KR101572463B1 - 에피메타볼릭 쉬프터(조효소 ｑ10)를 사용하는 육종의 치료 방법 - Google Patents

에피메타볼릭 쉬프터(조효소 ｑ10)를 사용하는 육종의 치료 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 조효소 Q10와 같은 에피메타볼릭 쉬프터, CoQ10의 빌딩 블록, CoQ10의 유도체, CoQ10의 유사체, CoQ10의 대사물, 또는 조효소 생합성 경로의 중간체를 사용하여, 사람에서 육종을 치료하기 위한 방법 및 제형에 관한 것이다. 육종의 치료, 진단 및 예측에 대한 효능을 평가하기 위한 방법이 또한 제공된다.

Description

에피메타볼릭 쉬프터(조효소 Ｑ10)를 사용하는 육종의 치료 방법{Methods for treatment of a sarcoma using an epimetabolic shifter (Coenzyme Ｑ 10)}
관련 출원:
본 출원은 에피메타볼릭 쉬프터(조효소 Ｑ10)를 사용하는 육종의 치료 방법("Methods for Treatment of a Sarcoma Using an Epimetabolic Shifter (Coenzyme Q10)") (대리인 도켓 번호: 117732-02601)이라는 발명의 명칭으로 2009년 8월 25일자로 출원된 미국 가출원 번호 제61/236,845호에 대한 우선권을 주장한다. 상기 출원의 전문 내용이 본원에 참조로서 인용된다.
암은 현재 선진국에서 주요 사망 원인 중 하나이고 현대 사회에 심각한 위협이 되고 있다. 육종은 특히 골격근, 평활근, 골 및 연골을 포함하는 신체 전반에 걸친 주요 부위에서 발병하는 간엽성 세포 기원의 이종성 그룹의 악성 종양이다. 유잉(Ewing) 계열의 종양(EFT)은 전형적인 골의 유잉 육종(ES), 골외성 유잉(Extraosseus Ewing)(EOE) 및 원발성 신경외배엽 종양(PNET)을 포함하는, 형태학적으로 작고 둥근 세포 악성 신생물 계열이다. 이들은 소아암의 거의 3%를 차지하고 어린이와 청소년에게 2번째로 가장 흔한 악성 종양이다. 유잉 육종의 빈도는 서반구에서 100만명당 약 1 내지 3건이다. 유잉 육종의 치료에 있어서 상당한 발전으로 생존율을 5년으로 증가시켰지만 전이성 질환을 갖는 유잉 환자에 대한 결과는 5년을 초과하여 생존하는 경우가 25% 미만으로 아직 심각한 상태에 있다.
유잉 육종은 매우 공격적인 암이고 이의 발병율은 멘델 유전, 환경 또는 약물 노출과 연관된 것으로 나타나지 않는다. 유잉 육종에 대해 가장 일관된 특징은 EWSR1 유전자좌와 ETS 전사 인자 유전자 간의 염색체 전좌에 따른 융합 유전자가 존재한다는 것이다. EWS-ETS 융합 유전자는 EWS-FLI1과 같은 전사 인자를 암호화하고 이의 비정상적인 기능이 유잉 육종의 발병기전과 관련되어 있다.
최근 연구는 많은 종양 발생의 분자적 기작에 대한 연구자의 이해를 크게 증가시켰고 암의 치료를 위한 많은 새로운 수단을 제공하였지만 유잉 계열의 종양을 포함하는 대부분의 악성종양에 대한 기본 치료법은 총체적 절제, 화학치료법 및 방사선치료법을 포함한다. 이들 각각의 치료법은 많은 부작용을 유발할 수 있다. 예를 들면, 수술은 건강한 조직에 고통스러운 외상 손상 및 상처를 유발할 수 있다. 방사선 치료법은 암 세포를 사멸시키는데 잇점을 갖지만 이와 동시에 비-암성 조직을 손상시킨다. 화학치료법은 환자에게 다양한 항암 약물을 투여함을 포함한다. 이들 기본 치료법은 흔히, 예를 들면, 구역질, 면역 억제, 위 궤양 및 2차 종양 발생과 같은 부작용을 수반한다.
수년 동안, 많은 개인 및 기관은 유잉 계열의 종양을 포함하는 광범위한 암에 대한 치료법의 개선을 모색하기 위해 광범위한 연구를 수행하여 왔다. 기관은 암에 대해 보다 이로운 치료법을 제공할 목적으로 화학적 물질, 예를 들면, 소분자 및 생물학적 물질, 예를 들면, 항체를 포함하는 생활성제를 개발하고 있다. 예를 들면, 인슐린형 성장 인자 수용체-1(IGF-1R) 항체가 재발 유잉 계열의 종양을 치료하기 위해, 단독으로 및 다른 기본 화학치료법과 조합된 잠재적인 치료법으로서 연구되고 있다. 그러나 지금까지 유잉 계열의 종양은 치료하기가 매우 어려운 상태로 남아있다. 따라서, 유잉 육종의 성공적인 치료를 위한 신규 치료법의 개발이 절실히 요구되고 있다.
조효소 Q10은 또한 본원에서 CoQ1O, Q10, 유비퀴논, 또는 우비데카레논으로서도 언급되는 일반적인 영양 보충물이고 영양 보충 판매소, 건강식품 판매소, 약국 등에서 CoQ10의 환원된 형태인 유비퀴놀의 항산화제 성질을 통해 면역계를 보호하는데 일조하는 비타민형 보충물로서 캡슐 형태로 찾을 수 있다. CoQ1O은 당업계에 공지되어 있고 추가로 국제 공개공보 WO 2005/069916에 기재되어 있으며 상기 특허 문헌의 전문이 본원에 참조로서 인용된다. CoQ10의 대사물을 포함하는, CoQ10의 대사 및 기능은 문헌[참조: Turunen et al., Biochimica et Biophysica Acta 1660: 171-199 (2004)]에 기재되어 있고, 이의 전문은 본원에 참조로서 인용된다.
CoQ1O은 사람 신체의 조직 및 다른 포유동물의 조직 전반에 걸쳐 발견된다. 사람에서 CoQ10의 조직 분포 및 산화환원 상태는 문헌[참조: Bhagavan HN, et al., Coenzyme Q10: Absorption, tissue uptake, metabolism and pharmacokinetic, Free Radical Research 40(5), 445-453 (2006) (이하, Bhagavan, et al.)]에서 검토되었다. 상기 저자는 "일반적인 규칙으로서, 심장, 신장, 간 및 근육과 같은 고에너지 요구량 또는 대사적 활성을 갖는 조직이 비교적 고농도의 CoQ10을 함유한다"라고 보고하고 있다. 상기 저자는 추가로 "조직내 CoQ10의 주요 부분은 뇌 및 폐를 제외하고는 하이드로퀴논 또는 유비퀴놀과 같은 환원된 형태로 존재한다" 이것은 "상기 2개의 조직에서 증가된 산화적 스트레스를 반영하는 것으로 나타난다"라고 보고하고 있다". 특히, 바가반 등(Bhagavan et al.)은 심장, 신장, 간, 근육, 장 및 혈액(혈장) 각각에서 CoQ10의 약 61%, 75%, 95%, 65%, 95% 및 96%가 환원된 형태로 존재함을 보고하고 있다. 유사하게, 문헌[참조: Ruiz-Jiminez, et al., Determination of the ubiquinol-10 and ubiquinone-10 (coenzyme Q10) in human serum by liquid chromatography tandem mass spectrometry to evaluate the oxidative stress, J. Chroma A 1175(2), 242-248 (2007) (이하, Ruiz-Jiminez, et al.)]에서는 사람 혈장이 Q10 및 환원된 형태의 Q10(Q10H2)에 대해 평가되는 경우 분자의 대부분(90%)이 환원된 형태로 발견됨을 보고한다.
CoQ1O은 매우 친지성이고 대부분이 물에 불용성이다. 물에서의 이의 불용성, 지질에서의 제한된 가용성 및 비교적 큰 분자량때문에, 경구 투여된 CoQ10의 흡수 효율은 불량하다. 바가반 등은 "랫트를 사용한 하나의 연구에서, 경구 투여된 CoQ10의 단지 약 2 내지 3%가 흡수된다고 보고되었다"라고 보고하고 있다. 바가반 등은 추가로 "랫트 연구로부터의 데이타는 CoQ10이 장에서 흡수 동안에 또는 흡수 후에 유비퀴놀로 환원된다는 것을 나타낸다"라고 보고하고 있다.
CoQ1O은 수년 동안 문헌에서 암과 관련이 있는 것으로 보고되었다. 하기에서는 모두를 포괄하지는 않는, 문헌에 보고된 일부 대표적인 연관성의 예에 대해 기재한다. 문헌[참조: Karl Folkers, et al., Survival of Cancer Patients on Therapy with Coenzyme Q10, Biochemical and Biophysical Research Communication 192, 241-245 (1993) (이후부터 "폴커스 등(Folkers, et al)")]은 "CoQ10을 이용한 치료시" 암 환자의 8가지 사례의 병력 및 "5년 내지 15년 기간 동안"의 생존에 대한 일화를 기재하고 있다. CoQ1O은 췌장 암종, 선암종, 후두암종, 유방암, 결장암, 폐암 및 전립선암을 포함하는 상이한 유형의 암을 갖는 8명의 환자에게 경구로 투여되었다. 폴커스 등은 "이들 결과가 현재 전신성 프로토콜을 정당화시킨다"라고 제시하고 있다. 문헌[참조: Lockwood, et al., Progress on Therapy of Breast Cancer with Vitamin Q10 and the Regression of Metastases, Biochemical and Biophysical Research Communication 212, 172-177 (1995) (이후부터 "락우드 등(Lockwood, et al.)")]은 "비타민 Q10을 사용한 유방암의 치료 진행"에 대해 보고하는 또 다른 고찰 문헌이다. 락우드 등은 폴커스 등이, "비-종양 및 종양 조직에서 비타민 Q10이 다양한 수준임을 밝히는 동물 및 사람에 대한 35년의 국제 연구를 포괄하고 종양을 갖는 치료된 마우스의 증가된 생존을 근거로 숙주 방어 시스템에 고유 특징인 비타민 Q10에 대한 데이타를 포함함"을 언급하고 있다.
락우드 등은 추가로, 199명의 스웨덴 및 미국 암 환자들에서 유방암의 경우에 다양한 수준으로 결핍되어 있는 CoQ10의 혈중 수준을 측정하는 연구를 바탕으로 하여 "사람 암에 대한 비타민 Q10 치료법의 효능은 1961년에 명백했음"을 제시하고 있다. 2002년 7월 9일자로 허여된 미국 특허 제6,417,233호는 미토콘드리아 질병(mitochondriopathy)의 예방 및/또는 치료를 위한, 지용성 벤조퀴논, 예를 들면, 조효소 Q10을 함유하는 조성물을 기재하고 있다. 시어스 등(Sears, et al.)은 "CoQ10 치료가 암 환자에서 일부 이득을 제공하는 것으로 보고되었다(칼럼 2, 30-31행 참조)"라고 제시하고 있다.
상기 출원 일자로, 국립 암 연구소는 암 치료에서 CoQ10에 대한 다수의 환자를 포함하는 잘 계획된 임상적 시험이 수행되지 못하였고 이는 "연구가 수행된 방식 및 보고된 양의 정보가, 조효소 Q10에 의한 이득인지 또는 기타 다른 것에 의한 이득인지가 불명확했기 때문이다"라고 보고하고 있다[문헌참조: The National Cancer Institute (NCI), available at www.cancer.gov/cancertopics/pdq/cam/coenzymeQ10/patient/allpages (September 29, 2008)]. 특히, NCI는 유방암 환자에서 기본 치료 후 보조 치료로서 CoQ10의 용도에 대한 3개의 소규모 연구(여기서, 일부 환자들은 치료에 의해 도움을 받은 것으로 나타났다)를 언급하고 있고 "그러나 연구 계획 및 보고서 작성의 취약함이 조효소 Q10에 의한 이득인지 또는 기타 다른 것에 의한 이득인지를 불명확하게 했다"라고 계속 언급하고 있다. NCI는 "이들 연구들이 하기와 같은 취약점: 연구가 무작위로 수행되거나 통제되지 못하였다; 환자들은 조효소 Q10 이외에 다른 보충제를 사용하였다; 환자들은 조효소 Q10 치료 전에 또는 동안에 기본 치료를 받았다; 및 상기 연구에서 모든 환자에 대한 세부 사항이 보고되지 않았다"라고 명시하고 있다. NCI는 추가로 "조효소 Q10이, 췌장암, 폐암, 결장암, 직장암 및 전립선암을 가진 환자를 포함하는 일부 암 환자의 수명 연장을 도왔다는 일화를 보고"하고 있지만 "이들 보고서에 기재된 환자들은 또한 화학치료법, 방사선치료 및 수술을 포함하는 조효소 Q10 이외의 다른 치료를 받았다"라고 보고하고 있다.
2006년 2월 16일자로 공개된 미국 특허 출원 공개번호 제2006/0035981호(이후부터 "마치오 2006(Mazzio 2006))는 숙주와 반대로, 에너지를 유도하기 위해 글루코스의 비-산화적 인산화를 위한 이의 혐기적 요구성과 관련된 암의 취약점을 이용하는 조성물을 사용하여 사람 및 동물 암을 치료하거나 예방하는 방법 및 제형을 기재하고 있다. 마치오 2006의 상기 제형은 산화성 대사를 상승작용적으로 촉진시키고/시키거나 락트산 데하이드로게나제 또는 혐기성 글루코스 대사를 방해하는 하나 이상의 화합물을 함유하고, 보다 특히 "2,3-디메톡시-5-메틸-1,4-벤조퀴논 (또한 본원에서 "DMBQ"로 호칭됨) (퀴노이드 염기)을 함유하고, 상응하는 하이드로퀴논, 유비크로메놀, 유비크로마놀 또는 합성된/천연 유도체 및 유사체를 포함하는 전체 유비퀴논 계열에 대한 옵션으로서 기재되어 있다[문헌참조: Mazzio 2006 at page 3, paragraph 0010]. 마치오 2006은 항암제로서 "단쇄 유비퀴논(CoQ<3)"을 기재하고 있고 추가로 "2,3-디메톡시-5-메틸-1,4-벤조퀴논(DMBQ)이 항암제로서 CoQ10 보다 1000배 초과로 더 강력함을 기재하고 있다[문헌참조: Mazzio 2006 at page 3, paragraph 0011]. 마치오 2006은 추가로 연구는 "CoQ10이 예상된 바와 같이 치명적이라는 것을 밝히지 못했다" 및 "암에 대해 CoQ10을 사용했던 이전의 연구는 어느정도는 모순이었다"라고 제시하고 있다[문헌참조: Mazzio 2006 at pages 3-4 for an extensive list of citations supporting this statement].
2007년 10월 25일자로 공개된 미국 특허 출원 공개번호 제2007/0248693호(이후부터 "마치오 2007")는 또한 기능성 식품의 조성물 및 암을 치료하거나 예방하기 위한 이의 용도를 기재하고 있다. 또한, 이러한 공개된 특허 출원은 단쇄 유비퀴논에 대해 집중 조명하였고 구체적으로는 CoQ10이 상기 발명의 중요한 구성 요소가 아님을 제시하고 있다. 마치오 2007에 따르면 "CoQ10은 암 세포에서 미토콘드리아 복합체 II 활성의 Vmax를 증가시킬 수 있지만 (문헌참조: Mazzio and Soliman, Biochem Pharmacol. 67: 1167-84, 2004), 이것은 복합체 IV를 통해 미토콘드리아 호흡 또는 O2 활용 비율을 조절하지 못했다. 그리고, CoQ10은 예상한 바와 같이 치명적이지 않았다. 또한, 암에 대한 CoQ10의 결과는 모순이었다"라고 기재하고 있다[문헌참조: Mazzio 2007 at page 5, paragraph 0019].
출원인들은 이전에 CoQ10의 국소 제형 및 동물 피검체에서 종양 성장 속도를 감소시키기 위한 방법을 기재하였다(문헌참조: Hsia et al., WO 2005/069916 published August 4, 2005). 문헌[참조: Hsia et al.]에 기재된 실험에서, CoQ10은 정상 세포에서는 아니지만 피부 암 세포의 배양에서 아폽토시스의 비율을 증가시키는 것으로 나타났다. 더욱이, CoQ10의 국소 제형을 사용한 종양 함유 동물의 치료는 동물에서 종양 성장 비율을 급격히 감소시키는 것으로 나타났다. 본 발명은 적어도 부분적으로 사람 및/또는 세포 내에서 CoQ10의 역할에 대한 보다 완전한 이해를 바탕으로 한다. 특히, 본 발명의 방법 및 제형은 적어도 부분적으로 시험관내에서 육종 세포의 CoQ10 치료에 대한 집중적인 연구로부터 CoQ10의 치료적 기작에 대해 수득된 지식을 바탕으로 한다.
구체적으로, 적어도 하나의 양태에서, 본 발명의 방법 및 제형은 적어도 부분적으로 상당수의 유전자의 발현이 CoQ10으로 처리된 원발성 육종 세포에서 조정된다는 놀라운 발견을 바탕으로 한다. 이들 조정된 단백질은 세포 과정, 대사적 과정, 전사 조절, 프로그램화된 세포사(아폽토시스), 세포 발육, 세포 골격, 핵, 프로테오좀 및 기관 발육의 조절을 포함하는 여러 세포 경로에 집중되어 있는 것으로 밝혀졌다. 종합했을때, 본원에 기재된 결과는 Q10의 치료적 기작에 대한 통찰을 제공하였다. 특정 이론과 결부시키고자 하는 것은 아니나, 본원에 기재된 결과들은 조효소 Q10이 세포골격 단백질의 총괄적 발현을 유도하여 세포의 구조물을 불안정화시키고 세포 프로그램이 개시되도록 하여 결국에는 비정상적이고 예기치 않게 신속하고 강력한 아폽토시스 반응을 초래함을 시사한다.
따라서, 본 발명은 하나의 측면에서 조효소 Q10 분자(예를 들면, CoQ10, CoQ10의 빌딩 블록, CoQ10의 유도체, CoQ10의 유사체, CoQ10의 대사물 또는 조효소 생합성 경로의 중간체)를 육종의 치료 또는 예방이 발생하도록 사람에게 국소적으로 투여함에 의해, 사람에서 육종을 치료하거나 예방하는 방법을 제공한다. 하나의 양태에서, 상기 국소 투여는 치료될 특정 육종을 위한 사람에서의 효능을 제공하기 위해 선택된 용량을 통해 수행된다. 특정 양태에서, 육종의 치료 또는 예방은 산화된 형태의 조효소 Q10을 투여함에 의해 발생한다.
특정 양태들에서, 치료되거나 예방되는 육종은, 치료 유효 수준의 활성제의 전신 전달이 예상되는 국소 투여에 의해 통상적으로 치료되거나 예방되는 육종은 아니다.
몇몇 양태에서, 치료되는 사람 조직내 조효소 Q10 분자의 농도는 건강하거나 정상적인 상태를 나타내는 사람 조직의 대조군 표준물의 것과는 상이하다.
본 발명의 다른 특정 양태들에서, 사람에게 투여되는 조효소 Q10 분자의 형태는 사람내 전신 순환계에서 발견되는 주된 형태와는 상이하다.
본 발명의 또 다른 양태에서, 상기 치료는 ANGPTL3, CCL2, CDH5, CXCL1, CXCL3, PRMT3, HDAC2, 산화질소 신타제 bNOS, 아세틸 포스포 히스톤 H3 AL9 S10, MTA 2, 글루탐산 데카복실라제 GAD65 67, KSR, HDAC4, BOB1 OBF1, a1신트로핀(a1Syntrophin), BAP1, 임포르티나(Importina) 57, αE-카테닌, Grb2, Bax, 프로테아좀 26S 서브유니트 13 (엔도필린(Endophilin) B1), 액틴형 6A (진핵세포 개시 인자 4A11), 핵 클로라이드 채널 단백질, 프로테아좀 26S 서브유니트, 디스뮤타제 Cu/Zn 슈퍼옥사이드, 트랜슬린-결합 인자 X, 아비산염 전위 ATP아제(ATPase) (스퍼민 신테타제), 리보솜 단백질 SA, dCTP 피로포스파타제 1, 프로테아좀 베타 3, 프로테아좀 베타 4, 산 포스파타제 1, 디아제팜 결합 억제제, 알파 2-HS 당단백질 (보스 토러스(Bos Taurus), 소), 리보솜 단백질 P2 (RPLP2); 히스톤 H2A, 마이크로튜불 결합 단백질, 프로테아좀 알파 3, 진핵세포 해독 연장 인자 1 델타, 라민 B1, SMT 3, mif two 3 동족체 2의 억제인자, 열 쇼크 단백질 27kD, hnRNP C1/C2, 진핵세포 해독 연장 인자 1 베타 2, HSPC-300 유사체, DNA 지시된 DNA 폴리머라제 엡실론 3(DNA directed DNA polymerase epislon 3); (캐노피 2 동족체(canopy 2 homolog)), LAMA5, PXLDC1, p300 CBP, P53R2, 포스파티딜세린 수용체, 사이토케라틴 펩타이드 17, 사이토케라틴 펩타이드 13, 뉴로필라멘트 160 200, Rab5, 필렌신(Filensin), P53R2, MDM2, MSH6, 열 쇼크 인자 2, AFX, FLIPg d, JAB 1, 미오신, MEKK4, cRaf pSer621, FKHR FOXO1a, MDM2, Fas 리간드, P53R2, 미오신 조절 경쇄, hnRNP C1/C2, 유비퀼린 1 (포스파타제 2A), hnRNP C1/C2, 알파 2-HS 당단백질 (보스 토러스, 소), 베타 액틴, hnRNP C1/C2, 열 쇼크 단백질 70kD, 베타 튜불린, ATP 의존성 헬리카제 II, 진핵세포 해독 연장 인자 1 베타 2, ER 지질 raft 결합 2 이소형 1 (베타 액틴), 시그날 서열 수용체 1 델타, 진핵세포 해독 개시 인자 3, 서브유니트 3 감마, 빌베르딘 리덕타제 A (트랜스알돌라제 1), 케라틴 1,10 (파라티모신), GST 오메가 1, Dj-1에 대한 쇄(chain) B 도파민 퀴논 접합체, 프로테아좀 활성화인자 Reg(알파), T-복합 단백질 1 이소형 A, 쇄 A 타파신 ERP57 (TCP1 함유 샤페로닌), 유비퀴틴 활성화 효소 E1; 알라닐-tRNA 신테타제, 다이낙틴 1, 열 쇼크 단백질 60kd, 베타 액틴, 스퍼미딘 신타제 (베타 액틴), 열 쇼크 단백질 70kd, 망막모세포종 결합 단백질 4 이소형 A, TAR DNA 결합 단백질, 진핵세포 해독 연장 인자 1 베타 2, TCP1 함유 샤페로닌, 서브유니트 3, 세포질 다이네인 IC-2, 안지오텐신-전환 효소 (ACE), 카스파제 3, GARS, 매트릭스 메탈로프로테이나제 6 (MMP-6), 뉴로라이신 (NLN)-촉매적 도메인, 및 뉴로라이신 (NLN), ADRB, CEACAM1, DUSP4, FOXC2, FOXP3, GCGR, GPD1, HMOX1, IL4R, INPPL1, IRS2, VEGFA, 추정 c-myc-반응성 이소형 1, PDK 1, 카스파제 12, 포스포리파제 D1, P34 cdc2, P53 BP1, BTK, ASC2, BUBR1, ARTS, PCAF, Raf1, MSK1, SNAP25, APRIL, DAPK, RAIDD, HAT1, PSF, HDAC1, Rad17, 수르비빈(survivin), SLIPR, MAG13, 카스파제 10, Crk2, Cdc 6, P21 WAF 1 Cip 1, ASPP 1, HDAC 4, 사이클린 B1, CD 40, GAD 65, TAP, Par4 (전립선 아폽토시스 반응 4), MRP1, MDC1, 라미닌2 a2, b카테닌, FXR2, 어넥신 V, SMAC 디아블로, MBNL1, 디메틸 히스톤 h3, 독립적 성장 인자(growth factor independence) 1, U2AF65, mTOR, E2F2, 카이소(Kaiso), 글리코겐 신타제 키나제 3, ATF2, HDRP MITR, 뉴라빈 I, AP1 및 Apaf1로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 유전자(또는 단백질)과 조효소 Q10 분자(예를 들면, CoQ10, CoQ10의 빌딩 블록, CoQ10의 유도체, CoQ10의 유사체, CoQ10의 대사물 또는 조효소 생합성 경로의 중간체)의 상호작용을 포함하거나 이를 통해 발생한다.
하나의 양태에서, 조효소 Q10 분자는 조효소 Q10 분자를 사람에게 투여한지 적어도 1시간 후 육종의 세포에서 아폽토시스를 유도하는 용량으로 투여된다. 다른 양태에서, 조효소 Q10 분자는 조효소 Q10을 사람에게 투여한 지 적어도 약 2시간, 3시간, 4시간, 5시간, 6시간, 7시간, 8시간, 9시간, 10시간, 12시간, 15시간, 18시간, 24시간, 36시간 또는 48시간 후 육종 세포에서 아폽토시스를 유도하는 용량으로 투여된다.
본 발명의 특정 양태들에서, 상기 방법들은 조효소 Q10을 육종의 치료 또는 예방이 발생하도록 사람에게 국소적으로 투여함에 의해 사람에서 육종을 치료하거나 예방하기 위해 제공되고, 여기서, 상기 사람에게 국소 비히클 중의 조효소 Q10의 국소 용량이 투여되며, 이러한 국소 용량은, 조효소 Q10이 피부 제곱 센티미터 당 조효소 Q10 약 0.01 내지 약 0.5mg 범위의 용량으로 표적 조직에 적용되는 용량이다. 하나의 양태에서, 조효소 Q10은 피부 제곱 센티미터 당 CoQ10 약 0.09 내지 약 0.15mg 범위의 용량으로 표적 조직에 적용된다. 또 다른 양태에서, 조효소 Q10은 피부 제곱 센티미터 당 조효소 Q10 약 0.12mg의 용량으로 표적 조직에 적용된다.
발명의 특정 양태에서, 치료되거나 예방되는 육종은 유잉 계열의 종양에서 의 일종의 육종이다. 특정 양태에서, 치료되거나 예방되는 유잉 계열의 종양에서 육종 유형은 유잉 육종이다.
본 발명의 특정 측면은 조효소 Q10 분자를 육종의 치료 또는 예방이 발생하도록 사람에게 국소적으로 투여함에 의해 사람에서 육종을 치료하거나 예방하는 방법들을 제공하고, 여기서, 조효소 Q10 분자는 6주 이상 동안 24시간 마다 1회 이상 국소적으로 적용된다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 육종의 치료 동안에 이의 산화된 형태로 유지되도록 조효소 Q10을 사람에게 투여함을 포함하는, 사람에서 육종을 치료하거나 예방하는 방법을 제공한다. 하나의 양태에서, 치료되는 육종은, 치료 유효 수준의 활성제의 전신 전달이 예상되는 국소적 투여를 통해 통상적으로 치료되는 육종, 예를 들면, 유잉 육종이 아니다.
본 발명은 또 다른 측면에서, 유잉 육종에서 발견되는 염색체 11번 및 22번간의 전좌에 의해 생성되는 융합 단백질, 즉 EWS-FLI1 융합 단백질의 활성을 억제하는 방법을 제공한다. 이들 방법들은 육종을 앓는 사람 피검체를 선별하거나 치료하고 치료 유효량의 조효소 Q10 분자를 사람에게 투여하여 EWS-FLI1 융합 단백질의 활성을 억제함을 포함한다.
특정 양태에서, 조효소 Q10 분자는 (a) 벤조퀴논 또는 벤조퀴논 환의 생합성을 촉진시키는 하나 이상의 분자 및 (b) 이소프레노이드 단위체의 합성 및/또는 벤조퀴논 환으로의 이소프레노이드 단위체의 접착을 촉진시키는 하나 이상의 분자를 포함하는 CoQ10 생합성 경로에서의 중간체이다. 다른 양태에서, 벤조퀴논 환의 생합성을 촉진시키는 상기 하나 이상의 분자는 L-페닐알라닌, DL-페닐알라닌, D-페닐알라닌, L-티로신, DL-티로신, D-티로신, 4-하이드록시-페닐피루베이트, 3-메톡시-4-하이드록시만델레이트(바닐릴만델레이트 또는 VMA), 바닐릭산, 피리독신 또는 판테놀을 포함한다. 다른 양태에서, 이소프레노이드 단위체의 합성 및/또는 벤조퀴논 환으로의 이소프레노이드의 접착을 촉진시키는 상기 하나 이상의 분자는 페닐아세테이트, 4-하이드록시-벤조에이트, 메발론산, 아세틸글리신, 아세틸-CoA, 또는 파르네실을 포함한다. 다른 양태에서, 상기 중간체는 (a) 하나 이상의 L-페닐알라닌, L-티로신 및 4-하이드록시페닐피루베이트; 및 (b) 하나 이상의 4-하이드록시 벤조에이트, 페닐아세테이트 및 벤조퀴논을 포함한다. 다른 양태에서, 상기 중간체는 (a) Bcl-2 발현을 억제하고/하거나 카스파제-3 발현을 촉진시키고/시키거나 (b) 세포 증식을 억제한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 사람에서 육종을 치료하거나 예방하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 사람의 세포막의 투과성이 조정되어 치료 또는 예방이 발생하도록 하는 투여 계획(dosing regimen)하에 조효소 Q10 분자를 필요로 하는 사람에게 조효소 Q10 분자를 투여함을 포함한다.
몇몇 양태에서, 사람에서 육종을 치료하거나 예방하는 방법 또는 사람에서 EWS-FLI1 융합 단백질의 활성을 억제하는 방법은 추가로
LAMA5, PXLDC1, p300 CBP, P53R2, 포스파티딜세린 수용체, 사이토케라틴 펩타이드 17, 사이토케라틴 펩타이드 13, 뉴로필라멘트 160 200, Rab5, 필렌신, P53R2, MDM2, MSH6, 열 쇼크 인자 2, AFX, FLIPg d, JAB 1, 미오신, MEKK4, cRaf pSer621, FKHR FOXO1a, MDM2, Fas 리간드, P53R2, 프로테아좀 26S 서브유니트 13 (엔도필린 B1), 미오신 조절 경쇄, hnRNP C1/C2, 유비퀼린 1 (포스파타제 2A), hnRNP C1/C2, 알파 2-HS 당단백질 (보스 토러스, 소), 베타 액틴, hnRNP C1/C2, 열 쇼크 단백질 70kD, 마이크로튜불 결합 단백질, 베타 튜불린, 프로테아좀 알파 3, ATP 의존성 헬리카제 II, 진핵세포 해독 연장 인자 1 델타, 열 쇼크 단백질 27kD, 진핵세포 해독 연장 인자 1 베타 2, HSPC-300 유사체, ER 지질 raft 결합된 2 이소형 1 (베타 액틴), 디스뮤타제 Cu/Zn 슈퍼옥사이드, 시그날 서열 수용체 1 델타, ADRB, CEACAM1, DUSP4, FOXC2, FOXP3, GCGR, GPD1, HMOX1, IL4R, INPPL1, IRS2 및 VEGFA, 추정 c-myc-반응성 이소형 1, PDK 1, 카스파제 12, 포스포리파제 D1, P34 cdc2, P53 BP1, BTK, ASC2, BUBR1, ARTS, PCAF, Raf1, MSK1, SNAP25, APRIL, DAPK, RAIDD, HAT1, PSF, HDAC1, Rad17, 수르비빈, SLIPR, MAG13, 카스파제 10, Crk2, Cdc 6, P21 WAF 1 Cip 1, ASPP 1, HDAC 4, 사이클린 B1, CD 40, GAD 65, TAP, Par4 (전립선 아폽토시스 반응 4) 및 MRP1로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 유전자의 발현 수준을 상향조절하는 단계 및/또는
ANGPTL3, CCL2, CDH5, CXCL1, CXCL3, PRMT3, HDAC2, 산화질소 신타제 bNOS, 아세틸 포스포 히스톤 H3 AL9 S10, MTA 2, 글루탐산 데카복실라제 GAD65 67, KSR, HDAC4, BOB1 OBF1, a1신트로핀, BAP1, 임포르티나 57, αE-카테닌, Grb2, Bax, 프로테아좀 26S 서브유니트 13 (엔도필린 B1), 액틴형 6A (진핵세포 개시 인자 4A11), 핵 클로라이드 채널 단백질, 프로테아좀 26S 서브유니트, 디스뮤타제 Cu/Zn 슈퍼옥사이드, 트랜슬린 결합 인자 X, 아비산염 전위 ATP아제 (스퍼민 신테타제), 리보솜 단백질 SA, dCTP 피로포스파타제 1, 프로테아좀 베타 3, 프로테아좀 베타 4, 산 포스파타제 1, 디아제팜 결합 억제제, 리보솜 단백질 P2 (RPLP2); 히스톤 H2A, 마이크로튜불 결합 단백질, 프로테아좀 알파 3, 진핵세포 해독 연장 인자 1 델타, 라민 B1, SMT 3, mif two 3 동족체 2의 억제인자, 열 쇼크 단백질 27kD, hnRNP C1/C2, 진핵세포 해독 연장 인자 1 베타 2, HSPC-300 유사체, DNA 지시된 DNA 폴리머라제 엡실론 3 (캐노피 2 동족체), 안지오텐신-전환 효소 (ACE), 카스파제 3, GARS, 매트릭스 메탈로프로테이나제 6 (MMP-6), 뉴로라이신 (NLN)-촉매적 도메인, 뉴로라이신(NLN), MDC1, 라미닌2 a2, b카테닌, FXR2, 어넥신 V, SMAC 디아블로, MBNL1, 디메틸 히스톤 h3, 독립적 성장 인자 1, U2AF65, mTOR, E2F2, 카이소, 글리코겐 신타제 키나제 3, ATF2, HDRP MITR, 뉴라빈 I, AP1 및 Apaf1로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자의 발현 수준을 하향조절하는 단계를 포함한다.
본 발명의 몇몇 양태에서, 사람에서 육종을 치료하거나 예방하는 방법 또는 사람에서 EWS-FLI1 융합 단백질의 활성을 억제하는 방법은 ANGPTL3, CCL2, CDH5, CXCL1, CXCL3, PRMT3, HDAC2, 산화질소 신타제 bNOS, 아세틸 포스포 히스톤 H3 AL9 S10, MTA 2, 글루탐산 데카복실라제 GAD65 67, KSR, HDAC4, BOB1 OBF1, a1신트로핀, BAP1, 임포르티나 57, αE-카테닌, Grb2, Bax, 프로테아좀 26S 서브유니트 13 (엔도필린 B1), 액틴형 6A (진핵세포 개시 인자 4A11), 핵 클로라이드 채널 단백질, 프로테아좀 26S 서브유니트, 디스뮤타제 Cu/Zn 슈퍼옥사이드, 트랜슬린-결합 인자 X, 아비산염 전위 ATP아제 (스퍼민 신테타제), 리보솜 단백질 SA, dCTP 피로포스파타제 1, 프로테아좀 베타 3, 프로테아좀 베타 4, 산 포스파타제 1, 디아제팜 결합 억제제, 알파 2-HS 당단백질 (보스 토러스, 소), 리보솜 단백질 P2 (RPLP2); 히스톤 H2A, 마이크로튜불 결합 단백질, 프로테아좀 알파 3, 진핵세포 해독 연장 인자 1 델타, 라민 B1, SMT 3, mif two 3 동족체 2의 억제인자, 열 쇼크 단백질 27kD, hnRNP C1/C2, 진핵세포 해독 연장 인자 1 베타 2, HSPC-300 유사체, DNA 지시된 DNA 폴리머라제 엡실론 3; (캐노피 2 동족체), LAMA5, PXLDC1, p300 CBP, P53R2, 포스파티딜세린 수용체, 사이토케라틴 펩타이드 17, 사이토케라틴 펩타이드 13, 뉴로필라멘트 160 200, Rab5, 필렌신, P53R2, MDM2, MSH6, 열 쇼크 인자 2, AFX, FLIPg d, JAB 1, 미오신, MEKK4, cRaf pSer621, FKHR FOXO1a, MDM2, Fas 리간드, P53R2, 미오신 조절 경쇄, hnRNP C1/C2, 유비퀼린 1 (포스파타제 2A), hnRNP C1/C2, 알파 2-HS 당단백질 (보스 토러스, 소), 베타 액틴, hnRNP C1/C2, 열 쇼크 단백질 70kD, 베타 튜불린, ATP 의존성 헬리카제 II, 진핵세포 해독 연장 인자 1 베타 2, ER 지질 raft 결합 2 이소형 1 (베타 액틴), 시그날 서열 수용체 1 델타, 진핵세포 해독 개시 인자 3, 서브유니트 3 감마, 빌베르딘 리덕타제 A (트랜스알돌라제 1), 케라틴 1,10 (파라티모신), GST 오메가 1, Dj-1에 대한 쇄 B 도파민 퀴논 접합체, 프로테아좀 활성화인자 Reg(알파), T-복합 단백질 1 이소형 A, 쇄 A 타파신 ERP57 (TCP1 함유 샤페로닌), 유비퀴틴 활성화 효소 E1; 알라닐-tRNA 신테타제, 다이낙틴 1, 열 쇼크 단백질 60kd, 베타 액틴, 스퍼미딘 신타제 (베타 액틴), 열 쇼크 단백질 70kd, 망막모세포종 결합 단백질 4 이소형 A, TAR DNA 결합 단백질, 진핵세포 해독 연장 인자 1 베타 2, TCP1 함유 샤페로닌, 서브유니트 3, 세포질 다이네인 IC-2, 안지오텐신-전환 효소 (ACE), 카스파제 3, GARS, 매트릭스 메탈로프로테이나제 6 (MMP-6), 뉴로라이신 (NLN)-촉매적 도메인, 및 뉴로라이신 (NLN), ADRB, CEACAM1, DUSP4, FOXC2, FOXP3, GCGR, GPD1, HMOX1, IL4R, INPPL1, IRS2, VEGFA, 추정 c-myc-반응성 이소형 1, PDK 1, 카스파제 12, 포스포리파제 D1, P34 cdc2, P53 BP1, BTK, ASC2, BUBR1, ARTS, PCAF, Raf1, MSK1, SNAP25, APRIL, DAPK, RAIDD, HAT1, PSF, HDAC1, Rad17, 수르비빈, SLIPR, MAG13, 카스파제 10, Crk2, Cdc 6, P21 WAF 1 Cip 1, ASPP 1, HDAC 4, 사이클린 B1, CD 40, GAD 65, TAP, Par4 (전립선 아폽토시스 반응 4), MRP1, MDC1, 라미닌2 a2, b카테닌, FXR2, 어넥신 V, SMAC 디아블로, MBNL1, 디메틸 히스톤 h3, 독립적 성장 인자 1, U2AF65, mTOR, E2F2, 카이소, 글리코겐 신타제 키나제 3, ATF2, HDRP MITR, 뉴라빈 I, AP1 및 Apaf1로 이루어진 그룹으로부터 선택된 유전자(또는 단백질)과 CoQ10 분자의 상호작용을 포함하거나 이를 통해 일어난다.
본 발명의 특정 양태에서, 상기 방법들은 수술, 방사선요법, 호르몬 치료법, 항체 치료법, 성장 인자 또는 사이토킨을 이용한 치료법, 화학치료법 및 동종 줄기 세포 치료법 중 어느 하나 또는 이들의 조합을 포함하는 치료 계획을 추가로 포함한다. 또 다른 측면에서, 본 발명은 피검체에서 육종을 치료하기 위한 치료의 효능을 평가하기 위한 방법을 제공한다. 상기 방법들은 치료 계획의 적어도 일부를 피검체에게 적용하기 전에 피검체로부터 채취된 제1 샘플 중에 존재하는 마커의 발현 수준(여기서, 상기 마커는 표 2 내지 9에 열거된 마커들로 이루어진 그룹으로부터 선택된다)과 치료 계획의 적어도 일부를 적용한 후에 상기 피검체로부터 채취된 제2 샘플에 존재하는 상기 마커의 발현 수준을 비교함을 포함하고, 여기서, 제1 샘플에 비해 제2 샘플 중의 상기 마커의 발현 수준에서의 조정(modulation)은 치료가 피검체에서 육종을 치료하는데 효과적임을 나타낸다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 피검체가 육종을 앓고 있는지의 여부를 평가하는 방법을 제공한다. 상기 방법들은 피검체로부터 채취된 생물학적 샘플 중에 존재하는 마커의 발현 수준을 측정하고(여기서, 상기 마커는 표 2 내지 9에 열거된 마커들로 이루어진 그룹으로부터 선택된다) 상기 피검체로부터 채취된 생물학적 샘플 중에 존재하는 마커의 발현 수준을 대조군 샘플 중에 존재하는 마커의 발현 수준과 비교하여 피검체가 육종을 앓고 있는지의 여부를 평가함을 포함하고, 여기서, 상기 대조군 샘플 중에 마커의 발현 수준과 비교하여 상기 피검체로부터 채취된 생물학적 샘플에서의 마커의 발현 수준에서의 조정이 피검체가 육종을 앓고 있는 것임을 나타낸다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 피검체가 육종을 발병할 성향이 있는지를 예측하는 방법을 제공한다. 상기 방법들은 피검체로부터 채취된 생물학적 샘플 중에 존재하는 마커의 발현 수준을 결정하고(여기서, 상기 마커는 표 2 내지 9에 열거된 마커들로 이루어진 그룹으로부터 선택된다) 피검체로부터 채취된 생물학적 샘플 중에 존재하는 상기 마커의 발현 수준을 대조군 샘플에 존재하는 마커의 발현 수준과 비교하여 피검체가 육종을 발병할 성향이 있는지를 예측함을 포함하고, 이때 상기 대조군 샘플 중의 마커의 발현 수준과 비교하여 상기 피검체로부터 채취된 생물학적 샘플 중의 마커의 발현 수준에서의 조정은 피검체가 육종을 발병할 성향이 있는 것임을 나타낸다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 피검체에서 육종의 재발을 예측하는 방법을 제공한다. 상기 방법들은 피검체로부터 채취된 생물학적 샘플 중에 존재하는 마커의 발현 수준을 결정하고(여기서, 상기 마커는 표 2 내지 9에 열거된 마커들로 이루어진 그룹으로부터 선택된다) 피검체로부터 채취된 생물학적 샘플들에 존재하는 상기 마커의 발현 수준을 대조군 샘플 중에 존재하는 상기 마커의 발현 수준과 비교하여 피검체에서 육종의 재발을 예측함을 포함하고, 여기서, 상기 대조군 샘플 중에 마커의 발현 수준과 비교하여 상기 피검체로부터 채취된 생물학적 샘플 중에 마커의 발현 수준에서의 조정은 육종의 재발을 나타낸다.
하나의 측면에서, 본 발명은 육종을 앓는 피검체의 생존력을 예측하는 방법을 제공한다. 상기 방법들은 피검체로부터 채취된 생물학적 샘플 중에 존재하는 마커의 발현 수준을 결정하고(여기서, 상기 마커는 표 2 내지 9에 열거된 마커들로 이루어진 그룹으로부터 선택된다) 피검체로부터 채취된 생물학적 샘플 중에 존재하는 상기 마커의 발현 수준을 대조군 샘플 중에 존재하는 상기 마커의 발현 수준과 비교하여 육종을 앓는 피검체의 생존력을 예측함을 포함하고, 여기서, 상기 대조군 샘플 중의 마커의 발현 수준과 비교하여 상기 피검체로부터 채취된 생물학적 샘플 중에 마커의 발현 수준에서의 조정이 피검체의 생존력을 나타낸다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 피검체에서 육종의 진행을 모니터링하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 치료 계획의 적어도 일부를 피검체에 적용하기 전에 피검체로부터 채취된 제1 샘플 중에 존재하는 마커의 발현 수준과 치료 계획의 적어도 일부를 적용한 후 피검체로부터 채취된 제2 샘플 중에 존재하는 마커의 발현 수준을 비교하여 피검체내 육종의 진행을 모니터링함을 포함하고, 여기서, 상기 마커는 표 2 내지 9에 열거된 마커들로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 피검체에서 육종을 치료하기 위한 화합물을 동정하는 방법을 제공한다. 상기 방법들은 피검체로부터 생물학적 샘플을 채취하고, 생물학적 샘플을 시험 화합물과 접촉시키고, 피검체로부터 채취된 생물학적 샘플 중에 존재하는 하나 이상의 마커의 발현 수준을 결정하고(여기서, 상기 마커는 양성 배수 변화 및/또는 음성 배수 변화를 갖는, 표 2 내지 9에 열거된 마커들로 이루어진 그룹으로부터 선택된다), 생물학적 샘플 중의 하나 이상의 마커의 발현 수준을 적당한 대조군과 비교하고, 음성 배수 변화와 함께 생물학적 샘플 중에 존재하는 하나 이상의 마커의 발현 수준을 감소시키고/시키거나 양성 배수의 변화와 함께 생물학적 샘플 중에 존재하는 하나 이상의 마커의 발현 수준을 증가시키는 시험 화합물을 선별함에 따라서 피검체에서 육종을 치료하는 화합물을 동정함을 포함한다.
하나의 양태에서, 상기 육종은 유잉 계열의 종양에서 육종의 한 유형이다. 하나의 양태에서, 육종의 유형은 유잉 육종이다.
본 발명의 방법에 사용하기 위해 적합한 샘플은 예를 들면, 유체, 예를 들면, 피검체로부터 채취된, 혈액, 토사물, 타액, 림프액, 낭포액, 뇨, 기관지 폐포에 의해 회수된 유체, 복막 세정에 의해 회수된 유체 및 부인과학적 유체를 포함한다. 하나의 양태에서, 상기 샘플은 혈액 샘플 또는 이의 구성요소이다. 본 발명의 방법에 사용하기 위해 적합한 샘플은 또한 예를 들면, 조직 또는 이의 구성 요소, 예를 들면, 골, 연결 조직, 연골, 폐, 간, 신장, 근육 조직, 심장, 췌장 및/또는 피부를 포함할 수 있다.
하나의 양태에서, 피검체는 사람이다.
하나의 양태에서, 생물학적 샘플 중의 마커의 발현 수준은 예를 들면, 샘플 중에 전사된 폴리뉴클레오타이드를 증폭시킴에 의해 전사된 폴리뉴클레오타이드 또는 이의 일부를 분석하여 결정된다.
피검체 샘플 중에 마커의 발현 수준은 예를 들면, 샘플 중에서 단백질과 특이적으로 결합하는 시약, 예를 들면, 표지된 시약을 사용하여 단백질 또는 이의 일부를 분석함으로써 결정된다. 하나의 양태에서, 상기 시약은 항체 및 항원 결합 항체 단편으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
하나의 양태에서, 샘플 중의 마커의 발현 수준은 상기 샘플에 대한, 폴리머라제 연쇄 반응(PCR) 증폭 반응, 역전사효소 PCR 분석, 단일 가닥 입체 다형성 분석(SSCP), 미스매치 절단 검출, 이형이중가닥 분석, 서던 블롯 분석, 노던 블롯 분석, 웨스턴 블롯 분석, 동일계 하이브리드화, 어레이 분석, 데옥시리보핵산 서열분석, 제한 단편 길이 다형태 분석 및 이들의 조합 또는 준조합(subcombination)으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 기술을 사용하여 결정된다.
또 다른 양태에서, 샘플 중의 마커의 발현 수준은 면역조직화학법, 면역세포화학법, 유동세포분석법, ELISA 및 질량 분광법으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 기술을 사용하여 결정한다.
또 다른 양태에서, 상기 마커는 ANGPTL3, CCL2, CDH5, CXCL1, CXCL3, PRMT3, HDAC2, 산화질소 신타제 bNOS, 아세틸 포스포 히스톤 H3 AL9 S10, MTA 2, 글루탐산 데카복실라제 GAD65 67, KSR, HDAC4, BOB1 OBF1, a1신트로핀, BAP1, 임포르티나 57, αE-카테닌, Grb2, Bax, 프로테아좀 26S 서브유니트 13 (엔도필린 B1), 액틴형 6A (진핵세포 개시 인자 4A11), 핵 클로라이드 채널 단백질, 프로테아좀 26S 서브유니트, 디스뮤타제 Cu/Zn 슈퍼옥사이드, 트랜슬린-결합 인자 X, 아비산염 전위 ATP아제 (스퍼민 신테타제), 리보솜 단백질 SA, dCTP 피로포스파타제 1, 프로테아좀 베타 3, 프로테아좀 베타 4, 산 포스파타제 1, 디아제팜 결합 억제제, 알파 2-HS 당단백질 (보스 토러스, 소), 리보솜 단백질 P2 (RPLP2); 히스톤 H2A, 마이크로튜불 결합 단백질, 프로테아좀 알파 3, 진핵세포 해독 연장 인자 1 델타, 라민 B1, SMT 3, mif two 3 동족체 2의 억제인자, 열 쇼크 단백질 27kD, hnRNP C1/C2, 진핵세포 해독 연장 인자 1 베타 2, HSPC-300 유사체, DNA 지시된 DNA 폴리머라제 엡실론 3; (캐노피 2 동족체), LAMA5, PXLDC1, p300 CBP, P53R2, 포스파티딜세린 수용체, 사이토케라틴 펩타이드 17, 사이토케라틴 펩타이드 13, 뉴로필라멘트 160 200, Rab5, 필렌신, P53R2, MDM2, MSH6, 열 쇼크 인자 2, AFX, FLIPg d, JAB 1, 미오신, MEKK4, cRaf pSer621, FKHR FOXO1a, MDM2, Fas 리간드, P53R2, 미오신 조절 경쇄, hnRNP C1/C2, 유비퀼린 1 (포스파타제 2A), hnRNP C1/C2, 알파 2-HS 당단백질 (보스 토러스, 소), 베타 액틴, hnRNP C1/C2, 열 쇼크 단백질 70kD, 베타 튜불린, ATP 의존성 헬리카제 II, 진핵세포 해독 연장 인자 1 베타 2, ER 지질 raft 결합 2 이소형 1 (베타 액틴), 시그날 서열 수용체 1 델타, 진핵세포 해독 개시 인자 3, 서브유니트 3 감마, 빌베르딘 리덕타제 A (트랜스알돌라제 1), 케라틴 1,10 (파라티모신), GST 오메가 1, Dj-1에 대한 쇄 B 도파민 퀴논 접합체, 프로테아좀 활성화인자 Reg(알파), T-복합 단백질 1 이소형 A, 쇄 A 타파신 ERP57 (TCP1 함유 샤페로닌), 유비퀴틴 활성화 효소 E1; 알라닐-tRNA 신테타제, 다이낙틴 1, 열 쇼크 단백질 60kd, 베타 액틴, 스퍼미딘 신타제 (베타 액틴), 열 쇼크 단백질 70kd, 망막모세포종 결합 단백질 4 이소형 A, TAR DNA 결합 단백질, 진핵세포 해독 연장 인자 1 베타 2, TCP1 함유 샤페로닌, 서브유니트 3, 세포질 다이네인 IC-2, 안지오텐신-전환 효소 (ACE), 카스파제 3, GARS, 매트릭스 메탈로프로테이나제 6 (MMP-6), 뉴로라이신 (NLN)-촉매적 도메인, 및 뉴로라이신 (NLN), ADRB, CEACAM1, DUSP4, FOXC2, FOXP3, GCGR, GPD1, HMOX1, IL4R, INPPL1, IRS2, VEGFA, 추정 c-myc-반응성 이소형 1, PDK 1, 카스파제 12, 포스포리파제 D1, P34 cdc2, P53 BP1, BTK, ASC2, BUBR1, ARTS, PCAF, Raf1, MSK1, SNAP25, APRIL, DAPK, RAIDD, HAT1, PSF, HDAC1, Rad17, 수르비빈, SLIPR, MAG13, 카스파제 10, Crk2, Cdc 6, P21 WAF 1 Cip 1, ASPP 1, HDAC 4, 사이클린 B1, CD 40, GAD 65, TAP, Par4 (전립선 아폽토시스 반응 4), MRP1, MDC1, 라미닌2 a2, b카테닌, FXR2, 어넥신 V, SMAC 디아블로, MBNL1, 디메틸 히스톤 h3, 독립적 성장 인자 1, U2AF65, mTOR, E2F2, 카이소, 글리코겐 신타제 키나제 3, ATF2, HDRP MITR, 뉴라빈 I, AP1 및 Apaf1로 이루어진 그룹으로부터 선택된 마커이다.
하나의 양태에서, 복수의 마커의 발현 수준을 결정한다.
하나의 양태에서, 피검체는 환경 영향인자(environmental influencer) 화합물, 수술, 방사선요법, 호르몬 치료, 항체 치료, 성장 인자 또는 사이토킨을 이용한 치료법, 화학치료법 및 동종 줄기 세포 치료법으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 치료법으로 치료된다.
하나의 양태에서, 상기 치료법은 환경 영향 인자 화합물을 포함하고, 임의로 수술, 방사선요법, 호르몬 치료법, 항체 치료법, 성장인자 또는 사이토킨을 이용한 치료법, 화학치료법 및 동종 줄기 세포 치료법으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 치료 계획을 추가로 포함한다.
상기 환경 영향 인자 화합물은 다차원 세포내 분자(MIM), 에피메타볼릭 쉬프터(에피-쉬프터(epi-shifter)), CoQ10 분자, 비타민 D3, 아세틸 Co-A, 팔미틸 Co-A, L-카르니틴, 티로신, 페닐알라닌, 시스테인, 소분자, 피브로넥틴, TNF-알파, IL-5, IL-12, IL-23, 혈관형성 인자 및/또는 아폽토시스 인자일 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면에서, 피검체가 육종을 앓고 있는지의 여부를 평가하기 위한 키트가 제공된다. 상기 키트는 표 2 내지 9에 열거된 마커들로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 마커의 발현 수준을 결정하기 위한 시약 및 피검체가 육종을 앓고 있는지의 여부를 평가하기 위한 키트의 사용 지침서를 포함한다.
하나의 측면에서, 본 발명은 피검체가 육종을 발병할 성향이 있는지의 여부를 예측하기 위한 키트를 제공한다. 상기 키트는 표 2 내지 9에 열거된 마커들로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 마커의 발현 수준을 결정하기 위한 시약 및 피검체가 육종을 발병할 성향이 있는지의 여부를 예측하기 위한 키트의 사용 지침서를 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 피검체에서 육종의 재발을 예측하기 위한 키트를 제공한다. 상기 키트는 표 2 내지 9에 열거된 마커들로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 마커의 발현 수준을 평가하기 위한 시약 및 육종의 재발을 예측하기 위한 키트의 사용 지침서를 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 육종의 재발을 예측하기 위한 키트를 제공한다. 상기 키트는 표 2 내지 9에 열거된 마커들로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 마커의 발현 수준을 결정하기 위한 시약 및 육종의 재발을 예측하기 위한 키트의 사용 지침서를 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 육종을 갖는 피검체의 생존력을 예측하기 위한 키트를 제공한다. 상기 키트는 표 2 내지 9에 열거된 마커들로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 마커의 발현 수준을 결정하기 위한 시약 및 육종을 갖는 피검체의 생존력을 예측하기 위한 키트의 사용 지침서를 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 피검체에서 육종의 진행을 모니터링하기 위한 키트를 제공한다. 상기 키트는 표 2 내지 9에 열거된 마커들로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 마커의 발현 수준을 결정하기 위한 시약 및 피검체내 육종의 진행을 예측하기 위한 키트의 사용 지침서를 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 육종을 치료하기 위한 치료법의 효능을 평가하기 위한 키트를 제공한다. 상기 키트는 표 2 내지 9에 열거된 마커들로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 마커의 발현 수준을 결정하기 위한 시약 및 육종을 치료하기 위한 치료법의 효능을 평가하기 위한 키트의 사용 지침서를 포함한다.
본 발명의 키트는 피검체 기원의 생물학적 샘플, 대조군 샘플 및/또는 환경 영향 인자 화합물을 수득하기 위한 수단을 추가로 포함할 수 있다.
하나 이상의 마커의 발현 수준을 결정하기 위한 수단은 샘플 중의 전사된 폴리뉴클레오타이드 또는 이의 일부를 분석하기 위한 수단 및/또는 샘플 중에 단백질 또는 이의 일부를 분석하기 위한 수단을 포함할 수 있다.
하나의 양태에서, 상기 키트는 복수의 마커의 발현 수준을 결정하기 위한 시약을 포함한다.
본 발명의 다양한 양태는 하기에서 도면을 참조로 본원에 기재될 것이다:
도 1은 상이한 처리 그룹 기원의 NCIES0808 세포에 대한 현미경 사진을 도시한다. (A) 3시간 배지 (B) 3시간 50uM Q1O (C) 3시간 1OOuM Q1O (D) 6시간 비히클 (E) 6시간 50uM Q1O (F) 6시간 1OOuM Q1O (G) 24시간 배지 (H) 24시간 50uM Q1O (I) 24시간 1OOuM Q1O (J) 48시간 배지 (K) 48시간 50uM Q1O (L) 48시간 1OOuM Q1O(여기서, 상기 임의의 그룹들의 Q10 처리 후 세포수 또는 형태에는 명백한 차이가 없다).
도 2는 3시간 동안 50μM CoQ10으로 처리된 NCIES0808로부터 분리된 단백질의 예시적인 항체 어레이의 패턴 분석을 도시한다.
도 3은 24시간 동안 CoQ10으로 처리된 NCIES008 세포의 2-D 겔 전기영동의 예시적인 겔 분석을 도시한다. 동정을 위해 절개된 부분을 표시한다.
도 4는 다양한 항체를 사용하여 24시간 동안 50uM 또는 100uM CoQ10으로 처리된 NCIES0808 세포로부터 분리된 단백질의 웨스턴 블롯 분석을 도시한다. (A) 항-안지오텐신-전환 효소 (ACE) (Santa Cruz Biotechnology, Inc., sc-23908). (B) 항-카스파제 3 (abcam Inc., ab44976). (C) 항-GARS (abcam Inc., ab42905). (D) 항-매트릭스 메탈로프로테이나제 6 (MMP-6) (Santa Cruz Biotechnology, Inc., sc-101453). (E) 항-뉴로라이신 (NON) - 촉매적 도메인 (abcam Inc., ab59523). (F) 항-뉴로라이신 (NLN) (abcam Inc., ab59519).
도 5는 (A) EWS 및 FLI1 단백질에 대한 단백질 상호작용의 네트워크 및 (B) ANGPTL3 단백질의 단백질 상호작용의 네트워크를 도시한다.
본 발명이 보다 용이하게 이해될 수 있도록 하기 위해, 특정 용어들이 먼저 정의된다.
I. 정의
본원에 사용된 바와 같이, 하기의 용어들 각각은 본 섹션에서 이와 연관된 의미를 갖는다.
본원에 사용된 부정관사 "a" 및 "an"은 본원에서 문법적으로 하나 이상(즉, 적어도 하나)의 대상 물체를 언급하기 위해 사용된다. 예를 들면, 요소("an element")는 하나 이상의 요소를 의미한다.
용어 "포함하는"은 본원에서 문장 "포함하지만 이에 제한되지 않음"을 의미하고 상기 문장과 상호교환적으로 사용된다.
용어 "또는"은 본원에서 달리 문맥에서 명백하게 특정되지 않는 한 용어 "및/또는"을 의미하고 상기 용어와 상호교환적으로 사용된다.
용어 "와 같은"은 본원에서 문장 "와 같지만 이에 제한되지 않는"을 의미하고 상기 문장과 상호교환적으로 사용된다.
본 발명의 방법에 의해 치료될 "환자" 또는 "피검체"는 사람 또는 비-사람 동물, 바람직하게는 포유동물을 의미할 수 있다. 본원에 기재된 임상적 관찰은 사람을 대상으로 하였고, 적어도 일부 양태에서 피검체는 사람임을 주지해야 한다.
"치료 유효량"은 질환을 치료하기 위해 환자에게 투여되는 경우 상기 질환의 치료 효과를 나타내기에 충분한 화합물의 양을 의미한다. 질환을 예방하기 위해 투여되는 경우, 상기 양은 질환의 발병을 회피하거나 지연시키는데 충분하다. "치료 유효량"은 화합물, 질환 및 이의 중증도, 및 치료될 환자의 연령, 체중 등에 따라 다양할 것이다.
"예방하는" 또는 "예방"은 질환 또는 장애를 획득할 위험성을 감소시키는 것(즉, 질환에 노출되거나 이의 성향을 가질 수 있지만 질환의 증상을 아직 경험하지 않거나 나타내지 않는 환자에서 질환의 하나 이상의 임상적 증상이 발병하지 않도록 하는 것)을 언급한다.
용어 "예방적" 또는 "치료적" 처치는 하나 이상의 피검체 조성물을 피검체에게 투여함을 언급한다. 원치 않는 병태(숙주 동물의 질환 또는 기타 원치 않는 상태)가 임상적으로 나타나기 전에 투여되는 경우, 그 처치는 예방적이고, 즉, 원치 않는 병태가 발병하지 않도록 숙주를 보호하는 것인 반면, 원치 않는 병태가 나타난 후 투여되는 경우, 그 처치는 치료적이다(즉, 기존의 원치 않는 병태 또는 이로부터의 부작용을 감소시키거나, 완화시키거나 현상유지시키는 것으로 의도된다).
