一性を決定す
るための好ましい方法は、試験する配列間で最も良く適
合するように設計される。同一性および類似性を決定す
る方法は、公に入手できるコンピュータープログラムで
組み立てられる。二つの配列間の同一性および類似性を
測定する好ましいコンピュータープログラム法には、Ｇ
ＣＧプログラムパッケージ（Devereux,J.ら、Nucleic A
cids Research12(1):387（1984）、BLASTP、BLASTN、お
よびFASTA（Atschul,S.F.ら、J.Molec.Biol.215:403-41
0（1990）））等があるが、これらに限定するものでは
ない。BLAST XプログラムはNCBIおよびその他の供給源
より公に入手可能である（BLAST Manual、Altschul,S.
ら、NCBI NLMNIHベゼスダ、メリーランド州20894；Alts
chul,S.ら、J.Molec.Biol.215:403-410（1990））。一
例として、配列番号：１のリファレンスヌクレオチド配
列に対して、例えば少なくとも９５％の同一性を有する
ヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを挙げる
と、そのポリヌクレオチドが配列番号：１のリファレン
スヌクレオチド配列のヌクレオチド１００個ごとに５個
までの点突然変異を含みうることを除き、そのポリヌク
レオチドのヌクレオチド配列はリファレンス配列と同一
である。言い換えると、リファレンスヌクレオチド配列
に対して少なくとも９５％同一であるヌクレオチドを有
するポリヌクレオチドを得るためには、リファレンス配
列中の５％までのヌクレオチドが欠失または別のヌクレ
オチドと置換していてもよく、あるいはリファレンス配
列中の全ヌクレオチドの５％までの数のヌクレオチドが
リファレンス配列に挿入されたものであってもよい。リ
ファレンス配列のこれらの変異は、リファレンスヌクレ
オチド配列の５’または３’末端位置に存在していても
よく、あるいはそれらの末端位置の間のいずれかの位置
に存在していてもく、リファレンス配列のヌクレオチド
に散在していてもよく、あるいはリファレンス配列内の
１個またはそれ以上の一連の群となっていてもよい。同
様に、配列番号：２のリファレンスアミノ酸配列に対し
て少なくとも例えば９５％の同一性を有するアミノ酸配
列を有するポリペプチドを例に挙げると、そのポリペプ
チド配列が配列番号：２のリファレンスアミノ酸配列の
アミノ酸１００個ごとに５個までのアミノ酸の変化を含
みうることを除き、そのポリペプチドのアミノ酸配列は
リファレンス配列と同一である。言い換えると、リファ
レンスアミノ酸配列に対して少なくとも９５％同一であ
るアミノ酸配列を有するポリペプチドを得るためには、
リファレンス配列中のアミノ酸の５％までが置換または
他のアミノ酸と置換していてもよく、あるいはリファレ
ンス配列中の全アミノ酸のうち５％までの数のアミノ酸
がリファレンス配列中に挿入されたものであってもよ
い。リファレンス配列におけるこれらの変化は、リファ
レンスアミノ酸配列のアミノまたはカルボキシ末端位置
に存在してもよく、あるいはそれらの末端間のいずれか
の位置に存在してもよく、リファレンス配列中に散在し
ていてもよく、あるいはリファレンス配列内で１個また
はそれ以上の一連の群をなしていてもよい。

【００１４】「単離」とは、「人間の手により」天然の
状態から変化させられた、すなわち、それが天然に存在
する場合、元来の環境から変化させるもしくは取り除
く、またはその両方を行ったことを意味する。例えばポ
リヌクレオチドまたはポリペプチドが、天然の状態で生
存動物に存在する場合は、「単離」されていないが、同
一のポリヌクレオチドまたはポリペプチドが、天然に共
存する物質から分離されている場合は、本明細書に用い
る用語である、「単離」がなされている。

【００１５】「ポリヌクレオチド」とは、修飾されてい
ないＲＮＡもしくはＤＮＡ、または修飾されたＲＮＡも
しくはＤＮＡであってよい、任意のポリリボヌクレオチ
ドまたはポリデオキシリボヌクレオチドを意味する。
「ポリヌクレオチド」は、一本鎖および二本鎖ＤＮＡ、
一本鎖および二本鎖領域の混合物または一本鎖、二本鎖
および三本鎖領域の混合物であるＤＮＡ、一本鎖および
二本鎖ＲＮＡ、ならびに一本鎖および二本鎖領域の混合
物であるＲＮＡ、一本鎖もしくはより通常的には二本鎖
もしくは三本鎖、または一本鎖および二本鎖領域の混合
物でよいＤＮＡおよびＲＮＡを含むハイブリッド分子を
意味するが、これに限定するものではない。さらに、本
明細書で用いるポリヌクレオチドは、ＲＮＡもしくはＤ
ＮＡまたはＲＮＡとＤＮＡの両方を含む三本鎖領域を意
味する。そのような領域における鎖は同一の分子または
異なる分子からのものでよい。この領域は一つまたはそ
れ以上の分子の全てを含み得るが、より典型的には幾つ
かの分子の一領域のみを含む。三重らせん領域の分子の
一つは、しばしばオリゴヌクレオチドである。本明細書
で用いる「ポリヌクレオチド」なる用語は、一つまたは
それ以上の修飾した塩基を含有する、上述のＤＮＡまた
はＲＮＡ等を含む。このように、安定性またはその他の
理由で修飾した骨格を有するＤＮＡまたはＲＮＡは、本
明細書で意図する用語である「ポリヌクレオチド」であ
る。さらに、イノシン等の通常的でない塩基、またはト
リチル化塩基等の修飾塩基を含むＤＮＡまたはＲＮＡは
（二つの例だけをを示す）、本明細書で用いる用語であ
る、ポリヌクレオチドである。当業者に既知の多くの有
用な目的を提供するＤＮＡおよびＲＮＡに、非常に多く
の修飾がなされていることは、明らかであろう。本明細
書で用いる「ポリヌクレオチド」なる用語は、ポリヌク
レオチドのこのような化学的、酵素的または代謝的に修
飾された形態、ならびにウイルスおよび、例えば単細胞
および複合細胞等の細胞に特徴的なＤＮＡおよびＲＮＡ
の化学的形態を包含する。「ポリヌクレオチド」は、し
ばしばオリゴヌクレオチドと称する短いポリヌクレオチ
ドを包含する。

【００１６】「ポリペプチド」は、ペプチド結合または
修飾したペプチド結合により互いに結合している２個ま
たはそれ以上のアミノ酸を含む任意のペプチドまたは蛋
白を意味する。「ポリペプチド」は、通常、例えばペプ
チド、オリゴペプチドおよびオリゴマーとも称する短
鎖、および一般的に蛋白と称する長鎖の両方を意味す
る。ポリペプチドは２０種の遺伝子によりコードされた
アミノ酸とは異なるアミノ酸を含有できる。「ポリペプ
チド」には、プロセッシングおよびその他の翻訳後修飾
のような天然の工程により修飾されたものが含まれる
が、当業者に周知の化学修飾技術によっても修飾され
る。このような修飾は基礎的な参考書およびさらに詳細
な論文ならびに多数の研究文献にも詳しく記載されてお
り、これらは当業者に周知である。同一の型の修飾は該
ポリペプチドの幾つかの部位で、同一または異なる程度
で存在し得ることは理解されよう。また、該ポリペプチ
ドは多くの型の修飾をも含み得る。修飾は、ペプチド骨
格、アミノ酸側鎖およびアミノまたはカルボキシル末端
等のポリペプチドの任意の部位で起こりうる。修飾に
は、アセチル化、アシル化、ＡＤＰ−リボシル化、アミ
ド化、フラビンの共有結合、ヘム部分の共有結合、ヌク
レオチドまたはヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質ま
たは脂質誘導体の共有結合、ホスホチジルイノシトール
の共有結合、交差架橋、環化、ジスルフィド結合形成、
脱メチル化、交差架橋共有結合形成、システイン形成、
ピログルタメート形成、ホルミル化、ガンマ−カルボキ
シル化、グリコシル化、ＧＰＩアンカー形成、水酸化、
ヨウ素化、メチル化、ミリストイル化、酸化、蛋白加水
分解プロセッシング、リン酸化、プレニル化、ラセミ
化、グリコシル化、脂質結合、硫酸化、グルタミン酸残
基のガンマ−カルボキシル化、水酸化およびＡＤＰリボ
シル化、セレノイル化、硫酸化、アルギニル化のような
トランスファーＲＮＡ媒介の蛋白へのアミノ酸の添加、
ならびにユビキチネーションなどがある。例えばProtei
ns-Structure and Molecular Properties、第２版、T.
E.Creighton、W.H.Freeman and Company、ニューヨーク
（1993）およびPosttranslational Covalent Modificat
ion of Proteins、B.C.Johnson編、アカデミックプレ
ス、ニューヨーク（1983）のWold,F.,Posttranslationa
l Protein Modifications ：Perspective and Prospect
s、1〜12頁；Seifterら、Meth.Enzymol.182:626-646（1
990）およびRattanら、Protein Synthesis：Posttransl
ational Modifications and Aging，Ann.N.Y.Acad.Sci.
663:48-62（1992）を参照されたい。ポリペプチドは分
岐または環状でよく、分岐していてもいなくてもよい。
環状、分岐および分岐した環状ポリペプチドは、翻訳後
の自然発生プロセッシングの結果であり、同様に全く合
成的な方法で合成できる。

【００１７】本明細書で用いる「変種」なる用語は、対
照ポリヌクレオチドまたはポリペプチドとは各々異なる
ポリヌクレオチドまたはポリペプチドであるが、本質的
な特性は保持している。典型的なポリヌクレオチドの変
種は、別の対照ポリヌクレオチドとはヌクレオチド配列
が異なる。変種のヌクレオチド配列の差異は、参照ポリ
ヌクレオチドによりコードされるポリペプチドのアミノ
酸配列を変化させるものであってもよく、変化させない
ものであってもよい。ヌクレオチドの変化は結果的に、
以下に論じるように、参照配列によりコードされるポリ
ペプチドにおけるアミノ酸置換、付加、欠損、融合およ
び切断を招く。典型的なポリペプチドの変種は、別の参
照ポリペプチドとはアミノ酸配列が異なる。一般的に差
異は、参照ポリペプチドおよび変種の配列が、全体的に
非常に類似しており、多くの領域で同一であるように限
定される。変種および対照ポリペプチドは、１またはそ
れ以上の置換、付加、欠損が任意の組み合わせで起こる
ことにより、アミノ酸配列が変化し得る。置換または挿
入したアミノ酸残基は、遺伝的コードによりコードされ
たものであってもなくてもよい。ポリヌクレオチドまた
はポリペプチドの変種は例えば対立遺伝子変種のような
天然発生のものでよいか、または天然に発生することが
知られていない変種でよい。ポリヌクレオチドおよびポ
リペプチドの非天然発生変種は、突然変異技術、直接的
合成、および当業者に既知のその他の組換え技術により
製造できる。

【００１８】発明の詳細な説明 本発明は以下により詳細に記載する、新規ｈｉｓＳポリ
ペプチドおよびポリヌクレオチドに関する。特に、本発
明は、ストレプトコッカス・エクイシミルスのヒスチジ
ルｔＲＮＡシンセターゼポリペプチドにアミノ酸配列の
相同性という点で関連している、ストレプトコッカス・
ニューモニアエの新規ｈｉｓＳのポリペプチドおよびポ
リヌクレオチドに関する。本発明は特に表１〜６の［配
列番号：１］および［配列番号：２］に各々示すヌクレ
オチドおよびアミノ酸配列を有するｈｉｓＳ、ならびに
寄託株中のＤＮＡのｈｉｓＳヌクレオチド配列およびそ
れによりコードされるアミノ酸配列に関する。

【００１９】ｈｉｓＳポリヌクレオチドおよびポリペプ
チド配列

【表１】

【表２】

【表３】

【表４】

【表５】

【表６】

【００２０】寄託物 ストレプトコッカス・ニューモニアエ０１００９９３株
を含む寄託物は、ナショナル・コレクション・オブ・イ
ンダストリアル・アンド・マリン・バクテリア・リミテ
ッド（ＮＣＩＭＢ）、２３ストリート、マッカードライ
ブ、アベルディーンＡＢ２１ＲＹ、スコットランドに、
１９９６年４月１７日寄託し、ＮＣＩＭＢ受託番号４０
７９４が付与された。イー・コリ（E.coli）中のストレ
プトコッカス・ニューモニアエ０１００９９３ＤＮＡラ
イブラリーも同様にＮＣＩＭＢに寄託され、受託番号４
０８００を付与された。寄託したストレプトコッカス・
ニューモニアエ株は本明細書では「寄託株」または「寄
託株のＤＮＡ」と称する。寄託物質はｈｉｓＳ遺伝子の
全長を含有する。寄託株中に含まれるポリヌクレオチド
配列、ならびにそれによりコードされるポリペプチドの
アミノ酸配列は、本明細書のいずれの記載との矛盾に際
しても支配的である。寄託は、特許手続き上の微生物寄
託の国際承認に関するブダペスト条約の条件下でなされ
ている。特許が発行されると何らの制限または条件もな
く、最終的に株は分譲される。寄託は当業者の便宜のた
めにのみ提供され、３５Ｕ.Ｓ.Ｃ.１１２条のもとに要
求されるような、寄託が実施可能要件であることを承認
するものではない。寄託物を製造、使用または販売する
ためにはライセンスが必要であるが、そのようなライセ
ンスはここでは賦与されていない。

【００２１】ポリペプチド 本発明のポリペプチドには、表１〜６の[配列番号：２]
のポリペプチド、ならびに表１〜６の[配列番号：２]の
ポリペプチドに少なくとも７０％の同一性を有するポリ
ペプチド、好ましくは表１〜６の[配列番号：２]のポリ
ペプチドに少なくとも８０％の同一性を有するポリペプ
チド、およびさらに好ましくは表１〜６の[配列番号：
２]のポリペプチドに少なくとも９０％の類似性（さら
に好ましくは少なくとも９０％の同一性）を有するポリ
ペプチド、なおさらに好ましくは表１〜６の[配列番
号：２]のポリペプチドに少なくとも９５％の類似性
（なおさらに好ましくは少なくとも９５％の同一性）を
有するポリペプチドなどがあり、また通常少なくとも３
０個のアミノ酸、さらに好ましくは少なくとも５０個の
アミノ酸を含むようなポリペプチド部分を有する、この
ようなポリペプチドの部分なども含まれる。また本発明
は、表６の（Ｄ）に示す式で表されるポリペプチドを包
含し、式中、アミノ末端においてＸは水素であり、カル
ボキシル末端においてＹは水素または金属であり、Ｒ１
およびＲ２はいずれかのアミノ酸残基であり、ｎは１な
いし１０００の整数である。Ｒ基により示されるアミノ
酸残基の鎖はヘテロポリマーであってもホモポリマーで
あってもよく、好ましくはヘテロポリマーであり、Ｒは
１よりも大である。

【００２２】フラグメントは、前述のポリペプチドのア
ミノ酸配列のすべてではなく一部に対して全く同一であ
るアミノ酸配列を有する変種ポリペプチドである。ｈｉ
ｓＳポリペプチドでは、フラグメントは「独立して存在
（free standing）」しているか、または一部分もしく
は領域を形成するより大きなポリペプチド内に含まれて
いてもよく、最も好ましくは単一の連続した領域とし
て、単一のより大きなポリペプチドに含まれる。好まし
いフラグメントは、アミノ末端を含む残基の一連の連続
（すなわち連続領域、部分または部位）もしくはカルボ
キシル末端を含む残基の一連の連続の欠損、または一つ
はアミノ末端を含み、一つはカルボキシル末端を含む残
基の二つの一連の連続の欠損を除いた、例えば表１〜６
の[配列番号：２]のアミノ酸配列を有する切断されたポ
リペプチド、またはそれらの変種を包含する。宿主、と
りわけストレプトコッカス・ニューモニアエにおける、
本発明のポリペプチドの切断形態もまた好ましい。ま
た、構造的または機能的属性により特徴づけられたフラ
グメント、例えばアルファーヘリックスおよびアルファ
ーヘリックス形成領域、ベータシートおよびベータシー
ト形成領域、ターンおよびターン形成領域、コイルおよ
びコイル形成領域、親水性領域、疎水性領域、アルファ
ー両親媒性領域、ベータ両親媒性領域、可変領域、表面
形成領域、基質結合領域、および高抗原性指標領域を含
むフラグメントなどがある。

【００２３】ｈｉｓＳの活性を媒介する、生物学的に活
性な領域もまた好ましく、類似の活性もしくは改善され
た活性のある、または望ましくない活性を減じたフラグ
メント等がある。動物、とりわけヒトにおいて抗原的ま
たは免疫原的なフラグメントもまた含まれる。特に好ま
しいのは、ストレプトコッカス・ニューモニアエの生存
にとり必須の機能を付与し、あるいは個体、詳細にはヒ
トにおいて疾病を開始させまたは維持する能力を付与す
る酵素の受容体またはドメインを含むフラグメントであ
る。本発明ポリペプチドのフラグメントである変種を、
ペプチド合成による対応全長ポリペプチドの製造に用い
てもよい。それゆえ、これらの変種を、本発明の全長の
ポリペプチドの製造のための中間体として用いてもよ
い。

【００２４】ポリヌクレオチド 本発明の別の態様は、表１〜６の[配列番号：２]の推定
アミノ酸配列を有するｈｉｓＳポリペプチドをコードす
る単離ポリヌクレオチド、ならびにそれらに、およびそ
れらの変種に密接に関連したポリヌクレオチドを提供す
る。本明細書に提供する情報を用いて、例えば表１〜６
の[配列番号：１]に示すポリヌクレオチド配列のよう
な、ｈｉｓＳポリペプチドをコードする本発明のポリヌ
クレオチドを、例えば出発物質としてストレプトコッカ
ス・ニューモニアエ０１００９９３細胞からの染色体Ｄ
ＮＡフラグメントをクローニングおよび配列決定するた
めに用いるような標準的なクローニングおよびスクリー
ニングを用いて得ることができ、次いでクローン全長を
得ることができる。例えば、表１〜６の[配列番号：１]
に示す配列のような本発明のポリヌクレオチド配列を得
るために、大腸菌または幾分異なる適切な宿主における
ストレプトコッカス・ニューモニアエ０１００９９３細
胞の染色体ＤＮＡのクローンの典型的なライブラリー
を、部分的配列に由来の、好ましくは１７量体またはそ
れ以上の長さの放射性標識化オリゴヌクレオチドにてプ
ローブする。プローブのＤＮＡに同一であるＤＮＡを担
うクローンは厳密な条件を用いて区別できる。オリジナ
ルの配列から設計した配列決定プライマーでこのように
同定した個々のクローンを配列決定することにより、次
に両方向で配列が伸長できるようになり、全遺伝子配列
を決定できる。このような配列決定は便宜的にプラスミ
ドクローンから調製した変性二本鎖ＤＮＡを用いて実施
する。適切な技法については、Maniatis,T.、Fitsch,F.
F.およびSambrookら、Molecular Cloning，A Laborator
y Manual、第２版；コールド・スプリング・ハーバー・
ラボラトリー・プレス、コールド・スプリング・ハーバ
ー、ニューヨーク（1989）に記載されている。（Screen
ing By Hybridization 1.90およびSequencing Denature
d Double-Stranded DNA Templates 13.70参照）。本発
明の説明のために、表１〜６の[配列番号：１]に示すポ
リヌクレオチドは、ストレプトコッカス・ニューモニア
エ０１００９９３に由来するＤＮＡライブラリーで発見
された。