용어 "치료 효과"는 약리학적 활성 물질에 의해 유발되는 동물, 특히 포유동물 및 보다 특히 사람에서의 국소 또는 전신성 효과를 언급한다. 따라서, 상기 용어는 동물 또는 사람에서 질환의 진단, 치유, 완화, 치료 또는 예방, 또는 바람직한 신체적 또는 정신적 발달 및 상태의 증진에 사용하고자 하는 임의의 물질을 의미한다. 문장 "치료 유효량"은 임의의 치료에 적용될 수 있는 합리적인 이익/위험 비율에서의 일부 목적하는 국소 또는 전선 효과를 나타내도록 하는 물질의 양을 의미한다. 특정 양태에서, 치료 유효량의 화합물은 이의 치료 지수 및 가용성 등에 의존할 것이다. 예를 들면, 본 발명의 방법들에 의해 발견된 특정 화합물은 상기 치료에 적용될 수 있는 합리적인 이익/위험 비율을 나타내기에 충분한 양으로 투여될 수 있다.
"환자"란, 말, 개, 고양이, 돼지, 염소, 토끼, 햄스터, 원숭이, 기니아피그, 래트, 마우스, 도마뱀, 뱀, 양, 소, 물고기 및 새를 포함하는 임의의 동물(예를 들면, 사람)을 의미한다.
"대사 경로"는 하나의 화합물을 또 다른 화합물로 전환시키고 세포 기능을 위한 중간체 및 에너지를 제공하는 일련의 효소-매개된 반응을 언급한다. 대사 경로는 선형이거나 순환형일 수 있다.
"대사 상태"는 건강 또는 질환 상태와 관련되는 다양한 화학적 및 생물학적 지시제에 의한 측정시 주어진 시점에서 특정 세포, 다세포 또는 조직 환경의 분자적 내용물(molecular content)을 언급한다.
용어 "마이크로어레이"는 기질, 예를 들면, 종이, 나일론 또는 다른 유형의 막, 필터, 칩, 유리 슬라이드 또는 임의의 다른 적합한 고체 지지체상에서 합성되는 독특한 폴리뉴클레오타이드, 올리고뉴클레오타이드, 폴리펩타이드(예를 들면, 항체) 또는 펩타이드의 어레이를 언급한다.
용어 "장애" 및 "질환"은 포괄적으로 사용되고, 신체의 임의의 부위, 기관 또는 시스템(또는 이의 임의의 조합)의 정상적인 구조 또는 기능으로부터 이탈된 것을 의미한다. 특이적 질환은 생물학적, 화학적 및 물리적 변화를 포함하는, 특징적인 증상 및 징후로 나타나고, 흔히 인구통계학적, 환경적, 사용, 유전학적 및 의학적 병력 인자를 포함하지만 이에 제한되지 않는 기타 다양한 인자들과 관련된다. 특정의 특징적인 징후, 증상 및 관련된 인자들은 다양한 방법들을 통해 정량되어 중요한 진단학적 정보를 수득할 수 있다.
용어 "육종"은 신체의 다른 구조 및 기관을 연결하거나, 지지하거나 둘러싸는 조직의 악성 종양을 언급한다. 하나의 양태에서, 육종은 "유잉 계열 종양"의 육종 유형이다.
본원에 사용된 용어 "유잉 계열의 종양"은 용어 "EFT"와 상호교환적으로 사용되고, 골 또는 인근 연조직에 영향을 주는 암 그룹을 언급한다. 본원에 사용된 용어 "유잉 계열의 종양"은 골의 유잉 종양(또한 유잉 육종으로 불리움), 가장 흔한 유형의 EFT, 골외성 유잉(EOE), 골 외부의 연조직에서 성장하는 종양 및 말초 원발성 신경외배엽성 종양(PPNET), 흉벽의 PPNET인 아스킨 종양을 포함하는, 골 및 연조직에서 발견되는 암을 포함한다.
용어 "발현"은 본원에서 폴리펩타이드가 DNA로부터 제조되는 과정을 의미하기 위해 사용된다. 상기 과정은 유전자의 mRNA로의 전사 및 상기 mRNA의 폴리펩타이드로의 해독을 포함한다. 사용되는 문맥에 따라, "발현"은 RNA, 단백질 또는 이들 둘 다의 제조를 언급할 수 있다.
용어 "세포내 유전자의 발현 수준" 또는 "유전자 발현 수준"은 세포에서 유전자에 의해 암호화된 mRNA 이전의 신생 전사체(들), 전사체 프로세싱 중간체, 성숙한 mRNA(들) 및 분해 생성물 뿐만 아니라 mRNA의 수준을 언급한다.
용어 "조정"은 반응의 상향조절(즉, 활성화 또는 자극), 하향조절(즉, 억제 또는 서프레션)을 언급하거나 조합된 상태 또는 개별적인 상태의 상기 두 가지의 조절을 언급한다. "조정제"는 조정시키는 화합물 또는 분자이고, 예를 들면, 효능제, 길항제, 활성화제, 자극제, 서프레서 또는 억제제일 수 있다.
"보다 고수준의 발현", "보다 고수준의 활성", "증가된 수준의 발현" 또는 "증가된 수준의 활성"은 발현 및/또는 활성을 평가하기 위해 사용되는 분석의 표준 오차보다 크고 대조군 샘플(예를 들면, 육종을 앓지 않는 건강한 피검체로부터의 샘플)에서의 마커의 발현 수준 및/또는 활성 및 바람직하게는 여러 대조군 샘플에서의 마커의 평균 발현 수준 및/또는 활성보다 바람직하게는 2배 이상 및 보다 바람직하게는 3배, 4배, 5배 또는 10배 이상인 시험 샘플에서의 발현 수준 및/또는 활성을 언급한다.
"보다 낮은 수준의 발현", "보다 낮은 수준의 활성", "감소된 수준의 발현" 또는 "감소된 수준의 활성"은 발현 및/또는 활성을 평가하기 위해 사용되는 분석의 표준 오차보다 크고 대조군 샘플(예를 들면, 마커의 예측적인 능력에 대해 입증 표준물로서 작용하는 후처리 정보와 함께 육종 패널에 대해 직간접적으로 계측된 샘플)에서 마커의 발현 수준 및 바람직하게는 여러 대조군 샘플에서 마커의 평균 발현 수준 및/또는 활성보다 바람직하게는 2배 이상 및 보다 바람직하게는 3배, 4배, 5배 또는 10배 이상만큼 적은 시험 샘플에서 발현 수준 및/또는 활성을 언급한다.
본원에 사용된 "항체"는 예를 들면, 천연 형태의 항체(예를 들면, IgG, IgA, IgM, IgE) 및 단일쇄 항체, 키메라 항체 및 사람화된 항체 및 다중 특이적 항체와 같은 재조합 항체, 및 이의 모두의 단편 및 유도체(여기서, 단편 및 유도체는 적어도 항원 결합 부위를 갖는다)를 포함한다. 항체 유도체는 항체에 접합된 단백질 또는 화학적 잔기를 포함할 수 있다.
본원에 사용된 "공지된 표준물" 또는 "대조군"은 본 발명의 마커 및 육종의 존재 또는 부재와 관련하여, 적용될 수 있는 바와 같은 양 및/또는 수학적 관계중 하나 이상을 언급한다. 공지된 표준물은 바람직하게 재발성 종양 및 비-재발성 종양 및/또는 공격성 또는 비-공격성 종양에 특징적인 상기 양 및/또는 수학적 관계를 반영한다. 공지된 표준물을 생성시키기 위한 시약은 제한없이 공격성인 것으로 공지된 종양으로부터의 종양 세포, 비-공격성인 것으로 공지된 종양으로부터의 종양 세포, 및 임의로 표지된 항체를 포함한다. 공지된 표준물은 또한 조직 배양 세포주(특이적 마커 단백질을 발현하도록 조작되거나 특이적 마커 단백질을 발현하지 않도록 조작된 세포주를 포함하지만 이에 제한되지 않음) 또는 일정량의 마커 단백질을 본질적으로 함유하거나 마커 단백질을 발현하도록 조작될 수 있는(예를 들면, 변화된 환경으로의 노출에 의해, 이때 상기 변화된 환경은 성장 인자, 호르몬, 스테로이드, 사이토킨, 항체, 다양한 약물 및 항-대사물 및 세포외 매트릭스를 포함할 수 있지만 이에 제한되지 않음) 종양 이종이식체를 포함할 수 있다. 세포주는 분석용 유리 슬라이드상에 직접 탑재될 수 있거나, 고정화되거나, 직접 펠렛으로서 파라핀에 매립되거나, 아가로스와 같은 매트릭스에 현탁됨에 이어서 고정화되거나 파라핀에 매립되고 조직 샘플로서 절개되고 가공된다. 상기 표준물은 마커 단백질의 예측적 능력에 대한 확증 표준물로서 작용하는 후처리(follow-up) 정보와 함께 육종 패널에 대해 직간접적으로 계산되어야만 한다.
본원에 사용된 "1차 치료"는 육종을 앓는 피검체의 초기 치료를 언급한다. 1차 치료는 제한없이, 수술, 방사선요법, 호르몬 치료, 화학치료법, 면역치료법, 혈관형성 치료법, 동종 줄기 세포 치료법 및 생조정제를 통한 치료법을 포함한다.
육종은, 육종의 하나 이상의 증상이 완화되거나, 종결되거나, 느려지거나, 또는 예방되는 것으로 예상되는 경우, "치료된다". 본원에 사용된 바와 같이, 육종은 또한 육종의 재발 또는 전이가 감소되거나, 느려지거나, 지체되거나, 예방되는 경우에 "치료된다".
키트는 본 발명의 마커를 특이적으로 검출하기 위한 하나 이상의 시약, 예를 들면, 프로브를 포함하는 임의의 제품(예를 들면, 팩키지 또는 컨테이너)이고, 상기 제품은 본 발명의 방법들을 수행하기 위한 단위체로서 지원되거나, 보급되거나, 시판된다.
본원에 사용된 용어 "트롤라민"은 트롤라민 NF, 트리에탄올아민, TEAlan®, TEAlan 99%, 트리에탄올아민 99%, 트리에탄올아민 NF 또는 트리에탄올아민 99% NF를 언급한다. 이들 용어들은 본원에서 상호교환적으로 사용될 수 있다.
본원에 사용된 "조효소 Q10 분자" 또는 "CoQ1O 분자"는 조효소 Q10, CoQ10의 빌딩 블록, CoQ10의 유도체, CoQ10의 유사체, CoQ10의 대사물 또는 조효소 생합성 경로의 중간체를 포함한다.
CoQ1O은 하기의 구조를 갖는다:
Figure 112012023750408-pct00001
CoQ10의 "빌딩 블록"은 페닐알라닌, 티로신, 4-하이도록시페닐피루베이트, 페닐아세테이트, 3-메톡시-4-하이드록시만델레이트, 바닐릭산, 4-하이드록시벤조에이트, 메발론산, 파르네실, 2,3-디메톡시-5-메틸-p-벤조퀴논 및 이들의 상응하는 산 또는 이온을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
"CoQ10의 유도체"는 CoQ10과 유사한 구조를 갖지만, 단, 하나의 원자 또는 기능성 그룹이 또 다른 원자 또는 원자단으로 대체되어 있다. "CoQ10의 유사체"는 이소프레닐 반복체를 갖지 않거나 하나 이상(예를 들면, 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개 또는 9개)을 갖는 유사체를 포함한다.
본원에 사용된 용어 "조효소 생합성 경로의 중간체"는 티로신 및 아세틸-CoA의 유비퀴논으로의 화학적/생물학적 전환 간에 형성되는 화합물들을 특징으로 한다. 조효소 생합성 경로의 중간체는 3-헥사프레닐-4-하이드록시벤조에이트, 3-헥사프레닐-4,5-디하이드록시벤조에이트, 3-헥사프레닐-4-하이드록시-5-메톡시벤조에이트, 2-헥사프레닐-6-메톡시-1,4-벤조퀴논, 2-헥사프레닐-3-메틸-6-메톡시-1,4-벤조퀴논, 2-헥사프레닐-3-메틸-5-하이드록시-6-메톡시-1,4-벤조퀴논, 3-옥타프레닐-4-하이드록시벤조에이트, 2-옥타프레닐페놀, 2-옥타프레닐-6-메톡시페놀, 2-옥타프레닐-3-메틸-6-메톡시-1,4-벤조퀴논, 2-옥타프레닐-3-메틸-5-하이드록시-6-메톡시-1,4-벤조퀴논, 2-데카프레닐-3-메틸-5-하이드록시-6-메톡시-1,4-벤조퀴논, 2-데카프레닐-3-메틸-6-메톡시-1,4-벤조퀴논, 2-데카프레닐-6-메톡시-1,4-벤조퀴논, 2-데카프레닐-6-메톡시페놀, 3-데카프레닐-4-하이드록시-5-메톡시벤조에이트, 3-데카프레닐-4,5-디하이드록시벤조에이트, 3-데카프레닐-4-하이드록시벤조에이트, 4-하이드록시 페닐피루베이트, 4-하이드록시페닐락테이트, 4-하이드록시-벤조에이트, 4-하이드록시신나메이트 및 헥사프레니디포스페이트를 포함한다.
특정 양태에서, 조효소 생합성 경로의 중간체는 다음을 포함한다: (a) 벤조퀴논 또는 상기 벤조퀴논 환의 생합성을 촉진시키는 하나 이상의 분자, 및 (b) 벤조퀴논 환으로의 이소프레노이드 단위체의 접착 및/또는 이의 합성을 촉진시키는 하나 이상의 분자. 다른 양태에서, 벤조퀴논 환의 생합성을 촉진시키는 상기 하나 이상의 분자는 다음을 포함한다: L-페닐알라닌, DL-페닐알라닌, D-페닐알라닌, L-티로신, DL-티로신, D-티로신, 4-하이드록시-페닐피루베이트, 3-메톡시-4-하이드록시만델레이트(바닐릴만델레이트 또는 VMA), 바닐릭산, 피리독신 또는 판테놀. 다른 양태에서, 벤조퀴논 환으로의 이소프레노이드 단위체의 접착 및/또는 이의 합성을 촉진시키는 상기 하나 이상의 분자는 다음을 포함한다: 페닐아세테이트, 4-하이드록시-벤조에이트, 메발론산, 아세틸글라이신, 아세틸-CoA, 또는 파르네실. 다른 양태에서, 상기 중간체는 다음을 포함한다: (a) L-페닐알라닌, L-티로신 및 4-하이드록시페닐피루베이트 중 하나 이상; 및 (b) 4-하이드록시 벤조에이트, 페닐아세테이트 및 벤조퀴논 중 하나 이상. 다른 양태에서, 상기 중간체는 (a) Bcl-2 발현을 억제하고/하거나 카스파제-3 발현을 촉진시키고/시키거나; (b) 세포 증식을 억제한다.
몇몇 양태에서, 본 발명의 화합물들, 예를 들면, 본원에 기재된 MIM 또는 에피-쉬프터, 예를 들면, 본 발명의 조효소 Q10 분자는 조효소 Q10과 공통된 활성을 공유한다. 본원에 사용된 바와 같이, 문장 "조효소 Q10과 공통된 활성을 공유한다"는 조효소 Q10과 동일하거나 유사한 활성의 적어도 일부를 나타내는 화합물의 능력을 언급한다. 몇몇 양태에서, 본 발명의 화합물은 조효소 Q10의 25% 이상의 활성을 나타낸다. 몇몇 양태에서, 본 발명의 화합물은 조효소 Q10의 약 130% 이하의 활성을 나타낸다. 몇몇 양태에서, 본 발명의 화합물은 조효소 Q10의 약 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%, 101%, 102%, 103%, 104%, 105%, 106%, 107%, 108%, 109%, 110%, 111%, 112%, 113%, 114%, 115%, 116%, 117%, 118%, 119%, 120%, 121%, 122%, 123%, 124%, 125%, 126%, 127%, 128%, 129%, 또는 130%의 활성을 나타낸다. 상기 문단에 열거된 값의 각각은 용어 "약"에 의해 변형될 수 있는 것으로 이해되어야만 한다. 추가로, 상기 문단에 열거된 임의의 2개 값에 의해 정의된 임의의 범위는 본 발명이 포괄하는 것으로 이해되어야만 한다. 예를 들면, 몇몇 양태에서, 본 발명의 화합물은 조효소 Q10의 약 50% 내지 약 100%의 활성을 나타낸다. 몇몇 양태에서, 조효소 Q10과 본 발명의 화합물이 공유하는 활성은 세포 대사에서의 전환을 유도하는 능력이다. 특정 양태에서, CoQ10과 본 발명의 화합물이 공유하는 활성은 OCR(산소 소비율) 및/또는 ECAR(세포외 산성화율)에 의해 측정된다. 특정 양태에서, CoQ10과 본 발명의 화합물이 공유하는 활성은 육종 세포의 성장을 억제하는 능력이다. 특정 양태에서, CoQ10과 본 발명의 화합물이 공유하는 활성은 세포골격 단백질의 전체 발현을 유도하는 능력이다. 특정 양태에서, CoQ10과 본 발명의 화합물이 공유하는 활성은 암, 예를 들면, 육종 세포의 구조를 불안정화시키는 능력이다.
지금부터, 본 발명의 바람직한 양태를 상세하게 기술할 것이다. 본 발명은 바람직한 양태와 연계하여 기재될 것이지만 이는 발명을 이들의 바람직한 양태로 제한고자하는 것이 아닌 것으로 이해되어야만 한다. 반대로, 첨부된 특허청구범위에 의해 정의된 발명의 취지 및 범위내에 포함될 수 있는 바와 같은 다른 대안, 변형 및 등가물을 포함하는 것으로 의도된다.
II. 환경 영향인자
하나의 측면에서, 본 발명은 환경 영향인자를 투여함에 의해 육종을 치료하는 방법들을 제공한다. "환경 영향인자" (Env-influencer)는 사람의 질환 환경이 정상 상태를 유도하는 정상 또는 건강한 환경으로 복귀하거나 상기 환경을 유지하도록 이로운 방식으로 사람의 질환 환경에 영향을 주거나 이를 조정하는 분자이다. 환경 영향 인자는 하기 정의된 바와 같이 다차원 세포내 분자(MIM) 및 에피메타볼릭 쉬프터(에피-쉬프터) 둘 다를 포함한다. 환경 영향 인자, MIM 및 에피-쉬프터는 미국 특허 출원 제12778,094호, 미국 특허 출원 제12/777,902호, 미국 특허 출원 제12/778,029호, 미국 특허 출원 제12/778,054호 및 미국 특허 출원 제12/778,010호에 보다 상세하게 기재되어 있고 상기 문헌 각각의 전문은 본원에 참조로서 인용된다.
1. 다차원 세포내 분자(Multidimensional Intracellular Molecule: MIM)
용어 "다차원 세포내 분자(MIM)"는 천연적으로 신체에 의해 생성되고/되거나 사람의 하나 이상의 세포에 존재하는 분리된 버젼 또는 합성적으로 제조된 버젼의 내인성 분자이다. MIM은 세포에 진입할 수 있고 세포로의 진입은 분자의 생물학적 활성 부분이 완전히 세포로 진입하는 한 세포로의 완전하거나 부분적인 진입을 포함한다. MIM은 세포 내에서 시그날 전달 및/또는 유전자 발현 기작을 유도할 수 있다. MIM은, 분자가 치료 효과 및 캐리어, 예를 들면, 약물 전달 효과 둘 다를 갖기 때문에 다차원이다. MIM은 또한, 분자가 질환 상태에서는 한 방식으로 작용하고 정상 상태에서는 다른 방식으로 작용하기 때문에 다차원이다. 예를 들면, CoQ10의 경우에, VEGF의 존재하에 CoQ10의 흑색종 세포로의 투여는 Bcl2의 수준을 감소시키고 이어서 이는 흑색종 세포에 대한 발암성 잠재력을 감소시킨다. 대조적으로, 정상의 섬유아세포에서, CoQ10 및 VEGF의 동시 투여는 Bcl2의 수준에 어떠한 효과도 나타내지 않는다.
하나의 양태에서, MIM은 또한 에피-쉬프터이다. 또 다른 양태에서, MIM은 에피-쉬프터가 아니다. 또 다른 양태에서, MIM은 이전의 기능들 중 하나 이상을 특징으로 한다. 또 다른 양태에서, MIM은 이전의 기능들 중 2개 이상을 특징으로 한다. 추가의 양태에서, MIM은 이전의 기능들 중 3개 이상을 특징으로 한다. 또 다른 양태에서, MIM은 이전의 기능들 모두를 특징으로 한다. 당업자는 본 발명의 MIM이 또한 2개 이상의 내인성 분자들의 혼합물을 포함함을 의도하는 것으로 이해할 것이고, 여기서, 상기 혼합물은 이전의 기능들 중 하나 이상을 특징으로 한다. 상기 혼합물에서 내인성 분자들은 상기 혼합물이 MIM으로서 기능하도록 하는 비율로 존재한다.
MIM은 지질계 또는 비-지질계 분자일 수 있다. MIM의 예는 CoQ1O, 아세틸 Co-A, 팔미틸 Co-A, L-카르니틴, 아미노산, 예를 들면, 티로신, 페닐알라닌 및 시스테인을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 하나의 양태에서, MIM은 소분자이다. 본 발명의 하나의 양태에서, MIM은 CoQ1O이 아니다. MIM은 통상적으로 본원에서 상세하게 기재되는 분석들중 어느 하나를 사용하여 당업자에 의해 동정될 수 있다.
(i) MIM을 동정하는 방법
본 발명은 MIM을 동정하는 방법을 제공한다. MIM을 동정하는 방법들은 일반적으로 내인성 분자의 세포로의 외인성 첨가 및 내인성 분자가 제공하는 세포에 대한 효과, 예를 들면 세포 미세환경 프로파일의 평가를 포함한다. 세포에 대한 효과는 세포 미세환경 프로파일에서의 변화를 동정하기 위해 세포, mRNA, 단백질, 지질 및/또는 대사물 수준 중 하나 이상이 평가된다. 하나의 양태에서, 세포는 예를 들면, 시험관내에 배양된 세포이다. 하나의 양태에서, 상기 세포는 유기체에 존재한다. 내인성 분자는 단일 농도로 세포에 첨가될 수 있거나, 다양한 농도 범위로 세포에 첨가될 수 있다. 하나의 양태에서, 내인성 분자는 세포내 내인성 분자의 수준이 대조군인 비처리된 세포에서의 내인성 분자의 수준과 비교하여 상승되도록(예를 들면, 1.1배, 1.2배, 1.3배, 1.4배, 1.5배, 1.6배, 1.7배, 1.8배, 1.9배, 2.0배, 3.0배, 4.0배, 5.0배, 10배, 15배, 20배, 25배, 30배, 35배, 40배, 45배, 50배 이상 상승) 세포에 첨가한다.
예를 들면, 형태학, 생리학 및/또는 조성(예를 들면, mRNA, 단백질, 지질, 대사물) 중 어느 하나 이상에서의 변화에 의해 검출되는 바와 같은, 세포에서의 변화를 유도하는 분자는 세포 미세환경 프로파일에 대해 유도된 변화가 질환 세포 상태와 정상 세포 상태간에 상이한 지를 결정하기 위해 추가로 평가될 수 있다. 다양한 조직 기원의 세포(예를 들면, 세포 배양주), 세포 유형 또는 질환 상태는 비교 평가를 위해 평가될 수 있다. 예를 들면, 암 세포의 세포 미세환경 프로파일에서 유도된 변화는 비-암성 또는 정상 세포에 유도된 변화와 비교될 수 있다. 세포의 미세환경 프로파일에서 변화를 유도하고(예를 들면, 형태학, 생리학 및/또는 조성, 예를 들면, 세포의 mRNA, 단백질, 지질 또는 대사물에서의 변화를 유도함)/하거나 정상 세포에 비해 환부 세포의 미세환경 프로파일에서의 변화를 차등적으로(예를 들면, 우선적으로) 유도하는 것으로 관찰된 내인성 분자는 MIM으로서 동정된다.
본 발명의 MIM은 지질계 MIM 또는 비지질계 MIM일 수 있다. 지질계 MIM을 동정하는 방법은 상기된 세포 기반 방법들(여기서, 지질계 내인성 분자는 외인성으로 세포에 첨가된다)을 포함한다. 바람직한 양태에서, 지질계 내인성 분자는 세포 내에서 지질계 내인성 분자의 수준이 상승되도록 세포에 첨가된다. 하나의 양태에서, 지질계 내인성 분자의 수준은 비처리된 대조군 세포내 수준과 비교하여 1.1배, 1.2배, 1.3배, 1.4 배, 1.5배, 1.6배, 1.7배, 1.8배, 1.9배, 2.0배, 3.0배, 4.0배, 5.0배, 10배, 15배, 20배, 25배, 30배, 35배, 40배, 45배, 50배 이상으로 상승한다.
지질계 분자의 세포로의 전달 및 이의 제형화는 시험된 각각의 분자의 성질에 따라 다르지만 많은 방법들이 당업계에 공지되어 있다. 지질계 분자의 제형화 및 전달의 예는 공용매에 의한 가용화, 캐리어 분자, 리포좀, 분산액, 현탁액, 나노입자 분산액, 에멀젼, 예를 들면, 수중유 또는 유중수 에멀젼, 다중상 에멀젼, 예를 들면, 유중수중유(oil-in-water-in-oil) 에멀젼, 중합체 포집 및 캡슐화를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 세포로의 지질계 MIM의 전달은 질량 분광법과 같은 당업계에 공지된 통상의 방법들에 의한 세포 지질의 추출 및 MIM의 정량에 의해 확인될 수 있다.
비지질계 MIM을 동정하는 방법은 비지질계 내인성 분자가 외인성으로 세포에 첨가되는 상기된 세포계 방법들을 포함한다. 바람직한 양태에서, 비지질계 내인성 분자는 세포에서 비지질계 내인성 분자의 수준이 상승되도록 세포에 첨가된다. 하나의 양태에서, 비지질계 내인성 분자의 수준은 비처리된 대조군 세포내 수준과 비교하여 1.1배, 1.2배, 1.3배, 1.4배, 1.5배, 1.6배, 1.7배, 1.8배, 1.9배, 2.0배, 3.0배, 4.0배, 5.0배, 10배, 15배, 20배, 25배, 30배, 35배, 40배, 45배, 50배 이상 상승된다. 비지질계 분자의 세포로의 전달 및 이의 제형화는 시험되는 각각의 분자의 성질에 의존하지만 많은 방법들이 당업계에 공지되어 있다. 비지질계 분자의 제형화 및 전달 방식의 예는 공용매에 의한 가용화, 캐리어 분자, 능동 수송, 중합체 포집 또는 흡착, 중합체 이식, 리포좀 캡슐화 및 표적화된 전달 시스템을 갖는 제형화를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 세포로의 비지질계 MIM의 전달은 질량 분광법과 같은 당업계에 공지된 통상의 방법들에 의한 세포 내용물의 추출 및 MIM의 정량에 의해 확인될 수 있다.
2. 에피메타볼릭 쉬프터(에피-쉬프터(epi-shifter))
본원에 사용된 바와 같이, "에피메타볼릭 쉬프터" (에피-쉬프터)는 건강한(또는 정상) 상태에서 질환 상태로의 대사 전환 및 이와 반대의 전환을 조정하여 사람에서 세포, 조직, 기관, 시스템 및/또는 숙주 건강을 유지하거나 재설정하는 분자이다. 에피-쉬프터는 조직 미세환경에서 표준화를 수행할 수 있다. 예를 들면, 에피-쉬프터는 세포에 첨가되거나 세포로부터 고갈되는 경우 세포의 미세환경(예를 들면, 대사 상태)에 영향을 줄 수 있는 임의의 분자를 포함한다. 당업자는 본 발명의 에피-쉬프터가 또한 2개 이상의 분자의 혼합물을 포괄함을 의도하는 것으로 이해할 것이고 여기서, 상기 혼합물은 이전의 기능들 중 하나 이상을 특징으로 한다. 상기 혼합물 중의 분자는 혼합물이 에피-쉬프터로서 기능하도록 하는 비율로 존재한다. 에피-쉬프터의 예는 CoQ10; 비타민 D3; ECM 성분, 예를 들면, 피브로넥틴; 면역조정제, 예를 들면, TNFa 또는 임의의 인터류킨, 예를 들면, IL-5, IL-12, IL-23; 혈관형성 인자; 및 아폽토시스 인자를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
하나의 양태에서, 에피-쉬프터는 또한 MIM이다. 하나의 양태에서, 에피-쉬프터는 CoQ1O이 아니다. 에피-쉬프터는 통상적으로 본원에 상세히 기재된 분석들 중 어느 하나의 분석을 사용하여 당업자에 의해 동정될 수 있다.
(i) 에피-쉬프터를 동정하는 방법
에피메타볼릭 쉬프터(에피-쉬프터)는 세포의 대사 상태를 조정할 수 있는, 예를 들면, 건강한(또는 정상) 상태에서 질환 상태로의 대사 전환을 유도하거나 이의 반대로의 전환을 유도하여 사람에서 세포, 조직, 기관, 시스템 및/또는 숙주 건강을 유지하거나 재설정할 수 있는 분자이다. 따라서, 본 발명의 에피-쉬프터는 환부 상태의 진단 평가에서 활용된다. 본 발명의 에피-쉬프터는 추가로, 에피-쉬프터의 적용 또는 투여(또는 다른 치료적 분자에 의한 에피-쉬프터의 조정)가 조직 미세환경 및 질환 상태에서 표준화를 유도하는 치료적 응용에서 활용된다.
에피메타볼릭 쉬프터의 동정은 일반적으로 차등적 질환 상태, 진행 또는 공격성을 나타내는 세포 또는 조직 패널에 대해 예를 들면, 대사물, 지질, 단백질 또는 RNA(개별 프로파일로서 또는 조합하여)의 분자 프로파일을 설정함을 포함한다. 수준의 변화(예를 들면, 증가되거나 감소된 수준)가 질환 상태, 진행 또는 공격성과 관련이 있는 프로파일(들)로부터의 분자가 잠재적 에피-쉬프터로서 동정된다.
하나의 양태에서, 에피-쉬프터는 또한 MIM이다. 잠재적인 에피-쉬프터는 당업계에 공지된 임의의 다수의 통상적인 기술들을 사용하고 본원에 기재된 방법들 중 어느 하나를 사용하여 세포에 외인성 첨가시 세포 진입하는 이들의 능력에 대해 평가될 수 있다. 예를 들면, 잠재적인 에피-쉬프터의 세포로의 진입은 질량 분광법과 같은 당업계에 공지된 통상의 방법들에 의한 세포 내용물 추출 및 잠재적인 에피-쉬프터의 정량으로 확인될 수 있다. 이로써 세포에 진입할 수 있는 잠재적인 에피-쉬프터는 MIM으로서 동정된다.
이어서, 에피-쉬프터를 동정하기 위해, 잠재적인 에피-쉬프터는 세포의 대사 상태를 전환시키는 능력에 대해 평가된다. 잠재적인 에피-쉬프터가 세포 미세환경의 대사 상태를 전환시키는 능력은 세포에 잠재적인 에피-쉬프터를 도입(예를 들면, 외인성으로 첨가)하고 세포에서 유전자 발현의 변화(예를 들면, mRNA 또는 단백질 발현의 변화), 지질 또는 대사물 수준의 농도 변화, 생물에너지시 분자 수준의 변화, 세포 에너지 변화 및/또는 미토콘드리아 기능 또는 수의 변화 중 하나 이상을 모니터링함에 의해 평가된다. 세포 미세환경의 대사 상태를 전환시킬 수 있는 잠재적인 에피-쉬프터는 통상적으로 본원에 상세하게 기재된 임의의 분석을 사용하여 당업자가 동정할 수 있다. 잠재적인 에피-쉬프터는 추가로 환부 세포의 대사 상태를 정상적인 건강한 상태로 전환시키는 능력(또는 반대로 정상 세포의 대사 상태를 질환 상태 쪽으로 전환시키는 능력)에 대해 평가된다. 정상의 건강한 상태 쪽으로 환부 세포의 대사 상태를 전환(또는 건강한 정상 세포의 대사 상태를 환부 상태 쪽으로 전환)시킬 수 있는 잠재적인 에피-쉬프터는 따라서 에피-쉬프터로서 동정된다. 바람직한 양태에서, 에피-쉬프터는 정상의 세포의 건강 및/또는 성장에 악영향을 미치지 않는다.
본 발명의 에피메타볼릭 쉬프터는 소분자 대사물, 지질계 분자 및 단백질 및 RNA를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 소분자 내인성 대사물 부류에서 에피메타볼릭 쉬프터를 동정하기 위해, 차등 질환 상태, 진행 또는 공격성을 나타내는 세포 또는 조직의 패널에 대한 대사물 프로파일을 설정한다. 각각의 세포 또는 조직의 대사물 프로파일은 세포 또는 조직으로부터 대사물을 추출함에 이어서, 예를 들면, 지질-크로마토그래피 커플링된 질량 분광법 또는 가스-크로마토그래피 커플링된 질량 분광법 등을 포함하는 당업자에게 공지된 통상적인 방법들을 사용하는 대사물을 동정하고 정량함에 의해 결정된다. 수준 변화(예를 들면, 증가된 또는 감소된 수준)가 질환 상태, 진행 또는 공격성과 관련되는 대사물은 잠재적인 에피-쉬프터로서 동정된다.
내인성 지질계 분자 부류에서 에피메타볼릭 쉬프터를 동정하기 위해, 차등적 질환 상태, 진행 또는 공격성을 나타내는 세포 또는 조직의 패널에 대한 지질 프로파일을 설정한다. 각각의 세포 또는 조직에 대한 지질 프로파일은 지질 추출 방법들을 사용함에 이어서, 예를 들면 지질-크로마토그래피 커플링된 질량 분광법 또는 가스-크로마토그래피 커플링된 질량 분광법 등을 포함하는, 당업자에게 공지된 통상적인 방법들을 사용하여 지질을 동정하고 정량함에 의해 결정된다. 수준의 변화(예를 들면, 대량 또는 소량 수준의 증가 또는 감소)가 질환 상태, 진행 또는 공격성과 관련되는 지질은 잠재적인 에피-쉬프터로서 동정된다.
단백질 및 RNA 부류에서 에피메타볼릭 쉬프터를 동정하기 위해, 차등적인 질환 상태, 진행 또는 공격성을 나타내는 세포 또는 조직의 패널에 대한 유전자 발현 프로파일을 설정한다. 각각의 세포 또는 조직에 대한 발현 프로파일은 예를 들면, 본원에 상세히 기재된 바와 같은 표준 프로테오믹, mRNA 어레이 또는 게놈 어레이 방법을 사용하여 mRNA 및/또는 단백질 수준(들)에서 결정된다. 발현 변화(예를 들면, mRNA 또는 단백질 수준에서의 발현 증가 또는 감소)가 질환 상태, 진행 또는 공격성과 관련되는 유전자는 잠재적인 에피-쉬프터로서 동정된다.
상기된 분자 프로파일이 설정된 경우(예를 들면, 가용성 대사물, 지질계 분자, 단백질, RNA 또는 기타 생물학적 부류의 조성물), 세포 및 생화학적 경로 분석은 세포 환경에서 동정된 잠재적 에피-쉬프터 간의 공지된 연계점을 설명하기 위해 수행된다. 상기 세포 및/또는 생화학적 경로 분석에 의해 수득된 정보는 경로 및 잠재적인 에피-쉬프터를 분류하기 위해 사용될 수 있다.
질환 상태를 조정하는 에피-쉬프터의 유용성은 당업계에 의해 공지되거나 본원에 상세히 기재된 임의의 수의 분석을 사용하여 당업자가 추가로 평가하고 확인할 수 있다. 질환 상태를 조정하기 위한 에피-쉬프터의 유용성은 에피-쉬프터를 직접 외인성으로 세포 또는 유기체에 전달하여 평가될 수 있다. 질환 상태를 조정하기 위한 에피-쉬프터의 유용성은 대안적으로, 직접적으로 에피-쉬프터를 조정(예를 들면, 에피-쉬프터의 수준 또는 활성을 조절)하는 분자를 개발하여 평가될 수 있다. 질환 상태를 조정하기 위한 에피-쉬프터의 유용성은 또한 에피-쉬프터와 동일한 경로에 위치하는 유전자(예를 들면, RNA 또는 단백질 수준에서 조절되는)와 같은 다른 분자를 조절함에 의해 간접적으로 에피-쉬프터를 조정(예를 들면, 에피-쉬프터의 수준 또는 활성을 조절)하는 분자를 개발하여 평가될 수 있다.
본원에 기재된 에피메타볼로믹 방법(epimetabolomic approach)은 세포 미세환경에 존재하는 내인성 분자의 동정을 촉진시키며, 상기 내인성 분자의 수준은 유전자, mRNA 또는 단백질-기반의 기작을 통해 제어된다. 본 발명의 에피-쉬프터에 의해 유발되는, 정상 세포에서 발견되는 조절 반응 경로는 잘못 조절된(misregulated) 세포 환경 또는 병에 걸린(diseased) 세포 환경에 치료적 수치를 제공할 수 있다. 또한, 본원에 기재된 에피메타볼릭 방법(epimetabolic approach)은 임상적 환자 선별, 질환 진단 키트 또는 예측적 지시제로서의 용도를 위한 진단적 지시를 제공할 수 있는 에피-쉬프터를 동정한다.
III. MIM/에피-쉬프터를 동정하기 위해 유용한 분석
목적하는 분자 및 화합물을 분리하고 동정하기 위해 사용되는 본 발명의 기술 및 방법은 액체 크로마토그래피(LC), 고압 액체 크로마토그래피(HPLC), 질량 분광법(MS), 가스 크로마토그래피(GC), 액체 크로마토그래피/질량 분광법(LC-MS), 가스 크로마토그래피/질량 분광법(GC-MS), 핵 자기 공명(NMR), 자기 공명 이미지화(MRI), 퓨리어 변환 적외선(FT-IR), 및 유도결합 플라즈마 질량 분광법(ICP-MS)를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 질량 분광측정 기술은 추가로 자기-섹터 및 이중 초점 장비, 전파 사극자 장비, 사극자 이온 포집 장비, 타임-오브-플라이트 장비(TOF), 퓨리어 변환 이온 사이클로트론 공명 장비(FT-MS) 및 매트릭스 원조된 레이저 탈착/이온화 타임 오브 플라이트 질량 분광법(MALDI-TOF MS)의 사용을 포함하지만 이에 제한되지 않는 것으로 이해된다.
생물에너지학적 분자 수준의 정량:
환경 영향인자(예를 들면, MIM 또는 에피-쉬프터)는 후보물 에피-쉬프터가 적용된 세포의 세포 생물에너지학적 분자 수준(예를 들면, ATP, 피루베이트, ADP, NADH, NAD, NADPH, NADP, 아세틸CoA, FADH2)에서의 변화로 동정될 수 있다. 생물에너지학적 분자 수준의 예시적인 분석은 비색법, 형광 및/또는 생체발광 방법을 사용한다. 이러한 분석의 예는 하기에 제공된다.
세포내 ATP의 수준은 당업계에 공지된 다수의 분석법 및 시스템으로 측정될 수 있다. 예를 들면, 하나의 시스템에서, 용해된 세포로부터 방출된 세포질 ATP는 루시페린 및 효소 루시페라제와 반응하여 발광한다. 상기 생체발광은 생체발광측정기를 사용하여 측정하고 용해된 세포의 세포내 ATP 농도가 계산될 수 있다(EnzyLight™ ATP 분석 키트(EATP-100), BioAssay Systems, Hayward, CA). 또 다른 시스템에서, 예를 들면, ATP 및 이의 탈인산화된 형태, ADP 둘 다는 생체발광을 통해 계산되고 ATP 수준이 계산된 후, ADP는 ATP로 전환되고, 이어서 동일한 루시퍼라제 시스템 (ApoSENSOR™ ADP/ATP Ratio Assay Kit, Bio Vision Inc., Mountain View, CA)을 사용하여 검출되고 계산된다.
피루베이트는 세포 대사 경로에서 중요한 중간체이다. 피루베이트는 세포의 대사 상태에 따라 글루코스신합성을 통해 탄수화물로 전환되거나, 지방산으로 전환되거나, 아세틸 CoA를 통해 대사되거나 알라닌 또는 에탄올로 전환될 수 있다. 따라서, 피루베이트 수준의 검출은 대사적 활성 및 세포 샘플의 상태의 측정을 제공한다. 피루베이트를 검출하기 위한 한가지 분석법은 예를 들면, 비색법 및 형광측정법 둘 다를 사용하여 상이한 범위내의 피루베이트 농도를 검출하는 것이다(EnzyChrom™ Pyruvate Assay Kit (Cat# EPYR-100), BioAssay Systems, Hayward, CA).
환경 영향인자(예를 들면, MIM 또는 에피-쉬프터)는 세포에서 생에너지학적 분자의 생성 및 유지에 관여하는, 세포내 미토콘드리아에 의해 수행되는 산화적 인산화 과정에 영향을 줄 수 있다. 세포 배양물 및 샘플에서 직접 세포 에너지학적 변화를 검출하는 분석법(하기 참조) 외에, 세포에서 미토콘드리아의 개별 효소 및 복합체에 대한 화합물의 효과를 검출하고 정량하는 분석법이 존재한다. 예를 들면, MT-OXC MitoTox™ 완전한 OXPHOS 활성 분석(MitoSciences Inc., Eugene, OR)으로 미토콘드리아로부터 추출된 복합체 I 내지 V에 직접적으로 적용되는 화합물의 효과를 검출하고 정량할 수 있다. NADH 데하이드로게나제(복합체 I), 시토크롬 c 옥시다제(복합체 IV) 및 ATP 신타제(복합체 V)와 같은 개별 미토콘드리아 복합체에 대한 효과의 검출 및 정량을 위한 분석이 또한 사용가능하다(MitoSciences Inc., Eugene, OR).
세포 에너지의 측정:
환경 영향인자(예를 들면, MIM 또는 에피-쉬프터)는 또한 세포 에너지의 변화로 동정될 수 있다. 세포 에너지 측정의 한 예는 세포 배양물 배지의 산소 분자의 소비 및/또는 pH 변화에 대한 실시간 측정이다. 예를 들면, 세포의 대사 상태를 조정하는 잠재적 에피-쉬프터의 능력은 예를 들면, XF24 분석기(Seahorse, Inc.)를 사용하여 분석될 수 있다. 상기 기술은 세포의 단층에서 산소 및 pH 변화의 실시간 검출을 가능하게 하여 세포 미세환경의 생에너지를 평가할 수 있다. XF24 분석기는 호기적 대사의 척도인 산소의 소비율(OCR) 및 해당과정의 척도인 세포외 산성화(ECAR)를 측정 비교하고, 상기 둘 다는 세포 에너지의 주요 척도이다.
산화적 인산화 및 미토콘드리아 기능의 측정
산화적 인산화는 ATP가 영양 화합물의 산화를 통해 생성되는 과정이고 진핵세포에서 미토콘드리아 막에 매립된 단백질 복합체를 통해 수행된다. 대부분의 유기체 세포에서 ATP의 1차 공급원으로서, 산화적 인산화 활성에서의 변화는 세포 내에서 대사 및 에너지 균형을 강하게 변화시킬 수 있다. 본 발명의 몇몇 양태에서, 환경 영향인자(예를 들면, MIM 또는 에피-쉬프터)는 산화적 인산화에 대한 이들의 효과에 의해 검출되고/되거나 동정될 수 있다. 몇몇 양태에서, 환경 영향인자(예를 들면, MIM 또는 에피-쉬프터)는 전자 수송 체인 및 ATP 합성을 포함하지만 이에 제한되지 않는, 산화적 인산화의 특정 측면에 대한 이들의 효과에 의해 검출되고/되거나 동정될 수 있다.
산화적 인산화에 관여하는 과정을 수행하는 미토콘드리아의 막 매립된 단백질 복합체는 특수한 일을 수행하고 I, II, III 및 IV의 번호로 지정된다. 이들 복합체는 내막관통 ATP 신타제(또한 복합체 V로서 공지됨)와 함께 산화적 인산화 과정에 관여하는 주요 실체이다. 일반적으로 미토콘드리아 기능 및 특히 산화적 인산화 과정에 대한 환경 영향인자(예를 들면, MIM 또는 에피-쉬프터)의 효과를 조사할 수 있는 분석법외에도 다른 복합체와는 별도의 개별 복합체에 대한 에피-쉬프터의 효과를 조사하기 위해 사용될 수 있는 분석법이 사용가능하다.
또한, NADH-조효소 Q 옥시도리덕타제 또는 NADH 데하이드로게나제로서 공지된 복합체 I은 전자 수송 체인에서 첫번째 단백질이다. 몇몇 양태에서, 복합체 I에 의한 NAD+의 생산에 대한 에피-쉬프터의 효과의 검출 및 정량이 수행될 수 있다. 예를 들면, 상기 복합체는 96웰 플레이트에서 샘플로부터 면역포획될 수 있고; NADH의 NAD+로의 산화는 450nM에서 증가된 흡광도를 갖는 염료 분자의 환원과 함께 동시에 일어난다(참조: Complex I Enzyme Activity Microplate Assay Kit, MitoSciences Inc., Eugene, OR).
또한 시토크롬 c 옥시다제(COX)로서 공지된 복합체 IV는 전자 수송 체인에서 마지막 단백질이다. 몇몇 양태에서, 복합체 IV에 의한 시토크롬 c의 산화 및 산소의 물로의 환원에 대한 에피-쉬프터의 효과의 검출 및 정량을 수행할 수 있다. 예를 들면, COX는 마이크로웰 플레이트에서 면역포획될 수 있고 COX의 산화는 비색법 분석으로 측정된다(참조: Complex IV Enzyme Activity Microplate Assay Kit, MitoSciences Inc., Eugene, OR).
산화적 인산화 과정의 최종 효소는 ATP 신타제(복합체 V)이고, 이는 다른 복합체에 의해 생성된 양성자 구배를 사용하여 ADP로부터 ATP가 합성되도록 한다. 몇몇 양태에서, ATP 신타제의 활성에 대한 에피-쉬프터 효과의 검출 및 정량을 수행할 수 있다. 예를 들면, 샘플에서 ATP 신타제의 활성과 ATP 신타제의 양 둘 다는 마이크로웰 플레이트 웰에서 면역포획된 ATP 신타제에 대해 측정될 수 있다. 상기 효소는 또한 특정 조건하에서 ATP아제로서 기능할 수 있고, 따라서 ATP 신타제 활성에 대한 상기 분석에서, ATP가 ADP로 환원되는 비율은 NADH의 NAD+로의 동시 산화를 검출함에 의해 측정된다. ATP의 양은 ATP아제에 대해 표지된 항체를 사용하여 계산된다(참조: ATP synthase Duplexing (Activity + Quantity) Microplate Assay Kit, MitoSciences Inc., Eugene, OR). 산화적 인산화에 대한 추가의 분석은 복합체 II 및 III의 활성에 대한 효과를 시험하는 분석법을 포함한다. 예를 들면, MT-OXC MitoTox™ 완전한 OXPHOS 시스템(MitoSciences Inc., Eugene, OR)을 사용하여 복합체 I, IV 및 V 뿐만 아니라 복합체 II 및 III에 대한 화합물의 효과를 평가하여 전체 산화적 인산화 시스템에 대한 화합물의 효과에 대한 데이타를 제공할 수 있다.
상기된 바와 같이, 온전한 세포 샘플의 실시간 관찰은 세포 배양 배지에서 산소 소비 및 pH의 변화에 대한 프로브를 사용하여 수행될 수 있다. 세포 에너지에 대한 이들 분석은 미토콘드리아 기능의 광범위한 개관 및 샘플 세포 내에서 미토콘드리아의 활성에 대한 잠재적인 환경 영향인자(예를 들면, MIM 또는 에피-쉬프터)의 효과를 제공한다.
환경 영향인자(예를 들면, MIM 또는 에피-쉬프터)는 또한 미토콘드리아 투과성 전이(MPT)(이러한 현상은 미토콘드리아 막이 미토콘드리아 투과성 전이 공극(MPTP)의 형성으로 인해 투과성이 증가하여 발생한다)에 영향을 줄 수 있다. 미토콘드리아 투과성의 증가는 미토콘드리아를 팽윤시켜 산화적 인산화 및 ATP 생성을 못하게 하여 세포를 사멸시킨다. MPT는 아폽토시스 유도에 관여될 수 있다(문헌참조: Halestrap, A. P., Biochem. Soc. Trans. 34:232-237 (2006) and Lena, A. et al. Journal of Translational Med. 7: 13-26 (2009), 이는 이의 전문이 본원에 참조로서 인용된다)
몇몇 양태에서, MPT 및 MPTP의 형성, 중단 및/또는 효과에 대한 환경 영향인자(예를 들면, MIM 또는 에피-쉬프터)의 효과의 검출 및 정량을 측정한다. 예를 들면, 분석은 미토콘드리아 및 다른 세포질 구획의 내막내에 위치하는 특수 염료 분자(칼세인)의 사용을 통해 MPT를 검출할 수 있다. 또 다른 분자 CoCl2의 적용은 세포질에서 칼세인 염료의 형광을 억제하는 작용을 한다. 그러나, CoCl2는 미토콘드리아의 내부로 접근할 수 없고 따라서 미토콘드리아내 칼세인 형광은 MPT가 발생하여 CoCl2가 MPTP를 통해 미토콘드리아의 내부에 접근할 수 없는 경우 억제되지 않는다. 미토콘드리아 특이적 형광의 소실은 MPT가 발생하였음을 지시한다. 유동 세포분석법를 사용하여 세포 및 기관의 형광을 평가할 수 있다(참조: MitoProbeTM Transition Pore Assay Kit, Molecular Probes, Eugene, OR). 추가의 분석은 실험 결과를 평가하기 위해 형광 현미경을 이용한다(참조: Image-iT™ LIVE Mitochondrial Transition Pore Assay Kit, Molecular Probes, Eugene, OR).
세포 증식 및 염증의 측정
발명의 몇몇 양태에서, 환경 영향인자(예를 들면, MIM 또는 에피-쉬프터)는 세포 증식 및/또는 염증과 관련된 분자의 생산 또는 활성에 대한 이들의 효과에 의해 동정되고 평가될 수 있다. 이들 분자는 사이토킨, 성장 인자, 호르몬, 세포외 매트릭스의 성분, 케모킨, 신경펩타이드, 신경전달물질, 신경성장인자(neurotrophin) 및 세포 시그날 전달에 관여하는 다른 분자, 및 세포내 분자, 예를 들면, 시그날 전달에 관여하는 것들을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
혈관 내피 성장 인자(VEGF)는 강력한 혈관형성, 맥관형성 및 분열촉진 성질을 갖는 성장 인자이다. VEGF는 내피 투과성 및 팽윤을 자극하고, VEGF 활성은 류마티스 관절염, 전이성 암, 노화 황반 변성 및 당뇨망막병증을 포함하는 많은 질환 및 장애에 연루되어 있다.
본 발명의 몇몇 양태에서, 환경 영향인자(예를 들면, MIM 또는 에피-쉬프터)는 VEGF의 생성에 대한 이의 효과에 의해 동정되고 확인될 수 있다. 예를 들면, 저산소 조건 또는 산증과 유사한 조건하에서 유지된 세포는 증가된 VEGF 생성을 나타낼 것이다. 배지로 분비된 VEGF는 시판되는 항-VEGF 항체 (R&D Systems, Minneapolis, MN)를 사용한 ELISA 또는 기타 항체 기반 분석을 사용하여 분석될 수 있다. 본 발명의 몇몇 양태에서, 에피-쉬프터는 VEGF에 대한 세포의 반응성에 대한 이의 효과(들) 및/또는 VEGF 수용체의 발현 또는 활성에 대한 이의 효과(들)를 기준으로 동정되고/되거나 확인될 수 있다.
자가면역 질환 뿐만 아니라 건강한 면역계 기능 둘 다에 연루된 종양 괴사 인자(TNF)는 염증 및 면역계 활성화의 주요 매개인자이다. 본 발명의 몇몇 양태에서, 에피-쉬프터는 TNF의 생성 또는 활성에 대한 이의 효과에 의해 동정되고 확인될 수 있다. 예를 들면, 배양된 세포에 의해 생산되고 배지로 분비된 TNF는 당업계에 공지된 ELISA 및 기타 항체 기반 분석을 통해 정량될 수 있다. 추가로, 몇몇 양태에서, 환경 영향인자는 TNF(Human TNF RI Duoset, R&D Systems, Minneapolis, MN)에 대한 수용체의 발현에 대한 이의 효과(들)에 의해 동정되고 확인될 수 있다.
세포외 매트릭스(ECM)의 성분은 세포 및 조직의 구조 둘 다에서 그리고 시그날 전달 과정에서 역할을 수행한다. 예를 들면, 잠재하는 형질전환 성장 인자 베타 결합 단백질은 ECM 내에 형질전환 성장 인자 베타(TGFβ)의 저장소를 생성시키는 ECM 성분이다. 매트릭스 결합된 TGFβ는 이후에 매트릭스 리모델링 과정 동안에 방출될 수 있고, 인근 세포에 대해 성장 인자 효과를 발휘할 수 있다(문헌참조: Dallas, S. Methods in Mol. Biol. 139:231-243 (2000)).
몇몇 양태에서, 환경 영향인자(예를 들면, MIM 또는 에피-쉬프터)는 배양된 세포에 의한 ECM의 생성에 대한 이의 효과(들)에 의해 동정되거나 확인될 수 있다. 연구자들은 ECM의 조성물 뿐만 아니라 세포에 의한 ECM의 생성이 연구되고 정량될 수 있는 기술을 개발하였다. 예를 들면, 세포에 의한 ECM의 합성은 항온처리 전에 하이드로겔 내에 세포를 매립시킴에 의해 평가될 수 있다. 생화학적 및 기타 분석은 세포 회수 및 하이드로겔의 분해 후 세포에 의해 생성된 ECM에 대해 수행된다(문헌참조: Strehin, I. and Elisseeff, J. Methods in Mol. Bio. 522:349-362 (2009)).
몇몇 양태에서, 유기체 중 ECM의 생성, 상태 또는 부재 또는 이의 성분들 중 하나에 대한 환경 영향인자(예를 들면, MIM 또는 에피-쉬프터)의 효과가 동정되고 확인될 수 있다. 조건적 녹아웃(KO) 마우스를 생성시키기 위한 기술이 개발되었고 이는 별개 유형의 세포에서 또는 발육의 특정 단계에서만 특정 ECM 유전자가 녹아웃되도록 한다(문헌참조: Brancaccio, M. et al. Methods in Mol Bio. 522: 15-50 (2009)). 따라서, 특정 조직 또는 특정 발육 단계에서 특정 ECM 성분의 활성 또는 부재에 대한 에피-쉬프터 또는 잠재적 에피-쉬프터의 적용 또는 투여 효과가 평가될 수 있다.
형질막 통합성 및 세포사멸의 측정
환경 영향인자(예를 들면, MIM 또는 에피-쉬프터)는 세포 샘플의 형질막 통합성을 변화시키고/시키거나 세포사멸의 증가되거나 감소된 가능성을 입증하는 아폽토시스, 괴사 또는 세포 변화를 겪는 세포의 수 또는 %의 변화에 의해 동정될 수 있다.
락테이트 데하이드로게나제(LDH)에 대한 분석은 세포 상태 및 손상 수준에 대한 측정을 제공할 수 있다. LDH는 안정하고 상대적으로 풍부한 세포질 효소이다. 형질막이 물리적 통합성을 상실하는 경우, LDH는 세포외 구획으로 이탈한다. 보다 높은 농도의 LDH는 보다 높은 수준의 형질막 손상 및 세포 사멸과 관련된다. LDH 분석의 예는 샘플 중에 LDH의 수준을 검출하고 동정하기 위한 비색법 시스템을 사용하는 분석을 포함하고 여기서, 환원된 형태의 테트라졸륨 염은 LDH 효소(QuantiChrom™ Lactate Dehydrogenase Kit (DLDH-100), BioAssay Systems, Hayward, CA; LDH Cytotoxicity Detection Kit, Clontech, Mountain View, CA)의 활성을 통해 생성된다.
아폽토시스는 다양한 상이한 개시 반응들을 가질 수 있는 프로그램화된 세포 사멸 과정이다. 다수의 분석이 아폽토시스를 진행하는 세포의 비율 및/또는 수의 변화를 검출할 수 있다. 아폽토시스를 검출하고 정량하기 위해 사용되는 한가지 유형의 분석은 카스파제 분석이다. 카스파제는 아폽토시스 동안에 단백질분해 절단을 통해 활성화되는 아스파르트산 특이적 시스테인 프로테아제이다. 활성화된 카스파제를 검출하는 분석의 예는 PhiPhiLux® (Oncolmmunin, Inc., Gaithersburg, MD) 및 Caspase-Glo® 3/7 분석 시스템(Promega Corp., Madison, WI)을 포함한다. 비교 샘플에서 아폽토시스를 검출할 수 있고 아폽토시스를 진행하는 세포의 % 또는 수의 변화를 검출할 수 있는 추가의 분석은 TUNEL/DNA 단편화 분석을 포함한다. 이들 분석은 아폽토시스의 수행 단계 동안에 뉴클레아제에 의해 생성되는 180 내지 200개 염기쌍 DNA 단편을 검출한다. 예시적인 TUNEL/DNA 단편화 분석은 동일계 세포 사멸 검출 키트(Roche Applied Science, Indianapolis, IN) 및 DeadEnd™ 비색법 및 형광측정 TUNEL 시스템(Promega Corp., Madison, WI)을 포함한다.
몇몇 아폽토시스 분석은 아폽토시스 및/또는 비-아폽토시스 상태와 관련된 단백질을 검출하고 정량한다. 예를 들면, 멀티톡스-플루오르 멀티플렉스 세포독성 분석(Promega Corp., Madison, WI)은 단일 기질, 형광 측정 시스템을 사용하여 생존 및 죽은 세포에 특이적인 프로테아제를 검출하고 정량함에 따라서 세포 또는 조직 샘플에서 아폽토시스를 진행한 세포에 대한 생존 세포의 비율을 제공한다.
아폽토시스를 검출하고 정량하기 위해 사용가능한 추가의 분석은 세포의 투과성을 검출하는 분석(예를 들면, APOPercentage™ APOPTOSIS Assay, Biocolor, UK) 및 어넥신 V에 대한 분석(예를 들면, Annexin V-Biotin Apoptosis Detection Kit, Bio Vision Inc., Mountain View, CA)을 포함한다.
IV. 육종 치료
본 발명은 환경 영향인자, 예를 들면, MIM 또는 에피-쉬프터, 예를 들면, CoQ10 분자(예를 들면, CoQ10, CoQ10의 빌딩 블록, CoQ10의 유도체, CoQ10의 유사체, CoQ10의 대사물 또는 조효소 생합성 경로의 중간체)를 육종을 치료하거나 예방하기에 충분한 양으로 사람에게 투여하여 육종을 치료하거나 예방함을 포함하는, 사람에서 육종을 치료하거나 예방하는 방법을 제공한다. 바람직한 양태에서, 사람에서 육종을 치료하거나 예방하는 방법은 CoQ10 분자를 육종을 치료하거나 예방하기에 충분한 양으로 사람에게 투여하여 육종을 치료하거나 예방함을 포함한다.
본 발명은 또한 CoQ10 분자의 조성물 및 이를 제조하는 방법을 제공한다. 하나의 양태에서, 본 발명은 CoQ10 조성물 및 이를 제조하는 방법들을 제공한다. 바람직하게, 상기 조성물은 적어도 약 1% 내지 약 25% CoQ10 w/w를 포함한다. CoQ10은 제조원[Asahi Kasei N&P (Hokkaido, Japan) as UBIDECARENONE (USP)]으로부터 수득될 수 있다. CoQ10은 또한 제조원[Kaneka Q10 as Kaneka Q10 (USP UBIDECARENONE), 분말 형태(Pasadena, Texas, USA)]으로부터 수득될 수 있다. 본원에 예시된 방법에 사용되는 CoQ10은 하기의 특성을 갖는다: 잔류 용매는 USP 467 요건을 충족하고; 물 함량은 0.0% 미만, 0.05% 미만 또는 0.2% 미만이고; 발화시 잔류물이 0.0%, 0.05% 미만, 또는 0.2% 미만이고; 중금속 함량이 0.002% 미만, 또는 0.001% 미만이고; 순도는 98 내지 100% 또는 99.9%, 또는 99.5%이다. 상기 조성물을 제조하는 방법들이 본원에 제공된다.
본원에 사용된 용어 또는 표현 "발암성 장애(oncological disorder)", "암", "신생물" 및 "종양"은 상호교환적으로 사용되고 단수 또는 복수 형태 어느 것에서도 이들이 숙주 유기체에 병적인 상태로 되게 하는 악성 전환을 진행하는 세포들을 언급한다. 1차 암 세포들(즉, 악성 전환 부위 근처로부터 수득된 세포)은 널리 확립된 기술, 특히 조직학적 조사에 의해 비암성 세포로부터 용이하게 구분될 수 있다. 본원에 사용된 암 세포의 정의는 1차 암 세포를 포함하지만 또한 암 전구 세포 또는 암 세포 선조체로부터 유래된 임의의 세포 뿐만 아니라 암 줄기 세포를 포함한다. 이것은 전이된 암세포 및 암세포로부터 유래된 시험관내 배양물 및 세포주를 포함한다. 통상적으로 고형 종양으로서 나타나는 암 유형을 언급하는 경우, "임상적으로 검출가능한" 종양은 종양 매스(tumor mass)를 기초로 검출가능한 종양, 예를 들면, CAT 스캔, MR 이미지화, X-선, 초음파 또는 촉진에 의해 검출가능한 종양 및/또는 환자로부터 수득가능한 샘플에서 하나 이상의 암 특이적 항원의 발현 때문에 검출가능한 종양이다.