【００２５】このように得られたＤＮＡ配列を表１〜６
の[配列番号：１]に示す。これは当該分野で周知のアミ
ノ酸残基分子量を用いて算出できる推定分子量を有す
る、表１〜６の[配列番号：２]に示すものとほぼ同数の
アミノ酸残基を有する蛋白をコードする読み枠を含有す
る。配列番号：１のヌクレオチド番号１から１２８７ま
でのポリヌクレオチドは配列番号：２のポリペプチドを
コードする。停止コドンは配列番号：１のヌクレオチド
番号１２８８から始まる。本発明のｈｉｓＳは、寄託株
のｈｉｓＳをコードするＤＮＡの配列決定の結果により
示されるように、ヒスチジルｔＲＮＡシンセターゼファ
ミリーのその他の蛋白に構造的に関連している。該蛋白
は、既知蛋白のうち、ストレプトコッカス・エクイシミ
ルスのヒスチジルｔＲＮＡシンセターゼ蛋白に最大の相
同性を示す。表１〜６の［配列番号：２］のｈｉｓＳ
は、ストレプトコッカス・エクイシミルスのヒスチジル
ｔＲＮＡシンセターゼポリペプチドに対して、その全長
にわたり約７７％の同一性および約８７％の類似性を有
する。

【００２６】本発明の配列はまた、表１〜６の[配列番
号：１]のコーディング配列に全長にわたり同一であっ
てもよい。本発明はまた、成熟ポリペプチドまたはそれ
らのフラグメントのコーディング配列、ならびに単独で
その他のコーディング配列を有する読み枠の成熟ポリペ
プチドまたはフラグメントのコーディング配列、例えば
リーダーまたは分泌配列、プレ、プロ、プレプロ蛋白配
列をコードするコーディング配列をも提供する。ポリヌ
クレオチドは、例えば、転写された非翻訳配列、終止シ
グナル、リボソーム結合部位、ｍＲＮＡを安定化する配
列、イントロン、ポリアデニル化シグナル等の転写非翻
訳配列、および付加アミノ酸をコードする付加コーディ
ング配列等の非コーディング５'および３'配列等の非コ
ーディング配列をも含有しうるが、これらに限定するの
ではない。例えば、融合ポリペプチドの精製を促すマー
カー配列をコードすることもできる。本発明のある好ま
しい態様において、マーカー配列は、ｐＱＥベクター
（キアゲン・インコーポレーティッド）に提供されるよ
うなヘキサ−ヒスチジンペプチド（Gentzら、Proc.Nat
l.Acad.Sci.,USA，86:821-824（1989）に記載される）
またはＨＡタグ（Wilsonら、Cell，37:767（1984））で
ある。本発明のポリヌクレオチドはまた、構造遺伝子お
よび遺伝子発現を調節する天然の配列をも含むが、これ
らに限定するものではない。

【００２７】本発明の好ましい具体例は表１〜６の配列
番号：１に示すヌクレオチド１から１２８７までを含む
ポリヌクレオチドであり、それはｈｉｓＳポリペプチド
をコードしている。

【００２８】また本発明は、表４および５の（Ｃ）に示
す式で表されるポリペプチドを包含し、式中、分子の
５’末端においてＸは水素であり、３’末端においてＹ
は水素または金属であり、Ｒ１およびＲ２はいずれかの
アミノ酸残基であり、ｎは１ないし１０００の整数であ
る。Ｒ基により示されるアミノ酸残基の鎖はヘテロポリ
マーであってもホモポリマーであってもよく、好ましく
はヘテロポリマーであり、Ｒは１よりも大である。

【００２９】本明細書で用いる「ポリペプチドをコード
するポリヌクレオチド」なる用語は、本発明のポリペプ
チド、とりわけ表１〜６の[配列番号：２]に示すアミノ
酸配列を有する細菌性の、さらに詳細にはストレプトコ
ッカス・ニューモニアエのｈｉｓＳをコードする配列を
含有するポリヌクレオチド包含する。この用語はまた、
付加領域と一緒になった、ポリペプチドをコードする単
一の連続領域または不連続領域（例えば組み込まれたフ
ァージもしくは挿入配列または削除により分断され
る）、さらにはコーディングおよび／または非コーディ
ング配列をも含有し得るポリヌクレオチドをも包含す
る。

【００３０】本発明はさらに、表１〜６の[配列番号：
２]の推定アミノ酸配列を有するポリペプチドの変種を
コードする、本明細書上述のポリヌクレオチドの変種に
関する。本発明の特に好ましい態様は、表１〜６の[配
列番号：２]に示すｈｉｓＳポリペプチドのアミノ酸配
列に幾つか、少しの、５〜１０、１〜６、１〜３、２、
１または０個のアミノ酸残基を置換、欠損または付加を
任意の組み合わせで施したアミノ酸配列を有するｈｉｓ
Ｓ変種をコードするポリヌクレオチドである。中でもと
りわけ好ましいものは、ｈｉｓＳの特性および活性を変
化しないサイレント置換、付加および欠損である。

【００３１】本発明のさらに好ましい態様は、表１〜６
の[配列番号：２]に示すアミノ酸配列を有するｈｉｓＳ
ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、およびこ
のようなポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチド
に対し、全長で少なくとも７０％同一であるポリヌクレ
オチドである。また別に、最も好ましいポリヌクレオチ
ドは、寄託株をコードするポリヌクレオチド、およびそ
れらに相補的なポリヌクレオチドに対し、全長で少なく
とも８０％同一である領域を含むポリヌクレオチドであ
る。この点に関して、全長で少なくとも９０％同一であ
るポリヌクレオチドがとりわけ好ましく、中でも少なく
とも９５％の同一性を有するものが特に好ましい。さら
に少なくとも９５％の同一性を有するものの中でも少な
くとも９７％であるのがより好ましく、中でも少なくと
も９８％および少なくとも９９％であるのが特に好まし
く、さらに少なくとも９９％であるのがより好ましい。
この点に関するとりわけ好ましい態様は、さらに、表１
〜６の[配列番号：１]のＤＮＡにコードされる成熟ポリ
ペプチドと実質的に同一の生物学的機能または活性を保
持するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであ
る。

【００３２】本発明はさらに本明細書上述の配列にハイ
ブリダイズするポリヌクレオチドに関する。この点に関
して、本発明は特に厳密な条件で本明細書上述のポリヌ
クレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドに関
する。本明細書で用いる「厳密な条件」および「厳密な
ハイブリダイゼーション条件」なる用語は、配列間の同
一性が少なくとも９５％、好ましくは少なくとも９７％
である場合のみに起こるハイブリダイゼーションを意味
する。厳密なハイブリダイゼーション条件の例として
は、５０％ホルムアミド。５ｘＳＳＣ（１５０ｍＭ Ｎ
ａＣｌ、１５ｍＭクエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭリ
ン酸ナトリウム（ｐＨ7.6）、５ｘデンハーツ溶液、１
０％硫酸デキストラン、および２０μｇ／ｍｌの変成
し、剪断されたサケ精子ＤＮＡを含有する溶液中、４２
℃で一晩インキュベーションし、続いて約６５℃で０.
１ｘＳＳＣ中フィルターを洗浄するものである。ハイブ
リダイゼーションおよび洗浄条件は周知であり、Sambro
okら、Molecular Cloning，A Laboratory Manual、第２
版；コールド・スプリング・ハーバー、ニューヨーク
（1989）、とりわけその第２章に実例が示されており、
その開示は本明細書において参考として全てを引用す
る。

【００３３】本発明はまた、厳密なハイブリダイゼーシ
ョン条件で配列番号：１に示すポリヌクレオチド配列の
完全遺伝子を含有する適当なライブラリーを、配列番
号：１に示す該ポリヌクレオチド配列の配列を有するプ
ローブでスクリーニングし、該ＤＮＡ配列を単離するこ
とにより得られるポリヌクレオチド配列を本質的に含む
ポリヌクレオチドをも提供する。このようなポリヌクレ
オチドを得るために有用なフラグメントには、例えば本
明細書の別の箇所に記載するプローブおよびプライマー
等がある。

【００３４】本発明のポリヌクレオチドアッセイに関し
てここでさらに論じるが、例えば上述の本発明のポリヌ
クレオチドは、ｈｉｓＳをコードするｃＤＮＡ全長およ
びゲノムクローンを単離するため、およびｈｉｓＳ遺伝
子に高度な配列類似性を有するその他の遺伝子のｃＤＮ
Ａおよびゲノムクローンを単離するための、ＲＮＡ、ｃ
ＤＮＡおよびゲノムＤＮＡのハイブリダイゼーションプ
ローブとして使用することができる。このようなプロー
ブは通常少なくとも１５塩基を含む。好ましくはこのよ
うなプローブは少なくとも３０塩基を有し、少なくとも
５０塩基を有していてもよい。とりわけ好ましいプロー
ブは少なくとも３０塩基を有し、５０塩基以下である。
例えばｈｉｓＳ遺伝子のコーディング領域は、配列番
号：１に示す既知ＤＮＡ配列を用いてオリゴヌクレオチ
ドプローブを合成し、スクリーニングすることにより単
離できる。次いで、本発明の遺伝子の配列に相補的な配
列を有する標識化オリゴヌクレオチドを、ｃＤＮＡ、ゲ
ノムＤＮＡまたはｍＲＮＡのライブラリーのスクリーニ
ングに用い、プローブがハイブリダイズするライブラリ
ーのメンバーを決定する。

【００３５】本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプ
チドは、疾患とりわけヒトの疾患の処置法および診断法
の発見のために研究物質および材料として使用でき、と
りわけポリヌクレオチドアッセイに関連して本明細書で
さらに論じる。配列番号：１および／または２の配列由
来のオリゴヌクレオチドである本発明ポリヌクレオチド
を本明細書記載の方法に使用してもよいが、好ましくは
ＰＣＲに使用して、本明細書で同定したポリヌクレオチ
ドが全てまたは一部が感染した組織に転写されるかどう
かを決定する。このような配列が、病因が達成した感染
のステージおよび感染の型の診断にも有用であることが
理解される。