용어 "육종"은 일반적으로 배아 연결 조직과 같은 물질로 이루어지고 일반적으로 미소섬유 또는 균일 물질에 매립된 밀접하게 팩킹된 세포들로 구성된 종양을 언급한다. 본 발명의 환경 영향인자로 치료될 수 있는 육종의 예는 유잉 계열의 종양(예를 들면, 유잉 육종(또한 골의 유잉 육종으로서 언급됨), 골외성 유잉(EOE) 및 말초 원발성 신경외배엽성 종양(PPNET)), 연골육종, 섬유육종, 림포육종, 흑색육종, 점액육종, 골육종, 아베메티(Abemethy) 육종, 지방조직 육종, 지방육종, 소와상 기포 연질부 육종, 사기질모세포 육종, 포도상 육종, 녹색종 육종, 융모막암종, 배아 육종, 윌름 종양 육종, 자궁내막 육종, 간질성 육종, 유잉 육종, 근막성 육종, 섬유아세포 육종, 거대 세포 육종, 과립구 육종, 호지킨 육종, 특발성 다중 색소 출혈성 육종, B 세포의 면역아구성 육종, 림프종, T세포의 면역아구성 육종, 얀센(Jensen) 육종, 카포시(Kaposi) 육종, 쿠프퍼(Kupffer) 세포 육종, 혈관육종, 백혈구육종, 악성 간엽종 육종, 골막성 육종, 망상적혈구 육종, 로우스(Rous) 육종, 장액낭 육종, 활액막 육종, 및 확장성 육종을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
따라서, 하나의 양태에서, 본 발명의 치료 또는 예방 방법은 유잉 육종, 골외성 유잉(EOE), 말초 원발성 신경외배엽성 종양(PPNET) 및 아스킨(Askin) 종양으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 육종의 치료 또는 예방을 포함한다. 하나의 양태에서, 육종은 유잉 육종이다. 하나의 양태에서, 상기 육종은 EOE이다. 하나의 양태에서, 상기 육종은 PPNET이다. 하나의 양태에서, 육종은 아스킨 종양이다.
몇몇 양태에서, 상기 육종은 아폽토시스의 부재를 특징으로 한다. 다른 양태에서, 상기 육종은 증가된 혈관형성을 특징으로 한다. 다른 양태에서, 상기 육종은 세포외 매트릭스(ECM) 분해를 특징으로 한다. 또 다른 양태에서, 상기 육종은 세포 사이클 조절 상실을 특징으로 한다. 여전히 다른 양태에서, 상기 육종은 대사적 지배에 있어서 미토콘드리아 산화적 인산화로부터 락테이트 및 당분해 유출에 대한 증가된 활용 및/또는 의존성으로의 전환을 특징으로 한다. 추가의 양태에서, 상기 육종은 면역 감시를 회피하는 적응된 면역조정 기작을 특징으로 한다. 하나의 양태에서, 상기 육종은 상기 특징들, 예를 들면, 증가된 혈관형성 및 ECM 분해 중 적어도 2개를 특징으로 한다. 하나의 양태에서, 상기 육종은 상기 특징들 중 적어도 3개를 특징으로 한다. 하나의 양태에서, 상기 육종은 상기 특징들 중 적어도 4개를 특징으로 한다. 하나의 양태에서, 상기 육종은 상기 특징들 중 적어도 5개를 특징으로 한다. 하나의 양태에서, 상기 육종은 상기 모든 6개의 특징들을 특징으로 한다.
따라서, 몇몇 양태에서, 본 발명의 CoQ10 분자는 아폽토시스에 대한 능력을 복구하거나 아폽토시스를 유도함에 의해 기능한다. 다른 양태에서, 본 발명의 CoQ10 분자는 혈관형성을 저하시키거나 감소시키거나 억제함에 의해 기능한다. 여전히 다른 양태에서, 본 발명의 CoQ10 분자는 재설정되는 세포외 매트릭스를 복구함에 의해 기능한다. 다른 양태에서, 본 발명의 CoQ10 분자는 세포 사이클 조절을 복구함에 의해 기능한다. 여전히 다른 양태에서, 본 발명의 CoQ10 분자는 해당과정에서 미토콘드리아 산화적 인산화로의 대사적 지배를 복귀 전환시킴에 의해 기능한다. 추가의 양태에서, 본 발명의 CoQ10 분자는 면역 감시를 복구시키거나 암 세포를 외래 물질로서 인지하는 신체의 능력을 복구시킴에 의해 기능한다.
임의의 특정 이론에 구애되는 것 없이, 통상적으로 암, 예를 들면, 육종을 형성하기 위해 집합되는 협력적인 일련의 반응들이 있는 것으로 사료된다. 즉, 몇몇 양태에서, 육종과 같은 암은 단순히 1 유전자-1 단백질-근원의 인과 관계에 의존하지 않는다. 몇몇 양태에서, 육종과 같은 암은 종양, 변화된 조직 상태, 예를 들면, 전이의 잠재력을 허용하고 면역감시의 부재 및/또는 변화된 상태의 혈관형성을 허용하는 왕성하게 손상된 세포외 매트릭스 통합성이 되는 조직 변화 및 변경으로 나타나는 생리학적 질환이다.
1차 암 세포, 예를 들면, 1차 육종 세포(즉, 악성 전환 부위 근처로부터 수득된 세포)는 널리 확립된 기술, 특히 조직학적 검사에 의해 비암성 세포로부터 용이하게 구분될 수 있다. 본원에 사용된 암 세포의 정의는 1차 암세포, 및 암 전구 세포 또는 암세포 선조체로부터 유래된 임의의 세포 뿐만 아니라 암 줄기 세포를 포함한다. 이것은 전이된 암 세포 및 암 세포로부터 유래된 시험관내 배양물 및 세포주를 포함한다. 통상적으로 고형 종양으로서 나타나는 암 유형을 언급하는 경우, "임상적으로 검출가능한" 종양은 종양 매스를 기초로 검출가능한 종양, 예를 들면, CAT 스캔, MR 이미지화, X-선, 초음파 또는 촉진에 의해 검출가능한 것 및/또는 환자로부터 수득가능한 샘플에서 하나 이상의 암 특이적 항원의 발현 때문에 검출가능한 종양이다.
몇몇 양태에서, 본 발명의 화합물, 예를 들면, 본 발명의 조효소 Q10 분자를 사용하여 이를 필요로 하는 피검체에서 조효소 Q10 반응성 육종을 치료할 수 있다. 상기 표현 "조효소 Q10 반응성 육종" 또는 "CoQ1O 반응성 육종"은 조효소 Q10의 투여에 의해 치료되거나 예방되거나 달리 완화될 수 있는 육종을 포함한다. 본원에 추가로 기재된 바와 같은 특정 이론에 구애되는 것 없이, CoQ10은 적어도 부분적으로 세포 미세환경으로의 대사 전환, 예를 들면, 정상 상태 세포에서의 산화적 인산화의 유형 및/또는 수준으로의 전환을 유도함에 의해 기능하다고 여겨진다. 따라서, 몇몇 양태에서, CoQ1O 반응성 육종은 세포 미세환경의 변화된 대사로부터 발생하는 육종이다. 조효소 Q10 반응성 육종은 예를 들면, 해당과정 및 락테이트 생합성쪽으로만 편중될 수 있는 육종을 포함한다.
일반적으로, CoQ1O 분자(예를 들면, CoQ1O, CoQ10의 빌딩 블록, CoQ1O의 유도체, CoQ10의 유사체, CoQ10의 대사물, 또는 조효소 생합성 경로의 중간체)를 사용하여 예방적으로 또는 치료적으로 임의의 신생물을 치료할 수 있다. 하나의 양태에서, CoQ1O 분자를 사용하여 육종을 치료하거나 예방한다. 하나의 양태에서, CoQ1O 분자는 유잉 계열의 종양을 치료하기 위해 사용된다. 하나의 양태에서, 유잉 계열의 종양은 유잉 육종이다.
본원에 사용된 암 세포의 정의는 혐기성 해당과정(예를 들면, 해당과정에 이어서 세포질내에서 락트산 발효), 호기성 해당과정(예를 들면, 해당과정에 이어서 미토콘드리아내에서 피루베이트의 산화) 또는 혐기성 해당과정 및 호기성 해당과정의 조합에 의해 에너지를 생산하는 암 세포를 포함하는 것으로 의도된다. 하나의 양태에서, 암 세포는 주로 혐기성 해당과정(예를 들면, 세포 에너지의 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 이상은 혐기성 해당과정에 의해 생성된다)에 의해 에너지를 생산한다. 하나의 양태에서, 암 세포는 주로 호기성 해당과정(예를 들면, 세포 에너지의 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 이상은 혐기성 해당과정에 의해 생성된다)에 의해 에너지를 생산한다. 본원에 사용된 암 세포의 정의는 또한 혐기성 해당과정에 의해 에너지를 생성하는 세포 및 호기성 해당과정에 의해 에너지를 생성하는 세포를 포함하는 암 세포 집단 또는 암 세포의 혼합물을 포함하는 것으로 의도된다. 하나의 양태에서, 암 세포 집단은 주로 혐기성 해당과정(예를 들면, 상기 집단 중 세포의 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 이상은 혐기성 해당과정에 의해 에너지를 생산한다)에 의해 에너지를 생산하는 세포를 포함한다. 하나의 양태에서, 암 세포 집단은 주로 호기성 해당과정(예를 들면, 상기 집단 중 세포의 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 이상)에 의해 에너지를 생산하는 세포를 포함한다.
본원에 사용된 용어 "글루코스의 혐기적 사용" 또는 "혐기성 해당과정"은 해당과정 후 세포질내에서 락트산 발효에 의한 세포의 에너지 생산을 언급한다. 예를 들면, 많은 암 세포들은 혐기성 해당과정에 의해 에너지를 생산한다.
본원에 사용된 용어 "호기성 해당과정" 또는 "미토콘드리아 산화적 인산화"는 해당과정 후 미토콘드리아 내에서 피루베이의 산화에 의한 세포 에너지 생산을 언급한다.
본원에 사용된 용어 "글루코스의 혐기적 사용을 차단하고 미토콘드리아 산화적 인산화를 증강시킬 수 있는"은 세포의 대사 상태를 혐기성 해당과정에서 호기성 해당과정 또는 미토콘드리아 산화적 인산화로 전환 또는 변화를 유도하는 환경 영향인자(예를 들면, 에피메타볼릭 쉬프터)의 능력을 언급한다.
본 발명의 몇몇 양태에서, 치료되는 육종은 통상적으로 치료 유효 수준에서 활성제가 전신 전달될 것으로 예상되는 국소적 투여를 통해 치료되는 장애가 아니다. 본원에 사용된 용어 "국소적 투여를 통해 통상적으로 치료되는 장애가 아닌"은 치료제의 국소적 투여를 통해 통상적으로 또는 일상적으로 치료되는 것이 아니라, 예를 들면, 치료제의 정맥내 투여를 통해 통상적으로 치료되는 육종을 언급한다.
본 발명은 또한 CoQ10 분자(예를 들면, CoQ10, CoQ10의 빌딩 블록, CoQ10의 유도체 및 CoQ10의 유사체, CoQ10의 대사물 또는 조효소 생합성 경로의 중간체)를 덜 공격성이거나 비공격성인 발암성 장애용으로 사용되거나 선택된 투여량 계획보다 낮게 선택된 용량으로 사람에게 투여하여 공격적 발암성 장애를 치료하거나 예방함을 포함하는, 사람에서 공격적 발암성 장애를 치료하거나 예방하는 방법을 제공한다. 관련 측면에서, 본 발명은 환경 영향인자를 공격적 발암성 장애용으로 사용되거나 선택된 투여량 계획보다 높게 선택된 용량으로 사람에게 투여하여 비-공격적 발암성 장애를 치료하거나 예방함을 포함하는, 사람에서 비-공격적 발암성 장애를 치료하거나 예방하는 방법을 제공한다.
본원에 사용된 용어 "공격적 발암성 장애"는 급속 성장 종양을 포함하는 발암성 장애를 언급한다. 공격적 발암성 장애는 통상적으로 치료적 치료에 응답하지 않거나 불량하게 응답한다. 공격적 발암성 장애의 예는 췌장 암종, 간세포 암종, 유잉 육종, 전이성 유방암, 전이성 흑색종, 뇌 암(성상세포종, 신경교아세포종), 신경내분비암, 결장암, 폐암, 골육종, 안드로겐과 무관한 전립선 암, 난소암 및 비호지킨 림프종을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
본원에 사용된 용어 "비공격적 발암성 장애"는 느리게 성장하는 종양을 포함하는 발암성 장애를 언급한다. 비공격적 발암성 장애는 통상적으로 치료적 치료에 적당히 또는 순응적으로 응답한다. 비-공격적 발암성 장애의 예는 비전이성 유방암, 안드로겐 의존성 전립선암, 소세포 폐암 및 급성 림프구 백혈병을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 하나의 양태에서, 비공격적 발암성 장애는 공격적 발암성 장애가 아닌 임의의 발암성 장애를 포함한다.
본 발명은 또한 육종을 앓는 사람 피검체를 선별하고 상기 사람에게 치료 유효량의 조효소 Q10 분자(예를 들면, CoQ10, CoQ10의 빌딩 블록, CoQ10의 유도체, CoQ10의 유사체, CoQ10의 대사물 또는 조효소 생합성 경로의 중간체)를 투여하여 사람에서 육종 세포의 세포골격 구조를 붕괴시킴을 포함하는, 사람의 육종 세포에서 세포골격 구조를 붕괴시키는 방법을 제공한다. 하나의 양태에서, 본 발명의 방법은 하나 이상의 세포골격 유전자 또는 단백질의 발현을 상향조절함을 포함한다.
하나의 양태에서, CoQ10 분자(예를 들면, CoQ10, CoQ10의 빌딩 블록, CoQ10의 유도체, CoQ10의 유사체, CoQ10의 대사물 또는 조효소 생합성 경로의 중간체)는 종양 크기를 감소시키고/시키거나 종양 성장을 억제하고/하거나 종양 함유 피검체의 생존 시간을 연장시킨다. 따라서, 본 발명은 또한 유효하고 비독성량의 CoQ10 분자(예를 들면, CoQ10, CoQ10의 빌딩 블록, CoQ10의 유도체, CoQ10의 유사체, CoQ10의 대사물 또는 조효소 생합성 경로의 중간체)를 사람 또는 동물에게 투여함에 의해 사람 또는 기타 동물에서 종양을 치료하는 방법에 관한 것이다. 당업자는 통상적인 실험에 의해 유효하고 비독성량이 악성 종양을 치료할 목적인지를 결정할 수 있다. 예를 들면, 치료적 활성량의 CoQ10 분자(예를 들면, CoQ10, CoQ10의 빌딩 블록, CoQ10의 유도체 및 CoQ10의 유사체, CoQ10의 대사물 또는 조효소 생합성 경로의 중간체)는 피검체의 질환 단계(예를 들면, 단계 I에서 단계 IV), 연령, 성별, 의학적 합병증(예를 들면, 면역억제된 병태 또는 질환) 및 체중, 및 피검체에서 목적하는 반응을 유발하는 CoQ10 분자의 능력과 같은 인자들에 따라 다양할 수 있다. 상기 투여량 계획은 최적의 치료적 반응을 제공하도록 조정될 수 있다. 예를 들면, 수개의 나누어진 용량은 매일 투여되거나 상기 용량은 치료적 상황의 긴박함에 의해 나타나는 바와 같이 비례적으로 감소시킬 수 있다.
하나의 양태에서, 조효소 Q10 분자, 예를 들면, CoQ10은 6주 이상 동안 24시간 마다 1회 이상 국소적으로 적용된다.
하나의 양태에서, 조효소 Q10 분자, 예를 들면, CoQ10은 피부 제곱 센티미터 당 CoQ10 크림 0.5 내지 10mg의 투여량으로 CoQ10 크림 형태로 투여되고, 여기서, CoQ10 크림은 1 내지 5%의 조효소 Q10을 포함한다. 하나의 양태에서, CoQ10 크림은 조효소 Q10 약 3%를 포함한다. 하나의 양태에서, 조효소 Q10은 피부 제곱 센티미터 당 CoQ10 크림 3 내지 5mg의 투여량으로 CoQ10 크림 형태로 투여되고, 이때CoQ10 크림은 1 내지 5%의 조효소 Q10을 포함한다. 하나의 양태에서, CoQ10 크림은 조효소 Q10 약 3%를 포함한다.
상기 치료 또는 예방 방법들의 특정 양태에서, 상기 방법은 ANGPTL3, CCL2, CDH5, CXCL1, CXCL3, PRMT3, HDAC2, 산화질소 신타제 bNOS, 아세틸 포스포 히스톤 H3 AL9 S10, MTA 2, 글루탐산 데카복실라제 GAD65 67, KSR, HDAC4, BOB1 OBF1, a1신트로핀, BAP1, 임포르티나 57, αE-카테닌, Grb2, Bax, 프로테아좀 26S 서브유니트 13 (엔도필린 B1), 액틴형 6A (진핵세포 개시 인자 4A11), 핵 클로라이드 채널 단백질, 프로테아좀 26S 서브유니트, 디스뮤타제 Cu/Zn 슈퍼옥사이드, 트랜슬린-결합 인자 X, 아비산염 전위 ATP아제 (스퍼민 신테타제), 리보솜 단백질 SA, dCTP 피로포스파타제 1, 프로테아좀 베타 3, 프로테아좀 베타 4, 산 포스파타제 1, 디아제팜 결합 억제제, 알파 2-HS 당단백질 (보스 토러스, 소), 리보솜 단백질 P2 (RPLP2); 히스톤 H2A, 마이크로튜불 결합 단백질, 프로테아좀 알파 3, 진핵세포 해독 연장 인자 1 델타, 라민 B1, SMT 3, mif two 3 동족체 2의 억제인자, 열 쇼크 단백질 27kD, hnRNP C1/C2, 진핵세포 해독 연장 인자 1 베타 2, HSPC-300 유사체, DNA 지시된 DNA 폴리머라제 에피슬론 3; (캐노피 2 동족체), LAMA5, PXLDC1, p300 CBP, P53R2, 포스파티딜세린 수용체, 사이토케라틴 펩타이드 17, 사이토케라틴 펩타이드 13, 뉴로필라멘트 160 200, Rab5, 필렌신, P53R2, MDM2, MSH6, 열 쇼크 인자 2, AFX, FLIPg d, JAB 1, 미오신, MEKK4, cRaf pSer621, FKHR FOXO1a, MDM2, Fas 리간드, P53R2, 미오신 조절 경쇄, hnRNP C1/C2, 유비퀼린 1 (포스파타제 2A), hnRNP C1/C2, 알파 2-HS 당단백질 (보스 토러스, 소), 베타 액틴, hnRNP C1/C2, 열 쇼크 단백질 70kD, 베타 튜불린, ATP 의존성 헬리카제 II, 진핵세포 해독 연장 인자 1 베타 2, ER 지질 raft 결합 2 이소형 1 (베타 액틴), 시그날 서열 수용체 1 델타, 진핵세포 해독 개시 인자 3, 서브유니트 3 감마, 빌베르딘 리덕타제 A (트랜스알돌라제 1), 케라틴 1,10 (파라티모신), GST 오메가 1, Dj-1에 대한 쇄 B 도파민 퀴논 접합체, 프로테아좀 활성화인자 Reg(알파), T-복합 단백질 1 이소형 A, 쇄 A 타파신 ERP57 (TCP1 함유 샤페로닌), 유비퀴틴 활성화 효소 E1; 알라닐-tRNA 신테타제, 다이낙틴 1, 열 쇼크 단백질 60kd, 베타 액틴, 스퍼미딘 신타제 (베타 액틴), 열 쇼크 단백질 70kd, 망막모세포종 결합 단백질 4 이소형 A, TAR DNA 결합 단백질, 진핵세포 해독 연장 인자 1 베타 2, TCP1 함유 샤페로닌, 서브유니트 3, 세포질 다이네인 IC-2, 안지오텐신-전환 효소 (ACE), 카스파제 3, GARS, 매트릭스 메탈로프로테이나제 6 (MMP-6), 뉴로라이신 (NLN)-촉매적 도메인, 및 뉴로라이신 (NLN), ADRB, CEACAM1, DUSP4, FOXC2, FOXP3, GCGR, GPD1, HMOX1, IL4R, INPPL1, IRS2, VEGFA, 추정 c-myc-반응성 이소형 1, PDK 1, 카스파제 12, 포스포리파제 D1, P34 cdc2, P53 BP1, BTK, ASC2, BUBR1, ARTS, PCAF, Raf1, MSK1, SNAP25, APRIL, DAPK, RAIDD, HAT1, PSF, HDAC1, Rad17, 수르비빈, SLIPR, MAG13, 카스파제 10, Crk2, Cdc 6, P21 WAF 1 Cip 1, ASPP 1, HDAC 4, 사이클린 B1, CD 40, GAD 65, TAP, Par4 (전립선 아폽토시스 반응 4), MRP1, MDC1, 라미닌2 a2, b카테닌, FXR2, 어넥신 V, SMAC 디아블로, MBNL1, 디메틸 히스톤 h3, 독립적 성장 인자 1, U2AF65, mTOR, E2F2, 카이소, 글리코겐 신타제 키나제 3, ATF2, HDRP MITR, 뉴라빈 I, AP1 및 Apaf1로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자(또는 단백질)를 조정하는 작용을 한다. 몇몇 양태에서, 치료 또는 예방 방법들은 이전의 유전자(또는 단백질) 중 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상, 7개 이상, 8개 이상, 9개 이상, 10개 이상, 11개 이상, 12개 이상, 13개 이상, 14개 이상, 15개 이상, 16개 이상, 17개 이상, 18개 이상, 19개 이상, 20개 이상, 25개 이상, 30개 이상의 조합을 조정하는 작용을 한다.
몇몇 양태에서, 본 발명의 치료 또는 예방 방법들은 LAMA5, PXLDC1, p300 CBP, P53R2, 포스파티딜세린 수용체, 사이토케라틴 펩타이드 17, 사이토케라틴 펩타이드 13, 신경미세섬유 160 200, Rab5, 필렌신, P53R2, MDM2, MSH6, 열 쇼크 인자 2, AFX, FLIPg d, JAB 1, 미오신, MEKK4, cRaf pSer621, FKHR FOXO1a, MDM2, Fas 리간드, P53R2, 프로테아좀 26S 서브유니트 13 (엔도필린 B1), 미오신 조절 경쇄, hnRNP C1/C2, 유비퀼린 1 (포스파타제 2A), hnRNP C1/C2, 알파 2-HS 당단백질(보스 토러스, 소), 베타 액틴, hnRNP C1/C2, 열 쇼크 단백질 70kD, 마이크로튜불 결합 단백질, 베타 튜불린, 프로테아좀 알파 3, ATP 의존성 헬리카제 II, 진핵세포 해독 연장 인자 1 델타, 열 쇼크 단백질 27kD, 진핵세포 해독 연장 인자 1 베타 2, HSPC-300 유사체, ER 지질 raft 결합 2 이소형 1 (베타 액틴), 디스뮤타제 Cu/Zn 슈퍼옥사이드, 및 시그날 서열 수용체 1 델타, ADRB, CEACAM1, DUSP4, FOXC2, FOXP3, GCGR, GPD1, HMOX1, IL4R, INPPL1, IRS2 및 VEGFA, 추정 c-myc-반응성 이소형 1, PDK 1, 카스파제 12, 포스포리파제 D1, P34 cdc2, P53 BP1, BTK, ASC2, BUBR1, ARTS, PCAF, Raf1, MSK1, SNAP25, APRIL, DAPK, RAIDD, HAT1, PSF, HDAC1, Rad17, 수르비빈, SLIPR, MAG13, 카스파제 10, Crk2, Cdc 6, P21 WAF 1 Cip 1, ASPP 1, HDAC 4, 사이클린 B1, CD 40, GAD 65, TAP, Par4 (전립선 아폽토시스 반응 4) 및 MRP1로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 유전자 또는 상기 유전자들의 임의의 조합의 발현 수준을 상향조절하는 작용을 한다. 몇몇 양태에서, 치료 또는 예방 방법들은 이전의 유전자(또는 단백질) 중 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상, 7개 이상, 8개 이상, 9개 이상, 10개 이상, 11개 이상, 12개 이상, 13개 이상, 14개 이상, 15개 이상, 16개 이상, 17개 이상, 18개 이상, 19개 이상, 20개 이상, 25개 이상, 30개 이상의 조합을 상향조절하는 작용을 한다.
추가의 양태에서, 본 발명에 의해 제공된 치료 또는 예방 방법들은 ANGPTL3, CCL2, CDH5, CXCL1, CXCL3, PRMT3, HDAC2, 산화질소 신타제 bNOS, 아세틸 포스포 히스톤 H3 AL9 S10, MTA 2, 글루탐산 데카복실라제 GAD65 67, KSR, HDAC4, BOB1 OBF1, a1신트로핀, BAP1, 임포르티나 57, αE-카테닌, Grb2, Bax, 프로테아좀 26S 서브유니트 13 (엔도필린 B1), 액틴형 6A (진핵세포 개시 인자 4A11), 핵 클로라이드 채널 단백질, 프로테아좀 26S 서브유니트, 디스뮤타제 Cu/Zn 슈퍼옥사이드, 트랜슬린-결합 인자 X, 아비산염 전위 ATP아제 (스퍼민 신테타제), 리보솜 단백질 SA, dCTP 피로포스파타제 1, 프로테아좀 베타 3, 프로테아좀 베타 4, 산 포스파타제 1, 디아제팜 결합 억제제, 리보솜 단백질 P2 (RPLP2); 히스톤 H2A, 마이크로튜불 결합 단백질, 프로테아좀 알파 3, 진핵세포 해독 연장 인자 1 델타, 라민 B1, SMT 3, mif two 3 동족체 2의 억제인자, 열 쇼크 단백질 27kD, hnRNP C1/C2, 진핵세포 해독 연장 인자 1 베타 2, HSPC-300 유사체, DNA 지시된 DNA 폴리머라제 엡실론 3 (캐노피 2 동족체), 안지오텐신 전환 효소 (ACE), 카스파제 3, GARS, 매트릭스 메탈로프로테이나제 6 (MMP-6), 뉴로라이신 (NLN)-촉매적 도메인, 뉴로라이신 (NLN), MDC1, 라미닌2 a2, b카테닌, FXR2, 어넥신 V, SMAC 디아블로, MBNL1, 디메틸 히스톤 h3, 독립적 성장 인자 1, U2AF65, mTOR, E2F2, 카이소, 글리코겐 신타제 키나제 3, ATF2, HDRP ΜITR, 뉴라빈 I, AP1 및 Apaf1로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 유전자 또는 상기 유전자들의 임의의 조합의 발현 수준을 하향조절하는 작용을 한다. 몇몇 양태에서, 치료 또는 예방 방법들은 이전의 유전자(또는 단백질) 중 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상, 7개 이상, 8개 이상, 9개 이상, 10개 이상, 11개 이상, 12개 이상, 13개 이상, 14개 이상, 15개 이상, 16개 이상, 17개 이상, 18개 이상, 19개 이상, 20개 이상, 25개 이상, 30개 이상의 조합을 하향조절하는 작용을 한다.
하나의 양태에서, 본 발명에 의해 제공된 치료 또는 예방 방법들은 당뇨병에 관여하는 유전자의 발현 수준을 조정하는 작용을 한다. 상기 유전자는 예를 들면, ADRB, CEACAM1, DUSP4, FOX C2, FOXP3, GCGR, GPD1, HMOX1, IL4R, INPPL1, IRS2, VEGFA, ANGPTL3, CCL2, CDH5, CXCL1, CXCL3, LAMA5 및/또는 PXLDC1을 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 치료 또는 예방 방법들은 이전의 유전자(또는 단백질) 중 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상, 7개 이상, 8개 이상, 9개 이상, 10개 이상, 11개 이상, 12개 이상, 13개 이상, 14개 이상, 15개 이상, 16개 이상, 17개 이상, 18개 이상 또는 모든 19개의 조합을 조정하는 작용을 한다.
추가의 양태에서, 치료 또는 예방 방법들은 당뇨병에 관여하는 유전자의 발현 수준을 상향조절하는 작용을 한다. 상기 유전자는 예를 들면, ADRB, CEACAM1, DUSP4, FOX C2, FOXP3, GCGR, GPD1, HMOX1, IL4R, INPPL1, IRS2 및/또는 VEGFA를 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 치료 또는 예방 방법들은 이전의 유전자(또는 단백질) 중 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상, 7개 이상, 8개 이상, 9개 이상, 10개 이상, 11개 이상 또는 모든 12개의 조합을 상향조절한다.
추가의 양태에서, 치료 또는 예방 방법은 당뇨병에 관여하는 유전자의 발현 수준을 하향조절하는 작용을 한다. 상기 유전자는 예를 들면, ANGPTL3, CCL2, CDH5, CXCL1, CXCL3, LAMA5 및/또는 PXLDC1을 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 치료 또는 예방 방법들은 이전의 유전자(또는 단백질) 중 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상 또는 모든 7개의 조합을 하향조절한다.
또 다른 양태에서, 치료 또는 예방 방법은 혈관형성에 관여하는 유전자의 발현 수준을 조정하는 작용을 한다. 상기 유전자는 예를 들면, ANGPTL3, CCL2, CDH5, CXCL1, CXCL3, LAMA5 및/또는 PXLDC1을 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 치료 또는 예방 방법들은 이전의 그룹 중 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상 또는 모든 7개의 유전자의 조합을 조정한다.
추가의 양태에서, 치료 또는 예방 방법은 혈관형성에 관여하는 유전자의 발현 수준을 상향조절하는 작용을 한다. 상기 유전자는 예를 들면, ANGPTL3, CCL2, CDH5, CXCL1 및/또는 CXCL3을 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 치료 또는 예방 방법들은 이전의 그룹 중 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상 또는 모든 5개의 유전자의 조합을 상향조절한다.
추가의 양태에서, 치료 또는 예방 방법들은 혈관형성에 관여하는 유전자의 발현 수준을 하향조절하는 작용을 한다. 상기 유전자는 예를 들면, LAMA5 및/또는 PXLDC1을 포함할 수 있다. 하나의 양태에서, 치료 또는 예방 방법들은 LAMA5 및 PXLDC1 둘 다를 하향조절한다.
또 다른 양태에서, 치료 또는 예방 방법들은 아폽토시스에 관여하는 유전자의 발현 수준을 조정하는 작용을 한다. 상기 유전자는 예를 들면, 본원에 기재된 실험에서 조정되는 유전자들, 즉 표 2 내지 9에 열거된 유전자들을 포함할 수 있다. 또 다른 양태에서, 아폽토시스에 관여하는 유전자 또는 단백질은 JAB1, p53R2, 포스파티딜세린 수용체, Rab 5, AFX, MEKK4, HDAC2, HDAC4, PDK1, 카스파제12, 포스포리파제 D1, p34cdc2, BTK, ASC2, BubR1, PCAF, Raf1, MSK1 및 mTOR 중 하나 이상을 포함한다. 몇몇 양태에서, 치료 또는 예방 방법들은 이전의 그룹 중 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상, 7개 이상, 8개 이상, 9개 이상, 10개 이상, 11개 이상, 12개 이상, 13개 이상, 14개 이상, 15개 이상, 16개 이상, 17개 이상, 18개 이상 또는 모든 19개의 유전자의 조합을 조정한다.
V. 본 발명의 진단 방법
본 발명은 육종을 진단하는 방법을 제공한다. 본 발명의 방법들은 당업자에 의해 사용되는 임의의 다른 방법과 연계하여 육종의 재발 및/또는 육종에 대해 치료되는 피검체의 생존을 진단하기 위해 수행될 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 방법들은 피검체로부터 채취된 샘플의 형태학적 또는 세포학적 분석과 연계하여 수행될 수 있다. 세포학적 방법들은 다른 마커와 연계하고/하거나 Shc 마커와 연계하여 임의의 다른 분자 마커 자체의 면역조직화학적 또는 면역형광 검출(및 경우에 따라, 정량)을 포함한다. 다른 방법들은 동일계 PCR에 의한 또는 조직을 추출하고 실시간 PCR에 의해 다른 마커를 정량함에 의한 다른 마커의 검출을 포함한다. PCR은 폴리머라제 연쇄 반응으로서 정의된다.
치료 계획의 효능을 평가하기 위한 방법들, 예를 들면, 화학치료, 방사선 치료, 수술, 호르몬 치료 또는 피검체에서 발암성 장애를 치료하기 위해 유용한 임의의 다른 치료적 방법이 또한 제공된다. 이들 방법들에서, 한쌍의 샘플(제1 샘플은 치료 계획에 적용되지 않고 제2 샘플은 치료 계획의 적어도 일부에 적용된다) 중의 마커의 양이 평가된다.
본 발명은 또한 육종이 공격성인지의 여부를 결정하기 위한 방법을 제공한다. 상기 방법은 세포에 존재하는 마커의 양을 결정하고, 상기 양을, 정의 섹션에서 정의된 대조군 샘플 중에 존재하는 마커의 대조 양과 비교하여 육종이 공격성인지를 결정함을 포함한다.
또한 본 발명의 방법들을 사용하여 육종의 공격성을 조정할 수 있는, 즉, 감소시킬 수 있는 화합물을 선택할 수 있다. 상기 방법에서, 암 세포를 시험 화합물과 접촉시키고 육종 세포에서 본 발명의 마커의 발현 및/또는 활성을 조정하는 시험 화합물의 능력을 결정하여 육종의 공격성을 조정할 수 있는 화합물을 선별한다.
본원에 기재된 방법을 사용하여, 특히 세포막을 통과할 수 있기에 충분히 작은 분자를 포함하는 다양한 분자를 스크리닝하여 본 발명의 마커의 발현 및/또는 활성을 조정하는, 예를 들면, 증가시키는 분자를 동정할 수 있다. 동정된 화합물은 피검체에서 육종의 공격성을 억제하거나, 피검체에서 육종의 재발을 예방하거나, 피검체에서 육종을 치료하기 위해 피검체에 제공될 수 있다.
VI . 본 발명의 마커
본 발명은 표 2 내지 9에 열거된 마커(이후부터 "마커" 또는 "본 발명의 마커")에 관한 것이다. 본 발명은 마커에 의해 암호화된 또는 상기 마커에 상응하는 핵산 및 단백질(이후부터 각각 "마커 핵산" 및 "마커 단백질")을 제공한다. 이들 마커는 특히 육종의 존재에 대해 스크리닝하고, 육종의 공격성 및 전이성 잠재력을 평가하고, 피검체가 육종을 앓고 있는지의 여부를 평가하고, 육종을 치료하기 위한 조성물을 동정하고, 육종을 치료하기 위한 환경 영향인자 화합물의 효능을 평가하고, 육종의 진행을 모니터링하고, 육종의 공격성을 예측하고, 육종을 앓는 피검체의 생존성을 예측하고, 육종의 재발을 예측하고 피검체가 육종을 발병할 성향이 있는지의 여부를 예측하는데 있어서 유용하다.
"마커"는 정상적인 또는 건강한 조직 또는 세포에서의 이의 발현 수준으로부터 상기 조직 또는 세포내 발현의 변화된 수준이 육종과 같은 질환 상태와 관련되는 유전자이다. "마커 핵산"은 본 발명의 마커에 의해 암호화되거나 이에 상응하는 핵산(예를 들면, mRNA, cDNA)이다. 상기 마커 핵산은 본 발명의 마커 또는 상기 서열의 상보체인 임의의 유전자의 전체 또는 부분적 서열을 포함하는 DNA(예를 들면, cDNA)를 포함한다. 상기 서열은 당업자에게 공지되어 있고, 예를 들면, NIH 정부 pubmed 웹사이트상에서 찾을 수 있다. 상기 마커 핵산은 또한 본 발명의 임의의 유전자 마커의 전체 또는 부분적 서열 또는 상기 서열의 상보체를 포함하는 RNA를 포함하고, 여기서, 상기 서열중에 모든 티미딘 잔기는 우리딘 잔기로 대체되어 있다. "마커 단백질"은 본 발명의 마커에 의해 암호화되거나 이에 상응하는 단백질이다. 마커 단백질은 본 발명의 임의의 마커 단백질의 전체 또는 부분적 서열을 포함한다. 상기 서열은 당업자에게 공지되어 있고, 예를 들면, NIH 정부 pubmed 웹사이트상에서 찾을 수 있다. 상기 용어 "단백질" 및 "폴리펩타이드"는 상호교환적으로 사용된다.
"육종 관련된" 체액은 환자의 신체에서 육종 세포와 접촉하거나 이를 통과하거나 또는 육종 세포로부터 이탈된 세포 또는 단백질이 통과할 수 있는 유체이다. 예시적인 육종 관련된 체액은 혈액(예를 들면, 전혈, 혈청, 이로부터 제거된 혈소판을 갖는 혈액)을 포함하고 하기에 보다 상세하게 기재되어 있다. 많은 육종 장애 관련된 체액은 특히 세포가 전이하는 경우 거기에 육종 세포를 가질 수 있다. 육종 세포를 함유할 수 있는 세포 함유 체액은 전혈, 이로부터 제거된 혈소판을 갖는 혈액, 림프액, 전립선액, 뇨 및 정액을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
마커의 "표준적인" 발현 수준은 육종을 앓지 않는 사람 피검체 또는 환자의 세포에서의 마커의 발현 수준이다.
마커의 "과발현" 또는 "보다 고수준의 발현"은 발현을 평가하기 위해 사용되는 분석의 표준 오차보다 크고, 대조군 샘플(예를 들면, 마커와 관련된 질환, 즉 육종을 갖지 않는 건강한 피검체 기원의 샘플) 중의 마커 발현 수준 및 바람직하게는 여러 대조군 샘플들 중의 마커의 평균 발현 수준보다 바람직하게는 2배 이상, 더욱 바람직하게는 3배, 4배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배 또는 10배인 시험 샘플에서의 발현 수준을 언급한다.
마커의 "보다 저수준의 발현"은 대조군 샘플(예를 들면, 마커와 관련된 질환 즉, 육종을 갖지 않는 건강한 피검체 기원의 샘플)에서 마커의 발현 수준 및 바람직하게는 여러 대조군 샘플들 중에서의 마커의 평균 발현 수준보다 2배 이상, 및 보다 바람직하게는 3배, 4배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배 또는 10배 적은 시험 샘플에서의 발현 수준을 언급한다.
"전사된 폴리뉴클레오타이드" 또는 "뉴클레오타이드 전사체"는 경우에 따라 본 발명의 마커의 전사 및 RNA 전사체 및 RNA 전사체의 역전사의 정상적인 전사후 프로세싱(예를 들면, 스플라이싱)에 의해 제조된 성숙한 mRNA 전부 또는 이의 일부와 상보적이거나 상동성인 폴리뉴클레오타이드(예를 들면, mRNA, hnRNA, cDNA 또는 상기 RNA 또는 cDNA의 유사체)이다.
"상보성"이란, 2개의 핵산 가닥의 영역들 간 또는 동일한 핵산 가닥의 2개의 영역들 간의 광범위한 개념의 서열 상보성을 언급한다. 제1 핵산 영역의 아데닌 잔기는 잔기가 티민 또는 우라실인 경우 제1 영역에 역평행하는 제2 핵산 영역의 잔기와 특이적 수소 결합을 형성("염기쌍 형성")할 수 있는 것으로 공지되어 있다. 유사하게, 제1 핵산 가닥의 시토신 잔기는, 잔기가 구아닌인 경우, 제1 가닥과 역평행하는 제2 핵산 가닥의 잔기와 염기쌍을 형성할 수 있는 것으로 공지되어 있다. 핵산의 제1 영역은, 2개의 영역이 역평행 방식으로 배열되는 경우 제1 영역의 하나 이상의 뉴클레오타이드 잔기가 제2 영역의 잔기와 염기쌍을 형성하는 경우 동일하거나 상이한 핵산의 제2 영역에 상보적이다. 바람직하게, 제1 영역이 제1 부분을 포함하고, 제2 영역이 제2 부분을 포함하고, 제1 및 제2 부분이 역평행 방식으로 배열되는 경우, 제1 부분의 뉴클레오타이드 잔기의 약 50% 이상, 및 바람직하게는 약 75% 이상, 약 90% 이상, 또는 약 95% 이상은 제2 부분에서 뉴클레오타이드 잔기와 염기쌍을 형성할 수 있다. 보다 바람직하게, 제1 부분의 모든 뉴클레오타이드 잔기는 제2 부분에서 뉴클레오타이드 잔기와 염기쌍을 형성할 수 있다.
본원에 사용된 "상동성"은 동일한 핵산 가닥의 2개 영역들 간 또는 2개의 상이한 핵산 가닥들의 영역들 간에 뉴클레오타이드 서열 유사성을 언급한다. 2개의 영역내 뉴클레오타이드 잔기 위치가 동일한 뉴클레오타이드 잔기에 의해 차지되는 경우, 상기 영역은 상기 위치에서 상동성이다. 제1 영역은, 각각의 영역의 하나 이상의 뉴클레오타이드 잔기가 동일한 잔기에 의해 차지되는 경우, 제2 영역과 상동성이다. 2개의 영역들 간의 상동성은 동일한 뉴클레오타이드 잔기가 차지하는 2개의 영역들의 뉴클레오타이드 잔기 위치의 비율과 관련하여 표현된다. 예를 들면, 뉴클레오타이드 서열 5'-ATTGCC-3'를 갖는 영역 및 뉴클레오타이드 서열 5'-TATGGC-3'를 갖는 영역은 50% 상동성을 공유한다. 바람직하게, 제1 영역은 제1 부분을 포함하고, 제2 영역은 제2 부분을 포함하고, 각각의 부분의 뉴클레오타이드 잔기 위치의 약 50% 이상 및 바람직하게는 약 75% 이상, 약 90% 이상 또는 약 95% 이상은 동일한 뉴클레오타이드 잔기가 차지한다. 보다 바람직하게, 각각의 부분의 모든 뉴클레오타이드 잔기 위치는 동일한 뉴클레오타이드 잔기가 차지한다.
"본 발명의 단백질"은 마커 단백질 및 이들의 단편; 변이체 마커 단백질 및 이들의 단편; 마커 또는 변이체 마커 단백질의 15개 이상의 아미노산 절편을 포함하는 펩타이드 및 폴리펩타이드; 및 마커 또는 변이체 마커 단백질, 또는 마커 또는 변이체 마커 단백질의 15개 이상의 아미노산 절편을 포함하는 융합 단백질을 포함한다.
본 발명은 추가로 본 발명의 마커 단백질 및 마커 단백질의 단편과 특이적으로 결합하는, 항체, 항체 유도체 및 항체 단편을 제공한다. 본원에서 달리 특정되지 않는 경우, 용어 "항체" 및 "항체들"은 광범위하게 천연 형태의 항체(예를 들면, IgG, IgA, IgM, IgE) 및 단일쇄 항체, 키메라 및 사람화된 항체 및 다중 특이적 항체와 같은 재조합 항체, 및 이전의 모두의 단편 및 유도체를 포함하고, 여기서, 단편 및 유도체는 적어도 항원성 결합 부위를 갖는다. 항체 유도체는 항체와 접합된 단백질 또는 화학적 잔기를 포함할 수 있다.
특정 양태에서, 본 발명의 마커는 ANGPTL3, CCL2, CDH5, CXCL1, CXCL3, PRMT3, HDAC2, 산화질소 신타제 bNOS, 아세틸 포스포 히스톤 H3 AL9S10, MTA 2, 글루탐산 데카복실라제 GAD65 67, KSR, HDAC4, BOB1 OBF1, a1신트로핀, BAP1, 임포르티나 57, αE-카테닌, Grb2, Bax, 프로테아좀 26S 서브유니트 13 (엔도필린 B1), 액틴형 6A (진핵세포 개시 인자 4A11), 핵 클로라이드 채널 단백질, 프로테아좀 26S 서브유니트, 디스뮤타제 Cu/Zn 슈퍼옥사이드, 트랜슬린-결합 인자 X, 아비산염 전위 ATP아제 (스퍼민 신테타제), 리보솜 단백질 SA, dCTP 피로포스파타제 1, 프로테아좀 베타 3, 프로테아좀 베타 4, 산 포스파타제 1, 디아제팜 결합 억제제, 알파 2-HS 당단백질 (보스 토러스, 소), 리보솜 단백질 P2 (RPLP2); 히스톤 H2A, 마이크로튜불 결합 단백질, 프로테아좀 알파 3, 진핵세포 해독 연장 인자 1 델타, 라민 B1, SMT 3, mif two 3 동족체 2의 억제인자, 열 쇼크 단백질 27kD, hnRNP C1/C2, 진핵세포 해독 연장 인자 1 베타 2, HSPC-300 유사체, DNA 지시된 DNA 폴리머라제 엡실론 3; (캐노피 2 동족체), LAMA5, PXLDC1, p300 CBP, P53R2, 포스파티딜세린 수용체, 사이토케라틴 펩타이드 17, 사이토케라틴 펩타이드 13, 뉴로필라멘트 160 200, Rab5, 필렌신, P53R2, MDM2, MSH6, 열 쇼크 인자 2, AFX, FLIPg d, JAB 1, 미오신, MEKK4, cRaf pSer621, FKHR FOXO1a, MDM2, Fas 리간드, P53R2, 미오신 조절 경쇄, hnRNP C1/C2, 유비퀼린 1 (포스파타제 2A), hnRNP C1/C2, 알파 2-HS 당단백질 (보스 토러스, 소), 베타 액틴, hnRNP C1/C2, 열 쇼크 단백질 70kD, 베타 튜불린, ATP 의존성 헬리카제 II, 진핵세포 해독 연장 인자 1 베타 2, ER 지질 raft 결합 2 이소형 1 (베타 액틴), 시그날 서열 수용체 1 델타, 진핵세포 해독 개시 인자 3, 서브유니트 3 감마, 빌베르딘 리덕타제 A (트랜스알돌라제 1), 케라틴 1,10 (파라티모신), GST 오메가 1, Dj-1에 대한 쇄 B 도파민 퀴논 접합체, 프로테아좀 활성화인자 Reg(알파), T-복합 단백질 1 이소형 A, 쇄 A 타파신 ERP57 (TCP1 함유 샤페로닌), 유비퀴틴 활성화 효소 E1; 알라닐-tRNA 신테타제, 다이낙틴 1, 열 쇼크 단백질 60kd, 베타 액틴, 스퍼미딘 신타제 (베타 액틴), 열 쇼크 단백질 70kd, 망막모세포종 결합 단백질 4 이소형 A, TAR DNA 결합 단백질, 진핵세포 해독 연장 인자 1 베타 2, TCP1 함유 샤페로닌, 서브유니트 3, 세포질 다이네인 IC-2, 안지오텐신-전환 효소 (ACE), 카스파제 3, GARS, 매트릭스 메탈로프로테이나제 6 (MMP-6), 뉴로라이신 (NLN)-촉매적 도메인 및 뉴로라이신 (NLN), ADRB, CEACAM1, DUSP4, FOXC2, FOXP3, GCGR, GPD1, HMOX1, IL4R, INPPL1, IRS2, VEGFA, 추정 c-myc-반응성 이소형 1, PDK 1, 카스파제 12, 포스포리파제 D1, P34 cdc2, P53 BP1, BTK, ASC2, BUBR1, ARTS, PCAF, Raf1, MSK1, SNAP25, APRIL, DAPK, RAIDD, HAT1, PSF, HDAC1, Rad17, 수르비빈, SLIPR, MAG13, 카스파제 10, Crk2, Cdc 6, P21 WAF 1 Cip 1, ASPP 1, HDAC 4, 사이클린 B1, CD 40, GAD 65, TAP, Par4 (전립선 아폽토시스 반응 4), MRP1, MDC1, 라미닌2 a2, b카테닌, FXR2, 어넥신 V, SMAC 디아블로, MBNL1, 디메틸 히스톤 h3, 독립적 성장 인자 1, U2AF65, mTOR, E2F2, 카이소, 글리코겐 신타제 키나제 3, ATF2, HDRP MITR, 뉴라빈 I, AP1 및 Apaf1로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자(또는 단백질)를 포함한다. 몇몇 양태에서, 상기 마커는 이전의 유전자(또는 단백질) 중 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상, 7개 이상, 8개 이상, 9개 이상, 10개 이상, 11개 이상, 12개 이상, 13개 이상, 14개 이상, 15개 이상, 16개 이상, 17개 이상, 18개 이상, 19개 이상, 20개 이상, 25개 이상, 30개 이상, 35개 이상, 40개 이상, 45개 이상, 50개 이상의 조합이다.
몇몇 양태에서, 본 발명의 마커는 육종 세포를 조효소 Q10으로 처리하는 즉시 상향조절되는 유전자 또는 단백질이다. 조효소 Q10으로 육종을 처리하는 즉시 상향조절되는 마커는 LAMA5, PXLDC1, p300 CBP, P53R2, 포스파티딜세린 수용체, 사이토케라틴 펩타이드 17, 사이토케라틴 펩타이드 13, 신경미세섬유 160 200, Rab5, 필렌신, P53R2, MDM2, MSH6, 열 쇼크 인자 2, AFX, FLIPg d, JAB 1, 미오신, MEKK4, cRaf pSer621, FKHR FOXO1a, MDM2, Fas 리간드, P53R2, 프로테아좀 26S 서브유니트 13 (엔도필린 B1), 미오신 조절 경쇄, hnRNP C1/C2, 유비퀼린 1 (포스파타제 2A), hnRNP C1/C2, 알파 2-HS 당단백질 (보스 토러스, 소), 베타 액틴, hnRNP C1/C2, 열 쇼크 단백질 70kD, 마이크로튜불 결합 단백질, 베타 튜불린, 프로테아좀 알파 3, ATP 의존성 헬리카제 II, 진핵세포 해독 연장 인자 1 델타, 열 쇼크 단백질 27kD, 진핵세포 해독 연장 인자 1 베타 2, HSPC-300 유사체, ER 지질 raft 결합 2 이소형 1 (베타 액틴), 디스뮤타제 Cu/Zn 슈퍼옥사이드, 및 시그날 서열 수용체 1 델타, ADRB, CEACAM1, DUSP4, FOXC2, FOXP3, GCGR, GPD1, HMOX1, IL4R, INPPL1, IRS2 및 VEGFA, 추정 c-myc-반응성 이소형 1, PDK 1, 카스파제 12, 포스포리파제 D1, P34 cdc2, P53 BP1, BTK, ASC2, BUBR1, ARTS, PCAF, Raf1, MSK1, SNAP25, APRIL, DAPK, RAIDD, HAT1, PSF, HDAC1, Rad17, 수르비빈, SLIPR, MAG13, 카스파제 10, Crk2, Cdc 6, P21 WAF 1 Cip 1, ASPP 1, HDAC 4, 사이클린 B1, CD 40, GAD 65, TAP, Par4 (전립선 아폽토시스 반응 4), 및 MRP1을 포함한다. 몇몇 양태에서, 상향조절되는 마커는 이전의 유전자(또는 단백질) 중 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상, 7개 이상, 8개 이상, 9개 이상, 10개 이상, 11개 이상, 12개 이상, 13개 이상, 14개 이상, 15개 이상, 16개 이상, 17개 이상, 18개 이상, 19개 이상, 20개 이상, 25개 이상, 30개 이상의 조합이다.
추가의 양태에서, 상기 마커는 CoQ10으로 처리 즉시 육종 세포에서 하향조절되는 유전자 또는 단백질이다. 하향조절되는 마커는 ANGPTL3, CCL2, CDH5, CXCL1, CXCL3, PRMT3, HDAC2, 산화질소 신타제 bNOS, 아세틸 포스포 히스톤 H3 AL9 S10, MTA 2, 글루탐산 데카복실라제 GAD65 67, KSR, HDAC4, BOB1 OBF1, a1신트로핀, BAP1, 임포르티나 57, αE-카테닌, Grb2, Bax, 프로테아좀 26S 서브유니트 13 (엔도필린 B1), 액틴형 6A (진핵세포 개시 인자 4A11), 핵 클로라이드 채널 단백질, 프로테아좀 26S 서브유니트, 디스뮤타제 Cu/Zn 슈퍼옥사이드, 트랜슬린-결합 인자 X, 아비산염 전위 ATP아제 (스퍼민 신테타제), 리보솜 단백질 SA, dCTP 피로포스파타제 1, 프로테아좀 베타 3, 프로테아좀 베타 4, 산 포스파타제 1, 디아제팜 결합 억제제, 리보솜 단백질 P2 (RPLP2); 히스톤 H2A, 마이크로튜불 결합 단백질, 프로테아좀 알파 3, 진핵세포 해독 연장 인자 1 델타, 라민 B1, SMT 3, mif two 3 동족체 2의 억제인자, 열 쇼크 단백질 27kD, hnRNP C1/C2, 진핵세포 해독 연장 인자 1 베타 2, HSPC-300 유사체, DNA 지시된 DNA 폴리머라제 엡실론 3 (캐노피 2 동족체), 안지오텐신 전환 효소 (ACE), 카스파제 3, GARS, 매트릭스 메탈로프로테이나제 6 (MMP-6), 뉴로라이신 (NLN)-촉매적 도메인, 뉴로라이신 (NLN), MDC1, 라미닌2 a2, b카테닌, FXR2, 어넥신 V, SMAC 디아블로, MBNL1, 디메틸 히스톤 h3, 독립적 성장 인자 1, U2AF65, mTOR, E2F2, 카이소, 글리코겐 신타제 키나제 3, ATF2, HDRP ΜITR, 뉴라빈 I, AP1 및 Apaf1을 포함한다. 몇몇 양태에서, 하향조절되는 마커는 이전의 유전자(또는 단백질) 중 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상, 7개 이상, 8개 이상, 9개 이상, 10개 이상, 11개 이상, 12개 이상, 13개 이상, 14개 이상, 15개 이상, 16개 이상, 17개 이상, 18개 이상, 19개 이상, 20개 이상, 25개 이상, 30개 이상의 조합이다.
하나의 양태에서, 본 발명의 마커는 당뇨병과 관련되거나 이에 관여하는 유전자 또는 단백질이다. 당뇨병에 관여하는 상기 유전자 또는 단백질은 예를 들면, ADRB, CEACAM1, DUSP4, FOX C2, FOXP3, GCGR, GPD1, HMOX1, IL4R, INPPL1, IRS2, VEGFA, ANGPTL3, CCL2, CDH5, CXCL1, CXCL3, LAMA5 및/또는 PXLDC1을 포함한다. 몇몇 양태에서, 본 발명의 마커는 이전의 유전자(또는 단백질) 중 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상, 7개 이상, 8개 이상, 9개 이상, 10개 이상, 11개 이상, 12개 이상, 13개 이상, 14개 이상, 15개 이상, 16개 이상, 17개 이상, 18개 이상 또는 모든 19개의 조합이다.
하나의 양태에서, 당뇨병과 관련되거나 이에 관여하는 마커는 육종 세포를 CoQ10로 처리시 상향조절되는 유전자 또는 단백질이다. 상기 마커는 예를 들면, ADRB, CEACAM1, DUSP4, FOX C2, FOXP3, GCGR, GPD1, HMOX1, IL4R, INPPL1, IRS2 및/또는 VEGFA를 포함한다. 몇몇 양태에서, 당뇨병에 관여하는 상향조절된 마커는 이전의 유전자(또는 단백질) 중 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상, 7개 이상, 8개 이상, 9개 이상, 10개 이상, 11개 이상 또는 모든 12개의 조합이다.
추가의 양태에서, 당뇨병과 관련되거나 이에 관여하는 마커는 육종 세포를 CoQ10으로 처리시 하향조절되는 유전자 또는 단백질이다. 상기 유전자는 예를 들면, ANGPTL3, CCL2, CDH5, CXCL1, CXCL3, LAMA5 및/또는 PXLDC1을 포함한다. 몇몇 양태에서, 당뇨병에 관여하는 하향조절된 마커는 이전의 유전자(또는 단백질) 중 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상 또는 모든 7개의 조합이다.
또 다른 양태에서, 본 발명의 마커는 혈관형성과 관련되거나 이에 관여하는 유전자 또는 단백질이다. 상기 유전자는 예를 들면, ANGPTL3, CCL2, CDH5, CXCL1, CXCL3, LAMA5 및/또는 PXLDC1을 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 혈관형성과 관련되거나 이에 관여하는 마커는 이전의 그룹 중 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상 또는 모든 7개의 유전자의 조합이다.
추가의 양태에서, 혈관형성과 관련되거나 이에 관여하는 마커는 육종 세포를 CoQ10과 처리시 상향조절되는 유전자 또는 단백질이다. 상기 유전자는 예를 들면, ANGPTL3, CCL2, CDH5, CXCL1 및/또는 CXCL3을 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 혈관형성과 관련하여 상향조절되는 마커는 이전의 그룹 중 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 또는 모든 5개의 유전자의 조합이다.
추가의 양태에서, 혈관형성과 관련되거나 이에 관여하는 마커는 육종 세포를 CoQ10으로 처리시 하향조절되는 유전자 또는 단백질이다. 상기 유전자는 예를 들면, LAMA5 및/또는 PXLDC1을 포함할 수 있다. 하나의 양태에서, 하향조절되는 마커는 LAMA5 및 PXLDC1 둘 다이다.
또 다른 양태에서, 마커는 아폽토시스에 관여하는 유전자 또는 단백질이다. 상기 유전자는 예를 들면, 표 2 내지 9에 열거된 유전자들을 포함할 수 있다. 하나의 양태에서, 아폽토시스에 관여하는 마커는 JAB1, p53R2, 포스파티딜세린 수용체, Rab 5, AFX, MEKK4, HDAC2, HDAC4, PDK1, 카스파제12, 포스포리파제 D1, p34cdc2, BTK, ASC2, BubR1, PCAF, Raf1, MSK1 및 mTOR을 포함한다.
본 발명의 다양한 측면은 하기의 서브섹션에서 추가로 상세하게 기재된다.
1. 분리된 핵산 분자
본 발명의 한가지 측면은 마커 단백질 또는 이의 일부분을 암호화하는 핵산을 포함하는, 분리된 핵산 분자에 관한 것이다. 본 발명의 분리된 핵산은 또한 마커 핵산 분자 및 마커 핵산 분자의 단편을 동정하기 위해 하이브리드화 프로브로서 사용하기에 충분한 핵산 분자, 예를 들면, 마커 핵산 분자의 증폭 또는 돌연변이를 위한 PCR 프라이머로서 사용하기 위해 적합한 것들을 포함한다. 본원에 사용된 용어 "핵산 분자"는 DNA 분자(예를 들면, cDNA 또는 게놈 DNA) 및 RNA 분자(예를 들면, mRNA) 및 뉴클레오타이드 유사체를 사용하여 제조된 DNA 또는 RNA 유사체를 포함하는 것으로 의도된다. 상기 핵산 분자는 단일가닥 또는 이중가닥일 수 있지만, 바람직하게는 이중가닥의 DNA이다.
"분리된" 핵산 분자는 핵산 분자의 천연 공급원에 존재하는 다른 핵산 분자로부터 분리된 것이다. 하나의 양태에서, "분리된" 핵산 분자는 핵산이 유래되는 유기체의 게놈 DNA에서 핵산을 천연적으로 플랭킹(flanking)하는 서열(바람직하게는 단백질 암호화 서열)(즉, 핵산의 5' 및 3' 말단에 위치하는 서열)이 부재이다. 예를 들면, 다양한 양태에서, 분리된 핵산 분자는 핵산이 유래된 세포의 게놈 DNA에서 천연적으로 핵산 분자를 플랭킹하는 약 5 kB, 4 kB, 3 kB, 2 kB, 1 kB, 0.5 kB 또는 0.1 kB 미만의 뉴클레오타이드 서열을 함유할 수 있다. 또 다른 양태에서, "분리된" 핵산 분자, 예를 들면, cDNA 분자는 재조합 기술에 의해 제조되는 경우 다른 세포 물질 또는 세포 배지가 실질적으로 부재일 수 있거나, 화학적으로 합성되는 경우 화학적 전구체 또는 다른 화학물질이 실질적으로 부재일 수 있다. 세포 물질이 실질적으로 부재인 핵산 분자는 약 30%, 20%, 10%, 또는 5% 미만의 이종 핵산(또한 본원에서 "오염 핵산"으로서 언급됨)을 갖는 제제를 포함한다.
본 발명의 핵산 분자는 표준 분자 생물학적 기술 및 본원에 기재된 데이타베이스 기록에서의 서열 정보를 사용하여 분리될 수 있다. 상기 핵산 서열의 전부 또는 일부를 사용하여, 본 발명의 핵산 분자는 표준 하이브리드화 및 클로닝 기술(문헌참조: Sambrook et al., ed., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989)에 의해 분리될 수 있다.
본 발명의 핵산 분자는 표준 PCR 증폭 기술에 따른 주형 또는 적당한 올리고뉴클레오타이드 프라이머로서 cDNA, mRNA 또는 게놈 DNA를 사용하여 증폭될 수 있다. 상기 증폭된 핵산은 적당한 벡터로 클로닝될 수 있고 DNA 서열 분석에 의해 확인될 수 있다. 추가로, 본 발명의 핵산 분자의 전부 또는 일부에 상응하는 뉴클레오타이드는 표준 합성 기술, 예를 들면, 자동화된 DNA 합성기를 사용하여 제조될 수 있다.