【００３６】また本発明は、付加アミノ酸もしくはカル
ボキシル末端アミノ酸または成熟ポリペプチドに内在す
るアミノ酸を加えた成熟蛋白であるポリペプチドをコー
ドできるポリペプチドも提供する（例えば成熟形態が一
つ以上のポリペプチド鎖を有する場合）。このような配
列は、前駆体から成熟形態への蛋白のプロセッシングに
役割を担い、蛋白の輸送を可能にし、蛋白の半減期を延
長もしくは短縮し、またはとりわけアッセイもしくは製
造のための蛋白の操作を容易にすることができる。一般
的にインビボの場合、付加アミノ酸は、細胞性酵素によ
りプロセッシングされ、成熟蛋白から取り除かれる。１
またはそれ以上のプロ配列と融合したポリペプチドの成
熟形態を有する前駆蛋白は、ポリペプチドの不活性形態
にできる。プロ配列が除去されると、このような不活性
前駆体が通常活性化される。プロ配列のいくつかまたは
全てを活性化の前に除去できる。通常、このような前駆
体はプロ蛋白と称される。要するに、本発明のポリヌク
レオチドは成熟蛋白、リーダー配列を加えた成熟蛋白
（プレ蛋白と称することができる）、プレ蛋白のリーダ
ー配列ではない１またはそれ以上のプロ配列を有する成
熟蛋白の前駆体、またはリーダー配列および１またはそ
れ以上のプロ配列を有するプロ蛋白の前駆体であるプレ
プロ蛋白をコードでき、プロ配列は通常ポリペプチドの
活性および成熟形態を産み出すプロセッシング段階で除
去される。

【００３７】ベクター、宿主細胞、発現 本発明はまた、ポリヌクレオチドまたは本発明のポリヌ
クレオチドを含むベクター、本発明のベクターで遺伝子
操作する宿主細胞および組換え技法による本発明のポリ
ペプチドの製造にも関する。無細胞翻訳系もまた、本発
明のＤＮＡ構築物に由来するＲＮＡを用いて、このよう
な蛋白を製造できる。組換え体を製造するために、宿主
細胞は、遺伝子操作して、発現系もしくはそれらの一
部、または本発明のポリヌクレオチドを組み込むことが
できる。ポリヌクレオチドの宿主細胞への導入は、例え
ば、Davisら、Basic Methods in Molecular Biology（1
986）；Sambrookら、Molecular Cloning；A Laboratory
Manual、第２版；コールド・スプリング・ハーバー・
ラボラトリー・プレス、コールド・スプリング・ハーバ
ー、ニューヨーク（1989）のように、多くの標準的な実
験マニュアルに記載される方法により行うことができ、
例えばリン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡ
Ｅ−デキストラン媒介トランスフェクション、トランス
ベクション、マイクロインジェクション、陽イオン脂質
媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、
トランスダクション、スクレープ負荷、バリスティック
導入および感染等がある。

【００３８】適当な宿主の代表的なものには、細菌細
胞、例えば連鎖球菌属（streptococci）、ブドウ球菌属
（staphylococci）、大腸菌（E.coli）、ストレプトミ
セスおよび枯草菌（Bacillus subtiis）細胞；真菌細胞
例えば酵母細胞およびアスペルギルス属（Aspergillu
s）細胞；昆虫細胞例えばドロソフィラＳ２（Drosophil
aS2）およびスポドプテラＳｆ９（Spodoptera Sf9）細
胞；動物細胞例えばＣＨＯ、ＣＯＳ、ＨｅＬａ、Ｃ１２
７、３Ｔ３、ＢＨＫ、２９３およびボウズ（Bows）黒色
腫細胞；ならびに植物細胞等がある。

【００３９】本発明のポリペプチドを製造するために非
常に多くの発現系を使用できる。このようなベクターに
は、染色体、エピソームおよびウイルス由来のベクタ
ー、例えば細菌プラスミド由来、バクテリオファージ由
来、トランスポゾン由来、酵母エピソーム由来、挿入物
由来、酵母染色体要素由来、例えばバキュロウイルス、
パポバウイルス、例えばＳＶ４０、ワクシナウイルス、
アデノウイルス、鶏痘ウイルス、仮性狂犬病ウイルスお
よびレトロウイルス等のウイルス由来のベクター、なら
びにそれらを組み合わせた物に由来するベクター、例え
ばプラスミドおよびバクテリオファージ遺伝学的エレメ
ント由来のベクター、例えばコスミドおよびファージミ
ド等がある。発現系の構築物には発現を制御および引き
起こす調節領域を含有できる。通常宿主中にポリヌクレ
オチドを保持、伸長または発現するのに、および／また
はポリペプチドを発現するのに適した任意の系またはベ
クターを、この点に関する発現に使用できる。周知のお
よび通常的な種々の任意の技術により、適当なＤＮＡ配
列を発現系に挿入でき、例えばSambrookら、Molecular
Cloning，A Laboratory Manual（上述）に記載されてい
る。

【００４０】翻訳蛋白を、小胞体内腔、ペリプラスミッ
クスペースまたは細胞外環境へ分泌するために、適当な
分泌シグナルを発現するポリペプチドに組み込むことが
できる。これらのシグナルはポリペプチドに本来的なも
のであってもく、あるいは異種性のシグナルでもよい。

【００４１】本発明のポリペプチドは周知の方法によ
り、組換え細胞培養物から回収および精製でき、その方
法には例えば硫酸アンモニウムまたはエタノール沈殿、
酸抽出、陰イオンまたは陽イオン交換クロマトグラフィ
ー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互
作用クロマトグラフィー、親和性クロマトグラフィー、
ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィーおよびレク
チンクロマトグラフィー等がある。高速液体クロマトグ
ラフィー（「ＨＰＬＣ」）を精製に用いるのが最も好ま
しい。ポリペプチドが単離および／または精製中に変性
した場合、再び活性な立体配座にするために、蛋白再生
のための周知の技法を用いることができる。

【００４２】診断アッセイ 本発明はまた診断試薬として使用するための本発明のｈ
ｉｓＳポリヌクレオチドの使用にも関する。真核生物と
りわけ哺乳動物、特にヒトにおけるｈｉｓＳの検出は、
疾患の診断のための診断法を提供する。真核生物（本明
細書において「個体」とも称する）とりわけ哺乳動物、
特にヒトがｈｉｓＳ遺伝子を含む生物に感染すると、種
々の方法によりＤＮＡレベルで検出できる。診断用の核
酸は、感染した個体の細胞および組織、例えば骨、血
液、筋肉、軟骨および皮膚より得ることができる。ゲノ
ムＤＮＡは直接的に検出するのに使用できるか、または
分析の前にＰＣＲもしくはその他の増幅法を用いること
により酵素的に増幅できる。ＲＮＡまたはｃＤＮＡもま
た同じ方法で用いることができる。増幅法を用いると、
真核生物とりわけ哺乳動物、特にヒトに存在する原核生
物株を、原核生物遺伝子の遺伝子型の分析により特徴づ
けすることができる。対照配列の遺伝子型に比較した増
幅産物の大きさの変化により、欠損および挿入を検出で
きる。点突然変異は、増幅ＤＮＡを標識化ｈｉｓＳポリ
ヌクレオチド配列にハイブリダイズすることにより同定
できる。完全に対合した配列はＲＮアーゼ消化により、
または融解温度の差により、誤対合二重らせんから区別
できる。ＤＮＡ配列の差はまた、変性物質を伴うまたは
伴わないゲル中のＤＮＡフラグメントの電気泳動の可動
性の変化を検出することにより、または直接的なＤＮＡ
の配列決定により検出できる。例えばMeyersら、Scienc
e，230:1242（1985）参照。特異的な位置での配列の変
化はまた、ヌクレアーゼ保護アッセイ例えばＲＮアーゼ
およびＳ１保護または化学的切断法によっても明らかに
することができる。例えばCottonら、Proc.Natl.Acad.S
ci.,USA，85:4397-4401（1985）参照。

【００４３】本発明の遺伝子の突然変異または多型性を
担う細胞はまた、種々の技術により、ＤＮＡレベルで、
例えばセロタイピングすることにより検出できる。例え
ば、ＲＴＰＣＲは突然変異を検出するために用いること
ができる。ＲＴ−ＰＣＲは自動検出系、例えばGeneScan
等と組み合わせて用いるのがとりわけ好ましい。ＲＮＡ
またはｃＤＮＡもまた同じ目的で、ＰＣＲまたはＲＴＰ
ＣＲに用いることができる。例を挙げると、ｈｉｓＳを
コードする核酸に相補的なＰＣＲプライマーは、突然変
異を同定および分析するのに用いることができる。

【００４４】本発明はまた５'および／または３'末端か
ら１、２、３または４ヌクレオチド除去したプライマー
をも提供する。これらのプライマーは個体に由来するサ
ンプルから単離したｈｉｓＳＤＮＡを増幅するのに用い
ることができる。該プライマーは感染した個体から単離
した遺伝子を増幅するために用いることができ、該遺伝
子は次いでＤＮＡ配列を調べるための種々の技法に供す
ることができる。このように、ＤＮＡ配列における突然
変異を検出し、感染の診断および感染性物質のセロタイ
ピングまたは分類に使用することができる。

【００４５】本発明はまた、疾患、好ましくは細菌感
染、さらに好ましくはストレプトコッカス・ニューモニ
アエによる感染、および最も好ましくは中耳炎、結膜
炎、肺炎、菌血症、髄膜炎、副鼻腔炎、膿胸および心内
膜炎、最も詳細には髄膜炎（例えば、脳脊髄液の感染）
等の疾患の診断方法を提供し、表１〜６の[配列番号：
１]の配列を有するポリヌクレオチドの発現レベルの上
昇を、個体由来のサンプルから決定することを含む。ｈ
ｉｓＳポリヌクレオチドの発現の増加または低下は、ポ
リヌクレオチドの定量法として当該分野で周知の方法の
任意の方法、例えば増幅、ＰＣＲ、ＲＴＰＣＲ、ＲＮア
ーゼ保護、ノーザンブロッティングおよびその他のハイ
ブリダイゼーション法を用いて測定できる。

【００４６】さらに、正常対照組織サンプルと比較し
た、ｈｉｓＳ蛋白の過剰発現を検出するための本発明診
断アッセイは、例えば感染の存在を検出するために用い
ることができる。宿主由来のサンプル中のｈｉｓＳ蛋白
のレベルを決定するために用いることができるアッセイ
技法は、当業者に周知である。このようなアッセイ法に
は、ラジオイムノアッセイ、競争結合アッセイ、ウェス
タンブロット分析およびＥＬＩＳＡアッセイ等がある。