또 다른 바람직한 양태에서, 본 발명의 분리된 핵산 분자는 마커 핵산의 뉴클레오타이드 서열 또는 마커 단백질을 암호화하는 핵산의 뉴클레오타이드 서열에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 갖는 핵산 분자를 포함한다. 소정의 뉴클레오타이드 서열에 상보적인 핵산 분자는 상기 소정의 뉴클레오타이드 서열과 안정한 이중가닥을 형성하도록 하이브리드화될 수 있기에 상기 소정의 뉴클레오타이드 서열과 충분히 상보적인 분자이다.
더욱이, 본 발명의 핵산 분자는 단지 핵산 서열의 일부를 포함할 수 있고, 여기서, 전장 핵산 서열은 마커 핵산, 또는 마커 단백질을 암호화하는 마커 핵산을 포함한다. 상기 핵산은 예를 들면, 프로브 또는 프라이머로서 사용될 수 있다. 상기 프로브/프라이머는 통상적으로 하나 이상의 실질적으로 정제된 올리고뉴클레오타이드로서 사용된다. 상기 올리고뉴클레오타이드는 통상적으로 엄격한 조건하에서 본 발명의 핵산의 약 7개 이상, 바람직하게는 약 15개 이상, 보다 바람직하게는 약 25개, 50개, 75개, 100개, 125개, 150개, 175개, 200개, 250개, 300개, 350개 또는 400개 이상의 연속 뉴클레오타이드와 하이브리드화하는 뉴클레오타이드 서열 영역을 포함한다.
본 발명의 핵산 분자의 서열을 기초로 하는 프로브는 본 발명의 하나 이상의 마커에 상응하는 전사체 또는 게놈 서열을 검출하기 위해 사용될 수 있다. 상기 프로브는 여기에 부착된 표지 그룹, 예를 들면, 방사선동위원소, 형광 화합물, 효소 또는 효소 보조인자를 포함한다. 상기 프로브는 예를 들면, 피검체 기원의 세포 샘플 중에서 단백질을 암호화하는 핵산 분자의 수준을 측정함에 의해, 예를 들면, mRNA 수준을 측정하거나 상기 단백질을 암호화하는 유전자가 돌연변이되거나 삭제되었는지의 여부를 결정함에 의해 단백질을 잘못 발현하는 세포 또는 조직을 동정하기 위한 진단 시험 키트의 구성품으로서 사용될 수 있다.
본 발명은 추가로 마커 단백질을 암호화하는 핵산의 뉴클레오타이드 서열과는 유전자 코드의 축퇴성(degeneracy)으로 인해 상이하지만 동일한 단백질을 암호화하는 핵산 분자를 포함한다.
당업자는 아미노산 서열에서 변화를 유도하는 DNA 서열 다형성이 집단(예를 들면, 사람 집단) 내에 존재할 수 있음을 인지할 것이다. 상기 유전자 다형성은 천연 대립형질 유전자 변형으로 인해 집단내의 개체들간에 존재할 수 있다. 대립형질 유전자는 소정의 유전자 좌에서 대안적으로 존재하는 유전자 그룹 중 하나이다. 또한, 이것은 RNA 발현 수준에 영향을 미치는 DNA 다형성이 또한 존재하여 유전자의 전체 발현 수준에 영향을 줄 수 있음을(예를 들면, 조절 또는 분해에 영향을 줌에 의해) 인지할 것이다.
본원에 사용된 용어 "대립형질 유전자 변이체"는 소정의 유전자 좌에 존재하는 뉴클레오타이드 서열 또는 상기 뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화된 폴리펩타이드를 언급한다.
본원에 사용된 용어 "유전자" 및 "재조합 유전자"는 본 발명의 마커에 상응하는 폴리펩타이드를 암호화하는 개방 판독 프레임을 포함하는 핵산 분자를 언급한다. 상기 천연 대립형질 변이는 통상적으로 소정의 유전자의 뉴클레오타이드 서열을 1 내지 5% 변화시킬 수 있다. 또 다른 대립형질 유전자는 다수의 상이한 개체에서 목적하는 유전자를 서열분석함에 의해 동정될 수 있다. 이것은 다양한 개체에서 동일한 유전자 좌를 동정하는 하이브리드화 프로브를 사용함에 의해 용이하게 수행될 수 있다. 천연 대립형질 변이의 결과이고 기능적 활성을 변화시키지 않는 임의의 모든 상기 뉴클레오타이드 변이 및 수득된 아미노산 다형태 또는 변이는 본 발명의 범위내에 있는 것으로 의도된다.
또 다른 양태에서, 본 발명의 분리된 핵산 분자는 길이가 7개 이상, 15개 이상, 20개 이상, 25개 이상, 30개 이상, 40개 이상, 60개 이상, 80개 이상, 100개 이상, 150개 이상, 200개 이상, 250개 이상, 300개 이상, 350개 이상, 400개 이상, 450개 이상, 550개 이상, 650개 이상, 700개 이상, 800개 이상, 900개 이상, 1000개 이상, 1200개 이상, 1400개 이상, 1600개 이상, 1800개 이상, 2000개 이상, 2200개 이상, 2400개 이상, 2600개 이상, 2800개 이상, 3000개 이상, 3500개 이상, 4000개 이상, 4500개 이상의 뉴클레오타이드이고, 엄격한 조건하에서 마커 핵산 또는 마커 단백질을 암호화하는 핵산에 하이브리드화한다. 본원에 사용된 용어 "엄격한 조건하에서 하이브리드화하다"는 통상적으로 서로 60% 이상(65%, 70%, 바람직하게는 75%) 동일한 뉴클레오타이드 서열이 서로 하이브리드화된 상태로 있는 하이브리드화 및 세척을 위한 조건을 기재하는 것으로 의도된다. 상기 엄격한 조건은 당업자에게 공지되어 있고, 문헌[참조: Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989)의 섹션 6.3.1-6.3.6]에서 찾을 수 있다. 엄격한 하이브리드화 조건의 바람직한 비제한적인 예는 6X 염화나트륨/나트륨 시트레이트(SSC)중에서 약 45℃에서의 하이브리드화에 이어서, 50 내지 65℃에서 0.2X SSC, 0.1% SDS에서 1회 이상 세척하는 것이다.
집단에 존재할 수 있는 본 발명의 핵산 분자의 천연 대립형질 유전자 변이 이외에, 당업자는 추가로 서열 변화가 이에 의해 암호화된 단백질의 생물학적 활성을 변화시키는 것 없이 암호화된 단백질의 아미노산 서열에서의 변화를 유도하는 돌연변이에 의해 도입될 수 있음을 인지할 것이다. 예를 들면, 당업자는 "비필수" 아미노산 잔기에서 아미노산 치환을 유도하는 뉴클레오타이드 치환을 수행할 수 있다. "비필수" 아미노산 잔기는 생물학적 활성을 변화시키는 것 없이 야생형 서열로부터 변화될 수 있는 잔기인 반면, "필수" 아미노산 잔기는 생물학적 활성을 위해 요구된다. 예를 들면, 다양한 종의 동족체들 중에 보존되지 않거나 단지 반 보존된 아미노산 잔기는 활성에 대해 비필수일 수 있고, 따라서 변화를 위한 표적이될 것이다. 대안적으로, 다양한 종(예를 들면, 쥐 및 사람)의 동족체들 중에 보존된 아미노산 잔기는 활성에 필수일 수 있고 변화를 위해 표적이 되지 않을 것이다.
따라서, 본 발명의 또 다른 측면은 활성에 필수적이지 않은 아미노산 잔기에 변화를 함유하는 변이체 마커 단백질을 암호화하는 핵산 분자에 관한 것이다. 상기 변이체 마커 단백질은 천연 마커 단백질과는 아미노산 서열에 있어서 차이가 있지만 여전히 생물학적 활성을 보유한다. 하나의 양태에서, 상기 변이 마커 단백질은 마커 단백질의 아미노산 서열과 적어도 약 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 갖는다.
변이 마커 단백질을 암호화하는 분리된 핵산 분자는 마커 핵산의 뉴클레오타이드 서열에 하나 이상의 뉴클레오타이드 치환, 첨가 또는 결실을 도입하여 하나 이상의 아미노산 잔기 치환, 첨가 또는 결실이 암호화된 단백질에 도입되도록 하여 제조될 수 있다. 돌연변이는 부위 지시된 돌연변이 유발 및 PCR 매개된 돌연변이유발과 같은 표준 기술에 의해 도입될 수 있다. 바람직하게, 보존적 아미노산 치환은 하나 이상의 예측된 비필수 아미노산 잔기에서 수행된다. "보존적 아미노산 치환"은 아미노산 잔기가 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기로 대체된 것이다. 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기의 계열은 당업계에서 규명되어 있다. 이들 계열은 염기성 측쇄를 갖는 아미노산(예를 들면, 라이신, 아르기닌, 히스티딘), 산성 측쇄를 갖는 아미노산(예를 들면, 아스파르트산, 글루탐산), 비하전된 극성 측쇄를 갖는 아미노산(예를 들면, 글라이신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 시스테인), 비극성 측쇄를 갖는 아미노산(예를 들면, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판), 베타 분지된 측쇄를 갖는 아미노산(예를 들면, 트레오닌, 발린, 이소류신) 및 방향족 측쇄를 갖는 아미노산(예를 들면, 티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘)을 포함한다. 대안적으로, 돌연변이는 예를 들면, 포화 돌연변이 유발에 의해 암호화 서열의 전부 또는 일부를 따라 무작위로 도입될 수 있고, 수득된 돌연변이는 활성을 보유하는 돌연변이를 동정하기 위해 생물학적 활성에 대해 스크리닝될 수 있다. 돌연변이 유발 후, 암호화된 단백질은 재조합적으로 발현될 수 있고, 상기 단백질의 활성은 결정될 수 있다.
본 발명은 안티센스 핵산 분자, 즉, 본 발명의 센스 핵산에 상보적인 분자, 예를 들면, 이중 가닥 마커 cDNA 분자의 암호화 가닥에 상보적이거나 마커 mRNA 서열에 상보적인 분자를 포함한다. 따라서, 본 발명의 안티센스 핵산은 본 발명의 센스 핵산과 수소 결합(즉, 어닐링)할 수 있다. 상기 안티센스 핵산은 전체 암호화 가닥, 또는 단지 이의 일부, 예를 들면, 단백질 암호화 영역(또는 개방 판독 프레임)의 전부 또는 일부에 상보적일 수 있다. 안티센스 핵산 분자는 또한 마커 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열의 암호화 가닥의 비암호화 영역의 전부 또는 일부에 안티센스일 수 있다. 비암호화 영역("5' 및 3' 비해독 영역")은 암호화 영역을 플랭킹하고 아미노산으로 해독되지 않는 5' 및 3' 서열이다.
안티센스 올리고뉴클레오타이드는 예를 들면, 길이가 약 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 또는 50개 이상인 뉴클레오타이드일 수 있다. 본 발명의 안티센스 핵산은 당업계에 공지된 과정을 사용하는 화학적 합성 및 효소적 연결 반응으로 작제될 수 있다. 예를 들면, 안티센스 핵산 (예를 들면, 안티센스 올리고뉴클레오타이드)는 천연 뉴클레오타이드 또는 분자의 생물학적 안정성을 증가시키거나 안티센스 및 센스 핵산 간에 형성된 이중가닥의 물리적 안정성을 증가시키도록 디자인된 다양하게 변형된 뉴클레오타이드(예를 들면, 포스포로티오에이트 유도체 및 아크리딘 치환된 뉴클레오타이드가 사용될 수 있다)를 사용하여 화학적으로 합성될 수 있다. 안티센스 핵산을 제조하기 위해 사용될 수 있는 변형된 뉴클레오타이드의 예는 5-플루오로우라실, 5-브로모우라실, 5-클로로우라실, 5-요오도우라실, 하이포크산틴, 크산틴, 4-아세틸시토신, 5-(카복시하이드록실메틸) 우라실, 5-카복시메틸아미노메틸-2-티오우리딘, 5-카복시메틸아미노메틸우라실, 디하이드로우라실, 베타-D-갈락토실쿠에오신, 이노신, N6-이소펜테닐아데닌, 1-메틸구아닌, 1-메틸이노신, 2,2-디메틸구아닌, 2-메틸아데닌, 2-메틸구아닌, 3-메틸시토신, 5-메틸시토신, N6-아데닌, 7-메틸구아닌, 5-메틸아미노메틸우라실, 5-메톡시아미노메틸-2-티오우라실, 베타-D-만노실쿠에오신, 5'-메톡시카복시메틸우라실, 5-메톡시우라실, 2-메틸티오-N6-이소펜테닐아데닌, 우라실-5-옥시아세트산(v), 위부톡소신, 슈도우라실, 쿠에오신, 2-티오시토신, 5-메틸-2-티오우라실, 2-티오우라실, 4-티오우라실, 5-메틸우라실, 우라실-5-옥시아세트산 메틸에스테르, 우라실-5-옥시아세트산(v), 5-메틸-2-티오우라실, 3-(3-아미노-3-N-2-카복시프로파일)우라실, (acp3)w, 및 2,6-디아미노퓨린을 포함한다. 대안적으로, 상기 안티센스 핵산은, 핵산이 안티센스 배향으로 서브클로닝되는(즉, 삽입된 핵산으로부터 전사된 RNA는 하기의 서브섹션에서 추가로 기재되는 목적하는 표적 핵산에 안티센스 배양이 될 것이다) 발현 벡터를 사용하여 생물학적으로 제조될 수 있다.
본 발명의 안티센스 핵산 분자는 통상적으로 피검체에 투여되거나 동일계에서 제조되어, 이들은 마커 단백질을 암호화하는 세포 mRNA 및/또는 게놈 DNA와 하이브리드화하거나 이에 결합하여 예를 들면, 전사 및/또는 해독을 억제하므로써 마커의 발현을 억제한다. 상기 하이브리드화는 안정한 이중가닥을 형성하기 위한 통상적인 뉴클레오타이드 상보성에 의한 것이거나, 예를 들면, DNA 이중가닥에 결합하는 안티센스 핵산 분자의 경우에 이중가닥의 메이져 그루브에서의 특이적 상호작용을 통한 것일 수 있다. 본 발명의 안티센스 핵산 분자의 투여 경로의 예는 조직 부위로의 직접적인 주사 또는 육종 관련된 체액으로의 안티센스 핵산의 주입을 포함한다. 대안적으로, 안티센스 핵산 분자는 선택된 세포를 표적화하도록 변형될 수 있고 이어서 전신으로 투여될 수 있다. 예를 들면, 전신성 투여를 위해, 안티센스 분자는 이들이 선택된 세포 표면상에 발현된 수용체 또는 항원에 특이적으로 결합하도록, 예를 들면, 세포 표면 수용체 또는 항원에 결합하는 펩타이드 또는 항체에 안티센스 핵산 분자를 연결시킴에 의해 변형될 수 있다. 상기 안티센스 핵산 분자는 또한 본원에 기재된 벡터를 사용하여 세포에 전달될 수 있다. 안티센스 분자의 충분한 세포내 농도를 성취하기 위해서는, 안티센스 핵산 분자가 강한 pol II 또는 pol III 프로모터 조절하에 있도록 위치된 벡터 작제물이 바람직하다.
본 발명의 안티센스 핵산 분자는 α-아노머 핵산 분자일 수 있다. α-아노머 핵산 분자는 상보적인 RNA와 특이적인 이중 가닥의 하이브리드를 형성하고, 여기서, 통상적인 α-유니트와는 반대로, 상기 가닥들은 서로에 대해 평행하다(문헌참조: Gaultier et al., 1987, Nucleic Acids Res. 15:6625-6641). 상기 안티센스 핵산 분자는 또한 2'-o-메틸리보뉴클레오타이드(문헌참조: Inoue et al., 1987, Nucleic Acids Res. 15:6131-6148) 또는 키메라 RNA-DNA 유사체(문헌참조: Inoue et al., 1987, FEBS Lett. 215:327-330)를 포함할 수 있다.
본 발명은 또한 리보자임을 포함한다. 리보자임은 이들이 상보적인 영역을 갖는 mRNA와 같은 단일 가닥 핵산을 절단할 수 있는 리보뉴클레아제 활성을 갖는 촉매적 RNA 분자이다. 따라서, 리보자임(예를 들면, 문헌[참조: Haselhoff and Gerlach, 1988, Nature 334:585-591]에 기재된 바와 같은 해머헤드(hammerhead) 리보자임)을 사용하여 mRNA 전사체를 촉매적으로 절단함으로써 mRNA에 의해 암호화된 단백질의 해독을 억제할 수 있다. 마커 단백질을 암호화하는 핵산 분자에 대해 특이성을 갖는 리보자임은 마커에 상응하는 cDNA의 뉴클레오타이드 서열을 기초로 디자인될 수 있다. 예를 들면, 테트라하이메나(Tetrahymena) L-19 IVS RNA의 유도체는 활성 부위의 뉴클레오타이드 서열이 절단될 뉴클레오타이드 서열에 상보적이도록 작제될 수 있다(문헌참조: Cech et al. 미국 특허 제4,987,071호; and Cech et al. 미국 특허 제5,116,742호). 대안적으로, 본 발명의 폴리펩타이드를 암호화하는 mRNA를 사용하여 RNA 분자 풀로부터 특이적 리보뉴클레아제 활성을 갖는 촉매적 RNA를 선별할 수 있다(문헌참조: Bartel and Szostak, 1993, Science 261: 1411-1418).
본 발명은 또한 3중 나선 구조를 형성하는 핵산 분자를 포함한다. 예를 들면, 본 발명의 마커의 발현은 마커 핵산 또는 단백질을 암호화하는 유전자의 조절 영역(예를 들면, 프로모터 및/또는 인핸서)에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 표적화하여 표적 세포에서 유전자의 전사를 방해하는 3중 나선 구조를 형성하도록함으로써 억제될 수 있다. 일반적으로 문헌[참조: Helene (1991) Anticancer Drug Des. 6(6):569-84; Helene (1992) Ann. N.Y. Acad. Sci. 660:27-36; and Maher (1992) Bioassays 14(12):807-15]을 참조한다.
다양한 양태에서, 본 발명의 핵산 분자는 염기 잔기, 당 잔기 또는 포스페이트 골격을 변형시켜, 예를 들면, 상기 분자의 안정성, 하이브리드화 또는 가용성을 개선시킬 수 있다. 예를 들면, 핵산의 데옥시리보스 포스페이트 골격은 펩타이드 핵산을 생성하도록 변형될 수 있다(문헌참조: Hyrup et al., 1996, Bioorganic & Medicinal Chemistry 4(1): 5-23). 본원에 사용된 용어 "펩타이드 핵산" 또는 "PNA"는 핵산 모사체, 예를 들면, DNA 모사체를 언급하고, 여기서, 데옥시리보스 포스페이트 골격은 슈도펩타이드 골격으로 대체되고 단지 4개의 천연 핵염기(nucleobase)가 보유된다. PNA의 중성 골격은 낮은 이온 강도의 조건하에서 DNA 및 RNA와의 특이적인 하이브리드화가 가능하도록 하는 것으로 나타났다. PNA 올리고머의 합성은 문헌[참조: Hyrup et al. (1996), supra; Perry-O'Keefe et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 14670-675]에 기재된 바와 같은 표준 고형상 펩타이드 합성 프로토콜을 사용하여 수행될 수 있다.
PNA는 치료적 및 진단학적 응용에 사용될 수 있다. 예를 들면, PNA는, 예를 들면, 전사 또는 해독 정지를 유도하거나 복제를 억제함에 의해 유전자 발현의 서열 특이적 조정을 위한 안티센스 또는 안티센스 제제로서 사용될 수 있다. PNA는 또한 예를 들면, PNA 지시된 PCR 클램핑에 의한 유전자내 단일 염기쌍 돌연변이 분석에서 사용될 수 있거나; 다른 효소, 예를 들면, S1 뉴클레아제(문헌참조: Hyrup (1996), supra)와 조합하여 사용되는 경우 인공 제한 효소로서 사용될 수 있거나 DNA 서열 분석 및 하이브리드화를 위한 프로브 또는 프라이머[문헌참조: Hyrup, 1996, supra; Perry-O'Keefe et al., 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 14670-675]로서 사용될 수 있다.
또 다른 양태에서, PNA는 예를 들면, 친지성 또는 다른 헬퍼 그룹을 PNA에 부착시키거나, PNA-DNA 키메라를 형성시키거나, 리포좀을 사용하거나 당업계에 공지된 약물 전달의 다른 기술을 사용함에 의해 이들의 안정성 또는 세포 흡수를 증진시키기 위해 변형될 수 있다. 예를 들면, PNA 및 DNA의 유리한 성질이 조합될 수 있는 PNA-DNA 키메라가 제조될 수 있다. 상기 키메라는 DNA 인지 효소, 예를 들면, RNase H 및 DNA 폴리머라제가 DNA 부분과 상호작용하도록 할 수 있고, PNA 부분은 높은 결합 친화성 및 특이성을 제공할 것이다. PNA-DNA 키메라는 염기 스택킹(stacking), 핵염기들 간의 결합 수 및 배향의 측면에서 선택된 적당한 길이의 링커를 사용하여 연결될 수 있다(문헌참조: Hyrup, 1996, supra). PNA-DNA 키메라의 합성은 문헌[참조: Hyrup (1996), supra, and Finn et al. (1996) Nucleic Acids Res. 24(17):3357-63]에 기재된 바와 같이 수행될 수 있다. 예를 들면, DNA 쇄는 표준 포스포르아미디트 커플링 화학반응 및 변형된 뉴클레오사이드 유사체를 사용하여 고형 지지체상에서 합성될 수 있다. 5'-(4-메톡시트리틸)아미노-5'-데옥시-티미딘 포스포르아미디트와 같은 화합물이 PNA와, DNA의 5' 말단간의 링커로서 사용될 수 있다(문헌참조: Mag et al., 1989, Nucleic Acids Res. 17:5973-88). 이어서, PNA 단량체는 단계적 방식으로 커플링하여 5' PNA 절편과 3' DNA 절편을 갖는 키메라 분자를 생성한다(문헌참조: Finn et al., 1996, Nucleic Acids Res. 24(17):3357-63). 대안적으로, 키메라 분자는 5' DNA 절편과 3' PNA 절편이 함께 합성될 수 있다(문헌참조: Peterser et al., 1975, Bioorganic Med. Chem. Lett. 5: 1119-11124).
다른 양태에서, 올리고뉴클레오타이드는 펩타이드와 같은 다른 부가 그룹(예를 들면, 생체내 숙주 세포 수용체를 표적화하기 위해) 또는 세포막을 통과하는 수송을 촉진시키는 제제(문헌참조: Letsinger et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:6553-6556; Lemaitre et al., 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:648-652; PCT Publication No. WO 88/09810) 또는 혈뇌 장벽(문헌참조: PCT Publication No. WO 89/10134)을 포함할 수 있다. 또한, 올리고뉴클레오타이드는 하이브리드화-유발 절단 제제(문헌참조: Krol et al., 1988, Bio/Techniques 6:958-976) 또는 삽입성 제제(intercalating agent)(문헌참조: Zon, 1988, Pharm. Res. 5:539-549)를 사용하여 변형될 수 있다. 이러한 목적을 위해, 올리고뉴클레오타이드는 또 다른 분자, 예를 들면, 펩타이드, 하이브리드화 유발 가교결합제, 수송 제제, 하이브리드화 유발 절단 제제 등에 접합될 수 있다.
본 발명은 또한 본 발명의 핵산에 상보적인 하나 이상의 영역을 갖는 분자 비콘(beacon) 핵산을 포함하고, 이때 분자 비콘은 샘플내 본 발명의 핵산의 존재를 정량하기 위해 유용하다. "분자 비콘" 핵산은 한쌍의 상보적 영역을 포함하고 형광단 및 이와 연합된 형광성 켄처(quencher)를 갖는 핵산이다. 형광단 및 켄처는 상보적 영역이 서로 어닐링되는 경우 형광단의 형광이 켄처에 의해 켄칭되도록 하는 배향으로 핵산의 상이한 부분과 연합되어 있다. 핵산의 상보적 영역이 서로 어닐링되지 않는 경우, 형광단의 형광은 보다 적은 정도로 켄칭된다. 분자 비콘 핵산은 예를 들면, 미국 특허 제5,876,930호에 기재되어 있다.
2. 분리된 단백질 및 항체
본 발명의 한가지 측면은 마커 단백질 또는 이의 단편에 대해 지시된 항체를 생성하기 위한 면역원으로서 사용하기에 적합한 폴리펩타이드 단편 뿐만 아니라 분리된 마커 단백질 및 이의 생물학적 활성 부분에 관한 것이다. 하나의 양태에서, 천연 마커 단백질은 표준 단백질 정제 기술을 사용한 적당한 정제 계획에 의해 세포 또는 조직 공급원으로부터 분리될 수 있다. 또 다른 양태에서, 마커 단백질의 전체 또는 절편을 포함하는 단백질 또는 펩타이드는 재조합 DNA 기술에 의해 제조된다. 재조합 발현에 대안적으로, 상기 단백질 또는 펩타이드는 표준 펩타이드 합성 기술을 사용하여 화학적으로 합성될 수 있다.
"분리된" 또는 "정제된" 단백질 또는 이의 생물학적 활성 부분은 단백질이 유래된 세포 또는 조직 공급원으로부터의 세포성 물질 또는 기타 오염 단백질이 부재하거나 또는 화학적으로 합성되는 경우 화학적 전구체 또는 다른 화학물질이 실질적으로 부재이다. 표현 "세포성 물질이 실질적으로 부재인"은 분리되거나 재조합적으로 제조되는 세포의 세포 성분으로부터 단백질이 분리된 단백질 제제를 포함한다. 따라서, 세포성 물질이 실질적으로 부재인 단백질은 약 30%, 20%, 10%, 또는 5% (무수 중량 기준) 미만의 이종성 단백질(또한 본원에서 "오염 단백질"로서 언급됨)을 갖는 단백질 제제를 포함한다. 단백질 또는 이의 생물학적 활성 부분이 재조합적으로 제조되는 경우, 바람직하게는 배양 배지가 실질적으로 부재이다. 즉 배양 배지는 단백질 제제의 약 20%, 10%, 또는 5% 미만의 용량을 차지한다. 단백질이 화학적 합성에 의해 제조되는 경우, 바람직하게 화학적 전구체 또는 기타 화학물질이 실질적으로 부재이다. 즉, 단백질 합성에 관여하는 화학적 전구체 또는 다른 화학물질로부터 분리되어 있다. 따라서, 상기 단백질 제제는 목적하는 폴리펩타이드를 제외한 화학적 전구체 또는 화합물을 약 30%, 20%, 10% 또는 5% (무수 중량 기준) 미만으로 갖는다.
마커 단백질의 생물학적 활성 부분은, 전장 단백질보다 적은 아미노산을 포함하고 상응하는 전장 단백질의 하나 이상의 활성을 나타내는 마커 단백질의 아미노산 서열과 충분히 동일하거나 이로부터 유래된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 포함한다. 통상적으로, 생물학적 활성 단백질은 상응하는 전장 단백질의 하나 이상의 활성을 갖는 도메인 또는 모티프를 포함한다. 본 발명의 마커 단백질의 생물학적 활성 부분은 예를 들면, 길이가 10, 25, 50 또는 100개 이상의 아미노산인 폴리펩타이드일 수 있다. 더욱이, 마커 단백질의 다른 영역이 결실된 다른 생물학적 활성 부분은 재조합 기술에 의해 제조될 수 있고, 본래 형태의 마커 단백질의 기능성 활성 중 하나 이상에 대해 평가될 수 있다.
바람직한 마커 단백질은 표 2 내지 9에 열거된 임의의 유전자를 암호화하는 서열을 포함하는 뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화된다. 다른 유용한 단백질은 이들 서열 중 하나와 실질적으로 동일하고(예를 들면, 약 40% 이상, 바람직하게는 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%), 상응하는 천연 마커 단백질의 기능적 활성을 보유하지만 본래의 대립형질 유전자 변이 또는 돌연변이 유발로 인해 아미노산 서열이 상이하다.
2개의 아미노산 서열 또는 2개의 핵산의 % 동일성을 결정하기 위해, 서열은 최적의 비교 목적을 위해 정열된다(예를 들면, 갭은 제2 아미노산 또는 핵산 서열과의 최적의 정렬을 위해 제1 아미노산 서열 또는 핵산 서열에 도입될 수 있다). 이어서, 상응하는 아미노산 위치 또는 뉴클레오타이드 위치에서 아미노산 잔기 또는 뉴클레오타이드가 비교된다. 제1 서열 중 위치가 제2 서열 중 상응하는 위치에서 동일한 아미노산 잔기 또는 뉴클레오타이드에 의해 차지되는 경우, 상기 분자는 상기 위치에서 동일하다. 바람직하게, 2개 서열들 간의 % 동일성은 전체 정렬을 사용하여 계산된다. 대안적으로, 2개 서열들 간의 % 동일성은 국소 정렬을 사용하여 계산된다. 2개의 서열들 간의 % 동일성은 서열에 의해 공유되는 동일한 위치의 갯수의 함수이다(즉, % 동일성 = 동일한 위치의 #/총 위치의 #(예를 들면, 중첩하는 위치) x 1OO). 하나의 양태에서, 2개의 서열들은 동일한 길이이다. 또 다른 양태에서, 2개의 서열들은 동일한 길이가 아니다.
2개의 서열들 간의 % 동일성의 결정은 수학적 알고리듬을 사용하여 수행될 수 있다. 2개 서열들의 비교를 위해 사용되는 수학적 알고리듬의 바람직한 비제한적인 예는 문헌[참조: Karlin and Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877]에서와 같이 변형된, 문헌[참조: Karlin and Altschul (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-2268]의 알고리듬이다. 상기 알고리듬은 문헌[참조: Altschul, et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410]의 BLASTN 및 BLASTX 프로그램으로 도입된다. BLAST 뉴클레오타이드 검색은 BLASTN 프로그램, 스코어 = 100, 단어길이 = 12와 함께 수행되어 본 발명의 핵산 분자에 상동성인 뉴클레오타이드 서열을 수득할 수 있다. BLAST 단백질 검색은 BLASTP 프로그램, 스코어 = 50, 단어길이 = 3과 함께 수행되어 본 발명의 단백질 분자와 상동성인 아미노산 서열을 수득할 수 있다. 비교 목적을 위한 갭 정렬을 수득하기 위해, 갭 BLAST로 불리우는 신규 버젼의 BLAST 알고리듬을 문헌[참조: Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389-3402]에 기재된 바와 같이 사용하여 프로그램 BLASTN, BLASTP 및 BLASTX에 대한 갭 국소 정렬을 수행할 수 있다. 대안적으로, PSI-Blast를 사용하여 분자들 간의 원거리 관계를 검출하는 반복되는 검색을 수행할 수 있다. BLAST, 갭 BLAST 및 PSI-Blast 프로그램을 사용하는 경우, 각각의 프로그램(예를 들면, BLASTX 및 BLASTN)에 대한 내정 파라메터가 사용될 수 있다. 웹사이트(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)를 참조한다. 서열의 비교를 위해 사용되는 수학적 알고리듬의 또 다른 바람직한 비제한적인 예는 문헌[참조: Myers and Miller, (1988) CABIOS 4: 11-17]의 알고리듬이다. 상기 알고리듬은 GCG 서열 정렬 소프트웨어 팩키지의 일부인 ALIGN 프로그램(버젼 2.0)으로 도입된다. 아미노산 서열을 비교하기 위해 ALIGN 프로그램을 사용하는 경우, PAM120 중량 잔기 표, 갭 길이 페널티 12, 및 갭 페널티 4를 사용할 수 있다. 국소 서열 유사성 및 정렬을 갖는 영역을 동정하기 위한 또 다른 유용한 알고리듬은 문헌[참조: Pearson and Lipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444-2448]에 기재된 바와 같은 FASTA 알고리듬이다. 뉴클레오타이드 또는 아미노산 서열을 비교하기 위해 FASTA 알고리듬을 사용하는 경우, PAM120 중량 잔기 표가 예를 들면, k-tuple 값 2와 함께 사용될 수 있다.
2개의 서열들 간의 % 동일성은 갭의 허용 또는 허용 없이 상기된 것들과 유사한 기술을 사용하여 결정될 수 있다. % 동일성을 계산하는데 있어서, 단지 정확한 매치만이 계산된다.
본 발명은 또한 마커 단백질 또는 이의 절편을 포함하는 키메라 또는 융합 단백질을 제공한다. 본원에 사용된 "키메라 단백질" 또는 "융합 단백질"은 이종성 폴리펩타이드(즉, 마커 단백질 이외의 폴리펩타이드)에 작동적으로 연결된(operably linked) 마커 단백질의 전부 또는 일부(바람직하게는 생물학적 활성 부분)를 포함한다. 융합 단백질 내에서, 용어 "작동적으로 연결된"은 마커 단백질 또는 이의 절편 및 이종성 폴리펩타이드가 서로 프레임내 융합되는 것임을 지시하는 것으로 의도된다. 상기 이종성 폴리펩타이드는 마커 단백질 또는 절편의 아미노 말단 또는 카복실 말단에 융합될 수 있다.
한가지 유용한 융합 단백질은 마커 단백질 또는 절편이 GST 서열의 카복실 말단에 융합된 GST 융합 단백질이다. 상기 융합 단백질은 본 발명의 재조합 폴리펩타이드의 정제를 촉진시킬 수 있다.
또 다른 양태에서, 상기 융합 단백질은 이의 아미노 말단에 이종성 시그날 서열을 함유한다. 예를 들면, 마커 단백질의 본래의 시그날 서열은 제거될 수 있고 또 다른 단백질 기원의 시그날 서열로 대체될 수 있다. 예를 들면, 바쿨로바이러스 외피 단백질의 gp67 분비 서열은 이종성 시그날 서열로서 사용될 수 있다(문헌참조: Ausubel et al., ed., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY, 1992). 진핵세포 이종성 시그날 서열의 다른 예는 멜리틴 및 사람 태반 알칼리성 포스파타제의 분비 서열을 포함한다(문헌참조: Stratagene; La Jolla, California). 또 다른 예에서, 유용한 원핵세포 이종성 시그날 서열은 phoA 분비 서열(문헌참조: Sambrook et al., supra) 및 단백질 A 분비 시그날(문헌참조: Pharmacia Biotech; Piscataway, New Jersey)을 포함한다.
또 다른 양태에서, 융합 단백질은 마커 단백질의 전부 또는 일부가 면역글로불린 단백질 계열의 구성원으로부터 유래된 서열과 융합된 면역글로불린 융합 단백질이다. 본 발명의 면역글로불린 융합 단백질은 약제학적 조성물 중에 혼입될 수 있고 피검체에 투여되어 리간드(가용성 또는 막 결합된)와 세포의 표면상의 단백질(수용체)간의 상호작용을 억제하므로써 생체내 시그날 전달을 억제할 수 있다. 상기 면역글로불린 융합 단백질은 마커 단백질의 동족 리간드의 생체이용율에 영향을 주도록 사용될 수 있다. 리간드/수용체 상호작용의 억제는 증식성 및 분화성 장애를 치료하고 세포 생존을 조정(예를 들면, 촉진시키거나 억제하는)하기 위해 치료적으로 유용할 수 있다. 더욱이, 본 발명의 면역글로불린 융합 단백질은 피검체에서 마커 단백질에 대해 지시된 항체를 제조하고 리간드를 정제하기 위한 면역원으로서 사용될 수 있고, 리간드와 마커 단백질의 상호작용을 억제하는 분자를 동정하기 위한 스크리닝 분석에서 면역원으로서 사용될 수 있다.
본 발명의 키메라 및 융합 단백질은 표준 재조합 DNA 기술에 의해 제조될 수 있다. 또 다른 양태에서, 상기 융합 유전자는 자동화 DNA 합성기를 포함하는 통상적인 기술에 의해 합성될 수 있다. 대안적으로, 유전자 단편의 PCR 증폭은, 후속적으로 어닐링되고 재증폭되어 키메라 유전자 서열을 생성할 수 있는 2개의 연속 유전자 단편들 간의 상보적 오버행(overhang)을 유도하는 앵커(anchor) 프라이머를 사용하여 수행될 수 있다(문헌참조: Ausubel et al., supra). 더욱이, 융합 잔기(예를 들면, GST 폴리펩타이드)를 이미 암호화하는 많은 발현 벡터가 시판되고 있다. 본 발명의 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산은, 융합 잔기가 본 발명의 폴리펩타이드에 프레임내 연결되도록 상기 발현 벡터에 클로닝될 수 있다.
시그날 서열을 사용하여 마커 단백질의 분비 및 분리를 촉진시킬 수 있다. 시그날 서열은 통상적으로 하나 이상의 절단 반응에서 분비 동안에 일반적으로 성숙한 단백질로부터 절단되는 소수성 아미노산의 코어를 특징으로 한다. 상기 시그날 펩타이드는 이들이 분비 경로를 통과함에 따라 성숙한 단백질로부터 시그날 서열의 절단을 가능하게 하는 프로세싱 부위를 함유한다. 따라서, 본 발명은 시그날 서열이 단백질분해적으로 절단되는 상기 단백질(즉, 절단 생성물) 뿐만 아니라 시그날 서열을 갖는 마커 단백질, 융합 단백질 또는 이의 절편에 관한 것이다. 하나의 양태에서, 시그날 서열을 암호화하는 핵산 서열은 발현 벡터에서 마커 단백질 또는 이의 절편과 같은 목적하는 단백질에 작동적으로 연결될 수 있다. 상기 시그날 서열은 예를 들면, 발현 벡터가 형질전환되는 진핵세포 숙주로부터 단백질의 분비를 지시하고 상기 시그날 서열은 후속적으로 또는 동시에 절단된다. 이어서, 상기 단백질은 당업계에 인지된 방법들에 의해 세포외 매질로부터 용이하게 정제될 수 있다. 대안적으로, 상기 시그날 서열은 예를 들면, GST 도메인과 함께 정제를 촉진시키는 서열을 사용하여 목적하는 단백질에 연결될 수 있다.
본 발명은 또한 마커 단백질의 변이체에 관한 것이다. 상기 변이체는 효능제(모사체) 또는 길항제 중 하나로서 작용할 수 있는 변화된 아미노산 서열을 갖는다. 변이체는 돌연변이유발, 예를 들면, 분별 점 돌연변이 또는 절단에 의해 생성될 수 있다. 효능제는 실질적으로 천연 형태의 단백질과 실질적으로 동일하거나 서브세트의 생물학적 활성을 보유할 수 있다. 단백질의 길항제는 예를 들면, 목적하는 단백질을 포함하는 세포성 시그날 전달 연쇄반응의 다운스트림 또는 업스트림 구성원에 경쟁적으로 결합하여 천연 형태의 단백질의 하나 이상의 활성을 억제할 수 있다. 따라서, 특이적 생물학적 효과는 제한된 기능을 갖는 변이체로 처리함에 의해 유발될 수 있다. 천연 형태의 단백질의 서브세트의 생물학적 활성을 갖는 변이체를 사용한 피검체의 치료는 천연 형태의 단백질로 치료하는 것과 비교하여 피검체에서 보다 적은 부작용을 가질 수 있다.
효능제(모사체) 또는 길항제 중 하나로서 기능하는 마커 단백질의 변이체는 효능제 또는 길항제 활성에 대한 본 발명의 단백질의 돌연변이체, 예를 들면, 절단 돌연변이체의 조합 라이브러리를 스크리닝함에 의해 동정될 수 있다. 하나의 양태에서, 다양한 라이브러리의 변이체가 핵산 수준에서 조합적 돌연변이유발에 의해 생성되고, 다양한 유전자 라이브러리에 의해 암호화된다. 다양한 라이브러리의 변이체는 예를 들면, 합성 올리고뉴클레오타이드의 혼합물을 유전자 서열에 효소적으로 연결시켜 축퇴성 세트의 잠재적 단백질 서열이 개별 폴리펩타이드로서 또는 대안적으로 보다 큰 융합 단백질(예를 들면, 상 디스플레이를 위해)의 세트로서 발현가능하도록함에 의해 제조될 수 있다. 축퇴성 올리고뉴클레오타이드 서열로부터 마커 단백질의 잠재적인 변이체 라이브러리를 제조하기 위해 사용될 수 있는 다양한 방법들이 있다. 축퇴성 올리고뉴클레오타이드를 합성하기 위한 방법들은 당업계에 공지되어 있다(문헌참조: Narang, 1983, Tetrahedron 39:3; Itakura et al., 1984, Annu. Rev. Biochem. 53:323; Itakura et al., 1984, Science 198: 1056; Ike et al., 1983 Nucleic Acid Res. 11:477).
또한, 마커 단백질 절편의 라이브러리를 사용하여 변이 마커 단백질 또는 이의 절편의 스크리닝 및 후속적 선별용으로 다양한 집단의 폴리펩타이드를 제조할 수 있다. 예를 들면, 암호화 서열 단편의 라이브러리는 목적하는 암호화 서열의 이중 가닥의 PCR 단편을 분자당 단지 약 1개의 닉(nick)이 발생하는 조건하에 뉴클레아제로 처리하고, 상기 이중 가닥 DNA를 변성시키고, 상이한 닉킹된 생성물로부터 센스/안티센스 쌍을 포함할 수 있는 이중 가닥의 DNA를 형성하도록 상기 DNA를 복원시키고, SI 뉴클레아제로 처리하여 재형성된 이중 가닥으로부터 단일 가닥 부분을 제거하고, 수득된 단편 라이브러리를 발현 벡터에 연결시킴에 의해 제조될 수 있다. 상기 방법에 의해, 목적하는 다양한 크기의 단백질의 아미노 말단 및 내부 단편을 암호화하는 발현 라이브러리가 유도될 수 있다.
점 돌연변이 또는 절단에 의해 제조된 조합 라이브러리의 유전자 생성물을 스크리닝하고 선택된 성질을 갖는 유전자 생성물에 대한 cDNA 라이브러리를 스크리닝하기 위한 여러 기술이 당업계에 공지되어 있다. 대형 유전자 라이브러리를 스크리닝하기 위해 고처리량 분석에 적합할 수 있는 가장 광범위하게 사용되는 기술은 통상적으로 유전자 라이브러리를 복제가능한 발현 벡터에 클로닝하고, 적당한 세포를 수득된 라이브러리의 벡터와 형질전환시키고, 목적하는 활성의 검출이, 생성물이 검출되는 유전자를 암호화하는 벡터의 분리를 촉진시키는 조건하에서 조합적 유전자를 발현시킴을 포함한다. 라이브러리 중 기능성 돌연변이의 빈도수를 증진시키는 반복적 앙상블 돌연변이유발(recursive ensemble mutagenesis: REM) 기술은 본 발명의 단백질의 변이체를 동정하기 위한 스크리닝 분석과 조합하여 사용될 수 있다(문헌참조: Arkin and Yourvan, 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:7811-7815; Delgrave et al., 1993, Protein Engineering 6(3):327- 331).
본 발명의 또 다른 측면은 본 발명의 단백질에 대해 지시된 항체에 관한 것이다. 바람직한 양태에서, 항체는 마커 단백질 또는 이의 단편과 특이적으로 결합한다. 본원에서 상호교환적으로 사용되는 용어 "항체" 및 "항체들"은 면역글로불린 분자의 면역 활성 부분(즉, 당해 부분은 마커 단백질과 같은 항원, 예를 들면, 마커 단백질의 에피토프에 특이적으로 결합하는 항원 결합 부위를 함유한다)을 포함하는 단편 및 이의 유도체 뿐만 아니라 면역글로불린 분자를 언급한다. 본 발명의 단백질에 특이적으로 결합하는 항체는 상기 단백질에 결합하는 항체이지만, 샘플, 예를 들면, 상기 단백질을 천연적으로 함유하는 생물학적 샘플 중에 다른 분자와는 실질적으로 결합하지 않는 항체이다. 면역글로불린 분자의 면역 활성 부분의 예는 단일쇄 항체(scAb), F(ab) 및 F(ab')2 단편을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 분리된 단백질 또는 이의 단편은 항체를 제조하기 위한 면역원으로서 사용될 수 있다. 전장 단백질이 사용될 수 있거나, 대안적으로 본 발명은 면역원으로서 사용하기 위한 항원성 펩타이드 단편을 제공한다. 본 발명의 단백질의 항원성 펩타이드는 본 발명의 단백질 중 하나의 아미노산 서열의 8개 이상(바람직하게는 10, 15, 20, 또는 30개 이상)의 아미노산 잔기를 포함하고, 단백질의 하나 이상의 에피토프를 포함하여 펩타이드에 대해 생성된 항체는 상기 단백질과 특이적 면역 복합체를 형성한다. 항원성 펩타이드에 의해 포함되는 바람직한 에피토프는 단백질의 표면상에 위치하는 영역, 예를 들면, 친수성 영역이다. 소수성 서열 분석, 친수성 서열 분석 또는 유사한 분석을 사용하여 친수성 영역을 동정할 수 있다. 바람직한 양태에서, 분리된 마커 단백질 또는 이의 단편은 면역원으로서 사용된다.
면역원은 통상적으로 적합한(즉, 면역적격성) 피검체, 예를 들면, 토끼, 염소, 마우스 또는 다른 포유동물 또는 척추동물을 면역화시킴에 의해 항체를 제조하는데 사용된다. 적당한 면역원성 제제는 예를 들면, 재조합적으로 발현되거나 화학적으로 합성된 단백질 또는 펩타이드를 함유할 수 있다. 상기 제제는 프로인트(Freund) 완전 또는 불완전 보조제 또는 유사한 면역자극제와 같은 보조제를 추가로 포함할 수 있다. 바람직한 면역원 조성물은 예를 들면, 본 발명의 단백질의 재조합 발현을 위해 비사람 숙주 세포를 사용하여 제조된 면역원성 조성물과 같이, 기타 사람 단백질을 함유하지 않는 것들이다. 상기 방식으로, 수득된 항체 조성물은 본 발명의 단백질 이외의 사람 단백질에 대한 결합이 감소되거나 이에 대한 결합이 전혀 없다.
본 발명은 폴리클로날 및 모노클로날 항체를 제공한다. 본원에 사용된 용어 "모노클로날 항체" 또는 "모노클로날 항체 조성물"은 특정 에피토프와 면역반응할 수 있는 단지 한 종의 항원 결합 부위를 함유하는 항체 분자 집단을 언급한다. 바람직한 폴리클로날 및 모노클로날 항체 조성물은 본 발명의 단백질에 대해 지시된 항체들에 대해 선택된 것들이다. 특히 바람직한 폴리클로날 및 모노클로날 항체 제제는 마커 단백질 또는 이의 단편에 대해 지시된 항체만을 함유하는 것들이다.
폴리클로날 항체는 적합한 피검체를 면역원으로서 본 발명의 단백질로 면역화시킴에 의해 제조될 수 있다. 면역화된 피검체에서 항체 역가는 고정화된 폴리펩타이드를 사용하는 효소 연결된 면역흡착 분석(ELISA)을 사용하는 것과 같은 표준 기술에 의해 시간 경과에 따라 모니터링할 수 있다. 면역화 후 적당한 시간에, 예를 들면, 특이적 항체 역가가 최고인 경우, 항체 생산 세포는 피검체로부터 수득될 수 있고 문헌[참조: Kohler and Milstein (1975) Nature 256:495-497]에 의해 최초 기재된 하이브리도마 기술, 사람 B 세포 하이브리도마 기술(문헌참조: Kozbor et al., 1983, Immunol. Today 4:72), EBV-하이브리도마 기술(문헌참조: Cole et al., pp. 77-96 In Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., 1985) 또는 트리오마(trioma) 기술과 같은 표준 기술에 의해 모노클로날 항체(mAb)를 제조하기 위해 사용될 수 있다. 하이브리도마를 제조하기 위한 기술은 널리 공지되어 있다(문헌참조: 일반적으로 Current Protocols in Immunology, Coligan et al. ed., John Wiley & Sons, New York, 1994). 본 발명의 모노클로날 항체를 생산하는 하이브리도마 세포는 예를 들면, 표준 ELISA 분석을 사용하여, 목적하는 폴리펩타이드에 결합하는 항체에 대한 하이브리도마 배양 상청액을 스크리닝함에 의해 검출된다.
모노클로날 항체 분비 하이브리도마를 제조하기 위한 대안적으로, 본 발명의 단백질에 대해 지시된 모노클로날 항체는 목적하는 폴리펩타이드로 재조합 조합적 면역글로불린 라이브러리(예를 들면, 항체 파지 디스플레이 라이브러리)를 스크리닝함에 의해 동정되고 분리될 수 있다. 파지 디스플레이 라이브러리를 제조하고 스크리닝하기 위한 키트는 시판되고 있다[예를 들면, 파마시아 재조합 파지 항체 시스템(Pharmacia Recombinant Phage Antibody System), Catalog No. 27-9400-01; 및 스트라타진 (Stratagene) SurfZAP 파지 디스플레이 키트, Catalog No. 240612]. 추가로, 항체 디스플레이 라이브러리를 제조하고 스크리닝하는데 사용하기에 특히 적합한 방법 및 시약의 예는, 예를 들면 문헌[참조: 미국 특허 제5,223,409호; PCT 공개 번호 WO 92/18619; PCT 공개 번호 WO 91/17271; PCT 공개 번호 WO 92/20791; PCT 공개 번호 WO 92/15679; PCT 공개 번호 WO 93/01288; PCT 공개 번호 WO 92/01047; PCT 공개 번호 WO 92/09690; PCT 공개 번호 WO 90/02809; Fuchs et al. (1991) Bio/Technology 9: 1370-1372; Hay et al. (1992) Hum. Antibod. Hybridomas 3:81-85; Huse et al. (1989) Science 246: 1275-1281; Griffiths et al. (1993) EMBO J. 12:725-734]에서 찾을 수 있다.
본 발명은 또한 본 발명의 단백질에 특이적으로 결합하는 재조합 항체를 제공한다. 바람직한 양태에서, 재조합 항체는 마커 단백질 또는 이의 단편에 특이적으로 결합한다. 재조합 항체는, 사람 및 비사람 부분 둘 다, 단일쇄 항체 및 다중 특이적 항체를 포함하는 키메라 및 사람화된 모노클로날 항체를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 키메라 항체는 상이한 부분이 상이한 동물 종으로부터 유래되는 분자로서 예를 들면, 쥐 mAb로부터 유래된 가변 영역 및 사람 면역글로불린 불변 영역을 갖는 것들이다[문헌참조: Cabilly et al., 미국 특허 제4,816,567호; 및 Boss et al., 미국 특허 제4,816,397호, 이의 전문이 본원에 참조로서 인용됨]. 단일쇄 항체는 하나의 항원 결합 부위를 갖고 단일 폴리펩타이드로 이루어진다. 이들은 당업계에 공지된 기술에 의해, 예를 들면, 문헌[참조: Ladner et. al, 미국 특허 제4,946,778호(이의 전문이 본원에 참조로서 인용됨); Bird et al., (1988) Science 242:423-426; Whitlow et al., (1991) Methods in Enzymology 2: 1-9; Whitlow et al., (1991) Methods in Enzymology 2:97-105; and Huston et al., (1991) Methods in Enzymology Molecular Design and Modeling: Concepts and Applications 203:46-88]에 기재된 방법들을 사용하여 제조될 수 있다. 다중 특이적 항체는 상이한 항원에 특이적으로 결합하는 2개 이상의 항원 결합 부위를 갖는 항체 분자이다. 상기 분자는 당업계에 공지된 기술에 의해, 예를 들면, 문헌[참조: Segal, 미국 특허 제4,676,980호(이의 전문이 본원에 참조로서 인용됨); Holliger et al., (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448; Whitlow et al., (1994) Protein Eng. 7: 1017-1026 및 미국 특허 제6,121,424호]에 기재된 방법을 사용하여 제조될 수 있다.
사람화된 항체는 비사람 종 기원의 하나 이상의 상보성 결정 영역(CDR) 및 사람 면역글로불린 분자 기원의 프레임워크 영역을 갖는 비사람 종 기원의 항체 분자이다[문헌참조: Queen, 미국 특허 제5,585,089호, 이의 전문이 본원에 참조로서 인용됨]. 사람화된 모노클로날 항체는 당업계에 공지된 재조합 DNA 기술에 의해, 예를 들면, 문헌[참조: PCT 공개 번호 제WO 87/02671호; 유럽 특허 출원 제184,187호; 유럽 특허 출원 제171,496호; 유럽 특허 출원 제173,494호; PCT 공개 번호 제WO 86/01533호; 미국 특허 제4,816,567호; 유럽 특허 출원 제125,023호; Better et al. (1988) Science 240: 1041-1043; Liu et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:3439-3443; Liu et al. (1987) J. Immunol. 139:3521- 3526; Sun et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:214-218; Nishimura et al. (1987) Cancer Res. 47:999-1005; Wood et al. (1985) Nature 314:446-449; and Shaw et al. (1988) J. Natl. Cancer Inst. 80: 1553-1559); Morrison (1985) Science 229: 1202-1207; Oi et al. (1986) Bio/Techniques 4:214; 미국 특허 제5,225,539호; Jones et al. (1986) Nature 321:552-525; Verhoeyan et al. (1988) Science 239: 1534; and Beidler et al. (1988) J. Immunol. 141:4053-4060.]에 기재된 방법을 사용하여 제조될 수 있다.
보다 특히, 사람화된 항체는 예를 들면, 내인성 면역글로불린 중쇄 및 경쇄 유전자를 발현할 수 있지만 사람 중쇄 및 경쇄 유전자를 발현할 수 있는 유전자전이 마우스를 사용하여 제조될 수 있다. 유전자전이 마우스는 정상적인 양상으로 선택된 항원, 예를 들면, 본 발명의 마커에 상응하는 폴리펩타이드의 전부 또는 일부로 면역화시킨다. 상기 항원에 대해 지시된 모노클로날 항체는 통상적인 하이브리도마 기술을 사용하여 수득될 수 있다. 유전자전이 마우스가 함유하는 사람 면역글로불린 전이유전자는 B 세포 분화 동안에 재배열하고, 이어서 클래스 스위칭 및 체세포 돌연변이를 진행한다. 따라서, 상기 기술을 사용하여, 치료적으로 유용한 IgG, IgA 및 IgE 항체를 제조할 수 있다. 사람 항체를 제조하기 위한 상기 기술의 고찰을 위해 문헌[참조: Lonberg and Huszar (1995) Int. Rev. Immunol. 13:65-93)]을 참조한다. 사람 항체 및 사람 모노클로날 항체를 제조하기 위한 상기 기술 및 상기 항체를 제조하기 위한 프로토콜의 상세한 논의를 위해, 예를 들면, 문헌[참조: 미국 특허 제5,625,126호; 미국 특허 제5,633,425호; 미국 특허 제5,569,825호; 미국 특허 제5,661,016호; 및 미국 특허 제5,545,806호]을 참조한다. 또한, 제조원[예를 들면 Abgenix, Inc. (Freemont, CA)]은 상기된 것과 유사한 기술을 사용하여 선택된 항원에 대해 지시된 사람 항체를 제공할 수 있다.
선택된 에피토프를 인지하는 완전한 사람 항체는 "유도된 선별"로서 언급되는 기술을 사용하여 제조될 수 있다. 상기 방법에서, 선택된 비사람 모노클로날 항체, 예를 들면, 쥐 항체를 사용하여 동일한 에피토프를 인지하는 완전한 사람 항체의 선별을 유도한다(문헌참조: Jespers et al., 1994, Bio/technology 12:899-903).
본 발명의 항체는 제조 후 (예를 들면, 피검체의 혈액 또는 혈청으로부터) 또는 합성 후 분리될 수 있고, 널리 공지된 기술에 의해 추가로 정제될 수 있다. 예를 들면, IgG 항체는 단백질 A 크로마토그래피를 사용하여 정제될 수 있다. 본 발명의 단백질에 특이적인 항체는 예를 들면, 친화성 크로마토그래피에 의해 선택되거나 정제(예를 들면, 부분적인 정제)될 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 재조합적으로 발현되고 정제된 (또는 부분적으로 정제된) 단백질은 본원에 기재된 바와 같이 제조되고 예를 들면, 크로마토그래피 칼럼과 같은 고형 지지체에 공유적으로 또는 비공유적으로 커플링된다. 이어서, 상기 칼럼을 사용하여 다수의 상이한 에피토프에 대해 지시된 항체를 함유하는 샘플로부터 본 발명의 단백질에 특이적인 항체를 친화성 정제할 수 있고, 이에 의해 실질적으로 정제된 항체 조성물, 즉, 오염 항체가 실질적으로 부재인 조성물을 제조할 수 있다. 본 맥락에서 실질적으로 정제된 항체 조성물이란, 항체 샘플이 본 발명의 목적하는 단백질의 에피토프 이외의 에피토프에 대해 지시된 오염 항체를 단지 30% 이하(무수 중량 기준)로 함유하고, 바람직하게는 샘플의 20% 이하, 보다 더 바람직하게는 10% 이하 및 가장 바람직하게는 5%(무수 중량 기준) 이하가 오염 항체임을 의미한다. 정제된 항체 조성물은 조성물 중 99% 이상의 항체가 본 발명의 목적하는 단백질에 대해 지시된 것임을 의미한다.
바람직한 양태에서, 본 발명의 실질적으로 정제된 항체는 본 발명의 단백질의 시그날 펩타이드, 분비된 서열, 세포외 도메인, 막관통 또는 세포질 도메인 또는 세포질막에 특이적으로 결합할 수 있다. 특히 바람직한 양태에서, 본 발명의 실질적으로 정제된 항체는 본 발명의 단백질의 아미노산 서열의 분비된 서열 또는 세포외 도메인에 특이적으로 결합한다. 보다 바람직한 양태에서, 본 발명의 실질적으로 정제된 항체는 마커 단백질의 아미노산 서열의 분비된 서열 또는 세포외 도메인에 특이적으로 결합한다.
본 발명의 단백질에 대해 지시된 항체를 사용하여 친화성 크로마토그래피 또는 면역침전과 같은 표준 기술에 의해 상기 단백질을 분리할 수 있다. 더욱이, 상기 항체를 사용하여 마커 단백질 또는 이의 단편(예를 들면, 세포 용해물 또는 세포 상청액 중)을 검출하므로써 마커 발현 수준 및 패턴을 평가할 수 있다. 상기 항체를 또한 진단학적으로 사용하여 임상적 시험 과정의 일부로서 조직 또는 체액 중(예를 들면, 육종 관련된 체액 중) 단백질 수준을 모니터링할 수 있고, 예를 들면, 소정의 치료 계획의 효능을 결정할 수 있다. 검출은 검출가능한 물질에 커플링된 본 발명의 항체를 포함하는 항체 유도체를 사용함에 의해 촉진될 수 있다. 검출가능한 물질의 예는 다양한 효소, 보족 그룹(prosthetic group), 형광 물질, 발광 물질, 생체발광 물질, 및 방사능 물질을 포함한다. 적합한 효소의 예는 서양고추냉이 퍼옥시다제, 알칼리성 포스파타제, β-갈락토시다제, 또는 아세틸콜린스테라제를 포함하고; 적합한 보족 그룹 복합체의 예는 스트렙트아비딘/비오틴 및 아비딘/비오틴을 포함하고; 적합한 형광 물질의 예는 움벨리페론, 플루오레세인, 플루오레세인 이소티오시아네이트, 로다민, 디클로로트리아지닐아민 플루오레세인, 댄실 클로라이드 또는 피코에리트린을 포함하고; 발광 물질의 예는 루미놀을 포함하고; 생체발광 물질의 예는 루시퍼라제, 루시페린 및 아에쿠오린을 포함하고, 적합한 방사능 물질의 예는 125I, 131I, 35S 또는 3H를 포함한다.
본 발명의 항체는 또한 암을 치료하는데 있어서 치료제로서 사용될 수 있다. 바람직한 양태에서, 본 발명의 완전한 사람 항체는 사람 암 환자, 특히 암을 갖는 환자들의 치료적 치료를 위해 사용된다. 또 다른 바람직한 양태에서, 마커 단백질 또는 이의 단편에 특이적으로 결합하는 항체는 치료적 치료를 위해 사용된다. 추가로, 상기 치료적 항체는 세포독소, 치료적 제제 또는 방사능 금속 이온과 같은 치료적 잔기에 접합된 항체를 포함하는 항체 유도체 또는 면역독소일 수 있다. 세포독소 또는 세독독성 제제는 세포에 치명적인 임의의 제제를 포함한다. 이의 예는 탁솔, 사이토칼라신 B, 그라미시딘 D, 에티듐 브로마이드, 에메틴, 미토마이신, 에토포사이드, 테노포사이드, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 콜키신, 독소루비신, 다우노루비신, 디하이드록시 안트라신 디온, 미톡산트론, 미트라마이신, 악티노마이신 D, 1-데하이드로테스토스테론, 글루코코르티코이드, 프로카인, 테트라카인, 리도카인, 프로프라놀롤, 및 푸로마이신 및 이의 유사체 또는 동족체를 포함한다. 치료적 제제는 항대사물(예를 들면, 메토트렉세이트, 6-머캅토퓨린, 6-티오구아닌, 시타라빈, 5-플루오로우라실 데카바진), 알킬화제(예를 들면, 메클로레타민, 티오에파 클로람부실, 멜팔란, 카르무스틴(BSNU) 및 로무스틴(CCNU), 사이클로토스파미드, 부설판, 디브로모만니톨, 스트렙토조토신, 미토마이신 C, 및 시스-디클로로디아민 플라티늄(II) (DDP) 시스플라틴), 안트라사이클린 (예를 들면, 다우노루비신(이전에는 다우노마이신) 및 독소루비신), 항생제(예를 들면, 닥티노마이신(이전에는 악티노마이신), 블레오마이신, 미트라마이신, 및 안트라마이신 (AMC)), 및 항-유사분열제(예를 들면, 빈크리스틴 및 빈블라스틴)를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 접합된 항체는 소정의 생물학적 반응을 변형시키기 위해 사용될 수 있고 약물 잔기에 대해 통상의 화학적 치료제로 제한되는 것으로 해석되지 말아야 한다. 예를 들면, 상기 약물 잔기는 목적하는 생물학적 활성을 갖는 단백질 또는 폴리펩타이드일 수 있다. 상기 단백질은 예를 들면, 리보솜 억제 단백질과 같은 독소를 포함할 수 있다(문헌참조: Better et al., 미국 특허 제6,146,631호, 이의 개시 내용은 이의 전문이 본원에 참조로서 인용된다), 아브린, 리신 A, 슈도모나스 외독소, 또는 디프테리아 독소; 종양 괴사 인자와 같은 단백질, 알파-인터페론, β-인터페론, 신경 성장 인자, 혈소판 유래 성장 인자, 조직 플라스미노겐 활성화인자; 또는, 생물학적 반응 개질제, 예를 들면, 림포킨, 인터류킨-1 ("IL-l "), 인터류킨-2 ("IL-2"), 인터류킨-6 ("IL-6"), 과립구 마크로파지 콜로니 자극 인자("GM-CSF"), 과립구 콜로니 자극 인자("G-CSF"), 또는 기타 성장 인자를 포함할 수 있다.
상기 치료적 잔기를 항체에 접합시키기 위한 기술은 널리 공지되어 있고, 예를 들면, 문헌[참조: Arnon et al., "Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy", in Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Reisfeld et al. (eds.), pp. 243-56 (Alan R. Liss, Inc. 1985); Hellstrom et al., "Antibodies For Drug Delivery", in Controlled Drug Delivery (2nd Ed.), Robinson et al. (eds.), pp. 623-53 (Marcel Dekker, Inc. 1987); Thorpe, "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review", in Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications, Pinchera et al. (eds.), pp. 475-506 (1985); "Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy", in Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwin et al. (eds.), pp. 303-16 (Academic Press 1985), and Thorpe et al., "The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates", Immunol. Rev., 62: 119-58 (1982)]을 참조한다.
따라서, 하나의 측면에서, 본 발명은 실질적으로 정제된 항체, 항체 단편 및 유도체를 제공하고, 이 모두는 본 발명의 단백질 및 바람직하게는 마커 단백질에 특이적으로 결합한다. 다양한 양태에서, 본 발명의 실질적으로 정제된 항체 또는 이의 단편 또는 유도체는 사람, 비사람, 키메라 및/또는 사람화된 항체일 수 있다. 또 다른 측면에서, 본 발명은 비사람 항체, 항체 단편 및 유도체를 제공하고, 이 모두는 본 발명의 단백질 및 바람직하게는 마커 단백질에 특이적으로 결합한다. 상기 비사람 항체는 염소, 마우스, 양, 말, 닭, 토끼 또는 랫트 항체일 수 있다. 대안적으로, 본 발명의 비사람 항체는 키메라 및/또는 사람화된 항체일 수 있다. 또한, 본 발명의 비사람 항체는 폴리클로날 항체 또는 모노클로날 항체일 수 있다. 여전히 추가의 측면에서, 본 발명은 모노클로날 항체, 항체 단편 및 유도체를 제공하고, 이 모두는 본 발명의 단백질 및 바람직하게는 마커 단백질에 특이적으로 결합한다. 상기 모노클로날 항체는 사람, 사람화된, 키메라 및/또는 비사람 항체일 수 있다.
본 발명은 또한 검출가능한 물질에 접합된 본 발명의 항체 및 사용 지침서를 함유하는 키트를 제공한다. 본 발명의 여전히 또 다른 측면은 본 발명의 항체를 포함하는 약제학적 조성물이다. 하나의 양태에서, 약제학적 조성물은 본 발명의 항체 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함한다.
3. 예측 의약
본 발명은 진단학적 분석, 예후 분석, 약리유전학 및 임상 시험의 모니터링이 예후(예측) 목적을 위해 사용되어 예방적으로 개체를 치료하는 예후 약물 분야에 관한 것이다. 따라서, 본 발명의 한 측면은 하나 이상의 마커 단백질 또는 핵산의 발현 수준을 결정하여 개체가 육종을 발병할 위험에 처해있는지의 여부를 결정하기 위한 진단 분석에 관한 것이다. 상기 분석은 예후 또는 예측 목적을 위해 사용되어 이로써 장애 개시 전에 개체를 예방적으로 치료할 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면은 제제(예를 들면, 육종을 억제하거나 임의의 다른 장애를 치료하거나 예방하기 위해 투여되는 약물 또는 기타 화합물{즉, 상기 치료가 가질 수 있는 임의의 발암성 효과를 이해하기 위해})의 임상 시험에서 본 발명의 마커의 발현 또는 활성에 대한 영향을 모니터링하는 것에 관한 것이다. 이들 및 기타 제제는 하기의 섹션에서 추가로 상세하게 기재된다.
A. 진단 분석
생물학적 샘플 중의 마커 단백질 또는 핵산의 존재 또는 부재를 검출하기 위한 예시적 방법은 시험 피검체로부터 생물학적 샘플(예를 들면, 육종 관련 체액 또는 조직 샘플)을 수득하고 상기 생물학적 샘플을 폴리펩타이드 또는 핵산(예를 들면, mRNA, 게놈 DNA 또는 cDNA)을 검출할 수 있는 화합물 또는 제제와 접촉시킴을 포함한다. 따라서, 본 발명의 상기 검출 방법들을 사용하여 예를 들면, 생체내 뿐만 아니라 시험관내에서 생물학적 샘플 중의 mRNA, 단백질, cDNA 또는 게놈 DNA를 검출할 수 있다. 예를 들면, mRNA의 검출을 위한 시험관내 기술은 노던 하이드리드화 및 동일계 하이브리드화를 포함한다. 마커 단백질의 검출을 위한 시험관내 기술은 효소 연결된 면역흡착 분석(ELISA), 웨스턴 블롯, 면역침전 및 면역형광을 포함한다. 게놈 DNA의 검출을 위한 시험관내 기술은 서던 하이브리드화를 포함한다. mRNA 검출을 위한 생체내 기술은 폴리머라제 연쇄 반응(PCR), 노던 하이브리드화 및 동일계 하이브리드화를 포함한다. 추가로, 마커 단백질의 검출을 위한 생체내 기술은 피검체에, 단백질 또는 이의 단편에 대해 지시된 표지된 항체를 도입함을 포함한다. 예를 들면, 상기 항체는 피검체에서 이의 존재 또는 위치가 표준 이미지화 기술에 의해 검출될 수 있는 방사능 마커로 표지될 수 있다.
상기 진단 및 예후 분석의 일반적인 원리는 적당한 조건하에서 및 마커와 프로브가 상호작용하고 결합하도록 하여 반응 혼합물에서 제거되고/되거나 검출될 수 있는 복합체를 형성하도록 하기에 충분한 시간 동안, 마커와 프로브를 함유할 수 있는 샘플 또는 반응 혼합물을 제조함을 포함한다. 이들 분석은 다양한 방식으로 수행될 수 있다.
예를 들면, 상기 분석을 수행하기 위한 한가지 방법은 마커 또는 프로브를 고형상 지지체(또한 기재로서 언급되기도 함)상에 부착시키고 반응 말기에 고형상에 부착된 표적 마커/프로브 복합체를 검출함을 포함한다. 상기 방법의 하나의 양태에서, 마커의 존재 및/또는 농도에 대해 분석될 피검체 기원의 샘플은 담체 또는 고형상 지지체상에 부착될 수 있다. 또 다른 양태에서, 역상황이 가능한데, 이때 프로브는 고형상에 부착될 수 있고, 피검체 기원의 샘플은 상기 분석의 비부착된 성분으로서 반응하도록 할 수 있다.
고형상에 분석 성분을 부착시키기 위한 많은 확립된 방법들이 있다. 이들은 제한 없이 비오틴 및 스트렙트아비딘의 접합을 통해 고정화되는 마커 또는 프로브 분자를 포함한다. 상기 비오티닐화된 분석 성분은 당업계에 공지된 기술(예를 들면, 비오티닐화 키트, Pierce Chemicals, Rockford, IL)을 사용하여 비오틴-NHS(N-하이드록시-석신이미드)로부터 제조될 수 있고 스트렙트아비딘 피복된 96웰 플레이트(Pierce Chemical)의 벽에 고정화된다. 특정 양태에서, 고정화된 분석 성분을 갖는 표면이 미리 제조되고 보관될 수 있다.
상기 분석용으로 다른 적합한 담체 또는 고형상 지지체는 마커 또는 프로브가 속하는 분자 부류에 결합할 수 있는 임의의 물질을 포함한다. 널리 공지된 지지체 또는 담체는 유리, 폴리스티렌, 나일론, 폴리프로파일렌, 나일론, 폴리에틸렌, 덱스트란, 아밀라제, 중성 및 변형된 셀룰로스, 폴리아크릴아미드, 가브로스 및 마그네티트를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
상기 언급된 방법을 사용한 분석을 수행하기 위해, 제2 성분이 부착되어 있는 고형상에 비고정화된 성분을 첨가한다. 반응이 종결된 후, 비복합된(uncomplexed) 성분들은 임의의 형성된 복합체가 고형상에 고정화된 상태로 잔류하도록 하는 조건하에서 제거(예를 들면, 세척에 의해)될 수 있다. 고형상에 부착된 마커/프로브 복합체의 검출은 본원에 명시된 다수의 방법들로 성취될 수 있다.
바람직한 양태에서, 비부착된 분석 성분인 경우 프로브는 본원에 논의된 검출가능한 표지와 직간접적으로 검출 및 분석의 판독을 목적으로 표지시킬 수 있고 이것은 당업자에게 널리 공지되어 있다.
성분(마커 또는 프로브)의 추가 조작 또는 표지화 없이, 예를 들면, 형광 에너지 전달 기술(문헌참조: Lakowicz et al., 미국 특허 제5,631,169호; Stavrianopoulos, et al., 미국 특허 제4,868,103호)을 사용함에 의해 마커/프로브 복합체 형성을 직접적으로 검출할 수 있다. 제1 '공여체' 분자상의 형광단 표지는 적당한 파장의 입사광에 의한 여기시 이의 방출된 형광 에너지가 제2 '수용체' 분자상의 형광 표지에 의해 흡수되어, 이어서 흡수된 에너지로 인해 형광을 나타낼 수 있도록 선택된다. 대안적으로, '공여체' 단백질 분자는 단순히 트립토판 잔기의 천연 형광 에너지를 사용할 수 있다. 상이한 파장의 광을 방출하여 '수용체' 분자 표지가 '공여체'의 표지와 구별될 수 있도록 하는 표지가 선택된다. 표지들 간의 에너지 전달 효율이 분자의 이격 거리와 관련되기 때문에, 분자들 간의 공간적 관계를 평가할 수 있다. 분자들 간에 결합이 발생하는 상황에서, 상기 분석에서 '수용체' 분자 표지의 형광성 방출은 최대이어야만 한다. FET 결합 반응은 당업계에 널리 공지된 표준 형광측정 검출 수단(예를 들면, 형광측정기를 사용하여)을 통해 간편하게 측정될 수 있다.
또 다른 양태에서, 마커를 인지하는 프로브의 능력 결정은 분석 성분(프로브 또는 마커)을 표지시키는 것 없이 실시간 생분자 상호작용 분석(BIA)과 같은 기술(문헌참조: Sjolander, S. and Urbaniczky, C, 1991, Anal. Chem. 63:2338-2345 and Szabo et al., 1995, Curr. Opin. Struct. Biol. 5:699-705)을 사용함에 의해 성취될 수 있다. 본원에 사용된 "BIA" 또는 "표면 플라스몬 공명"은 임의의 상호작용제(interactant)를 표지시키는 것 없이 실시간으로 생특이적 상호작용을 연구하기 위한 기술이다(예를 들면, BIAcore). 결합 표면에서 질량의 변화(결합 반응을 나타냄)는 표면 근처의 광 굴절 지수를 변화시켜(표면 플라스몬 공명(SPR)의 광학적 현상), 생물학적 분자들 간의 실시간 반응의 지표로서 사용될 수 있는 검출가능한 시그날을 생성한다.
대안적으로, 또 다른 양태에서, 유사한 진단학적 및 예후적 분석은 액상에서 용질로서 마커 및 프로브를 사용하여 수행될 수 있다. 상기 분석에서, 복합된 마커와 프로브는 차등 원심분리, 크로마토그래피, 전기영동 및 면역침전을 포함하지만 이에 제한되지 않는 임의의 다수의 표준 기술에 의해 비복합된 성분들로부터 분리된다. 차등 원심분리에서, 마커/프로브 복합체는 이들의 상이한 크기 및 밀도를 기초로 한 복합체의 상이한 침강 평형 때문에 일련의 원심분리 단계를 통해 비복합된 분석 성분으로부터 분리될 수 있다(문헌참조: Rivas, G., and Minton, A.P., 1993, Trends Biochem Sci. 18(8):284-7). 표준 크로마토그래피 기술을 또한 사용하여 복합된 분자를 비복합된 분자로부터 분리할 수 있다. 예를 들면, 겔 여과 크로마토그래피는 크기를 기초로 하고 칼럼 포맷내 적당한 겔 여과 수지의 활용을 통해 분자를 분리하는데, 예를 들면, 상대적으로 보다 큰 복합체는 상대적으로 보다 작은 비복합된 성분으로부터 분리될 수 있다. 유사하게, 비복합된 성분과 비교하여, 마커/프로브 복합체의 상대적으로 상이한 하전 성질은 예를 들면, 이온 교환 크로마토그래피 수지의 활용을 통해 상기 복합체를 비복합된 성분으로부터 구별하기 위해 사용될 수 있다. 상기 수지 및 크로마토그래피 기술은 당업자에게 널리 공지되어 있다(문헌참조: Heegaard, N.H., 1998, J. Mol. Recognit. Winter 11(1-6): 141-8; Hage, D.S., and Tweed, S.A. J Chromatogr B Biomed Sci Appl 1997 Oct 10;699(l-2):499-525). 겔 전기영동을 또한 사용하여 복합된 분석 성분을 미결합된 성분으로부터 분리할 수 있다(문헌참조: Ausubel et al., ed., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, 1987-1999). 상기 기술에서, 단백질 또는 핵산 복합체는 예를 들면, 크기 또는 하전을 기준으로 분리된다. 전기영동 과정 동안에 결합 상호작용을 유지하기 위해서는 환원제의 부재하의 비-변성 겔 매트릭스 물질 및 조건이 통상적으로 바람직하다. 특정 분석 및 이의 성분에 대한 적당한 조건은 당업자에게 널리 공지되어 있다.
특정 양태에서, 마커 mRNA의 수준은 당업계에 공지된 방법을 사용하여 생물학적 샘플 중에서 동일계 및 시험관내 포맷 둘 다에 의해 측정될 수 있다. 상기 용어 "생물학적 샘플"은 피검체 내에 존재하는 조직, 세포 및 유체 뿐만 아니라 피검체로부터 분리된 조직, 세포, 생물학적 유체 및 분리물을 포함하는 것으로 의도된다. 많은 발현 검출 방법은 분리된 RNA를 사용한다. 시험관내 방법들을 위해, mRNA의 분리에 대해 선택되지 않는 임의의 RNA 분리 기술이 세포로부터 RNA의 정제를 위해 사용될 수 있다(문헌참조: Ausubel et al., ed., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York 1987-1999). 추가로, 대다수의 조직 샘플은 예를 들면, 1단계 RNA 분리 공정(문헌참조: Chomczynski (1989, 미국 특허 제4,843,155호))과 같은 당업자에게 널리 공지된 기술을 사용하여 용이하게 프로세싱될 수 있다.
분리된 mRNA는 서던 또는 노던 분석, 폴리머라제 연쇄 반응 분석 및 프로브 어레이를 포함하지만 이에 제한되지 않는, 하이브리드화 또는 증폭 분석에서 사용될 수 있다. mRNA 수준의 검출을 위해 바람직한 하나의 진단 방법은 분리된 mRNA를, 검출되는 유전자에 의해 암호화된 상기 mRNA와 하이브리드화할 수 있는 핵산 분자(프로브)와 접촉시킴을 포함한다. 상기 핵산 프로브는 예를 들면, 전장 cDNA 또는 이의 일부, 예를 들면, 길이가 7개, 15개, 30개, 50개, 100개, 250개 또는 500개 이상의 뉴클레오타이드이고 엄격한 조건하에서 본 발명의 마커를 암호화하는 mRNA 또는 게놈 DNA와 특이적으로 하이브리드화하기에 충분한 올리고뉴클레오타이드일 수 있다. 본 발명의 진단 분석에 사용하기 위한 다른 적합한 프로브는 본원에 기재되어 있다. 프로브와 mRNA의 하이브리드화는 미지의 마커가 발현되고 있음을 지시한다.
하나의 포맷에서, mRNA를 고체 표면상에 고정시키고, 예를 들면, 분리된 mRNA를 아가로스 겔상에 적용하고 겔로부터 상기 mRNA를 니트로스셀룰로스와 같은 막으로 전달함에 의해 프로브와 접촉시킨다. 또 다른 포맷에서, 상기 프로브(들)는 고체 표면상에 고정시키고 mRNA는 예를 들면, 어피메트릭스 유전자 칩 어레이 중의 프로브(들)와 접촉시킨다. 당업자는 본 발명의 마커에 의해 암호화된 mRNA의 수준을 검출하는데 사용하기 위해 공지된 mRNA 검출 방법을 용이하게 채택할 수 있다.
샘플 중에서 mRNA의 마커 수준을 결정하기 위한 대안적인 방법은 예를 들면, RT-PCR (실험 양태는 문헌[참조: Mullis, 1987, 미국 특허 제4,683,202호]에 제시되어 있다), 리가제 연쇄 반응(문헌참조: Barany, 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88: 189-193), 자가 기반 서열 복제(문헌참조: Guatelli et al., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 1874-1878), 전사 증폭 시스템(문헌참조: Kwoh et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 1173-1177), Q-베타 레플리카제(문헌참조: Lizardi et al., 1988, Bio/Technology 6: 1197), 롤링 서클 복제(문헌참조: Lizardi et al., 미국 특허 제5,854,033호) 또는 임의의 다른 핵산 증폭 방법에 의한 핵산 증폭 과정에 이어서, 당업자에게 널리 공지된 기술을 사용한 증폭된 분자의 검출을 포함한다. 이들 검출 방식은 특히 상기 분자가 매우 낮은 수로 존재하는 경우 핵산 분자의 검출을 위해 유용하다. 본원에 사용된 증폭 프라이머는 유전자의 5' 또는 3' 영역(각각 양성 가닥 및 음성 가닥, 또는 그 반대)에 어닐링할 수 있고, 이들 사이에 짧은 영역을 함유할 수 있는 한쌍의 핵산 분자로서 정의된다. 일반적으로, 증폭 프라이머는 길이가 약 10개 내지 30개인 뉴클레오타이드이고, 길이가 약 50개 내지 200개인 뉴클레오타이드 영역을 플랭킹한다. 적당한 조건하에서 및 적당한 시약과 함께 상기 프라이머는 프라이머에 의해 플랭킹된 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산 분자의 증폭을 가능하게 한다.
동일계 방법들에 대해, mRNA는 검출 전에 분리될 필요는 없다. 상기 방법에서 세포 또는 조직 샘플은 공지된 조직학적 방법들을 사용하여 제조되고/프로세싱된다. 이어서, 상기 샘플을 지지체, 통상적으로 유리 슬라이드상에 고정시킨 다음, 마커를 암호화하는 mRNA와 하이브리드화할 수 있는 프로브와 접촉시킨다.
마커의 절대 발현 수준을 기준으로 결정하기 위한 대안적으로서, 마커의 표준화된 발현 수준을 기준으로 결정할 수 있다. 발현 수준은 마커가 아닌 유전자, 예를 들면, 본질적으로 발현되는 하우스키핑 유전자의 발현과 마커의 발현을 비교함에 의해 마커의 절대 발현 수준을 보정함에 의해 표준화시킨다. 표준화를 위해 적합한 유전자는 액틴 유전자 또는 상피 세포 특이적 유전자와 같은 하우스키핑 유전자를 포함한다. 상기 표준화는 하나의 샘플, 예를 들면, 환자 샘플 중의 발현 수준을 또 다른 샘플, 예를 들면, 비암 샘플 중의 발현 수준과 비교가능하게 하거나 상이한 공급원들 기원의 샘플들 간의 발현 수준을 비교가능하게 한다.
대안적으로, 상기 발현 수준은 상대적 발현 수준으로서 제공될 수 있다. 마커의 상대적 발현 수준을 결정하기 위해, 마커의 발현 수준은 미지의 샘플에 대한 발현 수준의 결정 전에 정상 대 암 세포 분리물의 10개 이상의 샘플, 바람직하게는 50개 이상의 샘플에 대해 결정된다. 보다 다수의 샘플 중에서 분석된 유전자들 각각의 평균 발현 수준이 결정되고, 이것은 마커에 대한 기준선 발현 수준으로서 사용된다. 이어서, 시험 샘플에 대해 결정된 마커의 발현 수준(절대 발현 수준)을 마커에 대해 수득된 평균 발현 값으로 나눈다. 이것은 상대적 발현 수준을 제공한다.
바람직하게, 기준선 결정에 사용되는 샘플은 비암 세포 기원일 것이다. 세포 공급원의 선택은 상대적 발현 수준의 사용에 따라 다양하다. 평균 발현 스코어로서 정상 조직에서 발견되는 발현의 사용은 분석된 마커가 암 특이적(정상 세포에 비해)인지의 여부를 입증하는데 도움이된다. 또한, 보다 많은 데이타가 축적됨에 따라서, 평균 발현값은 보정될 수 있고, 축적된 데이타를 기준으로 개선된 상대적 발현값을 제공한다. 암 세포로부터의 발현 데이타는 암 상태의 중증도를 등급화하기 위한 수단을 제공한다.
본 발명의 또 다른 양태에서, 마커 단백질이 검출된다. 본 발명의 마커 단백질을 검출하기 위해 바람직한 제제는 상기 단백질 또는 이의 단편에 결합할 수 있는 항체, 바람직하게 검출가능한 표지를 갖는 항체이다. 항체는 폴리클로날 또는 보다 바람직하게는 모노클로날일 수 있다. 온전한 항체 또는 이의 단편 또는 유도체(예를 들면, Fab 또는 F(ab')2)가 사용될 수 있다. 프로브 또는 항체와 관련된 용어 "표지된"은 검출가능한 물질을 프로브 또는 항체에 커플링(즉, 물리적으로 연결시킴)시킴에 의한 프로브 또는 항체의 직접적인 표지화 및 직접적으로 표지된 또 다른 시약과의 반응성에 의한 프로브 또는 항체의 간접적인 표지화를 포함하는 것으로 의도된다. 간접적인 표지화의 예는 형광성으로 표지된 2차 항체를 사용한 1차 항체의 검출 및 비오틴을 사용하여 형광성으로 표지된 스트렙트아비딘으로 검출될 수 있도록 하는, DNA 프로브의 말단 표지화를 포함한다.
세포 기원의 단백질은 당업자에게 널리 공지된 기술을 사용하여 분리될 수 있다. 사용되는 상기 단백질 분리 방법들은 예를 들면, 문헌[참조: Harlow and Lane (Harlow and Lane, 1988, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York)]에 기재된 것들일 수 있다.
다양한 포맷을 사용하여 샘플이 소정의 항체와 결합하는 단백질을 함유하는지의 여부를 결정할 수 있다. 상기 포맷의 예는 효소 면역분석(EIA), 방사선면역분석(RIA), 웨스턴 블롯 분석 및 효소 연결된 면역흡착 분석(ELISA)을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 당업자는 세포가 본 발명의 마커를 발현하는지의 여부를 결정하는데 사용하기 위해 공지된 단백질/항체 검출 방법들을 용이하게 채택할 수 있다.
하나의 포맷에서, 항체, 항체 단편 또는 유도체는 웨스턴 블롯 또는 면역형광 기술과 같은 방법들을 사용하여 발현된 단백질을 검출할 수 있다. 상기 경우에, 일반적으로 항체 또는 단백질을 고형 지지체상에 고정시키는 것이 바람직할 수 있다. 적합한 고형상 지지체 또는 담체는 항원 또는 항체와 결합할 수 있는 임의의 지지체를 포함한다. 널리 공지된 지지체 또는 담체는 유리, 폴리스티렌, 폴리프로파일렌, 폴리에틸렌, 덱스트란, 나일론, 아밀라제, 천연 및 변형된 셀룰로스, 폴리아크릴아미드, 가브로스, 및 마그네티트를 포함한다.
당업자는 항체 또는 항원에 결합하기 위해 적합한 많은 다른 담체를 인지하고 있고, 본 발명에 사용하기 위해 상기 지지체를 채택할 수 있다. 예를 들면, 암 세포로부터 분리된 단백질은 폴리아크릴아미드 겔 전기영동상에 적용될 수 있고, 니트로셀룰로스와 같은 고형상 지지체상에 고정될 수 있다. 이어서, 상기 지지체는 적합한 완충액으로 세척할 수 있고, 이후 검출가능하게 표지된 항체를 사용하여 처리할 수 있다. 이어서, 고형상 지지체는 완충액으로 2회 세척하여 미결합된 항체를 제거할 수 있다. 이어서, 고형 지지체상에 결합된 표지의 양은 통상적인 수단에 의해 검출될 수 있다.
본 발명은 또한 생물학적 샘플 중의 마커 단백질 또는 핵산의 존재를 검출하기 위한 키트를 포함한다. 상기 키트를 사용하여 피검체가 육종을 앓고 있는지의 여부 또는 육종의 발병 위험이 증가되었는지의 여부를 결정할 수 있다. 예를 들면, 상기 키트는 생물학적 샘플 중의 마커 단백질 또는 핵산을 검출할 수 있는 표지된 화합물 또는 제제, 및 샘플 중에 단백질 또는 mRNA의 양을 결정하기 위한 수단(예를 들면, 단백질 또는 이의 단편에 결합하는 항체, 또는 단백질을 암호화하는 DNA 또는 mRNA에 결합하는 올리고뉴클레오타이드 프로브)을 포함할 수 있다. 키트는 또한 키트를 사용하여 수득된 결과를 해석하기 위한 지침서를 포함할 수 있다.
항체 기반 키트의 경우, 상기 키트는 예를 들면, (1) 마커 단백질에 결합하는 제1 항체(예를 들면, 고형 지지체에 부착된), 및 임의로 (2) 단백질 또는 제1 항체에 결합하고 검출가능한 표지에 접합되는 상이한 제2 항체를 포함할 수 있다.
올리고뉴클레오타이드 기반 키트의 경우, 상기 키트는 예를 들면, (1) 올리고뉴클레오타이드, 예를 들면, 마커 단백질을 암호화하는 핵산 서열과 하이브리드화하는 검출가능하게 표지된 올리고뉴클레오타이드 또는 (2) 마커 핵산 분자를 증폭시키기 위해 유용한 한쌍의 프라이머를 포함할 수 있다. 상기 키트는 또한 예를 들면, 완충제, 보존제 또는 단백질 안정제를 포함한다. 상기 키트는 검출가능한 표지를 검출하는데 필요한 성분(예를 들면, 효소 또는 기질)을 추가로 포함할 수 있다. 상기 키트는 또한 분석되고 시험 샘플과 비교될 수 있는 대조군 샘플 또는 일련의 대조군 샘플을 함유할 수 있다. 상기 키트의 각각의 성분은 개별 컨테이너내에 봉입되고 다양한 모든 컨테이너는 상기 키트를 사용하여 수행된 분석의 결과를 해석하기 위한 지침서와 함께 단일 팩키지내에 존재할 수 있다.
B. 약리유전학
본 발명의 마커는 또한 약리유전학적 마커로서 유용하다. 본원에 사용된 "약리유전학적 마커"는 객관적 생화학적 마커이고 이의 발현 수준은 환자에서 특이적 임상적 약물 반응 또는 민감성과 관련된다(문헌참조: McLeod et al. (1999) Eur. J. Cancer 35(12): 1650- 1652). 약리유전학적 마커 발현의 존재 또는 양은 특이적 약물 또는 약물 부류를 이용한 치료에 대한 환자의 예측 반응 및 보다 특히 환자 육종의 예측 반응과 관련된다. 환자에서 하나 이상의 약리유전학적 마커의 발현의 존재 또는 양을 평가함에 의해, 환자에게 가장 적당하거나 보다 크게 성공적인 것으로 예측되는 약물 치료를 선택할 수 있다. 예를 들면, 환자에서 특이적 종양 마커에 의해 암호화된 RNA 또는 단백질의 존재 또는 양을 기준으로, 환자에 존재할 가능성이 있는 특이적 종양의 치료를 위해 최적화된 약물 또는 치료 과정을 선택할 수 있다. 따라서, 약리유전학적 마커의 사용은 상이한 약물 또는 계획을 시도하는 것 없이 암 환자 각각에 대해 가장 적당한 치료를 선택하거나 디자인할 수 있게 해준다.
약리유전학의 또 다른 측면은 신체가 약물에 대해 반응하는 방식을 변화시키는 유전자 조건을 취급한다. 이들 약리유전학적 조건은 드문 결점 또는 다형태로서 존재할 수 있다. 예를 들면, 글루코스-6-포스페이트 데하이드로게나제 (G6PD) 결핍은 주요 임상적 합병증이 산화성 약물(항말라리아제, 설폰아미드, 진통제, 니트로푸란)의 섭취 또는 잠두의 소비 후 용혈인 통상 유전되는 효소병증이다.
예시적인 양태로서, 약물 대사 효소의 활성은 약물 작용의 강도 및 지속성 둘 다에 의한 주요 결정인자이다. 유전자 다형태의 약물 대사 효소(예를 들면, N-아세틸트랜스퍼라제 2 (NAT 2) 및 시토크롬 P450 효소 CYP2D6 및 CYP2C19)의 발견은 몇몇 환자가 표준의 안전한 용량의 약물의 섭취 후 예측되는 약물 효과를 나타내지 못하거나 악화된 약물 반응 및 심각한 독성을 나타내는지의 이유를 설명한다. 이들 다형태는 집단 중 2개의 표현형, 광범위한 대사체(EM) 및 불량한 대사체(PM)로 나타난다. PM의 분포는 상이한 집단마다 상이하다. 예를 들면, CYP2D6을 암호화하는 유전자는 고도로 다형태이고 여러 돌연변이가 PM에서 동정되었고, 이 모두는 기능성 CYP2D6을 결실시킨다. CYP2D6 및 CYP2C19의 불량한 대사체는 이들이 표준 용량을 투여 받는 경우 매우 흔하게 악화된 약물 반응 및 부작용을 경험한다. 대사물이 활성 치료적 잔기인 경우, PM은 CYP2D6 형성된 대사물 모르핀에 의해 매개된 코데인의 진통 효과에 대해 입증된 바와 같이 어떠한 치료적 반응을 나타내지 않을 것이다. 다른 극한 경우는 표준 용량에도 반응하지 않는 소위 초급속 대사체이다. 최근에, 초급속 대사의 분자적 근본 이유가 CYP2D6 유전자 증폭 때문인 것으로 확인되었다.
따라서, 개체중에 본 발명의 마커의 발현 수준은 개체의 치료적 또는 예방적 치료를 위해 적당한 제제(들)를 선택하기 위해 결정될 수 있다. 또한, 약리유전학적 연구를 사용하여, 약물 대사 효소를 암호화하는 다형태 대립 형질의 유전자 분류를 개체의 약물 반응성 표현형의 동정에 적용할 수 있다. 상기 지식은 용량 또는 약물 선택에 적용되는 경우, 부작용 또는 치료 실패를 피할 수 있고, 따라서 본 발명의 마커의 발현 조정제를 사용하여 피검체를 치료하는 경우 치료적 또는 예방적 효율을 증진시킬 수 있다.
C. 임상 시험 모니터링
본 발명의 마커의 발현 수준에 대한 제제(예를 들면, 약물 화합물)의 영향력 모니터링이 기본 약물 스크리닝 및 임상 시험에 적용될 수 있다. 예를 들면, 마커 발현에 영향을 주는 제제의 효과는 육종에 대한 치료를 받은 피검체의 임상 시험에서 모니터링될 수 있다. 바람직한 양태에서, 본 발명은, (i) 제제의 투여 전에 피검체로부터 예비 투여 샘플을 채취하는 단계; (ii) 상기 예비 투여 샘플에서 본 발명의 하나 이상의 선태된 마커의 발현 수준을 검출하는 단계; (iii) 상기 피검체로부터 하나 이상의 투여 후 샘플을 채취하는 단계; (iv) 상기 투여 후 샘플 중의 마커(들)의 발현 수준을 검출하는 단계; (v) 상기 예비 투여 샘플 중의 마커(들)의 발현 수준을 상기 투여 후 샘플 또는 샘플들 중 마커(들)의 발현 수준과 비교하는 단계; 및 (vi) 상기 제제의 투여를 상기 피검체에 상응하게 변화시키는 단계를 포함하는, 제제(예를 들면, 효능제, 길항제, 펩타이드모사체, 단백질, 펩타이드, 핵산, 소분자 또는 기타 약물 후보물)를 사용한 피검체의 치료 효과를 모니터링하기 위한 방법을 제공한다. 예를 들면, 치료 과정 동안에 마커 유전자(들)의 증가된 발현은 비효과적인 투여량 및 투여량을 증가시킬 필요성을 지시하는 것일 수 있다. 역으로, 마커 유전자(들)의 감소된 발현은 효과적인 치료 및 용량을 변화시킬 필요가 없음을 지시하는 것일 수 있다.
D. 어레이
본 발명은 또한 본 발명의 마커를 포함하는 어레이를 포함한다. 상기 어레이를 사용하여 어레이내 하나 이상의 유전자의 발현을 분석할 수 있다. 하나의 양태에서, 상기 어레이를 사용하여 조직내 유전자 발현을 분석함으로써 어레이내 유전자의 조직 특이성을 확인할 수 있다. 상기 방식으로, 약 7600개 이하의 유전자가 발현에 대해 동시에 분석될 수 있다. 이것은 하나 이상의 조직에서 특이적으로 발현되는 많은 유전자들을 보여주는 프로파일이 개발될 수 있도록 한다.
상기 정량적 결정 이외에, 본 발명은 유전자 발현의 정량을 가능하게 한다. 따라서, 조직 특이성 뿐만 아니라 조직내 많은 유전자의 발현 수준이 확인될 수 있다. 따라서, 유전자는 이들의 조직 발현 자체 및 상기 조직내 발현 수준을 근거로 분류될 수 있다. 이것은 예를 들면, 조직들 간에 또는 조직들 중에 유전자의 발현의 관계를 확인하는데 유용하다. 따라서, 하나의 조직은 교란될 수 있고, 제2 조직에서 유전자 발현에 대한 상기 효과가 결정될 수 있다. 본 맥락에서, 생물학적 자극에 응답하는 또 다른 세포 유형에 대한 1개의 세포 유형의 효과가 결정될 수 있다. 상기 결정은 예를 들면, 유전자 발현 수준에서 세포-세포 상호작용의 효과를 알기 위해 유용하다. 제제가 1개의 세포 유형을 치료하기 위해 치료적으로 투여되지만 또 다른 세포 유형에 대해서는 바람직하지 못한 효과를 갖는 경우, 본 발명은 바람직하지 못한 효과의 분자적 근본 이유를 결정하기 위한 분석을 제공하고 따라서 역반응제를 동시 투여하거나 다르게는 목적하지 않은 효과를 치료하기 위한 기회를 제공한다. 유사하게, 단일 세포 유형 내에서도, 바람직하지 못한 생물학적 효과가 분자 수준에서 결정될 수 있다. 따라서, 표적 유전자 이외의 발현에 대한 제제의 효과는 확인되고 대처될 수 있다.
또 다른 양태에서, 상기 어레이를 사용하여 어레이내 하나 이상의 유전자의 발현 시간 과정을 모니터링할 수 있다. 이것은 본원에 기재된 바와 같이, 예를 들면, 육종의 발병, 육종의 진행 및 육종과 관련된 세포 형질전환과 같은 과정의 다양한 생물학적 상황으로 존재할 수 있다.
상기 어레이는 또한 동일한 세포 또는 상이한 세포에서 다른 유전자의 발현에 대한 1개 유전자의 발현 효과를 확인하기 위해 유용하다. 이것은 예를 들면, 최종 또는 다운스트림 표적이 조절될 수 없는 경우 치료적 간섭를 위해 또 다른 분자 표적물의 선택을 위해 제공된다.
상기 어레이는 또한 정상 및 비정상 세포에서 하나 이상의 유전자의 차등 발현 패턴을 확인하기 위해 유용하다. 이것은 진단 또는 치료적 간섭을 위해 분자 표적으로서 작용할 수 있는 많은 유전자들을 제공한다.
VII. 샘플을 채취하기 위한 방법
본 발명의 방법들에 유용한 샘플은 본 발명의 마커를 발현하는 임의의 조직, 세포, 생검 또는 체액 샘플을 포함한다. 하나의 양태에서, 샘플은 조직, 세포, 전혈, 혈청, 혈장, 구강 채취물, 타액, 뇌척수액, 뇨, 배변 또는 기관지폐포 세척액일 수 있다. 바람직한 양태에서, 상기 조직 샘플은 육종 샘플이다.
신체 샘플은 예를 들면, 생검을 사용하거나 영역을 긁어서 채취하거나 면봉채취하거나 체액을 흡인하기 위해 바늘을 사용함을 포함하는, 당업계에 공지된 다양한 기술에 의해 피검체로부터 채취될 수 있다. 다양한 체액 샘플을 회수하기 위한 방법은 당업계에 널리 공지되어 있다.
본 발명의 마커를 검출하고 정량하기 위해 적합한 조직 샘플은 당업자에게 공지된 방법에 따른 신선한 것이거나 동결된 것이거나 고정된 것일 수 있다. 적합한 조직 샘플은 바람직하게 절제되고 추가의 분석을 위해 현미경 슬라이드상에 놓는다. 대안적으로, 고체 샘플, 즉, 조직 샘플은 가용화되고/되거나 균질화되고, 후속적으로 가용성 추출물로서 분석될 수 있다.
하나의 양태에서, 새롭게 채취된 생검 샘플은 예를 들면, 액체 질소 또는 디플루오로디클로로메탄을 사용하여 동결시킨다. 동결된 샘플은 예를 들면, OCT를 사용한 절제를 위해 탑재하고, 저온유지장치에서 연속으로 절제한다. 상기 연속 절편을 유리 현미경 슬라이드상에 회수한다. 면역조직화학적 염색을 위해, 상기 슬라이드는 예를 들면, 크롬-알룸, 젤라틴 또는 폴리-L-라이신으로 피복시켜 절편이 슬라이드에 확실히 고착될 수 있도록 한다. 또 다른 양태에서, 샘플은 절개 전에 고정되고 매립된다. 예를 들면, 조직 샘플은 예를 들면, 포르말린 중에 고정될 수 있고, 연속적으로 탈수되고 예를 들면, 파라핀 중에 매립될 수 있다.
일단 샘플이 채취되면, 본 발명의 마커를 검출하고 정량하기 위해 적합한 당업계에 공지된 임의의 방법이 사용될 수 있다(핵산 또는 단백질 수준 중 하나에서). 상기 방법들은 당업계에 널리 공지되어 있고 웨스턴 블롯, 노던 블롯, 서던 블롯, 면역조직화학, ELISA, 예를 들면, 증폭된 ELISA, 면역침전, 면역형광, 유동 세포측정, 면역세포화학법, 질량 분광측정 분석, 예를 들면, MALDI-TOF 및 SELDI-TOF, 핵산 하이브리드화 기술, 핵산 역전사 방법 및 핵산 증폭 방법을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 특정 양태에서, 본 발명의 마커의 발현은 예를 들면, 이들 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 사용하여 단백질 수준에 대해 검출된다.
샘플은 항체 결합에 접근 가능한 본 발명의 마커를 제조하기 위해 변형시킬 필요가 있을 수 있다. 면역세포화학법 또는 면역조직화학법의 특정 측면에서, 슬라이드는 전처리 완충액으로 옮겨질 수 있고, 임의로 항원 접근성을 증가시키기 위해 가열될 수 있다. 전처리 완충액 중에서 샘플의 가열은 세포의 지질 이중층을 신속하게 파괴시키고 항원(새로운 표본에서의 경우이고 통상적으로 고정된 표본에서는 일어나지 않는다)은 항체 결합에 보다 접근가능해질 수 있다. 상기 용어 "전처리 완충액" 및 "제조 완충액"은 본원에서 특히 항체 결합을 위한 본 발명의 마커의 접근성을 증가시킴에 의한 면역염색용 세포학적 또는 조직학적 샘플을 제조하기 위해 사용되는 완충액을 언급하기 위해 상호교환적으로 사용된다. 상기 전처리 완충액은 pH-특이적 염 용액, 중합체, 세제 또는 비이온성 또는 음이온성 계면활성제, 예를 들면, 에틸옥실화된 음이온 또는 비음이온성 계면활성제, 알카노에이트 또는 알콕실레이트 또는 심지어 이들 계면활성제들의 블렌드 또는 심지어 담즙염의 사용을 포함할 수 있다. 상기 전처리 완충액은 예를 들면, 0.1% 내지 1%의 데옥시콜산 용액, 나트륨염 용액 또는 나트륨 라우레트-13-카복실레이트(예를 들면, Sandopan LS) 또는 및 에톡실화된 음이온성 복합체 용액일 수 있다. 몇몇 양태에서, 상기 전처리 완충액은 또한 슬라이드 저장 완충액으로서 사용될 수 있다.
항체 결합을 위해 보다 접근 가능한 본 발명의 마커 단백질을 제조하기 위한 임의의 방법이 본 발명의 실시에 사용될 수 있고 당업계에 공지된 항원 회수 방법들을 포함한다. 예를 들면, 이의 전문이 본원에 참조로서 인용되는 문헌[참조: Bibbo, et al. (2002) Acta. Cytol. 46:25-29; Saqi, et al. (2003) Diagn. Cytopathol. 27:365-370; Bibbo, et al. (2003) Anal. Quant. Cytol. Histol. 25:8-11]을 참조한다.
마커 단백질 접근성을 증가시키기 위한 전처리 후, 샘플은 적당한 차단제, 예를 들면, 과산화수소와 같은 퍼옥시다제 차단 시약을 사용하여 차단될 수 있다. 몇몇 양태에서, 상기 샘플은 항체의 비특이적 결합을 방해하기 위해 단백질 차단 시약을 사용하여 차단될 수 있다. 상기 단백질 차단 시약은 예를 들면, 정제된 카제인을 포함할 수 있다. 이어서, 항체, 특히, 본 발명의 마커에 특이적으로 결합하는 모노클로날 또는 폴리클로날 항체는 샘플과 항온처리한다. 당업자는 보다 정확한 예후 또는 진단이 몇몇 경우에 환자 샘플 중의 본 발명의 마커 단백질에 대한 다중 에피토프를 검출함에 의해 수득할 수 있음을 인지할 것이다. 따라서, 특정 양태에서, 본 발명의 마커의 상이한 에피토프에 대해 지시된 2개 이상의 항체가 사용된다. 하나 이상의 항체가 사용되는 경우, 이들 항체는 개별 항체 시약으로서 연속적으로 또는 항체 칵테일로서 동시에 단일 샘플에 첨가될 수 있다. 대안적으로, 각각의 개별 항체는 상기 동일한 환자 기원의 별도의 샘플에 첨가될 수 있고, 수득된 데이타는 수집된다.
항체 결합을 검출하기 위한 기술은 당업계에 널리 공지되어 있다. 본 발명의 마커에 결합하는 항체는 항체 결합 수준, 따라서 마커 단백질 발현 수준에 상응하는 검출가능한 시그날을 생성시키는 화학적 시약을 사용하므로써 검출될 수 있다. 본 발명의 면역조직화학법 또는 면역세포화학법 중 하나에서, 항체 결합은 표지된 중합체에 접합된 2차 항체의 사용을 통해 검출된다. 표지된 중합체의 예는 중합체 효소 접합체를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 이들 복합체 중 효소를 통상적으로 사용하여 항원-항체 결합 부위에서 크로모겐의 침적을 촉매시켜 목적하는 생체마커의 발현 수준에 상응하는 세포 염색을 유도한다. 특정 목적하는 효소는 서양고추냉이 퍼옥시다제(HRP) 및 알칼리성 포스파타제(AP)를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 하나의 특정 면역조직화학법 또는 면역세포화학법에서, 본 발명의 마커에 결합하는 항체는 2차 항체에 접합된 HRP-표지된 중합체의 사용을 통해 검출된다. 항체 결합은 또한 모노클로날 또는 폴리클로날 항체에 결합하는 종 특이적 프로브 시약, 및 종 특이적 프로브 시약에 결합하는, HRP에 접합된 중합체의 사용을 통해 검출될 수 있다. 임의의 크로마겐, 예를 들면, 크로마겐 3,3-디아미노벤지딘(DAB)을 사용한 항체 결합을 위해 슬라이드를 염색시키고, 이어서 헤마톡실린, 및 임의로 수산화암모늄 또는 TBS/Tween-20과 같은 청색화 시약으로 대비염색시킨다. 또 다른 적합한 크로마겐은 예를 들면, 3-아미노-9-에틸카바졸(AEC)을 포함한다. 본 발명의 몇몇 측면에서, 세포기술자 및/또는 병리학자는 슬라이드를 현미경으로 관찰하여 세포 염색, 예를 들면, 형광 염색(즉, 마커 발현)을 평가한다. 대안적으로, 샘플은 자동화 현미경을 통해 또는 양성 염색 세포의 동정을 촉진시키는 컴퓨터 소프트웨어의 도움으로 담당자가 관찰할 수 있다.
항체 결합 검출은 항마커 항체를 검출가능한 물질에 커플링시켜 촉진시킬 수있다. 검출가능한 물질의 예는 다양한 효소, 보족 그룹, 형광 물질, 발광 물질, 생체발광 물질, 및 방사능 물질을 포함한다. 적합한 효소의 예는 서양고추냉이 퍼옥시다제, 알칼리성 포스파타제, β-갈락토시다제, 또는 아세틸콜린에스테라제를 포함하고; 적합한 보족 그룹 복합체의 예는 스트렙트아비딘/비오틴 및 아비딘/비오틴을 포함하고; 적합한 형광 물질의 예는 움벨리페론, 플루오레세인, 플루오레세인 이소티오시아네이트, 로다민, 디클로로트리아지닐아민 플루오레세인, 댄실 클로라이드 또는 피코에리트린을 포함하고; 발광 물질의 예는 루미놀을 포함하고; 생체발광 물질의 예는 루시퍼라제, 루시페린 및 아에쿠오린을 포함하고; 적합한 방사능 물질의 예는 125I, 131I, 35S, 14C, 또는 3H을 포함한다.
본 발명의 하나의 양태에서, 동결된 샘플은 상기된 바와 같이 제조되고, 후속적으로 예를 들면, 트리스 완충 식염수(TBS)를 사용해 적당한 농도로 희석된 본 발명의 마커에 대한 항체로 염색된다. 1차 항체는 비오티닐화된 항-면역글로불린중에 슬라이드를 항온처리하여 검출될 수 있다. 상기 시그날은 임의로 항원의 디아미노벤지딘 침전을 사용하여 증폭되고 가시화될 수 있다. 추가로, 슬라이드는 임의로 예를 들면, 헤마톡실린으로 대비염색시켜 상기 세포를 가시화시킬 수 있다.
또 다른 양태에서, 고정되고 매립된 샘플을 본 발명의 마커에 대한 항체로 염색시키고 동결된 절편에 대해 상기된 바와 같이 대비염색시킨다. 또한, 상기 샘플을 임의로 시그날을 증폭시키는 제제로 처리하여 항체 염색을 가시화시킬 수 있다. 예를 들면, 퍼옥시다제-접합된 스트렙트아비딘(제조원: Catalyzed Signal Amplification (CSA) System, DAKO, Carpinteria, CA)과 반응하는 비오티닐-티라미드의 퍼옥시다제-촉매된 침적을 사용할 수 있다.
조직 기반 분석법(즉, 면역조직화학법)은 본 발명의 마커를 검출하고 정량하기 위한 바람직한 방법들이다. 하나의 양태에서, 본 발명의 마커의 존재 또는 부재는 면역조직화학법으로 결정될 수 있다. 하나의 양태에서, 상기 면역조직화학 분석은 저농도의 항마커 항체를 사용하여 마커가 없는 세포는 염색되지 않는다. 또 다른 양태에서, 본 발명의 마커의 존재 또는 부재는 고농도의 항마커 항체를 사용하여 마커 단백질이 없는 세포도 과염색되도록 하는 면역조직화학법을 사용하여 결정된다. 염색되지 않는 세포는 돌연변이된 마커를 함유하고 항원적으로 인지가능한 마커 단백질을 생성하는데 실패하거나 마커 수준을 조절하는 경로가 조절불능이어서 마커 단백질의 무시할만한 항정 상태 발현을 초래하는 세포이다.
당업자는 본 발명의 방법의 수행을 위해 사용되는 특정 항체의 농도가 결합 시간, 본 발명의 마커에 대한 항체의 특이성 수준 및 샘플 제조 방법과 같은 인자들에 따라 다양할 것이다. 더욱이, 다중 항체가 사용되는 경우, 요구되는 농도는 예를 들면, 칵테일로서 동시에 또는 개별 항체 시약으로서 연속적으로와 같이 항체가 샘플에 적용되는 정도에 의해 영향받을 수 있다. 추가로, 본 발명의 마커에 결합하는 항체를 가시화하기 위해 사용되는 검출 화학법은 또한 목적하는 시그날 대 노이즈 비율을 나타내도록 최적화되어야만 한다.
본 발명의 하나의 양태에서, 프로테오믹 방법들, 예를 들면, 질량 분광법은 본 발명의 마커 단백질을 검출하고 정량하기 위해 사용된다. 예를 들면, 혈청과 같은 생물학적 샘플의 단백질-결합 칩으로의 적용을 포함하는 매트릭스-연합된 레이저 탈착/이온화 타임-오브-플라이트 질량 분광법(MALDI-TOF MS) 또는 표면-증진된 레이저 탈착/이온화 타임-오브-플라이트 질량분광법(SELDI-TOF MS)[문헌참조: Wright, G.L., Jr., et al. (2002) Expert Rev Mol Diagn 2:549; Li, J., et al. (2002) Clin Chem 48: 1296; Laronga, C., et al. (2003) Dis Markers 19:229; Petricoin, E.F., et al. (2002) 359:572; Adam, B.L., et al. (2002) Cancer Res 62:3609; Tolson, J., et al. (2004) Lab Invest 84:845; Xiao, Z., et al. (2001) Cancer Res 61:6029]를 사용하여 PY-Shc 및/또는 p66-Shc 단백질을 검출하고 정량할 수 있다. 질량 분광법은 예를 들면, 미국 특허 제5,622,824호, 제5, 605,798호 및 제5,547,835호에 기재되어 있고 이의 각각의 전문이 본원에 참조로서 인용된다.
다른 양태에서, 본 발명의 마커의 발현은 핵산 수준에서 검출된다. 발현을 평가하기 위한 핵산 기반 기술은 당업계에 널리 공지되어 있고, 예를 들면, 피검체 기원의 샘플 중의 마커 mRNA의 수준을 결정함을 포함한다. 많은 발현 검출 방법들은 분리된 RNA를 사용한다. mRNA의 분리에 대해 선택되지 않은 임의의 RNA 분리 기술은 본 발명의 마커를 발현하는 세포로부터 RNA를 정제하기 위해 사용될 수 있다[문헌참조: Ausubel et al., ed., (1987-1999) Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley & Sons, New York]. 추가로, 다수의 조직 샘플은 당업자에게 공지된 기술, 예를 들면, 1단계 RNA 분리 공정[문헌참조: Chomczynski (1989, 미국 특허 제4,843,155호)]을 사용하여 용이하게 프로세싱될 수 있다.
용어 "프로브"는 본 발명의 마커에 선택적으로 결합할 수 있는 임의의 분자, 예를 들면, 뉴클레오타이드 전사체 및/또는 단백질을 언급한다. 프로브는 당업자에 의해 합성될 수 있거나, 적당한 생물학적 제제로부터 유래될 수 있다. 프로브는 표지되도록 특이적으로 디자인될 수 있다. 프로브로서 사용될 수 있는 분자의 예는 RNA, DNA, 단백질, 항체 및 유기 분자를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
분리된 mRNA는 서던 또는 노던 분석, 폴리머라제 연쇄 반응 분석 및 프로브 어레이를 포함하지만 이에 제한되지 않는 하이브리드화 또는 증폭 분석에 사용될 수 있다. mRNA 수준의 검출을 위한 한가지 방법은 분리된 mRNA를 상기 마커 mRNA와 하이브리드화할 수 있는 핵산 분자(프로브)와 접촉시킴을 포함한다. 핵산 프로브는 예를 들면, 전장 cDNA 또는 이의 일부, 예를 들면, 길이가 적어도 7개, 15개, 30개, 50개, 100개, 250개 또는 500개 뉴클레오타이드이고 엄격한 조건하에서 마커 게놈 DNA와 특이적으로 하이브리드화하기에 충분한 올리고뉴클레오타이드일 수 있다.
하나의 양태에서, mRNA를 고체 표면상에 고정시키고, 예를 들면, 아가로스 겔상에서 분리된 mRNA를 전개하고 겔로부터의 mRNA를 니트로셀룰로스와 같은 막으로 전달함에 의해 프로브와 접촉시킨다. 대안적인 양태에서, 상기 프로브(들)를 고체 표면상에 고정시키고, mRNA를 예를 들면, 어피메트릭스 유전자 칩 어레이에서 프로브(들)와 접촉시킨다. 당업자는 마커 mRNA의 수준을 검출하는데 사용하기 위해 공지된 mRNA 검출 방법들을 용이하게 채택할 수 있다.
샘플 중에 마커 mRNA의 수준을 결정하기 위한 대안적인 방법은 예를 들면, RT-PCR (문헌[참조: Mullis, 1987, 미국 특허 제4,683,202호]에 제시된 실험적 양태), 리가제 연쇄 반응(문헌참조: Barany (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 189-193), 자가 기반 서열 복제[문헌참조: Guatelli et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 1874-1878], 전사 증폭 시스템[문헌참조: Kwoh et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 1173-1177], Q-베타 레플리카제[문헌참조: Lizardi et al. (1988) Bio/Technology 6: 1197], 롤링 서클 복제[문헌참조: Lizardi et al., 미국 특허 제5,854,033호] 또는 임의의 다른 핵산 증폭 방법에 의한 핵산 증폭 과정에 이어서, 당업자에게 널리 공지된 기술을 사용하는 증폭된 분자의 검출을 포함한다. 이들 검출 계획은 특히 상기 분자가 매우 적은 수로 존재하는 경우 핵산 분자의 검출을 위해 유용하다. 본 발명의 특정 측면에서, 마커 발현은 정량적 형광생성 RT-PCR(즉, TaqMan™ 시스템)에 의해 평가된다. 상기 방법들은 통상적으로 본 발명의 마커에 특이적인 올리고뉴클레오타이드 프라이머 쌍을 사용한다. 공지된 서열에 대해 특이적인 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 디자인하기 위한 방법은 당업계에 널리 공지되어 있다.
본 발명의 마커의 발현 수준은 막 블롯(노던, 서던, 도트 등과 같은 하이브리드화 분석에 사용되는 것) 또는 마이크로웰, 샘플 튜브, 겔, 비드 또는 섬유(또는 결합된 핵산을 포함하는 임의의 고형 지지체)를 사용하여 모니터링될 수 있다. 문헌[참조: 미국 특허 제5,770,722호, 제5,874,219호, 제5,744,305호, 제5,677,195호 및 제5,445,934호, 이들은 본원에 참조로서 인용된다]을 참조한다. 마커 발현의 검출은 또한 용액 중 핵산 프로브를 사용함을 포함할 수 있다.
본 발명의 하나의 양태에서, 마이크로어레이를 사용하여 본 발명의 마커의 발현을 검출한다. 마이크로어레이는 특히, 상이한 실험들 간의 재현성 때문에 상기 목적에 매우 적합하다. DNA 마이크로어레이는 다수의 유전자 발현 수준의 동시 측정을 위한 한가지 방법을 제공한다. 각각의 어레이는 고형 지지체에 부착된 재현가능한 패턴의 포획 프로브로 이루어진다. 표지된 RNA 또는 DNA는 어레이상에 상보적인 프로브에 하이드리드화하고, 이어서 레이저 스캐닝에 의해 검출된다. 어레이상의 각각의 프로브에 대한 하이브리드화 강도가 결정되고 상대적 유전자 발현 수준을 나타내는 정량 값으로 전환된다. 문헌[미국 특허 제6,040,138호, 제5,800,992호, 제6,020,135호, 제6,033,860호, 및 제6,344,316호, 이들은 본원에 참조로서 인용된다]을 참조한다. 고밀도 올리고뉴클레오타이드 어레이는 특히 샘플 중의 다수의 RNA에 대한 유전자 발현 프로파일을 결정하기에 유용하다.
마커의 양 및/또는 본 발명의 마커의 양의 수학적 관계는 당업자에게 공지된 회귀 분석 방법들을 포함할 수 있는 본 발명의 방법들을 사용하여 육종에 대해 치료받은 피검체 중에서 육종 재발의 위험성, 육종에 대해 치료된 피검체의 생존성, 육종이 공격성인지의 여부, 육종을 치료하기 위한 치료 계획의 효율 등을 산출하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들면, 적합한 회귀 모델은 CART[문헌참조 Hill, T, and Lewicki, P. (2006) "STATISTICS Methods and Applications" StatSoft, Tulsa, OK], Cox (예를 들면, www.evidence-based-medicine.co.uk), 지수적, 정규적 및 로그 정규적(예를 들면, www.obgyn.cam.ac.uk/mrg/statsbook/stsurvan.html), 로지스틱(예를 들면, www.en.wikipedia.org/wiki/Logistic_regression), 파라미터, 비-파라미터, 반-파라미터(예를 들면, www.socserv.mcmaster.ca/jfox/Books/Companion), 선형(예를 들면, www.en.wikipedia.org/wiki/Linear_regression), 또는 가산적(예를 들면, www. en.wikipedia.org/wiki/Generalized_additive_model)을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
하나의 양태에서, 회귀 분석은 마커의 양을 포함한다. 또 다른 양태에서, 회귀 분석은 마커의 수학적 관계를 포함한다. 또 다른 양태에서, 마커 양의 회귀 분석, 및/또는 마커의 수학적 관계는 추가의 임상적 및/또는 분자 공변량(co-variate)을 포함할 수 있다. 상기 임상적 공변량은 결절(nodal) 상태, 종양 단계, 종양 등급, 종양 용적, 치료 계획, 예를 들면, 크로마토그래피 및/또는 방사선 치료, 임상적 결과(예를 들면, 재발, 질환 특이적 생존, 치료 실패) 및/또는 진단후 시간, 치료 개시 후 시간 및/또는 치료 종료 후 시간의 함수로서 임상적 결과를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
또 다른 양태에서, 당업자에게 공지된 회귀 분석 방법들을 포함할 수 있는 본 발명의 방법들을 사용하여 육종에 대해 치료받은 피검체 중에서 육종 재발의 위험성, 육종에 대해 치료된 피검체의 생존성, 육종이 공격성인지의 여부, 육종을 치료하기 위한 치료 계획의 효율 등을 산출하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들면, 적합한 회귀 모델은 CART [문헌참조 Hill, T, and Lewicki, P. (2006) "STATISTICS Methods and Applications" StatSoft, Tulsa, OK], Cox (예를 들면, www.evidence-based-medicine.co.uk), 지수적, 정규적 및 로그 정규적(예를 들면, www.obgyn.cam.ac.uk/mrg/statsbook/stsurvan.html), 로지스틱(예를 들면, www.en.wikipedia.org/wiki/Logistic_regression), 파라미터, 비-파라미터, 반-파라미터(예를 들면, www.socserv.mcmaster.ca/jfox/Books/Companion), 선형(예를 들면, www.en.wikipedia.org/wiki/Linear_regression), 또는 가산적(예를 들면, www. en.wikipedia.org/wiki/Generalized_additive_model)을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
하나의 양태에서, 회귀 분석은 마커의 양을 포함한다. 또 다른 양태에서, 회귀 분석은 마커의 수학적 관계를 포함한다. 또 다른 양태에서, 마커 양, 및/또는 마커의 수학적 관계의 회귀 분석은 추가의 임상적 및/또는 분자 공변량을 포함할 수 있다. 상기 임상적 공변량은 결절 상태, 종양 단계, 종양 등급, 종양 용적, 치료 계획, 예를 들면, 크로마토그래피 및/또는 방사선 치료, 임상적 결과(예를 들면, 재발, 질환-특이적 생존, 치료 실패) 및/또는 진단후 시간, 치료 개시 후 시간 및/또는 치료 종료 후 시간의 함수로서 임상적 결과를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
VIII. 키트
본 발명은 또한 육종, 육종의 재발, 또는 육종에 대해 치료된 피검체의 생존을 예측하기 조성물 및 키트를 제공한다. 이들 키트는 하기 중 하나 이상을 포함한다: 본 발명의 마커에 특이적으로 결합하는 검출가능한 항체, 본 발명의 마커에 특이적으로 결합하는 검출가능한 항체, 염색을 위해 피검체 조직 샘플을 채취하고/하거나 제조하기 위한 시약 및 사용 지침서.