【００４７】抗体 本発明のポリペプチドもしくはそれらの変種、またはそ
れらを発現する細胞は、このようなポリペプチドに免疫
特異的な抗体を産生する免疫原として用いることができ
る。本明細書で用いる「抗体」には、モノクローナルお
よびポリクローナル抗体、キメラ、一本鎖、サル化抗体
およびヒト化抗体、ならびにＦａｂ免疫グロブリン発現
ライブラリーの産物等のＦａｂフラグメント等がある。

【００４８】本発明のポリペプチドに対して生じる抗体
は、ポリペプチドまたはエピトープが付いたフラグメン
ト、アナログまたは細胞を、好ましくはヒトはでない動
物に、通常の実験法を用いて投与することにより得るこ
とができる。連続的細胞系培養により産生される抗体を
提供する、当業者周知の技術を用いて、モノクローナル
抗体を調製することができる。実例としては、Kohler，
G.およびMilstein,C.，Nature，256:495-497（1975）；
Kozborら、Immunology Today，4:72（1983）；Coleら、
Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy,Alan R Li
ss,Inc.、77-96頁（1985）に記載されるような種々の技
法がある。一本鎖抗体の産生のために記載された技術
（米国特許第４９４６７７８号）は、本発明のポリペプ
チドに対する一本鎖抗体を産生するのに適用できる。ま
た、トランスジェニックマウスまたはその他の生物例え
ばその他の哺乳動物は、ヒト化抗体等の抗体を発現する
のに用いることができる。

【００４９】別法としてファージディスプレイ技法を、
抗Ｆｂｐを有することにつきスクリーニングしたヒトの
リンパ球のＰＣＲ増幅したｖ遺伝子のレパートリーか
ら、または元来のライブラリーからのポリペプチドに対
する結合活性を有する抗体遺伝子を選別するために利用
できる。（McCafferty,J.ら、Nature 348:552-554（199
0）；Marks,J.ら、Biotechnology 10:779-783（199
2））。これらの抗体の親和性はチェインシャフリング
（chain shuffling）により改善することもできる（Cla
ckson,T.ら、Nature 352:624-628（1991））。

【００５０】二つの抗原結合ドメインが存在する場合、
各ドメインは「二特異性」抗体と称する異なるエピトー
プに対して指向される。

【００５１】上述の抗体はポリペプチドを発現するクロ
ーンを単離または同定するために用いることができ、親
和性クロマトグラフィーにより精製することができる。
従って、とりわけｈｉｓＳに対する抗体を、感染、とり
わけ細菌感染、特に中耳炎、結膜炎、肺炎、菌血症、髄
膜炎、副鼻腔炎、膿胸および心内膜炎、最も詳細には髄
膜炎（例えば、脳脊髄液の感染）等の疾患の処置に用い
ることができる。

【００５２】ポリペプチド変種には抗原的、エピトープ
的または免疫学的に等価な変種等があり、本発明の特定
の態様である。本明細書で用いる「抗原的に等価な誘導
体」なる用語は、本発明により蛋白またはポリペプチド
にまで高められた場合、病原および哺乳動物宿主間での
即時的な物理的相互作用で干渉する特定の抗体により特
異的に認識されるポリペプチドまたはその同等物を包含
する。本明細書で用いる「免疫学的に等価な誘導体」な
る用語は、脊椎動物における抗体を上昇させるのに適し
た処方を用いた場合、抗体が病原および哺乳動物宿主間
での即時的な物理的相互作用を妨害するように作用する
ペプチドまたはその等価物を包含する。

【００５３】ポリペプチド、例えば抗原的、免疫学的に
等価な誘導体、またはそれらの融合蛋白は、マウスまた
はその他の動物例えばラットもしくはニワトリを免疫化
するための抗原として使用できる。融合蛋白はポリペプ
チドに安定性を付与できる。抗原は、例えば抱合するこ
とにより、免疫原性キャリヤ蛋白、例えばウシ血清アル
ブミン（ＢＳＡ）またはキーホール・リンペット・ヘモ
シアニン（keyhole limpet haemocyanin：ＫＬＨ）に結
合することができる。あるいはまた、蛋白もしくはポリ
ペプチド、またはそれらに抗原的もしくは免疫学的に等
価なポリペプチドの多重コピーを含む多重抗原ペプチド
は、免疫原性を改良するための十分な抗原性を有してい
るので、キャリヤーを使用しなくてすむ。

【００５４】抗体またはそれらの変種を、個体における
免疫原性を減じるために修飾するのが好ましい。例え
ば、個体がヒトである場合、抗体は最も好ましくは「ヒ
ト化」されており；この場合、ハイブリドーマ由来の抗
体の相補性決定領域がヒトモノクローナル抗体に移植さ
れており、例えばJones,P.ら、Nature 321:522-525（19
86）またはTempestら、Biotechnology 9:266-273（199
1）に記載されている。本発明のポリヌクレオチドを遺
伝学的免疫化において使用する場合、例えば直接的なプ
ラスミドＤＮＡの筋肉への注射（Wolffら、Hum.Mol.Gen
et.1:363（1992）；Manthorpeら、Hum.Gene Ther.4:419
（1963））、特異的蛋白キャリヤーとのＤＮＡ複合体の
送達（Wuら、J.Biol.Chem.264:16985（1989））、リン
酸カルシウムとのＤＮＡ共沈（Benvenisty & Reshef、P
NAS 83:9551（1986））、種々の形態のリポソーム中へ
のＤＮＡ封入（Kanedaら、Science 243:375（198
9））、微粒子爆撃（Tangら、Nature 356:152（199
2）；Eisenbraunら、DNA Cell Biol.12:791（1993））
およびクローン化レトロウイルスベクターを用いたイン
ビボ感染（Seegerら、PNAS 81:5849（1984））等の適切
な送達方法を用いるのが好ましい。

【００５５】アンタゴニストおよびアゴニスト−アッセ
イおよび分子 本発明のポリペプチドはまた、例えば細胞、無細胞調製
物、化学的ライブラリー、および天然の産生物の混合物
中の、小さな分子の基質およびリガンドの結合を評価す
るために用いることもできる。これらの基質およびリガ
ンドは天然の基質およびリガンドでよく、または構造的
もしくは機能的な擬似物質でもよい。例えばColigan
ら、Current Protocols in Immunology 1(2):第5章（19
91）参照。

【００５６】本発明はまたｈｉｓＳポリペプチドまたは
ポリヌクレオチドの作用を増強（アゴニスト）または阻
害（アンタゴニスト）する化合物を同定するための、化
合物のスクリーニング方法をも提供する。例えば、アゴ
ニストまたはアンタゴニストをスクリーニングするため
に、ｈｉｓＳポリペプチドを含む、合成反応混合物、細
胞コンパートメント、例えば膜、細胞表面膜もしくは細
胞壁、またはそれらのいずれかの調製物、およびこのよ
うなポリペプチドの標識化基質またはリガンドを、ｈｉ
ｓＳアゴニストまたはアンタゴニストとなりうる候補分
子の存在下または不在下で、インキュベーションする。
候補分子がｈｉｓＳポリペプチドにアゴナイズまたは拮
抗する能力は、標識化リガンドの結合の低下またはこの
ような基質からの産生物の産生の低下に反映される。結
合しても影響を及ぼさない分子、すなわちｈｉｓＳの効
果を誘起しない分子は、最も良好なアンタゴニストとな
るであろう。結合性が良好で、基質からの生成物の生成
速度を高める分子はアゴニストである。基質からの生成
物の生成速度またはレベルはリポーターシステムを用い
ることにより増強できる。この点に関して有用なリポー
ターシステムには、産生物に転換される比色標識化基
質、ｈｉｓＳ活性の変化に反応するリポーター遺伝子、
および当該分野で周知の結合アッセイ等があるが、これ
らに限定するものではない。

【００５７】ｈｉｓＳアンタゴニストのアッセイの他の
例は競争アッセイであり、競争阻害アッセイに適した条
件下で、ｈｉｓＳおよび潜在的なアンタゴニストをｈｉ
ｓＳ結合分子、組換えｈｉｓＳ結合分子、天然基質もし
くはリガンド、または基質もしくはリガンド擬似物質と
混合する。ｈｉｓＳを例えば放射活性または比色化合物
により標識化し、結合分子に結合した、または産生物に
変換したｈｉｓＳ分子の数を正確に決定し、潜在的なア
ンタゴニストの効果を評価できる。潜在的なアンタゴニ
ストには、本発明のポリペプチドに結合し、それにより
その活性を阻害し、消滅させる小さい有機分子、ペプチ
ド、ポリペプチドおよび抗体などがある。潜在的アンタ
ゴニストはまた、結合分子の同一部位に結合する、正確
に関連した蛋白または抗体のような小さな有機分子、ペ
プチド、ポリペプチド、例えばｈｉｓＳ誘起活性を誘起
しない結合分子であってよく、それによりｈｉｓＳを結
合から排除して、ｈｉｓＳの作用を妨げる。潜在的なア
ンタゴニストには、ポリペプチドの結合部位に結合し、
およびそれを占領し、それにより細胞性結合分子への結
合を防御して、正常の生物学的活性を防御する小さな分
子等がある。小さな分子の例としては、小さな有機分
子、ペプチド、ペプチド様分子等があるが、これらに限
定するものではない。その他の潜在的なアンタゴニスト
にはアンチセンス分子等がある（これらの分子について
の記載に関してはOkano,J.，Neurochem.56:560（199
1）；Oligodeoxy-nucleotides as Antisense Inhibitor
s of Gene Expression，ＣＲＣプレス、ボッカラート
ン、フロリダ州（1988）参照）。好ましい潜在的アンタ
ゴニストには、ｈｉｓＳ関連化合物およびｈｉｓＳ変種
等がある。本明細書に示す各ＤＮＡ配列を、抗細菌化合
物の発見および開発に使用してもよい。コードされてい
る蛋白は、発現されると、抗細菌剤のスクリーニングの
ための標的として使用されうる。さらに、コードされて
いる蛋白のアミノ末端領域または各ｍＲＮＡのシャイン
−ダルガノ配列または他の翻訳容易化配列をコードして
いるＤＮＡ配列を用いてアンチセンス配列を構築し、目
的コーディング配列の発現を制御することもできる。