본 발명의 키트는 임의로 본 발명의 방법들을 수행하기 위해 유용한 추가의 성분을 포함할 수 있다. 예를 들면, 상기 키트는 상보적 핵산을 어닐링하기 위해 적합하거나 또는 항체와, 이것이 특이적으로 결합하는 단백질과 결합하기에 적합한 유체(예를 들면, SSC 완충액), 하나 이상의 샘플 구획물, 본 발명의 수행 방법을 기재하는 지침물 및 조직 특이적 대조물/표준물을 포함할 수 있다.
IX. 스크리닝 분석
본 발명의 표적은 후속적으로 본원의 표 2 내지 9에 열거된 유전자를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 본건 출원인에 의해 기재된 실험의 결과를 기준으로, Q10에 의해 조정되는 주요 단백질은 세포골격 성분, 전사 인자, 아폽토시스 반응, 펜토스 포스페이트 경로, 생합성 경로, 산화적 스트레스(산화제 촉진), 막 변화 및 산화적 인산화 대사를 포함하는, 상이한 경로 또는 분자 그룹과 관련되거나 이들로 분류될 수 있다.
따라서, 본 발명의 하나의 양태에서, 마커는 ANGPTL3, CCL2, CDH5, CXCL1, CXCL3, PRMT3, HDAC2, 산화질소 신타제 bNOS, 아세틸 포스포 히스톤 H3 AL9 S10, MTA 2, 글루탐산 데카복실라제 GAD65 67, KSR, HDAC4, BOB1 OBF1, a1신트로핀, BAP1, 임포르티나 57, αE-카테닌, Grb2, Bax, 프로테아좀 26S 서브유니트 13 (엔도필린 B1), 액틴형 6A (진핵세포 개시 인자 4A11), 핵 클로라이드 채널 단백질, 프로테아좀 26S 서브유니트, 디스뮤타제 Cu/Zn 슈퍼옥사이드, 트랜슬린-결합 인자 X, 아비산염 전위 ATP아제 (스퍼민 신테타제), 리보솜 단백질 SA, dCTP 피로포스파타제 1, 프로테아좀 베타 3, 프로테아좀 베타 4, 산 포스파타제 1, 디아제팜 결합 억제제, 알파 2-HS 당단백질 (보스 토러스, 소), 리보솜 단백질 P2 (RPLP2); 히스톤 H2A, 마이크로튜불 결합 단백질, 프로테아좀 알파 3, 진핵세포 해독 연장 인자 1 델타, 라민 B1, SMT 3, mif two 3 동족체 2의 억제인자, 열 쇼크 단백질 27kD, hnRNP C1/C2, 진핵세포 해독 연장 인자 1 베타 2, HSPC-300 유사체, DNA 지시된 DNA 폴리머라제 엡실론 3; (캐노피 2 동족체), LAMA5, PXLDC1, p300 CBP, P53R2, 포스파티딜세린 수용체, 사이토케라틴 펩타이드 17, 사이토케라틴 펩타이드 13, 뉴로필라멘트 160 200, Rab5, 필렌신, P53R2, MDM2, MSH6, 열 쇼크 인자 2, AFX, FLIPg d, JAB 1, 미오신, MEKK4, cRaf pSer621, FKHR FOXO1a, MDM2, Fas 리간드, P53R2, 미오신 조절 경쇄, hnRNP C1/C2, 유비퀼린 1 (포스파타제 2A), hnRNP C1/C2, 알파 2-HS 당단백질 (보스 토러스, 소), 베타 액틴, hnRNP C1/C2, 열 쇼크 단백질 70kD, 베타 튜불린, ATP 의존성 헬리카제 II, 진핵세포 해독 연장 인자 1 베타 2, ER 지질 raft 결합 2 이소형 1 (베타 액틴), 시그날 서열 수용체 1 델타, 진핵세포 해독 개시 인자 3, 서브유니트 3 감마, 빌베르딘 리덕타제 A (트랜스알돌라제 1), 케라틴 1,10 (파라티모신), GST 오메가 1, Dj-1에 대한 쇄 B 도파민 퀴논 접합체, 프로테아좀 활성화인자 Reg(알파), T-복합 단백질 1 이소형 A, 쇄 A 타파신 ERP57 (TCP1 함유 샤페로닌), 유비퀴틴 활성화 효소 E1; 알라닐-tRNA 신테타제, 다이낙틴 1, 열 쇼크 단백질 60kd, 베타 액틴, 스퍼미딘 신타제 (베타 액틴), 열 쇼크 단백질 70kd, 망막모세포종 결합 단백질 4 이소형 A, TAR DNA 결합 단백질, 진핵세포 해독 연장 인자 1 베타 2, TCP1 함유 샤페로닌, 서브유니트 3, 세포질 다이네인 IC-2, 안지오텐신-전환 효소 (ACE), 카스파제 3, GARS, 매트릭스 메탈로프로테이나제 6 (MMP-6), 뉴로라이신 (NLN)-촉매적 도메인, 및 뉴로라이신 (NLN), ADRB, CEACAM1, DUSP4, FOXC2, FOXP3, GCGR, GPD1, HMOX1, IL4R, INPPL1, IRS2 및 VEGFA를 포함할 수 있다.
동정된 마커의 조정제를 동정하기 위해 유용한 스크리닝 분석은 하기에 기재된다.
본 발명은 또한 조정제, 즉, 본 발명의 마커의 발현 및/또는 활성을 조정함에 의해 육종을 치료하거나 예방하기 위해 유용한 후보물 또는 시험 화합물 또는 제제(예를 들면, 단백질, 펩타이드, 펩티도미메틱(peptidomimetic), 펩토이드(peptoid), 소분자 또는 기타 약물)를 동정하기 위한 방법(또한 본원에서 "스크리닝 분석"으로서 언급됨)을 제공한다. 상기 분석은 통상적으로 본 발명의 마커와 하나 이상의 분석 성분들 간 반응을 포함한다. 다른 성분은 시험 화합물 자체 또는 시험 화합물과 본 발명의 마커의 천연 결합 파트너의 배합물일 수 있다. 본원에 기재된 것들과 같은 분석을 통해 동정된 화합물은 예를 들면, 육종의 공격성을 조정하거나, 예를 들면, 억제하거나, 완화시키거나, 치료하거나 또는 예방하기 위해 유용할 수 있다.
본 발명의 스크리닝 분석에 사용되는 시험 화합물은 천연 및/또는 합성 화합물의 시스템적 라이브러리를 포함하는, 임의의 사용가능한 공급원으로부터 수득될 수 있다. 시험 화합물은 또한 생물학적 라이브러리; 펩토이드 라이브러리(펩타이드 기능을 갖지만 효소적 분해에 내성이면서도 생활성을 유지하는 신규한 비-펩타이드 골격을 갖는 분자의 라이브러리; 문헌[참조: Zuckermann et al., 1994, J. Med. Chem. 37:2678-85]); 공간적으로 다룰수 있는 평행 고형상 또는 용액상 라이브러리; 디콘볼루션(deconvolution)을 필요로 하는 합성 라이브러리 방법들; '1개-비드 1개-화합물' 라이브러리 방법; 및 친화성 크로마토그래피 선택을 사용하는 합성 라이브러리 방법들을 포함하는, 당업계에 공지된 라이브러리 방법들을 조합한 임의의 다수의 방법들에 의해 수득될 수 있다. 생물학적 라이브러리 및 펩토이드 라이브러리 방법들은 펩타이드 라이브러리에 제한되지만 다른 4개의 방법들이 펩타이드, 비펩타이드 올리고머 또는 화합물의 소분자 라이브러리에 적용될 수 있다[문헌참조: Lam, 1997, Anticancer Drug Des. 12: 145].
분자 라이브러리 합성 방법들의 예는 예를 들면, 문헌[참조: DeWitt et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90:6909; Erb et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:11422; Zuckermann et al. (1994). J. Med. Chem. 37:2678; Cho et al. (1993) Science 261: 1303; Carrell et al. (1994) Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33:2059; Carell et al. (1994) Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33:2061; and Gallop et al. (1994) J. Med. Chem. 37: 1233]에서 찾을 수 있다.
화합물 라이브러리는 용액 중에[문헌참조: Houghten, 1992, Biotechniques 13:412-421], 또는 비드상에[문헌참조: Lam, 1991, Nature 354:82-84], 칩상에[문헌참조: Fodor, 1993, Nature 364:555-556], 세균 및/또는 포자상에[문헌참조:Ladner, USP 5,223,409], 플라스미드상에[문헌참조: Cull et al, 1992, Proc Natl Acad Sci USA 89: 1865-1869] 또는 파지상에[문헌참조: Scott and Smith, 1990, Science 249:386-390; Devlin, 1990, Science 249:404-406; Cwirla et al, 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. 87:6378-6382; Felici, 1991, J. Mol. Biol. 222:301-310; Ladner, supra.] 제공될 수 있다.
본 발명의 스크리닝 방법들은 육종 세포를 시험 화합물과 접촉시키고, 세포내 본 발명의 마커의 발현 및/또는 활성을 조정하는 시험 화합물의 능력을 결정함을 포함한다. 본 발명의 마커의 발현 및/또는 활성은 본원에 기재된 바와 같이 결정될 수 있다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 본 발명의 마커의 기질 또는 이의 생물학적 활성 부분인 후보물 또는 시험 화합물을 스크리닝하기 위한 분석을 제공한다. 또 다른 양태에서, 본 발명은 본 발명의 마커 또는 이의 생물학적 활성 부분에 결합하는 후보물 또는 시험 화합물을 스크리닝하기 위한 분석을 제공한다. 마커에 직접적으로 결합하는 시험 화합물 능력의 결정은 예를 들면, 화합물을 방사능동위원소 또는 효소적 표지와 커플링시켜 마커로의 화합물의 결합이 복합체내 표지된 마커 화합물을 검출함에 의해 결정될 수 있도록 함에 의해 성취될 수 있다. 예를 들면, 화합물(예를 들면, 마커 기질)은 직접적으로 또는 간접적으로 131I, 125I, 35S, 14C, 또는 3H로 표지될 수 있고, 상기 방사능동위원소는 직접적인 방사능방출 계수 또는 섬광 계수에 의해 검출된다. 대안적으로, 분석 성분은 예를 들면, 서양고추냉이 퍼옥시다제, 알칼리성 포스파타제 또는 루시페라제 및 적당한 기질의 생성물로의 전환 결정에 의해 검출되는 효소적 표지로 효소적으로 표지될 수 있다.
본 발명은 추가로 상기된 스크리닝 분석에 의해 동정되는 신규 제제에 관한 것이다. 따라서, 적당한 동물 모델에서 본원에 기재된 바와 같이 동정된 제제를 추가로 사용하는 것은 본 발명의 범위내에 있다. 예를 들면, 본원에 기재된 바와 같이 동정된 본 발명의 마커의 발현 및/또는 활성을 조정할 수 있는 제제를 동물 모델에서 사용하여 상기 제제를 이용한 치료의 효능, 독성 또는 부작용을 결정할 수 있다. 대안적으로, 본원에 기재된 바와 같이 동정된 제제를 동물 모델에 사용하여 상기 제제의 작용 기작을 결정할 수 있다. 추가로, 본 발명은 상기된 바와 같은 상기 치료 스크리닝 분석에 의해 동정된 신규 제제의 용도에 관한 것이다.
X. 약제학적 조성물 및 약제학적 투여
본 발명은 CoQ10 분자, 예를 들면, CoQ10을 포함하는 조성물을 제공한다. CoQ10 분자는 피검체에 투여하기에 적합한 약제학적 조성물에 혼입될 수 있다. 통상적으로, 상기 약제학적 조성물은 CoQ10 분자 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 본원에 사용된 "약제학적으로 허용되는 담체"는 임의의 모든 용매, 분산 매질, 피복물, 항균제 및 항진균제, 등장제 및 흡착 지연제 등의 생리학적으로 상용성 것들을 포함한다. 약제학적으로 허용되는 담체의 예는 물, 식염수, 인산 완충 식염수, 덱스트로스, 글리세롤, 에탄올 등 및 이들의 배합물을 포함한다. 많은 경우에, 조성물 중에 등장제, 예를 들면, 당, 다가 알코올, 예를 들면, 만니톨, 소르비톨, 또는 염화나트륨을 포함하는 것이 바람직할 수 있다. 약제학적으로 허용되는 담체는 환경 영향인자의 저장 수명 또는 효과를 증진시키는 습윤제 또는 유화제, 보존제 또는 완충제와 같은 극소량의 보조 물질을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 조성물은 다양한 형태일 수 있다. 이들은 예를 들면, 액체, 반고체 및 고형 투여 형태, 예를 들면, 액체 용액(예를 들면, 주가가능하고 주입가능한 액체), 분산액 또는 현탁액, 정제, 환제, 산제, 크림, 로션, 도찰제, 연고 또는 페이스트, 안구, 귀 또는 코 투여용 점적제, 리포좀 및 좌제를 포함한다. 바람직한 형태는 의도된 투여 방식 및 치료적 적용 방식에 의존한다.
CoQ10 분자는 당업계에 공지된 다양한 방법들에 의해 투여될 수 있다. 많은 치료적 적용을 위해, 바람직한 투여 경로/방식은 국소적 피하 주사, 정맥내 주사 또는 주입이다. 당업자에 의해 인지되는 바와 같이, 투여 경로 및/또는 방식은 목적하는 결과에 따라 다양할 것이다. 특정 양태에서, 활성 화합물은 급방출에 대해 화합물을 보호하는 담체, 예를 들면, 이식체, 경피 패취 및 마이크로캡슐화된 전달 시스템을 포함하는 조절 방출 제형과 함께 제조될 수 있다. 에틸렌 비닐 아세테이트, 폴리무수물, 폴리글리콜산, 콜라겐, 폴리오르토에스테르 및 폴리락트산과 같은 생분해가능한 생적합성 중합체가 사용될 수 있다. 상기 제형의 제조를 위한 많은 방법들은 특허되어 있거나 일반적으로 당업자에게 공지되어 있다[문헌참조: Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J.R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978]. 하나의 양태에서, 투여 방식은 비경구성(예를 들면, 정맥내, 피하내, 복막내, 근육내)이다. 하나의 양태에서, 환경 영향인자는 정맥내 주입 또는 주사에 의해 투여된다. 또 다른 양태에서, 환경 영향인자는 근육내 또는 피하 주사에 의해 투여된다. 바람직한 양태에서, 환경 영향인자는 국소적으로 투여된다.
치료적 조성물은 통상적으로 멸균되어야하고 제조 및 저장 조건하에 안정해야만 한다. 상기 조성물은 용액, 미세유액, 분산액, 리포좀 또는 고농도 약물에 적합한 다른 배열의 구조로서 제형화될 수 있다. 주사가능한 멸균 용액은 요구되는 바와 같은 상기 열거된 성분들 중 하나 또는 이들의 배합물과 함께 적당한 용매 중에 요구되는 양으로 활성 화합물(즉, 환경 영향인자)을 혼입시키고, 이어서 멸균 여과함에 의해 제조할 수 있다. 일반적으로, 분산액은 기본 분산 매질 및 상기 열거된 것들로부터 다른 요구되는 성분을 함유하는 멸균 비히클에 활성 화합물을 혼입시킴에 의해 제조된다. 멸균된 주사가능한 용액을 제조하기 위한 멸균 동결건조된 산제의 경우에, 제조를 위한 바람직한 방법들은 이의 이전에 멸균 여과된 용액으로부터 활성 성분 + 임의의 목적하는 추가 성분의 분말을 생성시키는 진공 건조 및 분무 건조이다. 적당한 용액의 유동성은 예를 들면, 레시틴과 같은 피복물을 사용하고, 분산액의 경우에 요구되는 입자 크기를 유지시키고, 계면활성제를 사용하여 유지될 수 있다. 주사가능한 조성물의 지연 흡수는 조성물 내에 흡수를 지연시키는 제제, 예를 들면, 모노스테아레이트 염 및 젤라틴을 포함시킴에 의해 야기될 수 있다.
기술 및 제형은 일반적으로 문헌[참조: Remmington's Pharmaceutical Sciences, Meade Publishing Co., Easton, Pa]에서 찾을 수 있다. 전신성 투여를 위해서는, 근육내, 정맥내, 복막내 및 피하를 포함하는 주사가 바람직하다. 주사를 위해, 본 발명의 화합물은 액체 용액에, 바람직하게는 행크 용액 또는 링거 용액과 같은 생리학적 상용성 완충제에서 제형화될 수 있다. 또한, 상기 화합물은 고체 형태로 제형화될 수 있고, 사용 직전에 재용해되거나 현탁될 수 있다. 동결건조된 형태가 또한 포함된다.
경구 투여를 위해, 약제학적 조성물은 예를 들면, 결합제(예를 들면, 예비젤라틴화된 옥수수 전분, 폴리비닐피롤리돈 또는 하이드록시프로파일 메틸셀룰로스); 충전제(예를 들면, 락토스, 미세결정성 셀룰로스 또는 인산수소칼슘); 윤활제(예를 들면, 마그네슘 스테아레이트, 탈크 또는 실리카); 붕해제(예를 들면, 감자 전분 또는 나트륨 전분 글리콜레이트); 또는 습윤제(예를 들면, 나트륨 라우릴 설페이트)와 같은 약제학적 허용되는 부형제와 함께 통상적인 수단에 의해 제조된 정제 또는 캡슐제의 형태를 취할 수 있다. 상기 정제는 당업계에 널리 공지된 방법들에 의해 피복될 수 있다. 경구 투여용의 액체 제제는 예를 들면, 용액, 시럽 또는 현탁액의 형태를 취할 수 있거나, 이들은 사용 전에 물 또는 다른 적합한 비히클과 구성하기 위한 무수 생성물로서 제공될 수 있다. 상기 액체 제제는 현탁제(예를 들면, 소르비톨 시럽, 셀룰로스 유도체 또는 수소화된 식용 지방); 유화제(예를 들면, 레시틴 또는 아카시아); 비-수성 비히클(예를 들면, 아티온드 오일, 오일 에스테르, 에틸 알코올 또는 분획된 식물성 오일); 및 보존제(예를 들면, 메틸 또는 프로파일-p-하이드록시벤조에이트 또는 소르브산)과 같은 약제학적으로 허용되는 첨가제와 함께 통상적인 수단에 의해 제조될 수 있다. 상기 제제는 또한 완충염, 향료, 착색제 및 감미제를 적절하게 함유할 수 있다.
경구 투여용 제제는 활성 화합물의 제어 방출을 수득하기 위해 적합하게 제형화될 수 있다. 구강 투여를 위해, 상기 조성물은 통상적인 방식으로 제형화된 정제 또는 로젠지 형태를 취할 수 있다. 흡입 투여를 위해, 본 발명에 따라 사용되는 화합물은 적합한 추진제, 예를 들면, 디클로로디플루오로메탄, 트리클로로플루오로메탄, 디클로로테트라플루오로에탄, 이산화탄소 또는 기타 적합한 가스의 사용과 함께 가압된 팩 또는 분무기로부터 에어로졸 분무 제공 형태로 간편하게 제공된다. 가압된 에어로졸의 경우에, 투여 단위는 계량된 양을 전달하기 위해 밸브를 제공함에 의해 결정될 수 있다. 예를 들면, 흡입기 또는 취입기에 사용하기 위한, 젤라틴의 캡슐제 및 카트릿지가 제형화될 수 있고 이는 화합물의 분말 혼합물 및 락토스 또는 전분과 같은 적합한 분말 기재를 함유한다.
상기 화합물은 주사, 예를 들면, 1회분 주사 또는 연속 주입에 의한 비경구 투여용으로 제형화될 수 있다. 주사용 제형은 보존제 첨가된 단위 투여형, 예를 들면, 앰풀 또는 다중용량 컨테이너로 제공될 수 있다. 상기 조성물은 오일 또는 수성 비히클내 현탁액, 용액 또는 유액과 같은 형태를 취할 수 있고, 현탁제, 안정제 및/또는 분산제와 같은 제형화제를 함유할 수 있다. 대안적으로, 활성 성분은 사용 전에 적합한 비히클, 예를 들면, 멸균 발열원 부재 물과 구성하기 위한 분말 형태일 수 있다.
상기 화합물은 또한 예를 들면, 코코아 버터 또는 기타 글리세리드와 같은 통상적인 좌제 기재를 함유하는 좌제 또눈 정체 관장제와 같은 직장 조성물로 제형화될 수 있다.
이전에 기재된 제형 이외에 상기 화합물은 또한 데포(depot) 제제로서 제형화될 수 있다. 상기 장기 지속적 제형은 이식(예를 들면, 피하 또는 균육내) 또는 근육내 주사에 의해 투여될 수 있다. 따라서, 예를 들면, 상기 화합물은 적합한 중합체성 또는 소수성 물질(예를 들면, 허용가능한 오일 중 유제로서) 또는 이온 교환 수지와 함께 또는 거의 불용성인 유도체로서, 예를 들면, 거의 불용성 염으로서 제형화될 수 있다.
전신성 투여는 또한 경점막 또는 경피 수단에 의한 것일 수 있다. 경점막 또는 경피 투여를 위해, 침투될 장벽에 적당한 침투제가 제형에 사용된다. 상기 침투제는 일반적으로 당업계에 공지되어 있고, 예를 들면, 경점막 투여용으로 담즙 염 및 푸시딘산 유도체를 포함한다. 또한 세제를 사용하여 침투를 촉진시킬 수 있다. 경점막 투여는 비강 스프레이를 통해서 또는 좌제를 사용하여 수행될 수 있다. 국소 투여를 위해, 본 발명의 화합물(들)은 당업계에 일반적으로 공지된 연고, 살브제(salve), 겔 또는 크림으로 제형화된다. 세척 용액을 국소적으로 사용하여 치유를 가속화하기 위해 손상 또는 염증을 치료할 수 있다.
상기 조성물은, 경우에 따라, 활성 성분을 함유하는 하나 이상의 단위 투여형을 함유할 수 있는 팩 또는 분배 장치에 제공될 수 있다. 상기 팩은 예를 들면, 금속 또는 플라스틱 포일, 예를 들면, 블리스터 팩일 수 있다. 상기 팩 또는 분배 장치는 투여용 지침서를 수반할 수 있다.
핵산의 투여를 포함하는 치료를 위해, 본 발명의 화합물(들)은 전신성 및 국소적 또는 국부적 투여를 포함하는 다양한 투여 방식용으로 제형화될 수 있다. 기술 및 제형은 일반적으로 문헌[참조: Remmington's Pharmaceutical Sciences, Meade Publishing Co., Easton, Pa]에서 찾을 수 있다. 전신성 투여를 위해, 근육내, 정맥내, 복막내, 결절내 및 피하를 포함하는 주사가 바람직하다. 주사를 위해, 본 발명의 화합물(들)은 액체 용액 중에, 바람직하게는, 생리학적 상용성 완충제, 예를 들면, 행크 용액 또는 링거 용액 중에서 제형화될 수 있다. 또한, 상기 화합물(들)은 고체 형태로 제형화될 수 있고, 사용 직전에 재용해되거나 현탁될 수 있다. 동결건조된 형태가 또한 포함된다.
본 발명의 바람직한 양태에서, CoQ10 분자, 예를 들면, CoQ10을 포함하는 조성물은 국소적으로 투여된다. 약제학적 제형으로서 활성 성분, 즉 CoQ10 분자를 제공하는 것이 바람직할 수 있다. 상기 활성 성분은 국소 투여를 위해 최종 생성물 중의 제형의 중량을 기준으로 약 0.001 내지 약 20% w/w를 포함할 수 있지만 이것은 제형의 30% w/w 정도, 바람직하게는 약 1 내지 약 20% w/w를 포함할 수 있다. 본 발명의 국소 제형은 하나 이상의 허용되는 담체(들) 및 임의로 다른 치료적 성분(들)과 함께 활성 성분을 포함한다. 상기 담체(들)는 제형의 다른 성분과 상용된다는 점에서 "허용가능"해야하고 이의 수용자에게 유해하지 않아야 한다.
관심의 대상이 되는 장애를 나타내는 환자를 치료하는데 있어서, 치료 유효량의 제제 또는 이들과 같은 제제들이 투여된다. 치료적 유효 용량은 환자에서 증상을 완화시키거나 생존을 연장시키는 화합물의 양을 언급한다.
상기 화합물의 독성 및 치료적 효능은 예를 들면, LD50(집단의 50%에 치명적인 용량) 및 ED50(집단의 50%에 치료적으로 효과적인 용량)을 결정하기 위해 세포 배양물 또는 실험 동물에서의 표준 약제학적 과정에 의해 결정될 수 있다. 독성 및 치료 효과 간의 용량 비는 치료 지수이고 이것은 LD50/ED50 비율로서 표현될 수 있다. 큰 치료 지수를 나타내는 화합물이 바람직하다. 이들 세포 배양물 분석 및 동물 연구로부터 수득된 데이타는 사람에 사용하기 위한 투여량 범위로 제형화하는데 사용될 수 있다. 상기 화합물의 투여량은 바람직하게 거의 독성이 없거나 독성이 없는 ED50을 포함하는 순환 농도 범위 내에 있다. 상기 투여량은 사용되는 투여형 및 사용되는 투여 경로에 따라 상기 범위 내에서 다양할 수 있다.
본 발명의 방법에 사용되는 임의의 화합물에 대해, 치료 유효량은 처음에 세포 배양물 분석으로부터 평가될 수 있다. 예를 들면, 1회 용량은 세포 배양물에서 측정된 IC50을 포함하는 순환 혈장 농도 범위를 성취하기 위해 동물 모델에서 제형화될 수 있다. 상기 정보를 사용하여 사람에서 유용한 용량을 보다 정확하게 결정할 수 있다. 혈장내 수준은 예를 들면, HPLC로 측정할 수 있다.
정확한 제형, 투여 경로 및 투여량은 환자의 병태의 관점에서 개별 담당의가 선택할 수 있다[문헌참조: Fingl et al., in The Pharmacological Basis of Therapeutics, 1975, Ch. 1 p. 1]. 담당의는 독성 또는 기관 기능부전으로 인해 투여를 언제 어떻게 종결하거나, 중단하거나 조정해야하는지를 숙지하고 있음을 주지해야 한다. 역으로, 담당의는 또한, 임상적 반응이 적정하지 않은 경우(독성을 제외하고) 보다 높은 수준으로 치료를 조정하는 법을 알 것이다. 관심의 대상이 되는 발암성 장애를 다루는데 있어서 투여 용량 정도는 치료될 병태의 중증도 및 투여 경로에 따라 다양할 것이다. 상기 병태의 중증도는 예를 들면, 부분적으로 표준 예후 평가 방법들에 의해 평가될 수 있다. 추가로, 용량 및 용량 빈도수는 또한 개별 환자의 연령, 체중 및 반응에 따라 다양할 것이다. 상기 논의된 것에 상응하는 프로그램은 수의 약물에 사용될 수 있다.
치료될 특정 병태에 의존하여, 상기 제제는 전신성으로 또는 국소적으로 제형화하고 투여될 수 있다. 제형화 및 투여를 위한 기술은 문헌[참조: Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th ed., Mack Publishing Co., Easton, Pa. (1990)]에서 찾을 수 있다. 적합한 경로는 단지 몇가지 거론하자면, 경구, 직장, 경피, 질내, 경점막 또는 장 투여; 근육내, 피하내, 수내 주사를 포함하는 비경구 전달, 및 경막내, 직접적인 뇌실내, 정맥내, 복막내, 비강내 또는 안구내 주사를 포함할 수 있다.
상기된 조성물은 임의의 적합한 제형으로 피검체에 투여될 수 있다. CoQ10 분자, 예를 들면, CoQ10의 국소적 제형을 사용한 육종의 치료 이외에, 본 발명의 다른 측면에서 CoQ10 분자는 다른 방법들에 의해 전달될 수 있다. 예를 들면, CoQ1O 분자는 비경구 전달용으로, 예를 들면, 피하, 정맥내, 근육내 또는 종양내 주사용으로 제형화될 수 있다. 전달의 다른 방법들, 예를 들면, 리포좀 전달 또는 상기 조성물이 함침된 장치로부터의 확산이 사용될 수 있다. 상기 조성물은 단일 1회분, 수회 주사 또는 연속 주입(예를 들면, 정맥내 또는 복막 투석에 의해)에 의해 투여될 수 있다. 비경구 투여를 위해, 상기 조성물은 바람직하게 멸균 발열원 부재 형태로 제형화된다. 본 발명의 조성물은 또한 세포가 함유된 유체에 상기 조성물을 단순히 첨가함에 의해 시험관내에서 세포에 투여될 수 있다(예를 들면, 시험관내 배양물 내의 암 세포에서 아폽토시스를 유도하기 위해).
주사를 위해, 본 발명의 제제는 수용액 중에, 바람직하게는 생리학적 상용성 완충액, 예를 들면, 행크 용액, 링거 용액 또는 생리학적 식염수 완충액 중에서 제형화될 수 있다. 상기 경점막 투여를 위해, 침투될 장벽에 적당한 침투제가 상기 제형에 사용된다. 상기 침투제는 일반적으로 당업계에 공지되어 있다.
본 발명의 실시를 위해 본원에 기재된 화합물을 전신 투여용으로 적합한 투여량으로 제형화하기 위한 약제학적으로 허용되는 담체의 용도는 본 발명의 범위내에 있다. 담체의 적당한 선택과 적합한 제조 실시와 함께, 특히 용제로서 제형화된 것들인 본 발명의 조성물은 예를 들면, 정맥내 주사에 의해 비경구로 투여될 수 있다. 상기 화합물은 당업계에 널리 공지된 약제학적으로 허용되는 담체를 사용하여 경구 투여용으로 적합한 투여형으로 용이하게 제형화될 수 있다. 상기 담체는 본 발명의 화합물이, 정제, 환제, 캡슐제, 액제, 겔, 시럽, 슬러리, 현탁액 등으로서 치료될 환자에 의한 경구 섭취용으로 제형화될 수 있도록 한다.
세포내 투여되는 것으로 의도된 제제는 당업자에게 널리 공지된 기술을 사용하여 투여될 수 있다. 예를 들면, 상기 제제는 리포좀으로 캡슐화될 수 있고, 이어서 상기된 바와 같이 투여될 수 있다. 리포좀은 내부가 수성인 구형 액체 이중층이다. 리포좀 형성시에 수용액에 존재하는 모든 분자는 수성 내부에 혼입된다. 리포좀 내용물은 외부 미세환경으로부터 모두 보호되고, 리포좀은 세포막과 융합하기 때문에 세포질내로 충분히 전달된다. 추가로, 이들의 소수성 때문에, 작은 유기 분자는 세포내로 직접 투여될 수 있다.
본 발명에 사용하기에 적합한 약제학적 조성물은 활성 성분이 이의 의도된 목적을 성취하기 위한 유효량으로 함유되어 있는 조성물을 포함한다. 유효량의 결정은 특히 본원에 제공된 상세한 기재의 관점에서 당업자의 능력 범위내에 있다. 활성 성분 이외에, 이들 약제학적 조성물은 활성 화합물이 약제학적으로 사용될 수 있는 제제로 프로세싱되는 것을 촉진시키는 부형제 및 보조제를 포함하는 적합한 약제학적으로 허용되는 담체를 함유할 수 있다. 경구 투여를 위해 제형화된 제제는 정제, 당의정, 캡슐제 또는 용제 형태일 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물은 예를 들면, 통상적인 혼합, 용해, 과립화, 당의정 제조, 부양, 유화, 캡슐화, 포착 또는 동결건조 방법에 의해 공지된 방식 자체로 제조될 수 있다.
국소 투여용으로 적합한 제형은 치료가 요구되는 부위로 피부를 통한 침투에 적합한 액체 또는 반액체 제제, 예를 들면, 도찰제, 로션, 크림, 연고 또는 페이스트, 및 안구, 귀 또는 코에 투여하기에 적합한 점적제를 포함한다. 본 발명에 따른 점적제는 멸균 수용액 또는 오일 용액 또는 현탁액을 포함할 수 있고, 활성 성분을 살균제 및/또는 살진균제 및/또는 임의의 다른 적합한 보존제의 적합한 수용액내 및 바람직하게는 표면 활성제를 포함하는 적합한 수용액 내에 용해시킴에 의해 제조할 수 있다. 이어서, 상기 수득된 용액을 세정하고, 여과 멸균하고, 무균 기술에 의해 컨테이너로 이동될 수 있다. 점적제 중에 내포시키기에 적합한 살균제 및 살진균제의 예는 페닐수은 질산염 또는 아세테이트(0.002%), 벤즈알코늄 클로라이드(0.01%) 및 클로르헥시딘 아세테이트(0.01%)이다. 오일 용액의 제조를 위해 적합한 용매는 글리세롤, 희석된 알코올 및 프로파일렌 글리콜을 포함한다.
본 발명에 따른 로션은 피부 또는 눈에 적용하기에 적합한 것들을 포함한다. 눈 로션은 임의로 살균제를 함유하는 멸균 수용액을 포함할 수 있고 점적제 제조를 위한 것들과 유사한 방법에 의해 제조될 수 있다. 피부에 적용하기 위한 로션 또는 도찰제는 또한 건조를 촉진시키고 피부를 냉각시키는 제제, 예를 들면, 알코올 또는 아세톤 및/또는 습윤화제, 예를 들면, 글리세롤 또는 오일, 예를 들면, 피마자유 또는 낙화생유를 포함할 수 있다.
본 발명의 크림, 연고 또는 페이스트는 외부 적용을 위한 활성 성분의 반고체 제형이다. 이들은 활성 성분을 단독으로, 또는 적합한 기계를 사용하여 지성 또는 비지성 기재와 함께 수성 또는 비수성 유체 중의 용액 또는 현탁액 중에서 미분되거나 분말화된 형태로 혼합하여 제조될 수 있다. 상기 기재는 경질, 연질 또는 액체 파라핀, 글리세롤, 밀랍, 금속성 비누와 같은 탄화수소; 점액; 아몬드, 옥수수, 아라키스, 피마자유 또는 올리브유와 같은 천연 오일; 양모지 또는 이의 유도체, 또는 플로필렌 글리콜 또는 마크로겔과 같은 알코올과 함께 스테아르산 또는 올레산과 같은 지방산을 포함할 수 있다. 상기 제형에는 음이온성, 양이온성 또는 비이온성 표면 활성제(예를 들면, 소르비탄 에스테르 또는 이의 폴리옥시에틸렌 유도체)와 같은 임의의 적합한 표면 활성제가 혼입될 수 있다. 천연 고무, 셀룰로스 유도체 또는 무기 물질(예를 들면, 규소 실리카) 및 기타 성분(예를 들면, 라놀린)과 같은 현탁액가 또한 포함될 수 있다.
비경구 투여용 약제학적 제형은 수용성 형태로 활성 화합물의 수용액을 포함한다. 추가로, 활성 화합물의 현탁액은 적당한 오일 주사 현탁액으로서 제조될 수 있다. 적합한 친지성 용매 또는 비히클은 참깨유와 같은 지방 오일, 또는 에틸 올레에이트 또는 트리글리세라이드와 같은 합성 지방산 에스테르, 또는 리포좀을 포함한다. 수성 주사 현탁액은 나트륨 카복시메틸 셀룰로스, 소르비톨 또는 덱스트란과 같은 현탁액의 점도를 증가시키는 물질을 함유할 수 있다. 임의로, 상기 현탁액은 또한 화합물의 용해도를 증가시켜 고농도의 용액이 제조되도록 하는 적합한 안정제 또는 제제를 함유할 수 있다.
경구용 약제학적 제제는 활성 화합물을 고체 부형제와 배합하여, 임의로 수득된 혼합물을 분쇄하고 과립의 혼합물을 프로세싱하여 수득될 수 있고 경우에 따라 적합한 보조제를 첨가하여 정제 또는 당의정 코어를 수득할 수 있다. 적합한 부형제는 특히, 락토스, 슈크로스, 만니톨 또는 소르비톨을 포함하는 당과 같은 충전제; 예를 들면, 옥수수 전분, 밀 전분, 쌀 전분, 감자 전분, 젤라틴, 고무 트라가칸트, 메틸 셀룰로스, 하이드록시프로파일메틸-셀룰로스, 나트륨 카복시-메틸셀룰로스 및/또는 폴리비닐 피롤리돈(PVP)과 같은 셀룰로스 제제이다. 경우에 따라, 가교 결합된 폴리비닐 피롤리돈, 한천 또는 알긴산 또는 나트륨 알기네이트와 같은 이의 염과 같은 붕해제가 첨가될 수 있다.
당의정 코어는 적합한 피복물과 함께 제공된다. 상기 목적을 위해, 농축된 당 용액이 사용될 수 있으며, 이는 임의로 아라비아 고무, 탈크, 폴리비닐 피롤리돈, 카보폴 겔, 폴리에틸렌 글리콜 및/또는 이산화티탄, 래커 용액 및 적합한 유기 용매 또는 용매 혼합물을 함유할 수 있다. 염료 또는 안료의 식별을 위해 또는 상이한 조합의 활성 화합물 용량을 확인하기 위해 정제 또는 당의정 피복물에 첨가될 수 있다.
경구로 사용될 수 있는 약제학적 제제는 젤라틴 및 가소제(예를 들면, 글리세롤 또는 소르비톨)로 구성된 연질의 밀봉된 캡슐제 분만 아니라 젤라틴으로 구성된 푸쉬-피트(push-fit) 캡슐제를 포함한다. 상기 푸쉬-피트 캡슐제는 락토스와 같은 충전제, 전분과 같은 결합제, 및/또는 탈크 또는 마그네슘 스테아레이트와 같은 윤활제 및 임의로 안정제와 혼합된 활성 성분을 함유할 수 있다. 연질의 캡슐제에서, 상기 활성 화합물은 지방 오일, 액체 파라핀 또는 액체 폴리에틸렌 글리콜과 같은 적합한 액체 중에 용해되거나 현탁될 수 있다. 또한, 안정제가 첨가될 수 있다.
상기 조성물은, 경우에 따라, 완충 시스템을 포함할 수 있다. 완충 시스템은 조성물의 pH가 목적하는 범위 내에서 유지되거나 완충되도록 선택된다. 본원에 사용된 용어 "완충 시스템" 또는 "완충제"는 수용액 중에서 산 또는 염기가 여기에 첨가되는 경우 pH(또는 수소 이온 농도 또는 활성)가 크게 변하지 않도록 하는 용질 제제 또는 제제들을 언급한다. 상기 지시된 범위 내에서 완충된 출발 pH 값으로부터 pH의 저항성 또는 변화에 관여하는 용질 제제 또는 제제들은 널리 공지되어 있다. 무수히 많은 적합한 완충제가 존재하지만, 인산칼륨 일수화물이 바람직한 완충제이다.
상기 약제학적 조성물의 최종 pH 값은 생리학적 상용성 범위 내에서 다양할 수 있다. 필수적으로, 최종 pH 값은 사람 피부에 자극적이지 않고, 바람직하게 활성 화합물, 즉 CoQ10 분자의 경피 수송이 촉진되도록 하는 pH이다. 상기 제약을 위반하는 것 없이, 상기 pH는 CoQ10 분자 안정성을 개선하고, 요구되는 경우 점조도를 조정하도록 선택될 수 있다. 하나의 양태에서, 바람직한 pH 값은 약 3.0 내지 약 7.4이고, 보다 바람직하게는 약 3.0 내지 약 6.5이고, 가장 바람직하게는 약 3.5 내지 약 6.0이다.
바람직한 국소 전달 비히클에 대해, 조성물의 잔류 성분은 필수적으로 정제된 물, 예를 들면, 탈이온수이다. 이러한 전달 비히클 조성물은 조성물의 총 중량을 기준으로 하여 약 50 내지 약 95% 이상의 범위로 물을 함유한다. 존재하는 특정양의 물이 중요하지 않지만, 목적하는 점도(일반적으로 약 50cps 내지 약 10,000cps) 및/또는 다른 성분의 농도를 수득하기 위해 조정할 수 있다. 상기 국소 전달 비히클은 바람직하게 약 30 센티포이즈 이상의 점도를 갖는다.
다른 공지된 경피 피부 침투 증진제를 또한 사용하여 CoQ10 분자의 전달을 촉진시킬 수 있다. 이의 예는, 설폭사이드, 예를 들면, 디메틸설폭사이드 (DMSO) 등; 사이클릭 아미드, 예를 들면, 1-도데실아자사이클로헵탄-2-온(Azone.TM., Nelson Research, Inc.의 등록상표) 등; 아미드, 예를 들면, N,N-디메틸 아세트아미드(DMA) N,N-디에틸 톨루아미드, N,N-디메틸 포름아미드, N,N-디메틸 옥트아미드, Ν,Ν-디메틸 데카미드 등; 피롤리돈 유도체, 예를 들면, N-메틸-2-피롤리돈, 2-피롤리돈, 2-피롤리돈-5-카복실산, N-(2-하이드록시에틸)-2-피롤리돈 또는 이의 지방산 에스테르, 1-라우릴-4-메톡시카보닐-2-피롤리돈, N-탈로우알킬피롤리돈 등; 폴리올, 예를 들면, 프로파일렌 글리콜, 에틸렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 디프로파일렌 글리콜, 글리세롤, 헥산트리올 등; 직쇄 및 측쇄 지방산, 예를 들면, 올레산, 리놀레산, 라우르산, 발레르산, 헵탄산, 카프로산, 미리스트산, 이소발레르산, 네오펜탄산, 트리메틸 헥산산, 이소스테아르산 등; 알코올, 예를 들면, 에탄올, 프로판올, 부탄올, 옥탄올, 올레일, 스테아릴, 리놀레일 등; 음이온 계면활성제, 예를 들면, 나트륨 라우레이트, 나트륨 라우릴 설페이트 등; 양이온성 계면활성제, 예를 들면, 벤즈알코늄 클로라이드, 도데실트리메틸암모늄 클로라이드, 세틸트리메틸암모늄 브로마이드 등; 비이온성 계면활성제, 예를 들면, 프로폭실화된 폴리옥시에틸렌 에테르, 예를 들면, 폴록사머 231, 폴록사머 182, 폴록사머 184 등, 에톡실화된 지방산, 예를 들면, Tween 20, Myjr 45 등, 소르비탄 유도체, 예를 들면, Tween 40, Tween 60, Tween 80, Span 60 등, 에톡실화된 알코올, 예를 들면, 폴리옥시에틸렌 (4) 라우릴 에테르 (Brij 30), 폴리옥시에틸렌 (2) 올레일 에테르 (Brij 93) 등, 레시틴 및 렉시틴 유도체 등; 테르펜, 예를 들면, D-리모넨, 알파-피넨, 베타-카렌, 알파-테르피네올, 카볼, 카본, 멘톤, 리모넨 옥사이드, 알파-피넨 옥사이드, 유칼립투스 오일 등이다. 또한, 유기산 및 에스테르, 예를 들면, 살리실산, 메틸 살리실레이트, 시트르산, 석신산 등이 피부 침투 증진제로서 적합하다.
하나의 양태에서, 본 발명은 CoQ10 분자 조성물 및 이의 제조 방법을 제공한다. 바람직하게, 상기 조성물은 적어도 약 1% 내지 약 25%의 CoQ10 분자, 예를 들면, CoQ10 w/w를 포함한다. CoQ10은 제조원[Asahi Kasei N&P (Hokkaido, Japan)]으로부터 UBIDECARENONE (USP)로서 구입할 수 있다. CoQ10은 또한 제조원[Kaneka Q10 as Kaneka Q10 (USP UBIDECARENONE)]으로부터 분말 형태(Pasadena, Texas, USA)로 구입할 수 있다. 본원에 예시된 방법들에 사용되는 CoQ10은 하기의 특성들을 갖는다: 잔류 용매는 USP 467 요건을 충족하고; 물 함량은 0.0% 미만, 0.05% 미만 또는 0.2% 미만이고; 발화시 잔류량은 0.0%, 0.05% 미만, 또는 0.2% 미만이고; 중금속 함량은 0.002% 미만, 또는 0.001% 미만이고; 순도는 98 내지 100% 또는 99.9%, 또는 99.5%이다. 조성물을 제조하는 방법들은 하기의 실시예 섹션에서 제공된다.
본 발명의 특정 양태에서, 조효소 Q10 분자, 예를 들면, CoQ10을 치료 또는 예방이 발생하도록 사람에게 국소적으로 투여하여 사람에서 육종을 치료하거나 예방하는 방법들이 제공되고, 여기서, 국소 용량의 조효소 Q10 분자, 예를 들면, CoQ10이 국소 비히클로 사람에게 투여되고, 여기서, 조효소 Q10 분자는 피부 제곱 센티미터 당 조효소 Q10 분자(예를 들면, CoQ10) 약 0.01 내지 약 0.5 mg의 범위에서 표적 조직에 적용된다. 하나의 양태에서, 조효소 Q10 분자(예를 들면, CoQ10)는 피부 제곱 센티미터 당 CoQ10 약 0.09 내지 약 0.15mg의 범위에서 표적 조직에 적용된다. 다양한 양태에서, 조효소 Q10 분자(예를 들면, CoQ10)는 피부 제곱 센티미터당 CoQ10 분자(예를 들면, CoQ10) 약 0.001 내지 약 5.0, 약 0.005 내지 약 1.0, 약 0.005 내지 약 0.5, 약 0.01 내지 약 0.5, 약 0.025 내지 약 0.5, 약 0.05 내지 약 0.4, 약 0.05 내지 약 0.30, 약 0.10 내지 약 0.25, 또는 약 0.10 내지 0.20 mg의 범위에서 표적 조직에 적용된다. 또 다른 양태에서, 조효소 Q10 분자(예를 들면, CoQ10)는 피부 제곱 센티미터당 CoQ10 약 0.01, 0.02, 0.03, 0.04, 0.05, 0.06, 0.07, 0.08, 0.09, 0.10, 0.11, 0.12, 0.13, 0.14, 0.15, 0.16, 0.17, 0.18, 0.19, 0.20, 0.21, 0.22, 0.23, 0.24, 0.25, 0.26, 0.27, 0.28, 0.29, 0.30, 0.31, 0.32, 0.33, 0.34, 0.35, 0.36, 0.37, 0.38, 0.39, 0.40, 0.41, 0.42, 0.43, 0.44, 0.45, 0.46, 0.47, 0.48, 0.49 또는 0.5 mg의 용량으로 표적 조직에 적용된다. 하나의 양태에서, 조효소 Q10 분자(예를 들면, CoQ10)는 피부 제곱 센티미터 당 CoQ10 분자(예를 들면, CoQ10) 약 0.12mg의 용량으로 표적 조직에 적용된다. 이것은 상한치 또는 하한치로서 상기 값들 중 어느 하나를 갖는 범위, 예를 들면, 피부 제곱 센티미터 당 약 0.03 내지 약 0.12, 약 0.05 내지 약 0.15, 약 0.1 내지 약 0.20, 또는 약 0.32 내지 약 0.49 mg이 본 발명의 일부인 것으로 의도됨을 이해해야만 한다.
본 발명의 또 다른 양태에서, 조효소 Q10 분자는 피부 제곱 센티미터 당 CoQ10 분자 크림 0.5 내지 10mg의 용량으로 CoQ10 분자 크림 형태로 투여되고, 여기서, CoQ10 분자 크림은 1 내지 5%의 조효소 Q10 분자(예를 들면, CoQ10)를 포함한다. 하나의 양태에서, CoQ10 분자(예를 들면, CoQ10) 크림은 약 3%의 조효소 Q10 분자(예를 들면, CoQ10)를 포함한다. 다른 양태에서, CoQ10 분자 크림은 약 1%, 1.5%, 2%, 2.5%, 3%, 3.5%, 4%, 4.5% 또는 5%의 조효소 Q10 분자(예를 들면, CoQ10)를 포함한다. 다양한 양태에서, CoQ10 분자 크림은 피부 제곱 센티미터 당 CoQ10 분자(예를 들면, CoQ10 크림) 약 0.5, 1.0, 1.5, 2.0, 2.5, 3.0, 3.5, 4.0, 4.5, 5.0, 5.5, 6.0, 6.5, 7.0, 7.5, 8.0, 8.5, 9.0, 9.5 또는 10mg의 용량으로 투여된다. 상한치 또는 하한치로서 이들 값들 중 어느 하나를 갖는 범위는 또한, 예를 들면 피부 제곱 센티미터당 약 0.5 내지 약 5.0, 약 1.5 내지 2.5, 또는 약 2.5 내지 5.5 mg의 CoQ10 분자(예를 들면, CoQ10) 크림으로서 본 발명의 일부인 것으로 의도됨을 이해해야 한다.
또 다른 양태에서, 조효소 Q10 분자는 피부 제곱 센티미터 당 CoQ10 분자(예를 들면, CoQ10) 크림 3 내지 5mg의 용량으로 CoQ10 크림의 형태로 투여되고, 여기서, CoQ10 분자(예를 들면, CoQ10) 크림은 1 내지 5%의 조효소 Q10을 포함한다. 하나의 양태에서, CoQ10 분자(예를 들면, CoQ10) 크림은 약 3%의 조효소 Q10을 포함한다. 다른 양태에서, CoQ10 분자(예를 들면, CoQ10) 크림은 약 1%, 1.5%, 2%, 2.5%, 3%, 3.5%, 4%, 4.5% 또는 5%의 조효소 Q10을 포함한다. 다양한 양태에서, CoQ10 분자(예를 들면, CoQ10) 크림은 피부 제곱 센티미터 당 CoQ10 분자(예를 들면, CoQ10) 크림 약 3.0, 3.1, 3.2, 3.3, 3.4, 3.5, 3.6, 3.7, 3.8, 3.9, 4.0, 4.1, 4.2, 4.3, 4.4, 4.5, 4.6, 4.7, 4.8, 4.9 또는 5.0mg의 용량으로 투여된다. 상한치 또는 하한치로부터 이들 값들 중 어느 하나를 갖는 범위, 예를 들면, 피부 제곱 센티미터당 CoQ10 분자(예를 들면, CoQ10) 크림 약 3.0 내지 약 4.0, 약 3.3 내지 5.3, 또는 약 4.5 내지 4.9 mg이 본 발명의 일부인 것으로 의도됨을 이해해야 한다.
본 발명의 특정 측면은 조효소 Q10을 치료 또는 예방이 발생하도록 사람에게 국소적으로 투여함에 의해 사람에서 육종을 치료하거나 예방하는 방법들을 제공하고, 여기서, 조효소 Q10은 6주 이상 동안 24시간 마다 1회 이상 국소적으로 적용된다.
본 발명의 특정 측면은 상 A, B, C, D 및 E를 제조하는 단계 및 3% CoQ10 크림의 수중유 에멀젼이 형성되도록 상기 모든 상을 배합하는 단계를 포함하는 조효소 Q10 크림 3%를 제조하기 위한 방법을 제공한다.
몇몇 양태에서, 상 A 요소는 알킬 C12-15 벤조에이트 NF 4.00 %w/w, 세틸 알코올 NF 2.00 %w/w, 글리세릴 스테아레이트/PEG-100 4.5 %w/w 및 스테아릴 알코올 NF 1.50 %w/w를 포함하고, 상 B 성분은 디에틸렌 글리콜 모노에틸 에테르 NF 5.00 %w/w, 글리세린 USP 2.00 %w/w, 프로파일렌 글리콜 USP 1.50 %w/w, 페녹시에탄올 NF 0.475 %w/w, 정제수 USP 16.725 %w/w 및 카보머 분산액 2% 40.00 %w/w를 포함하고, 상 C 성분은 락트산 USP 0.50 %w/w, 나트륨 락테이트 용액 USP 2.00 %w/w, 트롤라민 NF 1.30 %w/w, 및 정제수 USP 2.50 %w/w를 포함한다. 추가로, 이들 양태에서 상 D 성분은 이산화티탄 USP 1.00 %w/w를 포함하고, 상 E 성분은 CoQ10 21% 농축물 15 %w/w를 포함한다.
다른 특정 양태에서, 상 A 성분은 카프릭/카프릴릭 트리글리세라이드 4.00 %w/w, 세틸 알코올 NF 2.00 %w/w, 글리세릴 스테아레이트/PEG-100 4.5% 및 스테아릴 알코올 NF 1.5 %w/w를 포함하고, 상 B 성분은 디에틸렌 글리콜 모노에틸 에테르 NF 5.00 %w/w, 글리세린 USP 2.00 %w/w, 프로파일렌 글리콜 USP 1.50 %w/w, 페녹시에탄올 NF 0.475 %w/w, 정제수 USP 16.725 %w/w 및 카보머 분산액 2% 40.00 %w/w를 포함하고, 상 C 성분은 락트산 USP 0.50 %w/w, 나트륨 락테이트 용액 USP 2.00 %w/w, 트롤아민 NF 1.30 %w/w, 및 정제수 USP 2.50 %w/w를 포함한다. 추가로, 이들 양태에서, 상 D 성분은 이산화티탄 USP 1.00 %w/w를 포함하고, 상 E 성분은 CoQ10 21% 농축물 15% w/w를 포함한다.
본 발명의 특정 양태에서, (1) 상 A 성분을 적합한 컨테이너에 첨가하고 수욕에서 70 내지 80℃로 가열하는 단계; (2) 카보머 분산액을 제외한 상 B 성분을 적합한 컨테이너에 첨가하고 혼합하여 혼합된 상 B를 형성하는 단계; (3) 상 E 성분을 적합한 컨테이너에 위치시키고, 수욕을 사용하여 50 내지 60℃의 온도에서 용융시켜 용융된 상 E를 형성하는 단계; (4) 카보머 분산액을 혼합 탱크에 첨가하고 70 내지 80℃에서 혼합하면서 가열하는 단계; (5) 혼합 상 B를 혼합 탱크에 온도를 70 내지 80℃로 유지시키면서 첨가하는 단계; (6) 상 C 성분을 70 내지 80℃로 온도를 유지시키면서 혼합 탱크에 첨가하는 단계; (7) 상 D 성분을 혼합 탱크에 첨가하고, 이어서 계속 혼합하여 혼합 탱크의 내용물을 균질화시키는 단계에 이어서, (8) 균질화를 종료하고 혼합 탱크의 내용물을 50 내지 60℃로 냉각시키는 단계에 이어서, (9) 혼합을 중단하고 용융된 상 E를 혼합 탱크에 첨가하여 분산액을 형성하는 단계; (10) 이어서, 상기 혼합을 분산액이 부드럽고 균일해질때까지 재개하는 단계에 이어서, (11) 상기 혼합 탱크의 내용물을 45 내지 50℃로 냉각시키는 단계를 포함하는 조효소 Q10 크림 3%를 제조하기 위한 방법이 제공된다.
본 발명의 몇몇 다른 양태에서, CoQ10 크림 3%를 포함하는 약제학적 조성물이 제공된다. 상기 크림은 조성물의 4.00 %w/w에서 C12 -15 알킬 벤조에이트, 조성물의 2.00 %w/w에서 세틸 알코올, 스테아릴 알코올 1.5 %w/w, 글리세릴 스테아레이트 및 PEG-100 4.5 %w/w를 갖는 상 A; 글리세린 2.00 %w/w, 프로파일렌 글리콜 1.5 %w/w, 에톡시디글리콜 5.0 %w/w, 페녹시에탄올 0.475 %w/w, 카보머 분산액 40.00 %w/w, 정제수 16.725 %w/w를 갖는 상 B; 트리에탄올아민 1.300 %w/w, 락트산 0.500 %w/w, 나트륨 락테이트 용액 2.000 %w/w, 물 2.5 %w/w를 갖는 상 C; 이산화티탄 1.000 %w/w를 갖는 상 D; 및 CoQ1O 21% 농축물 15.000 %w/w를 갖는 상 E를 포함한다. 몇몇 양태에서, 카보머 분산액은 물, 페녹시에탄올, 프로파일렌 글리콜 및 카보머 940을 포함한다.
본 발명의 몇몇 다른 양태에서, CoQ1O 크림 3%를 포함하는 약제학적 조성물이 제공된다. 상기 크림은 조성물의 4.00 %w/w에서 카프릭/카프릴릭 트리글리세라이드, 조성물의 2.00 %w/w에서 세틸 알코올, 스테아릴 알코올 1.5 %w/w, 글리세릴 스테아레이트 및 PEG-100 4.5 %w/w를 갖는 상 A; 글리세린 2.00 %w/w, 프로파일렌 글리콜 1.5 %w/w, 에톡시디글리콜 5.0 %w/w, 페녹시에탄올 0.475 %w/w, 카보머 분산액 40.00 %w/w, 정제수 16.725 %w/w를 갖는 상 B; 트리에탄올아민 1.300 %w/w, 락트산 0.500 %w/w, 나트륨 락테이트 용액 2.000 %w/w, 물 2.5 %w/w를 갖는 상 C; 이산화티탄 1.000 %w/w를 갖는 상 D; 및 CoQ10 21% 농축물 15.000 %w/w를 갖는 상 E를 포함한다. 몇몇 양태에서, 카보머 분산액은 물, 페녹시에탄올, 프로파일렌 글리콜 및 카보머 940을 포함한다.
본 발명의 몇몇 다른 양태에서, CoQ10 크림 1.5%를 포함하는 약제학적 조성물이 제공된다. 상기 크림은 C12-15 알킬 벤조에이트 5.000 %w/w, 세틸 알코올 2.000 %w/w, 스테아릴 알코올 1.5 %w/w, 글리세릴 스테아레이트 및 PEG-100 스테아레이트 4.500 %w/w를 갖는 상 A; 글리세린 2.000 %w/w, 프로파일렌 1.750 %w/w, 에톡시디글리콜 5.000 %w/w, 페녹시에탄올 0.463 %w/w, 카보머 분산액 50 %w/w, 및 정제수 11.377 %w/w를 갖는 상 B; 트리에탄올아민 1.3 %w/w, 락트산 0.400 %w/w, 나트륨 락테이트 용액 2.000 %w/w, 및 물 4.210 %w/w를 갖는 상 C; 이산화티탄 1.000 %w/w를 갖는 상 D; 및 CoQ10 21% 농축물 1.500 %w/w를 갖는 상 E를 포함한다.
본 발명의 몇몇 다른 양태에서, CoQ10 크림 1.5%를 포함하는 약제학적 조성물이 제공된다. 상기 크림은 카프릭/카프릴릭 트리글리세라이드 5.000 %w/w, 세틸 알코올 2.000 %w/w, 스테아릴 알코올 1.5 %w/w, 글리세릴 스테아레이트 및 PEG-100 스테아레이트 4.500 %w/w를 갖는 상 A; 글리세린 2.000 %w/w, 프로파일렌 1.750 %w/w, 에톡시디글리콜 5.000 %w/w, 페녹시에탄올 0.463 %w/w, 카보머 분산액 50 %w/w, 및 정제수 11.377 %w/w를 갖는 상 B; 트리에탄올아민 1.3 %w/w, 락트산 0.400 %w/w, 나트륨 락테이트 용액 2.000 %w/w, 및 물 4.210 %w/w를 갖는 상 C; 이산화티탄 1.000 %w/w를 갖는 상 D; 및 CoQ10 21% 농축물 1.500 %w/w를 갖는 상 E를 포함한다. 몇몇 양태에서, 카보머 분산액은 물, 페녹시에탄올 및 프로파일렌 글리콜을 포함한다.
1. 병용 치료
특정 양태에서, CoQ10 분자 및/또는 이의 약제학적 조성물은 하나 이상의 다른 치료제와의 병용 치료에 사용될 수 있다. CoQ10 분자 및/또는 이의 약제학적 조성물 및 기타 치료제는 부가적으로 또는 보다 바람직하게는 상승작용적으로 작용할 수 있다. 하나의 양태에서, CoQ1O 분자 및/또는 이의 약제학적 조성물은 또 다른 치료제의 투여와 동시에 투여된다. 또 다른 양태에서, 화합물 및/또는 이의 약제학적 조성물은 또 다른 치료제의 투여 전후에 투여된다.
하나의 양태에서, 본 발명의 치료적 방법들은 첨가제를 포함한다. 예를 들면, 하나의 양태에서, 본 발명의 치료적 방법들에 사용하기 위한 첨가제는 화학치료제이다.
화학치료제는 일반적으로 다양한 부류에 속하고, 예를 들면: 1. 토포이소머라제 II 억제제 (세포독성 항생제), 예를 들면, 안트라사이클린/안트라센디온, 예를 들면, 독소루비신, 에피루비신, 이다루비신 및 네모루비신, 안트라퀴논(예를 들면, 미톡산트론 및 로속산트론), 포도필로톡신(예를 들면, 에토포사이드 및 테니포사이드); 2. 마이크로튜불 형성에 영향을 미치는 제제(유사분열 억제제), 예를 들면, 식물 알칼로이드(예를 들면, 생물학적 활성이고 세포독성인, 식물로부터 유래된 알칼리성 질소 함유 분자 계열에 속하는 화합물), 예를 들면, 탁산, 예를 들면, 파클리탁셀 및 도세탁셀, 및 빈카 알칼로이드, 예를 들면, 빈블라스틴, 빈크리스틴, 및 비노렐빈, 및 포도필로톡신의 유도체; 3. 알킬화제, 예를 들면, 질소 머스타드, 에틸렌이민 화합물, 알킬 설포네이트 및 알킬화 작용을 갖는 다른 화합물, 예를 들면, 니트로소우레아, 다카바진, 사이클로포스파미드, 이포스프아미드 및 멜팔란; 4. 항대사물(뉴클레오사이드 억제제), 예를 들면, 폴레이트, 예를 들면, 폴산, 피우로피리미딘, 퓨린 또는 피리미딘 유사체, 예를 들면, 5-플루오로우라실, 카페시타빈, 겜시타빈, 메토트렉세이트 및 에다트렉세이트; 5. 토포이소머라제 I 억제제, 예를 들면, 토포테칸, 이리노테칸, 및 9-니트로캄프토테신, 및 캄프토테신 유도체; 및 6. 백금 화합물/착물, 예를 들면, 시스플라틴, 옥살리플라틴, 및 카보플라틴을 포함한다. 본 발명의 방법에 사용하기 위한 예시적인 화학치료제는 아미포스틴 (에티올), 시스플라틴, 다카바진 (DTIC), 닥티노마이신, 메클로레타민 (질소 머스타드), 스트렙토조신, 사이클로포스파미드, 카르누스틴(BCNU), 로무스틴 (CCNU), 독소루비신 (아드리아마이신), 독소루비신 리포 (독실), 겜시타빈 (겜자르), 다우노루비신, 다우노루비신 리포(다우녹솜), 프로카바진, 미토마이신, 시타라빈, 에토포사이드, 메토트렉세이트, 5-플루오로우라실(5-FU), 빈블라스틴, 빈크리스틴, 블레오마이신, 파클리탁셀 (탁솔), 도세탁셀(탁소테레), 알데스류킨, 아스파라기나제, 부설판, 카보플라틴, 클라드리빈, 캄포테신, CPT-I1,1O-하이드록시-7-에틸-캄포테신 (SN38), 다카바진, S-I 카페시타빈, 프토라푸르, 5'데옥시플루로우리딘, UFT, 에닐우라실, 데옥시시티딘, 5-아자사이토신, 5-아자데옥시사이토신, 알로푸리놀, 2-클로로 아데노신, 트리메트렉세이트, 아미노프테린, 메틸렌-10-데아자아미노프테린(MDAM), 옥사플라틴, 피코플라틴, 테트라플라틴, 사트라플라틴, 백금-DACH, 오르마플라틴, CI-973, JM-216, 및 이들의 유사체, 에피루비신, 에토포사이드 포스페이트, 9-아미노캄프토테신, 10,11-메틸렌디옥시캄프토테신, 카레니테신, 9-니트로캄프토테신, TAS 103, 빈데신, L-페닐알라닌 머스타드, 이포스파미드메포스파미드, 퍼포스파미드, 트로포스파미드 카르무스틴, 세무스틴, 에포틸론 A-E, 토무덱스, 6-머캅토퓨린, 6-티오구아닌, 암사크린, 에토포사이드 포스페이트, 카레니테신, 아사이클로비르, 발라사이클로비르, 간시클로비르, 아만타딘, 리만타딘, 라미부딘, 지도부딘, 베바시주마브, 트라스투주마브, 리툭시마브, 5-플루오로우라실, 카페시타빈, 펜토스타틴, 트리메트렉세이트, 클라드리빈, 플록수리딘, 플루다라빈, 하이드록시우레아, 이포스파미드, 이다루비신, 메스나, 이리노테칸, 미톡산트론, 토포테칸, 류프롤리드, 메게스트롤, 멜팔란, 머캅토퓨린, 플리카마이신, 미토탄, 페가스파르가제, 펜토스타틴, 피포브로만, 플리카마이신, 스트렙토조신, 타목시펜, 테니포사이드, 테스톨락톤, 티오구아닌, 티오테파, 우라실 머스타드, 비노렐빈, 클로람부실, 시스플라틴, 독소루비신, 파클리탁셀 (탁솔) 및 블레오마이신, 및 특정 종양 또는 암에 대해 적당한 표준 케어를 기준으로 당업자에게 용이하게 자명한 이들의 배합물을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
또 다른 양태에서, 본 발명의 치료제와 병용하여 사용하기 위한 추가의 제제는 생물학적 제제이다.
생물학적 제제(또한 생물제로서도 언급됨)는 생물학적 시스템, 예를 들면, 유기체, 세포 또는 재조합 시스템의 생성물이다. 상기 생물학적 제제의 예는 핵산 분자(예를 들면, 안티센스 핵산 분자), 인터페론, 인터류킨, 콜로니 자극 인자, 항체, 예를 들면, 모노클로날 항체, 항-혈관형성 제제 및 사이토킨을 포함한다. 예시적인 생물학적 제제는 하기에서 보다 상세하게 논의되고 일반적으로 다양한 부류에 속하고, 예를 들면: 1. 호르몬, 호르몬 유사체 및 호르몬 복합체, 예를 들면, 에스트로겐 및 에스트로겐 유사체, 프로게스테론, 프로게스테론 유사체 및 프로게스틴, 안드로겐, 아드레노코르티코스테로이드, 항에스트로겐, 항안드로겐, 항테스토스테론, 아드레날 스테로이드 억제제 및 항-황체 형성 호르몬; 및 2. 효소, 단백질, 펩타이드, 폴리클로날 및/또는 모노클로날 항체, 예를 들면, 인터류킨, 인터페론, 콜로니 자극 인자 등을 포함한다.
하나의 양태에서, 생물학적 제제는 인터페론이다. 인터페론(IFN)은 신체에 천연적으로 존재하는 생물학적 제제이다. 인터페론은 또한 실험실에서 제조되고 생물학적 치료에서 암 환자에게 투여된다. 이들은 암 환자의 면역계가 암 세포에 대해 작용하는 방식을 개선시키는 것으로 나타났다.
인터페론은 직접 암세포에 작용하여 이들의 성장을 지체시킬 수 있거나 이들은 암 세포가 보다 정상적인 거동을 갖는 세포가 되도록 변화시킬 수 있다. 몇몇 인터페론은 또한 암 세포와 싸우도록 도와주는 혈중 백혈구 세포의 일종인 천연 킬러 세포(NK) 세포, T 세포 및 마크로파지를 자극할 수 있다.
하나의 양태에서, 상기 생물학적 제제는 인터류킨이다. 인터류킨 (IL)은 많은 면역 세포의 성장 및 활성을 자극한다. 이들은 신체에 자연적으로 발생하는 단백질(사이토킨 및 케모킨)이지만 또한 실험실에서 제조될 수 있다.
몇몇 인터류킨은 암 세포를 파괴하는 작용을 하는 림프구와 같은 면역 세포의 성장 및 활성을 자극한다.
또 다른 양태에서, 상기 생물학적 제제는 콜로니 자극 인자이다.
콜로니-자극 인자(CSF)는 보다 많은 혈액 세포를 생성하도록 골수내 줄기 세포를 촉진시키기 위해 환자에게 투여되는 단백질이다. 상기 신체는, 특히 암이 존재하는 경우, 새로운 백혈 세포, 적혈 세포 및 혈소판을 계속적으로 필요로 한다. CSF는 면역계의 부스팅을 돕기위해 화학치료제와 함께 투여된다. 암 환자가 화학치료를 받는 경우, 새로운 백혈 세포를 제조하는 골수의 능력이 억제되어 환자는 감염될 경향이 크게 된다. 면역계의 일부는 혈액 세포 없이는 기능할 수 없고 따라서 콜로니-자극 인자는 골수 줄기 세포가 백혈 세포, 혈소판 및 적혈 세포를 생성하도록 촉진시킨다.
적당한 세포 생산과 함께, 다른 암 치료는 환자가 안전하게 보다 높은 용량의 화학치료를 계속 받을 수 있게 해줄 수 있다.
또 다른 양태에서, 상기 생물학적 제제는 항체이다. 항체, 예를 들면, 모노클로날 항체는 암 세포와 결합하는 실험실에서 제조되는 제제이다.
암 파괴제가 신체에 도입되는 경우, 이들은 항체를 찾아내어 암 세포를 사멸시킨다. 모노클로날 항체 제제는 건강한 세포를 파괴하지 않는다. 모노클로날 항체는 다양한 기작을 통해 이들의 치료 효과를 성취한다. 이들은 아폽토시스 또는 프로그램화된 세포사를 생성시키는데 직접적인 효과를 가질 수 있다. 이들은 성장 인자 수용체를 차단하여 종양 세포의 증식을 효과적으로 억제할 수 있다. 모노클로날 항체를 발현하는 세포에서, 이들은 항-이디오타입 항체 형성을 유발할 수 있다.
본 발명의 병용 치료에 사용될 수 있는 항체의 예는 항-인슐린 형 성장 인자 수용체-1, 항-CD20 항체, 예를 들면, 세툭시마브, 토시투모마브, 리툭시마브, 및 이브리투모마브를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 항-HER2 항체는 또한 암 치료를 위해 환경 영향인자와 병용하여 사용될 수 있다. 하나의 양태에서, 항-HER2 항체는 트라스투주마브 (Herceptin)이다. 암 치료를 위해 환경 영향인자와 병용하여 사용될 수 있는 항체의 다른 예는 항-CD52 항체(예를 들면, 알렘투주마브), 항-CD-22 항체(예를 들면, 에프라투주마브), 및 항-CD33 항체(예를 들면, 겜투주마브 오조가미신)를 포함한다. 항-VEGF 항체는 또한 암 치료를 위해 환경 영향인자와 병용하여 사용될 수 있다. 하나의 양태에서, 항-VEGF 항체는 베바시주마브이다. 또 다른 양태에서, 상기 생물학적 제제는 항-EGFR 항체, 예를 들면, 세툭시마브인 항체이다. 또 다른 예는 항-글리코프로테인 17-1 A 항체 에드레콜로마브이다.
또 다른 양태에서, 상기 생물학적 제제는 사이토킨이다. 사이토킨 치료는 피검체의 면역계가 암인 세포를 인지하고 이들을 파괴하도록 도와주기 위한 단백질(사이토킨)을 사용한다. 사이토킨은 면역계에 의해 신체에서 천연적으로 생성되지만 또한 실험에서도 제조될 수 있다. 상기 치료는 진전된 흑색종 및 보조 치료(1차 암 치료 후 또는 이에 추가로 주어지는 치료)와 함께 사용된다. 사이토킨 치료는 신체 모든 부위에 도달하여 암 세포를 사멸시키고 종양이 성장하는 것을 차단한다.
또 다른 양태에서, 상기 생물학적 제제는 융합 단백질이다. 예를 들면, 재조합 사람 Apo2L/TRAIL (Genentech)는 병용 치료에 사용될 수 있다. Apo2/TRAIL은 아폽토시스(프로그램화된 세포 사멸)의 조절에 관여하는 아폽토시스 촉진 수용체 DR4 및 DR5 둘 다를 활성화시키도록 디자인된 제1 이원 아폽토시스 촉진 수용체 효능제이다.
하나의 양태에서, 상기 생물학적 제제는 안티센스 핵산 분자이다.
본원에 사용된 "안티센스" 핵산은 단백질을 암호화하는 "센스" 핵산에 상보적인, 예를 들면, 이중가닥 cDNA 분자의 암호화 가닥에 상보적이거나, mRNA 서열에 상보적이거나 유전자의 암호화 가닥에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 따라서, 안티센스 핵산은 센스 핵산에 수소 결합할 수 있다.
하나의 양태에서, 생물학적 제제는 혈관형성을 증진시키는 분자, 예를 들면, bFGF, VEGF 및 EGFR의 siRNA 분자이다. 하나의 양태에서, 혈관형성을 억제하는 생물학적 제제는 RNAi를 매개한다. RNA 간섭(RNAi)은 이중가닥 RNA(dsRNA)와 동일한 서열을 함유하는 전령 RNA(mRNA)를 분해시키는 dsRNA를 사용하는 전사후 표적화된 유전자 사일런싱 기술이다[문헌참조: Sharp, P.A. and Zamore, P.D. 287, 2431-2432 (2000); Zamore, P.D., et al. Cell 101, 25-33 (2000). Tuschl, T. et al. Genes Dev. 13, 3191-3197 (1999); Cottrell TR, and Doering TL. 2003. Trends Microbiol. 11:37-43; Bushman F.2003. Mol Therapy. 7:9-10; McManus MT and Sharp PA. 2002. Nat Rev Genet. 3.737-47]. 상기 과정은 내인성 리보뉴클레아제가 보다 긴 dsRNA를 작은 간섭 RNA 또는 siRNA로 호칭되는 보다 짧은, 예를 들면, 21개 또는 22개 뉴클레오타이드 길이의 RNA로 절단하는 경우 발생한다. 이어서 보다 작은 RNA 절편은 표적 mRNA의 분해를 매개한다. RNAi의 합성을 위한 키트는 예를 들면, 제조원(New England Biolabs 또는 Ambion)으로부터 시판되고 있다. 하나의 양태에서, 안티센스 RNA에 사용하기 위한 하나 이상의 화학요법은 RNAi를 매개하는 분자에 사용될 수 있다.
세포내 특정 단백질의 발현을 하향조절하기 위한 안티센스 핵산의 용도는 당업계에 널리 공지되어 있다(문헌참조: Weintraub, H. et al., Antisense RNA as a molecular tool for genetic analysis, Reviews - Trends in Genetics, Vol. 1(1) 1986; Askari, F.K. and McDonnell, W.M. (1996) N. Eng. J. Med. 334:316- 318; Bennett, M.R. and Schwartz, S.M. (1995) Circulation 92: 1981-1993; Mercola, D. and Cohen, J.S. (1995) Cancer Gene Ther. 2:47-59; Rossi, JJ. (1995) Br. Med. Bull. 51.217-225; Wagner, R.W. (1994) Nature 372:333-335). 안티센스 핵산 분자는 또 다른 핵산 분자의 암호화 가닥(예를 들면, mRNA 서열)에 상보적이어서 다른 핵산 분자의 암호화 가닥에 수소 결합할 수 있는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. mRNA의 서열에 상보적인 안티센스 서열은 mRNA의 암호화 영역에서 발견되는 서열, mRNA의 5' 또는 3' 비해독 영역 또는 암호화 영역과 비해독 영역을 연결하는 영역(예를 들면, 5' 비해독 영역과 암호화 영역의 접합부에서)에 상보적일 수 있다. 추가로, 안티센스 핵산은 mRNA를 암호화하는 유전자의 조절 영역에 대한 서열, 예를 들면, 전사 개시 서열 또는 조절 요소에 상보적일 수 있다. 바람직하게, 안티센스 핵산은 암호화 가닥상에 또는 mRNA의 3' 비해독 영역에서 개시 코돈 전방에 있거나 이에 걸쳐있는 영역에 상보적이도록 디자인된다.
혈관형성을 증진시키는 분자의 암호화 가닥 서열이 주어진 경우, 본 발명의 안티센스 핵산은 왓슨 및 크릭 염기쌍 형성의 법칙에 따라 디자인될 수 있다. 상기 안티센스 핵산 분자는 mRNA의 전체 암호화 영역에 상보적일 수 있지만, 보다 바람직하게는 mRNA의 암호화 또는 비암호화 영역의 일부에만 안티센스인 올리고뉴클레오타이드이다. 예를 들면, 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 mRNA의 해독 개시 부위를 둘러싸는 영역에 상보적일 수 있다. 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 예를 들면, 길이가 약 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 또는 50개의 뉴클레오타이드일 수 있다.
본 발명의 안티센스 핵산은 당업계에 공지된 과정을 사용하는 화학적 합성 및 효소적 연결 반응을 사용하여 작제될 수 있다. 예를 들면, 안티센스 핵산(예를 들면, 안티센스 올리고뉴클레오타이드)은 분자의 생물학적 안정성을 증가시키도록 또는 안티센스와 센스 핵산들 사이에 형성된 이중가닥의 물리적 안정성을 증가시키도록 디자인된 천연 뉴클레오타이드 또는 다양하게 변형된 뉴클레오타이드를 사용하여 화학적으로 합성될 수 있고, 예를 들면, 포스포로티오에이트 유도체 및 아크리딘 치환된 뉴클레오타이드가 사용될 수 있다. 안티센스 핵산을 제조하도록 사용될 수 있는 변형된 뉴클레오타이드의 예는 5-플루오로우라실, 5-브로모우라실, 5-클로로우라실, 5-요오도우라실, 하이포크산틴, 크산틴, 4-아세틸사이토신, 5-(카복시하이드록실메틸)우라실, 5-카복시메틸아미노메틸-2-티오우리딘, 5-카복시메틸아미노메틸 우라실, 디하이드로우라실, 베타-D-갈락토실쿠에오신, 이노신, N6-이소펜테닐아데닌, 1-메틸구아닌, 1-메틸이노신, 2,2-디메틸구아닌, 2-메틸아데닌, 2-메틸구아닌, 3-메틸사이토신, 5-메틸사이토신, N6-아데닌, 7-메틸구아닌, 5-메틸아미노메틸우라실, 5-메톡시아미노메틸-2-티오우라실, 베타-D-만노실쿠에오신, 5'-메톡시카복시메틸우라실, 5-메톡시우라실, 2-메틸티오-N6-이소펜테닐아데닌, 우라실-5-옥시아세트산 (v), 위부톡소신, 슈도우라실, 쿠에오신, 2-티오사이토신, 5-메틸-2-티오우라실, 2-티오우라실, 4-티오우라실, 5-메틸우라실, 우라실-5-옥시아세트산 메틸에스테르, 우라실-5-옥시아세트산 (v), 5-메틸-2-티오우라실, 3-(3-아미노-3-N-2-카복시프로파일)우라실, (acp3)w, 및 2,6-디아미노퓨린을 포함한다. 세포내 발현을 억제하기 위해, 하나 이상의 안티센스 올리고뉴클레오타이드가 사용될 수 있다. 대안적으로, 안티센스 핵산은 핵산이 안티센스 배향으로 서브클로닝된(즉, 삽입된 핵산으로부터 전사된 RNA는 추후 하기 서브섹션에서 추가로 기재되는 목적하는 표적 핵산에 대해 안티센스 배향일 것이다) 발현 벡터를 사용하여 생물학적으로 제조될 수 있다.
또 다른 양태에서, 본 발명의 안티센스 핵산 분자는 α-아노머 핵산 분자이다. α-아노머 핵산 분자는 상보적인 RNA와 특이적인 이중 가닥 하이브리드를 형성하고 여기서, 통상의 a-단위체와 반대로, 상기 가닥들은 서로에 대해 평행하다(문헌참조: Gaultier et al. (1987) Nucleic Acids. Res. 15:6625-6641). 상기 안티센스 핵산 분자는 또한 2'-o-메틸리보뉴클레오타이드(문헌참조: Inoue et al. (1987) Nucleic Acids Res. 15:6131-6148) 또는 키메라 RNA-DNA 유사체(문헌참조: Inoue et al. (1987) FEBS Lett. 215:327-330)를 포함할 수 있다.
또 다른 양태에서, 본 발명의 안티센스 핵산은 RNAi를 매개하는 화합물이다. RNA 간섭 제제는 표적 유전자 또는 게놈 서열에 상동성인 RNA 분자를 포함하는 핵산 분자, "짧은 간섭 RNA"(siRNA), "짧은 헤어핀" 또는 "작은 헤어핀 RNA"(shRNA) 및 RNA 간섭(RNAi)에 의해 표적 유전자의 발현을 간섭하거나 억제하는 소분자를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. RNA 간섭은 이중 가닥 RNA(dsRNA)와 동일한 서열을 함유하는 전령 RNA(mRNA)로 분해시키기 위해 dsRNA를 사용하는 전사후 표적화된 유전자 사일런싱 기술이다(문헌참조: Sharp, P.A. and Zamore, P.D. 287, 2431-2432 (2000); Zamore, P.D., et al. Cell 101, 25-33 (2000). Tuschl, T. et al. Genes Dev. 13, 3191-3197 (1999)). 상기 공정은 내인성 리보뉴클레아제가 더 긴 dsRNA를 작은 간섭 RNA 또는 siRNA로 호칭되는 보다 짧은 21개 또는 22개 뉴클레오타이드 길이의 RNA로 절단하는 경우 발생한다. 보다 작은 RNA 절편이 표적 mRNA의 분해를 매개한다. RNAi의 합성을 위한 키트는 예를 들면, 제조원[New England Biolabs and Ambion]으로부터 시판되고 있다. 하나의 양태에서, 안티센스 RNA에 사용하기 위해 상기된 화학요법중 하나 이상이 사용될 수 있다.
예를 들면, 혈관형성을 억제하는 분자를 암호화하는 핵산 분자는 피검체의 세포내 암호화된 단백질의 발현을 위해 적합한 형태로 피검체에 도입될 수 있고 또한 본 발명의 방법에 사용될 수 있다. 혈관형성을 억제하는 예시적인 분자는 TSP-1, TSP-2, IFN-g, IFN-a, 안지오스타틴, 엔도스타틴, 투마스타틴, 칸스타틴, VEGI, PEDF, 바소히빈, 및 프롤락틴 2-메톡시에스트라디올의 16kDa 절편을 포함하지만 이에 제한되지 않는다[문헌참조: Kerbel (2004) J. Clin Invest 114:884, 리뷰용].
예를 들면, 전장 또는 부분적 cDNA 서열은 재조합 발현 벡터 내로 클로닝되고 상기 벡터는 표준 분자 생물학 기술을 사용하여 세포 내로 형질감염시킨다. cDNA는 예를 들면, 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)을 사용하는 증폭 또는 적당한 cDNA 라이브러리의 스크리닝에 의해 수득될 수 있다. cDNA의 뉴클레오타이드 서열은 표준 PCR 방법들에 의한 cDNA의 증폭을 허용하는 PCR 프라이머의 디자인 또는 표준 하이브리드화 방법들을 사용하여 cDNA 라이브러리를 스크리닝하기 위해 사용될 수 있는 하이브리드화 프로브 디자인을 위해 사용될 수 있다. cDNA의 분리 또는 증폭 후, DNA 절편을 적합한 발현 벡터 내로 도입한다.
본 발명의 방법들에 사용하기 위한 예시적인 생물학적 제제는 게피티니브(Iressa), 아나스트라졸, 디에틸스틸베스테롤, 에스트라디올, 프레마린, 랄록시펜, 프로게스테론, 노레티노드렐, 에스티스테론, 디메스티스테론, 메게스트롤 아세테이트, 메드록시프로게스테론 아세테이트, 하이드록시프로게스테론 카프로에이트, 노레티스테론, 메틸테스토스테론, 테스토스테론, 덱사메타손, 프레드니손, 코르티졸, 솔루메드롤, 타목시펜, 풀베스트란트, 토레미펜, 아미노글루테티미드, 테스톨락톤, 드롤록시펜, 아나스트로졸, 비칼루타미드, 플루타미드, 닐루타미드, 고세렐린, 플루타미드, 류프롤리드, 트리프토렐린, 아미노글루테티미드, 미토탄, 고세렐린, 세툭시마브, 에를로티니브, 이마티니브, 토시투모마브, 알렘투주마브, 트라스투주마브, 겜투주마브, 리툭시마브, 이브리투모마브 티욱세탄, 베바시주마브, 데닐류킨 디프티톡스, 다클리주마브, 인터페론 알파, 인터페론 베타, 항-4-lBB, 항-4-lBBL, 항-CD40, 항-CD 154, 항-OX40, 항-OX40L, 항-CD28, 항-CD80, 항-CD86, 항-CD70, 항-CD27, 항-HVEM, 항-LIGHT, 항-GITR, 항-GITRL, 항-CTLA-4, 가용성 OX40L, 가용성 4-IBBL, 가용성 CD 154, 가용성 GITRL, 가용성 LIGHT, 가용성 CD70, 가용성 CD80, 가용성 CD86, 가용성 CTLA4-Ig, GVAX®, 및 특정 종양 또는 암에 대해 적당한 표준 케어를 기준으로 당업자에게 용이하게 자명한 이들의 조합을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 가용성 형태의 제제는 예를 들면, 융합 단백질로서 상기 제제를 예를 들면, Ig-Fc 영역과 작동적으로 연결시킴에 의해 제조될 수 있다.
하나 이상의 추가 제제, 예를 들면, 1, 2, 3, 4 또는 5개의 제제가 CoQ10 분자와 병용하여 투여될 수 있음을 주지해야 한다. 예를 들면, 하나의 양태에서, 2개의 화학치료제는 CoQ10 분자와 병용하여 투여될 수 있다. 또 다른 양태에서, 화학치료제, 생물학적 제제 및 CoQ10 분자가 투여될 수 있다.
다양한 형태의 생물학적 제제가 사용될 수 있다. 이들은 제한없이 이식되거나, 주사되거나 달리 종양내로 삽입되는 경우 생물학적으로 활성화되는 전구체(proform) 분자, 비하전된 분자, 분자 복합체, 염, 에테르, 에스테르, 아미드 등과 같은 형태를 포함한다.
본 발명은 어떠한 방식으로든지 제한하는 것으로 해석되지 말아야 하는 하기 실시예에 의해 추가로 설명된다. 본 출원 전반에 걸쳐 인용되는 일반 문헌 서류, 승인된 특허 문헌 및 공개된 특허 출원을 포함하는 모든 인용된 참조문헌의 내용은 명백히 본원에 참조로서 인용된다.
본 발명의 실시예 :
실시예 1: MIM으로서 CoQ10의 동정
잠재적인 MIM으로서 CoQ10을 평가하기 위해, 산화 형태의 CoQ10을 암 세포주 및 정상 대조 세포주 둘 다를 포함하는 세포주 패널에 외인성으로 첨가하고 상기 패널에서 각각의 세포주에 대해 세포성 미세환경 프로파일에 유도된 변화를 평가하였다. mRNA 및 단백질 수준 둘 다를 포함하는, 세포 형태/생리학 및 세포 조성에 대한 변화를 평가하고 정상 세포와 환부 세포를 비교하였다. 이들 실험의 결과로 CoQ10 및 특히, MIM으로서 산화된 형태의 CoQ10을 동정하였다.
제1 세트의 실험에서, 세포 형태/생리학적 변화는 CoQ10에 대한 세포의 민감성 및 아폽토시스 반응을 조사함에 의해 평가되었다. 대조군 세포주(각질세포 및 멜라닌세포의 1차 배양물) 및 여러 피부 암 세포주(SK-MEL-28, 비전이성 피부 흑색종; SK-MEL-2, 전이성 피부 흑색종; 또는 SCC, 편평 세포 암종; PaCa2, 췌장 암 세포주; 또는 HEP-G2, 간 암 세포주)를 포함하는 피부 세포주의 패널을 다양한 수준의 조효소 Q10으로 처리하였다. 이들 실험의 결과는 암 세포주가 대조군 세포주와 비교하여 변화된 용량 의존성 반응을 나타내고 아폽토시스 및 세포 사멸이 암 세포에서만 유도됨을 입증하였다.
이어서, 분석은 CoQ10으로 처리한 후 세포의 조성의 변화를 평가하기 위해 사용되었다. mRNA 수준에서 유전자 발현의 변화는 실시간 PCR 어레이 방법을 사용하여 분석되었다. 상보적 실험에서, 단백질 수준에서의 유전자 발현의 변화는 항체 마이크로어레이 방법, 2차원 겔 전기영동에 이어서 질량 분광법 특성 분석을 사용한 단백질 동정 및 웨스턴 블롯 분석에 의해 분석되었다. 이들 분석으로부터의 결과는 mRNA 및 단백질 수준 둘 다에서 유전자 발현의 상당한 변화가 산화된 형태의 CoQ10의 부가로 인해 조사된 세포주에서 유도되었음을 입증하였다. CoQ10 처리에 의해 조정되는 유전자는 아폽토시스, 암 생물학 및 세포 성장, 해당과정 및 대사, 분자 수송 및 세포 시그날 전달을 포함하는, 여러 세포 경로에 운집되어 있는 것으로 밝혀졌다.
실험은 CoQ10의 세포로의 진입을 확인하고 세포에 존재하는 CoQ10의 수준 및 형태를 결정하기 위해 수행되었다. 특히, 미토콘드리아에 존재하는 CoQ10의 형태(즉, 산화되거나 환원된) 뿐만 아니라 조효소 Q10의 수준은 CoQ10으로 처리된 세포 기원의 미토콘드리아 집적된 제제를 분석함으로써 결정되었다. 미토콘드리아에 존재하는 조효소 Q10의 수준은 외인성 Q10의 첨가와 함께 시간 및 용량 의존성 방식으로 증가하는 것으로 확인되었다. 놀랍고도 예상치 않은 결과에서, CoQ10은 미토콘드리아에 주로 산화된 형태로 존재하는 것으로 측정되었다. 또한, 미토콘드리아 풍부 샘플 기원의 단백질 수준의 변화는 2-D 겔 전기영동 및 질량 분광법 특성 분석에 의한 단백질 동정에 의해 분석되었다. 이들 실험으로부터의 결과는 시간 경과에 따른 미토콘드리아내 산화된 형태의 CoQ10의 수준이 대사적 및 아폽토시스 경로와 관련된 특이적 단백질에 대한 mRNA 및 단백질 수준의 조정에 의해 입증된 바와 같이, 광범위한 세포 변화와 관련되어 있음을 입증하였다.
본원에서 출원인에 의해 기재된 상기 결과는 MIM으로서 내인성 분자 CoQ10 및 특히 산화된 형태의 CoQ10을 동정하였다. 예를 들면, 상기 결과는 CoQ10이 mRNA 및 단백질 수준 둘 다에서 유전자 발현의 변화를 유도하는 것으로 관찰되었기 때문에, CoQ10을 MIM으로서 동정하였다. 상기 결과는 CoQ10이 정상 (예를 들면, 비암성) 상태와 비교하여 질환 상태(예를 들면, 암)에서 세포 형태/생리학 및 세포 조성에서의 차등 변화(예를 들면, mRNA 및 단백질 수준 둘 다에서 유전자 발현의 차등적 변화)를 유도했기 때문에, 다차원 특성을 갖는 것으로서 CoQ10을 동정하였다. 더욱이, 상기 결과는 CoQ10이 세포에 진입할 수 있음에 따라서 치료적 및 담체 효과를 둘 다 나타낸다는 점에서 다차원 특성을 갖는 것으로서 CoQ10을 동정하였다.
실시예 2: 육종에 대한 관련 과정 및 생체마커를 동정하기 위한 방법
세포주, 예를 들면, 육종 세포주가 목적하는 분자로 처리된 세포 기반 분석으로부터, 처리된 세포 대 비처리된 세포에서의 차이를 mRNA 어레이, 단백질 항체 어레이 및 2D 겔 전기영동에 의해 평가한다. MIM 또는 환경적-전환인자, 예를 들면, CoQ10에 의해 조정될 비교 샘플 분석으로부터 동정된 단백질은 경로 분석(Ingenuity IPA software) 및 공지된 문헌의 검토와 함께 시스템 생물학적 관점으로부터 평가된다. 잠재적인 치료적 또는 생체마커 표적으로서 동정된 단백질은 웨스턴 블롯 분석, siRNA 녹-다운 또는 재조합 단백질 제조 및 특성 확인 방법들과 같은 확인 분석에 적용된다.
실시예 3: 조효소 Q10에 대한 발암성 및 정상 세포의 상대적 민감성
다양한 발암성 및 정상 세포주에 대한 조효소 Q10 치료 효과를 조사하고 비교하였다. 조효소 Q10에 대한 세포의 민감성은 아폽토시스의 유도를 모니터링함에 의해 평가하였다. 세포의 CoQ1O 치료는 하기의 재료 및 방법에 기재된 바와 같이 수행하였다. 아폽토시스의 유도는 하기된 바와 같은 조기 아폽토시스의 지표(예를 들면, Bcl-2 발현, 카스파제 활성화 및 어넥신 V 분석을 사용함에 의해)를 모니터링함에 의해 처리된 세포에서 평가되었다. 이들 연구로부터, 세포주의 패널에서 아폽토시스를 유도하기 위해 요구되는 최소 CoQ10 용량, 예를 들면 CoQ10의 농도 및 처리 시간을 측정하였다.
놀랍고 예측하지 못한 결과에서, 상기 데이터는 조효소 CoQ10 처리의 효능이, 증가된 발암성 및/또는 보다 큰 전이성 잠재력을 나타내는 세포 유형, 즉 보다 공격성인 암 또는 종양으로부터 유래된 세포 유형에서 보다 크다는 것을 입증하였다. 이들 연구 결과는 하기 표 1에 요약하였다. 상기 데이터는 CoQ10이 보다 공격적인 암 상태에서 세포에 대해 시간 및 농도 의존적 방식 둘 다에서 보다 효과적임을 입증한다. 더욱이, 놀라운 다양한 효과가 발암성 세포와 비교하여 정상 세포상에서 관찰되었다. 구체적으로, 조효소 Q10은 예상치않게 정상 조직 환경에서, 약간의 지지 역할을 나타내는 것으로 밝혀졌고, 여기서, 증가된 증식 및 이동이 각질세포 및 진피 섬유아세포를 포함하는 정상 세포에서 관찰되었다.
암에서 유전자 조절 및 단백질 기작에 대한 조효소 Q10의 효과는 정상 세포에서와는 상이하다. 주요 세포 기구 및 성분들, 예를 들면, 세포골격 구조, 막 유동성, 수송 기작, 면역조정, 혈관형성, 세포 주기 조절, 게놈 안정성, 산화성 조절, 해당과정 흐름, 대사적 조절 및 세포외 매트릭스 단백질의 통합성(intergrity)이 조절불능이고, 따라서 세포의 유전자 및 분자 핑거프린트가 변경된다. 질환 환경은 세포 조절 과정의 지배를 선호한다. 본원에 제공된 상기 데이터는 CoQ10이 복구된 아폽토시스 잠재력을 고려하여 상기 언급된 주요 과정의 일부를 표준화함으로써(예를 들면, 암 세포 대 정상 세포에서 및 덜 공격성이거나 비공격성인 암 상태의 세포와 비교하여 보다 공격성인 암 상태의 세포에서) 보다 큰 수준의 효능을 발휘함을 시사한다.
Figure 112015033452186-pct00041
재료 및 방법
세포 제조 및 처리
디쉬 또는 플라스크에서 제조된 세포
세포를 5% CO2 수준으로 37℃ 항온처리기에서 10% 태아 소 혈청(FBS), 1% PSA (페니실린, 스트렙토마이신, 암포테리신 B ) (Invitrogen 및 Cellgro)가 보충된 관련 배지를 갖는 T-75 플라스크에서 70% 내지 80% 컨플루언스에 도달할때까지 배양하였다. 처리용 세포를 회수하기 위해, 플라스크에 1mL 트립신을 처리하고 흡인하고 추가의 3ml로 트립신 처리하고, 3 내지 5분 동안 37℃에서 항온처리하였다. 이어서, 세포를 동등한 용적의 배지로 중화시키고, 후속 용액을 8분 동안 10,000rpm에서 원심분리하였다. 상기 상청액을 흡인하고, 세포를 8.5ml의 배지에 재현탁시켰다. 500ul의 재현탁액과 9.5ml의 이소프로판올의 혼합물을 코울터 계수기로 2회 판독하고, 각각의 디쉬에 씨딩된 적당수의 세포를 측정하였다. 대조군 및 0 내지 200μM 그룹 범위의 농도를 3회 조사하였다. 500μM CoQ10 스톡 용액으로부터, 연속 희석을 수행하여 적당한 디쉬에서 목적하는 실험 농도를 수득하였다. 디쉬를 세포 유형 및 실험 프로토콜에 따라 0 내지 72시간 동안 5% CO2 수준으로 37℃ 항온처리기에서 항온처리하였다.
단백질 분리 및 정량
디쉬에서 제조된 세포
세포 처리 항온처리 기간 종료 후, 단백질 분리를 수행하였다. 모든 처리 그룹의 디쉬는 빙냉 1 x 인산염 완충 식염수(PBS) 2ml로 2회, 1ml로 1회 세척하였다. 상기 PBS를 단지 초기 2회 세척 후 디쉬로부터 흡인제거하였다. 세포를 약하게 박리시키고, 제3 세척액 기원의 최종 용적을 사용하여 미량원심분리 튜브에 회수하고, 10분 동안 10,000rpm에서 원심분리하였다. 원심분리 후, 상기 상청액을 흡인제거하고, 펠렛을 50uL의 용해 완충액(용해 완충액 100uL에 대해 1uL의 프로테아제 및 포스포타제 억제제)으로 용해시켰다. 이어서, 샘플을 -20℃에서 밤새 동결시켰다.
플라스크에서 제조된 세포
세포 처리 항온처리 기간 종료 후, 단백질 분리를 수행하였다. 모든 처리 그룹의 플라스크를 빙냉 1 x PBS 5ml로 2회, 3ml로 1회 세척하였다. 상기 PBS를 단지 처음 2회 세척 후 플라스크로부터 흡인제거하였다. 세포를 약하게 박리시키고, 제3 세척액 기원의 최종 용적을 사용하여 15ml 원심분리 튜브로 회수하고, 10분 동안 10,000rpm에서 원심분리하였다. 원심분리 후, 상기 상청액을 흡인제거하고, 상기 펠렛을 적당량의 용해 완충액(용해 완충액 100uL에 대해 1uL의 프로테아제 및 포스포타제 억제제)으로 용해시켰다. 용해 완충액 용적은 펠렛 용량에 의존하였다. 샘플을 미량원심분리 튜브로 옮기고, -20℃에서 밤새 동결시켰다.
단백질 정량
샘플은 -4℃에서 해동시키고 초음파 처리하여 단백질 분리 후, 다음날 확실히 균질화되도록 하였다. 단백질 정량은 마이크로 BCA 단백질 분석 키트(Pierce)를 사용하여 분석하였다. 면역 블롯팅에 대한 샘플을 준비하기 위해, 1:19 용액의 베타머캅토에탄올 (Sigma) 대 샘플 완충액(Bio-Rad)을 제조하였다. 샘플은 베타머캅토에탄올 샘플 완충액으로 1:1 희석하고, 5분 동안 95℃에서 비등시키고, -20℃에서 밤새 동결시켰다.
면역-블롯팅
Bcl-2, 카스파제, 9, 시토크롬 c
웰당 부하되는 샘플의 용량은 BCA 단백질 분석으로부터 수득된 단백질의 본래 평균 농도를 사용하여 측정되었다. 대략 30 내지 60μg의 단백질을 각각의 처리 시점을 위해 로딩하였다. 단백질을 85볼트 및 100볼트에서 12% 트리스-HCl 예비 겔(Bio-Rad)상에서 3회 전개하거나, 1 x 전개 완충액 중에서 핸드 캐스트 겔 중에서 전개하였다. 이어서, 단백질을 100볼트에서 1시간 동안 니트로셀룰로스지상으로 이동시키고, 5% 밀크 용액 중에서 추가의 1시간 동안 차단시켰다. -4℃에서 밤새 막을 1차 항체(luL Ab: 1000 uL TBST) (세포 시그날 전달)중에 위치시켰다. 다음 날에, 막을, 트리스 완충 식염수 Tween-20(TBST) 각각으로 10분 동안 3회 세척하고, 2차 항체(항-토끼; 1uL Ab: 1000 uL TBST)를 -4℃에서 1시간 동안 적용하였다. 막을 TBST로 10분 동안 3회 다시 세척하고, Pico 또는 Femto 기질을 사용하는 화학발광을 완료하였다(Pierce). 이어서, 막을 최상의 가시적 결과를 나타내는 시간 간격으로 전개하였다. 전개 후, 막을 액틴 수준이 측정될 수 있을 때까지 -4℃에서 TBST 중에 유지시켰다.
액틴
막을 -4℃에서 1시간 동안 1차 액틴 항체(1uL Ab:5000 uL TBST) (세포 시그날 전달)중에 위치시키고, TBST로 각각 10분 동안 3회 세척하고, 2차 항체(항-마우스; 1uL Ab: 1000 uL TBST)를 -4℃에서 1시간 동안 적용하였다. 막을 다시 TBST로 각각 10분 동안 3회 다시 세척하고, Pico 기질을 사용한 화학발광을 완료하였다(Pierce). 이어서, 막을 최상의 가시적 결과는 나타내는 시간 간격으로 전개하였다.
어넥신 V 분석
세포를 PBS10X 중에서 2회 세척하고, 결합 완충액(0.1 M HEPES, pH 7.4; 1.4 M NaCl; 25mM CaCl2)중에 재현탁시켰다. 100μl의 샘플을 배양 튜브에 5μl의 어넥신-PE 염료 또는 7-ADD와 함께 첨가하였다. 상기 세포를 혼합하고 실온에서 15분 동안 광 부재하에 항온처리하였다. 이후, 400μl의 1X 결합 완충액을 각각의 샘플에 첨가하고 이들을 유동 세포분석법에 의한 분석에 적용하였다.
하기 실시예 4 내지 7에서, 목표는 NCIES0808 세포에 대해 독특한 CoQ10 작용 기작에 대한 통찰을 수득하는 것이었다. 상기 NCIES0808 세포주는 유잉의 육종을 갖는 환자로부터 직접 유래된 것이고, 따라서 상기 연구에 사용될 가장 적절한 세포주이다. 상기 프로젝트에 근간이 되는 개념은 상기 연구가 API의 개발에 이로울 것이고 이의 작용에 대한 보다 양호한 이해를 제공할 것이라는 것이다.
상기 실험의 의도는 하기의 실험을 기준으로 RNA 및 단백질 수준에서 세포 환경내에서의 변화를 확인하는 것이다.
(1) PCR 어레이
혈관형성
당뇨병
미토콘드리아
(2) 항체 어레이
(3) 2D 겔 분석
(4) 웨스턴 분석
실시예 4 내지 8에 대한 재료 및 방법
조효소 Q10 스톡
500μM의 조효소 Q10 (세포 성장 배지중 5% 이소프로판올)을 다음과 같이 제조하였다. 10 mL의 500μM 조효소 Q10 스톡을 매번 새롭게 제조하였다.
분자량: 863.34
(0.0005 mol/L)(0.010 L)(863.34 g/mol) = 0.004317 g
500μM의 스톡 10mL를 제조하기 위해, 4.32 mg의 조효소 Q10을 15mL 팔콘 튜브 중에서 칭량하고, 500μL의 이소프로판올을 첨가하였다. 상기 용액을 50 내지 60℃의 수욕에서 가온시키고 와동시켜서 완전히 용해시켰다. 상기 용액에, 9.5 mL의 배지(세포가 성장한 동일한 배지)를 첨가하였다.
NCIES0808 세포
NCIES0808 세포를, 5% FBS, 펜스트렙 및 암포테리신과 함께 글루타맥스 및 17mM 글루코스를 함유하는 DMEM/F12 중에서 성장시켰다. 세포를, 실험용으로 수득된 충분한 용적으로 계대하였다.
조효소 Q1O 처리 및 총 단백질 분리
보충된 배지를 50 내지 100μM 농도의 Q10으로 컨디셔닝시켰다. 세포를 대조군 50μM Q10, 및 100μM Q10으로 3회 처리하였다. 단백질은 3, 6 또는 24시간 후 처리된 플라스크 및 대조군 플라스크로부터 분리하였다. 단백질을 분리하기 위해, 세포를 pH 7.4의 5mL의 빙냉 PBS로 3회 세척하였다. 이어서, 상기 세포를 3mL의 PBS 중에서 박리시키고, 원심분리하여 펠렛화하고, pH 7.4의 용해 완충액(80mM 트리스-HCl, 1% SDS, 프로테아제 및 포스파타제 억제제와 함께) 중에 재현탁시켰다. 단백질 농도는 BCA 방법을 사용하여 정량하였다.
RNA 분리:
세포는 제조업자의 지침에 따라 RNeasy 소형 키트(Qiagen, Inc., Valencia CA)를 사용하여 상이한 처리 시간에 RNA 분리를 위해 용해시켰다. RNA는 260nm에서 광학 밀도를 측정함에 의해 정량하였다.
제1 가닥 합성:
제1 가닥 cDNA를, 제조업자의 추천에 따라 RT2 제1 가닥 합성 키트 (SABiosciences., Frederick MD)를 사용하여 총 1μg의 RNA로부터 합성하였다.
실시간 PCR:
제1 가닥 합성 기원의 생성물을 물로 희석하고, SYBR 녹색 마스커 믹스(SABiosciences., Frederick MD)와 혼합하고, PCR 어레이상에 로딩하였다. 실시간 PCR을 Biorad CFX96상의 PCR 어레이(아폽토시스 어레이, 당뇨병 분석, 산화적 스트레스 및 항산화제 방어 어레이 및 열 쇼크 단백질 어레이)(SABiosciences, Frederick MD)상에서 진행하였다.
PCR 어레이:
NCIES0808 세포를 50uM/100uM Q10을 함유하는 배지에서 플라스크 당 2 x 106 의 세포 밀도로 T25 플라스크에 분주하였다. 모든 처리 그룹을 3회 수행하였다. 세포는 0, 3, 6, 24 또는 48시간에 회수하였다. 회수하기 전에 세포 형태를 조사하기 위해 촬영하였다. 세포를 회수하기 위해, 배지를 제거하고 부유 아폽토시스 세포를 회수할 수 있도록 모았다. 세포를 1ml의 트립신-EDTA로 트립신처리하고, 상기 효소 작용을 4ml의 완전 배지를 첨가하여 종료하였다. 트립신처리된 세포는 죽은 세포를 갖는 배지를 함유하는 적당한 튜브에 첨가하였다. 세포는 5분 동안 1200rpm에서 원심분리하고, 배지를 흡인제거하고 RNA 추출을 위해 세포 펠렛을 잔류시켰다. 세포 펠렛으로부터 RNA 분리는 제조업자의 지침에 따라 RNeasy 키트(Qiagen, Valencia CA)를 사용하여 수행하였다. RNA 샘플을 수중 스핀 칼럼으로부터 용출시키고; 260nm, 230nm 및 280nm에서 흡광도를 측정하였다. RNA의 순도를 260/230 및 280/230 비율에 의해 평가하였다. 샘플 모두에서 RNA의 농도를 230nm의 흡광도 값으로부터 계산하였다. 제1 가닥의 cDNA를 제1 가닥 키트 (SABiosciences, Frederick, MD)와 함께 제공된 지침서를 사용하여 0.5ug의 모든 RNA 샘플로부터 합성하였다. 샘플 기원의 합성된 제1 가닥을 경로(혈관형성, 당뇨병 및 미토콘드리아) 내에 프라이머를 함유하는 PCR 어레이 플레이트(SABiosciences Corporation, Frederick, MD)에 균등하게 분배하였다. 상기 어레이는 제조업자의 승인된 프로토콜을 사용하는 SYBR 녹색 검출 방법들을 사용하는 실시간 PCR로 증폭시켰다. 샘플 각각으로부터의 ct 값은 3개의 하우스키핑 유전자로 표준화시키고, Q10 처리된 그룹의 배수 조절은 정규 배지에서 성장한 세포 기원의 시간 일치된 대조군과 비교하여 계산하였다.
프로테오믹스용 샘플 제조:
NCIES0808 세포를 PCR 어레이 섹션에서 기술된 것들과 유사한 실험적 조건에서 T25 플라스크에 분주하였다. 처리 시간 말기에, 세포는 PCR 어레이 섹션에 기재된 바와 같이 트립신 처리하고, 빙냉 TBS에서 2회 세척하고, 액체 질소에서 순간 동결시켰다. 웨스턴 블롯을 위한 추가의 프로세싱은 UMass에서 수행하였다.
NCIES0808 세포를 프로테오믹 분석을 위해 충분한 미토콘드리아를 분리하기 위해 보다 큰 용적에서 Q10과 별도로 처리하였다. 세포를, T175 플라스크에서 0, 3, 6, 24 및 48시간 동안 배지 50uM Q10 또는 1OOuM Q10으로 처리하였다. 2개의 플라스크를 각각의 조건에 대해 성장시키고, 2개로부터 기원하는 세포를 회수 동안에 모았다. 요구되는 처리 시간 후, 세포를 트립신처리하고, 빙냉 TBS에서 2회 세척하였다. 펠렛화된 세포를 액체 질소에서 순간 동결시키고, 미토콘드리아 분리시까지 -80℃에서 동결보관하였다. 배양된 세포에 대한 MitoProfile Mitosciences 분리 키트 (Mitosciences Inc, Eugene, OR)와 함께 사용가능한 제조업자의 지침을 사용하여 분리하였다.
웨스턴 블롯 제조:
세포를 성장시키고, 적당한 대조군과 함께 50uM 및 100uM의 CoQ10으로 처리하였다. 상기 총 세포 용해물(상기 제조된 바와 같음)을 프로세싱하고, 웨스턴 블롯 분석에 의해 평가하였다. 각각의 처리 그룹 기원의 단백질은 SDS-PAGE 상에서 분리하고, PVDF 막상으로 옮겼다. 이어서, 이들을 항체와 하이브리드화시켰다.
면역블롯팅:
5 또는 10μg의 단백질은 면역블롯팅에 의해 샘플 당 분석하였다.
단백질을 10 내지 20% 트리스-HCl 겔 또는 4 내지 12% 비스-트리스 겔상에서 분리하고, 전기영동을 통해 PVDF 막으로 옮기고, 1차 항체와 항온처리하기 전에 5% GE/Amersham ECF 차단제 및 TBST 용액을 사용하여 차단시켰다. 상기 1차 항체는 5% BSA 및 TBST 용액 중에서 4℃에서 밤새 항온처리하였다. 2차 항체는 실온에서 1시간 동안 항온처리하였다. 모든 항체는 제조원으로부터 구입하였다. 항체는 1:5000의 희석비로 대조군 β액틴과 함께 제조업자의 추천된 희석으로 사용하였다. GE/Amersham ECF 시약을 사용하여 블롯을 전개하고, 결과는 Fuji FL-5100 레이저 스캐너 및 Bio-Rad 퀀티티 원 밀도측정 분석 소프트웨어를 사용하여 정량하였다. 또한 모든 블롯을 이들의 각각의 β액틴 발현에 대해 탐지하고 표준화시켰다.
2차원 전기영동:
등전점 포커싱(IEF) 전에 샘플을 40mM 트리스, 7 M 우레아, 2 M 티오우레아, 및 1% C7 양쪽성 세제 중에 가용화시키고, 트리부틸포스핀으로 환원시키고 실온에서 90분 동안 10mM 아크릴아미드로 알킬화시켰다. 샘플을, 샘플의 전도도를 감소시키기 위해 7M 우레아, 2M 티오우레아 및 2% CHAPS로 이루어진 3배 용적 이상의 재현탁 완충액과 함께 10-kDa 컷오프 아미콘 울트라 장치를 통해 전개하였다. 100μg의 단백질을 11-cm pH 3 내지 10, pH 4 내지 7 또는 pH 6 내지 11 고정된 pH 구배 스트립(GE, Amersham, USA)상의 IEF에 100,000 볼트 시간으로 적용하였다. IEF 후에, 고정된 pH 기울기 스트립을 6 M 우레아, 2% SDS, 50mM 트리스-아세테이트 완충액(pH 7.0), 및 0.01% 브롬페놀 블루 중에서 평형화시키고, 8 내지 16% 트리스-HCl 프리캐스트 겔(Precast Gel), 1mm(Bio-Rad, USA) 상의 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 적용하였다. 상기 겔을 2회 적용하였다. 이들을 고정시키고, SYPRO Ruby, 80mL/gel(Invitrogen, USA)중에서 염색시키고, Fuji FLA-5100 레이저 스캐너상에서 이미지화하였다.
이미지 분석:
모든 겔 이미지 분석은 장치(Progenesis Discovery and Pro (Nonlinear Dynamics Inc., Newcastle upon Tyne, UK))를 사용하여 수행하였다. 스팟 검출, 매칭, 기본 공제, 표준화 및 여과 후에, SYPRO Ruby 겔 이미지에 대한 데이타를 발송하였다. 그룹들 간에 장치(Progenesis Discovery)에서 스튜던트 t 시험을 사용하여 쌍으로 비교하여 발현이 상당히 변경된(p> 0.05) 스팟을 동정하였다. 각각의 통계학적으로 유의적인 스팟에 대해 손으로 주석을 달아 확실히 정확한 검출이 되게하였다.
질량 분광법:
각각의 겔 플러그로부터 추출된 트립신처리된 펩타이드를 10ul 용적 이하로 건조시키고, 1 내지 2ul의 1% TFA로 산성화시켰다. 샘플을 0.1% TFA 중에 예비 평형화시킨 후 uC18 Zip Tip (Millipore, Corp) 상에 로딩하였다. 2 x 10ul의 적정액의 0.1% TFA로 세척한 후, 샘플을 50:50 아세토니트릴:0.1% TFA 중에서 2,5-디하이드록시벤조산(MassPrep DHB, Waters Corp.)의 1ul의 매트릭스 용액 15mg/ml를 사용하여 MALDI 샘플 표적상으로 직접 침적시켰다. 샘플을 질량 분광법으로 삽입하기 전에 통기 건조시켰다. 분석을 Kratos Axima QIT (Shimadzu Instruments) 매트릭스-원조된-레이저 탈착/이온화(MALDI) 질량 분광기 상에서 수행하였다. 펩타이드는 중간 질량 범위(700 내지 3000Da) 중의 양이온 방식으로 분석하였다. 상기 장치를 외부적으로 안지오텐신 II(1046.54), P14R(1533.86) 및 ACTH(18-39) 2465.20 Da를 사용하여 보정하였다. 전구체를 충돌 가스로서 아르곤을 사용하는 CID 단편화에 대해 250의 질량 분리 폭에서 시그날 강도를 기준으로 선택하였다. 데이터베이스 검색은 MS 데이터에 대해 펩타이드 질량 핑거프린트 프로그램을 사용하고 CID 데이터에 대해 MS/MS 이온 검색 프로그램을 사용하는 마스코트(Mascot)(Matrix Sciences, Ltd.)와 함께 실내에서 수행되었다. 모든 동정은 CID(MS/MS) 데이터를 사용하여 확인되거나 확립되었다.
항체 어레이:
NCIES0808 세포를 T165 플라스크(x 55) 중에 SBH로부터 수용하였다. 상기 세포는 대략 90 내지 95% 컨플루언스를 갖고, 상기 배지는 전형적인 분홍색을 가졌다. 상기 세포 형태는 현미경하에 밀착 조사하였고, 세포는 오염 또는 세포내 내용물에 대한 어떠한 가시적 징후가 없는 건강한 상태인 것으로 나타났다.
500μM Q10 스톡을 PCR 어레이에 대해 명시된 동일한 프로토콜을 사용하여 제조하였다. 상기 배지를 각 플라스크에서, 적절한 플라스크 내에 위치되는 50μM 및 100μM Q10 배지로 교환하였다. 상기 세포를 Q10 제형화된 배지에서 3시간 및 6시간 동안 항온처리하고, 세포를 회수하였다. 각각의 플라스크를 10ml의 빙냉 PBS로 세척하고, 5ml의 트립신-EDTA로 트립신처리하였다. 상기 세포를 약한 피펫팅으로 회수하고, 효소 작용은 30ml의 완전한 배지를 첨가하여 종결하였다. 상기 세포를 5분 동안 1200rpm에서 원심분리하고, 배지를 튜브로부터 흡인제거하여 단백질 추출을 위한 세포 펠렛을 잔류시킨다.
상기 단백질을 제조품 정보지(Sigma®, Panarama® 항체 마이크로어레이 EPRESS Profiler725, cat#: XP725)의 제2면 서브-카테고리 IA에서와 같이 세포로부터 추출하였다. 전세포 용해물로부터의 상기 단백질 물질은 상기 언급된 제품지 서브-카테고리 IIA에 명시된 제조업자의 지침에 따라 Cy3 및 Cy5 염료(제조원: GE Healthcare, 제품 #: 25-8009-86 Cy3 및 25-8009-87 Cy5)와 접합되었다. 제품지의 서브-카테고리 III에 기재된 제조업자의 지침에 따라 상기 항체 어레이 칩을 다시 제조하고, 24시간 동안 암실에서 건조되도록 방치하였다. 상기 어레이는 Cy3 염료에 대해서는 532nm에서 그리고 Cy5 염료에 대해서는 635nm에서 Fuji FLA-5100 UV 스캐너를 사용하여 분석되었다. 데이터를 배지 단독, 50μM Q10 및 100μM Q10 샘플에 대해서 3시간 및 6시간 째에 모두 3회씩 수집하였다.
IPA 분석:
하기된 실험으로부터의 산출값을 Q10에 의해 조정되는 잠재적 경로를 설명하기 위한 도구로서 독창적인 경로 분석(http://www.ingenuity.com)을 사용하여 함께 조합하였다.
실시예 4: CoQ10 처리에 대한 NCI-ES-0808 세포의 민감성
NCI-ES-0808 세포의 형태는 CoQ10으로 처리한 후 모니터링하였다. NCI-ES-0808 세포는 Q10 처리 후 3, 6, 24 또는 48시간째 그리고 회수 직전에 현미경을 통해 사진 촬영하였다. 세포는 처리한지 3시간 후에 부분적으로 부착되었고, 6시간까지 이들은 완전히 부착된 것으로 나타났다. 형태, 가시적으로 확인가능한 아폽토시스 세포의 수 또는 세포 수에 있어서 처리 후 3시간 및 6시간의 실험 시간 스케일 동안에 처리 그룹들 간에 현미경으로 조사했을때 어떠한 명백한 차이가 없었다(도 1).
실시예 5: 실시간 PCR 어레이
본 실시예에서 기재된 실험은 Q10이 유잉의 육종 세포에서 다수의 유전자 발현에 효과를 가질 것이라는 총괄적 가정을 시험하기 위해 수행되었다. 다양한 시간 동안 50μM 또는 100μM Q10으로 처리된 NCIES0808 세포 기원의 mRNA를 사람 당뇨병, 사람 혈관형성 또는 사람 미토콘드리아 경로에 관여하는 표적 단백질 패널에 대해 RT-PCR로 평가하였다.
실시간 열순환기로부터 수득된 Ct 값은 배지를 갖는 세포와 비교하여 배수 조절의 계산을 위해 SABiosciences 웹사이트상의 분석 도구상에 로딩되었다. 사람 당뇨병 어레이의 분석에서 CoQ10으로 조정된 유전자는 표 2에 요약되어 있다. 사람 혈관형성 어레이의 분석에서 CoQ10으로 조정된 유전자는 표 3에 요약된다. 하기 표에 포함되는 유전자는 0.05에 근접하는 p값을 나타내는 유전자들이다. 사람 미토콘드리아 어레이의 분석은 조사된 CoQ10 용량들 및 시점들에서 어떠한 조정된 유전자도 나타내지 않았다.
Figure 112012023750408-pct00003
Figure 112012023750408-pct00004
실시예 6: 항체 마이크로어레이 분석
Q10의 존재로 인한 단백질 농도의 변화 평가는 항체 마이크로어레이 방법들의 사용을 통해 평가하였다. 상기 마이크로어레이는 700개 이상의 단백질에 대한 항체를 함유하였고, 광범위한 단백질 유형 및 잠재적인 경로 마커를 샘플링한다.
모든 데이터 세트에 대한 각각의 칩(n=l, 2, 3)의 일반적인 고찰을 위해 칩 제조물의 효율 및 재현성의 초기 분석을 수행하였다. 50μM Q10, 3hr 데이터 시리즈의 패턴 분석은 n=1 및 n=2가 매우 유사할지라도 n=3이 많은 상이한 패턴을 가짐을 보여준다. 이러한 이유 때문에, n=3 데이터는 어레이 데이터의 통계학적 평가에서 무시되었다.
일단 데이터 세트가 모든 어레이에 대해 회수된 후, 상기 데이터를 3개의 주요 파라미터에 대해 조사하였다. 제1 데이터는 제조 지침서의 서브-카테고리 V에 기재된 총합 형광 강도 방법을 사용하여 표준화시켰다. 표준화 과정 후, 표준화된 Cy3/Cy5 비율에 대한 제로 값을 갖는 임의의 데이터 포인트는 통계학적으로 관련없는 것으로 간주되었고 시험 세트로부터 제거하였다. 양성 및 음성 Cy3/Cy5 데이터의 평가(칩상의 대조군으로서 포함됨) 및 주어진 스팟에 대한 스펙트럼 밀도의 가시적인 조사로 10 미만의 스펙트럼 밀도를 갖는 어레이 데이터 포인트가 기본 수준에 근접하고 통계학적으로 관련없는 것으로 간주되었고 데이터 시리즈로부터 제거하기로 결정하였다. 상기 수득된 데이터는 추가 평가를 위한 기본 데이터 세트로 간주되었다. 각각의 데이터 세트는 표준화된 스펙트럼 밀도 비율에 따라 분류하고 상부 45 상향조절되고 하향조절된 단백질을 평가하였다. 모든 복제 연구(n=1, 2, 3)에서 나타나는 것으로 주지되는 단백질만이 통계학적으로 관련이 있는 것으로 지명되었고, 이들 통계학적 평가의 95% 신뢰 구간 범위내에 있다. 3시간 시도의 각각의 데이터 세트내에서 유의적인 변화가 있었음을 주지해야 한다. 이 시점에서 세포는 높은 %의 통계학적 관련성을 갖는 데이터로부터 결론내릴 수 있는 점까지는 수렴되지 않는 것으로 나타난다. 그러나, 6시간 시점으로부터 수득된 데이터는 모든 통계학적 분석을 충족시키고 복제 실험(n=1, 2, 3)에서 존재하고 이들 분석을 위한 데이터는 표 4 및 5에 제공된다.