【００５８】また本発明は、感染の続発症に関与する病
因および哺乳動物宿主間の最初の物理的相互作用を妨害
するための本発明ポリペプチド、ポリヌクレオチドまた
は阻害物質の使用を提供する。とりわけ本発明の分子
を、細菌とりわけグラム陽性細菌の内在デバイス上の哺
乳動物細胞外マトリックス蛋白、または創傷の細胞外マ
トリックス蛋白への付着の防御；例えば哺乳動物チロシ
ンキナーゼのリン酸化の開始により、哺乳動物細胞侵入
を媒介するｈｉｓＳ蛋白の阻害（Rosenshineら、Infec
t.Immun.60:2211（1992））；哺乳動物細胞外マトリッ
クス蛋白および組織損傷を媒介する細菌性ｈｉｓＳ蛋白
間の細菌付着の阻害；内在デバイスの埋め込みまたはそ
の他の外科的手技により開始した感染における病因の通
常の進行の防御に使用することができる。

【００５９】本発明アンタゴニストおよびアゴニスト
を、例えば、中耳炎、結膜炎、肺炎、菌血症、髄膜炎、
副鼻腔炎、膿胸および心内膜炎、最も詳細には髄膜炎
（例えば、脳脊髄液の感染）等の抑制および処置に用い
てもよい。ヘリコバクター・ピロリ（Helicobacter pyl
ori）細菌（本明細書ではエイチ・ピロリという）は世
界人口の３分の１以上のヒトの胃に感染しており、胃ガ
ン、潰瘍および胃炎を引き起こす（International Agen
cy for Research on Cancer,Lyon,France;http://www.u
icc.ch/ecp/ccp2904.htm）。そのうえ、最近、Internat
ional Agency for Research on Cancerは、エイチ・ピ
ロリと胃のアデノカルシノーマとの因果関係を認識し、
当該細菌をＩ群の癌原性細菌と分類定義した。本発明に
より提供されるスクリーニングを用いて見いだされる本
発明の好ましい抗菌化合物（ｈｉｓＳのアゴニストおよ
びアンタゴニスト）、詳細には広スペクトル抗生物質
は、エイチ・ピロリ感染に処置に有用なはずである。か
かる処置は、エイチ・ピロリにより誘導される癌の出
現、例えば胃腸のカルシノーマの出現を減少させるはず
である。また、かかる処置は胃潰瘍および胃炎を治癒す
るはずである。

【００６０】ワクチン 本発明の別の態様は、個体とりわけ哺乳動物における免
疫学的反応を誘起する方法に関し、その方法には個体に
ｈｉｓＳ、またはそれらのフラグメントもしくは変種を
個体に接種し、該個体が感染とりわけ細菌感染、特にス
トレプトコッカス・ニューモニアエ感染から防御する抗
体および／またはＴ細胞を十分に産生させることを含
む。さらに、免疫学的応答により細菌複製を遅らせる方
法も提供される。本発明のまた別の態様は、個体中に疾
病がすでに確立されているか否かにかかわらず、ｈｉｓ
Ｓポリペプチドまたはそのフラグメントもしくは変種を
発現させるための核酸ベクターを送達して、インビボで
ｈｉｓＳポリペプチドまたはそれらのフラグメントもし
くは変種を発現させて、該動物を疾患から保護する抗体
および／またはＴ細胞免疫応答を生じさせる免疫学的反
応を誘起すること、例えば、サイトカイン産生Ｔ細胞ま
たは細胞毒性Ｔ細胞の応答を生じさせる免疫学的反応を
誘起することを特徴とする、哺乳動物における免疫学的
反応を誘起する方法に関する。遺伝子投与の１の方法
は、微粒子上のコーティングとなった遺伝子を加速して
所望細胞中に導入すること、あるいは他の方法による。
かかる核酸ベクターは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、修飾核酸、ま
たはＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドを含んでいてもよい。

【００６１】本発明のさらなる態様は、免疫学的反応を
宿主内に誘起できる、または誘起した宿主に導入した場
合、ｈｉｓＳまたはコードされている蛋白に対する免疫
学的反応を該宿主に誘起する免疫学的組成物に関し、そ
の組成物は組換えｈｉｓＳまたはコードされている蛋白
を含み、該ｈｉｓＳの抗原をコードし発現するＤＮＡ、
またはそれによりコードされる蛋白を含む。免疫学的応
答を治療的または予防的用いてもよく、免疫学的応答は
抗体免疫または細胞免疫（例えば、ＣＴＬまたはＣＤ４
＋Ｔ細胞から生じるもの）の形態であってもよい。

【００６２】ｈｉｓＳまたはそれらのフラグメントは、
それ自身は抗体を産生しないが、第１の蛋白を安定化
し、免疫原的および保護特性を有する融合蛋白を産生す
る能力のある共存蛋白（co-protein）と融合できる。こ
のように融合した組換え蛋白には、さらに抗原補蛋白、
例えばヘモフィルス・インフルエンザエ（Hemophilus i
nfluenzae）由来のリポ蛋白Ｄ、グルタチオン−Ｓ−ト
ランスフェラーゼ（ＧＳＴ）またはベーターガラクトシ
ダーゼのごとき共存蛋白、蛋白を可溶化して、それらの
産生および精製を促進する比較的大きな共存蛋白等が含
まれるのがより好ましい。さらに、共存蛋白は免疫系に
おいて普遍的な刺激を提供するという意味で、アジュバ
ントとして作用することができる。共存蛋白は第１の蛋
白のアミノまたはカルボキシル末端のどちらかに付着で
きる。

【００６３】本発明は、組成物、とりわけワクチン組成
物、および本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチ
ドおよび免疫刺激ＤＮＡ配列を含む方法を提供し、Sato
Y.ら、Science 273:352(1969)に記載されている。

【００６４】また、本発明は、ストレプトコッカス・ニ
ューモニアエに感染した動物モデルにおける、このよう
な遺伝的免疫化実験で用いるＤＮＡ構築物の、細菌細胞
表面蛋白の非可変領域をコードすることが示されてい
る、記載したポリヌクレオチドまたはとりわけそれらの
フラグメントを用いる方法を提供し、これらはとりわけ
予防的または治療的免疫反応を生じることができる蛋白
エピトープを同定するのに有用である。この研究は、哺
乳動物、とりわけヒトにおける細菌感染とりわけスタフ
ィロコッカス・ニューモニアエ感染の予防薬または治療
的処置の開発のために、感染に抵抗し一掃するのに成功
した動物の必須器官から特に価値あるモノクローナル抗
体を引き続き調製することを可能にすると思われる。

【００６５】ポリペプチドは、例えば細菌の損傷組織へ
の付着を阻害することにより、細菌の侵入に対して保護
する特異的抗体を産生するための宿主のワクチン化のた
めの抗原として使用することができる。組織損傷の例と
しては、例えば機械的、化学的もしくは熱損傷により、
または内在デバイスの埋め込みにより、引き起こされた
皮膚または結合組織の創傷、または粘膜例えば口、乳
腺、尿道または膣の創傷等がある。

【００６６】本発明にはまた免疫原性組換え蛋白を適切
な担体と共に含むワクチン処方を包含する。蛋白は胃で
分解するので、非経口的例えば皮下、筋肉内、静脈内ま
たは皮膚内等に投与するのが好ましい。非経口投与に適
した処方には、抗酸化剤、緩衝液、静菌剤および処方を
個体の体液、好ましくは血液と等張にする溶質を含有し
ていてもよい、水性または非水性無菌注射液；および懸
濁化剤または増粘剤を含有していてもよい、水性または
非水性無菌懸濁液等がある。処方は単位投与または多回
投与用容器、例えばシールしたアンプルおよびバイアル
に入れてよく、凍結乾燥状態で保存し、使用直前に無菌
液体担体の添加のみを必要とする。ワクチン処方は処方
の免疫原性を高めるアジュバント系をも含有でき、例え
ば水中油系または当該分野で周知のその他の系等があ
る。投与量はワクチンの特異的活性に依存し、通常の実
験法により容易に決定できる。本発明は特定のｈｉｓＳ
蛋白に関して記載したが、これは天然に存在する蛋白お
よび、実質的に組換え蛋白の免疫原特性に影響しない付
加、欠失または置換を施した類似の蛋白のフラグメント
を包含することが理解されよう。

【００６７】組成物、キットおよび投与 本発明はまた上述のポリヌクレオチドもしくはポリペプ
チド、またはアゴニストもしくはアンタゴニストを含ん
でなる組成物にも関する。本発明のポリペプチドは非無
菌もしくは無菌担体と、または細胞、組織もしくは生物
に用いられる担体、例えば対象への投与に適した医薬的
担体と組み合わせて用いることができる。このような組
成物は、例えば溶媒添加物または治療上有効量の本発明
ポリペプチド、および医薬的に許容できる担体または賦
形剤を含む。このような担体には生理食塩水、緩衝化生
理食塩水、デキストロース、水、グリセロール、エタノ
ールおよびそれらの組み合わせ等があるが、これらに限
定するものではない。処方は投与法に適したものにすべ
きである。本発明はさらに、本発明の前述の組成物成分
を１またはそれ以上を充填した１またはそれ以上の容器
を含んでなる診断用および医薬用パックおよびキットに
も関する。

【００６８】本発明のポリペプチドおよびその他の化合
物は、単独でまたは治療用化合物等のその他の化合物と
組み合わせて用いることができる。医薬組成物は任意の
有効な、利便的な方法、例えば、とりわけ局所、経口、
経膣、静脈内、腹膜腔内、筋肉内、皮下、鼻腔内、また
は皮膚内の経路で投与できる。治療において、または予
防として、活性物質を注射用組成物として、例えば、好
ましくは等張の、無菌水性分散物として個体に投与でき
る。あるいはまた、組成物は局所適用用、例えば軟膏、
クリーム、ローション、眼軟膏、点眼液、点耳液、洗口
剤、染み込ませた包帯および縫合用の糸、ならびにエア
ロゾール等の形態に処方でき、適当な慣用的な添加物、
例えば保存剤、薬物の浸透を補助する溶媒、ならびに軟
膏およびクリームには軟化剤を含有してよい。このよう
な局所用処方はまた、適合した慣用的な担体、例えばク
リームまたは軟膏基剤、およびローションにはエタノー
ルまたはオレイルアルコールを含有してよい。このよう
な担体は重量で処方の約１％から約９８％でよく、より
通常には重量で処方の約８０％までにする。哺乳動物と
りわけヒトに投与するために、活性物質の1日あたりの
投与量は、０.０１ｍｇ／ｋｇから１０ｍｇ／ｋｇであ
り、典型的には約１ｍｇ／ｋｇである。医者はあらゆる
場合、個体に最も適した実際の投与量を決定し、年齢、
体重および特に個体の反応性に応じて変化させる。上述
の投与量は、平均的なケースの典型例である。もちろ
ん、高量および低量の範囲が適合する個々の例もあり、
これらは本発明の範囲内である。