Figure 112012023750408-pct00005
Figure 112012023750408-pct00006
실시예 7: 2차원 겔 분석
3, 6 및 24시간 동안 처리된 NCIES0808 세포를 2-D 겔 전기영동에 적용하고, 대조군 배지 샘플과 비교하여 단백질 수준 변화를 동정하기 위해 분석하였다. 다수의 2중 겔을 통과한 스팟의 비교 분석을 수행하였고, 50uM 및 100uM 용량 둘 다에서 모든 처리된 샘플에 대해 "대조군 배지 샘플"을 비교하였다. 상기 분석은 증가, 감소 또는 해독후 변형으로 인한 시간 과정에 대한 스팟의 변화의 동정을 포함했다. 겔 이미지의 대표적인 예는 도 3에 나타내고, 조정된 단백질은 표 6에 나타낸다.
50μM 및 100μM CoQ10으로 3, 6 및 24시간 동안 처리된 NCIES0808 세포에서 조정된 단백질
NCI-0808: 3시간 Q-10:
3시간
단백질 동정 스팟 50uM Q10 100uM Q10
프로테아좀 26S 서브유니트 13; 엔도필린 B1 240 -1.3 1.5
미오신 조절 경쇄 612 1.4 1.4
hnRNP C1/C2 583 1.4 1.5
유비퀼린 1; 포스파타제 2A 940 1 1.3
hnRNP C1/C2 685 1.2 1.2
액틴형 6A; 진핵세포 개시 인자 4A11 746 -1.3 -1.2
핵 클로라이드 채널 단백질 938 -1.2 -1.2
프로테아좀 26S 서브유니트 284 -1.1 -1.6
디스뮤타제 Cu/Zn 슈퍼옥사이드 667 -1.1 -1.4
트랜슬린-결합 인자 X 154 1 -1.9
NCI-0808: 6시간 Q-10:
6시간
단백질 동정 스팟 50uM Q10 100uM Q10
아비산염 전위 ATP아제; 스퍼민 신테타제 1057 -1.1 -1.2
리보솜 단백질 SA 530 -1.2 -1.4
dCTP 피로포스파타제 1 720 -1.2 -1.2
프로테아좀 베타 3 652 -1.1 -1.3
프로테아좀 베타 4 773 -1.1 -1.2
산 포스파타제 1 452 -1.3 -1.5
디아제팜 결합 억제제 477 -1.4 -1.2
NCI-0808: 24시간 Q-10:
24시간
단백질 동정 스팟 50uM Q10 100uM Q10
알파 2-HS 당단백질 (보스 토러스, 소) 16 1.4 5.9
리보솜 단백질 P2; 히스톤 H2A 130 -1.3 -4.2
베타 액틴 180 1.3 3
hnRNP C1/C2 234 -1.2 -2.6
열 쇼크 단백질 70kD 244 1.1 1.7
마이크로튜불 결합 단백질 275 1.1 -1.8
베타 튜불린 311 1.7 2.6
프로테아좀 알파 3 314 1.1 -2.2
ATP 의존성 헬리카제 II 363 1.2 2.1
진핵세포 해독 연장 인자 1 델타 369 1.1 -2
라민 B1 372 1 -2.1
SMT 3, mif two 3 동족체 2의 억제인자 387 1 -1.95
열 쇼크 단백질 27kD 388 1.1 -1.7
hnRNP C1/C2 396 -1.4 -2
진핵세포 해독 연장 인자 1 베타 2
 436 1 -1.9
HSPC-300과 유사 490 -1.2 1.5
열 쇼크 단백질 27kD 506 -1.2 -1.9
진핵세포 해독 연장 인자 1 델타 511 1 -1.6
진핵세포 해독 연장 인자 1 델타 524 1 -1.7
추정 c-myc-반응성 이소형 1 532 1 1.4
라민 B1 557 1 -1.6
ER 지질 raft 결합 2 이소형 1; 베타 액틴 575 1.1 1.6
디스뮤타제 Cu/Zn 슈퍼옥사이드 583 1.1 -1.3
DNA 지시된 DNA 폴리머라제 엡실론 3; (캐노피 2 동족체) 622 -1.1 -1.6
시그날 서열 수용체 1 델타 646 1 1.5
+ = Q10에 의한 상향조절
- = Q10에 의한 하향조절
주지: "1"은 단백질의 양이 변화가 없음을 지시한다.
MASCOT 분석으로부터 상부 타이어(tier) 스팟을 보다 조기에 동정하였다. 분석 제2 단계에서, 2개의 스팟 수준이 분석되었고 가시적 검사 및 QC를 기준으로 또한 MS 동정을 위해 송부하였다.
하기 표 7에는 "수준 2" 스팟으로서 동정된 지 3시간 후 CoQ10으로 처리된 NCIES0808 세포 내에서 이의 양이 조정되는 단백질에 대한 단백질 ID가 열거되어 있다.
Figure 112012023750408-pct00007
NICES0808 샘플의 미토콘드리아 제제를 또한 단백질에 대해 분석하였고, 하기 표 8에는 CoQ10으로 처리 후 이의 양이 조정되는 단백질이 열거되어 있다.
Figure 112012023750408-pct00008
실시예 8: 웨스턴 블롯 분석
50μM 또는 100μM Q10으로 24시간 동안 처리된 NCIES0808 세포를 웨스턴 블롯 분석에 적용하고 대조군 배지 샘플과 비교하여 단백질-수준 변화를 동정하기 위해 분석하였다.
처리된 세포로부터 수득된 단백질을 안지오텐신 전환 효소(ACE)에 대한 항체(도 4a), 카스파제 3에 대한 항체 (도 4b), GARS에 대한 항체(도 4c), 매트릭스 메탈로프로테이나제 6(MMP-6)에 대한 항체(도 4d) 및 뉴로라이신(NLN)에 대한 일련의 항체(도 4e-f)에 대해 웨스턴 블롯 분석으로 평가하였다. 이들 실험으로부터의 결과는 조사된 단백질 모두가 Q10으로 세포 처리 결과로서 하향조절되었음을 입증하였다. 특히, 100μM Q10으로 처리한지 24시간째에 카스파제 3이 현저하게 하향조절되었다.
Figure 112012023750408-pct00009
실시예 4 내지 8의 고찰
유잉 육종은 멘델 유전, 환경적 또는 약물 노출과 관련이 없는 것으로 나타난 매우 공격성인 암이다. ES의 대부분의 일치하는 특징은 EWSR1 유전자좌와 ETS 전사 인자 유전자 간의 염색체 전좌의 결과로서 융합 유전자가 존재하는 것이다. EWS-ETS 융합 유전자는 EWS-FLI1과 같은 전사 인자들을 암호화하고, 이의 비정상적인 기능이 ES 병리학과 관련이 있다. 고속 산출(high-throughput: HTS) 기술의 사용이 최근 발전하여 EWS-FLI1의 기능적 결과에 대한 이해를 제공하기 시작했다.
상기 실시예에 제공된 결과는 프로테오믹 데이터의 분석을 기재하고 있고 이는 유잉 육종의 병인을 특징으로 하는 주요 유전자 마커에 대한 조효소 Q10의 영향을 입증하고 있다. 항체 어레이, 2차원 겔 전기영동/질량 분광법 및 실시간 폴리머라제 연쇄 반응 마이크로어레이의 조합으로 90개 이상의 유전자 생성물을 동정하였고, 이들의 발현이 CoQ10 처리에 응답하여 유잉 육종 세포주(JDT, 0808)에서 상당히 영향받는 것으로 나타났다. 이들 중에서 동정된 유전자 생성물의 약 60%의 발현 패턴은 상향조절되고 40%는 하향조절되었다. 기능성 그룹은 42개 주요 클러스터내 유전자를 세분하는 기구["The Database for Annotation, Visualization and Integrated Discovery" [DAVID]]를 사용하여 동정하였다. 상기 목록으로부터 최대 수의 유전자는 "세포 과정의 조절"에서 별도로 구성되어 있고 다른 단백질들을 갖는 "대사적 과정" 기능성 그룹은 전사, 프로그램화된 세포사, 세포 발육, 세포 골격, 핵, 프로테오좀 및 기관 발육의 조절을 포함하는 기능성 그룹들로 전파된다. 단백질의 기능성 평가 및 세포 반응의 이들의 조정은 CoQ10에 노출된 유잉 세포가 세포 골격 단백질의 전체 발현을 유도하고, 초래하는 구조체의 불안정화는 세포 프로그램을 개시하여 급속하고 강력한 아폽토시스 반응을 유도함을 시사한다.
A. 조효소 Q10 은 여러 세포 골격의 단백질의 발현을 조정한다:
아폽토시스 반응의 개시에서 세포 골격의 붕괴
CoQ10을 사용한 유잉 육종 세포주의 처리는 미세필라멘트(베타 액틴, 미오신 조절 경쇄, 액틴 관련 단백질 ACTL6), 중간 필라멘트(케라틴 1, 10, 13, 17) 및 마이크로튜불(베타 튜불린, 마이크로튜불 관련 단백질, 다이네인), 상호작용 단백질(다인액틴) 및 샤페론(TCP1을 함유하는 샤페론)을 포함하는, 다수의 세포골격 성분들의 발현을 변화시켰다. 이러한 현상은 부분적으로 리보솜 단백질(RPLP2), 진핵세포 해독 개시 인자 (EIF3G, EIF4A2) 및 진핵세포 해독 연장 인자(EEF1B2, EEF1D)에서 관찰된 증가에 의해 부분적으로 지지된다. 상응하는 열 쇼크 단백질(HSP27, HSP60, HSP70)의 발현 증가 및 액틴의 발현을 상향조절하고 마이크로튜불 구조를 안정화시키는 HSP27의 잘 보고된 능력은 CoQ10 매개된 구조 단백질 발현의 변화가 세포골격 구조를 불안정화시킴을 시사한다(문헌참조: Robitaille et al, 2009; Mounier & Arrigo, 2002). 아폽토시스 실행에서의 세포골격 관련 변화, 예를 들면, 세포 라운딩, 막 기포 및 염색질 응축이 관여함은 문헌(참조: Mills et al, 1999)에서 보고되었다. 그러나, 최근 연구는 세포골격의 붕괴 또는 조정이 아폽토시스 과정에서 요구되는 단계임을 시사한다(문헌참조: Pawalak & Helfman, 2001). 사이토칼라신 D에 의한 세포골격 붕괴는 카스파제 3 활성화를 증가시키고 DNA-손상 유도된 아폽토시스를 가속화시킨다. 이러한 효과는 100μM CoQ10이 유잉 JDT 세포주 노출 후 1시간 이내에 카스파제 3 발현을 30% 증가시킨다는 관찰에 의해 설명된다. 다이에닌과 같은 마이크로튜불(이의 발현은 CoQ10에 응답하여 증가한다)은 DNA 손상에 응답하여 핵으로의 p53의 수송을 촉진시키고 튜불린 및 마이크로튜불 결합 단백질이 유사분열의 과정에서 필수 역할을 한다면, 이것은 CoQ10이 세포골격 구조 및 세포 주기를 붕괴시키고/불안정화시켜 프로그램화된 세포사를 활성화시킴을 시사한다.
B. CoQ10 은 CBP / p300 경로를 통한 아폽토시스의 EWS - ETS 매개 억제를 탈억제한다 .
NCIES0808 세포주에서 CoQ10 노출에 응답하여 상향조절되는 단백질 중 하나는 CBP/p300, CREB-결합 단백질 및 이의 E1A 결합 단백질 동족체이고 이 둘 다는 널리 확인된 전사 보조활성화인자이다(문헌참조: Chirivia JC et al, 1995; Eckner R et al, 1994). CBP 및 p300은 세포 성장 및 발육을 조절하는 유사한 상호교환가능한 세포 기능을 갖는다(문헌참조: Janknecht R, 2002; Goodman & Smolik. 2000). CBP/p300은 많은 전사 인자에 대한 보조활성화제로서 기능하고, 전사 기구내에서 브릿지/스캐폴드로서 작용하는 것으로 나타난다(문헌참조: Smolik & Goodman, 2000). 정상적인 세포 기능의 유지에서 EWSR1 유전자 생성물의 전사 활성이 부분적으로 CBP/p300과의 상호작용을 통해 매개된다는 증거가 있다(문헌참조: Araya et al, 2003; Rossow & Janknecht, 2001). 추가로, 결실 돌연변이를 사용하여 Fli-1 단독 및 EWS-Fli1 융합체가 CBP에 결합하고, 핵 수용체 전사 활성을 방해함이 입증되었다(문헌참조: Ramakrishnan et al, 2004). CBP/p300에 의한 EWS-ETS 융합 단백질의 간접적인 조정에 대한 증거는 RNA 헬리카제의 DEXH 계열의 구성원인 RNA 헬리카제 A(RHA), 및 전사를 조정하는 RNA 폴리머라제 II와 상호작용하는 이의 능력을 기초로 한다(문헌참조: Nakajima T, 1997). RHA의 발현은 ES 세포주 및 종양에서 발견되었고, RHA와 EWS-FLI1의 융합 간의 물리적 상호작용은 EWS-FLI1 단백질의 전사적 및 형질전환적 잠재력을 증진시키는 것으로 나타난다(문헌참조: Toretsky et al, 2006). 사실, EWS-ETS에 의한 CBP와 같은 전사 보조인자의 활성을 표적화하는 것이 부분적으로 세포 형질전환에 관여할 수 있는 것으로 제안되었다(문헌참조: Fujimura et al, 1996). 상기 개념은 EWS-FLI1이 CBP/p300 경로에 영향을 미침에 의해 아폽토시스 경로를 억제한다는 관찰에 의해 뒷받침된다(문헌참조: Ramakrishnan et al, 2004). 동일 연구에서, 또한 CBP/p300의 세포 수준을 증가시킴으로써 세포가 레티노산 아폽토시스에 감작화되도록 할 수 있음이 입증되었다(문헌참조: Ramakrishnan et al, 2004). 본 연구에서, CoQ10을 사용한 ES0808 세포주의 처리는 CBP/p300의 발현을 증가시켰다(기준선에 비해). CBP/p300의 CoQ10 매개된 증가는 유잉 육종에서 EWS-ETS 단백질에 의해 일반적으로 억제되는 아폽토시스 경로를 재활성화(즉, 탈억제)시키는 것으로 제안된다.
C. 유잉 육종 세포주에서 CoQ1O 유도된 세포사는 p53 전사 인자 조절된 아폽토시스의 활성화때문이다 .
다수 계열의 증거는 유잉 육종 모델 세포주에서 CoQ10 유도된 세포사에서의 아폽토시스의 역할을 지지한다. 이들 중 가장 명백한 것은 CoQ10으로 처리한지 1시간 후 유잉 JDT 세포주에서 이의 발현이 상당히 증가됨에 의해 입증된 p53의 활성화가 관여한다는 것이다. p53 전사 인자가 세포 손상/스트레스에 응답하여 활성화되고 유전자 발현 경로를 활성화시켜 세포주기 억제 또는 아폽토시스를 유발하는 것으로 잘 보고되어 있다(문헌참조: Levine, 1997; Giaccia and Kastan, 1998). 추가로, CBP/p300은 p53과 상호작용하고 p53 의존성 MDM2, p21 및 Bax 프로모터를 전사적으로 활성화시키고(문헌참조: Avantaggiati et al, 1997; Gu et al, 1997; Lill et al, 1997), 특이적 라이신 잔기를 아세틸화하고 p53의 DNA 결합 성질을 증강시킨다(문헌참조: Gu & Roeder, 1997). 따라서, CoQ10은 유잉 육종 세포주에서 p53의 발현을 직간접적으로 증가시킨다.
Ku70(이는 당업계 및 본원에서 ATP 의존성 헬리카제 II로도 불림)의 감소는 CoQ10으로 처리된 유잉 육종 ES0808 세포주에서 관찰되었다. Ku70은 아폽토시스 촉진 단백질 Bax와 관련되고 탈유비퀴틴(dequbiquitin) 효소 활성을 갖는다(문헌참조: Rathaus et al, 2009). 최근 증거는 아세틸화된 p53이 Ku70-Bax 복합체를 차단하고 붕괴시켜 아폽토시스를 증진시키는 능력을 가짐을 시사한다(문헌참조: Yamaguchi et al, 2009). 따라서, 이것은 증가된 p53 활성과 협력하여 Ku70에서 CoQ10 유도된 감소는 Bax의 아폽토시스 촉진 활성을 증강시킬 수 있음을 시사한다.
CoQ10을 사용한 처리는 24시간까지 지속적인 이종성 핵 리보뉴클레오단백질 C(hnRNP C1/C2) 발현을 하향조절하였다. hnRNP C1/C2 단백질은 아폽토시스의 X-연결된 억제제(XIAP) 및 내부 리보솜 진입 부위(IRES)를 형성하는 복합체의 일부이다(문헌참조: Holcik et al, 2003). XIAP는 아폽토시스의 가장 강력한 고유 억제제이고, 카스파제 3, 카스파제 7 및 카스파제 9와 결합하여 이들의 활성을 억제한다(문헌참조: Deveraux et al, 1997). hnRNP C1/C2의 과발현은 특히 XIAP IRES의 해독을 증진시켰고, 이것은 XIAP 발현의 조정에서의 역할을 시사한다(문헌참조: Holcik et al, 2003). hnRNA C1/C2 발현의 감소는 XIAP 발현을 감소시키고, 유잉 육종 세포주의 CoQ10 유도된 아폽토시스에 대한 민감성을 증강시키는 것으로 제안된다. 상기 가정은 CoQ10 처리한지 1시간 후 유잉 JDT 육종 세포주에서 카스파제 3 발현이 상당히 증가된다는 관찰에 의해 지지된다. hnRNP C/C2가 EWS 단백질과 함께 동시 정제된다는 관찰(문헌참조: Zinszner et al, 1994)은 XIAP의 조절에 대한 새로운 경로 및 EWS-FLI1 융합체의 항-아폽토시스 잠재력을 시사한다.
CoQ10으로 처리된 유잉 육종 ES0808 세포주는, 프로테오좀 서브유니트 PSMA3, PSMB3, PSMB4 및 유비퀴틴 효소(유비퀼린)을 포함하는 프로테오좀을 구성하는 다양한 서브유니트들의 지속적인 발현 증가를 나타낸다. 상기 프로테오좀은 폴리유비퀴틴 태그에 의해 표지되는 단백질을 인지하고 결합하고 분해시키는 대형 다중 단백질 복합체이다. 아폽토시스의 과정은 세포 크기의 점진적인 감소를 수반하기 때문에, 프로테오좀은 세포질 및 핵 단백질의 분해를 위해 필수적이다(문헌참조; Wojcik, 1999). 실제로, 아폽토시스 동안에 프로테오좀 시스템의 활성화는 이전에 보고되었다(문헌참조: Drexler, 1998; Piedimonte, 1999).
유잉 육종 세포의 CoQ10-유도된 세포독성(예를 들면, 종양 세포 성장 억제 또는 아폽토시스의 활성화)에서 세포 구조 골격의 불안정화와 같은 아폽토시스 및 다른 경로에 대한 역할이 이의 조정에 의해 입증되는 다른 단백질은 다음을 포함한다:
(a) JAB1 발현의 증가: JAB1(Jun 활성화 결합 도메인 또는 CSN5)은 다중 시그날 전달 경로를 조절하는 COP9 시그날로좀의 일부이다. JAB1은 BcLG-특이적 결합 단백질이고 BH3 도메인 의존성 아폽토시스 경로를 증진시킨다(문헌참조: Liu X, et al. Cell Signaling 20(1): 230-240, 2008.).
(b) p53R2 발현의 증가: 리보뉴클레오사이드 디포스페이트 리덕타제는 핵 및 미토콘드리아 DNA 합성 및 복구에 관여하는 효소이다. p53R2 발현은 DNA 손상 후 p53에 의해 유도된다. p53R2의 과발현은 p53 의존성 DNA 복구 경로의 조절을 방해하고, 항암 약물에 대한 세포의 민감성을 증가시킨다(문헌참조: Yamaguchi T, et al. Cancer Res. 2001 Nov 15; 61(22): 8256-62.; Nakamura Y: Cancer Sci. 95(1):7-11, 2004.; Pontarin G, et al. Proc Natl Acad Sci U S A. 105(46): 17801-6, 2008.).
(c) 포스파티딜세린 수용체의 발현 증가: 이들 수용체는 마크로파지 및 수지상 세포와 같은 항원 제공 세포(APC)의 세포 표면상에서 발현된다. 이들은 잠재적으로 포스파티딜세린 또는 아폽토시스 세포로부터 방출되는 분비된 포스파티딜세린과 상호작용하여 종양 마크로파지의 유인을 조력함에 의해 소염 반응을 촉진시킬 수 있다(문헌참조: Kim JS, et al. Experimental Molecular Med. 37(6):575-87, 2005.).
(d)
(e) 사이토케라틴 펩타이드 13 및 17의 발현 증가: 사이토케라틴 펩타이드는 세포질내 세포골격 단백질 계열에 속하고, 이의 조절불능의 발현은 기저 세포 암종(BCC)과 관련된다(문헌참조: Lo BK, et al. Am J Pathol. 176(5):2435-46, 2010.). 사이토케라틴 발현은 폐 및 결장직장 선암종의 진단을 위한 가장 일관된 마커 중 하나이다(문헌참조; Kummar S, et al. Br J Cancer. 86(12): 1884-7, 2002.). 사이토케라틴 펩타이드(예를 들면, 18)는 카스파제 3 단백질 분해의 최종 생성물인 것으로 공지되어 있지만, 아폽토시스 연쇄 반응의 생성물로서 펩타이드 17 및 13에 대해서는 많이 보고되지 않았다. 그러나, CK 17은 BCC 종양 발생에서 백혈구 화학주성에 역할을 갖는 케모킨 수용체와 동일한 위치에 존재하는 것으로 나타났다. 이들 생성물은 처리된 NCI0808 세포에서 증가된 아폽토시스의 효과 또는 변화된 종양 발생의 원인일 가능성이 있다.
(f) 신경필라멘트 160 및 200의 발현 증가: 신경필라멘트 160 및 200은 각각 신경 세포에서 발현된 중간 필라멘트 단백질의 이소형이다. 유잉 육종은 신경원이고, 200kD 이소형의 비정상적인 발현은 EWS 세포주에서 관찰되었다(문헌참조: Lizard-Nacol S, et al. Tumour Biol. 13(l-2):36-43, 1992.).
(g) Rab5 발현 증가: Rab 5는 자가소화작용, 및 파고좀(phagosome)에서 아폽토시스 세포의 프로세싱에 관여하는 소형 GTPase이다(문헌참조: Kinchen JM, et al. Nature. 464(7289):778-82, 2010.). CoQ10으로 처리된 NCI0808 세포에서 이의 증가된 발현은 아폽토시스 후 반응들의 최종 단계를 나타낸다.
(h) AFX 의 발현 증가: 또한 FOXO4로서 공지됨, 이것은 포크 헤드 전사 인자 계열의 구성원이다. FOXO4는 NAD 의존성 데아세틸라제 SIRT1 및 아세틸 트랜스퍼라제, CBP/p300에 의해 조절된다. FOXO4는 산화적 스트레스 반응(MnSOD), DNA 복구 (GADD45), 세포 주기 억제(p27Kip1) 및 아폽토시스(Bim 및 Fas 리간드) 유전자를 활성화시킨다(문헌참조: Giannakou ME, et al. Trends Cell Biol. 14(8):408-12, 2004). AFX의 증가된 발현은 CoQ10 유도된 세포사에 대한 NCI0808 세포의 증가된 감수성과 일치한다. FOXO1a는 또한 100μM의 CoQ10으로 처리시 상향조절된다,
(i) MEKK4 의 발현 증가: 또한 MAP3K4로서 공지됨, 이것은 다운스트림의 유사분열물질 활성화된 키나제, p38 및 cJun N 말단 키나제(JNK)를 조절하는 유사분열물질 활성화된 단백질 키나제 4이다. 심근세포에서 MEKK4의 활성화는 증가된 수준의 아폽토시스를 유발하는 것으로 나타났다(문헌참조: Mizote I, et al. J Mol Cell Cardiol. 48(2):302-9, 2010). 50μM CoQ10으로 처리된 NCI0808 세포에서 MEKK4의 발현 증가는 상기 처리에 응답하는 진행중인 아폽토시스를 나타낼 수 있다.
(j) HDAC2 발현의 감소: CBP/p300은 HDAC2와 상호작용하여 Bcl2의 프로모터 활성을 증가시키고 이의 활성은 HDAC 억제제의 존재하에 완화된다(문헌참조: Duan H, et al. Molecular and Cellular Biology. 25(5): 1608-1619, 2005). 따라서, CoQ10에 응답하는 HDAC2 발현의 감소는 Bcl2의 프로모터 활성(항아폽토시스 기능과 관련된)을 감소시켜야만 한다.
(k) HDAC4 발현의 감소: HDAC4와 상호작용하는 CBP/p300은 HIF-1α의 전사 조절에 관여한다(문헌참조: Seo H-W, et al. FEBS Letters 583:55-60, 2009; Buchwald M, et al. Cancer Letters. 280: 160-167, 2009.). 따라서, CoQ10에 의한 HDAC4 발현의 감소는 HIF-1α의 전사 활성화 및 세포 형질전환 및 발암과 관련된 다운스트림 시그날 전달 연쇄 반응을 감소시켜야만 한다.
(l) PDK1 발현의 증가: 포스포이노시티드 3 포스페이트 의존성 키나제 1 (PDK1)은 AKT의 마스터 조절제이고, AKT 시그날 전달을 통해 세포 생존에서의 역할을 수행한다. 최근에 MEK/ERK 및 PI3K/AKT 시그날 전달 복합체의 본질적 활성화는 유잉 종양 계열 종양(ESFT)(문헌참조: Benini S. et al. Int J Cancer. 108(3):358-66, 2004; Liu LZ et al. Cancer Res. 67(13):6325-32, 2007)에서 보고되었다. 항암 치료제와 반응하는 PDK1을 포함하는 이들 시그날 전달 효소의 상승된 발현이 또한 보고되었다(문헌참조: Kawaguchi W, et al: Cancer Sci. 98(12):2002-2008, 2007, Liu SQ, et al. Dig Liver Dis. 2006 May;38(5):310-318, 2006). ESFT에서 항암 약물과 조합된 PDK1 및 MAPK의 억제는 암 치료제의 개발에서 매우 성공적인 전략이었다(문헌참조: Yamamoto T, et al. J Cancer Res Clin Oncol. 135(8): 1125-36, 2009).
(m) 카스파제 12 발현의 증가: 이들은 ER 스트레스 특이적 아폽토시스의 중요한 매개체인 광범위한 계열의 시스테인 프로테아제에 속한다. ER 스트레스가 EWS에서 중요한 성분인 것으로 공지되어 있지 않지만, CoQ10 처리가 ER 스트레스를 유발할 것으로 추정된다. 시스플라틴과 같은 항암제를 사용한 이전의 연구는 카스파제 12 매개된 ER 스트레스 특이적 아폽토시스를 증가시키는 것으로 나타났다(문헌참조: Liu H, et al. J Am Soc Nephrol. 16(7): 1985-92, 2005).
(n) 포스포리파제 D1 발현의 증가: 이것은 유사 분열/세포 증식 및 막 트래픽킹을 조절하는 시그날 전달 반응에 관여하는 포스파티딜콜린 특이적 포스포리파제 D이다. EWS/FLi 또는 FLi의 과발현 및 RNAi 녹다운을 포함하는 한 연구는 단지 PLD2 유전자 발현을 변화시키지만 PLD1 유전자 발현은 변화시키지 않음을 입증하였다(문헌참조: Kikuchi R, et al. Oncogene. 26(12): 1802-10, 2007). 이들은 또한 PLD1 유전자내 5' 프로모터가 EWS/FLi 융합 단백질에 대한 결합 서열이 부재임을 보여주었다. 그러나, PLD1은 세포 생존 및 아폽토시스로부터의 보호를 위해 필수적인 것으로 나타났다. 카스파제에 의한 PLD1의 절단은 p53 의존성 세포사 경로의 조정을 통해 아폽토시스를 촉진시킨다(문헌참조: Jang YH, et al. Cell Death Differ. 15(11): 1782- 93, 2008).
(o) p34 cdc2 키나제 및 p34 BP1 의 발현 증가: p34cdc2는 M 상으로의 세포 진입을 조절하는 키나제이다. p34cdc2의 미성숙한 활성화는 세포 주기를 억제하고 아폽토시스를 개시한다. 탁솔과 같은 항암제는 p34cdc2의 미성숙한 활성화를 유도하여 EWS에서 아폽토시스를 유발한다(문헌참조: Duan, H., et al., 2005; Lee S., et al. Cancer Res. 62(20):5703-10, 2002.). CoQ10에 응답한 p34cdc2 및 결합 단백질(p34 BP1) 발현의 증가는 NCI0808 세포에서 CoQ10 유도된 아폽토시스 활성의 증가를 시사한다.
(p) 브루톤 감마글로불린혈증 티로신 키나제(BTK)의 발현 증가: BTK는 포스포리파제 γ2의 활성화에 관여하여 세포내 칼슘 방출, 세포외 칼슘 유입 및 PKC 활성화를 유도한다. BTK는 EWS 단백질에 직접 결합하여 이와 상호작용하는 것으로 보고되었지만(문헌참조: Bajpai UD, et al. J Exp Med. 191(10): 1735-44, 2000), EWS에서 이의 정확한 역할은 공지되어 있지 않다. BTK는 PKC를 활성화시키기 때문에 이들은 암 세포에서 칼슘 유발된 아폽토시스를 매개함을 시사한다(문헌참조: Zhu, D-M., et al. Clin. Cancer Res., 5: 355- 360, 1999.).
(q) ASC2 의 발현 증가: CARD 도메인(카스파제 유인 도메인)을 함유하는 단백질과 같은 아폽토시스-관련 스펙(speck)은 피린 도메인 함유 단백질의 부류에 속하고, 염증, 아폽토시스 및 사이토킨 프로세싱을 조절하는 경로의 주요 성분이다. 이들 단백질은 NFkb 및 카스파제 1을 활성화시키는 피리딘 도메인을 사용한다(문헌참조: Stehlik C, et al. Biochem J. 373(Pt 1): 101, 2003). 이들 단백질은 CoQ10에 응답하여 NCI0808에서 아폽토시스를 매개하는데 관여하는 것으로 제안된다.
(r) BubR1 의 발현 증가: BubR1은 유사분열 후기(Anaphase) 촉진 복합체 (APC/C)를 조절하기 위해 필수적인 유사분열 체크포인트 세린/트레오닌 단백질 키나제로서 작용한다(문헌참조: Choi et al 2009). 상기 단백질의 붕괴는 암 세포의 유사분열 억제 및 아폽토시스를 유발한다(문헌참조: Xu HZ, et al. Cell Cycle. 9(14):2897-907, 2010). 손상된 스핀들 체크포인트는 많은 형태의 암에서 보고되었고 BubR1의 증가된 발현은 CoQ10에 대한 반응과 일관성이 있는 것으로 나타난다.
(s) PCAF 발현의 증가: PCAF는 히스톤 및 비히스톤 단백질 둘 다를 아세틸화하는 히스톤 아세틸 트랜스퍼라제 효소이다. 이것은 아폽토시스를 포함하는 다양한 기능을 매개하는데 관여한다.
(t) Raf1 의 발현 증가: Raf1은 원종양유전자이고 세포 주기로부터 G2/M 출구를 조절하는 세린 트레오닌 단백질 키나제로서 기능한다. 이것은 세포 막으로부터 핵으로의 유사분열 시그날의 전달에 관여하고, 수용체로부터 핵으로의 Ras 의존성 시그날 전달 경로의 서브세트를 나타낸다.
(u) MSK1 의 발현 증가: MSK1은 유사분열물질이고, MAPK 및 SAPK/p38에 의해 직접 활성화되고 이어서 CREB 단백질을 활성화시킬 수 있는 스트레스 활성화된 단백질 키나제 1이다(문헌참조: Deak M, et al. EMBO J. 17(15):4426-41, 1998). 활성 CREB의 억제는 사람 비 소세포 폐암에서 아폽토시스를 유도하고 세포 성장을 억제한다.
(v) SNAP25 의 발현 증가: SNAP-25 단백질은 SNARE 복합체의 성분이고, 시냅스전 신경 막에서 채널 어셈블리에 관여한다. EWS/Fli 키메라 단백질은 SNAP25를 조절하는 전사 인자인 Brn-3a를 조절함에 의해 신경 분화 및 SNAP25의 발현을 억제한다(문헌참조: Gascoyne DM, et al. Oncogene. 23(21):3830-40, 2004). CoQ1O은 처리된 NCIES 0808 세포에서 EWS/Fli 키메라 단백질의 활성을 억제할 수 있다.
(v) mTOR 발현의 감소: 라파마이신 또는 FK506 결합 단백질 12-라파마이신 관련 단백질 1(FRAP1)의 기작적 표적물인 것으로도 공지된 라파마이신의 포유동물 표적물은 사람에서 FRAP1 유전자에 의해 암호화된 단백질이다(문헌참조: Brown EJ, et al. Nature 369 (6483): 756-8, 1994; Moore PA, et al. Genomics 33 (2): 331-2, 1996). mTOR은 세포 성장, 세포 증식, 세포 운동성, 세포 생존, 단백질 합성, 전사를 조절하는 세린/트레오닌 단백질 키나제이고, 포스파티딜이노시톨 3-키나제-관련 키나제 단백질 계열에 속한다(문헌참조: Hay N, et al. Genes Dev 18 (16): 1926-45, 2004; Beevers C., et al. Int J Cancer 119 (4): 757-64, 2006). mTOR은 영양분 및 해독을 조절하는 성장 인자와 같은 유사분열물질에 의해 유발되는 시그날 전달에 중추적 역할을 수행한다. mTOR은 인슐린, 성장 인자(예를 들면, IGF-1 및 IGF-2) 및 유사분열물질을 포함하는 업스트림 경로로부터의 유입을 통합한다. mTOR은 또한 영양분 및 에너지 수준 및 산화환원 상태를 감지한다(문헌참조: Hay N, et al., 2004). 세포 대사/생물에너지 상태를 조절하는데 있어서의 이의 주요 역할 및 mTOR의 조절불능이 암과 관련된다는 관찰때문에, NCIES 0808 세포주에서 CoQ10에 응답하는 mTOR의 발현 감소는 유잉 육종에서 세포 대사/생물에너지 상태에 영향을 미치는 이의 능력을 시사한다.
실시예 9: CoQ10 21% 농축물 및 알킬 벤조에이트를 포함하는 CoQ10 크림 3%의 0.5kg 배치를 제조하는 방법
CoQ10 크림 3.0% 조성물의 0.5kg 배치는 하기의 상들을 배합하여 제조하였다. 상 A는 C12 -15 알킬 벤조에이트 4.00 %w/w, 세틸 알코올 NF 2.00 %w/w, 글리세릴 스테아레이트/PEG-100 스테아레이트 4.50 %w/w 및 스테아릴 알코올 NF 1.5 %w/w를 포함한다. % 및 양은 하기의 표에 열거되어 있다.
Figure 112012023750408-pct00010
상 B는 디에티렌 글리콜 모노에틸 에테르 NF 5.00 %w/w, 글리세린 USP 2.00 %w/w, 프로파일렌 글리콜 USP 1.50 %w/w, 페녹시에탄올 NF 0.475 %w/w, 정제수 USP 16.725 %w/w 및 카보머 분산액 2% 40 %w/w를 포함한다. % 및 양은 하기의 상응하는 상의 표에 열거되어 있다.
Figure 112012023750408-pct00011
상 C는 락트산 USP 0.50 %w/w, 나트륨 락테이트 용액 USP 2.00 %w/w, 트리에탄올아민 NF 1.30 %w/w 및 정제수 USP 2.50 %w/w를 포함했다. %, 양 및 추가의 세부사항은 하기의 표에 열거되어 있다.
Figure 112012023750408-pct00012
상 D는 이산화티탄 USP 1.00 %w/w를 포함하고 상 E는 CoQ1O 21 % 농축물 15.00 %w/w를 포함한다. %, 양 및 추가의 세부사항은 하기의 표에 열거되어 있다.
Figure 112012023750408-pct00013
모든 중량%는 전체 CoQ10 크림 3.0% 조성물의 중량을 기준으로 한 것이다.
상 A 성분을 적합한 컨테이너에 첨가하고 수욕에서 70 내지 80℃로 가열하였다. 카보머 분산액을 포함하지 않는 상기 상 B 성분을 적합한 컨테이너에 첨가하고 혼합하였다. 상기 상 C 성분을 적합한 컨테이너에 첨가하고 이어서 수욕에서 70 내지 80℃로 가열하였다. 상 E의 CoQ1O 21% 농축물을 적합한 컨테이너에 위치시키고 수욕을 사용하여 50 내지 60℃에서 용융시켰다. 상기 성분은 균일성을 확실히 하기 위해 필요한만큼 혼합하였다. 이어서 카보머 분산액을 적합한 컨테이너(믹스 탱크)에 첨가하고, 혼합하면서 70 내지 80℃로 가열하였다. 성분들을 혼합하면서, 상 B 성분을 온도를 유지시키면서 믹스 탱크의 내용물에 첨가하였다. 상기 내용물을 계속적으로 혼합하고 균질화시켰다. 이어서, 상기 믹서의 운행을 중단했지만 균질화는 지속되었다. 균질화가 계속되면서, 상 D의 이산화티탄을 믹스 탱크에 첨가하였다. 이어서, 상기 믹서를 가동시키고, 내용물을 혼합합고, 완전히 균일하고 완전히 분포될때까지(색상 점검) 추가로 균질화시켰다. 이어서, 균질화를 종료하고 배치를 50 내지 60℃로 냉각시켰다. 이어서, 상기 믹서의 운행을 중단하고 용융된 CoQ10 21% 농축물을 믹스 탱크에 첨가하였다. 상기 믹서를 후속적으로 가동시키고, 분산액이 부드럽고 균일해질때까지 상기 혼합물을 혼합하고 재순환시켰다. 이어서, 믹스 탱크의 내용물을 45 내지 50℃로 냉각시켰다. 이어서, 상기 내용물을 개봉할때까지 저장을 위해 적합한 컨테이너로 옮겼다.
실시예 10: 생체내에서 유잉 육종 종양의 치료
동물 모델에서 생체내 유잉 육종 종양에 대한 국소적 조효소 Q10 처리 효능을 평가하기 위한 실험을 수행하였다. 하기의 유잉 육종 세포주들 중 하나 이상을 이들 실험에 사용한다: TC71, TC32, RD-ES, 5838, A4573, EWS-925, NCI-EWS-94, 및 NCI-EWS-95(문헌참조: Kontny HU et al., Simultaneous expression of Fas and nonfunctional Fas ligand in Ewings's sarcoma. Cancer Res 1998;58:5842-9). NCI-EWS-011 및 NCI-EWS-021 세포주는 재발성 유잉 육종으로부터 수득된 종양 조직으로부터 국립암연구소에서 제조하였다. 절개된 종양 및 생성된 세포주 둘 다는t(ll;22) EWS/FLI-1 전좌에 대해 양성이다. 횡문근육종 주 RD4A (문헌참조: Kalebic T, et al., Metastatic human rhabdomyosarcoma: molecular, cellular and cytogenetic analysis of a novel cellular model, Invasion Metastasis 1996; 16:83-96) 및 신경아세포종 세포주 CHP-212 및 KCNR(문헌참조: Thiele C. Neuroblastoma. In: Masters J, Palsson B, editors. Human cell culture. Vol 1. Boston (MA): Kluwer Academic Publishers; 1999. p. 21-53)은 음성 대조군으로서 사용된다. 세포주를 2mM L-글루타민 및 0.1% 또는 10% 태아 소 혈청(Life Technologies, Gaithersburg, MD)이 보충된 RPMI-1640 배지에서 성장시킨다.
종양 세포는 75% 컨플루언스가 될 때까지 배양하고, 트립신/EDTA와 함께 회수하고, 이어서 PBS로 2회 세척하였다. 200만개의 유잉 육종 세포를 100μL의 PBS중에서 4- 내지 8-주령 암컷 SCID/bg 마우스의 비복근에 주사한다(Taconic, Germantown, NY). 각각의 마우스는 일반적으로 접종한지 21일 내지 28일 후에 명백한 1개의 감지할만한 종양을 나타낸다. 100 내지 50mm3의 종양 용적에서, 마우스를 무작위로 본원에 기재된 바와 같이 다양한 용량의 국소적 조효소 Q10(예를 들면, 피부 제곱 센티미터 당 0.01 내지 약 0.5mg의 조효소 Q10 또는 마우스에 투여하기 위한 적당한 등가물) 또는 비히클 단독(그룹당 5마리 또는 10마리의 마우스)을 투여받도록 할당된다. 조효소 Q10의 국소 용량을 단일 투여 또는 투여의 다중 (예를 들면, 2회, 3회, 4회, 또는 5회 이상) 횟수 또는 다중 라운드로 마우스에 투여한다. 종양 치수를 디지탈 캘리퍼로 1일 또는 2일마다 측정하여 2개의 직경의 종양 구형을 얻는다. 종양 부위에서 최저치 용적은 화학식 [(D x d2/6) x π, 여기서, D는 보다 긴 직경이고, d는 보다 짧은 직경이다]으로 결정된다. 종양이 없는 최저치 용적은 대략 50mm3이다. 종양 치수는 조효소 Q10으로 그리고 비히클 단독으로 국소적으로 처리된 마우스에서 시간 경과에 따라 비교되어, 생체내 유잉 육종 종양 세포의 성장 또는 증식을 억제하는데 있어서 조효소 Q10의 효능을 평가한다.
참조문헌:
Figure 112012023750408-pct00014
Figure 112012023750408-pct00015
Figure 112012023750408-pct00016
Figure 112012023750408-pct00017

균등물:
당업자는 단지 통상적인 실험을 사용하여 본원에 기재된 특정 양태 및 방법에 대한 많은 균등물을 인지하거나 확인할 수 있을 것이다. 이러한 균등물은 하기의 특허청구범위의 범위에 의해 포괄되는 것으로 의도된다.

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  17. 육종을 앓고 있는 피검체로부터 채취된 생물학적 샘플에 존재하는 2개 이상의 마커의 발현 수준을 비교하는 방법으로서, 상기 방법이,
    육종의 치료 요법의 적어도 일부가 상기 피검체에 적용되기 전에 상기 피검체로부터 채취된 제1 샘플에 존재하는 상기 2개 이상의 마커의 발현 수준과 상기 요법의 적어도 일부가 적용된 후에 상기 피검체로부터 채취된 제2 샘플에 존재하는 상기 마커의 발현 수준을 비교하는 단계를 포함하며,
    상기 마커가 ANGPTL3, CCL2, CDH5, CXCL1, CXCL3, PRMT3, HDAC2, 산화질소 신타제 bNOS, 아세틸 포스포 히스톤 H3 AL9 S10, MTA 2, 글루탐산 데카복실라제 GAD65 67, KSR, HDAC4, BOB1 OBF1, a1신트로핀(a1Syntrophin), BAP1, 임포르틴(Importina)-α5, 임포르틴-α7, αE-카테닌, Grb2, Bax, 프로테아좀 26S 서브유니트 13, 엔도필린(Endophilin) B1, 액틴형 6A, 진핵세포 개시 인자 4A11, 핵 클로라이드 채널 단백질, 프로테아좀 26S 서브유니트, 디스뮤타제 Cu/Zn 슈퍼옥사이드, 트랜슬린-결합 인자 X, 아비산염 전위 ATP아제(ATPase), 스퍼민 신테타제, 리보솜 단백질 SA, dCTP 피로포스파타제 1, 프로테아좀 베타 3, 프로테아좀 베타 4, 산 포스파타제 1, 디아제팜 결합 억제제, 알파 2-HS 당단백질, 리보솜 단백질 P2 (RPLP2), 히스톤 H2A, 마이크로튜불 결합 단백질, 프로테아좀 알파 3, 진핵세포 해독 연장 인자 1 델타, 라민 B1, SMT 3, mif two 3 동족체 2의 억제인자, 열 쇼크 단백질 27kD, hnRNP C1/C2, 진핵세포 해독 연장 인자 1 베타 2, HSPC-300 유사체, DNA 지시된 DNA 폴리머라제 엡실론 3(DNA directed DNA polymerase epsilon 3), 캐노피 2 동족체(canopy 2 homolog), LAMA5, PXLDC1, p300 CBP, P53R2, 포스파티딜세린 수용체, 사이토케라틴 펩타이드 17, 사이토케라틴 펩타이드 13, 뉴로필라멘트 160, 뉴로필라멘트 200, Rab5, 필렌신(Filensin), P53R2, MDM2, MSH6, 열 쇼크 인자 2, AFX, FLIPg d, JAB 1, 미오신, MEKK4, cRaf pSer621, FKHR FOXO1a, MDM2, Fas 리간드, P53R2, 미오신 조절 경쇄, 유비퀼린 1, 포스파타제 2A, 알파 2-HS 당단백질, 베타 액틴, hnRNP C1/C2, 열 쇼크 단백질 70kD, 베타 튜불린, ATP 의존성 헬리카제 II, ER 지질 raft 결합 2 이소형 1, 시그날 서열 수용체 1 델타, 진핵세포 해독 개시 인자 3, 서브유니트 3 감마, 빌베르딘 리덕타제 A, 트랜스알돌라제 1, 케라틴 1, 케라틴 10, 파라티모신, GST 오메가 1, Dj-1에 대한 쇄(chain) B 도파민 퀴논 접합체, 프로테아좀 활성화인자 Reg(알파), T-복합 단백질 1 이소형 A, 쇄 A 타파신 ERP57, TCP1 함유 샤페로닌, 유비퀴틴 활성화 효소 E1, 알라닐-tRNA 신테타제, 다이낙틴 1, 열 쇼크 단백질 60kd, 스퍼미딘 신타제, 망막모세포종 결합 단백질 4 이소형 A, TAR DNA 결합 단백질, TCP1 함유 샤페로닌, 서브유니트 3, 세포질 다이네인 IC-2, 안지오텐신-전환 효소 (ACE), 카스파제 3, GARS, 매트릭스 메탈로프로테이나제 6 (MMP-6), 뉴로라이신 (NLN)-촉매적 도메인, 및 뉴로라이신 (NLN), ADRB, CEACAM1, DUSP4, FOXC2, FOXP3, GCGR, GPD1, HMOX1, IL4R, INPPL1, IRS2, VEGFA, 추정 c-myc-반응성 이소형 1, PDK 1, 카스파제 12, 포스포리파제 D1, P34 cdc2, P53 BP1, BTK, ASC2, BUBR1, ARTS, PCAF, Raf1, MSK1, SNAP25, APRIL, DAPK, RAIDD, HAT1, PSF, HDAC1, Rad17, 수르비빈(survivin), SLIPR, MAG13, 카스파제 10, Crk2, Cdc 6, P21 WAF 1 Cip 1, ASPP 1, HDAC 4, 사이클린 B1, CD 40, GAD 65, TAP, Par4 (전립선 아폽토시스 반응 4), MRP1, MDC1, 라미닌2 a2, b카테닌, FXR2, 어넥신 V, SMAC 디아블로, MBNL1, 디메틸 히스톤 h3, 독립적 성장 인자(growth factor independence) 1, U2AF65, mTOR, E2F2, 카이소(Kaiso), 글리코겐 신타제 키나제 3, ATF2, HDRP MITR, 뉴라빈 I, AP1 및 Apaf1로 이루어진 그룹으로부터 선택되고,
    상기 제1 샘플과 비교하여 상기 제2 샘플에서의 상기 마커의 발현 수준에서의 변화(modulation)가, 상기 요법이 상기 피검체의 육종을 치료하기 위해 효과적임을 지시하는 것인, 마커의 발현 수준을 비교하는 방법.
  18. 육종을 앓고 있는 것으로 의심되는 피검체로부터 채취된 생물학적 샘플에 존재하는 2개 이상의 마커의 발현 수준을 비교하는 방법으로서, 상기 방법이,
    상기 피검체로부터 채취된 상기 생물학적 샘플에 존재하는 상기 2개 이상의 마커의 발현 수준을 결정하는 단계로서, 상기 마커가 제17항에 기재된 마커로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 단계, 및
    상기 피검체로부터 채취된 상기 생물학적 샘플에 존재하는 상기 마커의 발현 수준을 대조군 샘플에 존재하는 상기 마커의 발현 수준과 비교하는 단계를 포함하며,
    상기 대조군 샘플에서의 마커의 상기 발현 수준과 비교하여 상기 피검체로부터 채취된 상기 생물학적 샘플에서의 상기 마커의 발현 수준에서의 변화가, 상기 피검체가 육종을 앓고 있음을 지시하는 것인, 마커의 발현 수준을 비교하는 방법.
  19. 피검체로부터 채취된 생물학적 샘플에 존재하는 2개 이상의 마커의 발현 수준을 비교하는 방법으로서, 상기 방법이,
    상기 피검체로부터 채취된 상기 생물학적 샘플에 존재하는 상기 2개 이상의 마커의 발현 수준을 결정하는 단계로서, 상기 마커가 제17항에 기재된 마커로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 단계, 및
    상기 피검체로부터 채취된 상기 생물학적 샘플에 존재하는 상기 마커의 발현 수준을 대조군 샘플에 존재하는 상기 마커의 발현 수준과 비교하는 단계를 포함하며,
    상기 대조군 샘플에서의 상기 마커의 발현 수준과 비교하여 상기 피검체로부터 채취된 상기 생물학적 샘플에서의 상기 마커의 발현 수준에서의 변화가, 상기 피검체가 육종의 발병 성향이 있음을 지시하는 것인, 마커의 발현 수준을 비교하는 방법.
  20. 육종 치료 후 회복중인 피검체로부터 채취된 생물학적 샘플에 존재하는 2개 이상의 마커의 발현 수준을 비교하는 방법으로서, 상기 방법이,
    상기 피검체로부터 채취된 상기 생물학적 샘플에 존재하는 상기 2개 이상의 마커의 발현 수준을 결정하는 단계로서, 상기 마커가 제17항에 기재된 마커로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 단계, 및
    상기 피검체로부터 채취된 상기 생물학적 샘플에 존재하는 상기 마커의 발현 수준을 대조군 샘플에 존재하는 상기 마커의 발현 수준과 비교하는 단계를 포함하며,
    상기 대조군 샘플에서의 상기 마커의 발현 수준과 비교하여 상기 피검체로부터 채취된 상기 생물학적 샘플에서의 상기 마커의 발현 수준에서의 변화가, 육종의 재발을 지시하는 것인, 마커의 발현 수준을 비교하는 방법.
  21. 육종이 치료된 피검체로부터 채취된 생물학적 샘플에 존재하는 2개 이상의 마커의 발현 수준을 비교하는 방법으로서, 상기 방법이,
    상기 피검체로부터 채취된 상기 생물학적 샘플에 존재하는 상기 2개 이상의 마커의 발현 수준을 결정하는 단계로서, 상기 마커가 제17항에 기재된 마커로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 단계, 및
    상기 피검체로부터 채취된 상기 생물학적 샘플에 존재하는 상기 마커의 발현 수준을 대조군 샘플에 존재하는 상기 마커의 발현 수준과 비교하는 단계를 포함하며,
    상기 대조군 샘플에서의 상기 마커의 발현 수준과 비교하여 상기 피검체로부터 채취된 상기 생물학적 샘플에서의 마커의 발현 수준에서의 변화가, 상기 피검체의 생존율을 지시하는 것인, 마커의 발현 수준을 비교하는 방법.
  22. 육종을 앓고 있는 피검체로부터 채취된 생물학적 샘플에 존재하는 2개 이상의 마커의 발현 수준을 비교하는 방법으로서, 상기 방법이,
    육종의 치료 요법의 적어도 일부가 상기 피검체에 적용되기 전에 상기 피검체로부터 채취된 제1 샘플에 존재하는 상기 2개 이상의 마커의 발현 수준과, 상기 요법의 적어도 일부가 적용된 후 상기 피검체로부터 채취된 제2 샘플에 존재하는 상기 마커의 발현 수준을 비교하는 단계를 포함하며,
    상기 마커가 제17항에 기재된 마커로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 마커의 발현 수준을 비교하는 방법.
  23. 피검체에서 육종을 치료하기 위한 화합물을 동정하는 방법으로서, 상기 방법이,
    피검체로부터 채취된 생물학적 샘플을 시험 화합물과 접촉시키는 단계;
    상기 피검체로부터 채취된 상기 생물학적 샘플에 존재하는 2개 이상의 마커의 발현 수준을 결정하는 단계로서, 상기 2개 이상의 마커가 양성 배수 변화 또는 음성 배수 변화를 갖는 제17항에 기재된 마커로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 단계;
    상기 생물학적 샘플 중의 상기 2개 이상의 마커의 발현 수준을 대조군과 비교하는 단계; 및
    상기 생물학적 샘플에 존재하는 음성 배수 변화를 갖는 상기 마커의 발현 수준을 감소시키거나 상기 생물학적 샘플에 존재하는 양성 배수 변화를 갖는 상기 마커의 발현 수준을 증가시키는 시험 화합물을 선별하여, 피검체에서 육종을 치료하기 위한 화합물을 동정하는 단계를 포함하는, 피검체에서 육종을 치료하기 위한 화합물을 동정하는 방법.
  24. 제17항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 육종이 유잉 계열의 종양 중의 육종 유형인 방법.
  25. 제24항에 있어서, 상기 유잉 계열의 종양 중의 육종의 유형이 유잉 육종인 방법.
  26. 제17항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 샘플이 상기 피검체로부터 채취된 유체를 포함하는 방법.
  27. 제26항에 있어서, 상기 유체가 혈액, 토사물, 타액, 림프액, 낭포액, 뇨, 기관지 세정에 의해 회수된 유체, 복막 세정에 의해 회수된 유체 및 부인과적 유체로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 방법.
  28. 제27항에 있어서, 상기 샘플이 혈액 샘플 또는 이의 구성요소인 방법.
  29. 제17항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 샘플이 상기 피검체로부터 채취된 조직 또는 이의 구성요소를 포함하는 방법.
  30. 제29항에 있어서, 상기 조직이 골, 연결 조직, 연골, 폐, 간, 신장, 근육 조직, 심장, 췌장 및 피부로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 방법.
  31. 제17항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 피검체가 사람인 방법.
  32. 제17항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 생물학적 샘플 중의 상기 마커의 발현 수준이 상기 샘플 중의 전사된 폴리뉴클레오타이드 또는 이의 일부를 분석함으로써 결정되는 방법.
  33. 제32항에 있어서, 상기 전사된 폴리뉴클레오타이드의 분석이 상기 전사된 폴리뉴클레오타이드를 증폭시킴을 포함하는 방법.
  34. 제17항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 피검체 샘플 중의 상기 마커의 발현 수준이 상기 샘플 중의 단백질 또는 이의 일부를 분석함으로써 결정되는 방법.
  35. 제34항에 있어서, 상기 단백질이 상기 단백질과 특이적으로 결합하는 항체 및 항원-결합 항체 단편을 사용하여 분석되는 방법.
  36. 제17항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 샘플 중의 상기 마커의 발현 수준이 상기 샘플의 폴리머라제 연쇄 반응(PCR) 증폭 반응, 역전사효소 PCR 분석, 단일 가닥 입체 다형성 분석(SSCP), 미스매치 절단 검출, 이형이중가닥 분석, 서던 블롯 분석, 노던 블롯 분석, 웨스턴 블롯 분석, 동일계 하이브리드화, 어레이 분석, 데옥시리보핵산 서열 분석, 제한 단편 길이 다형태 분석 및 이들의 조합 또는 준조합(subcombination)으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 기술을 사용하여 결정되는 방법.
  37. 제17항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 샘플 중의 상기 마커의 발현 수준이 면역조직화학법, 면역세포화학법, 유동 세포분석법, ELISA 및 질량분광법으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 기술을 사용하여 결정되는 방법.
  38. 삭제
  39. 제17항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 4개 이상의 마커들의 발현 수준이 결정되는 방법.
  40. 제17항, 제21항 및 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 피검체가 환경 영향인자(environmental influencer) 화합물, 수술, 방사선요법, 호르몬 치료법, 항체 치료법, 성장 인자 또는 사이토킨을 이용한 치료법, 화학치료법, 동종 줄기 세포 치료법으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 치료법을 사용하여 치료되고, 상기 환경 영향 인자 화합물이 다차원 세포내 분자(MIM), 에피메타볼릭 쉬프터(에피-쉬프터(epi-shifter)), CoQ10 분자, 비타민 D3, 아세틸 Co-A, 팔미틸 Co-A, L-카르니틴, 티로신, 페닐알라닌, 시스테인, 소분자, 피브로넥틴, TNF-알파, IL-5, IL-12, IL-23, 혈관형성 인자, 아폽토시스 인자 및 이들의 배합물로부터 선택되는 방법.
  41. 제40항에 있어서, 상기 환경 영향인자 화합물이 조효소 Q10 분자인 방법.
  42. 육종을 치료하기 위한 치료법의 효능을 평가하기 위한 키트로서,
    상기 키트가 제17항에 기재된 마커로 이루어진 그룹으로부터 선택된 2개 이상의 마커의 발현 수준을 결정하기 위한 프로브, 및 상기 육종을 치료하기 위한 치료법의 효능을 평가하기 위한 상기 키트의 사용 지침서를 포함하며,
    상기 프로브가 RNA, DNA, 단백질 및 항체로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 키트.
  43. 피검체가 육종을 앓고 있는지의 여부를 평가하기 위한 키트로서,
    상기 키트가 제17항에 기재된 마커로 이루어진 그룹으로부터 선택된 2개 이상의 마커의 발현 수준을 결정하기 위한 프로브, 및 상기 피검체가 육종을 앓고 있는지의 여부를 평가하기 위한 상기 키트의 사용 지침서를 포함하며,
    상기 프로브가 RNA, DNA, 단백질 및 항체로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 키트.
  44. 피검체가 육종이 발병할 성향이 있는지를 예측하기 위한 키트로서,
    상기 키트가 제17항에 기재된 마커로 이루어진 그룹으로부터 선택된 2개 이상의 마커의 발현 수준을 결정하기 위한 프로브, 및 상기 피검체가 육종이 발병할 성향이 있는지의 여부를 예측하기 위한 상기 키트의 사용 지침서를 포함하며,
    상기 프로브가 RNA, DNA, 단백질 및 항체로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 키트.
  45. 피검체에서 육종의 재발을 예측하기 위한 키트로서,
    상기 키트가 제17항에 기재된 마커로 이루어진 그룹으로부터 선택된 2개 이상의 마커의 발현 수준을 평가하기 위한 프로브, 및 육종의 재발을 예측하기 위한 상기 키트의 사용 지침서를 포함하며,
    상기 프로브가 RNA, DNA, 단백질 및 항체로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 키트.
  46. 육종의 재발을 예측하기 위한 키트로서,
    상기 키트가 제17항에 기재된 마커로 이루어진 그룹으로부터 선택된 2개 이상의 마커의 발현 수준을 결정하기 위한 프로브, 및 육종의 재발을 예측하기 위한 상기 키트의 사용 지침서를 포함하며,
    상기 프로브가 RNA, DNA, 단백질 및 항체로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 키트.
  47. 육종을 앓는 피검체의 생존율을 예측하기 위한 키트로서,
    상기 키트가 제17항에 기재된 마커로 이루어진 그룹으로부터 선택된 2개 이상의 마커의 발현 수준을 결정하기 위한 프로브, 및 육종을 앓는 상기 피검체의 생존율을 예측하기 위한 상기 키트의 사용 지침서를 포함하며,
    상기 프로브가 RNA, DNA, 단백질 및 항체로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 키트.
  48. 피검체에서 육종의 진행을 모니터링하기 위한 키트로서,
    상기 키트가 제17항에 기재된 마커로 이루어진 그룹으로부터 선택된 2개 이상의 마커의 발현 수준을 결정하기 위한 프로브, 및 상기 피검체에서 육종의 진행을 예측하기 위한 키트의 사용 지침서를 포함하며,
    상기 프로브가 RNA, DNA, 단백질 및 항체로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 키트.
  49. 제42항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, 피검체로부터 생물학적 샘플을 채취하기 위한 도구를 추가로 포함하는, 키트.
  50. 제42항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, 대조군 샘플을 추가로 포함하는, 키트.
  51. 제42항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 2개 이상의 마커의 발현 수준을 결정하기 위한 프로브가, 전사된 폴리뉴클레오타이드 또는 이의 일부를 분석하기 위한 프로브를 포함하는, 키트.
  52. 제42항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 2개 이상의 마커의 발현 수준을 결정하기 위한 프로브가, 단백질 또는 이의 일부를 분석하기 위한 프로브를 포함하는, 키트.
  53. 제42항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, 다차원 세포내 분자(MIM), 에피메타볼릭 쉬프터(에피-쉬프터), CoQ10 분자, 비타민 D3, 아세틸 Co-A, 팔미틸 Co-A, L-카르니틴, 티로신, 페닐알라닌, 시스테인, 소분자, 피브로넥틴, TNF-알파, IL-5, IL-12, IL-23, 혈관형성 인자, 아폽토시스 인자 및 이들의 배합물로 이루어진 그룹으로부터 선택된 환경 영향인자 화합물을 추가로 포함하는, 키트.
  54. 제42항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 키트가 4개 이상의 마커들의 발현 수준을 결정하기 위한 프로브를 포함하고, 상기 프로브가 RNA, DNA, 단백질 및 항체로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 키트.
  55. 삭제
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