【００６９】内在デバイスには外科的インプラント、補
てつデバイスおよびカテーテル等があり、即ち個体の体
に導入し、長時間その位置に存在するデバイスである。
このようなデバイスには、例えば人工関節、心臓弁、ペ
ースメーカー、血管移植片、血管カテーテル、脳脊髄液
シャント、尿カテーテル、継続的歩行可能腹膜透析（co
ntinuous ambulatory peritoneal dialysis：ＣＡＰ
Ｄ）カテーテル等がある。本発明の組成物を注射により
投与し、内在デバイスの挿入の直前に、関連する細菌に
対する全身的な効果を得ることができる。手術後、デバ
イスが体内に在る時間中、処置を続けてよい。さらに、
任意の外科的手技の手術中に広げるカバーに用いて、細
菌性創傷感染、とりわけストレプトコッカス・ニューモ
ニアエの創傷感染を防御するために用いることができ
る。

【００７０】多くの整形外科医は、補てつ関節を有する
ヒトは、菌血症を生み出し得る歯科的処置の前に、抗生
物質予防法を考慮されるべきであると考える。遅延性の
重篤な感染は、時々補てつ関節を失うに至る深刻な合併
症であり、有意性のある羅病率および死亡率を伴う。従
って、この場合、予防的な抗生物質の代わりに、活性物
質の用途を拡張することが可能である。

【００７１】上述の治療に加え、本発明の組成物は一般
的に創傷の治療薬として使用でき、創傷組織に曝露した
マトリックス蛋白に細菌が付着するのを防ぎ、歯科治療
において抗生物質の予防法に代わって、またはそれと組
み合わせて、予防的に使用できる。

【００７２】あるいはまた、本発明の組成物は挿入直前
に、内在デバイスを浸すために使用できる。活性物質は
創傷または内在デバイスを浸すために１μｇ／ｍｌから
１０ｍｇ／ｍｌの濃度であるのが好ましい。ワクチン組
成物は便宜的に注射可能な形態にする。便宜的なアジュ
バントは免疫反応を高めるために用いることができる。
ワクチン化に適した単位投与量は、抗原０.５〜５μｇ
／ｋｇであり、このような投与量は１〜３週間隔で１〜
３回投与するのが好ましい。提示した投与量範囲では、
本発明の化合物で、適切な個体への投与を妨げるよう
な、不利な毒性効果は観察されない。本明細書に開示の
各文献を、参照により本明細書に記載されているものと
みなす。

【００７３】

【実施例】以下の実施例は、詳細に記載したこと以外
は、当業者に周知で通常的な標準的な技法を用いて実施
する。実施例は説明のためにのみ示すもので、本発明を
限定するものではない。 実施例１：菌株の選択、ライブラリーの製造および配列
決定 配列番号：１に示すＤＮＡ配列を有するポリヌクレオチ
ドはイー・コリにおけるストレプトコッカス・ニューモ
ニアエの染色体ＤＮＡのクローンのライブラリーより入
手した。重複するストレプトコッカス・ニューモニアエ
のＤＮＡを含有する２個またはそれ以上のクローンから
の配列決定データを、配列番号：１の隣接ＤＮＡ配列を
構築するために使用した場合もある。ライブラリーは通
常の方法、例えば以下の方法１および２により製造でき
る。全細胞ＤＮＡは、ストレプトコッカス・ニューモニ
アエ０１００９９３より、標準法に準じて単離し、二つ
の方法のどちらかによりサイズ分画する。

【００７４】方法１ 標準法に準じてサイズ分画化するために、全細胞ＤＮＡ
をニードルに通して機械的に剪断する。１１ｋｂｐまで
の大きさのフラグメントを、エクソヌクレアーゼおよび
ＤＮＡポリメラーゼで処理することにより、平滑末端化
し、ＥｃｏＲＩリンカーを加える。フラグメントを、Ｅ
ｃｏＲＩで切断したベクターラムダＺａｐＩＩに連結
し、標準法によりライブラリーをパッケージングし、次
いでパッケージングしたライブラリーで大腸菌を感染さ
せる。ライブラリーは標準法により増幅する。 方法２ 全細胞性ＤＮＡは、ライブラリーベクター（例えば、Ｒ
ｓａＩ、ＰａｌＩ、ＡｌｕＩ、Ｂｓｈｌ２３５Ｉ）にク
ローニングするための一連のフラグメントを適切に生じ
る制限酵素一つでまたはこれを組み合わせたもので部分
的加水分解し、このようなフラグメントを標準法に準じ
てサイズ分画化する。ＥｃｏＲＩリンカーはＤＮＡおよ
びフラグメントに連結し、次いでＥｃｏＲＩで切断した
ベクターラムダＺａｐＩＩに連結し、標準法によりライ
ブラリーをパッケージングし、およびパッケージングし
たライブラリーで大腸菌を感染させる。ライブラリーを
標準法により増幅する。

【００７５】実施例２：ｈｉｓＳの特徴付け 酵素により媒介される放射性標識アミノ酸のｔＲＮＡ中
への取り込みをアミノアシル化法により測定することが
でき、該方法は、ｔＲＮＡおよびＡＴＰ存在下で放射性
標識アミノ酸からトリクロロ酢酸沈殿した放射活性とし
てアミノ酸−ｔＲＮＡを測定するものである（Hughes
J.,Mellows G.and Soughton S,1980,FEBSLetters,122:3
22-324）。かくして、対照に対するトリクロロ酢酸沈殿
放射活性の減少によりヒスチジルｔＲＮＡシンセターゼ
の阻害剤を検出することができる。別法として、ｔＲＮ
Ａシンセターゼにより触媒される部分ＰＰｉ／ＡＴＰ交
換反応（ＰＰｉからの放射性標識ＡＴＰの生成を測定）
を用いてヒスチジルｔＲＮＡシンセターゼ阻害剤を検出
することもできる（Calender R & Berg P,1966,Biochem
istry,5,1681-1690）。

【００７６】

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> Daniel Gentry Robecca Greenwood Elizabeth Lawlor <120> Novel hisS <130> 179987 <150> US 08/906744 <151> 1997-08-06 <160> 2 <210> 1 <211> 1290 <212> RNA <213> <400> 1 ATGAAATTAC AAAAACCAAA AGGAACGCAG GATATTTTAC CTGCTGAATC TGCTAAGTGG 60 CAGTACGTTG AGGGCTTTGC CCGTGAGATT TTCAAGCGCT ATAACTATGC AGAAGTGCGC 120 ACGCCTATTT TTGAGCATTA CGAGGTTATC AGTCGCTCTG TCGGAGATAC AACGGATATC 180 GTAACCAAGG AAATGTACGA TTTTTATGAC AAGGGTGACC GTCATATTAC CCTCCGTCCA 240 GAAGGAACTG CGCCCGTTGT CCGTTCCTAT GTGGAAAATA AACTCTTCGC CCCAGAAGTG 300 CAAAAGCCAA GCAAGTTCTA CTACATGGGA CCTATGTTCC GTTATGAGCG TCCACAGGCA 360 GGGCGCTTGC GCCAATTCCA CCAGATTGGT GTTGAGTGTT TTGGTTCTAG CAATCCAGCT 420 ACCGATGTGG AAACAATCGT TATGGCAGCC CATTTTTTGA AGGAAATCGG TATTCAAGGT 480 GTCAAATTGC ACCTCAACAC TCTTGGAAAT CCTGAGAGCC GTGCAGCCTA CCGCCAAGCC 540 TTGATTGACT ATTTGACACC GCTCAAGGAG ACCTTGTCTA AGGATAGCCA ACGTCGCTTG 600 GAGGAAAATC CTCTTCGTGT CTTGGACTCT AAGGAAAAAG AAGACAAGGT GGCAGTAGAG 660 AATGCGCCGT CTATCTTGGA CTTTCTTGAT GAAGAAAGCC AAACTCATTT TGATGCTGTG 720 AGTCAGATGT TGGAAAATCT TGGAGTAGAT TACATCATCG ATACCAATAT GGTGCGTGGT 780 CTGGACTACT ACAACCACAC CATTTTCGAG TTTATCACAG AGATTGAGGG CAATGACTTG 840 ACAGTCTGTG CGGGTGGTCG CTACGATGGT TTGGTTGCTT ACTTTGGAGG CCCTGAAACT 900 GCTGGATTTG GTTTTGGGCT TGGTGTAGAG CGCCTGCTTC TCATCCTTGA AAAACAAGGC 960 GTGGCCCTCC CTATCGAAAA TGCCCTAGAT GTCTATATCG CAGTCTTGGG TGATGGAGCA 1020 AATGTCAAAG CCCTAGAACT AGTCCAAGCC CTTCGCCAAC AAGGTTTCAA AGCAGAGCGT 1080 GATTACCTCA ACCGTAAACT CAAAGCTCAA TTCAAGTCAG CCGATGTCTT TGCAGCTAAG 1140 ACCCTCATCA CCCTAGGAGA GAGCGAAGTC GAAAGCAGAC AAGTGACAGT CAAGAACAAC 1200 CAAACCCGAG AAGAAGTGCA AGTGTCACTT GAGACAATCA GCCAAAACTT CTCAGAAATC 1260 TTTGAAAAAC TAGGATTTTA TACTCAATGA 1290 <210> 2 <211> 429 <212> PRT <213> <400> 2 Met Lys Leu Gln Lys Pro Lys Gly Thr Gln Asp Ile Leu Pro Ala Glu 1 5 10 15 Ser Ala Lys Trp Gln Tyr Val Glu Gly Phe Ala Arg Glu Ile Phe Lys 20 25 30 Arg Tyr Asn Tyr Ala Glu Val Arg Thr Pro Ile Phe Glu His Tyr Glu 35 40 45 Val Ile Ser Arg Ser Val Gly Asp Thr Thr Asp Ile Val Thr Lys Glu 50 55 60 Met Tyr Asp Phe Tyr Asp Lys Gly Asp Arg His Ile Thr Leu Arg Pro 65 70 75 80 Glu Gly Thr Ala Pro Val Val Arg Ser Tyr Val Glu Asn Lys Leu Phe 85 90 95 Ala Pro Glu Val Gln Lys Pro Ser Lys Phe Tyr Tyr Met Gly Pro Met 100 105 110 Phe Arg Tyr Glu Arg Pro Gln Ala Gly Arg Leu Arg Gln Phe His Gln 115 120 125 Ile Gly Val Glu Cys Phe Gly Ser Ser Asn Pro Ala Thr Asp Val Glu 130 135 140 Thr Ile Val Met Ala Ala His Phe Leu Lys Glu Ile Gly Ile Gln Gly 145 150 155 160 Val Lys Leu His Leu Asn Thr Leu Gly Asn Pro Glu Ser Arg Ala Ala 165 170 175 Tyr Arg Gln Ala Leu Ile Asp Tyr Leu Thr Pro Leu Lys Glu Thr Leu 180 185 190 Ser Lys Asp Ser Gln Arg Arg Leu Glu Glu Asn Pro Leu Arg Val Leu 195 200 205 Asp Ser Lys Glu Lys Glu Asp Lys Val Ala Val Glu Asn Ala Pro Ser 210 215 220 Ile Leu Asp Phe Leu Asp Glu Glu Ser Gln Thr His Phe Asp Ala Val 225 230 235 240 Ser Gln Met Leu Glu Asn Leu Gly Val Asp Tyr Ile Ile Asp Thr Asn 245 250 255 Met Val Arg Gly Leu Asp Tyr Tyr Asn His Thr Ile Phe Glu Phe Ile 260 265 270 Thr Glu Ile Glu Gly Asn Asp Leu Thr Val Cys Ala Gly Gly Arg Tyr 275 280 285 Asp Gly Leu Val Ala Tyr Phe Gly Gly Pro Glu Thr Ala Gly Phe Gly 290 295 300 Phe Gly Leu Gly Val Glu Arg Leu Leu Leu Ile Leu Glu Lys Gln Gly 305 310 315 320 Val Ala Leu Pro Ile Glu Asn Ala Leu Asp Val Tyr Ile Ala Val Leu 325 330 335 Gly Asp Gly Ala Asn Val Lys Ala Leu Glu Leu Val Gln Ala Leu Arg 340 345 350 Gln Gln Gly Phe Lys Ala Glu Arg Asp Tyr Leu Asn Arg Lys Leu Lys 355 360 365 Ala Gln Phe Lys Ser Ala Asp Val Phe Ala Ala Lys Thr Leu Ile Thr 370 375 380 Leu Gly Glu Ser Glu Val Glu Ser Arg Gln Val Thr Val Lys Asn Asn 385 390 395 400 Gln Thr Arg Glu Glu Val Gln Val Ser Leu Glu Thr Ile Ser Gln Asn 405 410 415 Phe Ser Glu Ile Phe Glu Lys Leu Gly Phe Tyr Thr Gln 420 425

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ０７Ｋ 16/40 Ｃ１２Ｎ 1/19 ４Ｃ０８４ Ｃ１２Ｎ 1/15 1/21 ４Ｃ０８５ 1/19 9/00 ４Ｈ０４５ 1/21 Ｃ１２Ｑ 1/25 5/10 1/68 Ａ 9/00 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ Ｃ１２Ｑ 1/25 33/50 Ｚ 1/68 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｇ０１Ｎ 33/15 5/00 Ａ 33/50 Ｂ Ａ６１Ｋ 37/56 (72)発明者 レベッカ・クレア・グリーンウッド アメリカ合衆国19312ペンシルベニア州バ ーウィン、ハイポイント・ドライブ75番 (72)発明者 エリザベス・ジェーン・ローラー アメリカ合衆国19355ペンシルベニア州マ ルバーン、ラップ・ロード260番 Ｆターム(参考） 2G045 AA34 AA35 BB07 DA13 DA36 FB08 4B024 AA01 AA11 BA07 CA03 DA02 DA06 EA04 GA11 HA17 4B050 CC03 CC04 DD02 LL01 LL03 4B063 QA01 QA06 QA13 QA19 QQ21 QQ42 QR32 QR55 QR62 QS25 QS34 4B065 AA19X AA26X AA49Y AA50 AA53 AA60X AA72X AA88X AA90X AB01 AC14 BA02 CA27 CA44 CA46 4C084 AA02 AA06 AA07 BA01 BA22 CA53 DA41 DC26 ZB092 ZB352 4C085 AA03 BA14 BB22 DD62 4H045 AA11 BA10 CA11 DA75 DA76 DA89 EA29 FA72 FA73 FA74 HA06

Claims (19)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 （ａ） 配列番号：２のアミノ酸を含む
   ポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドに対し
   て少なくとも７０％の同一性を有するポリヌクレオチ
   ド； （ｂ） 寄託株のストレプトコッカス・ニューモニアエ
   （Streptococcus pneumoniae）中に含まれるｈｉｓＳ遺
   伝子により発現されるのと同じ成熟ポリペプチドをコー
   ドしているポリヌクレオチドに対して少なくとも７０％
   の同一性を有するポリヌクレオチド； （ｃ） 配列番号：２のアミノ酸配列に対して少なくと
   も７０％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドコ
   ードしているポリヌクレオチド； （ｄ） （ａ）、（ｂ）または（ｃ）のポリヌクレオチ
   ドに対して相補的であるポリヌクレオチド； （ｅ） （ａ）、（ｂ）または（ｃ）のポリヌクレオチ
   ドの少なくとも１５個の一連の塩基を含むポリヌクレオ
   チドからなる群から選択されるポリヌクレオチド配列を
   含む、単離ポリヌクレオチド。
2. 【請求項２】 ポリヌクレオチドがＤＮＡである、請求
   項１記載のポリヌクレオチド。
3. 【請求項３】 ポリヌクレオチドがＲＮＡである、請求
   項１記載のポリヌクレオチド。
4. 【請求項４】 配列番号：１に示す核酸配列を含む、請
   求項２記載のポリヌクレオチド。
5. 【請求項５】 配列番号：１に示すヌクレオチド１から
   １２８７を含む、請求項２記載のポリヌクレオチド。
6. 【請求項６】 配列番号：２のアミノ酸配列を含むポリ
   ペプチドをコードする、請求項２記載のポリヌクレオチ
   ド。
7. 【請求項７】 請求項１記載のポリヌクレオチドを含む
   ベクター。
8. 【請求項８】 請求項７記載のベクターを含む宿主細
   胞。
9. 【請求項９】 該ＤＮＡによりコードされるポリペプチ
   ドを請求項８記載の宿主細胞から発現させることを特徴
   とする、ポリペプチドの製造方法。
10. 【請求項１０】 該ポリペプチドまたはフラグメントの
    生成に十分な条件下で請求項８記載の宿主を培養するこ
    とを特徴とする、ｈｉｓＳポリペプチドまたはフラグメ
    ントの製造方法。
11. 【請求項１１】 配列番号：２のアミノ酸配列に対して
    少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を含むポリペ
    プチド。
12. 【請求項１２】 配列番号：２に示すアミノ酸を含むポ
    リペプチド。
13. 【請求項１３】 請求項１１記載のポリペプチドに対す
    る抗体。
14. 【請求項１４】 治療上有効量の請求項１１記載のポリ
    ペプチドの個体への投与を特徴とする、ｈｉｓＳポリペ
    プチドを必要とする個体の処置方法。
15. 【請求項１５】 治療上有効量の配列番号：２のアミノ
    酸配列に対して少なくとも７０％同一であるアミノ酸配
    列を含むポリペプチドの活性または発現を阻害するアン
    タゴニストの個体への投与を特徴とする、ｈｉｓＳポリ
    ペプチドの阻害を必要とする個体の処置方法。
16. 【請求項１６】 個体における請求項１１記載のポリペ
    プチドの発現または活性に関連する疾病の診断方法であ
    って、 （ａ）該ポリペプチドをコードしている核酸配列を決定
    すること；および／または （ｂ）個体由来の試料中の該ポリペプチドの存在または
    量を分析すること；を特徴とする診断方法。
17. 【請求項１７】 請求項１１記載のポリペプチドと相互
    作用し、活性を阻害または活性化する化合物の同定方法
    であって；化合物とポリペプチドとの間の相互作用を可
    能にする条件下で、ポリペプチドをスクリーニングすべ
    き化合物と接触させて化合物の相互作用を評価すること
    （かかる相互作用は、ポリペプチドと化合物との相互作
    用に応答した検出可能なシグナルを提供しうる第２の成
    分に関連したものである）；次いで、化合物とポリペプ
    チドとの相互作用から生じたシグナルの存在または不存
    在を検出することにより、化合物がポリペプチドと相互
    作用して、その活性を活性化または阻害するかどうかを
    決定することを特徴とする方法。
18. 【請求項１８】 哺乳動物における免疫学的反応を誘起
    する方法であって、該動物を疾患から防御する抗体およ
    び／またはＴ細胞免疫応答を生じさせるに十分な請求項
    １１記載のｈｉｓＳポリペプチドまたはそのフラグメン
    トもしくは変種を該哺乳動物に接種することを特徴とす
    る方法。
19. 【請求項１９】 哺乳動物における免疫学的反応を誘起
    する方法であって、請求項１１記載のｈｉｓＳポリペプ
    チドまたはそのフラグメントもしくは変種を発現させる
    ための核酸ベクターを送達し、インビボでｈｉｓＳポリ
    ペプチドまたはそれらのフラグメントもしくは変種を発
    現させて、該動物を疾患から保護する抗体および／また
    はＴ細胞免疫応答を生じさせる免疫学的反応を誘起する
    ことを特徴とする方法。